DE2408724A1

DE2408724A1 - Biologische extrakte und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2408724A1
Application number: DE19742408724
Authority: DE
Inventors: Christopher Adlam; David Eric Reid
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1973-02-23
Filing date: 1974-02-22
Publication date: 1974-09-05
Also published as: DK141757C; AU6591074A; DK141757B; IL44267A0; HU173676B; BE811491A; GB1476422A; FR2218888A1; NL7402455A; FR2218888B1; ZA741189B; IE39332B1; IE39332L; IL44267A; JPS5063196A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATBMT AMWÄ'-Tl β MÜNCHEN flO. MAUERKIR^KCReTn. 49

Anwaltsakte 24- 791 22. Februar 1974

Be/Sch

The Wellcome Foundation Ltd. London / England

"Biologische' Extrakte und Verfahren zu ihrer

Herstellung"

Die vorliegende Erfindung betrifft Glycopeptide mit pharmakologiseher Wirksamkeit, die Extraktion der Glycopeptide aus Bakterienzellen und ihre Adaption für medizinische Zwecke.

Es ist bekannt, daß bestimmte Bakterien, zu denen die Actinomycetaceae-oder Mycobacteriaceae-Familien der

A 423 ' -2-

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Prevot's Klassifizierung (1) gehören, "immunstimulierende¹¹ Eigenschaften haben.

Unter dem Begriff "immunstimulierend" sind Eigenschaften zu verstehen, eine nicht spezifische Immunreizbeantwortung bei Säugern und Vögeln zu stimulieren, d.h. die Fähigkeit, Säugern und Vögeln eine Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenen Krankheitserregern, wie Viren, Bakterien (12) und Parasiten (13) zu verleihen, ohne daß eine antigene Verwandtschaft bzw. Affinität zwischen dem Krankheitserreger und den Produkten der Immunstimulierung vorliegtj sowie die Eignung als Adjuvans bei Säugern und Vögeln.

Es wurde festgestellt, daß Glycopeptide mit immunstimulierenden Eigenschaften aus den oben erwähnten Bakterien erhalten werden können.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein immunstimulierendes Glycopeptid, das geeignet ist, Säugern oder Vögeln eine Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenen Krankheitserregern zu verleihen, wobei das Glycopeptid aus der Zellwandung eines immunstimulierenden Bakteriums erhältlich ist, das zu den Actinomycetaceae - oder Mycobacteriaceae-Familien der Prevot's Klassifizierung gehört, das Glycopeptid im wesentlichen in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid, Diäthylenglycol und Hexan unlöslich ist;

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eine Absorption im Infrarotspektrum bei 1550 und 1660 cm~ entsprechend dem Vorliegen des Peptide, eine Absorption im InfrarotSpektrum zwischen 950 und 1100 cm mit einer Maximumabsorption bei 1050 bis I070 cm entsprechend dem Vorliegen von Kohlehydrat, geringe oder keine Lipoidabsorption im Infrarotspektrum bei 2850 bis 2950 cm" hat und das, nach intravenöser Verabfolgung, das Gewicht der Leber und der Milz, sowie die Lebenserwartung von Mäusen mit Tumoren erhöht.

Als Genera, die zu der einen oder anderen der Actinomycetaceae- oder Mycobacteriaceae-Familien gehören, sind zu erwähnen Actinomyces, Nocardia, Streptomyces, Micromonospora, Corynebacterium (ebenso bekannt als Propionibacterium) sowohl die aerobischen als auch anaerobischen Species, Actinobacteriiim (ebenso bekannt als Bif idobacterium), Erysipelothrix, Listeria und Mycobacterium.

Als Species, die zu dem Genus Gorynebacterium gehören, können erwähnt.werden C. anaerobium, C. granulosum, C. liquefaciens, G. pyogenes, G. lymphophilum, C. hepatodystrophicans, C. adamsoni, G. parvum, C. avidum, G. diphtheroides, C. renale cuniculi, C. acnes, C. equi und C. ovis.

Hinsichtlich der Taxonomie der Corynebakterien bestehen beträchtlich kontroverse Ansichten. Ohne Rücksicht auf

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irgendwelche Referenzen hinsichtlich, der Species C. parvum wird hier angenommen, daß hierzu der Stamm gehört, der die "Wellcome Culture Collection"-Nummer CN 6134- hat, wobei dieser Stamm von dem Pasteur Institut erhalten wurde und die "Pasteur Institut ¹S Culture"-Nummer 4685 hat und vorausgehend als C. anaerobium (siehe beispielsweise Ref. 9) beschrieben wurde.

Die Zubereitung der Glycopeptide der vorliegenden Erfindung sind variabel als Folge von Faktoren, wie der genetischen Variation je nach dem als Quelle für Bakterienzellen verwendeten Jeweiligen Stamm und der jeweiligen zur Kultur dieser Zellen verwendeten Verfahren. Die Veränderung kann aber auch mit dem Grad der Reinheit zusammenhängen, der durch das verwendete Isolierungsverfahren erreicht wird, beispielsweise durch die unvollständige Entfernung des an den Glycopeptiden haftenden äußeren Proteins.

Wünschenswerte Glycopeptide der vorliegenden Erfindung enthalten 30 bis 45, vorzugsweise etwa 40 Gew.# Kohlehydrat.

Vorzugsweise enthalten die Glycopeptide bei Mikroanalyse 38 bis 43# Kohlenstoff, 7 bis 10# Stickstoff und 5 bis Wasserstoff, wobei sich die Prozentsätze auf das Gewicht des trockenen Glycopeptide beziehen.

Die Glycopeptide der vorliegenden Erfindung können aus Bakterienzellen extrahiert werden, wozu man eine Kultur

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der Bakterienzellen bildet, die kultivierten Bakterienzellen aus der Kultur gewinnt, gegebenenfalls die kultivierten Bakterienzellen einer Lysis unterwirft, um ein Lysat derselben zu bilden,und die kultivierten Bakterienzellen oder deren Lysat einer Zweiphasen-Lösungsmittelextraktion unterwirft, sodaß man das Glycopeptid als unlöslichen Rückstand erhält.

Die Bakterienzellen, aus denen die Glycopeptide der vorliegenden Erfindung erhalten werden, können aus jeder bekannten Quelle erhalten werden. Im allgemeinen können die Bakterienzellen anfangs aus Säugern oder Vögeln erhalten werden, die mit dem gewünschten Bakterium infiziert sind, beispielsweise kann G. parvum dem Blut von Patienten entnommen werden, die an einer Septicaemia leiden, während C. renale cuniculi oftmals bei normalen Säugernieren anzutreffen sind. Einige Bakterien können jedoch von mehr als einem Wirt erhalten werden, wie beispielsweise C. parvum, das auch von der Haut normaler Menschen erhalten werden kann.

Die Bakterienzellen, die immunostimulierende Eigenschaften aufweisen (und aus denen die Glycopeptide der vorliegenden Erfindung erhalten werden können), können leicht dadurch identifiziert werden, daß sie geeignet sind, das Milz- und^ Lebergewicht bei Mäusen zu erhöhen und/oder durch ihre Ad-Öuvansaktivität bei Mäusen (9) und ihre Fähigkeit, Resistenz

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gegenüber Tumoren bei Mäusen (14) hervorzurufen.

Es kann jede Kultur der Bakterienzellen, die nach· den bereits bekannten Verfahren hergestellt wurden, als Material · zur Extraktion des Glycopeptide verwendet werden. Vorteilhafterweise werden frisch isolierte Stämme unter gefriergetrockneten Bedingungen gehalten, bevor sie in einem Nährmedium kultiviert werden, wie Robertson's gekochtem Fleischmedium (3) ergänzt mit 1# Gew./Vol. Glucose und 5# Vol/Vol. Perdeserum. Die Kultur wird wünschenswerterweise bei einer Temperatur über Umgebungstemperatur, beispielsweise etwa 37⁰G mehrere Tage, geeigneterweise 5 bis 7 Tage und vorzugsweise ohne Wuchsstörung des Kulturmediums gehalten. Um die Ausbeute der Kultur zu erhöhen, können die Produkte der Anfangskultur verwendet werden, um weitere Mengen Wuchsmedium zu impfen, beispielsweise ein Medium, das 1$ Gew./Vol. Glucose enthält, worin der Wuchs unter ähnlichen Bedingungen stattfindet. Zu weiteren geeigneten Wuchsmedien gehören Todd-Hewitt-Boullion (4) und Thioglycollat-Boullion (5). Um eine maximale Ausbeute an Zellen in einem Minimum an Zeit zu erhalten, sind successive Unterkulturen der Zellen erforderlich und jede Unterkultur wird vorzugsweise in der logarithmischen Phase des Wuchses angelegt und in jedem Falle beträgt das Inoculum vorzugsweise etwa 1O#, bezogen auf das Volumen der Folgekultur, obgleich für die letzte Stufe das Inoculum zweckmäßigerweise 2 bis 3#j bezogen auf das Volumen der Folgekultur beträgt.

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Die kultivierten Bakterienzellen können von dem Kulturmedium nach jedem herkömmlichen Verfahren zum Abernten solcher Medien, beispielsweise durch Zentrifugieren, gewönnen werden. Wünschenswerterweise werden kann die kultivierten Bakterienzellen vor der Extraktion wiederholt gewaschen, beispielsweise-mit wäßrigem O,85#igem Gew./Vol. Natriumchlorid oder mit destilliertem Wasser.

Die Lysis der kultivierten Bakterienzellen kann nach jedem herkömmlichen Verfahren zur Lysis der Zellen bewirkt werden, beispielsweise unter Verwendung von physikalischchemisch wirkenden Mitteln, wie hypertonischen Puffern mit mechanischem Rühren des viskosen Lysats, oder mittels mechanischer Lysis, beispielsweise unter Verwendung von Ultraschallwellen; durch intracellulare Cavitation; durch Passage bei niederer !Temperatur und hohem Druck durch eine enge Düse in einer Presse, wie der Hughes-Presse (6); oder durch mechanisches Rühren in einer Homogenisiervorrichtung oder einer Mahlvorrichtung (7). Wünschenswerterweise werden die zerbrochenen Zellwandungen von den anderen Bestandteilen des Lysats, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt..Das Zentrifugieren kann bei 15 000 bis 25 000, beispielsweise 20 000 g während etwa 30 bis 90 Minuten, beispielsweise 1 Stunde, durchgeführt werden. Zweckmäßigerweise wird ein vorausgehendes Zentrifugieren bei langsamer Geschwindigkeit, beispielsweise 3 Minuten bei etwa 300 g, durchgeführt, um die überstehende Schicht .von

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dieser Stufe, dann bei der Hauptzentrifugierungsstufe bei höherer Geschwindigkeit zu verwenden, während intakte Zellen in dem Sediment verbleiben.

Zweiphasische Lösungsmittelextraktion der zerbrochenen Zellwandungen und/oder der kultivierten ganzen bakteriellen
Zellen und/oder dessen Lysats unter Bildung des Glycopeptide wird in der Weise bewirkt, daß man den wäßrigen Arylalkohol und das Glycopeptid, das von den Zellbestandteilen isoliert wurde, nicht in der wäßrigen Phase extrahiert.
Unter der Bezeichnung "Arylalkohol", wie sie hier verwendet wird, ist eine Verbindung zu verstehen, worin ein ^ydroxykern unmittelbar mit einem aromatischen Kern verbunden ist, beispielsweise ein gegebenenfalls substituiertes Phenol wie ein Cresol, jedoch vorzugsweise ein unsubstituiertes Phenol (siehe Beispiel, Ref. 16).

Die zweiphaslge Lösungsmittelextraktion wird dadurch bewirkt, daß man den Kontakt mit Wasser und dem Arylalkohol einen bestimmten Zeitraum bei einer Temperatur von O bis
1OO°C, vorzugsweise 15 bis 7O°C, zweckmäßigerweise unter
Rühren durchführt. Ein geeigneter Zeitraum ist der Bereich von wenigen Minuten bis wenigen Stunden, je nach der verwendeten Temperatur. Im Falle daß Phenol verwendet wird,
ist eine besonders geeignete Temperatur 68⁰C, bei der das Rühren 15" Minuten durchgeführt werden kann.

Die Konzentration des Arylalkohols in dem Arylalkohol-Wassergemisch kann etwas variiert werden, wobei es notwendig ist zu beachten, daß man am Ende ein 2-Phasensystem erhält, wobei pede Phase -völlig mit der anderen gesättigt ist. Im Falle von Phenol kann die Phenolkonzentration in dem Phenol-Wassergemisch 10 bis 9O# Vol./Vol. betragen, beträgt jedoch vorzugsweise 40 bis 55# Vol./Vol.

Das Gemisch wird dann bei etwa 5 000 bis 10 000 g 4-5 bis 15 Minuten, beispielsweise bei -8000 g 30 Minuten, zentrifugiert, wodurch man vier Schichten erhält: einen festen Kuchen, der die Zellentrümmer enthält, über diesem in der Reihenfolge die alkoholische Phase, eine weiße Zwischenphasenregion und eine wäßrige Phase. Im Falle daß ein Verfahren keine Lysis beinhaltet, ist wenig oder kein Material in der Zwischenphasenregion enthalten, sodaß die Zentrifugierung nur drei Schichten liefert: einen festen Kuchen, der die nicht zerbrochenen Zellen enthält, darüber in der Reihenfolge die alkoholische und die wäßrige Phase.

Die wäßrige Phase und die alkoholische Phase werden verworfen und wünschenswerterweise die Zweiphasen-Lösungsmittelextraktiqn bei dem verbleibenden Material so lange wiederholt, bis vorzugsweise die wäßrigen und alkoholischen Phasen nach Zentrifugieren farblos sind (oder im Falle eines gefärbten Alkohols) in der Farbe im Laufe der Extraktion verändert sind. Es kann auch nur die wäßrige Phase

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verworfen werden, wobei das verbleibende Material einschließlich der alkoholischen Phase, wenn gewünscht, erneut extrahiert werden kann.

Das nach der wäßrigen Phase (und, wenn gewünscht, der alkoholischen Phase) verbleibende Material, das verworfen wurde, wird dann wünschenswerterweise gegen Wasser dialysiert, um den Arylalkohol (bzw. den rückständigen Arylalkohol) zu entfernen. Die Dialyse wird mehrere Tage, wünschenswerterweise bei einer Temperatur unter Umgebungstemperatur, beispielsweise bei etwa 4°C, durchgeführt.

Nach der Dialyse wird ein Sediment erhalten, das die folgenden Schichten enthält: eine dunkel gefärbte Unterschicht (nicht vorhanden, wenn die alkoholische Phase nach Zentrifugieren verworfen wurde), eine braun-cremig gefärbte Schicht mit einer öligen Konsistenz und eine obere Schicht, die eine weiße fein verteilte Suspension enthält, welche dann gesammelt werden kann, um die immunostimulierenden Glycopeptide der vorliegenden Erfindung zu liefern, die wünschenswerterweise mit destilliertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung (0,85# Gew./Vol. wäßriges Natriumchlorid) gewaschen werden.

Die Glycopeptide der vorliegenden Erfindung können therapeutisch oder prophylactisch dazu verwendet werden, Säugern und Vögeln eine Resistenz gegenüber Tumoren und verschiede-

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nen Krankheitserregern zu verleihen, wobei sie den Wuchs solcher Tumore und Krankheitserreger inhibieren und/oder ihr Ausmaß verringern, wozu man eine wirksame therapeutische oder prophylactische' Dosierung der Glycopeptide verabfolgt. Zu Tumoren, die in dieser Hinsicht erwähnt werden können, gehören Leukämie, die Hodgkin'sche Krankheit, Karzinome der Lunge, Blase und Brust, Melanokarzinom und Burkitt·sches Lymphoma. Zu bakteriellen Krankheitserregern, die .hier erwähnt werden können, gehören Bordetella pertussis und Bruceila, abortus. Zu parasitären Krankheitserregern gehören Protozon wie Malaria.

Der Umfang der therapeutischen oder prophylactischen Dosierung des Glycopeptide wird natürlich von der Natur und Schwere des in Betracht kommenden Tumors oder der pathogenen Infektion, dem jeweiligen Glycopeptid und seiner Verabfolgungsweise abhängen. Im allgemeinen liegt die Dosierung im Bereich von 0,1 bis 20, vorzugsweise 0,5 bis 10 und insbesondere von 0,7 bis 2 mg Glycopeptid pro kg Körp ergewicht bei Säugern oder Vögeln, bei denen das Glycopeptid verabfolgt werden soll.

Es kann Jegliche herkömmliche Verabfolgungsweise entsprechend der Weisung des Arztes und abhängig von der Natur und dem Ort des Tumors oder der in Betracht kommenden pathogenen Infektion verwendet werden. Eine solche Verabfolgung kann auf oralem Wege oder über die Lunge mittels üblicher Verab-

folgungsweisen bewirkt werden, wie beispielsweise durch Injektion subcutan, intramuskulär, intraperitonal oder vorzugsweise intravenös. Wenn gewünscht, kann die "Injektion" in Form einer Infusion während längerer Dauer, beispielsweise mehrerer Stunden, durchgeführt werden.

Die Glycopeptide können in Form einer pharmazeutischen Zubereitung formuliert werden zur Verwendung in dem voraus beschriebenen Behandlungsverfahren oder zur Prophylaxe mittels irgendeinem herkömmlichen pharmazeutischen Verfahren, einschließlich unter anderem dem Mischen der Glycopeptide mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern. Die Natur der Zubereitung wird natürlich von dem gewählten Verabfolgungsweg abhängen. Zur oralen Verabfolgung kann eine Zubereitung eines Glycopeptids der vorliegenden Erfindung als getrennte Einheit wie als Kapsel, Kachette oder Tablette, wobei jede eine voraus bestimmte Menge des Glycopeptids enthält, als Pulver oder Granulate oder als Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit, einer nicht-wäßrigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasseremulsion oder einer Wasser-in-Ölemulsion dargeboten werden. Zur Verabfolgung über die Lunge kann eine Zubereitung eines Glycopeptids der vorliegenden Erfindung als eine zur Inhalation geeignete Zubereitung dargeboten werden.

Eine pharmazeutische Zubereitung der vorliegenden Erfindung, die zur Injektion geeignet ist, enthält ein Giycopeptid der

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vorliegenden Erfindung, suspendiert in einem inerten pharmazeutisch verträglichen flüssigen Verdünnungsmittel. Die Zubereitungen zur Injektion müssen natürlich steril und mit dem Blut des Säugers oder des Vogels isotonisch sein, dem sie verabfolgt werden sollen. Ein geeignetes Verdünnungsmittel ist Wasser und eine geeignete Injektionszubereitung, die bei Menschen verwendet werden soll, ist eine Suspension des Glycopeptide in physiologischer Kochsalzlösung (0,85# Gew./Vol. wäßriges Natriumchlorid). Vorteilhafterweise wird das Glycopeptid in einem sterilen Verdünnungsmittel unter aseptischen Bedingungen suspendiert. Die Sterilisation der Injektionszubereitungen kann mittels herkömmlicher Verfahren bewirkt werden, beispielsweise durch Zugabe von Formalin in einer Konzentration von etwa 0,5$ Vol./Vol. Wünschenswerterweise wird ein Konservierungsmittel, beispielsweise Thiomersalat, geeigneterweise in einer Konzentration von 0,01^5 Gew./Vol. den InJektionszubereitungen einverleibt.

Die Injektionszubereitungen der vorliegenden Erfindung können mittels herkömmlicher Verfahren isotonisch gemacht werden, beispielsweise durch Dialyse gegenüber einer Salzlösung, die mit dem Blut des Säugers oder des Vogels, die injiziert werden sollen, isotonisch ist. Jede Salzlösung, die als Insektionsmedium geeignet ist, beispielsweise physiologische Kochsalzlösung (0,85$ Gew./VoI-. wäßriges Natriumchlorid) oder isotonische Phosphatpuffer, können

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verwendet werden.

Die Inn" ekt ions Zubereitungen der vorliegenden Erfindung . können entweder "als konzentrierte Injektionszubereitungen zur Verdünnung vor ihrer Verwendung- oder als zur Verwendung fertige Inn"ektionszubereitung hergestellt werden. Im letzteren Falle beträgt die Konzentration des immunostimulierenden Glycopeptids wünschenswerterweise 20 bis 2 mg/ml, vorzugsweise etwa 7 mg/ml. Zweckmäßigerweise können die Inn'ektionszubereitungen gefrier-getrocknet werden, beispielsweise aus 5# Gew./Vol. wäßriger Saccharose, um unmittelbar vor Verwendung mit Wasser gebrauchsfertig gemacht zu werden.

Eine weitere Verwendung der Glycopeptide der vorliegenden Erfindung ist die eines Hilfsmittels oder als Bestandteil in einem Vakzin mit einem anderen Wirkstoff. Ein Beispiel einer solchen Verwendung ist die Substituierung des Glycopeptids für hitze-abgetötete Bakterienelemente von Freund's Volladjuvans (einer Wasser-in-Ölemulsion eines Wirkstoffs in einem Mineralöl, das weiterhin wärme-abgetötete Bakterien enthält) und ein Beispiel eines Vakzins, das Glycopeptid als Adn'uvans enthält, ist ein Vakzin zur Immunisierung gegen Bruceila.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert, ohne den Erfindungsbereich einzuschränken.

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Beispiel 1

Isolierung von immunstimulierendem Glycopeptid von C.parvum-Zellen

A. Herstellung eier kultivierten O.parvum-Zellen; Gefriergetrocknete Zellen von C. p.arvum (0,2 bis 0,5 nig) (Wellcome Culture No. CN 6134) wurden in Robertson's gekochtes Fleischmedium (20 ml) (5), das mit Glucose (1# Gew./Vol.) und Pferdeserum (5$ Vol./Vol.) ergänzt war, geimpft, wobei das Medium in einer mit Schraubverschluß versehenen Flasche enthalten war. Nach 6 Tagen statischem Bebrüten bei 37°C wurde das Bebrüten 6 Tage in Flaschen mit 2 1 Fassungsvermögen (1800 ml Brühe) und dann etwa 7 Tage in Flaschen mit einem Fassungsvermögen von 15 1 fortgesetzt. In jedem Falle betrug das Volumen des verwendeten Impfgemischs etwa 10 Vol.# der zu impfenden Brühe, ausgenommen in der letzten Stufe, bei der ein 2 1/2#iges Inoculum verwendet wurde.

Die kultivierten Zellen werden dann in der Weise abgeerntet, daß man das Endkulturgemisch 2 Stunden bei 2000 g zentrifugiert. Die überstehende Schicht wurde verworfen und die Zellen wurden wiederholt durch Suspendieren der sedimentierten Zellen in physiologischer Kochsalzlösung und Zentrifugieren der Suspension, wie angegeben, gewaschen.

B. Zellysis

Die gewaschenen Zellen (10 g Naßgewicht) wurden mit Ballotini-Glasperlen (35 g No. 14) und einer geringen Menge

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- 16 physiologischer Kochsalzlösung (etwa 1 ml) gemischt.

Das Gemisch wurde dann in einem Novotny-Desintegrator (8) 15 Minuten dem mechanischen Rühren unterworfen, wobei die Paddel mit 2CX)O UpM rotierten. Die erhaltene Aufschlämmung wurde dann mit einer weiteren Menge physiologischer Kochsalzlösung (ca. 10 ml) verdünnt und in einem Abscheider mit grobem gesintertem Glas zur Entfernung der Glas-Balbtini filtriert. Der Rückstand wurde in physiologischer Kochsalzlösung (ca. 10 ml) erneut suspendiert und 1 Stunde bei 20 000 g zentrifugiert, um die gebrochenen Zellwandungen zu sedimentieren.

0. Extraktion der C.parvum-Zellwandungen Zu den C.parvum zerbrochenen Zellwandungen (20 g Naßgewicht) gab man destilliertes Wasser (350 ml) und wäßriges Phenol (0# Gew./Vol., 350 ml), beides bei 68⁰O. Das Gemisch wurde bei 68⁰C 15 Minuten unter konstantem Rühren bebrütet, in einem Eisbad gekühlt und dann 30 Minuten bei 4-°C bei 8000 g zentrifugiert. Vier getrennte Schichten wurden in dem Zentrifugenbehälter beobachtet, ein Kuchen, eine untere Phenolphase, eine weiße Zwischenphasenschicht und eine obere wäßrige Phase. Die wäßrige Phase wurde verworfen und die verbleibenden Schichten erneut in einer weiteren Menge destilliertem Wasser (350 ml) bei 68⁰C suspendiert und wie vorausgehend wieder extrahiert. Es wurde wiederum die obere wäßrige Phase verworfen und die verbleibenden Schichten

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dann zusammengegeben und gegen laufendes Leitungswasser 4 Tage, danach gegen destilliertes Wasser bei 4°C weitere 3 Tage dialysiert, um das Phenol zu entfernen.

Nach 1 Woche erhielt man ein Sediment von drei Schichten in dem Dialysenbehälter. Eine untere, dunkel gefärbte Schicht, die zerbrochene Zeilen,verbunden mit DNA, enthielt. Eine zweite braun-beige gefärbte Schicht mit öliger Konsistenz (wobei diese beiden Schichten nur geringe oder keine immunstimulierende Aktivität aufwiesen). Die obere weiße Schicht wurde gesammelt, nachdem das Wasser aus dem Dialysenbehälter entfernt war, wodurch man das Glycopeptid erhielt (nachfolgend als Glycopeptid A bezeichnet), dessen Eigenschaften nachfolgend beschrieben werden.

Physikalische Eigenschaften

Das Glycopeptid wies die folgenden Eigenschaften auf:

a) Es war leicht in Dimethylsulfoxid löslich. Es war unlöslich in Wasser, Phenol, Äthanol, Methanol, Chloroform, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid, Diäthylenglycol, Hexan, Aceton, Äther und physiologischer Kochsalzlösung;

b) Es war im wesentlichen lipoidfrei (J. Falch u.a. J. Biol. Chem. 226 497 O957));

c) Bei Suspendierung in einem Phenol-Wasserge.misch wurde es in der Zwischenphasenregion konzentriert;

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d) Es hatte eine chemische Zusammensetzung, bestimmt mittels Mikroanalyse, wobei die angegebenen Mengen Gewichtsprozentsätze sind: Kohlenstoff 39>Ö3; Wasserstoff 6,24; Stickstoff 9iO3; Phosphorspuren; Asche 5»4-' Siliciumdioxid 1,48; Schwefel unter o,2.; und Sauerstoff, durch Differenz festgestellt, von etwa 40. Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff wurden in einer "Perkin-Elmer 240"-halbautomatischen Analysiervorrichtung bestimmt.

e) Das feste Material (1,5 mg) zeigte eine Infrarotanalyse bei Dispersion in einer Standard-16 mm Duchmesser-Kaliumchloridscheibe die folgenden Extinktionswerte pro mg festes ^ülycopeptid:

Bindung	Wellenlänge cm	Ab s orption/mg
CO-NH	1660	0,78
C-OH	1050-1070	0,29 ⁺
C-H	2850-2950	0,004 ⁺

(⁺ relativ zu Albumin)

Einzelheiten über das erhaltene Infrarotspektrum werden nachfolgend noch angegeben.

f) Chromatographisches Fraktionieren eines Hydrolysate des Glycopeptids läßt das Vorliegen bestimmter Aminosäuren und Zucker wie folgt erkennen:

Als Aminosäuren wurden Ornithin-, Alanin-, Valin-, Leucin- und Asparaginsäure festgestellt; die Hydrolyse wurde in

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6N HCL in geschlossenen Ampullen 18 Stunden bei 10O⁰G bewirkt, der Rückstand in Wasser gelöst und die Chromatographie auf Whatman 3 mm-Papier bewirkt, wobei man die aufsteigende Chromatographie 18 bis 24 Stunden mit einem Lösungsmittel verwendet, das Butanol (60 ml), Essigsäure (15 ml) und Wasser (25 ml) enthält, und man dann mit einem Ninhydrinspray für Aminosäuren entwickelt und als Zucker wurde Galactose, Glucose, Mannose und Spurenmengen von Arabinose festgestellt; hierzu wurde die Hydrolyse mit 2N HCl in verschlossenen Ampullen 3 Stunden bei 1OO°C durchgeführt,der Rückstand in Pyridin gelöst und die Chromatographie auf Whatman 3 mm - Papier durchgeführt, wozu die absteigende Chromatographie 18 bis 24 Stunden mit eine Lösungsmittel verwendet wurde, das Butanol (60 ml), Pyridin (40 ml) und Wasser (30 ml^ enthielt, wonach mit einem Anilin-Oxalatspray für Zucker (P. Novotny, J. Med. Microbiol. 2 81 (1969)) entwickelt wurde;

g) Ein Biurettest für Protein wurde (Ref. 10) bei dem Glycopeptid festgestellt, wodurch man eine Blaufärbung erhielt, die nicht abgewaschen wurde.

h) Das Glycopeptid ergab ein positives Ansprechen bei dem Anthrontest (Bezug 11), wobei sich die Reaktionslösung blau-grün verfärbte.

Beispiele 2 und 3

Isolierung von immunstimulierendem Glycopeptid von C.parvum-

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Zellen

Es wurden zwei weitere Glycopeptid-Aufbereitungen (nachfolgend als Glycopeptide B und C) nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung des gleichen C. ρarvum-Stamms erhalten.

Beispiel 4-

Isolierung von immunstimulierendem Glycopeptid von C.parvum-Zellen

Es wurde eine weitere Glycopeptid-Aufbereitung (nachfolgend als Glycopeptid D) von dem in Beispiel 1 verwendeten C.parvum-Stamm nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten, jedoch mit dem folgenden Unterschied: das Gemisch von Lysat, Wasser und Phenol wurde 1 Stunde bei 1500 g (anstelle von 30 Minuten bei 8000 g) zentrifugiert.

Beispiel 5

Eigenschaften der Glycopeptide der Beispiele 1 und 2

1. Infrarotanalysen der Glycopeptide A und B, dispergiert in Standard-16 mm-Durchmesser-Kaliumhalogenidscheiben, ergaben die folgenden Ergebnisse:

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Wellen länge	Min.	Glycopeptid A (1,57mg KCl-Scheibe)	ffAbs	A°	A = #Abs = A⁰ =	Gly c 0	peptid ß mg KBr-ScI	leibe
cm"	max.	A	22		A	ffAbs	A°_
850	Beug.	0,12	•79	0,58	0,02	5
⁺1O55	min.	0,68	■ 58		0,31	50	0,66
1152	doublet max	0,37	36		0,19	36
1200	min.	0,20	67	0,42	0,10	20
1380) 1405)	max.	0,49	45		0,26	45	0,55
1480	min.	0,26	81	0,62	0,15	29
1545	Beug.	Ö,72	77		0,35	55	0,74
1575	max.	0,64	83		0,32	52
1605	Basis	0,78	93	1,00	—	-
1660	max.	1,17	5		0,47	66	1,00
1900	max.	0,03	57	0,32	0,07	14
2920	0,37	92	0,94	0,24	42	0,51
3400	1,10	.nahezu flach, 1045-1070 cm""'¹	0,50	70	1,06
Max,	Minimum Maximum = Beugung
min = max = infl.		= Absorption (Extinktion) = Prozent Absorption = Absorption im Verhältnis	zu

der Peptidbande bei 1660 cm

2. Die Mikroanalyse der Glycopeptids B (unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 (d)) lieferte die folgende Zusammensetzung: Kohlenstoff 39,77#, Wasserstoff 6,40#, Stickstoff 8,15#, Asche 2,8#, Siliciumdioxid 0,84# und weniger als 0,2# an jeweils Phosphor und Schwe'fel, wobei die angegebenen Prozentsätze Gewichtsprozentsätze, bezogen

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auf das Trockengewicht des Glycopeptidsj sind.

Beispiel 6

Pharmazeutische, zur Injektion geeignete Zubereitung

Das Glycopeptid von Beispiel 1 (70 mg) wurde in einer Lösung von physiologischer Kochsalzlösung (0,85$ Gew./Vol. wäßriges Natriumchlorid, 10 ml), die 0,01# Gew.AoI. Thiomersalat enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde durch Zugabe von 0,1$ Gew./Vol. Formalin 24 Stunden sterilisiert, worauf das Formalin durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 38 000 g entfernt wurde. Nach zweimaligem Waschen in physiologischer Kochsalzlösung wurde dann das Glycopeptid erneut in physiologischer Kochsalzlösung (10 ml) suspendiert, die 0,01# Gew./Vol. Thiomersalat enthielt, und in 1 ml Glasampullen verteilt, die dann geschlossen wurden.

Beispiel 7

Eigenschaften der Glycopeptide der Beispiele 2 und 3

1. Die Infrarotanalysen der Glycopeptide B und G, dispergiert in Standard-16 mm-Durchmesser-Kaliumchloridscheiben, ergaben die folgenden Werte:

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Wellenlänge

cm"

925

1065 max
1155 max
1202 min

1382)äoub
1412)max

1482 min
1557 max
1605 min
1900

2940 max
3400 max
1660 max

Glycopeptid C (1,45 mg)

A #Abs. A^

0,16 31

0,55 72 0,44

0,33 53

0,195 36

. 0,425 62,5 0,34 0,47 66

0,26

0,86

0,74

0,035

0,41

1,25 1,25

min =s Minimum max - Maximum infl.= Beugung

45 86 82 8 61 94 94

0,69 0,33

1,00 1,00 Wellenlänge

-1

Glycopeptid B (1,54- mg)

cm ' A ffAbs A

860 min 0,145 . 28

1061 max 0,66 78 0,66

1152infl. 0,36 56,5

1200 min 0,19 35

1382)doub.0,48 67 0,48

1410)max 0,4? 66

1480 min 0,25 44

1570 max 0,74 82 0,74

1900 Basis 0,035 8

2940 max 0,38 58 0,38

3400 max 0,96 89 0,96

1650 max 1,00 90 1,00

A = Absorption (Extinktion) #Abs= Prozent Absorption
A° = Absorption im Verhältnis zu der Peptidbande bei 1660 cm

-1

2. Die Mikroanalyse des Glycopeptide G (wie im Beispiel 1 (d)) ergab die folgende Zusammensetzung: Kohlenstoff 38 Wasserstoff 5,81#, Stickstrff 8,22$, Phosphor 0,23#, Schwefel ^0,3#, Asche 4,2# und Siliciumdioxid 1,81#, wobei die angegebenen Prozentsätze Gewichtsprozentsätze sind, die sich auf das Trockengewicht des Extrakts beziehen.

-24-

409836/1068

Beispiel 8 ,

Biologische Eigenschaften des Glycopeptide von C.parvum-Zellen

1. Lympho - rekticular stimulierende Aktivität 10 Olac-Mäuse ( ⁿ Random-bred", W-Swiss, weiblich, Körpergewicht 16 bis 20 g) erhielten jeweils eine einzelne intravenöse Injektion, die das Glycopeptid von Beispiel 5 (1»^ mg) in 0,85# Gew./Vol. wäßrigem Natriumchlorid (0,2 ml) enthielt. Nach 10 !Tagen wurden die Mäuse getötet und ihre Milz und Leber entnommen und gewogen. 10 ähnliche Kontrollmäuse erhielten jeweils eine einzige intravenöse Injektion von wäßrigem Natriumchlorid (0,85$ Gew./YoI.) und wurden ebenso nach 10 Tagen getötet, wobei auch hier Milz und Leber entnommen und gewogen wurden. Die in der Tabelle I angegebenen Ergebnisse beziehen sich auf ein mittleres Organgewicht in mg und sind korrigiert auf ein 20 g Körpergewicht der Maus.

Tabelle I

Wirkung von Glycopeptid bei der Vergrößerung von Milz- und Lebergewichten bei Mäusen

Milzgewicht (mg) Lebergewicht(mg)

Kontrollen 102 1060

üntersuchungsmäuse 250 174-1

2. Aktivität gegen Tumor

20 Olac-Mäuse (weiblich, jede mit einem Körp-ergewicht von

-25-

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16 bis 20 g) wurden intraperitonal mit einem allogenen Maussarkom 180T/G (1(r Zellen) (Eef.16) injiziert. 24 Stunden später erhielten 10 Untersuchungsmäuse jede eine einzige intravenöse Injektion, die das Glycopeptid von Beispiel 3 (1,4 mg) in wäßrigem Natriumchlorid (0,85# Gew./Vol.) enthielt. Die restlichen 10 Kontrollmäuse erhielten jeweils eine einzige intravenöse Injektion von wäßrigem Natriumchlorid (0,85 # Gew./Vol.).

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	Tage nach	Tumor 180/TG bei	Mäusen	Unt ersuchungsmäuse
Tabelle II	der Glycopeptid-	Anzahl der	überlebenden Mäuse	10
	in,i ektion		-	9
Die Wirkung des von C.parvum extrahierten Glycopeptids auf	15	Kontrolle	-9
den	16	10	9
17	10	9
18	9	8
19	6	7
20	4-	7
21	4-	7
22	3	7
23	2	5
24-	2	5
25	2.	5
26	2	VJl
27	1	5
. 28	1	VJl
29	1
30	1
1

Die Todesfälle der Mäuse wurden 30 Tage festgehalten.

Ergebnisse

Die Tabelle II zeigt die Wirkung des Glycopeptids hinsichtlich der Verbesserung der Lebenserwartung der Mäuse, die

-27-

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intraperitonal mit dem Maussarkom injiziert wurden.

Beispiel 9

Isolierung des immunstimulierenden Glycopeptids von C.parvum-Zeilen

Eine weitere Glycopeptidaufbereitung (nachfolgend als Glycopeptid E bezeichnet) wurde aus lysierten Zellen, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurden, isoliert. Es wurde das Isolierungsverfahren von Beispiel 1 verwendet, außer daß die Phenolphase gleichzeitig mit der wäßrigen Phase verworfen wurde. Die Dialyse wurde, wie vorausgehend beschrieben, durchgeführt, wobei das rückständige Phenol entfernt wurde und man ein Sediment von nur zwei Schichten erhielt: einer unteren dunkel gefärbten Schicht und einer oberen weißen Schicht. Die letztere wurde, wie vorausgehend beschrieben, unter Bildung des Glycopeptid E gesammelt.

Beispiel 10

Isolierung von immunstimulierendem Glycopeptid aus O.parvum-Zellen

Eine weitere GIycopeptidaufbereitung (nachfolgend als Glycopeptid E bezeichnet) wurde unter Verwendung des C.parvum-Stamms und des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens erhalten.

Beispiel 11

Biologische Eigenschaften der Glycopeptide von Beispiel 9

-28-409836/1068

und 10.

Die lymphoreticulare stimulierende Aktivität der Glycopeptide E und F wurde unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 8.1 untersucht, wobei die folgenden Ergebnisse erzielt wurden:

Milz Leber

Gewicht (mg) Gewicht (mg)

Kontrollen (5) 88 1155

Mäuse, die 1,0 mg
Glycopeptid E (5) erhielten 227 1724

Kontrollen (5) 91 1098

Mäuse, die 1,4 mg
Glycopeptid F (10) erhielten 185 1481

Die Milz- und Lebergewichte sind Mittelwerte. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der bei den Versuchen verwendeten Mäuse an.

Bezugstellen

1. Prevot, A.-R., & Fredette, V., (1966) "Manual for the classification and determination of the anaerobic bacteria", Lea and Febiger, Philadelphia, U.S.A.

2. Prevot, A.-E., J. Retic. Soc. 1 115 (1964)

-29-409836/1088

3- Mackie & McCartney's Handbook of Bacteriology Seite Herausgegeben von R. Cruickshank, 10. Ausgabe, Livingstone, Edinburgh & London, 1960

4. ebenda Seite 192

5. ebenda S. 234

6. ebenda S. 309

7. ebenda S. 308

8. Nature 202 (4930) Seiten 364-6, 25.April 1966

9. Adlam, C.& M.T. Scott, J. Med. Microbiol. 6 261(1973)

10. Data for Biochemical Research Ed. Dawson, R.M.C., Daphne C. Elliott, W.H. Elliott & K.M. Jones, 2.Ausgabe O.Ü.P., Oxford 1969, Seite 618

11. Spiro, R.G. Methods iii Enzymology 8 3 (1966) (Ed. Neufeld, E.F. & Ginsberg, V., pub. Academic Press New York & London

12. Adlam, C, Broughton, E.Si & Scott, M.T., Nature, New Biol. 235, 219 (1972)

13· Nussenzweig, Ruth S. Expl. Parasitöl., 21, 224 (1967)

14. Woodruff, M.F.A. & Boak, J.L., Brit. J. Cancer 20 345 (1966)

15. Sartorelli A.C., Fischer D.S. & Downs W.G-, J. Immunology 96 676 (1966)

16. Westphal, 0. & Jann, K., Methods in Carbohydrate Chemistry 5 83 (1966), Ed. Whistler, -pub. Academic Press, New Xork & London.

. -Patentansprüche-

-30-

409336/1068

Claims

Patentansprüche:

1. Immunstimulierendes Glycopeptid zur Verleihung einer Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenen Krankheitserregem bei Säugern und Vögeln, d. adurch gekennzeichnet , daß man es aus der Zellwandung eines immunostimulierenden Bakteriums der Actinomyeetaeeae- oder Myeobacteriaceae-Familien der Prevot's-Klassifizierung erhält, daß es im wesentlichen in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Methanol, Äthanol, Phenol, Chloroform, Dioxan, Pyridin, Dimethylformamid, Diäthylenglycol und Hexan unlöslich ist, eine Absorption in dem Infrarotspektrum bei 1550 und 1660 cm entsprechend dem Vorliegen des Peptids, eine Absorption im InfrarotSpektrum zwischen 950 und 1100 cm bei einer maximalen Absorption bei 1050 bis 1070 cm entsprechend dßm Vorliegen von Kohlehydrat, nur geringe oder keine Lipoidabsorption indem Infrarot-Spektrum bei 2850 bis 2950 cm hat und daß es nach intravenöser Verabfolgung das Leber- und Milzgewicht bei Mäusen, sowie die Lebenserwartung der Mäuse mit Tumoren erhöht.

2. Glycopeptid gemäß Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet , daß das immunstimulierende BaTcterium dem Corynebacterium genus angehört.

3- Glycopeptid gemäß Anspruch 2, dadurch ge-

-31-

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kennzeichnet , daß das immunstimulierende Bakterium den Corynebacterium parvum-Spezies angehört.

4.. Glycopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es 30 bis 45 Gew.# Kohlehydrat enthält.

5. Glycopeptid gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß es etwa 40 Gew.% Kohlehydrat enthält.

6. Glycopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß es 38 bis 43 Gew.# Kohlenstoff, 7 bis 10 Gew.% Stickstoff und 5 bis 7 Gew.# Wasserstoff enthält.

7- Verfahren zur Herstellung eines Glycopeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man immunostimulierende Actinomycetaceaeoder Mycobacteriaceae-Bakterienzellen kultiviert, die kultivierten Bakterienzellen von der Kultur gewinnt und die kultivierten Bakterienzellen der Zweiphasen-Lösungsmittelextraktion unterwirft, wozu man eine Phase, die Wasser enthält, und eine zweite Phase, die Arylalkohol (wie vorausgehend definiert) enthält, so verwendet, daß das Glycopeptid als unlöslicher Rückstand verbleibt.

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8. Verfahren gemäß Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet , daß man die kultivierten Bakterienzellen der Lysis vor der Zweiphasen-Lösungsmittelextraktion unterwirft.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , daß man als Arylalkohol ein unsubstituiertes Phenol verwendet.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9> dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zweiphasen-Lösungsmittelextraktion in der Weise durchführt, daß man die Bakterienzellen und/oder deren Lysat mit Wasser und dem Arylalkohol in Kontakt bringt, danach das erhaltene Gemisch zentrifugiert, die wäßrige Phase und die alkoholische Phase entfernt, wodurch man ein Sediment erhält, das eine obere Phase aufweist, die eine weiße fein verteilte Suspension enthält, die man sammelt unter Bildung des Glycopeptide .

11. Glycopeptid, sofern es nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10 hergestellt ist.

12. Pharmazeutische Zubereitung mit der Eignung, Säugern oder Vögeln Resistenz gegenüber Tumoren und verschiedenen Krankheitserregern zu verleihen, dadurch g e -

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kennz eichnet , daß sie ein Glycopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 11, zusammen mit einem hierfür geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

13- Zubereitung gemäß Anspruch 12, da durch gekennzeichnet , daß die Zubereitung steril und mit dem Blut des Säugers oder des Vogels, dem die Zubereitung verabfolgt- werden soll, isotonisch ist und in einer Form vorliegt, die zur Verabfolgung durch Injektion geeignet ist.

. Zubereitung gemäß Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Suspension des Glycopeptide in 0,85# Gew./Vol. wäßrigem Natriumchlorid enthält.

15- Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung 2 bis 20 mg/ml Glycopeptid enthält.

16. Zubereitung gemäß Anspruch 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß die Zubereitung ein Konservierungsmittel enthält.

17- Zubereitung gemäß Anspruch 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß sie in gefrier-getrockneter Form vorliegt und zur Verwendung mit Wasser zur Infusion hergerichtet wird.

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18. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch. gekennzeichnet, daß sie einen weiteren Wirkstoff mit antigenen Eigenschaften enthält, wobei die Zubereitung geeignet ist, die Bildung vpn Antikörpern gegen den anderen Wirks'toff zu erhöhen.

19· Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß man das Glycopeptid und den pharmazeutisch verträglichen Träger zusammenbringt, die Zubereitung steril und mit dem Blut des Säugers oder des Vogels dem die Zubereitung verabfolgt werden soll, isotonisch macht.

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