DE68925660T2

DE68925660T2 - Peptidfragmente von HIV

Info

Publication number: DE68925660T2
Application number: DE68925660T
Authority: DE
Inventors: Andrew James Mcmichael; Douglas Fraser Nixon; Alain Robert Michael Townsend
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1996-09-26
Anticipated expiration: 2009-06-03
Also published as: GB2220939B; EP0346022B1; DE346022T1; DE68925660D1; GB8912651D0; US5459238A; US5683701A; GB2220939A; JPH0236198A; EP0346022A1; HK141594A; ATE134195T1

Description

Die Erfindung betrifft Peptidfragmente von HIV (menschliches Immundefizienzvirus) und ihre Verwendung in einem potentiellen Impfstoff gegen AIDS (Syndrom der erworbenen Immunschwäche) und zur Diagnose und Therapie.

Hintergrund der Erfindung

Im Stand der Technik (Walker et al., Nature 328 (1987), 345-348) ist bekannt, daß Antworten cytotoxischer T-Lymphocyten (CTL) auf das Hüliprotein (env) von HIV in Menschen erzeugt werden können. Die gleichen Autoren nahmen an, daß einige zelluläre Antworten auf das Gruppenassoziations-Antigen (gag) von HIV in infizierten Individuen ebenfalls vorhanden waren, konnten jedoch nicht nachweisen, daß irgendwelche dieser Antworten durch CTLs vermittelt wurden.
Takahashi et al. (PNAS USA 85 (1988), 3105-3109) konnten ein Peptidfragment von env identifizieren, das als ein immundominantes Epitop in Mäusen des H-2d-Haplotyps wirkte. Eine CTL-Antwort dieser Mäuse auf das Epitop wurde nachgewiesen, und die Autoren nahmen an, daß das Epitop auch in Menschen als Epitop wirken kann, obwohl kein Beweis zur Stützung dieser Annahme vorgelegt wurde.
Insgesamt war wenig über CTL-Antworten auf HIV in Menschen bekannt, besonders im Zusammenhang mit angeblichen Antworten auf das gag-Protein.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein erster erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines in vitro-Verfahrens zur Stimulierung HIV-spezifischer cytotoxischer T-Lymphocyten (CTL), umfassend den Erhalt peripherer mononudeärer Blutzellen (PBMC) von einem Individuum, das HIV-seropositiv ist, die Inkubation einer Fraktion der PBMC mit Phytohämagglutinin für einen Zeitraum, der ausreichend ist zur Aktivierung der CTL und dabei zur Produktion aktivierter PBMC, das Waschen der aktivierten PBMC und die gemeinsame Züchtung der aktivierten PBMC mit einer zweiten, unstimulierten Fraktion der PBMC für einen Zeitraum, der zur Produktion gezüchteter, CTL-enthaltender PBMC ausreichend ist.
Mit diesem Verfahren konnten CTL erstaunlich wirksam erzeugt werden.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zum Absuchen eines Peptids nach einem HIV-spezifischen CTL-Epitop, umfassend: den Erhalt von PBMC von einem Individuum, das HIV-seropositiv ist; die Inkubation einer Fraktion der PBMC mit Phytohämagglutinin für einen Zeitraum, der ausreichend ist zur Aktivierung der CTL und dabei zur Produktion aktivierter PBMC; das Waschen der aktivierten PBMC; die gemeinsame Züchtung der aktivierten PBMC mit einer zweiten Fraktion von unstimulierten PBMC für einen Zeitraum, der zur Produktion gezüchteter, CTL-enthaltender PBMC ausreichend ist; die Inlaibation der gezüchteten PBMC mit markierten autologen Zielzellen oder lymphoblastoiden B- Zellen, die auf einen menschlichen Leukocytenantigen (HLA)-Typ und das Peptid abgestimmt sind; und die Bestimmung der Menge an freigesetztem Marker und die dadurch bedingte Identifizierung eines HIV-spezifischen CTL-Epitops.
Ein dritter Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Peptids, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren identifiziert werden kann, wobei es die Aminosäuresequenz eines Fragments des gag-Proteins von HIV hat, das mit einem bestimmten HLA-Klasse 1-Molekül unter Stimulierung der CTL-Immunität spezifisch interagiert.
Ein solches Peptid weist die Sequenz NH&sub2;-Lysin-Arginin-Tryptophan- Isoleucin-Isoleucin-Leucin-Glycin-Leucin-Asparagin-Lysin-Isoleucin-Valin-Arginin- Methionin-Tyrosin-Cystein-COOH auf, die vom gag (Gruppenassoziations-Antigen)- p24-Protein von HIV (d. h., einem der internen Kernproteine) zwischen den Resten 263 und 277 stammt. Das Carboxy-terminale Cystein ist nicht Teil der gag-Sequenz und wird zur Erleichterung der chemischen Kopplungsreaktionen zugesetzt. Dieses Peptid interagiert spezifisch mit HLA B27, und Individuen mit HLA B27 (etwa 7% der kaukasischen Bevölkerung) antworten auf das Peptid, was eine Produktion von gag- und HLA B27-spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) und eine Lyse von HIV-infizierten Zellen bewirkt.
Andere Peptide interagieren spezifisch mit anderen HLA-Molekülen und zeigen auch bei Individuen mit dem relevanten HLA-Molekül ein entsprechendes Verhalten.
Es wurde erläutert, daß Virusproteine wie gag den T-Zellen als abgebaute Peptidfragmente (etwa 15 Aminosäuren), die an größere HLA-Klasse 1-Moleküle gebunden sind, auf der Obertläche von infizierten Zellen präsentiert werden. Unterschiedliche Peptidbereiche (Epitope) werden erkannt und interagieren spezifisch mit unterschiedlichen HLA-Klasse 1-Molekülen. CTL erkennen nur Zielzellen, die HLA-Klasse 1-Moleküle aufweisen, d. h., die T-Zellen erkennen eine Kombination von Virusantigen plus eigenem HLA. Es gibt wahrscheinlich etwa 120 unterschiedliche HLA-Klasse I-Moleküle, und jeder einzelne Mensch besitzt eine begrenzte Auswahl und antwortet daher nur auf bestimmte Epitope.
Epitope, die mit unterschiedlichem HLA erkannt werden, können auf bekannte Weise identifiziert und isoliert oder unter Verwendung von bekannten Verfahren durch Proteinsynthese hergestellt werden.
Erfindungsgemäße Peptide können als Basis eines Impfstoffs gegen AIDS verwendet werden, indem die Produktion von CTL, die auf das jeweilige HLA antworten, stimuliert und so die CTL-Antwort induziert wird.
Ein weiterer efflndungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines AIDS-Impfstoffs, der ein Peptid umfaßt, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren identifiziert werden kann, wobei es die Aminosäuresequenz eines Fragments des gag-Proteins von HIV aufweist, das mit einem bestimmten menschlichen Leukozytenantigen (HLA)-Klasse 1-Molekül unter Stimulierung der CTL-Immunität spezifisch interagiert.
Der Impfstoff umfaßt vorzugsweise ein Peptid, das mit einem relativ üblichen HLA-Klasse 1-Molekül interagiert, wie HLA A2, das in etwa 40 % der Bevölkerung festgestellt wird, oder HLA A1, A3, B7 oder B44, von denen jedes in etwa 10 % der Bevölkerung gefünden wird.
Der Impfstoff kann mehr als ein Peptid umfassen und umfaßt zur Erhöhung der Wirksamkeit vorzugsweise Peptide, die mit einigen der stärker verbreiteten HLA- Klasse I-Molekülen reagieren. Ein Impfstoff, der Peptide aufweist, die mit HLA Al, A2, A3, B7 und B44 reagieren, stimuliert beispielsweise CTL-Antworten in etwa 90 % der Bevölkerung: die verbleibenden 10 % konnten durch Gruppenimmunität geschützt werden.
Der Impfstoff kann unterschiedliche Formen aufweisen. Der Impfstoff kann beispielsweise ein Peptid oder ein Gemisch von Peptiden umfassen, die in gelöster Form, nach Absorption auf unlöslichem Material oder in Form eines Gemisches mit einem Adjuvans verabreicht werden. Die Aminosäuresequenz des Peptids kann alternativ zur Konstruktion von synthetischen oder Fusions-Proteinen, die die relevanten Peptidepitope enthalten, durch bekannte DNA-Rekombinationsverfahren verwendet werden. Diese Proteine können in Form einer Lösung, nach Absorption auf unlöslichem Material oder in Form eines Gemisches mit einem Adjuvans verwendet werden. Alternativ kann die Sequenzinformation verwendet werden, um unter Verwendung bekannter Verfahren rekombinante Mikroorganismen zu konstruieren, die die jeweiligen Sequenzen als eigene Proteine exprimieren. Beispiele dafür sind rekombinante Vacciniaviren, rekombinante Poliomyelitisviren, rekombinante BCG, rekombinante Salmonellen und rekombinantes Adenovirus.
Die Sequenzinformation kann ferner zur Konstruktion von Peptidanalogen oder anderen Chemikalien verwendet werden, die mit den jeweiligen HLA-Molekülen oder T-Zellrezeptoren interagieren, z. B. daran binden, und diese Form der Immunantwort stören oder stimulieren. Eine Hemmung dieser Art von Immunität kann wichtig sein, wenn diese Immunantwort im Zusammenhang mit jeglicher HIV-verursachten Pathologie nachteilig ist. In einem solchen Fall ist es wichtig, das Niveau dieser Art von T-Zellimmunität in HIV-seropositiven Individuen zu regulieren, um einen Ausgleich zwischen vorteilhaften und nachteiligen Wirküngen zu erreichen. Eine Stimulierung durch solche Wirkstoffe kann ein alternativer Weg zur Induzierung einer Immunantwort in seronegativen Individuen sein.
Das Verfahren zum Absuchen eines Peptids nach einem erfindungsgemäßen HIV-spezifischen CTL-Epitop kann auch zu Diagnosezwecken verwendet werden. Insbesondere wurde festgestellt, daß zur Identifizierung einer T-Lymphocyten-Antwort ein Peptid, von dem bekannt ist, daß es ein solches Bpitop umfaßt, in einem relativ einfachen Test verwendet werden kann. Kurz gesagt werden frische periphere mononucleäre Blutzellen (oder aus Biopsymaterial erhaltene Lymphocyten) hergestellt und in Verhältnissen von 50:1, 25:1 und 10:1 zu 10&sup4; &sup5;¹chrom-markierten lymphoblastoiden B-Zellen, die auf das relevante HLA-Molekül abgestimmt sind, zugesetzt. Der HLA- Typ des Patienten wird in bekannter Weise durch Gewebetypisierung bestimmt, und die lymphoblastoiden B-Zellen werden von einem Spender mit bekanntem HLA-Typ (erneut in bekannter Weise durch Gewebetypisierung ermittelt) erhalten und unter Verwendung von bekannten Verfahren mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert. Ein erfindungsgemäßes Peptid, das mit dem relevanten HLA-Molekül interagiert, wird den Zellen in einer Konzentration von 10 bis 100 µmolar ebenfalls zugesetzt. Nach einer Inkubation von 4 Stunden wird der Überstand entfernt und das freigesetzte &sup5;¹chrom gemessen. Das freigesetzte &sup5;¹chrom wird mit dem durch Inkubation von markierten Zellen in Detergens freigesetzten Chrom als Maximalwert und mit dem durch in Medium allein inkubierte markierte Zellen freigesetzten Chrom als Minimalwert verglichen. Wenn eine Lyse (bei der definitionsgemäß mindestens die doppelte Menge des Minimalwerts an &sup5;¹Chrom freigesetzt wird) beobachtet wird, bedeutet dies, daß es cytotoxische T- Lymphocyten unter den mononudeären Zellen des Patienten gibt und diese wahrscheinlich eine Infektion mit HIV anzeigen.
Ein derartiger Test zusammen mit Antikörpermessungen kann auch für Messungen der allgemeinen Immunantwort auf HIV und zu Prognosen verwendet werden. Diese Vorgehensweise kann ein sehr einfaches Verfahren sein, das zur Messung der zellvermittelten Immunität in HIV-seropositiven Patienten verwendet werden kann. Das Verfahren kann auch automatisiert werden.
Durch einen Vergleich der Menge an freigesetztem Marker mit bekannten Standards kann ein Hinweis auf den Grad der Lyse und damit auf die Wahrscheinlichkeit einer Infektion mit HIV erhalten werden.
Das in vitro-Verfahren zur erfindungsgemäßen Stimulierung von HIV-spezifischen CTLs kann potentiell zur Therapie verwendet werden. Das Verfahren umfaßt eine Exponierung von gezüchteten peripheren mononudeären Blutzellen, die cytotoxische T- Lymphocyten enthalten, gegen autologe Zellen, mononudeäre Zellen oder lymphoblastoide B-Zellinien, die eine Stunde mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Peptid bei etwa 10 bis 100 µg/ml behandelt, anschließend in Gewebekülturmedium gewaschen und mit 3 000 rad bestrahlt worden waren. Die Zellen werden anschließend in Gegenwart von 10 Einheitenlml Interleukin-2 gezüchtet. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Zellinien von Peptid-spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten gezüchtet und diese Linien auf bis zu 108 Zellen vermehrt. Diese vermehrten Linien von cytotoxischen T- Lymphocyten wurden zur Behandlung von Patienten durch Reinfüsion verwendet.
Vorläufige Daten zeigen, daß Patienten mit AIDS oder dem AIDS-verwandten Komplex niedrige Niveaus einer cytotoxischen T-Zellaktivität zeigen, während die mit HIV infizierten, jedoch gesunden Patienten hohe Niveaus zeigen. Das Immunschwäche-Syndrom kann daher zum Teil das Ergebnis einer gehemmten Aktivität von cytotoxischen T-Zellen sein. Man würde daher vorschlagen, autologe cytotoxische T-Zellen, die in vitro auf mit synthetischem Peptid behandelten Zellen gezüchtet wurden, zu reinfündieren. Anfänglich wurden Patienten, die zuvor eine hohe cytotoxische T-Zellaktivität aufwiesen, in einem Stadium behandelt, in dem die Menge dieser Zellen abnimmt. Die cytotoxischen T-Zellen stammen vorzugsweise von Lymphocyten, die Patienten in einem früheren Stadium entnommen werden. Die Lymphocyten können in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden, bis sie zur Herstellung der cytotoxischen T- Zellinie verwendet werden.
Das Peptidepitop von HIV-gag-p24, das auf HLA B27 beschränkt ist, erwies sich bei unterschiedlichen Stämmen von HIV 1 und 2 als ziemlich konserviert, und es wurde festgestellt, daß die cytotoxischen T-Lymphocyten von einem mit HIV 1 infizierten Patienten mit der HIV 2-Peptidsequenz kreuzreagierten. Dies bedeutet, daß dieses Peptid und andere Peptidepitope von ähnlich konservierten Teilen des Virus zur Stimulierung eines Schutzes sowohl gegen HIV 1 als auch HIV 2 in Impfstoffen und ferner zur Diagnose und Therapie von mit HIV 1 und/oder HIV 2 infizierten Patienten verwendet werden können. Es wird angenommen, daß mindestens 50 % solcher Epitope auf diese Art konserviert sind.
Die Erfindung wird im nachstehend beschriebenen Beispiel näher erläutert.

Beispiel

Es wurde an dem Peptid mit der Sequenz NH&sub2;-Lysin-Arginin-Tryptophan- Isoleucin-Isoleucin-Leucin-Glycin-Leucin-Asparagin-Lysin-Isoleucin-Valin-Arginin- Methionin-Tyrosin-Cystein-COOH gearbeitet. Das Peptid stammt vom gag-p24-Protein von HIV zwischen den Resten 263 und 277. Das Carboxy-terminale Cystein ist kein Teil der HIV-gag-Sequenz und wurde zur Erleichterung von chemischen Kupplungsreaktionen angefügt. Es kann in der Zukunft möglich sein, dieses Peptid noch genauer zu definieren, wobei ein Optimum von 10 bis 12 Aminosäuren ermittelt wird.
Ein Verfahren zur Stimulierung der im peripheren Blut zirkulierenden Vorläufer von cytotoxischen T-Lymphocyten zur Weiterentwicklung in aktive cytotoxische T-Lymphocyten, die in vitro für HIV spezifisch sind, wurde erarbeitet. Dies wird nachstehend genauer beschrieben, umfaßt jedoch kurz gesagt eine 24-stündige Stimulierung einer kleinen Fraktion der peripheren Blutlymphocyten mit dem Mitogen Phytohämagglutinin (PHA) und anschließende Zugabe dieser Zellen zu den verbliebenen Lymphocyten. Die PHA-Aktivierung bewirkt wahrscheinlich eine Aktivierung des HIV- Genoms, so daß HIV-Virus-Proteine synthetisiert werden. Nach einer siebentägigen Züchtung kann die Aktivität von cytotoxischen T-Lymphocyten gemessen werden, indem autologe Zielzellen (Epstein-Barr-Virus transformierte lymphoblastoide B- Zellinien), die mit einzelne HIV-Proteine exprimierenden rekombinanten Vacciniaviren infiziert sind, abgetötet werden.
Es wurde gezeigt, daß 70 bis 80% von HIV-seropositiven Spendern eine Antwort von cytotoxischen T-Lymphocyten auf das durch das rekombinante Vacciniavirus exprimierte gag-Protein liefern. Diese Antwort der cytotoxischen T- Lymphocyten wird durch HLA beschränkt, was bedeutet, daß nur die von nicht-verwandten Individuen erhaltenen Zielzellen lysiert werden, die HLA-Klasse 1-Antigene mit der antwortenden T-Zelle teilen. Diese cytotoxischen T-Lymphocyten konnten mit dem T-Zell-Wachstumsfaktor, der das Lymphokin Interleukin-2 enthält, bis zu vier Wochen gezüchtet werden.
Nach der Herstellung dieser HIV-gag-spezifischen cytotoxischen T-Zellinien konnte getestet werden, ob sie autologe Zielzellen in Gegenwart von kurzen (bis zu 20 Aminosäuren) synthetischen Peptiden lysieren konnten, die auf der HIV-gag-Sequenz basieren. Bisherige Arbeiten zeigten, daß Virusproteine wie gag den T-Zellen als abgebaute Peptidfragmente, die an HLA-Klasse I-Moleküle gebunden waren, auf der Oberfläche von infizierten Zellen präsentiert werden. Nach den bisher gefündenen und veröffentlichten Grundsätzen (Townsend et al., Cell 44 (1986), 959-968, McMichael et al., J. Exp. Med. 164 (1986), 1397-1406, und Gotch et al., Nature 326 (1987), 881- 882) wurden die cytotoxischen T-Lymphocyten, die nicht-infizierten Zielzellen und alle synthetischen Peptide zu einer Endkonzentration von 10 µg/ml vermischt. In Gegenwart des richtigen Peptids wurden die Zielzellen lysiert, und das gag-Peptid 263-277 wurde durch die für gag und HLA B27 spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt. Es wurde zuvor für das Influenzavirus gezeigt, daß es unterschiedliche Peptidbereiche (Epitope) gibt, die gemäß dem beteiligten HLA-Klasse I-Molekül erkannt werden. Für HIV wurde das vorstehend beschriebene Peptid definiert, das mit dem HLA-Antigen B27 assoziiert ist. Aufgrund unserer bisherigen Arbeit mit dem Influenzavirus wird angenommen, daß alle oder die meisten auf HIV antwortenden Individuen mit HLA B27 dieses bestimmte Peptid erkennen.
Dieses Verfahren zum Auffinden von Epitopen kann zur Suche nach weiteren Epitopen, die mit anderen HLA-Klasse I-Molekülen assozueren, verwendet werden. Das gleiche Prinzip gilt für jedes andere HIV-Protein.

Herstellung von peripheren Blutlymphocvten und Induzierung von HIV-spezifischen CTL

40 ml Venenblut von HIV-seropositiven Spendern wurden Heparin-enthaltenden Behältern (100 µl mit 100 Einheiten/ml Heparin ohne Konservierungsmittel) zugesetzt und in Abwesenheit von Serum mit RPMI 1640-Gewebekülturmedium (Gibco), dem 100 Einheiten/ml Penicillin und 200 µg/ml Streptomycin zugesetzt wurden, 2:1 verdünnt.
5 ml Lymphocyten-Trennmedium (LSM, Flow Laboratories) wurden sorgfältig unter 15 ml Blut/Mediumgemisch in einem sterilen 25 ml-Plastik-Universalbehälter geschichtet. Das Röhrchen wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 1200 Upm zentritugiert, worauf hin periphere mononudeäre Blutzellen (PBMC) aus der Interphase entfernt wurden. Die PBMC wurden zweimal mit RPMI 1640 gewaschen, anschließend in 8 ml RPMI 1640 + 10 % fötalem Kälberserum ("R10") resuspendiert und gezählt. 1/8 der PBMC wurden in 50 ml Kolben (Falcon), denen R10 zugesetzt wurde, bis zu einer Konzentration von 1,5 x 10&sup6; Zellen/ml inkübiert. Phytohämagglutinin (PHA - Wellcome Diagnostics) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1/200 (2 µg/ml) zugesetzt. Diese Zellen wurden 24 Stunden bei 37ºC in 5 % CO&sub2; in Luft irikubiert. Die restlichen 7/8 der PBMC wurden bei 37ºC bis zu einer Konzentration von 1,5 x 10&sup6;/ml in R10 in 5 % CO&sub2;/Luft in einem 50 ml Gewebekulturkolben gezüchtet.
Nach 24 Stunden wurden die PHA-stimulierten Zellen zweimal in R10 gewaschen, in RiO mit 1,0 x 10&sup6;/ml resuspendiert und den unstimulierten Zellen zugesetzt. Die Kulturen blieben sieben Tage vor der Verwendung im cytotoxischen T-Zelltest im Inkubator. Nach sieben Tagen wurden der Kultur 10 Einheiten/ml T-Zell- Wachstumsfaktor (Lymphocult T, Biotest) zugesetzt und die wachsenden Zellen bei 0,5 bis 1 x 10&sup6;/ml gehalten, wobei alle 3 Tage R-10 zusammen mit 10 µg/ml T- Zellwachstumsfaktor zugesetzt wurde.

Herstellung von Zielzellen

Mit Epstein-Barr-Virus transformierte lymphoblastoide B-Zellinien, die autolog auf HLA-Klasse I abgestimmt bzw. nicht abgestimmt sind, wurden gewaschen und zu 1 bis 5 x 10&sup6;/100 µl in R10 resuspendiert. 300 µCi Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; (Cr&sup5;¹ Amersham) wurden zugesetzt und die Zellen eine Stunde bei 37ºC in 5 % CO&sub2;-Luft inkubiert. Die Zellen wurden einmal gewaschen und anschließend in Peptidlösungen (Peptid- Stammlösung, die in R10 zu 1 mg/ml gelöst ist) zu einer Endkonzentration von 10 µg/ml resuspendiert. Jedes Peptid wurde getrennt getestet. Jedes Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC in 5 % CO&sub2;-Luft inkubiert, anschließend wurden die Zellen dreimal gewaschen, in R10 auf 2 x 10&sup5; Zellen/ml konzentriert und in Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen mit runden Böden-Nunc) verteilt. Als Kontrollen dienten die autologen lymphoblastoiden B-Zellinien, entweder nicht infiziert und nicht mir Peptid behandelt (negative Kontrolle) oder mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert (10 pfu/Zelle 4 Stunden bei 37ºC in 5 % CO&sub2;-Luft, positive Kontrolle) (McMichael et al., J. Gen. Virol. 67 (1986), 719).

Herstellung von Effektorzellen

Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 1 500 Upm geerntet und zur Verwendung im CTL-Test in R10 resuspendiert.

CTL-Test

Zielzellen wurden zu 10&sup4; Zellen/Vertiefung in 50 µl R10 in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit runden Böden verteilt und Effektorzellen in 100 µl des gleichen Mediums zugesetzt.
Für die Experimente wurden die Vertiefungen in zweifacher Ausführung befüllt. Kontrollen für die Hintergrund-&sup5;¹Cr-Freisetzung in Abwesenheit der Effektorzellen (Mediumkontrollen) und maximale &sup5;¹cr-Freisetzung in Gegenwart von 5 % Triton X-100 ("Triton" ist ein registriertes Warenzeichen von Union Carbide Chemicals and Plastics Co. Inc.; Detergens-Kontrollen) wurden in vierfacher Ausführung plattiert. Die Platten wurden 4 Stunden bei 37ºC inkubiert und zur Zählung in einem Gammazähler wurden 75 µl Überstand in kleine Röhrchen abgetrennt. 75 µl 10 % Chlorverbindungen ("Chloros") wurden vor der Entfernung aus dem Sicherheitslabor zugesetzt. Die Lyse wurde durch die Formel berechnet:
% spezifische Lyse = experimentelle Zählimdulse - Mediumkontrolle x 100/experimentelle Zählimpulse Detergenskontrolle -Mediumkontrolle
Die spontane Freisetzung von &sup5;¹Cr durch die Zielzellen bei alleiniger Gegenwart im Medium schwankte von 8 bis 30 % der freigesetzten Zählimpulse, in Gegenwart von Triton (registriertes Warenzeichen) X-100.

Claims

1. In vitro-Verfahren zur stimulierung HIV-spezifischer cytotoxischer T-Lymphocyten (CTL), umfassend den Erhalt peripherer mononualeärer Blutzellen (PBMC) von einem Individuum, das HIV-seropositiv ist, die Inkubation einer Fraktion der PBMC mit Phytohämagglutinin für einen Zeitraum, der ausreichend ist zur Aktivierung der CTL und dabei zur Produktion aktivierter PBMC, das Waschen der aktivierten PBMC und die gemeinsame Züchtung der aktivierten PBMC mit einer zweiten, unstimulierten Fraktion der PBMC für einen Zeitraum, der zur Produktion gezüchteter, CTL-enthaltender PBMC ausreichend ist.

2. Verfahren zum Absuchen eines Peptids nach einem HIV-spezifischen CTL-Epitop, umfassend:

den Erhalt von PBMC von einem Individuum, das HIV seropositiv ist; die Inkubation einer Fraktion der PBMC mit Phytohämagglutinin für einen Zeitraum, der ausreichend ist zur Aktivierung von CTL und dabei zur Herstellung aktivierter PBMC; das Waschen der aktivierten PBMC; die gemeinsame Züchtung der aktivierten PBMC mit einer zweiten Fraktion unstimulierter PBMC für einen Zeitraum, der ausreichend ist zur Produktion gezüchteter, CTL-enthaltender PBMC; die Inkubation der gezüchteten PBMC mit markierten autologen Zielzellen oder lymphoblastoiden B- Zellen, die auf einen menschlichen Leukocytenantigen (HLA)-Typ und das Peptid abgestimmt sind; und die Bestimmung der Menge an freigesetztem Marker und die dadurch bedingte Identifizierung eines HIV-spezifischen CTL-Epitops.

3. Peptid, identifizierbar durch das Verfahren nach Anspruch 2, das die Aminosäuresequenz eines Fragments des gag-Proteins von HIV hat, das spezifisch mit einem bestimmten HLA-Klasse 1-Molekül zur Stimulierung der CTL- Immunität interagiert.

4. Peptid nach Anspruch 3, das die Sequenz NH&sub2;-Lysin-Arginin-Tryptophan-Isoleucin-Isoleucin-Leucin-Glycin-Leucin- Asparagin-Lysin- Isoleucin-Valin-Arginin-Methionin-Tyrosin-COOH hat.

5. Peptid nach Anspruch 3, das die Sequenz NH&sub2;-Lysin-Arginin-Tryptophan-Isoleucin-Isoleucin-Leucin-Glycin-Leucin- Asparagin-Lysin-Isoleucin-Valin-Arginin-Methionin-Tyrosin-Cystein-CCOH hat.

6. Verfahren zur Untersuchung von PBMC eines Individuums auf die Gegenwart HIV-spezifischer CTL, umfassend den Erhalt von PBMC von dem Individuum, die Inkubation der PBMC mit markierten autologen Zielzellen oder lymphoblastoiden B-Zellen, die auf einen HLA-Typ abgestimmt sind, und mit einem Peptid gemäß einem der Ansprüche 3, 4 oder 5, und die Bestimmung des Betrages an freigesetztem Marker.

7. Impfstoff gegen AIDS, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 5.

8. Impfstoff nach Anspruch 7, umfassend ein Peptid, das die Sequenz NH&sub2;-Lysin-Arginin-Tryptophan-Isoleucin-Isoleucin-Leucin-Glycin-Leucin-Asparagin-Lysin-Isoleucin-Valin-Arginin-Methionin-Tyrosin-COOH hat.

9. Impfstoff nach Anspruch 7, umfassend ein Peptid, das die Sequenz NH&sub2;-Lysin-Arginin-Tryptophan-Isoleucin-Isoleucin-Leucin-Glycin-Leucin-Asparagin-Lysin- Isoleucin-Valin-Arginin-Methionin-Tyrosin-Cystein-COOH hat.

10. Impfstoff nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9, umfassend ein Peptid, das mit HLA A1, A2, A3, B7 oder B44 interagiert.

11. Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 10, umfassend einen rekombinanten Mikroorganismus, der zur Expression der entsprechenden Peptidsequenz(en) hergestellt wurde.