DE68928130T2

DE68928130T2 - Synthetische vom HIV-GP120-env-Protein abgeleitete Peptide und ihre Anwendung

Info

Publication number: DE68928130T2
Application number: DE68928130T
Authority: DE
Inventors: Chang Yi Wang
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1988-02-12
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1997-11-20
Anticipated expiration: 2009-02-11
Also published as: EP0328403B1; EP0328403A2; DE68928130D1; CA1341285C; ATE154610T1; EP0328403A3; JPH0222296A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung von synthetischen Peptiden als Festphasenimmunadsorbentien zur Ermittlung von Antikörpem gegen Human-Immunodeficiency-Virus (HIV) gp120 und insbesondere Antikörper mit HIV-neutralisierenden Fähigkeiten. Die Aminosäuresequenzen der Peptide entsprechen den Segmenten des äußeren Hüllproteins gp120 von HIV. Diese Peptide erwiesen sich als höchst immunogen und sind reaktiv mit Antikörpern in Seren von Patienten mit AIDS, ARC oder mit HIV-infizierten Individuen. Sie können außerdem verwendet werden, um die Produktion von neutralisierenden Antikörpern gegen HIV hervorzurufen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines synthetischen Peptids, enthaltend 33 Aminosäuren in einer vorgeschriebenen Sequenz, dessen Analoge und Gemische, entsprechend dem äußeren HIV-gp 120- Protein zur Ermittlung von Antikörpem gegen HIV-gp120. Es ist besonders geeignet zur Ermittlung von Antikörpern mit HIV-neutralisierenden Fähigkeiten. Die Ermittlungsmethode umfaßt einen enzymgebundenen Immunassay und andere Formen von Immunassay-Verfahren. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Methode zur Erzeugung eines hohen Titers von Antikörpern gegen HIV gp120-Protein in gesunden Säugem, einschließlich Menschen, durch die Verwendung der synthetischen Peptide, deren Analoge oder Gemische entweder in einer konjugierten oder einer polymeren Form als eine Schlüsselkomponente in einem synthetischen Impfstoff zur Vorbeugung gegenüber AIDS.
Seit das Human Immunodeficiency-Virus (HIV) begann, sich über die menschliche Bevölkerung auszudehen, hat die AIDS-Epidemie sich ständig weltweit ausgebreitet aus Mangel an irgendeiner therapeutischen oder vorbeugenden Maßnahme zur Bekämpfung. Die einzigartige Pathogenizität und die Vielfältigkeit des HIV haben neue Herausforderungen auf den Plan gebracht bezüglich Design, Testen und Bewertung von therapeutischen Mitteln und Impfstoffen gegenüber HIV. Es erscheint im Augenblick, daß die Entwicklung einer wirksamen Methode zur Ermittlung einer HIV-Infektion und ein wirksamer Impfstoff die einzigen Maßnahmen bleiben, durch die die Krankheit zu kontrollieren und auszurotten ist.
Ein idealer Impfstoff gegen HIV-Infektion sollte höchst immunogen sein, sowohl T- und B-Zellen- virusspezifische Immunität induzieren und frei von irrelevanten Trägerproteinen sein. Obgleich traditionelle Versuche unter Verwendung von ganzen Virionen oder Virion-Untereinheiten im allgemeinen dieses Ziel erreichen können, haben praktische Überlegungen, wie Sicherheit und Verfügbarkeit eines nativen Antigens, stark dazu geführt, andere höher ausgebildete Impfstoffkonstruktionen gegen AIDS in Erwägung zu ziehen.
Studien an der Durchführbarkeit eines Virion-Untereinheits-Impfstoffs zum Schutz gegen virale Infektionen haben ihr Augenmerk hauptsächlich auf das Hüllprotein von HIV gerichtet, das Vorläufer gp160-Protein und das davon abstammende äußere Protein gp120 und Transmembranprotein gp41.
Das Transmembranprotein gp41 von HIV erwies sich als höchst antigen dahingehendv daß bei der Infektion alle Individuen Antikörper gegen gp41 entwickeln, die ermittelt worden sind durch rekombinante Proteinev enthaltend Segmente von gp41 (1) oder durch synthetische Peptide, die eine wohldefinierte Region dieses Proteins (2) abdecken.
Es ist wohl dokumentiert, daß HIV-infizierte Subjekte Antikörper gegen gp120 produzieren (3). Jedoch sind die immunogenen Stellen und deren entsprechende Aminosäuresequenzen in diesem Molekül bis jetzt nicht identifiziert.
Ein kürzlicher Artikel berichtet über den Status der intensiven Anstrengungen, die auf diese Auffindung eines geeigneten Kandidaten für einen Impfstoff gerichtet sind (4). Diese Anstrengungen sind in der Hauptsache auf die Verwendung eines äußeren Teils des HIV-Hüllglykoproteins gp120 gerichtet. Natives gp120 wurde von HIV-produzierenden Zellinien gereinigt, ergab jedoch sehr niedrige Ausbeuten (3). Außerdem, obgleich natives gp120 toxische Wirkung auf CD4-positive Zellen zeigt, ruft es nur mäßige neutralisierende Antikörpertiter hervor und ruft keine antikörperabhängige zellvermittelte Cytotoxizität in den Studien unter Verwendung von Schi mpansen-Wirten hervor (3).
Rekombinante Proteine, die das gesamte Hüllprotein gp160, das äußere Hüll protein gpl 20 oder Teile von gp120 enthalten, wurden produziert in Insektenzellen (5), Säugerzellen (6), Hefezellen (7) und Escherichia Coli (8). Gereinigtes gp120 zeigte, daß es den Zellrezeptor CD4 (9,10) bindet und daß es neutralisierende Antikörper von immunisierten Tieren hervorruft (11). Berichte, gemäß denen synthetische Peptide verwendet werden, die kleine Segmente von gp120 darstellen, ergaben, daß verschiedene Regionen immunreaktiv sind, die zwei mäßig antigene Regionen umfassen, die reaktiv gegen Seren einiger HIV-infizierter Patienten sind (12,13) und zwei Regionen, die repräsentativ für antigene Stellen von Helfer-T-Zellen sind (14), eine Region, die HIV-Rezeptorbindung und T-Zell- Infektivität inhibiert (15) und eine Region, die marginale neutralisierende Antikörper hervorruft (16,17).
Pert et al. berichtet von einem 8mer-Peptid, genannt Peptid T, das die Fähigkeit besitzt, die Bindung von I-125 markierten HIV-gp120 an T4-Antigen in Gehirnmembranen zu inhibieren und HIV-Infektion von menschlichen T-Zellen in vitro zu blockieren (15). Cease et al. berichtete von der Identifizierung einer antigenen Stelle von HIV-gp120, dargestellt durch ein 16mer-Peptid, genannt Peptid T1, das insbesondere T-Zellimmunität hervorruft. Jedoch wurde von keinen Ergebnissen über die Immunreaktivität der Peptide mit Serumantikörpem, die von HIV-infizierten Individuen entstammen (d.h. B-Zell immunität) berichtet. Palker et al. berichtete, daß ein 15mer-Peptid, Sp-22, das von einer konservierten Region am Carboxylterminus von HIV-gp120 stammt, mäßige Immunreaktivität mit Antikörpern von HIV-infizierten Individuen zeigte. Jedoch diese gegenüber Sp-22-Peptid reaktiven Anti-gp120- Antikörper erwiesen sich klar als nicht neutralisierend (12). Im Gegensatz zu Palker et al.'s Bericht, beschrieb Chanh et al., daß ein synthetisches 30mer-Peptid, das eine überlappende Sequenz mit Palker et al.'s Sp-22 aufweist, schwache Immunogenizität zeigte durch Hervorrufung neutralisierender Antikörper gegen gp120 (16,17).
Auf ähnliche Weise beschrieb Cosand ein Peptidkonjugatv bezeichnet als Peptid 36-BSA, das mäßige antigene Eigenschaften mit Serumantikörpem von einigen HIV-infizierten Individuen aufweist (13). Cosand's Peptid-36, ein 24mer, besitzt eine überlappende Aminosäuresequenz mit Palker's SP-22 Peptid und Chanh's 30mer Peptid.
Diese Peptide, deren Aminosäuresequenzen und berichtete Immunreaktivitäten sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Es soll außerdem erwähnt werden WO 86/02383, das Hüllantigene von Lymphadenopathy-verknüpftem Virus betrifft und deren Anwendungen, und WO 88/00471, das eine Stoffzusammensetzung und eine Methode zum Immunisieren gegen virale verursachende Mittel von AIDS und ARC betrifft.
Unsere vorangegangenen Anstrengungen bei der Identifizierung und Charakterisierung von hochantigenen Epitopen auf den gp41- und p24-HIV-Proteinen haben die Entwicklung von wirksamer HIV- Antikörper-Prüfung und eine diagnostische Methode unter Verwendung von syntetischen Peptiden wirklich gemacht, anstelle des Virus selbst als den festen Immunadsorbenten (2). Eine ähnliche Aufgabe zur Erfassung der Reaktivität von neutralisierenden Antikörpem auf Epitopen auf humanem retroviralen Protein, insbesondere dem HIV-gp120-Protein bleibt eine andere Herausforderung, die zum Design und der Entwicklung von synthetischen Impfstoffen zur Induzierung von hochneutrahsierenden Antikörper-Titem und spezifischer cellularer Immunantwort führt, um die Ausbreitung von AIDS erfolgreich zu verhindern. Tabelle 1 Synthetische HIV gp120 Peptide mit berichteten Eigenschaften
In dieser Anmeldung werden Standard-Einzelbuchstaben-Symbole für die Aminosäuren durchgehend verwendet. Diese stellen die folgenden Aminosäuren dar:

Literaturstellen

1. Chang, T.W. et al. Biotechnology, 3, 905-909 (1985
2. Wang, J.J.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 9709-9713 (1986)
3. Matthews, T.J. et al. Proc.Natl.Acad. Sci. USA. 83, 9709-9713 (1986)
4. Homsy, J. et al. Immunology Today, 8, 193-196 (1987)
5. Rusche, J.R. et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA, 84, 6924-6928 (1986)
6. Lasky, L.A. et al. Science 233, 209-212 (1986)
7. Barr, P.J. et al., Vaccine, 5, 90 (1987)
8. Putney, S.D. et al., Science, 234, 1392-1395 (1986)
9. Dalgleish, A.G. et al. Nature (London), 312, 763-768 (1984)
10. McDougal, J.S. et al. J. Immunol., 135, 3151-3157 (1985)
11. Robey, W.G. et al. Proc.Nat.Acad. Sci. USA, 83, 7023-7027
12. Palker, J. T. et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84, 2479-2483 (1987)
13. Cosand, W. US-Patent Nr. 4 629 783
14. Cease, K.B. et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 84, 4249-4253 (1987)
15. Pert, C.B. et al. Proc.Nati.Acad.Sci. USA, 83, 9254-9258 (1986)
16. Chanh, T.C. et al. EMBO, 5, 3065-3071(1986)
17. Chanh, T.C. et al. Eur.J.Immunol., 16, 1465-1468 (1986)
18. Merrifield, R.B. J..A.C.S., 85, 2149-2154 (1963)
19. Prince, A.M. et al J- of Infectious Diseases, 156, Nr. 2, 268-272 (1987).
Die vorliegende Erfindung stellt eine Peptidzusammensetzung bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie spezifische Immunreaktivität gegen Antikörper gegen HIV aufweist und die Produktion von neutralisierenden Antikörpem gegen HIV hervorruft die ausgewählt ist aus:
(i) QSVEINCRTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGK (Peptid 127;
(ii) einem Analog davon mit einer Aminosäuresequenz, stammend von einem Stamm/Isolat von HIV in einer Regionv entsprechend dem Peptid;
(iii) einem Konjugat davon mit einem Träger;
(iv) einem Polymer davon; und
(v) einem Gemisch des Peptids mit einem Analog, konjugat oder Polymer davon.
Beispielsweise kann die vorliegende Peptidzusammensetzung ein Konjugat des Peptids und ein Protein mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000 enthalten, wie Rinderserumalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Peptidzusammensetzung enthalten:
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Methode zur Ermittlung der Gegenwart von Antikörpem gegen HIV und der Gegenwart von neutralisierenden Antikörpem gegen HIV-gp120 in einem Immunassay bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Verwendung einer vorstehend definierten Peptidzusammensetzung als das Immunsorbent umfaßt.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Analog von Peptid-127 bereit, das dadurch gekennzeichnet Istv daß es ausgewählt ist aus:
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem neutralisierende Antikörper gegen AIDS-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch die Verwendung einer Peptidzusammensetzung wie vorstehend definiert hervorgerufen werden.
Ein anderes synthetisches Peptidv Peptid 126:
CRIKQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC
wird in EP-A 328 403 beschrieben. Obgleich Peptid 126 keinen Teil der Erfindung bildet, wie vorstehend angegeben, erfolgen im vorliegenden einige Bezugnahmen darauf der Einfachheit und der Vollständigkeit halber.
Die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide eignen sich zur Ermittlung von Antikörpem gegen HIV in physiologischen Flüssigkeiten und sind insbesondere geeignet zur Ermittlung von neutralisierenden Antikörpem gegen HIV-gp120 in physiologischen Flüssigkeiten.
Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich außerdem als Schlüsselkomponenten in Impfstoffen zur Immunisierung von Tieren einschließlich Menschen, um die Produktion von Antikörpern gegen HIV hervorzurufen.
Bezugnehmend auf die anliegenden erläuternden Zeichnungen:
Fig. 1a bzw. 1b zeigen die Ergebnisse von EIA-Assays unter Verwendung von Peptid 126 und Peptid 127 als Festphasen-Immunadsorbent unter Verwendung von Sera von Patientenv bei denen AIDS, ARC diagnostiziert wurde, von Personen, die als seropositiv bekannt sind, Lymphoid-Leukämie- Bösartigkeiten (LLM), Autoimmunerkrankung, Erwachsenen-T-Zell-Leukämie (ATL) und von beliebigen Blutspendern.
Fig. 2a und 2b zeigen die Spezifität von Immunreaktivitäten von Peptid 126 und Peptid 127 mit HIV- Serumantikörpern. Eine erhöhte Menge an Peptid 126, Peptid 127 oder Peptid T wird vorinkubiert mit Serumantikörpern von einer repräsentativen Probe (N-19-13), gefolgt durch EIA unter Verwendung von entweder Peptid 126 (Fig.2a) oder Peptid 127 (Fig. 2b) als Festphasen-Immunadsorbent.
Fig. 3 zeigt die gegenseitige Abhängigkeit der durch EIA erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung von Peptid 126 und Peptid 127 und dem Titer der neutralisierenden Antikörper von 30 Serumproben.
Fig. 4a und 4b zeigen die entsprechende Immunreaktivität von Peptid 126 und Peptid 127 mit einer Reihe von Serumspecies, erhalten von Patienten A und BV die einer Serokonversion unterlagen. Zum Zeitpunkt der Serumgewinnungv wenn das Signal/Ausschaltverhältnisv das von EIA stammt, auf der Basis des gp41/p24-Peptidgemisch größer als 1 wird, ist eine HIV-Infektion in dem entsprechenden Patienten ermittelt.
Fig. 5a, 5b, 5c und 5d zeigen Serumantikörper-Titer von Meerschweinchen nach ursprünglicher Immunisierung und einer Zusatzspritze unter Verwendung von (i) Peptid 126-BSA (Fig. 5a), (ii) Peptid 127-BSA (Fig. 5c), (iii) Peptid 126octamer (Fig. 5b) und (iv) Peptid 127octamer (Fig. 5d).
Fig. 6a, 6b, 6c und 6d zeigen, daß verzögerte hohe Titer von Serum-Antikörpem produziert werden durch Immunisierung mit (i) Peptid 126-BSA (Fig. 6a), (ii) Peptid 127-BSA (Fig. 6c), (iii) Peptid 126octamer (Fig. 6b) und (iv) Peptid 127octamer (Fig. 6d).
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse von Western Blot Analysen, die die Produktion von hohen Spiegeln von spezifischen Anti-gp120-Antikörpem demonstrieren, durch Immunisierung von Meerschweinchen mit (I) Peptid 126-BSA bei Verdünnungen von 1:200, 1:1000 und 1:2000 (Bahnen 1-3)V (II) Peptid 127- BSA bei Verdünnungen von 1:200, 1:1000 und 1:2000 (Bahnen 4-5), (III) Peptid 126octamer bei Verdünnungen von 1:200, 1:1000, 1:2000, 1:10000 und 1:20000 (Bahnen 7-11) und (IV) Peptid 127octamer bei Verdünnungen von 1:200, 1:1000, 1:2000, 1:10000 und 1:20000 (Bahnen 12-16) im Vergleich zu einer Serumprobev die von einem Meerschweinchen erhalten wurde, immunisiert mit (V) entaktiviertem vollen Virallysat bei Verdünnungen von 1:100 (Bahn 17) und einer Serumprobe, erhalten von einem nichtimmunisierten Kontrollmeerschweinchen bei einer Verdünnung von 1:100 (Bahn 18).
Die vorliegende Erfindung stellt neue Peptide bereit, die äußeres Hüllprotein von HIV-gp120 immunologisch nachahmen, codiert durch die env-Region des viralen Genoms.
Die vorliegenden Peptide haben Aminosäuresequenzen, die folgendem entsprechen:
QSVEINCTRPNNNTRKSIRIQGPGRAFVTIGK (Peptid 127), codiert innerhalb der bp669 bis bp6767-Region von gp120. Die Peptide werden im vorliegenden codiert als Peptid 127 zur leichteren Identifizierung.
Die Aminosäuresequenz von Peptid 127 wird von einer hochvariablen Region in gp120 entnommen, wie in Tabelle II gezeigt wird. Die neuen Peptide zeigen einen hohen Spiegel an Immunreaktivität mit Antikörpern gegen HIV und eignen sich in einem hochempfindlichen und spezifischen Enzym-Immun- Assay (EIA) für die Ermittlung von Antikörpem gegen HIV im Serum. Die EIA-Ergebnissev erhalten durch Verwendung von Peptid 127, zeigen ebenfalls einen hohen Grad an gegenseitiger Abhängigkeit von Antikörper-Neutralisationstiter und eignen sich als eine schnelle und einfache Methode zur Ermittlung von HIV-neutralisierenden Antikörpern in Sera.
Die vorliegende Erfindung kann modifiziert werden durch Einfügung von konservativen und nichtkonservativen Änderungen, Weglassungen oder Zufügungen von Aminosäurenv um wirksam die unterschiedlichen Epitopen der unterschiedlichen retroviralen Stämme nachzuahmenv solange die spezifische Immunreaktivität von Antikörpem gegen HIV und Antikörpern gegen HIV-gp120 bewahrt bleibt.
Es ist vorgesehen daß die Peptide und die infrage kommenden Analoge etwa 15 Aminosäuren enthalten, üblicherweise sind weniger als 50, noch üblicher weniger als etwa 40 Aminosäuren innerhalb einer Sequenz enthalten, für die durch das HIV-gp120 codiert wird und entspricht der folgenden Sequenz:
QSVEINCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGK (Peptid 127)
Die Peptidsegmente sollten so klein wie möglich sein, aber dabei noch im wesentlichen die gesamte Empfindlichkeit der größeren Peptide beibehalten. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, ein oder mehrere Peptide, die nicht überlappend sind, zu einem größeren Peptid zu verbinden. Diese Peptide können außerdem als individuelle Peptide verwendet werden, die getrennt oder zusammen Empfindlichkeit oder Wirksamkeit äquivalent zum Eltempeptid liefern. Tabelle IIA Peptid 126 und dessen Substitutionsanaloge
Diese Sequenz stammt von der gp120-Hüllproteinsequenz, entnommen von einem Prototyp HIV (BH10), codiert in einer Region, ausgehend von bp7053 bis bp7136. Diese Sequenz stellt eine konserviertere Region von gp120 dar. Analoge mit Aminosäuresequenzen, stammend von dieser Regionv die verschiedene HIV-Isolate darstellen, werden ebenfalls gezeigt. Tabelle II Peptid 127 und dessen Substitutionsanaloge
* Leere Stellen sind reserviert für maximale Sequenzanordnung
Diese Sequenz stammt von der gp120-Hüllproteinsequenz, entnommen vom HIV-Stamm (BH10), codiert in einer Regionv beginnend von bp6669 bis bp6767. Diese Sequenz stellt eine variable Region von gp120 dar. Analoge dieser Sequenz von verschiedenen HIV-Stämmen werden ebenfalls gezeigt.
Diese Peptide können modifiziert werden durch Einfügung von konservativen oder nicht-konservativen Substitutionen in den Peptiden zu wirksamerem Nachahmen der unterschiedlichen Epitopen auf den verschiedenen retroviralen Stämmen.
Außerdem, um Variationen von Stamm zu Stamm zwischen den verschiedenen Isolaten anzupassen, können Einstellungen für konservative Substitutionen und Auswahl unter den Alternativen,wo nichtkonservative Substitutionen daran beteiligt sind, gemacht werden. Diese Peptide können einzeln oder zusammen zur Ermittlung von Antikörpem gegen das gp120-Hüllprotein in einer physiologischen Probe verwendet werden. In Abhängigkeit von der Art des Assay-Protokolls können die Peptide markiert oder unmarkiert sein, an eine feste Oberfläche gebunden sein, polymer oder konjugiert an einen Träger oder andere Verbindungen u.dgl.
Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide brauchen nicht identisch mit der spezifischen Sequenz zu sein, so lange die entsprechenden Verbindungen in der Lage sind, für immunologische Konkurrenz mit gp120 von mindestens einem der Stämme des HIV-Retrovirus zu sorgen.
Ein spezifisches Peptid, das durch die vorliegende Erfindung umfaßt wird, ist Peptid 127, ein 33mer, das folgende Aminosäuresequenz hat:
QSVEINCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGK-X, worin X OH oder NH&sub2; bedeutet. Diese Sequenz entspricht einem schmalen Segment des äußeren Hüll-gp120 von HIV oder deren Analoge.
Die Peptide können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Die Peptide werden wegen ihrer relativ kleinen Größe leicht synthetisiert durch die Festphasen-Strategie, wie sie durch Merrifield (18) entwickelt wurde, die durch Bezugnahme hierin enthalten ist. Verschiedene im Handel erhältliche automatische Peptid-Synthesizer mit bekannten Protokollen werden verwendet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können außerdem hergestellt werden durch rekombinante DNA-Technologie. Bei ihrer Herstellung kann eine Nucleotidsequenz, die für das gewünschte Peptid oder die Peptide codiert, in Tandom-Anordnung, die die ausgewählten Epitope und deren Analoge darstellt, hergestellt werden unter Anwendung von üblicher Routinemethode für DNA-Synthese. Die synthetisierten Oligonucleotide sind verbunden durch eine einfache, im vorstehenden beschriebene Strategie für die Konstruktion eines synthetischen Gens, das ein solches künstliches Protein codiert, enthaltend die spezifischen Epitope, die durch Aminosäuresequenz von Peptid 127 oder dessen Analoge gekennzeichnet ist. Das so konstruierte synthetische Gen wird zur optimalen Expression in Escherichia coli-Wirtszellen transferiert.
Die erfindungsgemäßen Peptide zeigen einen hohen Grad an spezifischer Immunreaktiivität mit Antikörpern gegen HIV. Ein Vergleich der Ergebnisse, erhalten für bekannte Serumproben durch EIA, unter Verwendung von Peptid 127 als der Festphasen-Immunabsorbent mit den vorher erhaltenen Ergebnissen für diese bekannten Serumproben durch Diagnostik, zeigt, daß Peptid 127 hochspezifisch in seiner Immunreaktivität auf Antikörper gegen HIV ist. Dies zeigt, daß Peptid 127 hoch reaktive Epitopen in der gp120-Region von HIV definiert.
Analyse von Seropositivität mit Peptid 127 durch EIA bei 30 wohlgekennzeichneten Seren mit bekannten neutralisierenden Antikörpertitern ergab einen hohen Grad an gegenseitiger Abhängigkeit, wie berechnet durch Spearman Rank Correlation Coefficient, r=0,888, p< 0,001 für Peptid 127. Das bedeutet, daß eine schnelle EIA-Methode unter Verwendung von Peptid 127 angewandt werden kann, um die zeitraubende Methode der Messung von serumneutralisierenden Antikörpertitern zu ersetzen.
HIV-neutralisierende Antikörpertiter wurden früher bestimmt durch Umkehr-Transkriptase-Assay, was sehr zeitraubend ist und höchstvariable Ergebnisse erzeugt. Beispielsweise beschrieb Prince et al. einen halbautomatisierten Mikrotiter-Assay, der die Züchtung von Serumspezies mit HIV-Virus 14 bis 21 Tage erforderte und dann wiederholtes Messen der Umkehr-Transkriptase-Aktivität von jeder Probe in 12 Replikaten, um signifikante Daten zu erhalten. Die Methode ist extrem zeitraubend und variabel. Außerdem zeigte Prince et al., daß überhaupt keine gegenseitige Abhängigkeit zwischen neutralisierenden Antikörpertitern, die durch diese Methode erhalten wurden und einer ELISA- Methode bestand unter Verwendung von entaktiviertem Virus als Immunabsorbens.
Im Gegensatz dazu wurde durch Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide ein hoher Grad an gegenseitiger Abhängigkeit gefunden. Somit kann EIA unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide angewandt werden, um Plasmaproben auszuwählenv die hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern enthalten, und quantitativ HIV-neutralisierende Antikörpertiter zu bestimmen.
Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich außerdem als Immunogene, um die Produktion von hohen Titem von Anti-gp120-Antikörpem in Säugem hervorzurufen. Dies zeigt, daß die Peptide sich als Immunogene und Impfstoffe für die Verhinderung von HIV-Infektion eignen.
Die nachstehenden Beispiele verwenden Peptid 126 und Peptid 127 entweder als Festphasenantigene in Immunassay oder als Immunogene in verschiedenen Formen&sub1; um spezifische Anti-HIV- gp120-Antikörper mit hohem Titer hervorzurufen.

Beispiel 1

Ermittlung von Antikörpern gegenüber HIV-gp120 durch EIA

Näpfchen von 96-Näpfchen-Pfatten wurden bei 4ºC über Nacht mit Peptid 126 oder Peptid 127 beschichtet, hergestellt durch Standard-Festphasen-Peptidsynthese auf automatisiertem BIOSEARCH 9500 Peptidsynthesizer und vom Harz durch HF-Behandlung abgespalten. Jedes Peptid wurde auf die Näpfchen bei einem Ansatz pro Napf in 100µl 10mM NaHCO&sub3;-Puffer&sub1; pH 9,5, geschichtet. Die Näpfchen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und dann mit 250 µl 3 Gew.% Gelatine in PBS bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert, um die nichtspezifischen Protein bindungsstellen zu blockieren, gefolgt durch drei weitere Waschungen mit PBS, enthaltend 0,05 Vol.-% Tween 20. Die Testseren von Patienten oder normalen Blutspendern wurden auf 1:20 Volumen zu Volumen mit PBS verdünnt, enthaltend 20 Vol.-% normales Ziegenserum, 1 Gew.-% Gelatine und 0,05 Vol.-% Tween 20. 200 µl der verdünnten Seren wurden jedem Näpfchen zugesetzt, und man ließ sie 15 Minuten bei 37ºC reagieren. Die Näpfchen wurden dann dreimal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS gewaschen, um nichtgebundene Antikörper zu entfernen. 100 µl Ziegenantihuman- IgG konjugiert mit Meerrettich peroxidase bei einer Verdünnung von 1:3000 in 1 Vol.-% normalem Ziegenserum, 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS wurde jedem Näpfchen bei 37ºC 15 Minuten lang zugesetzt als ein zweiter Antikörper-Indikator, um den in den positiven Näpfchen geformten Antikörper-Antigenkomplex zu binden.
Die Näpfchen wurden fünfmal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, und mit 100 µl des Substratgemischs umgesetzt, enthaltend 0,04 Gew.-% o-Phenylendiamin (OPD) und 0,012 Vol.-% Hydrogenperoxid in Natriumcitratpuffer, pH 5,0. Dieses Substratgemisch wurde verwendet, um die Peroxidasemarkierung durch Bildung eines farbigen Produktes zu ermitteln. Reaktionen wurden gestoppt durch die Zugabe von 50 µl 1M H&sub2;SO&sub4; und die Farbausbeute gemessen unter Verwendung eines EIA-Ablesers bei 492 nm. Absorptionsablesungen größer als das Dreifache der Durchschnittsablesungen von 100 normalen Blutspenderseren wurden als positiv bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle III gezeigt. Tabelle III Ermittlung von Antikörpern gegen HIV durch EIA unter Verwendung von Peptid 126 und Peptid 127 als Festphasen-Immunadsorbens
* Die meisten der HIV-EIA gp41/p24 Prüfassays von seropositiven Proben ergaben ein A492nm von über 2,00.
Anmerkung: Seren von Patienten mit AIDS, ARC, Lymphoid-Leukämie-Bösartigkeiten wurden freundlicherweise durch Dr. Daniel M. Knowles von der Neu York University Medical School, Dr. Frederick P. Siegal vom Long Island Jewish Hospital zusammen mit detaillierter Patientendiagnose und Geschichte zur Verfügung gestellt. Seren von HTLV-I-seropositiven Individuen einschließlich solcher mit Erwachsenen-T-Zell-Leukämie wurden durch das japanische Rote Kreuz zur Verfügung gestellt. Seren von Patienten mit Autoimmunkrankheit wurden durch Dr. Nicholas Chiorazzi vom North Shore University Hospital, N.Y., zusammen mit deren Diagnose und Patientengeschichte zur Verfilgung gestellt. Menschliches Plasma von normalen Blutspendem wurde erhalten vom Hyland Plamsa Center, III.
A492 von EIA unter Verwendung von Peptid 126 und Peptid 127 für verschiedene klinische Datenpunkte werden in Fig. 1a und 1b dargestellt.
Wie aus den graphischen Darstellungen ersichtlich ist, demonstrieren die Ergebnisse, die für EIAs unter Verwendung von Peptid 126 und Peptid 127 erhalten wurden, einen hohen Grad an Spezifität dahingehend, daß alle HIV-seronegativen Individuen negative Ergebnisse mit beiden Assays ergaben, während diejenigen in den HIV-seropositiven Gruppen unterschiedliche Grade an Reaktivitäten zeigten.
Es wird außerdem beobachtet, daß Peptid 126 auf der Basis von EIA höhere Absorption ergab und eine breitere HIV-seropositive Population abdeckt (82,5 %) als Peptid 127 auf der Basis von EIA (70%).

Beispiel 2

HIV-gp120-Seropositivität unter Verwendung von Peptiden 126 und 127 ist einzigartig für die in dieser Erfindung beschriebenen beiden Peptide. Ein Serumtitrationsversuch wurde durchgeführt unter Verwendung von Peptid 126, Peptid 127, einem anderen Peptid mit einer Aminosäuresequenz von RPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAP (Peptid 065) und einem 8mer-Peptid mit einer Aminosäuresequenz ASTTTNYT (Peptid T). Es wird beobachtet, daß "Peptid 065" und "Peptid T" keine Immunreaktivität mit Seren von HIV-seropositiven Individuen haben. Siehe Tabelle IV. Tabelle IV Spezifische Immunreaktivität verbunden mit HIV-gp120-Peptiden 126 und 127
Serientitrationen zeigen, daß die Immunreaktivität mit Peptid 126 und Peptid 127, gezeigt durch HIV- seropositive Proben, spezifisch gegenüber jedem Epitop ist, wie in Figuren 2a. und 2b gezeigt. Nur Peptid 127, jedoch weder Peptid 126 noch Peptid T können die Antikörper-Immunreaktivität gegenüber Peptid 127 inhibieren. Auf ähnliche Weise kann Peptid 126, jedoch nicht Peptid T und noch viel weniger Peptid 127, die Immunreaktivität gegenüber Peptid 126 inhibieren.

Beispiel 3

Insgesamt 30 Seren, die zuvor sorgfältig titriert wurden auf ihre Fähigkeitu HIV-Infektion in Zellkulturen zu neutralisieren, unter Anwendung einer von Prince (23) beschriebenen Methode, wurden getestet bei einer 1:45-Verdünnung durch EIA, unter Verwendung von (i) einem gp41/p24-HIV- EIA-Kit, enthaltend ein Gemisch aus 3 Peptiden, bekannt als hochspezifisch für Antikörper gegen HIV: Ein 11mer-Peptid aus der p24-Regionv ein 19mer-Peptid und ein 21 mer-Peptid aus der gp41- Region (UBI, Hauppaugu N.Y.), (ii) Peptid 126 und (iii) Peptid 127 als Festphasen-Immunadsorbent- Antigene. Die Ergebnisse dieser Studie werden in Tabelle V wiedergegeben. Weitere Analysedaten zeigten an, daß ein hoher Grad an gegenseitiger Abhängigkeit zwischen dem neutralisierenden Antikörpertiter jedes Serums und dessen Immunreaktivität mit entweder Peptid 126 oder Peptid 127 bestand. Siehe Fig. 3. Die berechneten Spearman Rank Korrelationskoeffizienten zwischen neutralisierendem Antikörpertiter und EIA-Ablesungen betrugen r = 0,949, p< 0,001 für Peptid 126 und r = 0,888, p< 0,001 für Peptid 127.
Vorliegende angewandte Methoden zur Messung von serumneutralisierenden Antikörpertitern erfordern für ihre Durchführung 14 bis 21 Tage und sind der Gegenstand vieler experimenteller Fehler. Dieser hohe Grad an gegenseitiger Abhängigkeit zwischen der schnellen EIA-Methode unter Verwendung von entweder Peptid 126 oder Peptid 127 als Festphasen-Immunadsorbent-Antigen und den bekannten neutralisierenden Antikörpertitem zeigen, daß diese schnellen EIA-Methoden unter Verwendung von Peptid 126 oder Peptid 127 die früheren mühsamen Bioassaymethoden ersetzen können, um die serumneutralisierenden Antikörpertiter zu bestimmen. Tabelle V Ergebnisse von Serenv gesteted durch Neutralisationsassay und EIA unter Verwendung von UBI-HIV- EIA-Kitt (p24/gp41) und Peptid 126 (gp120) und 127 (gp120) als Immunabsorbentantigene

Beispiel 4

Insgesamt 13 aufeinanderfolgende Blutentnahmen von 2 Patienten, die zwei Serokonversionen unterliefen, wurden auf ihre Reaktivität getestet, unter Verwendung des gp41/p24-HlV-ELA-Testkits (UBI, Hauppaugv N.Y.) und Peptid 126 und Peptid 127 als Immunadsorbentien in einer EIA-Methode. Die Ergebnisse zeigen, daß die Latenzperiode für die Entwicklung von Antikörpem gegenüber gp120 Peptid 126 länger ist als Antikörper gegenüber den gp41/p24-Epitopen und die Latenzzeit für die Entwicklung von Antikörpem gegenüber gp120-Peptid 127 sogar länger war, wobei sie viel später im Zuge der Infektion erschienen. Siehe Fig. 4a und 4b.

Beispiel 5

Konjugation von Peptid 126 und Pedtid 127 mit Rinderserumalbumin (BSA).

5 mg BSA wurden gelöst in 5 ml PBS unter schwacher Beschallung. Zum Überstand wurden 4 mg HF-gespaltenes Peptid 126 oder Peptid 127 zugesetzt gefolgt durch die Zugabe von 40 µl Blutaldehyd (25%) unter Erzielung einer End-Glutaldehyd konzentration von 0,2 %. Das Peptid- BSA und Glutaldehydgemisch wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert, gefolgt durch eine extensive Dialyse mit mehrfachen Wechseln (200 × seines Volumens) von PBS. Das dialysierte Peptid-BSA- Konjugat wurde dann verwendet zusammen mit entweder vollständigem oder unvollständigem Freundvs Adjuvants zur Verabreichung an Tiere in einem Immunisierungsprogramm.

Beispiel 6

Synthese von Lysindolymeren der Pedtide 126 und 127

Die Synthese einer octameren Form von Peptid 126 und Peptid 127 wurde eingeleitet auf einem 4- Methylbenzylhydrazin (MBHA)-Harz, an das nach und nach Boc-Lys (BOZ) gekuppelt wurde, unter Bildung eines Mehrfach-Antigen-Peptidsystems mit 8 reaktiven Aminoenden. Die Synthese von Peptid 126 oder Peptid 127 an diesem hexameren Lysinharz mit 8 reaktiven Aminoenden war ähnlich der Synthese von linearem Peptid unter Verwendung einer Standard-Festphasen-Peptidsynthese- Strategie. Das Poly-L-Lysin mit 8 Einheiten an Peptid 126 oder Peptid 127 (siehe Tabellen V1a und VIb) wurden dann freigesetzt von dem Festphasenharz durch HF-Spaltungsverfahren, mit Essigsäure extrahiert und Iyophilisiert. Das erhaltene Molekulargewicht, bestimmt durch Einfachband-SDS- PAGE, der Octamere von Peptid 126 und Peptid 127 stimmten wohl überein mit den entsprechenden berechneten Molekulargewichten von 28 600 und 31 200. Analysen des HF-gespaltenen octameren Peptids 126 und Peptids 127 ergaben breite Peaks in der C4-Umkehrphasen-HPLC. Tabelle VIa Schematische Zeichung vom Peptid 126 Octamer Tabelle VIb Schematische Zeichnung von Peptid 127 Octamer

Beispiel 7

Meerschweinchen-Immunisierungs-Protokoll

Duncan Hartly-Meerschweinchen-Weibchen einer wahllosen Zucht in einer geschlossenen Kolonie mit einem Gewicht von 400 bis 450 g wurden in allen Versuchen verwendet. Jede Immunisierung wurde in der beschriebenen Dosis verabreicht durch subkutane und intradermale Injektion in einem Volumen von 1,0 ml an jedes Mitglied von 2 Meerschweinchen über mehrfache Stellen. Insgesamt 4 Gruppen wurden für die Immunisierung vorgesehen durch: Peptid 126-BSA-Konjugatv Peptid 127- BSA-Konjugat, Peptid 126-Octamer und Peptid 127-Octamer. Für die anfängliche Immunisierung wurden 100 µg Peptid-Konjugat oder Octamer in 0,5 mg mit einem gleichen Volumen von vollständigem Freund's Adjuvant vermischt, und 1,0 ml wurden an jedes Tier sowohl subkutan als auch intradermal über mehrfache Stellen injiziert. Nach 2 bis 3 Wochen Ruhezeit wurde eine identische Dosis von jedem der gleichen Immunogene nochmals injiziert als Zusatzspritze sowohl subkutan als auch intradermal in jedes Tier mit dem Unterschied daß unvollständiges Freundvs Adjuvants verwendet wurde.
Den Tieren wurde durch Herzpunktur periodisch Blut entnommenv um ihre Serum-Anti-gp120-Titer zu beobachten, und anschließende Zusatzspritzen wurden alle 2 bis 6 Wochen verabreicht. Wie in Fig. 6a, 6b, 6c und 6d gezeigt wirdv induzierten Peptid 126-BSA, Peptid 126-Octamer, Peptid 127-BSA und Peptid 127-Octamer alle hohe Antikörper-Titer (> 1:1000-1:10000) zum entsprechenden immunsierenden Peptid nach nur einer Zusatzspritze. Hohe Antikörpertiterv kreuzreaktiv zu dem nativen HIV-gpl 20-Protein wurden ebenfalls produziertv wie durch Westem Blot-Analyse gezeigt wird. Siehe Fig. 7.
Die Kinetiken der Immunantwortv die durch das spezifizierte Immunisierungsschema hervorgerufen wurden, zeigten anv daß wirksame, verzögerte Spiegel der hohen Serum-Antikörpertiter hervorgerufen wurden im Verlaufe der Immuniserung, insbesondere mit der octameren Form der Peptide. Siehe Fig. 6a-d.
Die Ergebnisse zeigen anu daß sowohl Peptid 126 als auch Peptid 127 hochimmunogene Epitope darstellen, die auf dem HIV-gp120-Protein vorhanden sind. Serenv die von Meerschweinchen erhalten wurden, die vorher mit den Peptidkonjugaten oder deren polymeren Formen immunisert worden waren, induzieren hohe Antikörpertiter zu dem immunisierenden Peptid und erwiesen sich als hochkreuzreaktiv zu dem nativen gp120, wie durch die Westem Blot Analyse demonstriert wurde. Siehe Fig 7.
Es ist ziemlich bemerkenswert, daß synthetische Peptide, die winzige Fraktionen des äußeren Hüllproteins eines großen Virus darstellen, so manipuliert werden können, daß sie die antigen/immunogenen Stellen in einem Ausmaß nachahmen, daß neutralisierende oder schützende Antikörper hervorgerufen werden können durch Immunisierung mit diesen wohldefinierten Peptiden, und quantitative EIAs unter Verwendung dieser synthetischen Peptide als die Festphasen-Immunadsorbentien verwendet werden können, um natürliche Antikörper gegen gp120, die in HIV-infizierten Individuen vorhanden sind, in einem Ausmaß zu ermitteln, daß ihre neutralisierenden Fähigkeiten vorausgesagt werden können durch das von diesen EIA-Ergebnissen erhaltene Signal. Auf der Basis dieser hochgradigen gegenseitigen Abhängigkeit von neutralisierenden Antkörper-Titem ist zu erwarten, daß diese Peptide, deren Analoge und Gemische sowohl in den konjugierten als auch polymeren Formen, nützlich sein werden als Kandidaten für synthetische Impfstoffe.

Claims

1. Eine Peptidzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifische Immunreaktivität auf Antikörper gegenüber HIV aufweist und die Produktion von neutralisierenden Antikörpern gegenüber HIIV hervorruft, die ausgewählt ist aus:

(i) QSVEINCRTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGK (Peptid 127);

(ii) einerm Analog davon mit einer Aminosäuresequenzv die von einem Stamm/ Isolat von HIV stammt in einer Region entsprechend dem Peptid;

(iii) einem Konjugat davon mit einem Träger;

(iv) einem Polymer davon und

(v) einem Gemisch der Peptide mit einem Analog, Konjugat oder Polymer davon.

2. Eine Peptidzusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin sie ein Konjugat von Peptid 127 und ein Protein mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000 enthält.

3. Eine Peptidzusammensetzung gemäß Anspruch 2V worin das Protein Rinderserumalbumin ist.

4. Eine Peptidzusammensetzung gemäß Anspruch IV welche enthält:

5. Eine Methode zur Ermittlung der Gegenwart von Antikörpern gegenüber HIV und der Gegenwart von neutralisierenden Antikörpern gegenüber HIV-gp-120 in einem Immunassay, dadurch gekennzeichnet, daß sie als das Immunosorbent eine Peptidzusammensetzung gemäß Anspruch 1 verwendet.

6. Ein Analog von Peptid-127, dadurch gekennzeichnetv daß es ausgewählt ist aus:

(i) TSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRQPCRAFVTIGK (Peptid -127HXB2)

(ii) ESVAINCTRPNNNTRKSIRYQRGPGRAFHTTGR (Peptid -127SP2)

(iii) ESVEINCTRVYRNLSKRIQRGPGRAFRTREI (Peptid -127WMJ2)

(iv) KSVEINCTRPNNNTKKGIAIGPQRTLYAREK (Peptid -127NY5)

(v) ASVQINCTRPNNNTRKSITKGPGRVIYATGQ (Peptid -127RF)

(vi) ETVTINCTRPCNNTRRGIHFGPGQALYTTGI (Peptid -127MAL)

(vii) KYYNLSLHKRPGNKTVKQIMLMSHRVFHSHYQ (Peptid -127HJV-2).

7. Neutralisierende Antikörper für das AIDS-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß sie hervorgerufen werden durch die Verwendung einer Peptidzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6.