DE69633233T2

DE69633233T2 - Multivalenter impstoff gegen bovines coronavirus und methode zur behandlung einer infektion mit bovinem coronavirus

Info

Publication number: DE69633233T2
Application number: DE1996633233
Authority: DE
Inventors: Sanjay Kapil
Original assignee: Kansas State University
Current assignee: Kansas State University
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: US5916570A; CA2224309C; ES2224172T3; WO1996041874A1; EP0833903B1; ATE274579T1; DK0833903T3; AU705186B2; CA2224309A1; PT833903E; AU6383296A; EP0833903A1; DE69633233D1; EP0833903A4

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung ist auf modifizierte Lebendimpfstoffe zur Verabreichung an Rinder (insbesondere neugeborene Kälber) gerichtet, um die Rinder gegen Infektionen (enterisch und respiratorisch) durch virulente Wildtyp-Rinder-Coronaviren zu immunisieren. Die Impfstoffe hiervon enthalten wenig passagierte Rinder-Coronaviren, welche aus der Gruppe bestehend aus Rinder-Coronaviren vom Typ II und Typ III und Mischungen davon ausgewählte werden, und können auch das bekannte Rinder-Coronavirus vom Typ I enthalten. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Behandlung von Rindern mit Hygromycin B in ausreichenden Mengen, um das Ausscheiden von Hygromycin B-empfindlichen Rinder-Coronaviren in die Fäzes der Rinder zu unterdrücken.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Das Rinder-Coronavirus (BCV) ist eine bedeutende Ursache von Enterocolitis und Atemwegsinfektionen bei Kälbern und erwachsenen Rindern. In einigen Fällen werden die Erkrankungen als Kälberdiarrhoe, Kälberdurchfall ("calf scours") oder Kälberenteritis und als Winter-Dysenterie bei erwachsenen Rindern bezeichnet. Bislang ist nur ein Serotyp von BCV beschrieben worden und modifizierte Lebendvirusimpfstoffe sind durch intensives Passagieren des virulenten Virus hergestellt worden. Solche Impfstoffe werden in den U.S.-Patenten mit den Nr. 3,839,556, 3,838,004 und 3,869,547 beschrieben.
Es haben sich jedoch in den letzten Jahren die bekannten Impfstoffe als klinisch unwirksam gegen viele Wildtyp-BCV-Infektionen erwiesen, und es wird angenommen, dass solche Infektionen tatsächlich ein breites Spektrum von Krankheitssyndromen verursachen.
Ein anderes Problem, das mit Rinder-Coronavirus-Infektionen untrennbar verbunden ist, ist das Fehlen einer wirksamen Behandlung der Rinder nach einer Infektion. Ein primärer Träger für die Ausbreitung von solchen Infektionen resultiert aus dem Ausscheiden von virulenten BCV in den Fäzes von infizierten Tieren. Bislang gibt es keine mitgeteilte Behandlung für infizierte Rinder, die ein solches Ausscheiden unterdrücken oder beseitigen würde.
Es gibt dementsprechend in diesem Fachgebiet einen wirklichen und nicht-befriedigten Bedarf für neue Behandlungsmodalitäten für Rinder, bei denen das Risiko einer BCV-Infektion besteht, sowohl in Bezug auf einen wirkungsvolleren anti-BCV-Impfstoff als auch auf eine Behandlung zur Unterdrückung der BCV-Ausscheidung durch infizierte Rinder.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung überwindet die oben dargelegten Probleme und stellt neue modifizierte BCV-Lebendimpfstoffe für Rinder bereit, die verglichen mit bestehenden Impfstoffen eine breitere Immunität gegen virulente Wildtyp-BCV verleihen. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung von neuen, hinsichtlich der Antigene unterschiedlichen Isolaten von BCV, die als Rinder-Coronaviren vom Typ II und Typ III bezeichnet werden. Diese Typ II- und Typ III-Coronaviren werden vorzugsweise bis zu ungefähr zehnmal in Zellkultur, welche die Vermehrung des Virus unterstützt, passagiert, um modifizierte Lebendimpfstoffe herzustellen. Eine übermäßige Zellkulturpassagierung der Coronaviren sollte vermieden werden. Die Typ II- und Typ III-BCV können individuell als monovalente Impfstoffe verwendet werden. Mehr bevorzugt wird ein multivalenter Impfstoff bereitgestellt, welcher wenigstens die Typ II- und Typ III-BCV umfasst, und ein solcher Impfstoff kann auch das herkömmliche Typ I-BCV (wie jenes, das bei der ATCC unter der Aufnahmenummer VR-874 hinterlegt worden ist) enthalten.
Wie hier verwendet, werden BCV-Isolate vom Typ I, Typ II und Typ III definiert anhand der Verdünnungsinhibitionstiter, welche in einem Einweg-Hämagglutinationsinhibitions (HI)-Assay bestimmt werden. D. h., unter Verwendung dieses Assays weist Typ I-BCV einen Verdünnungsinhibitionstiter im Bereich von 1 : 512–1 : 4096 auf; Typ II-BCV hat einen Verdünnungsinhibitionstiter von 1 : 32–1 : 256 und Typ III hat einen Inhibitionsverdünnungstiter von 1 : 16 oder weniger. Die Assayprozedur, welche bei der Bestimmung der korrekten Verdünnungsinhibitionstiterdaten zur Bestimmung eines Isolattyps verwendet werden muss, wird in Beispiel 1 vollständig beschrieben.
In bevorzugten Formen enthält jede Dosis der modifizierten Lebendimpfstoffe der Erfindung ungefähr 10⁴ bis ungefähr 10⁸ Plaque-bildende Einheiten (PFU) von Rinder-Coronaviren, am meisten bevorzugt ungefähr 10⁶ PFU. Bei der Verwendung werden die modifizierten Lebendviren der Erfindung an Kälber, typischerweise durch oral-nasale Inokulation verabreicht. Es wird angenommen, dass die wirkungsvollste Behandlung eine Verabreichung des Impfstoffs an neugeborene Kälber unmittelbar nach der Geburt wenigstens zwei Stunden vor dem Füttern mit Kolostrum darstellt.
Bezüglich eines anderen Aspekts der Erfindung ist festgestellt worden, dass Hygromycin B, ein bekannter Futterzusatzstoff für Schweine- und Geflügelfutter, an Rinder verabreicht werden kann als eine Behandlung für chronische BCV-Infektionen bei Kälbern und erwachsenen Rindern. Die Verabreichung von Hygromycin B dient dazu, das Ausscheiden von Hygromycin B-empfindlichen BCV in den Fäzes von Rindern zu unterdrücken oder zu beseitigen, wodurch eine primäre Infektionsquelle minimiert wird. Typischerweise wird Hygromycin B einfach mit dem Kälber- oder Rinderfut ter in Mengen, um wenigstens das Ausscheiden von Hygromycin B-empfindlichen BCV in den Fäzes zu unterdrücken, verfüttert. Eine geeignete Dosierung von Hygromycin B würde ungefähr 6–9 g Arzneimittel pro Tonne Rinderfutter betragen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung von Hygromycin B auf die Virusreplikation von Rinder-Coronaviren in Zellkultur, wie in Beispiel 4 beschrieben, darlegt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die folgenden Beispiele beschreiben die Isolierung und Charakterisierung von neuen BCV-Isolaten gemäß der Erfindung und beschreiben darüber hinaus eine Weise zur Verwendung davon. Es versteht sich, dass diese Beispiele nur zur Veranschaulichung aufgeführt werden, und dass nichts darin als eine Beschränkung hinsichtlich des gesamten Umfangs der Erfindung aufgefasst werden soll.
Beispiel I
Hämagglutinationsassay (HA)/Einweg-Hämagglutinationsinhibitions (HI)-Assay unter Verwendung von 25 hinsichtlich Rinder-Coronaviren positiven Fäzes-Suspensionen
Wisconsin-Proben
Es wurden insgesamt 20 Rinderfäzes-Proben vom The Wisconsin Animal Health Laboratory, Madison, WI, erhalten. Es ist durch direkte Elektronenmikroskopie zuvor bestimmt worden, dass jede von diesen Proben Rinder-Coronaviren enthielt, aber frei von anderen bekannten Rinder-Viren war. Jede Probe wurde 1 : 10 (Vol./Vol.) mit Calcium- und Magnesiumionen-freiem PBS (CMF-PBS, pH 7,2) verdünnt.
Jede Probe wurde dann bei 3000 Upm 10 min zentrifugiert und der klare Überstand wurde abpipettiert und aufgehoben. Jeder Überstand wurde dann durch einen 0,45 μm Spritzenfilter mit geringer Proteinabsorption filtriert. Das Filtrat von jeder Probe wurde dann nachfolgend dem Assay unterzogen.
Der erste Assayschritt bestand darin, die Anzahl von HAU (Hämagglutinationseinheiten) in jeder Probe zu bestimmen. Speziell wurde der BCV-Titer in jeder Probe bestimmt unter Verwendung von Mäuse-Erythrozyten, welche in einem Anteil von 0,5% (Vol./Vol.) in PBS, pH 7,2 und enthaltend 0,1 Gew.-% BSA Fraktion V, suspendiert worden waren. Als erstes wurden aufeinanderfolgende 2-fache Verdünnungen (von 2- bis 4096-fach) von jeder Coronavirus-Filtratprobe unter Verwendung der PBS/BSA-Lösung hergestellt. Dann wurden fünfundzwanzig Mikroliter von jeder Verdünnung in individuelle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und V-Boden gegeben, gefolgt von der Zugabe von zusätzlichen 25 μl der PBS/BSA-Lösung in jede Vertiefung. Als Nächstes wurden 25 μl der Mäuse-Erythrozyten-Suspension zu jeder Vertiefung hinzugesetzt. Danach wurden die Seitenwände der Platte 4–5-mal angestoßen, um das Mischen der flüssigen Fraktionen in jeder Vertiefung sicherzustellen. Die Platte wurde dann abgedeckt und bei 10°C 90 min aufbewahrt. Die Platte wurde dann auf ein mit Spiegeln ausgestattetes Betrachtungsgerät gesetzt. Jede Vertiefung wurde dann visuell untersucht, um den Hämagglutinationsendpunkt-Titer für jede Filtratprobe zu bestimmen.
Diese Titerdaten wurden verwendet, um das Verdünnungsausmaß zu bestimmen, welches erforderlich ist, um für jede Probe eine Konzentration von ungefähr 4–8 HAU/25 μl Filtratprobe zu erzielen. Diese Verdünnungen wurden in individuellen Eppendorf-Reaktionsgefäßen unter Verwendung der PBS/BSA-Lösung ausgeführt.
Jede standardisierte Probe wurde dann einem Hämagglutinationsinhibitions (HI)-Assay unterzogen. Dieser Assay wird grundlegend von Sato et al., "Hemagglutination by Calf Diarrhea Coronavirus", Vet. Microbiology, 2 (1977), 83–87, beschrieben. Der Assay, der im Rahmen der Erfindung verwendet wurde als ein Weg, um zu bestimmen, ob ein gegebenes BCV ein Typ I-, Typ II- oder Typ III-Virus ist, ist sehr ähnlich zu jenem, der von Sato et al. beschrieben worden ist. Der in Verbindung mit der Erfindung verwendete HI-Assay verwendet insbesondere ein anti-BCV-Serum, wie das Standard-Hyperimmun-anti-BCV-Serum, welches vom National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA, erhalten wird. Ein übliches Serum, das von dieser Quelle erhalten wird, ist die Charge mit der Nummer 320BDV8801. Das Serum wurde zuerst verdünnt (0,2 ml Serum in 0,5 ml PBS) und durch Erwärmen auf 56°C und Halten dieser Temperatur für 30 min hitzeinaktiviert. Als nächstes wurde das inaktivierte Serum durch die Zugabe von Kaolin (0,4 ml einer 25%-igen Kaolinzubereitung) behandelt, gefolgt von einer Zentrifugation (15000 g für 1 min). Der Überstand wurde dann mit 0,2 ml gepackten Mäuse-Erythrozyten pro ml Überstand gemischt. Das behandelte Serum wurde dann 1 h bei 37°C gehalten. Danach wurde das behandelte Serum zentrifugiert (15000 g für 1 min) und der Überstand wurde in dem HI-Assay verwendet.
Dann wurden ansteigende zweifache Verdünnungen des Überstands des behandelten Serums hergestellt und 25 μl von jeder Verdünnung wurden in individuelle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und V-Boden gegeben. Fünfundzwanzig μl von jeder der standardisierten Filtratproben wurden dann zu jeder Vertiefung hinzugesetzt, gefolgt von Anstoßen und Mischen. Die Platte wurde dann 1 h bei 37°C inkubiert. An diesem Punkt wurden 25 μl der zuvor beschriebenen Mäuse-Erythrozyten-Suspension zu jeder Vertiefung hinzugesetzt, gefolgt von Anstoßen und Mischen. Es wurde eine zweite Inkubation bei 10°C für 90 min ausgeführt.
Nach dem Abschluss der zweiten Inkubation wurde die Platte visuell untersucht, um das Ausmaß der Inhibition der hämagglutinierenden Aktivität von jedem Virus durch die Serumantikörper zu bestimmen. Eine vollständige Inhibition wird durch die Bildung eines kleinen "Knopfes" im Zentrum der Vertiefungen nachgewiesen. Fehlende Inhibition wird durch eine Mattierung am Boden der Vertiefungen angezeigt.
Von den 20 Ausgangsproben wurden nur vier vollständig durch das behandelte Serum inhibiert, und es wurde geschlossen, dass diese Proben das bekannte BCV-Virus vom Typ I (WI-1.SK) enthielten. Acht Ausgangsproben wurden nicht inhibiert, zwei wurden bis zu einer 1 : 2-Verdünnung inhibiert und zwei wurden bis zu einer 1 : 4-Verdünnung inhibiert, zwei wurden bis zu einer 1 : 6-Verdünnung inhibiert und eine wurde bis zu einer 1 : 16-Verdünnung inhibiert. Diese 15 Proben waren dementsprechend BCV-Typ III-Virus. Eine einzige Probe wurde bis zu einer 1 : 128-Verdünnung inhibiert und es wurde angenommen, dass diese Probe BCV-Typ II-Virus enthielt.
Dieses Experiment zeigte, dass nur eine geringe Anzahl der Ausgangsproben den Typ I-Stamm enthielt, wohingegen 15 der Proben den Typ III-Stamm enthielten. Dementsprechend würden die bekannten Impfstoffe gegen den Typ I-Stamm keine Immunogenität gegen die Typ III-Stämme verleihen. Es wird postuliert, dass die Typen II und III des BCV-Virus sich ausgehend von dem ursprünglich isolierten Typ I-Virus unter immunologischem Druck entwickelt haben oder sich unabhängig von dem Typ I-Virus entwickelt haben könnten.
Kalifornien-Proben
Sechs Kalifornien-Proben wurden auf genau die gleiche Weise wie die Wisconsin-Proben getestet. Alle sechs der Kalifornien-Proben waren BCV-Typ III.
Beispiel 2
Genetische Reinigung von BCV-Virus-Stämmen und Herstellung von Animpf-Stammlösungen
Zellkulturen wurden mit jedem der 26 BCV enthaltenden Überstände, wie in Beispiel 1 beschrieben, inokuliert.
Speziell enthielt jede Zellkultur humane Rektaltumor (HRT-18)-Zellen, welche von Dr. David Benfield, University of South Dakota, Brookings, SD, erhalten worden waren. Diese Zellen wurden gescreent und waren frei von Mycoplasma sp., Rinder-Virusdiarrhöe-Virus (BVD) und jeglichen verunreinigenden Bakterien. Diese Zellen wurden in 25 cm²-Kolben ausplattiert und bei 37°C inkubiert, bis die Monolayer konfluent wurde (üblicherweise 2–3 Tage). Jede Monolayer wurde dann schnell mit CMF-PBS, welches 5 μg/ml Trypsin enthielt, gewaschen. 0,2 ml von jedem filtrierten und verdünnten Überstand der 26 Proben wurde dann zu einer jeweiligen behandelten Zellkultur hinzugesetzt. Diese Kolben wurden alle 15 Minuten während einer Inkubation bei 37°C für 1 h umgeschwenkt (anfängliche Passage). Danach wurden 4–5 ml MEM (minimales essentielles Medium) zu jedem Kolben hinzugesetzt. Das MEM enthielt 5 μg/ml sowohl von Trypsin als auch von Pancreatin. Jeder Kolben wurde dann bei 37°C für einen Zeitraum von ungefähr 4–5 Tagen weiter inkubiert mit täglicher Beobachtung, um einen zytopathogenen Effekt (CPE) zu bestimmen. Ein CPE wurde entweder durch Ablösung unter Abrundung ("rounding detachment") oder Synzytium-Bildung bestimmt.
Alle der 26 Kolben wurde dann auf drei unterschiedliche Weisen getestet, um die Anwesenheit von BCV zu bestimmen und zu bestätigen. Als erstes wurde jede Zellkultur durch einen direkten Assay mittels fluoreszierender Antikörper unter Verwendung von FITC-markiertem anti-BCV-Konjugat, welches vom National Veterinary Services Laboratory, Ames, IA, geliefert wurde, getestet. Bei der Ausführung des Assays wurde den Anweisungen bezüglich des Konjugats auf dem Etikett gefolgt. Als zweites wurde die Menge von Virus in jeder Zellkultur unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen HA-Assays bestimmt. Als drittes wurde jede Zellkultur auf verunreinigende Rinder-Viren unter Verwendung von direkter Techniken mittels fluoreszierenden Antikörpern überprüft, d. h. jede Kultur war frei von Rinder-Rotaviren, IBR, BVD, Rinder-Adenoviren und Rinder-Reoviren. Von den 26 Zellkulturen wurde bei 14 bestätigt, dass sich in ihnen BCV vermehrt hatte; 8 von diesen Kulturen stammten aus den Wisconsin-Proben und 6 stammten aus Kalifornien.
Die BCV-positiven Proben wurden aus jeder Zellkultur durch drei Einfrier-Auftau-Zyklen, gefolgt von einer Zentrifugation, um die Zellen zu pelletieren, geerntet. Der zellfreie Überstand wird aliquotiert (1 ml) und bei –70°C aufbewahrt.
In dem nächsten Schritt wurden die 14 BCV-Isolate über Plaques gereinigt unter Verwendung der Technik, die in Kapil et al., Plaque Variations in Clinical Isolates of Bovine Coronavirus, J. Vet. Diagn. Invest. 7 (1995) 538–539, beschrieben wurde. Kurz zusammengefasst, wurden HRT-18-Zellen in Kulturschalen mit 6 Vertiefungen ausplattiert und in MEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin, kultiviert. Nach 3–4 Tagen Vermehrung bei 37°C wurden die resultierenden konfluenten Monolayer mit CMF-PBS gewaschen.
Die 14 eingefrorenen, geernteten BCV-Proben wurden unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut und zehnfach in CMF-PBS verdünnt. Einhundert μl von jeder Verdünnung (10^–1 bis 10^–6) wurden dann in jede Vertiefung der Gewebekulturschale gegeben. Die Kulturschalen wurden bei 37°C 1 h inkubiert, wobei alle 15 min umgeschwenkt wurde. Nach der Inkubation wurde jede Vertiefung schnell mit 1 ml CMF-PBS gewaschen. Als nächstes wurden 4 ml MEM, ergänzt mit 1% (Gew./Vol.) Agarose bei 45°C zu jeder Ver tiefung hinzugesetzt. Man ließ die Agarose sich dann in jeder Vertiefung verfestigen, was bei Raumtemperatur üblicherweise 30 min dauerte. Die Gewebekulturplatten wurde dann umgewendet und bis zu drei Tage bei 37°C inkubiert. Die Virus-Plaques erschienen nach ungefähr 2 Tagen Inkubation. Am Ende des Inkubationszeitraums wurde jeder Virus-Plaque einzeln mittels einer Pipette geerntet, es wurden ungefähr 50 μl CMF-PBS zugesetzt und die Plaques wurden bei –70°C eingefroren. Es gab ungefähr 69 resultierende, genetisch reine Plaques.
Ein Plaque pro Virusisolat wurde für Reihenpassagierung und Vermehrung, um ungefähr 2 Liter Virus herzustellen, ausgewählt. Speziell wurden die ausgewählten Plaques aufgetaut, mit 5–10 ml CMF-PBS verdünnt und ungefähr ein halber Milliliter von jeder Verdünnung wurde zu individuellen 150 cm²-Gewebekulturkolben hinzugesetzt. Es folgte eine Inkubation bei 37°C über einen Zeitraum von 3 Tagen. Auf die gleiche Weise wurden vier zusätzliche Passagen ausgeführt, was insgesamt 6 Passagen ergab, nämlich die anfängliche Passage, die Plaque-Reinigung und die vier nachfolgenden Passagen. Am Ende der Passageabfolge lagen für jedes der 14 Isolate ungefähr 25 ml von Passage 6 vor. Um große Volumen von jedem Isolat zu erzeugen, wurde ½ ml von jedem Isolat in einen jeweiligen 150 cm²-Kolben gegeben. Als Passage 7 folgte eine Inkubation bei 37°C und die gesammelten Mengen aus jedem Kolben für jedes Isolat wurden gepoolt. Jedes gepoolte Isolat bildete einen modifizierten Lebendimpfstoff.
Insgesamt wurden 11 monovalente modifizierte Lebendimpfstoffe erfolgreich produziert: zwei sind Typ I-Impfstoffe, einer ist ein Typ II-Impfstoff und acht sind Typ III-Impfstoffe.
Beispiel 3
Verwendung von multivalenten modifizierten Lebendimpfstoffen
Die Typ I-, Typ II- und Typ III-Isolate von Beispiel 2 werden in vivo durch oral-nasale Inokulation von ungefähr ½ ml von jedem Isolat (wobei eine jede derartige Dosis ungefähr 10⁶ PFU BCV enthält) verabreicht. Eine solche Inokulation wird an Kälber mit Kolostrum-Entzug unmittelbar nach der Geburt verabreicht. Diesen Kälbern wird Kolostrum zwei Stunden nach der Geburt gestattet. Die Inokulationen verleihen den Kälbern Immunität zumindest gegen homologe Typen von BCV.
Ein multivalenter Impfstoff wird hergestellt, indem gleiche Mengen von ausgewählten Typ I-, Typ II- und Typ III-BCV-Isolaten, welche in Beispiel II beschrieben worden sind, gemischt werden. Auf die gleiche Weise kann ein multivalenter Impfstoff nur unter Verwendung von Typ II- und Typ III-BCV-Isolaten hergestellt werden, sofern gewünscht. Die Verwendung von solchen multivalenten Impfstoffen erfolgt genau, wie oben beschrieben.
Beispiel 4
Virussuppression unter Verwendung von Hygromycin B
In diesem Beispiel wurde die Wirkung eines Futterzusatz-Arzneimittels, Hygromycin B, auf BCV in Zellkultur getestet. In einem ersten Satz von Experimenten wurden jeweils drei Replikate von individuellen Zellkulturen, welche ein Wisconsin-Isolat (WI-1.SK, ein Typ I-BCV) enthielten, mit variierenden Mengen von Hygromycin B inokuliert und es wurde die Virusvermehrung über die Zeit überwacht.
Jede der Zellkulturen enthielt HRT-18-Zellen, die wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt wurden. Konfluente Monolayer in jeder Kultur wurden dann mit einer Dosis inokuliert, welche ungefähr 32 HAU des WI-1.SK-Isolats zusammen mit ausgewählten Mengen von Hygromycin B, welche von Null (Kontrolle) bis 3 mM Hy gromycin B reichten, enthielt. Jede der Zellkulturen wurde dann bei 37°C für variierende Zeiträume bis zu 90 h inkubiert. Um die Menge von Virus in HAU über die Zeit zu bestimmen, wurden jeweilige Zellkulturen drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterworfen und die zuvor beschriebene HA-Analyse wurde an den Überständen ausgeführt.
Die beigefügte Figur veranschaulicht die Ergebnisse dieses Tests nach 54 und 68 h Inkubation nach der Virusinokulation. Wie ersehen werden kann, zeigten jene Kulturen, die mit wenigstens 0,4 mM Hygromycin B inokuliert worden waren, eine sehr geringe, vernachlässigbare Virusvermehrung; tatsächlich können die Ergebnisse einfach die Wirkung des ursprünglichen Virus sein.
In einem zweiten Satz von Experimenten wurden 36 BCV-Isolate getestet, um ihre Empfindlichkeit gegenüber Hygromycin B zu bestimmen, unter Verwendung des oben beschriebenen Zellkulturassays mit der Ausnahme, dass 1) Doppelassays nicht ausgeführt wurden, 2) jede Kultur entweder kein Hygromycin B (Kontrolle) oder Hygromycin B in einer Konzentration von 0,5 mM enthielt und 3) jede Kultur bei 37°C drei Tage inkubiert wurde. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass Hygromycin B unwirksam ist, die in vitro-Replikation von 4 der 36 getesteten BCV-Isolate, nämlich der MN-9-, MN-29-, MN-30- und MN-36-Isolate, zu hemmen (für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht sich, dass die zweifachen Unterschiede bei den HAU zwischen Zellkulturassays mit und ohne Hygromycin B in diesen vier Tests nicht statistisch signifikant sind). Die Ergebnisse von beiden Sätzen von Hygromycin B-Experimenten zeigen, dass Hygromycin B die BCV-Replikation in vitro hemmt, da das Arzneimittel gegen die meisten getesteten BCV-Isolate wirksam war unabhängig von ihrer Antigenzusammensetzung und ihren Antigenunterschieden. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass das Arzneimittel auch die in vivo-Replikation der Hauptanzahl von BCV-Stämmen unterdrücken wird.

Claims

Isoliertes Rinder-Coronavirus, wobei die hämagglutinierende Aktivität des Rinder-Coronavirus (BCV) in dem Einweg-Mäuse-Erythrozyten-Hämagglutinationsinhibitionsassay von Beispiel I unter Verwendung von Standard-Hyperimmun-anti-BCV-Serum des National Veterinary Service Laboratory bei einem Antikörpertiter im Bereich von ungefähr 1 : 1 bis 1 : 16 vollständig gehemmt wird und bei einem Titer von ungefähr 1 : 32 und höher nicht gehemmt wird.
Impfstoff, umfassend ein Rinder-Coronavirus, wobei die hämagglutinierende Aktivität des Rinder-Coronavirus (BCV) in dem Einweg-Mäuse-Erythrozyten-Hämagglutinationsinhibitionsassay von Beispiel I unter Verwendung von Standard-Hyperimmun-anti-BCV-Serum des National Veterinary Service Laboratory bei einem Antikörpertiter im Bereich von ungefähr 1 : 1 bis 1 : 16 vollständig gehemmt wird und bei einem Titer von ungefähr 1 : 32 und höher nicht gehemmt wird.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei eine Dosis des Impfstoffs 10⁴ bis 10⁸ PFU enthält.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das Virus bis zu zehnmal in einer Zellkultur, welche die Vermehrung des Virus unterstützt, passagiert worden ist.
Verwendung eines isolierten Rinder-Coronavirus, wobei die hämagglutinierende Aktivität des Rinder-Coronavirus (BCV) in dem Einweg-Mäuse-Erythrozyten-Hämagglutinationsinhibitionsassay von Beispiel I unter Verwendung von Standard-Hyperimmun-anti-BCV-Serum des National Veterinary Service Laboratory bei einem Antikörpertiter im Bereich von ungefähr 1 : 1 bis 1 : 16 vollständig ge hemmt wird und bei einem Titer von ungefähr 1 : 32 und höher nicht gehemmt wird, zur Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung eines Kalbs gegen eine Infektion durch ein Rinder-Coronavirus.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei eine Dosis des Impfstoffs 10⁴ bis 10⁸ PFU enthält.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Impfstoff zur oralen oder nasalen Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Kalb unter Kolostrum-Entzug steht.
Verwendung nach Anspruch 5, umfassend die Verwendung einer ausreichenden Menge von Hygromycin B, um das Ausscheiden von Rinder-Coronaviren in die Fäzes des Kalbs zu unterdrücken.