KR102243374B1 - 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소 코로나바이러스(Bovine Coronavirus: BCV), 소 로타바이러스(Bovine Rotavirus; BRV) 및 소 바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus: BVDV)에 대한 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 불활화된 단독 백신주인 소 코로나바이러스 백신주(BCV Group 1b 타입주), 또는 불활화된 혼합 백신주인 소 코로나바이러스 백신주(BCV Group 1b 타입주), 소 로타바이러스 백신주(BRV G6P[5] 타입주) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주(BVDV Group 1a 타입주 및 BVDV Group 2a 타입주)를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 소 코로나바이러스(Bovine Coronavirus: BCV), 소 로타바이러스(Bovine Rotavirus; BRV) 및 소 바이러스성설사병바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus: BVDV)에 대한 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 불활화된 단독 백신주인 소 코로나바이러스 백신주(BCV Group 1b 타입주), 또는 불활화된 혼합 백신주인 소 코로나바이러스 백신주(BCV Group 1b 타입주), 소 로타바이러스 백신주(BRV G6P[5] 타입주) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주(BVDV Group 1a 타입주 및 BVDV Group 2a 타입주)를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.
소 코로나바이러스는 코로나바이러스과에 속하는 RNA 바이러스이다. 코로나바이러스가 일반적으로 감염시키는 숙주 동물은 사람, 마우스, 돼지, 개, 소 등으로 광범위하며 주로 동물의 분비물 또는 배설물을 통한 감염 및 호흡기 감염을 통해 전파된다. 소 코로나바이러스는 생후 3-21일령 어린 송아지의 설사병과 성우(成牛)의 겨울철 설사병(winter dysentery: WD)을 야기하는 주요 원인바이러스로 알려져 있다. 성우의 WD는 미국을 포함한 많은 국가들에서 임상적으로나 경제적으로 매우 중요한 질병으로 분류된다. 소 코로나바이러스 감염으로 인한 질병은 50-100%의 높은 이환율과 1-2%의 낮은 폐사율(특히, 송아지에서 높은 폐사율을 나타냄)을 보이며 계절별로는 11월과 이듬해 4월 사이에 소들을 방목하지 않고 우사에 가두었을 때 주로 낙농 젖소의 성우에서 자주 발생한다. 소 코로나바이러스는 임상적으로 혈액과 점액 방출이 동반되는 심한 수양성 설사(물같이)를 야기할 수 있으며, 젖소의 우유 생산량 감소, 식욕 부진, 침울, 체중 감소, 호흡 질환(기침 등), 비강 출혈 등을 발생시킬 수 있다. 소 코로나바이러스 감염으로부터 회복된 소들은 1-5년 동안 소 코로나바이러스 감염에 대한 면역력을 갖지만 완전하게 회복되지 않은 경우 소무리들에서 반복적인 소 코로나바이러스 감염을 유발할 수 있다. 소 코로나바이러스에 감염된 어린 송아지는 수양성 설사 및 출혈성 설사가 주요 증상으로 나타나며, 2-6일 동안 설사가 지속되고, 식욕 부진, 원기 소실 및 탈수로 인한 체중 감소가 유발된다. 소 코로나바이러스에 감염된 송아지는 이환율과 폐사율이 매우 높고 일부 개체에서 출혈성 설사 임상 증상이 발생한 이후에는 몇 시간 내에 저혈량으로 폐사 할 수 있다.
소 코로나바이러스는 설사를 유발하는 소화기형(enteric type)과 호흡기형(respiratory type)으로 나뉘어지는데 호흡기형 소 코로나바이러스의 경우 임상 증상이 보통 생후 2-16주령의 소에서 나타나며 주요 증상으로는 비염으로 인한 재치기 및 기관지염으로 인한 기침 등으로 설사와 관련 없이 매우 경미하게 호흡기 증상을 유발한다.
국내에서도 소 코로나바이러스가 호흡기형과 소화기형으로 존재하는데 축산농가에서 소화기형 소 코로나바이러스는 어린 송아지의 폐사와 성우의 겨울철 집단 설사 발병의 원인이 되고 있으며 한우뿐만 아니라 젖소에서도 우유 생산에 경제적 손실을 초래하고 있다. 국내에서 주로 사용중인 소 코로나바이러스 백신(BCV Vaccine)은 2000년 이전에 제작된 백신으로 BCV 유전자 I, II, III 타입 중에서 III 타입의 유전형을 갖는 소 코로나바이러스를 대상으로 한다. 2000년 이후 조사된 BCV 유전자형들은 I형이 주를 이루고 있으며, 2010년에 조사된 BCV 유전자형은 I형 중에서도 BCV-Ib 타입에 속하는 바이러스가 주를 이루는 것으로 조사되었다. 이처럼 최근 국내에서 유행하는 소 코로나바이러스와 사용 가능한 백신 간에 유전적 차이로 인해 기존 백신은 최근 국내에서 유행하는 소 코로나바이러스에 대한 면역 적합성이 문제가 될 수 있어 최근 유행하는 소 코로나바이러스에 대응(예방) 가능한 맞춤형 백신을 개발하여야 하는 필요성이 대두되고 있다.
소 로타바이러스는 Reoviridae 계열에 속하는 non-enveloped RNA 바이러스이고, 송아지, 특히 신생 송아지에서 발생되는 설사의 가장 흔한 원인인자로 알려져 있으며, 출생한지 5-14일된 송아지에서 설사를 주로 일으키나, 출생한지 1개월 이상된 송아지에서는 임상적인 설사 관련 병변은 잘 나타나지 않는다. 하지만 주기적인 무증상으로 오랜 기간 동안 소 로타바이러스에 감염된 송아지나 소에서는 소 로타바이러스의 방출(배출)로 인해 다른 개체를 감염시키는 원인이 되기도 한다. 일반적으로 소 로타바이러스에 의해 유발되는 설사는 송아지에서 엷은 황색 설사가 흔하지만 간혹 점액질 및 혈액이 수반되며, 어린 송아지에서 설사가 4-8일간 지속되는 경우 심한 탈수증과, 2차 병원균 감염으로 인해 병증이 악화될 수 있다. 소 로타바이러스 관련 병변은 소장에 한정되며, 병리조직학적으로 관찰해 보면 장융모 상피세포의 팽대, 변성 및 탈락 등이 보이며 계절적으로 늦겨울부터 초봄까지 심하게 나타나는 경향이 있다. 전세계적으로 로타바이러스는 사람뿐만 아니라 소, 돼지 등의 다양한 동물에서 심각한 신생축의 설사병을 유발하는 바이러스로 알려져 있으며, 바이러스 종간 전파가 용이하여 다양한 혈청형을 가지고 있다.
소 로타바이러스는 여섯 개의 바이러스 구조 단백질(structural protein, VP1-4, VP6-7)과 다섯 개의 비구조 단백질(NSP1-5)을 발현하는 11개의 분절을 가진 이중나선 RNA(dsRNA)로 구성되어있다. 이 중 두 개의 바깥쪽 켑시드(capsid) 단백질인 VP4와 VP7은 숙주 동물에게 있어서 소 로타바이러스 감염을 방어하는데 필수적인 중화항체를 유도하는 중요한 역할을 하며 각각 P와 G 유전형(genotype) 으로 분류된다. 축산농가에서 주로 검출되는 소 로타바이러스 G 유전형은 G6, G8 및 G10 타입이며, 소 로타바이러스 P 유전형은 P[1], P[5] 및 P[11] 타입으로 알려져 있다.
국내에서 주로 사용중인 소 로타바이러스 백신(BRV Vaccine)은 2000년 이전에 국내에서 만들어진 백신으로 소 로타바이러스 G6P[1]주 및 소 로타바이러스 G10P[11]주를 사용하였으나 최근 일선 축산농가 및 임상수의사들에 따르면 이러한 기존 백신은 최근 유행하는 소 로타바이러스 감염에 대한 방어 효능이 낮은 것으로 평가되었으며, 최근 야외 소 로타바이러스의 유전형 분포를 조사하기 위하여 2017-2018년에 모니터링 사업을 실시한 결과 소 로타바이러스 G6P[5]주가 80% 이상 검출되어 기존 백신으로는 최근 유행하는 소 로타바이러스를 효과적으로 방어하기에는 다소 어렵다는 것이 증명되었다.
소 바이러스성설사병바이러스는 Flaviviridae과의 Pestivirus속에 속하며, 전세계 대부분의 국가들에서 흔히 나타나는 소 관련 가축산업에 막대한 경제적 피해를 초래하는 바이러스로 잘 알려져 있다.
소 바이러스성설사병바이러스에 감염되면 면역억제 효과와 호흡기 질환 및 생식 능력에 직접적인 영향을 미치기 때문에 다양한 임상 증후를 동반한다. 특히. 소 임신기간 중 소 바이러스성설사병바이러스에 감염된 소는 감염된 PI(Persistent Infection) 송아지를 출산하게 되고 이러한 PI 송아지는 생주기 동안 지속적으로 소 바이러스성설사병바이러스를 배출하여 동거 소들을 감염시킨다. PI 동물의 보유율을 살펴보면, 유럽 국가들, 북미 국가들 및 호주는 0.8% 이하의 PI 동물 보유율을 가지고 있고, 동아시아에 위치한 국가들은 0.8-1.6%의 PI 동물 보유율을 가지고 있으며, 서아시아에 위치한 국가들은 1.6% 이상의 PI 동물 보유율을 가지는 것으로 알려져 있다. 상기 국가들에서는 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 통제 및 퇴치 프로그램이 실패로 돌아가 높은 수치의 PI 소 보유율을 나타내는 것으로 알려져 있다.
소 바이러스성설사병바이러스는 크게 Genotype 1(BVDV-1)과 Genotype 2(BVDV-2)로 나뉘어 지며, BVDV-1은 16개의 서브타입(a-p)으로 나뉘어지고 BVDV-2는 3개의 서브타입(a-c)으로 분류된다. BVDV-1은 대부분의 국가에서 존재하지만 BVDV-2는 북아메리카에서 발생되는 소 바이러스성설사병바이러스 관련 사례의 50%를 차지한다. BVDV-2는 2000년 영국에서 최초로 분리되었고, BVDV-2는 현재 유럽에서 소 바이러스성설사병바이러스 발생율의 11%를 차지한다. 소 바이러스성설사병바이러스는 PI 소에 의해 일시적/지속적으로 감염된 소에 의해 수평 및 수직 전파로 인해 감염되며, 소 바이러스성설사병바이러스는 감염 동물과의 직접접촉, 감염 동물의 분비물 및 소 바이러스성설사병바이러스에 오염된 기구 등을 통해 전염되고 환경에 의한 저항성도 높아 2주 이상 생체 밖에서 생존할 수도 있다.
국내에서 현재 사용중인 소 바이러스성설사병바이러스 백신(BVDV Vaccine)은 2000년 이전에 BVDV-1a 타입 한가지만 들어있는 백신으로, 2010년도 이후부터 국내에서 연구조사된 소 바이러스성설사병바이러스 조사 자료들에 따르면 BVDV-1 타입은 BVDV-1a와 BVDV-1b가 주를 이루며, BVDV-2 타입은 BVDV-2a가 주를 이루는 것으로 확인되었다. 또 다른 연구조사에서도 BVDV-1은 BVDV-1a와 BVDV-1b가 주를 이루지만 그 외에도 다양한 타입이 존재하는 것으로 파악되었다. 소 바이러스성설사병바이러스는 PI 송아지를 근절하기 위해서는 국제적인 소 바이러스성설사병바이러스 통제 프로그램에서도 BVDV-1 타입과 BVDV-2 타입을 통시에 백신 접종에 사용하도록 권고하고 있다. 그러므로 최근 국내에서 유행하는 2가지 타입의 BVDV 주들에 대응 가능한 맞춤형 백신을 개발하여야 하는 필요성이 대두되고 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 송아지 및 소에서 설사 문제를 야기하는 대표적인 3종의 바이러스인 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각에 대해서 최근 유행하는 바이러스 유전형에 적합한 항원으로 각 바이러스에 대한 단독 백신(Singular Vaccine; 1가 백신(Monovalent Vaccine)) 및 상기 3종의 바이러스에 대한 혼합 백신(Combination Vaccine; 다가 백신(Polyvalent Vaccine))을 개발하고자 예의 노력한 결과, 최종 선별된 3가지 유형의 바이러스 백신주, 즉 소 코로나바이러스 1주(BCV Group 1b 타입주), 소 로타바이러스 1주(BRV G6P[5] 타입주) 및 소 바이러스성설사병바이러스 2주(BVDV Group 1a 타입주 및 BVDV Group 2a 타입주)를 불활화시킨 후 단독 백신으로서 접종한 목적 동물의 혈청/혈액 내 중화항체 역가가 바이러스 유형별로 높게 나타났고, 특히 상기 3종의 바이러스 백신주를 불활화시킨 혼합 백신(복합 백신)으로 접종한 목적 동물에서도 바이러스 유형별로 혈청/혈액 내 중화항체 역가가 높게 나타나는 것으로 확인되어 각 유형별 바이러스에 대한 방어능이 매우 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 현재 우리나라 전역에서 유행하나 기존 백신주로는 방어가 어려운 소 코로나바이러스의 방어에 효과적인 신규 소 코로나바이러스 백신주와, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 3종 바이러스 방어에 효과적인 신규 소 코로나바이러스 백신주, 신규 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스주들을 이용한 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 예방용 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 신규 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401, 신규 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 및 소 바이러스설사병바이러스 백신주들인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 Bovine Coronavirus 17KBC401, Bovine Rotavirus 17KBR412, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 불활화시켜 제조한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 Bovine Coronavirus 17KBC401, Bovine Rotavirus 17KBR412, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 불활화시켜 제조한 백신 조성물을 제공한다.
삭제
본 발명에 따른 백신 조성물은 최근 5년 동안 국내에 유행하고 있는 소 코로나바이스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 예방 효능을 증진시켜 국내에서 사육되는 송아지 및 소들의 설사병 바이러스 감염으로 인한 설사 빈도 및 설사 증세를 감소시키는 효과가 높아 축산농가에 생산성 향상 및 경제적 이익을 극대화 할 수 있다.
도 1은 HRT-18 세포에 본 발명에 따른 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401 및 대조군인 BC94 백신주 각각의 바이러스 백신주를 접종한 후 형광현미경 및 광학현미경 하에서 FITC, DAPI, Merge, BF 채널로 각각의 바이러스 백신주로 접종한 HRT-18 세포를 관찰한 결과를 사진으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물(불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신; 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신)의 흑염소 접종 시험 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 2.5x107.0TCID50/dose)을 BEI(Binary ethyleneimine)로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01 겔)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 코로나바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 3.5x107.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 로타바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 9.83x107.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.3x107.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 코로나바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 로타바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소바이러스성설사병바이러스 타입 1에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소바이러스성설사병바이러스 타입 2에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신주(Bovine Coronavirus 17KBC401, Bovine Rotavirus 17KBR412, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 혼합물)를 어쥬번트와 혼합하여 준비된 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)을 흑염소에게 접종하고 도 2에 나타낸 바와 같이 기간별로 혈청을 채혈하여 백신 제조에 사용된 각각의 바이러스에 대한 중화항체가 변이(seroconversion)를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물(불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신; 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신)의 흑염소 접종 시험 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 2.5x107.0TCID50/dose)을 BEI(Binary ethyleneimine)로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01 겔)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 코로나바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 3.5x107.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 로타바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 9.83x107.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.3x107.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 2종(IMS1313과 Montanide01)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 코로나바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소 로타바이러스에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소바이러스성설사병바이러스 타입 1에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401(바이러스 역가: 6.25x106.0TCID50/dose), 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(바이러스 역가: 7.00x107.0TCID50/dose), 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 2.45x107.0TCID50/dose) 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)(바이러스 역가: 5.75x106.0TCID50/dose)를 BEI로 불활화한 후 어쥬번트 3종(IMS1313, Montanide01, Carbopol)으로 각각 혼합하여 3주 간격으로 2회 접종한 다음, 소바이러스성설사병바이러스 타입 2에 대한 중화항체 변화율을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신주(Bovine Coronavirus 17KBC401, Bovine Rotavirus 17KBR412, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 혼합물)를 어쥬번트와 혼합하여 준비된 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)을 흑염소에게 접종하고 도 2에 나타낸 바와 같이 기간별로 혈청을 채혈하여 백신 제조에 사용된 각각의 바이러스에 대한 중화항체가 변이(seroconversion)를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 최근 국내에 유행하고 있는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 바이러스에 대한 백신주를 이용하여 백신 조성물로 개발함으로써 기존의 상용화된 국내 백신들 보다 야외 바이러스에 더욱 적합한 백신주로 제작한 백신을 제공할 수 있으므로, 더욱 효과적으로 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 의해 발생되는 바이러스 질병을 예방할 수 있게 한다. 또한, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 백신주를 불활화시켜 제조한 3종 혼합 백신은 상용화된 제품이 없어 농가에서 1회 접종으로 3가지 바이러스에 의해 유발되는 질병을 매우 효과적으로 예방할 수 있는 편리성과 노동력 절감효과를 가져올 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 길이, 면적, 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.
일 관점에서, 본 발명은 신규한 그룹 1b 타입주에 속하는 소화기형 소 코로나바이러스 백신주, 더 구체적으로 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401에 관한 것이다.
본 발명의 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401의 Spike 유전자 염기서열은 서열번호 22로 표기되고, 상기 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401의 HE 유전자 염기서열은 서열번호 23으로 표기되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401은 사람 선암종 세포, 바람직하게는 결직장 선암종(Colorectal Adenocarcinoma) 세포인 HRT-18 세포에서 연속계대 배양 후, 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 5x107.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.
본 발명의 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401은 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18738P로 2018년 11월 7일에 수탁(기탁)되었다.
본 발명의 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401의 Spike 유전자 염기서열은 서열번호 22로 표기되고, 상기 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401의 HE 유전자 염기서열은 서열번호 23으로 표기되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401은 사람 선암종 세포, 바람직하게는 결직장 선암종(Colorectal Adenocarcinoma) 세포인 HRT-18 세포에서 연속계대 배양 후, 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 5x107.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.
본 발명의 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401은 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18738P로 2018년 11월 7일에 수탁(기탁)되었다.
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다른 관점에서, 본 발명은 불활화(불활성화)된 본 발명의 소 코로나바이러스 백신주를 유효성분으로 함유하는 소 코로나바이러스의 감염 예방 또는 소 코로나바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 불활화(불활성화)된 본 발명의 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주의 불활화된 바이러스를 함유하는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 감염 예방 및 소 설사병의 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주는 신규 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주는 신규 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주는 대한민국 등록특허 제10-1938556호에 명시된 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주는 신규 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주는 대한민국 등록특허 제10-1938556호에 명시된 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.
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공지의 불활화 처리 방법으로는, 예를 들어 바이러스 불활화에 사용되는 BEI(Binary ethyleneimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제(불활성화제)를 사용하여 불활화(불활성화)될 수 있다.
본 발명의 신규 소 코로나바이러스 백신주는 불활화 처리를 거친 후, 사람의 선암종 세포, 바람직하게는 HRT-18 세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 신규 소 로타바이러스 백신주는 불활화 처리를 거친 후, 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포, 가장 바람직하게는 TF-104 세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주인 대한민국 등록특허 제10-1938556호에 명시된 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)는 불활화 처리를 거친 후, 원숭이의 신장세포, 바람직하게는 Vero 세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주는,
(a) 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시켜 수득한 배양물에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 사람 선암종 세포에 접종(감염)시킨 후 30대 이상의 계대수(Passage Number), 바람직하게는 45~50대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0~1x108.0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지는 소 코로나바이러스일 수 있다.
본 발명의 신규 소 로타바이러스 백신주는 불활화 처리를 거친 후, 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포, 가장 바람직하게는 TF-104 세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주인 대한민국 등록특허 제10-1938556호에 명시된 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)는 불활화 처리를 거친 후, 원숭이의 신장세포, 바람직하게는 Vero 세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주는,
(a) 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시켜 수득한 배양물에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 사람 선암종 세포에 접종(감염)시킨 후 30대 이상의 계대수(Passage Number), 바람직하게는 45~50대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0~1x108.0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지는 소 코로나바이러스일 수 있다.
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본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 소 코로나바이러스 백신주 배양물의 상층액일 수 있다.
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본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활화 반응은 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서, 72시간 이상, 바람직하게는 48시간 이상, 가장 바람직하게는 20시간 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활화제의 중화제로서 불활화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 사용할 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 사람 선암종 세포로는 HRT-18 세포 등을 사용하거나, 소 신장세포로는 MDBK 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또, 본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주는,
(a) 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시켜 수득한 배양물에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시킨 후 5대 이상의 계대수, 바람직하게는 7~9대 이상의 계대수, 더 바람직하게는 7~25대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0~1x108.0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지는 소 로타바이러스일 수 있다.
또, 본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주는,
(a) 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시켜 수득한 배양물에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시킨 후 5대 이상의 계대수, 바람직하게는 7~9대 이상의 계대수, 더 바람직하게는 7~25대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0~1x108.0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지는 소 로타바이러스일 수 있다.
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본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 소 로타바이러스 백신주 배양물의 상층액일 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활화 반응은 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서, 72시간 이상, 바람직하게는 48시간 이상, 가장 바람직하게는 24~33시간 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활화제의 중화제로서 불활화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 사용할 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 원숭이 신장세포로는 MA-104 세포, LLC-MK2 세포, BSC-1 세포, CV-1 세포, Vero 세포, CMK 세포, AGMK 세포, TF-104 세포 등을 사용할 수 있고, 소 신장세포로는 MDBK 세포, GBK 세포, FBK 세포 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 MA-104 세포 또는 TF-104 세포를 사용한다.
본 발명의 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주는 대한민국 등록특허 제10-1938556호에 명시된 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 제조방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주의 제조에 사용되는 소 바이러스성설사병바이러스는 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주를 원숭이 신장세포, 바람직하게는 Vero 세포에 접종(감염)시킨 후 20대 이상의 계대수, 바람직하게는 25대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106. 0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0~1x108. 0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지는 소 바이러스성설사병바이러스일 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주의 제조에 사용되는 소 바이러스성설사병바이러스는 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주를 원숭이 신장세포, 바람직하게는 Vero 세포에 접종(감염)시킨 후 20대 이상의 계대수, 바람직하게는 25대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0~1x108. 0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지는 소 바이러스성설사병바이러스일 수 있다.
상기 소 코로나바이러스의 감염 예방 또는 소 코로나바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물인 1가 백신 조성물(Monovalent Vaccine Composition), 또는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 감염 예방 및 소 설사병의 예방용 백신 조성물인 다가 백신 조성물(Polyvalent Vaccine Composition)은 불활성화된 바이러스 백신주 이외에도, 1종 이상의 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 어쥬번트, 항생제, 면역조절제 등을 더 포함할 수 있다.
본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매(용액), 분산 매질, 코팅제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제(항균제, 항진균제 등), 흡착 지연제, 보조제(어쥬번트, Adjuvant), 삽입물 등을 의미한다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 1종 이상의 전달 비히클(Vehicle)의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 1종 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 1종 이상 이내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.
상기 희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등이 포함될 수 있고, 상기 등장성 작용제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 상기 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 보조제로는 광물성 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어 사포닌 유도체, 예를 들어 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가음이온(다중음이온); 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루론 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어 몬타나이드(Montanide) ISA-50(셉픽(Seppic), 프랑스), 카보폴(Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II(하이드로닉스(Hydronic), 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼(예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체(CytRx, 죠지아주 아틀란타); SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균(E. coli) 유래 열-불안정성 장 독소(재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313(셉픽(Seppic사), 프랑스); ISA206; 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel)(셉픽(Seppic), 프랑스); 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 IMS1313, 카보폴 및 몬타나이드 01 겔로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트이다. 상기 어쥬번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다.
상기 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물에 포함되는 상기 불활화된 바이러스 백신주(들)와 어쥬번트의 혼합비율은 부피 기준으로, 5~9 : 1~5, 바람직하게는 6~9 : 1~4, 더 바람직하게는 7~9 : 1~3, 가장 바람직하게는 7 : 3 또는 9 : 1일 수 있다.
상기 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물에 포함되는 불활화된 소 코로나바이러스 백신주는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 3x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 6.25x106.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
상기 다가 백신 조성물에 포함되는 불활화된 소 로타바이러스 백신주는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 3.5x107.0~7.0x107.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
상기 다가 백신 조성물에 포함되는 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1의 백신주는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 2.45x107.0~9.83x107.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)를 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
상기 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물에 포함되는 상기 불활화된 바이러스 백신주(들)와 어쥬번트의 혼합비율은 부피 기준으로, 5~9 : 1~5, 바람직하게는 6~9 : 1~4, 더 바람직하게는 7~9 : 1~3, 가장 바람직하게는 7 : 3 또는 9 : 1일 수 있다.
상기 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물에 포함되는 불활화된 소 코로나바이러스 백신주는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 3x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 6.25x106.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
상기 다가 백신 조성물에 포함되는 불활화된 소 로타바이러스 백신주는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 3.5x107.0~7.0x107.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
상기 다가 백신 조성물에 포함되는 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1의 백신주는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 2.45x107.0~9.83x107.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)를 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
상기 다가 백신 조성물에 포함되는 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 백신주는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 5x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 5.75x106.0~2.3x107.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
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상기 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물에 포함되는 항생제로는 겐타마이신(Gentamicin) 및 메티올레이트(Merthiolate)가 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물은 사이토카인(예컨대, 인터류킨, 인터페론 등)과 같은 1종 이상의 면역조절제를 더 포함할 수 있다.
상기 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물은 주사 용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 냉동-건조, 동결-건조 또는 탈수 형태(단, 투여 전에 제약상 허용되는 비히클(예컨대, 멸균 식염수, 완충액 등)로 재수화 또는 현탁됨)로 제조될 수 있다.
상기 1가 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)로서, 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물(Ruminant)에서 소 코로나바이러스 감염에 따른 증상을 예방, 방어, 관리 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서 본원 명세서에 개시된 백신 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.
상기 다가 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)로서, 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물(Ruminant)에서 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 감염에 따른 증상을 예방, 방어, 관리 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서 본원 명세서에 개시된 백신 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.
상기 1가 백신 조성물은 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물의 소 코로나바이러스에 대한 면역반응 유도용일 수 있다.
상기 다가 백신 조성물은 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물의 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2에 대한 면역반응 유도용일 수 있다.
상기 반추동물은 소, 산양, 면양, 사슴, 낙타 및 기린으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 "소"란 용어는 수소, 암소, 수송아지, 암송아지, 임신우, 수유중인 암소, 임신우의 태아 등 모두를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 임신중인 암소(임신우), 수유중인 암소, 임신우의 태아 등의 소과 동물이 모두 포함된다.
목적 동물(숙주 동물)의 면역반응 유도를 위한 효과적인 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물의 용량은 각 백신 조성물의 성분 및 목적 동물(숙주 동물) 투여 스케쥴에 따라 달라진다. 특히 각 백신 조성물에 포함되는 각 바이러스 백신주의 정확한 용량은 목적 동물(숙주 동물)의 면역반응을 효과적으로 유도해낼 수 있는 양(유효량)을 의미하며, "효과량(유효량)"이란 용어는 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물이 투여되는 동물에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 백신 조성물의 양을 말한다.
상기 면역반응은, 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료적으로 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정 바이러스, 목적 동물(예컨대, 소)의 상태 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다.
본원 명세서에서, '치료'란 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 본 발명에 따른 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물은 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로에 의해 소에게 투여하지만, 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구 투여, 비강 투여(예컨대, 에어로졸 또는 다른 무침 투여), 경피 투여 및 비경구 투여(예컨대, 정맥주사, 복강 투여, 림프절내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 질 투여 또는 근육내 투여), 또는 이들 투여 경로를 조합한 경로를 포함하는 공지된 경로를 통해 수행될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더욱 바람직한 투여 경로는 피하 투여 또는 근육내 투여이며, 가장 바람직한 투여 경로는 동물의 목 부분의 근육내 투여이다.
상기 "TCID50(Tissue Culture Infective Dose 50%)"는 바이러스의 "감염유발 단위"로, 세포 또는 조직 배양물의 50％를 감염 또는 사망시키는데 필요한 양으로 정의된다. 상기 TCID50의 계산방법을 간략하게 설명하면, 먼저 바이러스 시료를 연속계단희석(Serial Dilution)하고 각 희석된 바이러스 시료를 세포배양용 플레이트(예컨대, 96-well plate)의 각 웰에서 동일한 수로 배양된 숙주세포들에 첨가하여 감염시킨 다음, 세포병변을 나타내는 웰 수를 확인하여 50%의 웰 수에서 세포병변을 나타내는 희석율의 역수로 최종 바이러스의 TCID50 값을 계산한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 1가 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소 코로나바이러스 함유 추정 시료의 소 코로나바이러스의 검출 또는 소 코로나바이러스 유전형의 판별용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 다가 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 함유 추정 시료의 각 바이러스의 검출 또는 각 바이러스 유전형의 판별용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 판별 또는 검출은 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 1가 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소 코로나바이러스 함유 추정 시료의 소 코로나바이러스의 검출 또는 소 코로나바이러스 유전형의 판별용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 추가로 상기 항체와 소 코로나바이러스 함유 추정 시료 내 소 코로나바이러스, 또는 소 코로나바이러스의 파편들(Fragments)간 혼성화되는 반응을 탐지하기 위한 검출시약을 더 포함할 수 있으며, 검출시약은 검사하고자 하는 표적물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지시약(Labelled Reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성성분이 구비될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 다가 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 함유 추정 시료의 각 바이러스의 검출 또는 각 바이러스 유전형의 판별용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 추가로 상기 항체와 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 함유 추정 시료 내 각 바이러스, 또는 각 바이러스의 파편들간 혼성화되는 반응을 탐지하기 위한 검출시약을 더 포함할 수 있으며, 검출시약은 검사하고자 하는 표적물질의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지시약, 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성성분이 구비될 수 있다.
상기 표지시약 즉, 표지된 검출시약은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 것을 사용할 수 있으며, 상기 표지는 예컨대 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타아제, 퍼옥시다아제 등, 보다 구체적인 예로는 염기성 포스퍼타아제와 호스래디시 퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase, HRP) 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도페와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플루우레세인(Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine) 등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate Latex), 발색 지시약(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color Matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보조적 특이결합부재의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 예를 들면, 아비딘(Avidin), 바이오틴(Biotin), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 항-FITC 항체, 마우스 면역 글로불린, 항-마우스 면역 글로불린 항체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 1가 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 이용하여 소 코로나바이러스 함유 추정 시료의 소 코로나바이러스를 검출하고 소 코로나바이러스의 유전형을 판별하는 단계를 포함하는 소 코로나바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 다가 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 이용하여 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 함유 추정 시료의 각 바이러스를 검출하고 각 바이러스의 유전형을 판별하는 단계를 포함하는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 판별 또는 검출은 조직면역염색법, 방사능면역분석법, 효소결합 면역흡착 검사법, 웨스턴블럿팅, 면역침전분석법, 면역확산분석법, 보체고정분석법, FACS 및 단백질칩 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 1가 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 이용하여 소 코로나바이러스 함유 추정 시료의 서로 다른 유전형의 소 코로나바이러스를 판별하고 검출하는 단계를 포함하는 서로 다른 유전형의 소 코로나바이러스에 대한 교차면역반응 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소 코로나바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법, 방사능면역분석법, 효소결합 면역흡착 검사법, 웨스턴블럿팅, 면역침전분석법, 면역확산분석법, 보체고정분석법, FACS 및 단백질칩 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "시료(검체)"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(Biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2와 혼합된 시료이거나, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2에 감염된 개체(예컨대, 소 등)의 시료일 수 있으며, 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직(Tissue) 또는 기관(Organ)으로부터 유래될 수 있다.
상기 조직의 대표적인 예로는, 결합 조직(Connective Tissue), 피부 조직, 근육 조직 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(Fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(Medium)도 포함하며, 이는 인간 또는 동물로부터 채취된 시료, 또는 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "백신"이라는 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물과 같은 동물에 투여될 수 있는 형태의 면역원성 조성물을 함유하는 조성물 또는 제제를 지칭한다.
본 발명에 따른 1가 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)에 투여하기 위해 제제화된, 본원 명세서에 개시된 면역원성 조성물인 소 코로나바이러스 백신주를 포함하는 조성물 및 기타 면역원성 조성물들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 다가 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)에 투여하기 위해 제제화된, 본원 명세서에 개시된 면역원성 조성물인 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주를 포함하는 조성물 및 기타 면역원성 조성물들을 포함할 수 있다.
상기 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1의 백신주 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 백신주를 포함하는 면역원성 조성물의 "면역원성"은 각 바이러스 백신주의 서로 다른 유전형, 특히 각 바이러스 백신주에 대해 목적 동물(숙주 동물)에서 면역 반응을 유발하는 각 바이러스 백신주의 능력(항원으로서의 작용력)을 의미한다. 면역반응은 주로 세포독성 T-세포에 의해 매개되는 세포성 면역반응, 또는 B-세포를 활성화시켜 항체 생성을 유도하는 보조 T-세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역반응일 수 있다.
특히, "면역원성"이라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에서 면역반응을 유발하는 소 코로나바이러스를 구성하는 핵산, 폴리펩티드 등의 물질을 지칭하는 것으로 체액성 유형(B 세포) 및/또는 세포성 유형(T 세포)의 면역반응을 유도할 수 있는 물질들이 이러한 특성을 갖는다.
특히, "면역원성"이라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에서 면역반응을 유발하는 소 코로나바이러스를 구성하는 핵산, 폴리펩티드 등의 물질을 지칭하는 것으로 체액성 유형(B 세포) 및/또는 세포성 유형(T 세포)의 면역반응을 유도할 수 있는 물질들이 이러한 특성을 갖는다.
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상기 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)에 도입 시 면역반응, 바람직하게는 도입된 항원(들)에 대해 특이적인 면역반응을 일으킬 수 있는데, 이와 같은 면역반응은 백신 접종된 목적 동물(숙주 동물)의 세포 및 조직 내에서의 특이적 항체의 생산, 사이토카인, 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 기타 세포성 반응의 활성화 여부로 검출하되, 면역학 업계의 당업자에게 공지된 통상적인 검정법을 사용하여 쉽게 검출 가능하다.
소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2는 분변-경구 방식으로 바이러스 감염 개체로부터 다수의 비감염 개체들에게 전파된다. 특히, 바이러스 감염 징후를 유발하는데 필요한 바이러스 수는 바이러스의 유전형 및 바이러스 발생 지역(Origin)의 특성에 따라 바이러스의 병원성 및 동물 무리 전체에 전파되는 속도와 연관이 있는 것으로 보고된 바 있다.
동물의 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 감염 여부는 증상학(Symptomology)에 의해 확인될 수 있다. 상기 바이러스들에 감염된 동물의 통상적인 증상으로는 수양성 설사, 우울감, 식욕 부진, 탈수 증세 등이 포함될 수 있으며, 현재까지의 바이러스 감염증의 진단은 상기 증상들을 기준으로 이루어져 왔다.
그러나 혈청학적 연구에 따르면, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2로 감염된 소들은 임상적 증후가 나타나지 않더라도, 지속감염(Persistent Infection, PI)이 되어 있는 것으로 보고된 바 있다.
따라서, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 감염 동물의 바람직한 확인방법은 증상학에 의존하기보다는 혈청학적 분석방법을 통해 바이러스 자체의 존재를 검출하는 것이다. 예컨대, 바이러스 및/또는 바이러스-감염 동물의 정확한 검출방법으로는 바이러스 분리법(Virus Isolation), 바이러스 역가 측정(Virus Titration), 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법이 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 바이러스 분리법, 역전사-중합효소 연쇄 반응, 조직면역염색법, 효소결합 면역흡착 검사법이 포함된다(Haines et al., Vet. Pathol ., 29(1):27-32, 1992; Homer et al., Vet. Microbiol ., 43(1):75-84, 1995).
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 1가 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물, 가장 바람직하게는 소 또는 송아지에 투여하여 소 코로나바이러스에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 다가 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물, 가장 바람직하게는 소 또는 송아지에 투여하여 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다
본 발명에 따라, 임신우 및 임신우의 젖을 먹는 송아지를 포함하는 소에 투여되는 효과량의 1가 백신 조성물 및 다가 백신 조성물은 바이러스와 관련된 질병 및 태아 감염에 대한 효과적인 면역성을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 1가 백신 조성물 또는 다가 백신 조성물을 송아지에게 약 1 내지 4주의 간격으로 2회 투여한다. 예를 들어, 제1 투여는 동물이 약 1 내지 약 3개월이 되었을 때 수행된다. 제2 투여는 백신 조성물의 제1 투여 이후 약 1 내지 약 4주 후 수행된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 투여는 교미 5주 전에 수행된다. 제2 투여는 교미 2주 전에 수행된다. 후속 1가 백신 조성물 또는 다가 백신 조성물의 투여량의 투여는 바람직하게는 해마다 실시해온 바에 근거하여 수행된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 약 6개월이 되기 전에 백신 접종된 동물은 6개월이 된 후 다시 백신 접종되어야 한다. 후속 백신 투여는 바람직하게는 해마다 실시해온 바에 근거하여 수행된다. 효과적인 백신의 투여량은 백신의 성분 및 투여 일정에 따라 좌우된다. 전형적으로, 불활성화된 바이러스 제제가 백신 조성물에 사용되는 경우, 약 3 내지 4주의 기간 동안 목적 동물(숙주 동물)에 2회 투여될 때 바이러스 투여량 당 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106. 0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 5x106.0~1x108.0TCID50/mL의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 백신의 양이 효과적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[실시예 1]: 소 코로나바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신, 및 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신의 제작에 사용되는 바이러스 백신주의 준비
[1-1]: 최근 국내에서 유행하는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스의 선발
최근 국내(한국)에서 유행하는 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스 분리를 위해 2017~2018년에 걸쳐 전국에서 183개의 소 설사병 의심 분변 시료를 수집하였다. 상기 수집한 각 시료의 분변 약 2g에 1% 겐타마이신(Gentamicin, Sigma, USA)을 함유하는 1X PBS(Phosphate-Buffered Saline, Welgene, South Korea) 3mL을 첨가하여 현탁시킨 후 3,000rpm에서 약 15분간 원심분리하였다. 그다음, 각 시료의 분변 현탁액(Suspension)의 상층액을 수거한 후 RNA 분리 시약을 이용하여 상기 상층액에 포함된 핵산을 분리(추출)한 다음, RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 분석방법을 통해 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스의 양성반응 여부를 확인하였다.
< RT- PCR 분석방법 >
RT-PCR 분석방법에 필요한 RNA 추출 키트(RNeasy Mini Kit(Cat.No.74104), Qiagen Inc., USA), PCR Premix Kit(AccuPower Profi Taq PCR Premix(Cat.No.K-2632), Bioneer Inc. South Korea) 및 cDNA 합성 키트(HelixCript Easy cDNA Synthesis Kit(Cat.No.ECDNA100), Nanohelx Inc., South Korea)를 준비하였다
먼저, RNA 추출 키트를 이용하여 상기 분변 현탁액의 RNA를 분리하고, 상기 분리한 RNA를 cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성(RT, Reverse Transcription)하였다. 합성된 cDNA와, 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스 각각의 바이러스에 특이적 프라이머 쌍(아래 표 1 및 표 2 참조)을 PCR Premix Tube(시험약에 Taq Polymerase 포함)에 첨가한 후, 하기 반응조건으로 PCR을 수행하여 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.
RT-
PCR
반응조건
(1) RT: 상기 cDNA 합성 키트 및 상기 분변 현탁액의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
(2) PCR: 상기 합성된 cDNA를 이용하여, [95℃: 5분], [(95℃: 45초; 50℃: 45초; 68℃: 60초) x 40cycle], 및 [68℃: 5분]으로 PCR 반응을 수행하였다.
상기 RT-PCR 반응생성물을 1%(W/V) 겔 상에서 전기영동한 후, 상기 반응생성물의 증폭된 핵산의 분자량을 확인하여 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.
표 1은 소 코로나바이러스의 Spike 유전자 및 HE 유전자의 염기서열 확인용 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.
| 표적 유전자 | 프라이머 쌍a | 프라이머 서열 (5' to 3') | 증폭부위 | PCR산물 크기 | 서열목록 |
| Spike | S1-F | TTGTGTGTATGATCCGCTACC | -138~+920 | 1058 bp | 서열번호 1 |
| S1-R | ACACCAGTAGATGGTGCTAT | 서열번호 2 | |||
| S2-F | GGGTTACACCTCTCACTTT | +781~+1550 | 770 bp | 서열번호 3 | |
| S2-R | GCAGGACAAGTGCCTATACC | 서열번호 4 | |||
| S3-F | CTGTCCGTGTAAATTGGATG | +1459~+2286 | 828 bp | 서열번호 5 | |
| S3-R | TGTAGAGTAATCCACACAG | 서열번호 6 | |||
| S4-F | TTCACGACAGCTGCAACCTA | +2151~+3022 | 872 bp | 서열번호 7 | |
| S4-R | CCATGGTAACACCAATCCCA | 서열번호 8 | |||
| S5-F | CCCTGTATTAGGTTGTTTAG | +2691~3606 | 916 bp | 서열번호 9 | |
| S5-R | ACCACTACCAGTGAACATCC | 서열번호 10 | |||
| S6-F | GTGCAGAATGCTCCATATGGT | +3439~+4217 | 779 bp | 서열번호 11 | |
| S6-R | CCCACTAAACAGCAGGCATT | 서열번호 12 | |||
| HE | HE-F | GAGACTARRCTCAGTGAAAATG | -19~+1302 | 1320 bp | 서열번호 13 |
| HE-R | GTATCAAAAACATGTTTAGATTATGGTCTA | 서열번호 14 |
표 2는 소 로타바이러스의 VP7 유전자 및 VP4 유전자의 염기서열 확인용 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.
| 표적 유전자 | 프라이머 쌍 | 프라이머 서열(5' to 3') | PCR 산물 크기 | 서열목록 |
| VP4 | VP4-01-F | ATG GCT TCG CTC ATA TAC AGA CAG | 1085bp | 서열번호 15 |
| VP4-01-R | AAT GCT TGT GAA TCG TCC CA | 서열번호 16 | ||
| VP7 | VP7-01-F | GGC TTT AAA AGC GAG AAT TT | 1062bp | 서열번호 17 |
| VP7-01-R | GGT CAC ATC ATA CAA CTC TA | 서열번호 18 | ||
| VP7-02-F | GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG G | 1062bp | 서열번호 19 | |
| VP7-02-R | GGT CAC ATC ATA CAA TTC TAA TCT AAG | 서열번호 20 | ||
| VP7-03-F | GCC TTT AAA AGC GAG AAT TT | 1062bp | 서열번호 21 | |
| VP7-01-R | GGT CAC ATC ATA CAA CTC TA | 서열번호 18 |
다음으로, 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스 각각에 대해 양성반응이 확인된 시료로부터 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스 각각의 바이러스 백신주를 확립하기 위해 사용되는 세포주 및 이의 배양 조건을 확립하고자 하였다. 구체적으로, 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스 각각의 바이러스 백신주를 확립하기 위해 사용될 각 바이러스의 최적의 배양 조건을 확인하기 위해 기존 백신주인 BCV-BC94주(BC94 백신주), BRV-678 주, P44 주를 이용하였다.
그 결과, 소 코로나바이러스 백신주의 확립에 적합한 세포주는 HRT-18 세포주 및 MDBK 세포주인 것을 확인하였고(도 1 참조), 소 로타바이러스 백신주의 확립에 적합한 세포주는 TF-104 세포주인 것을 확인하였다(데이터 미도시)
그 결과, 소 코로나바이러스 백신주의 확립에 적합한 세포주는 HRT-18 세포주 및 MDBK 세포주인 것을 확인하였고(도 1 참조), 소 로타바이러스 백신주의 확립에 적합한 세포주는 TF-104 세포주인 것을 확인하였다(데이터 미도시)
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다음으로, 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스 각각의 바이러스 접종 전 세포주에 처리되는 트립신(Trypsin)의 전처리 농도를 확인하기 위해서 소 코로나바이러스는 트립신 0.5-5μg/ml, 소 로타바이러스는 트립신 0.5-15μg/ml의 전처리 농도에서 세포배양을 실시하였고 각 트립신 전처리 농도범위 안에서 계대배양이 적합함을 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스의 증식 정도로 위 RT-PCR 분석방법을 통해 확인하였다.
그 결과, 소 코로나바이러스는 1-5μg/ml의 트립신 농도, 소 로타바이러스는 0.5-15μg/ml의 트립신 농도에서 세포배양 시 각각의 바이러스가 잘 증식하는 것을 확인하였다(데이터 미도시).
상기와 같이, 특정 세포주에서 바이러스 접종 전 특정 농도범위의 트립신 전처리 농도에서 세포배양을 실시하여 소 코로나바이러스 및 소 로타바이러스 각각의 바이러스 백신주를 확립하였고, 확립한 각각의 바이러스 백신주의 특성을 분석하였다.
먼저, 소 코로나바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료를 1-5μg/ml의 트립신 농도로 전 처리된 HRT-18 세포주에 접종하고 계대배양하여 각 계대에서 표 1에 제시된 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR로 소 코로나바이러스에 대한 양성반응을 확인하고, 도 1에 나타낸 바와 같이 세포변성효과(CPE)의 관찰과 소 코로나바이러스 특이적 항체를 이용한 형광항체염색(FA staining; fluorescent antibody staining)법을 통해 소 코로나바이러스 백신주를 확립하였다.
상기 소 코로나바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료(야생형 소 코로나바이러스)를 트립신으로 전 처리된 HRT-18 세포주에 접종한 후 계대배양하여 확립한 소 코로나바이러스 백신주는 Bovine Coronavirus 17KBC401로 명명하였고, 상기 Bovine Coronavirus 17KBC401을 HRT-18 세포 또는 MDBK 세포에서 계대배양한 결과, 50계대수에서의 바이러스 역가는 5x107.0TCID50/ml인 것으로 확인되었다(데이터 미도시).
다음으로, 소 로타바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료를 0.5-15μg/ml의 트립신 농도로 전 처리된 TF-104 세포주에 접종하고 계대배양하여 각 계대에서 표 2에 제시된 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR로 소 로타바이러스에 대한 양성반응을 확인하고, 세포변성효과의 관찰과 소 로타바이러스 특이적 항체를 이용한 형광염색법을 통해 소 로타바이러스 백신주를 확립하였다(데이터 미도시).
상기 소 로타바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료(야생형 소 로타바이러스)를 트립신으로 전 처리된 TF-104 세포주에 접종한 후 계대배양하여 확립한 소 로타바이러스 백신주는 타입(G6P[5])인 것으로 확인되어 Bovine Rotavirus 17KBR412로 명명하였고, 상기 Bovine Rotavirus 17KBR412를 TF-104 세포에서 계대배양한 결과, 23계대수에서의 바이러스 역가는 1x108.0TCID50/ml인 것으로 확인되었다.
소 바이러스성설사병바이러스는 등록특허 제10-1938556호에 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18531P로 수탁된 소 바이러스설사병바이러스(BVDV) 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)와 수탁번호 KCTC18533P로 수탁된 소 바이러스설사병바이러스(BVDV) 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 이용하여 Vero 세포주에서 증식시켰다. 그 결과, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)의 25계대수에서의 바이러스 역가는 1x108.0TCID50/ml이었고, BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 25계대수에서의 바이러스 역가는 5x107.0TCID50/ml인 것으로 확인되었다.
결국, Bovine Coronavirus 17KBC401, Bovine Rotavirus 17KBR412, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)는 각각 특정 세포주에서의 특정 계대수에 따라 시간대별 바이러스 증식성 조사결과에서 유효한 바이러스 역가(바이러스 함량) 차이를 보이면서 증식하는 것을 확인하였다.
[1-2]: 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주의 상관계통도 분석
실시예 1의 [1-1]의 방법으로 확립한 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401에 대해 표 1에서 제시된 프라이머 쌍을 이용하여 표적 유전자인 spike 유전자와 HE 유전자의 염기서열 전체를 실시예 1의 [1-1] RT-PCR 조건으로 확인하였다.
RT-PCR 반응생성물을 시퀀싱으로 염기서열 분석을 한 결과, 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401은 2017년과 2018년에 집중적으로 검출되는 Group 1b에 속하는 것으로 확인되었다(현재 보편적으로 백신 제조에 사용되고 있는 소 코로나바이러스 백신주들은 Group 3에 속함).
또, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 정확한 유전형을 확인하기 위해 표 2에 제시된 프라이머를 이용하여 소 로타바이러스에서 유전형을 결정하는데 필수적인 VP7 과 VP4 유전자를 실시예 1의 [1-1] RT-PCR 조건으로 각각 증폭시켰다. 이후 RT-PCR 반응생성물을 시퀀싱으로 염기서열 분석을 한 후, 다른 국내 소 로타바이러스 검출주 및 기존의 백신주와의 상관계통도 분석(Phylogenic tree analysis)을 수행하였다.
그 결과, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 VP7 유전자 계통도 분석에 따르면 G6 타입인 것으로 확인되었으며, VP4 유전자 계통도 분석 결과에 따르면 P[5] 타입인 것을 확인하였다.
상기 시험결과를 토대로, 본 발명에 따른 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2018년 11월 7일자로 수탁(기탁)하였고, 수리되어 수탁번호 KCTC18738P를 부여받았다. 또한, 본 발명에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2018년 11월 7일자로 수탁(기탁)하였고, 수리되어 수탁번호 KCTC18739P를 부여받았다.
소 바이러스성설사병바이러스 백신주는 대한민국 등록특허 제10-1938556호에 명시된 것과 같이 소 바이러스설사병바이러스(BVDV) 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)는 BVDV 1a 타입이고, BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)는 BVDV 2a 타입인 것을 시퀀싱을 통한 염기서열 분석결과로 확인하였다.
[실시예 2]: 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주, 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주들의 백신으로서의 평가
[2-1]: 서로 다른 어쥬번트를 포함하는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신의 제조
실시예 1에서 준비한 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 바이러스 백신주를 불활화시키기 위해 불활화 백신 제조에 일반적으로 쓰이는 BEI 처리법(BEI[Binary ethyleneimine] treatment method)으로 각 바이러스 종마다 적합한 BEI 처리농도와 처리시간으로 불활화 처리된 백신주를 제조한 다음, 바이러스의 불활화 여부를 확인하기 위하여 불활화 처리된 백신주를 세포에 접종한 후 세포변성효과(CPE)의 유무를 FA 염색법을 통해 확인하였다. 여기서, BEI는 2-BEA(2-Bromoethylamine Hydrobromide, Sigma, USA)를 0.2N NaOH 용액에 0.1M이 되도록 용해하여 37℃ 항온 수조에서 1시간 처리하여 0.1M BEI로 제조한 것이다(4℃ 보관).
먼저, 소 코로나바이러스 백신주의 경우, 1mM BEI 최종 처리농도에서 1) 37℃, 20hrs, 2) 실온, 48hrs의 처리 조건으로 불활화 처리한 결과, 1mM BEI, 37℃, 20hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활화되는 것을 세포접종을 통해 확인하였다.
다음으로, 소 로타바이러스 백신주의 경우, 3, 6, 9mM BEI 최종 처리농도에서 1) 37℃, 24hrs, 2) 실온, 24hrs의 처리 조건으로 불활화 처리한 결과, 9mM BEI, 37℃, 24hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활화되는 것을 세포접종을 통해 확인하였다.
또, 소 바이러스성설사병바이러스 백신주의 경우, 1mM BEI 최종 처리 농도에서 1) 37℃, 24hrs, 2) 실온, 24hrs의 처리 조건으로 불활화 처리한 결과, 1mM BEI, 37℃ 24hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활화되는 것을 세포접종을 통해 확인하였다.
아울러, 불활화 처리된 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 백신주 시료에 함유된 BEI의 중화를 위해서 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)를 첨가하여 37℃에서 약 1시간 동안 반응시킨 후에 불활화/안정화 공정을 마무리하였다. 바이러스 백신주의 불활화 여부의 확인은 불활화 처리된 바이러스 백신주를 세포에 접종하여 3일간 배양 후 세포변성효과의 유무를 확인하거나, 항체반응을 통해 바이러스 백신주를 접종한 세포의 세포염색반응으로 바이러스 검출을 통해 바이러스 백신주의 활성(감염성) 여부를 확인하였다.
그 결과, 불활화/안정화 공정을 마친 소 코로나바이러스 백신주를 HRP-18 세포에 접종하고, 불활화/안정화 공정을 마친 소 로타바이러스 백신주를 TF-104 세포에 접종하고, 불활화/안정화 공정을 마친 소 바이러스성설사병바이러스 백신주를 Vero 세포에 접종한 후 72시간 동안 배양하더라도 세포변성효과가 없는 것으로 나타나 불활화 처리가 완료된 것을 확인하였다(데이터 미제시).
한편, 후술되는 시험에서 동물의 백신 접종에 사용되는 어쥬번트(adjuvant)로 IMS1313(Seppic), Montanide 01 gel(Seppic) 및 Carbopol(Lubrizol)을 각각 30%(v/v), 10%(v/v) 및 10%(v/v)가 되도록 항원 시료인 단독 백신주(소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 또는 소 바이러스성설사병바이러스 백신주), 또는 혼합 백신주(소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주)와 혼합하여 백신 조성물을 제조하였다.
[2-2]: 불활화된 1종 또는 복수의 바이러스 백신주로 이루어진 백신 조성물의 안전성 및 면역원성 평가
소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 바이러스 백신주를 백신용 항원으로 사용하고, 이와 조합되는 어쥬번트별로 11 그룹으로 나누어 바이러스 항원 및 어쥬번트로 이루어진 백신을 흑염소(체중 25kg/마리; 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 항체반응 음성)에 3주 간격으로 2회 접종하였다(근육 접종: 매회 5ml/dose 접종)(도 2의 흑염소 접종 시험 모식도 참조).
구체적으로, 상기 그룹은 총 11그룹으로 준비되었으며,
(1) 불활화된 소 코로나바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 3 참조);
(2) 불활화된 소 코로나바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 3 참조);
(3) 불활화된 소 로타바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 4 참조);
(4) 불활화된 소 로타바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 4 참조);
(5) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 5 참조);
(6) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 5 참조);
(7) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 6 참조);
(8) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 6 참조);
(9) 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 7~10 및 도 11 참조);
(10) 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 7~10 참조); 및
(11) 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신(바이러스:Carbopol의 부피비 = 9:1)(도 7~10 참조)으로 구성되었다.
불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 BVD 1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD 2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 바이러스 항원을 부피 기준으로 1:1의 용량으로 혼합하였다. 또, 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신은 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주의 바이러스 항원을 부피 기준으로 1:1:2의 용량으로 혼합하되, 소 바이러스성설사병바이러스 백신주는 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 부피 기준으로 1:1의 용량으로 혼합하였다.
불활화된 소 코로나바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 2.5x107.0 TCID50/dose의 함량으로 접종에 사용하였고, 불활화된 소 로타바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 3.5x107.0 TCID50/dose의 함량으로 접종에 사용하였으며, 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)의 경우 9.83x107.0 TCID50/dose의 함량, 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 경우 2.3x107.0 TCID50/dose의 함량으로 접종에 사용하였다.
또, 불활화된 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신에는 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401 6.25x106.0 TCID50/dose, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 7.00x107.0 TCID50/dose와, 소 바이러스성설사병바이러스 백신주들인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 2.45x107.0 TCID50/dose 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus) 5.75x106.0 TCID50/dose의 혼합물이 함유되어 접종에 사용하였다.
불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신 또는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 접종된 흑염소의 중화항체 생성 여부를 확인하기 위하여 주기적으로 혈청 채혈(혈청 확보)이 이루어졌으며, 구체적으로 불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신 또는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신을 흑염소 접종 2주 전에 1차 혈청 채혈을 하였고, 1차 백신 접종 3주후에 2차 백신 접종 시 2차 혈청 채혈을 하였으며, 2차 백신 접종 1주후, 2주후 및 4주후에 각 기간별로 3차 혈청 채혈, 4차 혈청 채혈 및 5차 혈청 채혈을 하였다.
먼저, 소 코로나바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료를 1-5μg/ml의 트립신 농도로 전 처리된 HRT-18 세포주에 접종하고 계대배양하여 각 계대에서 표 1에 제시된 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR로 소 코로나바이러스에 대한 양성반응을 확인하고, 도 1에 나타낸 바와 같이 세포변성효과(CPE)의 관찰과 소 코로나바이러스 특이적 항체를 이용한 형광항체염색(FA staining; fluorescent antibody staining)법을 통해 소 코로나바이러스 백신주를 확립하였다.
상기 소 코로나바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료(야생형 소 코로나바이러스)를 트립신으로 전 처리된 HRT-18 세포주에 접종한 후 계대배양하여 확립한 소 코로나바이러스 백신주는 Bovine Coronavirus 17KBC401로 명명하였고, 상기 Bovine Coronavirus 17KBC401을 HRT-18 세포 또는 MDBK 세포에서 계대배양한 결과, 50계대수에서의 바이러스 역가는 5x107.0TCID50/ml인 것으로 확인되었다(데이터 미도시).
다음으로, 소 로타바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료를 0.5-15μg/ml의 트립신 농도로 전 처리된 TF-104 세포주에 접종하고 계대배양하여 각 계대에서 표 2에 제시된 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR로 소 로타바이러스에 대한 양성반응을 확인하고, 세포변성효과의 관찰과 소 로타바이러스 특이적 항체를 이용한 형광염색법을 통해 소 로타바이러스 백신주를 확립하였다(데이터 미도시).
상기 소 로타바이러스에 대한 양성반응이 확인된 시료(야생형 소 로타바이러스)를 트립신으로 전 처리된 TF-104 세포주에 접종한 후 계대배양하여 확립한 소 로타바이러스 백신주는 타입(G6P[5])인 것으로 확인되어 Bovine Rotavirus 17KBR412로 명명하였고, 상기 Bovine Rotavirus 17KBR412를 TF-104 세포에서 계대배양한 결과, 23계대수에서의 바이러스 역가는 1x108.0TCID50/ml인 것으로 확인되었다.
소 바이러스성설사병바이러스는 등록특허 제10-1938556호에 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18531P로 수탁된 소 바이러스설사병바이러스(BVDV) 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)와 수탁번호 KCTC18533P로 수탁된 소 바이러스설사병바이러스(BVDV) 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 이용하여 Vero 세포주에서 증식시켰다. 그 결과, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)의 25계대수에서의 바이러스 역가는 1x108.0TCID50/ml이었고, BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 25계대수에서의 바이러스 역가는 5x107.0TCID50/ml인 것으로 확인되었다.
결국, Bovine Coronavirus 17KBC401, Bovine Rotavirus 17KBR412, BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)는 각각 특정 세포주에서의 특정 계대수에 따라 시간대별 바이러스 증식성 조사결과에서 유효한 바이러스 역가(바이러스 함량) 차이를 보이면서 증식하는 것을 확인하였다.
[1-2]: 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주의 상관계통도 분석
실시예 1의 [1-1]의 방법으로 확립한 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401에 대해 표 1에서 제시된 프라이머 쌍을 이용하여 표적 유전자인 spike 유전자와 HE 유전자의 염기서열 전체를 실시예 1의 [1-1] RT-PCR 조건으로 확인하였다.
RT-PCR 반응생성물을 시퀀싱으로 염기서열 분석을 한 결과, 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401은 2017년과 2018년에 집중적으로 검출되는 Group 1b에 속하는 것으로 확인되었다(현재 보편적으로 백신 제조에 사용되고 있는 소 코로나바이러스 백신주들은 Group 3에 속함).
또, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 정확한 유전형을 확인하기 위해 표 2에 제시된 프라이머를 이용하여 소 로타바이러스에서 유전형을 결정하는데 필수적인 VP7 과 VP4 유전자를 실시예 1의 [1-1] RT-PCR 조건으로 각각 증폭시켰다. 이후 RT-PCR 반응생성물을 시퀀싱으로 염기서열 분석을 한 후, 다른 국내 소 로타바이러스 검출주 및 기존의 백신주와의 상관계통도 분석(Phylogenic tree analysis)을 수행하였다.
그 결과, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 VP7 유전자 계통도 분석에 따르면 G6 타입인 것으로 확인되었으며, VP4 유전자 계통도 분석 결과에 따르면 P[5] 타입인 것을 확인하였다.
상기 시험결과를 토대로, 본 발명에 따른 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401을 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2018년 11월 7일자로 수탁(기탁)하였고, 수리되어 수탁번호 KCTC18738P를 부여받았다. 또한, 본 발명에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2018년 11월 7일자로 수탁(기탁)하였고, 수리되어 수탁번호 KCTC18739P를 부여받았다.
소 바이러스성설사병바이러스 백신주는 대한민국 등록특허 제10-1938556호에 명시된 것과 같이 소 바이러스설사병바이러스(BVDV) 백신주인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)는 BVDV 1a 타입이고, BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)는 BVDV 2a 타입인 것을 시퀀싱을 통한 염기서열 분석결과로 확인하였다.
[실시예 2]: 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주, 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주들의 백신으로서의 평가
[2-1]: 서로 다른 어쥬번트를 포함하는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신의 제조
실시예 1에서 준비한 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 바이러스 백신주를 불활화시키기 위해 불활화 백신 제조에 일반적으로 쓰이는 BEI 처리법(BEI[Binary ethyleneimine] treatment method)으로 각 바이러스 종마다 적합한 BEI 처리농도와 처리시간으로 불활화 처리된 백신주를 제조한 다음, 바이러스의 불활화 여부를 확인하기 위하여 불활화 처리된 백신주를 세포에 접종한 후 세포변성효과(CPE)의 유무를 FA 염색법을 통해 확인하였다. 여기서, BEI는 2-BEA(2-Bromoethylamine Hydrobromide, Sigma, USA)를 0.2N NaOH 용액에 0.1M이 되도록 용해하여 37℃ 항온 수조에서 1시간 처리하여 0.1M BEI로 제조한 것이다(4℃ 보관).
먼저, 소 코로나바이러스 백신주의 경우, 1mM BEI 최종 처리농도에서 1) 37℃, 20hrs, 2) 실온, 48hrs의 처리 조건으로 불활화 처리한 결과, 1mM BEI, 37℃, 20hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활화되는 것을 세포접종을 통해 확인하였다.
다음으로, 소 로타바이러스 백신주의 경우, 3, 6, 9mM BEI 최종 처리농도에서 1) 37℃, 24hrs, 2) 실온, 24hrs의 처리 조건으로 불활화 처리한 결과, 9mM BEI, 37℃, 24hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활화되는 것을 세포접종을 통해 확인하였다.
또, 소 바이러스성설사병바이러스 백신주의 경우, 1mM BEI 최종 처리 농도에서 1) 37℃, 24hrs, 2) 실온, 24hrs의 처리 조건으로 불활화 처리한 결과, 1mM BEI, 37℃ 24hrs의 처리 조건에서 최적으로 불활화되는 것을 세포접종을 통해 확인하였다.
아울러, 불활화 처리된 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 백신주 시료에 함유된 BEI의 중화를 위해서 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)를 첨가하여 37℃에서 약 1시간 동안 반응시킨 후에 불활화/안정화 공정을 마무리하였다. 바이러스 백신주의 불활화 여부의 확인은 불활화 처리된 바이러스 백신주를 세포에 접종하여 3일간 배양 후 세포변성효과의 유무를 확인하거나, 항체반응을 통해 바이러스 백신주를 접종한 세포의 세포염색반응으로 바이러스 검출을 통해 바이러스 백신주의 활성(감염성) 여부를 확인하였다.
그 결과, 불활화/안정화 공정을 마친 소 코로나바이러스 백신주를 HRP-18 세포에 접종하고, 불활화/안정화 공정을 마친 소 로타바이러스 백신주를 TF-104 세포에 접종하고, 불활화/안정화 공정을 마친 소 바이러스성설사병바이러스 백신주를 Vero 세포에 접종한 후 72시간 동안 배양하더라도 세포변성효과가 없는 것으로 나타나 불활화 처리가 완료된 것을 확인하였다(데이터 미제시).
한편, 후술되는 시험에서 동물의 백신 접종에 사용되는 어쥬번트(adjuvant)로 IMS1313(Seppic), Montanide 01 gel(Seppic) 및 Carbopol(Lubrizol)을 각각 30%(v/v), 10%(v/v) 및 10%(v/v)가 되도록 항원 시료인 단독 백신주(소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 또는 소 바이러스성설사병바이러스 백신주), 또는 혼합 백신주(소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주)와 혼합하여 백신 조성물을 제조하였다.
[2-2]: 불활화된 1종 또는 복수의 바이러스 백신주로 이루어진 백신 조성물의 안전성 및 면역원성 평가
소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 바이러스 백신주를 백신용 항원으로 사용하고, 이와 조합되는 어쥬번트별로 11 그룹으로 나누어 바이러스 항원 및 어쥬번트로 이루어진 백신을 흑염소(체중 25kg/마리; 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 항체반응 음성)에 3주 간격으로 2회 접종하였다(근육 접종: 매회 5ml/dose 접종)(도 2의 흑염소 접종 시험 모식도 참조).
구체적으로, 상기 그룹은 총 11그룹으로 준비되었으며,
(1) 불활화된 소 코로나바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 3 참조);
(2) 불활화된 소 코로나바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 3 참조);
(3) 불활화된 소 로타바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 4 참조);
(4) 불활화된 소 로타바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 4 참조);
(5) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 5 참조);
(6) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 5 참조);
(7) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 6 참조);
(8) 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 백신주로 이루어진 단독 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 6 참조);
(9) 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신(바이러스:IMS1313의 부피비 = 7:3)(도 7~10 및 도 11 참조);
(10) 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신(바이러스:Montanide 01 겔의 부피비 = 9:1)(도 7~10 참조); 및
(11) 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신(바이러스:Carbopol의 부피비 = 9:1)(도 7~10 참조)으로 구성되었다.
불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 BVD 1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD 2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 바이러스 항원을 부피 기준으로 1:1의 용량으로 혼합하였다. 또, 불활화된 소 코로나바이러스/소 로타바이러스/소 바이러스성설사병바이러스의 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신은 소 코로나바이러스 백신주, 소 로타바이러스 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 백신주의 바이러스 항원을 부피 기준으로 1:1:2의 용량으로 혼합하되, 소 바이러스성설사병바이러스 백신주는 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)를 부피 기준으로 1:1의 용량으로 혼합하였다.
불활화된 소 코로나바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 2.5x107.0 TCID50/dose의 함량으로 접종에 사용하였고, 불활화된 소 로타바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 3.5x107.0 TCID50/dose의 함량으로 접종에 사용하였으며, 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신은 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus)의 경우 9.83x107.0 TCID50/dose의 함량, 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)의 경우 2.3x107.0 TCID50/dose의 함량으로 접종에 사용하였다.
또, 불활화된 3종 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신에는 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401 6.25x106.0 TCID50/dose, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 7.00x107.0 TCID50/dose와, 소 바이러스성설사병바이러스 백신주들인 BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) 2.45x107.0 TCID50/dose 및 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus) 5.75x106.0 TCID50/dose의 혼합물이 함유되어 접종에 사용하였다.
불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신 또는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 접종된 흑염소의 중화항체 생성 여부를 확인하기 위하여 주기적으로 혈청 채혈(혈청 확보)이 이루어졌으며, 구체적으로 불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신 또는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신을 흑염소 접종 2주 전에 1차 혈청 채혈을 하였고, 1차 백신 접종 3주후에 2차 백신 접종 시 2차 혈청 채혈을 하였으며, 2차 백신 접종 1주후, 2주후 및 4주후에 각 기간별로 3차 혈청 채혈, 4차 혈청 채혈 및 5차 혈청 채혈을 하였다.
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먼저, 불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신으로 접종된 흑염소의 혈청으로 단독 백신에 대한 면역원성을 중화항체가(log2)로 평가한 결과, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 백신주는 혼합되는 어쥬번트의 종류에 관계없이 모두 높은 중화항체가를 나타내었다(표 3 및 도 1~6 참조).
표 3은 불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신을 흑염소 접종 전후로 확보된 혈청의 중화항체 생성능을 중화항체가(log2) 변화 추이로 나타낸 것이다.
다음으로, 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 접종된 흑염소의 혈청으로 혼합 백신에 대한 면역원성을 중화항체가(log2)로 평가한 결과, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 백신주를 불활화한 다음 혼합 접종한 그룹은 불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신에 대한 중화항체가(log2)에 대한 면역원성과 대등하게 어쥬번트의 종류에 관계없이 모두 높은 중화항체가를 나타내었고 그 중에서도 특히 IMS1313 어쥬번트는 바이러스 항원과 조합 시 중화항체 형성능이 높았고, 중화항체 생성의 지속성면에서 좋은 결과를 나타내었다(표 4 및 도 7~11 참조).
표 4는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신을 흑염소 접종 전후로 확보된 혈청의 중화항체 생성능을 중화항체가(log2) 변화 추이로 나타낸 것이다.
표 3은 불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신을 흑염소 접종 전후로 확보된 혈청의 중화항체 생성능을 중화항체가(log2) 변화 추이로 나타낸 것이다.
| 단독 백신 | 어쥬번트 | 백신접종 전 | 1차 백신접종 3주후 | 2차 백신접종 1주후 | 2차 백신접종 2주후 | 2차 백신접종 4주후 |
| Bovine Coronavirus 17KBC401 | IMS1313 | 1 | 3 | 7 | 7.5 | 6 |
| Montanide 01 | 1 | 4 | 8.5 | 8 | 6 | |
| Bovine Rotavirus 17KBR412 | IMS1313 | 0 | 10 | 11 | 10.5 | 10.5 |
| Montanide 01 | 0 | 8.5 | 10 | 10 | 11 | |
| BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) | IMS1313 | 0 | 2.7 | 10.2 | 9 | 8 |
| Montanide 01 | 0 | 3 | 10.5 | 9.5 | 8.5 | |
| BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus) | IMS1313 | 0.7 | 4 | 9 | 9 | 9.5 |
| Montanide 01 | 0 | 4 | 9 | 9 | 8.5 |
다음으로, 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신으로 접종된 흑염소의 혈청으로 혼합 백신에 대한 면역원성을 중화항체가(log2)로 평가한 결과, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 백신주를 불활화한 다음 혼합 접종한 그룹은 불활화된 1종의 바이러스 백신주로 이루어진 단독 백신에 대한 중화항체가(log2)에 대한 면역원성과 대등하게 어쥬번트의 종류에 관계없이 모두 높은 중화항체가를 나타내었고 그 중에서도 특히 IMS1313 어쥬번트는 바이러스 항원과 조합 시 중화항체 형성능이 높았고, 중화항체 생성의 지속성면에서 좋은 결과를 나타내었다(표 4 및 도 7~11 참조).
표 4는 불활화된 3종의 바이러스 백신주로 이루어진 혼합 백신을 흑염소 접종 전후로 확보된 혈청의 중화항체 생성능을 중화항체가(log2) 변화 추이로 나타낸 것이다.
| 혼합 백신 | 중화시험 바이러스 | 어쥬번트 | 백신접종 전 | 1차 백신접종 3주후 | 2차 백신접종 1주후 | 2차 백신접종 2주후 | 2차 백신접종 4주후 |
| Bovine Coronavirus 17KBC401 + Bovine Rotavirus 17KBR412 + BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) + BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus) | Bovine Coronavirus 17KBC401 | IMS1313 | 0.5 | 3 | 8 | 7.5 | 7 |
| Montanide 01 | 0 | 2.5 | 6 | 7.5 | 7 | ||
| Carbopol | 1 | 3 | 6.5 | 6 | 6.5 | ||
| Bovine Rotavirus 17KBR412 | IMS1313 | 0 | 7 | 10 | 9.5 | 9 | |
| Montanide 01 | 0 | 8 | 8.5 | 7.5 | 7 | ||
| Carbopol | 0 | 6.5 | 10 | 9 | 9.5 | ||
| BVD1a-JB(Bovine viral diarrhea virus) | IMS1313 | 0 | 0 | 8.5 | 8 | 7 | |
| Montanide 01 | 0 | 0 | 7.5 | 6.5 | 5 | ||
| Carbopol | 0 | 1 | 8.5 | 7.5 | 6 | ||
| BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus) | IMS1313 | 1 | 1 | 8.5 | 9.5 | 7 | |
| Montanide 01 | 0.5 | 1 | 8.5 | 7.5 | 6.5 | ||
| Carbopol | 1 | 4 | 10.5 | 9.5 | 7.5 |
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이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Vaccine Composition Against Bovine Coronavirus, Bovine Rotavirus
and Bovine Viral Diarrhea Virus
<130> YPD201905-0069
<160> 23
<170> KopatentIn 2.0
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<213> Spike Gene of Bovine Coronavirus Vaccine Strain 17KBC401(KCTC18738P)
<400> 22
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tatgtcccta ctaagtatgt cacagcgaag gttagtcccg gtctgtgcat tgctggtgat 3540
agaggtatag cccccaagag tggttatttt gttaatgtaa ataatacttg gatgttcact 3600
ggtagtggtt attactaccc tgaacctata actggaaata atgttgttgt tatgagtacc 3660
tgtgctgtta attatactaa agcgccggat gtaatgctga acatttcaac acccaacctc 3720
cctgatttta aggaagagtt ggatcaatgg tttaaaaacc aaacatcagt ggcaccagat 3780
ttgtcacttg attatataaa tgttacattc ttggacctac aagatgaaat gaataggtta 3840
caggaggcaa taaaagtttt aaatcagagc tacatcaatc tcaaggacat tggtacatat 3900
gagtattatg taaaatggcc ttggtatgta tggcttttaa ttggctttgc tggtgtagct 3960
atgcttgttt tactattctt catatgctgt tgtacaggat gtgggactag ttgttttaag 4020
aaatgtggcg gttgttgtga tgattatact ggacatcagg agttagtaat taaaacatca 4080
catgacgatt aa 4092
<210> 23
<211> 1275
<212> DNA
<213> HE Gene of Bovine Coronavirus Vaccine Strain 17KBC401(KCTC18738P)
<400> 23
atgtttttgc ttcctagatt tgttctagtt agctgcataa ttggtagcct aggttttgac 60
aaccctccta ccaatgttgt ttcgcattta aatggagatt ggtttttatt tggtgacagt 120
cgttcagatt gtaatcatgt tgttactacc aacccccgta attattctta tatggacctt 180
aatcctgcct tgtgtggttc tggtaaaata tcatctaaag ctggcaactc catttttagg 240
agttttcact ttactgattt ttataattac acaggcgaag gtcaacaaat tattttctat 300
gagggtgtta attttacgcc ttatcatgcc tttaaatgca ccacttctgg tagtaatgat 360
atttggatgc agaataaagg cttgttttac actcaggttt ataagaatat ggctgtgtat 420
cgcagcctta cttttgttaa tgtaccatat gtttataatg gctctgcaca atctacagcc 480
ctttgtaaat ctggtagttt agttcttaat aaccctgcat atatagctcg tgaagctaat 540
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atcgtaccac tttgtatttt taacggcaag tttttgtcga atacaaagta ttatgatgat 660
agtcaatatt attttaataa agatactggt gttatttatg gtctcaattc tactgaaacc 720
attaccactg gttttgactt taattgtcat tatttagttc taccctctgg taattattta 780
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aacatgacgg cagttgcttg tcaacccccg tactgttatt ttcgtaattc tactaccaat 960
tatgttggtg tttatgatat caatcatggg gatgctggtt ttactagcat actcagtggt 1020
ttgttatatg actcaccttg tttttcgcaa caaggtgttt ttaggtatga taatgttagc 1080
agtgtctggc ctctctaccc ttatggcaga tgccctactg ctgctgatat taatacccct 1140
gatgtaccca tttgtgtgta tgacccgcta ccaattattt tgcttggcat tcttttgggt 1200
gttgcggtca taattattgt agttttgttg ttatatttta tggtggataa tggtactagg 1260
ctgcatgatg cttag 1275
Claims (19)
- 수탁번호 KCTC18738P로 수탁된 소 코로나바이러스 백신주.
- 제1항에 있어서, 상기 소 코로나바이러스 백신주를 불활화 처리 및 중화화 처리하여 준비한 불활화된 바이러스는 사람 선암종 세포인 HRT-18 세포에 접종하여 72시간 이상 계대 배양 시, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 소 코로나바이러스 백신주.
- 제2항에 있어서, 상기 불활화 처리는 상기 소 코로나바이러스 백신주에 BEI(Binary ethyleneimine)을 처리하는 것이고, 상기 중화화 처리는 상기 소 코로나바이러스 백신주에 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 처리하는 것임을 특징으로 하는, 소 코로나바이러스 백신주.
- 제1항에 있어서, 상기 소 코로나바이러스 백신주는 사람 선암종 세포인 HRT-18 세포에서 연속계대 배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 소 코로나바이러스 백신주.
- 제1항에 있어서, 상기 소 코로나바이러스 백신주의 Spike 유전자 염기서열은 서열번호 22로 표기되고, 상기 소 코로나바이러스 백신주의 HE 유전자 염기서열은 서열번호 23으로 표기되는 것을 특징으로 하는, 소 코로나바이러스 백신주.
- 수탁번호 KCTC18738P로 수탁된 소 코로나바이러스 백신주의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 함유하는 소 코로나바이러스의 감염 예방 및 소 코로나바이러스 감염증의 치료 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위한 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물은 IMS1313, 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel) 및 카보폴(Cabopol)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물은 상기 불활화된 바이러스와 어쥬번트를 부피 기준으로, 5~9 : 1~5로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물은 반추동물의 소 코로나바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 하는, 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
- 수탁번호 KCTC18738P로 수탁된 소 코로나바이러스 백신주의 불활화된 바이러스, 수탁번호 KCTC18739P로 수탁된 소 로타바이러스 백신주의 불활화된 바이러스, 수탁번호 KCTC18531P로 수탁된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주의 불활화된 바이러스 및 수탁번호 KCTC18533P로 수탁된 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주의 불활화된 바이러스로 이루어진 바이러스 혼합물을 유효성분으로 함유하는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2의 감염 예방 및 소 설사병의 예방용 복합 백신 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물은 IMS1313, 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel) 및 카보폴(Cabopol)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 복합 백신 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 조성물은 상기 바이러스 혼합물과 어쥬번트를 부피 기준으로, 5~9 : 1~5로 포함하는 것을 특징으로 하는, 복합 백신 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물은 반추동물의 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 하는, 복합 백신 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 복합 백신 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 소 코로나바이러스 백신주는 사람 선암종 세포인 HRT-18 세포에서 연속계대 배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내며,
상기 소 로타바이러스 백신주는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에서 연속계대 배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내고,
상기 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1은 원숭이 신장세포인 Vero 세포에서 연속계대 배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내며,
상기 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2는 원숭이 신장세포인 Vero 세포에서 연속계대 배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 복합 백신 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 소 코로나바이러스 백신주를 불활화 처리 및 중화화 처리하여 준비한 불활화된 바이러스는 사람 선암종 세포인 HRT-18 세포에 접종하여 72시간 이상 계대 배양 시, 세포변성효과를 나타내지 않으며,
상기 소 로타바이러스 백신주를 불활화 처리 및 중화화 처리하여 준비한 불활화된 바이러스는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에 접종하여 72시간 이상 계대 배양 시, 세포변성효과를 나타내지 않고,
상기 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주 각각을 불활화 처리 및 중화화 처리하여 준비한 각각의 불활화된 바이러스는 원숭이 신장세포인 Vero 세포에 접종하여 72시간 이상 계대 배양 시, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 복합 백신 조성물. - 제17항에 있어서, 상기 불활화 처리는 상기 소 코로나바이러스 백신주, 상기 소 로타바이러스 백신주, 상기 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 상기 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주에 BEI(Binary ethyleneimine)을 처리하는 것이고, 상기 중화화 처리는 상기 소 코로나바이러스 백신주, 상기 소 로타바이러스 백신주, 상기 소 바이러스성설사병바이러스 타입 1 백신주 및 상기 소 바이러스성설사병바이러스 타입 2 백신주에 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 처리하는 것임을 특징으로 하는, 복합 백신 조성물.
- 삭제
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