TW201641689A - 豬流行性下痢病毒品系及得自其之免疫組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於豬流行性下痢病毒(「PEDV」)(包括其新穎基因型)的新穎核苷酸及胺基酸序列，該等序列皆適用於製備供治療及預防豬及其他動物之疾病的疫苗。根據本發明之實務所提供的疫苗有效針對多種豬PEDV基因型及分離株。診斷及治療性多株及單株抗體亦為本發明的特徵，適用於繁殖病毒及製備疫苗的感染性純系亦為本發明的特徵。本發明之特別重要的態樣包括在組織培養物中及在宿主豬中複製的聚核苷酸構築體。本發明亦提供可在宿主動物及組織培養物中有效複製的新穎全長PEDV基因組。

Description

豬流行性下痢病毒品系及得自其之免疫組成物 【相關申請案之交叉參考】
本案依據35 U.S.C § 119主張2015年2月27日提申之臨時專利申請案第62/121,955號、2015年8月24日提申之臨時專利申請案第62/209,119號、2015年11月4日提申之臨時專利申請案第62/250,961號及2016年1月7日提申之臨時專利申請案第62/276,022號的優先權，該等臨時專利申請案均以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於保護豬免患豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus；PEDV)所引起之疾病的新穎免疫組成物。
豬流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea；PED)具高度傳染性且其特徵為豬、尤其幼齡豬崽之脫水、下痢以及高死亡率。病原體豬流行性下痢病毒(PEDV)為單股正義RNA病毒，其屬於冠狀病毒科(Coronaviridae )之α冠狀病毒屬。PEDV具有約28kb之總基因組尺寸且含有7個開放閱讀框架。PEDV感染之症狀往往類似於傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus；TGEV)及豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus；PDCoV)所引起的症狀，此之亦為冠狀病毒科之成員。應 注意，通常觀測不到PEDV與TGEV之間的交叉防護，總體病毒核苷酸序列至多約60%類似。
PED可能首次在歐洲1970年前後觀測到，且隨後表徵致病性病毒(參見例如M.Pensaert等人，Arch.Virol，第58卷，第243-247頁，1978及D.Chasey等人，Res.Vet Sci，第25卷，第255-256頁，1978)。PEDV在北美洲直至2013年才鑑別到，此時開始廣泛爆發，且導致養豬業出現嚴重經濟損失。病毒在數日內出現於多個廣泛分佈的大母豬群中，且其已散佈至至少32個州。生產者預計未治療新生豬崽可能會出現高達100%損失。就管控感染而言呈遞的建議包括實施嚴格的生物安保及/或使整個豬群有意暴露於PEDV以獲得免疫。
在20世紀70年代及20世紀80年代期間，PEDV在歐洲若干個國家引起廣泛傳染；但自20世紀90年代起，PED在歐洲已變得罕見，其間偶有爆發。此經典PEDV品系隨後散佈至亞洲國家，諸如日本、中國、南韓等。自2010年起，已報導在中國出現嚴重PED流行性爆發且自此等爆發所回收的PEDV在基因學上不同於經典PEDV品系。在美國出現的初始PED爆發與在中國所觀測到的PED爆發具有類似的臨床表現。序列分析揭露，原始的美國PEDV(下文稱為美國PEDV原型品系)在基因學上最類似於中國在2011年至2102年所流行的一些PEDV。2014年1月，在美國豬群中鑑別出PEDV變異型品系，相較於美國PEDV原型品系，該PEDV變異型品系在刺突蛋白(spike)基因中具有插入及缺失(insertions and deletions；INDEL)。此變異型品系稱為美國PEDV S-INDEL-變異型品系。PED在美國爆發之後，已報導在加拿大、墨西哥、臺灣、南韓及日本偵測到美國原型 樣PEDV；已報導在南韓、日本、德國、比利時、法國及葡萄牙偵測到美國S-INDEL-變異型樣PEDV。當前，PEDV仍為全球養豬業的重大威脅。
PEDV在培養物中的生長通常不良，且需要鑑別適於培養足以供商業疫苗製備用之病毒的兩種特定品系。另外，需要開發針對已知PEDV分離株提供有效交叉保護且預期針對演變的PEDV品系提供有效交叉保護的疫苗。
本發明涵蓋免疫組成物，其包含自原型品系及自插入缺失型品系繼代的(passaged)變異型PEDV品系。美國PEDV S-INDEL-變異型品系在基因學上不同於美國PEDV原型樣品系，包括在刺突蛋白S1域區域(特定言之，其開頭1170個鹼基)中出現的特徵性插入及缺失。插入及缺失包括3個缺失(位置167之1-nt缺失、位置176之11-nt缺失及位置416之3-nt缺失)、位置474與位置475之間的6-nt插入，及主要位於S1區域之開頭1,170個核苷酸中的若干個其他突變。美國PEDV S-INDEL-變異型品系的毒力比美國PEDV原型品系小且在一個具體實例中或在完整病毒中可以減毒活疫苗形式使用。投予豬崽時，經本發明之連續繼代活減毒S-INDEL-變異型品系感染的豬未產生疾病且重要的是，針對毒力原型PEDV品系或S-INDEL-變異型品系之攻毒展現交叉保護作用。
因此，本發明包含適用作疫苗的免疫組成物，其包含本發明之S-INDEL-變異型PEDV品系(較佳為活的且減毒的)或其免疫片段；一或多種佐劑；及視情況存在之一或多種賦形劑，該免疫組成物的量有效誘使豬產生中和性抗體。佐劑較佳提供具有其他組分的水包油型乳液。本發 明之免疫組成物保護豬免受PEDV感染且以單劑、以兩劑程序或以包括多劑之疫苗接種程序來發揮有效作用，多劑可相隔至少一週且視情況相隔更大的時間間隔，諸如一至數月。應注意，視特定豬群中之流行性威脅程度而定，可不時地重複一次、兩次或多次劑之疫苗劑程序作為預防措施。另外，應注意，給妊娠期間之大母豬接種疫苗將經由初乳及乳汁中之抗體及T細胞之母體轉移而向幼齡豬崽提供保護作用，但此保護作用可能需要後續向豬崽接種額外的疫苗劑。涵蓋包括豬崽及成年豬之所有豬之疫苗接種。
已驚訝地發現，本發明之美國PEDV S-INDEL-變異型品系提供針對其他PEDV品系的交叉反應性/保護作用且預期將賦予針對歐洲常見品系的保護作用，且更特定針對歐洲最近出現之與美國S-INDEL-變異型品系在全基因組序列層次具有極高基因類似性(>99%)之分離株的保護作用。因此，本發明的疫苗接種組成物適用於保護豬免受歐洲常見PEDV品系(包括最新分離株)所致之疾病或攻毒。
本發明包括PEDV(包括其新穎基因型)之新穎核苷酸及胺基酸序列，該等序列適用於製備供治療及預防豬及其他動物之疾病的疫苗。根據本發明之實務所提供的疫苗有效針對多種豬PEDV基因型及分離株。診斷及治療性多株及單株抗體亦為本發明的特徵，適用於繁殖病毒及製備疫苗的感染性純系亦為本發明的特徵。特別重要的是，所揭示的疫苗包含具有PEDV開放閱讀框架(最特定言之，刺突蛋白基因之開頭2.2kb，更特定言之，S1域，以及編碼PEDV蛋白質之全長序列的片段)的全病毒(活病毒或減毒病毒)或單一抗原性蛋白質。本發明亦提供在細胞培養物中處於不同繼代之PEDV品系的全長基因組序列，該等序列可在宿主動物 及組織培養物中有效複製。
本發明提供一種治療或預防動物因PEDV感染所致之疾病或病症的方法，該疾病或病症包括PEDV直接引起的疾病病況及PEDV導致或強化的疾病病況。PEDV可強化且亦可根據本發明之實務治療或預防的豬疾病病況包括傳染性胃腸炎病毒PHEV及PRCV所引起的疾病病況或與其相關的疾病病況。
本發明亦包括投與組合疫苗的選項，亦即抗原(可包括針對非PEDV病原體之活抗原、經修飾之活抗原或不活化抗原)與適當選擇之佐劑的二價或多價組合。
部分地根據如本文所揭示之獨特PEDV序列，本發明亦提供一種診斷套組用於區分接種上述PEDV疫苗的豬科動物及經野外PEDV品系感染之豬科動物。
本發明之代表性實施例包括經分離之聚核苷酸序列，其包括編碼經減毒且可以免疫組成物形式使用之變異型PEDV蛋白質的基因組聚核苷酸。此可包括選自由以下組成之群的全基因組序列：(a)編碼PEDV病毒變異體的SEQ ID NO 8-16及35-39或其免疫片段；(b)(a)中之任何序列的補體；(c)在嚴格條件下與(a)或(b)之序列雜交的聚核苷酸，該等嚴格條件定義為在65℃、在0.5M NaHPO4、7% SDS、1mM EDTA中雜交以過濾所結合的DNA且在68℃、在0.1X SSC/0.1% SDS中洗滌。
(d)與(a)或(b)之聚核苷酸至少70%一致的聚核苷酸；(e)與(a)或(b)之聚核苷酸至少80%一致的聚核苷酸； (f)與(a)或(b)之聚核苷酸至少90%一致的聚核苷酸；及(g)與(a)或(b)之聚核苷酸至少95%一致的聚核苷酸。
較佳與第二異源序列組合。
本發明另外提供RNA及DNA分子、其補體、片段以及用於表現任何此類RNA或DNA聚核苷酸的載體及質體，以及自此類核苷酸序列表現的PEDV病毒，其中該病毒為活病毒或完全或部分減毒。
本發明亦提供包含前述聚核苷酸序列及可發揮感染性純系功能之相應核苷酸序列的疫苗。
本發明亦包括編碼來自PEDV之變異型蛋白質的核酸ORF，如所附表1中所示。表1變異體是參考PEDV USA/IL20697/2014繼代5來描述。
b 僅顯示非同義突變且未顯示靜默突變。複製酶蛋白質之胺基酸是根據其在複製酶多蛋白pplab中的位置編號。結構蛋白之胺基酸是根據其在相應結構蛋白中的位置編號。c *，終止密碼子。d 相較於P3、P5、P7、P18及P30病毒以及P3R1、P5R1、P7R1、P8R1及P18R1病毒，P45及P60病毒在核苷酸位置24,808-24,823具有16個核苷酸缺失，導致P45及P60病毒之ORF3轉譯發生早期終止。基本上，所推定之P45及P60 ORF3蛋白質僅具有7個胺基酸長度。相較於P5病毒，P7、P8及P18病毒在核苷酸位置25,197-25,200具有4個核苷酸缺失(ATTA)，導致P7、P8及P18病毒之ORF3轉譯發生早期終止。基本上，所推定之P7、P8及P18 ORF3蛋白質具有143個aa長度。相較於P3、P5、P7、P18及P30病毒，P45及P60病毒在核苷酸位置25,199-25,201具有3個核苷酸缺失(TAT)。相較於P3R1病毒，P5R1病毒在核苷酸位置25,199-25,201具有3個核苷酸缺失(TAT)。相較於P3R1病毒，P5R1、P7R1、P8R1及P18R1病毒在核苷酸位置25,197-25,200具有4個核苷酸缺失(ATTA)。相較於P3及P5病毒以及P3R1、P5R1、P7R1、PSR1及P1SR1病毒，P7、PIS、P30、P45及P60病毒在核苷酸位置25,304-25,35具有56個核苷酸缺失。
本發明另外提供核酸序列及所得蛋白質變異體，其具有胺基酸取代且毒力減小，從而減毒且允許組成物安全地作為免疫組成物及作為疫苗使用。
胺基酸序列及變異型蛋白質再次顯示於所附表2中，胺基酸是參考PEDV/USA/IL20697/2014之繼代5來提及。
在另一個較佳具體實例中，且利用本文所揭示之大量多肽序列資訊，另外提供多肽疫苗，其中抗原由以下定義：(a)刺突蛋白；或(b)與其至少90%一致的胺基酸序列；或(c)其富含精胺酸的區域。
在另一個具體實例中，本發明包括疫苗組成物，其包含：活減毒變異型品系豬流行性下痢病毒(PEDV)，及載劑，其中該組成物能夠保護豬免受PEDV之變異型品系與原型品系攻擊，及預防或治療一或多種與PEDV感染相關的症狀，且其中根據選自由以下組成之群的終點來確定保護作用之達成：預防或控制PEDV感染症狀脫水、發熱、下痢、嘔吐、不良泌乳表現、不良生殖表現、死亡中的任一者，及預防或控制體重減輕或不使體重增加，其中該品系編碼具有以下胺基酸之取代的蛋白質及其保守性變異體以及具有特定取代且與序列其餘部分具有99%同源性的蛋白質：胺基酸取代包括以下或其保守性變異體：
A)繼代P18R1 F6a
多蛋白1a/1b(SEQ ID NO：46)：位置551之P(緊鄰DEDAT之後的P)；刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置1009之P(緊鄰IGNIT之後的P)、位置973之H(緊鄰ALPFS之後的H)、位置48之L(緊鄰APAVV之後的L)、位置345之V(緊鄰TNLSF之後的A)；ORF 3(SEQ ID NO：48)：位置144缺失I(緊鄰YDGKS之後的I)、174-189缺失(緊鄰LYLAI之後)、位置138-143之LTANPL(緊鄰NGKAA之後)，及核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，SEQ ID NO：51)：位置27之H(緊鄰 LRVTN之後的H)。
B)繼代P18R1 Gb8
刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置1009之P(緊鄰IGNIT之後的P)、位置973之H(緊鄰ALPFS之後的H)、位置48之L(緊鄰APAVV之後的L)、位置345之V(緊鄰TNLSF之後的A)；ORF 3(SEQ ID NO：48)：位置144缺失I(緊鄰YDGKS之後的I)、174-189缺失(緊鄰LYLAI之後)、位置138-143之LTANPL(緊鄰NGKAA之後)，及核衣殼蛋白(SEQ ID NO：51)：位置27之H(緊鄰LRVTN之後的H)。
C)繼代P7
刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置633之K(緊鄰TPKPL之後的K)；ORF 3(SEQ ID NO：48)：位置189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)。
D)繼代P18
刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置633之K(緊鄰TPKPL之後的K)、位置884之R(緊鄰VYDPA之後的R)；ORF 3(SEQ ID NO：48)：位置189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)。
E)繼代P30
刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置884之R(緊鄰VYDPA之後的R)、位置959之A(緊鄰LIGGM之後的A)；ORF 3(SEQ ID NO：48)：位置189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)。
F)繼代P38
刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置48之L(緊鄰APAVV之後的L)、 位置345之V(緊鄰TNLSF之後)、位置884之R(緊鄰VYDPA之後的R)、位置959之A(緊鄰LIGGM之後的A)，ORF 3(SEQ ID NO：48)：138-144缺失(緊鄰NGKAA之後)、189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)，核衣殼(SEQ ID NO：51)：位置27之H(緊鄰LRVTN之後的H)。
G)繼代P45
多蛋白1a/1b(SEQ ID NO：46)：位置1591之M(緊鄰VVKVS之後的M)、位置5087之S(緊鄰YLFST之後的S)、位置6138之S(緊鄰WQTFS之後的S)；刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置884之R(緊鄰VYDPA之後的R)、位置959之A(緊鄰LIGGM之後的A)、位置1225之D(緊鄰IESLV之後的D)；ORF 3(SEQ ID NO：48)：位置8缺失Y(緊鄰LGLFO之後的Y)、138-144缺失(緊鄰NGKAA之後)，及174至189缺失(緊鄰LYLAI之後)，被膜(envelope)蛋白(SEQ ID NO：49)：位置62之F(緊鄰YRVYK之後的F)；位置183之膜蛋白I(緊鄰IVYGG之後的I)。
H)繼代P60
多蛋白1a/1b(SEQ ID NO：46)：位置1591之M(緊鄰VVKVS之後的M)、位置5087之S(緊鄰YLFST之後的S)、位置6138之S(緊鄰WQTFS之後的S)；刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置884之R(緊鄰VYDPA之後)、位置 959之A(緊鄰LIGGM之後)、位置973之H(緊鄰ALPFS之後的H)、位置1225之D(緊鄰IESLV之後的D)；ORF 3(SEQ ID NO：48)：位置8缺失Y(緊鄰LGLFO之後的Y)、138-144缺失(緊鄰NGKAA之後)，及174至189缺失(緊鄰LYLAI之後)，被膜蛋白(SEQ ID NO：49)：位置62之F(緊鄰YRVYK之後的F)；膜蛋白：位置5之A(緊鄰MSNG之後的A)、位置183之I(緊鄰IVYGG之後的I)。
I)繼代P3R1
刺突蛋白(SEQ ID NO：47)：位置48之L(緊鄰APAVV之後)、位置345之V(緊鄰TNLSF之後)；位置1272之T(緊鄰DVFNA之後的T)；被膜蛋白(SEQ ID NO：49)：位置62之S(緊鄰YRVYK之後的S)；核衣殼蛋白(SEQ ID NO：51)：位置27之H(緊鄰LRVTN之後的H)。
本發明另外包括以Genbank®登錄號KF650371繼代3存取的繼代及得自原型病毒繼代的胺基酸取代。胺基酸變異體如下表示：多蛋白1a/1b(SEQ ID NO：52)：814之V、1076之A、1564之F、1896之I、2310之H、2600之Y、3247之F、3473之V或3522之R；刺突蛋白(SEQ ID NO：54)：257之N、326之I、375之F、491之Y、881之R、888之R、1277之F、1339之T或1358之L；ORF 3(SEQ ID NO：55)：在39或其後終止；被膜蛋白(SEQ ID NO：56)：位置69之I；膜蛋白(SEQ ID NO：57)：位置208之T；核衣殼蛋白(SEQ ID NO：58)：位置141之L、418之Q、424之N或 439之I。
在本文所述之任何PEDV繼代中進行額外修飾屬於本發明之範疇內，其中該等修飾包括使用熟習此項技術者已知之方法(例如同源重組)提供其他繼代(原型、INDEL譜系1或INDEL譜系2)之突變。
GenBank®為公認的美國NIH基因序列資料庫，包括公開可獲得之DNA序列之註釋集，且其另外合併來自歐洲分子生物學實驗室(European Molecular Biology Laboratory；EMBL)及日本DNA資料庫(DNA DataBank of Japan；DDBJ)之提案，關於論述，參見Nucleic Acids Research,2013年1月，第41(D1)D36-42卷。
以下圖式形成本說明書的一部分且為了進一步證明本發明之某些具體實例或各種態樣而包括在內。在一些情況下，本發明之具體實例可結合本文中所呈現的實施方式、藉由參看附圖而得到最佳理解。實施方式及附圖可突顯本發明之某個特定實施例或某個態樣。然而，熟習此項技術者應瞭解，實施例或態樣的一部分可與本發明之其他實施例或態樣組合使用。
圖1顯示2014年1月，當本發明人研究組首次鑑別美國PEDVS-INDEL-變異型品系時，得自臨床個案之PEDV S1部分核苷酸序列的譜系學分析。利用軟體MEGA 5.2之基於距離之鄰近歸併法來構築譜系樹。對1,000個複製資料集進行靴帶式分析(Bootstrap analysis)，且指明與分支點鄰近的值。新近鑑別出的美國PEDV S-INDEL-變異型品系(ISU個案1-5)用實心圓指示，其序列不同於2013年在美國所鑑別的PEDV(美國PEDV原型品系)， 該PEDV用三角形指示。
圖2顯示基於S1部分序列及全基因組序列的譜系樹。參見附件。可見，除美國豬之外，亦已在南韓、加拿大及墨西哥偵測到美國原型樣品系；已在南韓、墨西哥及德國偵測到美國變異型INDEL樣品系。
圖3A顯示本發明之品系之S1序列(SEQ ID NO：1)。圖3B顯示S-INDEL-變異型PEDV細胞培養物分離株2014020697-P5繼代5譜系1的全基因組序列(SEQ ID NO：8)。
圖4為比對，其為PEDV US S-INDEL-變異型分離株2014020697-P5繼代5譜系1之刺突蛋白基因序列(SEQ ID NO：2)與PEDV US原型分離株2013019338-P3繼代3(SEQ ID NO：3)、2013022038-P3繼代3(SEQ ID NO：4)、2013035140-P3繼代3(SEQ ID NO：5)、2013049379-P3繼代3(SEQ ID NO：6)及2013049469-P1繼代1(SEQ ID NO：7)的比較，相同鹼基用圓點指示。
圖5為PEDV US變異型分離株2014020697-P5繼代5譜系1之全基因組(SEQ ID NO：8)與PEDV US原型分離株2013019338-P3繼代3(SEQ ID NO：9)、2013022038-P3繼代3(SEQ ID NO：10)、2013035140-P3繼代3(SEQ ID NO：11)、2013049379-P3繼代3(SEQ ID NO：12)及2013049469-P1繼代1(SEQ ID NO：13)的比較，相同鹼基用圓點指示。
圖6A至圖6D為全長基因組及S1部分核苷酸序列的譜系學分析。此研究中所獲得之三種美國原型PEDV分離株(USA/NC35140/2013、USA/IA49379/2013及USA/NC49469/2013)及先前經分離、但在此研究中評價的兩種分離株(美國PEDV原型分離株USA/IN19338/2013及美國S-INDEL-變異型分離株USA/IL20697)用彈點或三角形指示。分析中亦包括四十五個 選自GenBank®的PEDV序列。使用軟體MEGA6中的基於距離之鄰近歸併法(6A及6C)及最大似然法(圖6B及圖6D)構築譜系樹。美國原型樣PEDV用藍色字體顯示，其中指示分枝系1及分枝系2。美國S-INDEL-變異型樣PEDV用紅色字體顯示。
圖7A至圖7D顯示接種美國PEDV原型及S-INDEL-變異型分離株之5日齡豬的臨床評估及病毒排出。圖7A顯示接種後(days post inoculation；DPI)之7天期間的下痢平均分。圖7B顯示平均每日體重增加(average daily weight gain；ADG)。分別對各群組在(-1)至3DPI及(-1)至7DPI的ADG進行統計學分析。接種豬之直腸拭子中的病毒排出顯示於圖7C中且血清中的病毒排出顯示於圖7D中，如藉由基於PEDV N基因之定量即時RT-PCR所測定。各時間點的病毒效價(Log10基因組複本數/毫升)為各組中之所有可用豬(PCR陽性豬與陰性豬)的平均病毒效價。標準誤差條顯示於各圖中。在圖7D中，分別在3DPI及7DPI對各群組的病毒血症程度進行統計學分析。無相同字母的標記指示顯著差異，例如A與B的差異顯著，但A與AB的差異不顯著。
圖8A至8B顯示接種豬在3DPI及7DPI屍體剖檢時之肉眼病變之檢查。小腸、盲腸及結腸之內容物平均分數顯示於圖8A中。小腸、盲腸及結腸之病變平均分數顯示於圖8B中。評分標準描述於實施例2之材料及方法中。對各個接種群組進行統計學分析，但每次針對一種組織類型且在一個時間點進行。無相同字母的標記指示顯著差異。
圖9A至9T顯示在3DPI屍體剖檢之接種豬的代表性顯微鏡下病變及IHC染色。得自不同接種群組之小腸(迴腸)之經蘇木精及曙紅染色的組織 切片(圖9A至9E)。得自不同接種群組之迴腸(圖9F至9J)、盲腸(圖9K至9O)及結腸(圖9P至9T)的免疫組織化學染色組織切片。所有影像均為100倍放大。
圖10A至10D顯示在3DPI屍體剖檢之豬的平均纖毛高度(μm)、腺管深度(μm)、纖毛/腺管比率及免疫組織化學分數。對各個接種群組進行統計學分析，但每次針對一種組織類型進行。無相同字母的標記指示顯著差異。
圖11A至11D顯示在7DPI屍體剖檢之豬的平均纖毛高度(μm)、腺管深度(μm)、纖毛/腺管比率及免疫組織化學分數。對各個接種群組進行統計學分析，但每次針對一種組織類型進行。無相同字母的標記指示顯著差異。
圖12為PEDV基因組組織化及病毒蛋白質之推定功能的示意圖。描繪PEDV全基因組組織(頂圖)。顯示5'前導序列、編碼複製酶多蛋白的ORF 1a及1b、刺突蛋白(S)、ORF3、被膜(E)、膜(M)及核衣殼(N)基因，其中指示核糖體讀框轉移位點。描繪複製酶多蛋白及推定功能域之預測裂解產物(nsp1-nsp16)(底圖)。Nsp1可能抑制先天性免疫反應及宿主蛋白合成。nsp2之確切功能仍不明確。Nsp3包括番木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PL1pro及PL2pro，裂解位點=白色箭頭)及腺苷二磷酸酯-核糖1"-磷酸酶(ADRP,X域)活性。PL2pro亦為干擾素拮抗劑。Nsp5為主要蛋白酶或3C樣蛋白酶(3CLpro，裂解位點=黑色箭頭)。Nsp3、nsp4及nsp6含有跨膜域(TM)且充當膜錨定蛋白質。Nsp7及nsp8形成具有中央通道的十六聚物複合物，用於結合至雙股RNA且起始RNA合成。Nsp9為單股RNA結合蛋白(RBP)。 Nsp10為nsp14及nsp16之輔因子(活化劑)。nsp14在N末端具有3'-5'核酸外切酶(ExoN)且在C末端具有7-甲基轉移酶(7MT)。nsp16充當2'-O-甲基轉移酶(2'-O-MT)。nsp10、nsp14與nsp16之間的相互作用在複製保真度及病毒甲基化方面起關鍵作用。nsp11功能然而未得到完全瞭解。Nsp12為病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)。Nsp13含有鋅結合域(zinc-binding domain；ZBD)及病毒解螺旋酶。Nsp13亦具有三磷酸核苷水解酶及RNA 5'三磷酸酶活性。Nsp15含有一種基元，稱為巢狀病毒尿苷酸特異性內切核糖核酸酶(nidoviral uridylate-specific endoribonuclease；NendoU)。S蛋白充當與細胞受體發生相互作用的病毒附著蛋白。另外，S蛋白假設具有中和抗原決定基且亦與病毒毒力/減毒相關。M蛋白及E蛋白在病毒組裝中起關鍵作用。N蛋白結合至病毒基因組RNA且封裝於核衣殼中。N蛋白亦顯示可拮抗干擾素-β產生。由ORF3編碼的輔助蛋白可能與細胞培養適應相關且亦可能對細胞週期及亞細胞結構產生影響。
圖13為一個影像，其顯示針對美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系之抗血清的IFA抗體測試。頂圖顯示平均IFA抗體效價且底圖顯示IFA抗體陽性樣品的數目。原型抗血清：自美國PEDV原型品系接種豬收集的抗血清；變異體抗血清：自美國PEDV S-INDEL-變異型品系接種豬收集之抗血清；陰性抗血清：自陰性對照豬收集的抗血清；Pro IFA：基於美國PEDV原型品系之IFA；Var IFA：基於美國PEDV S-INDEL-變異型品系之IFA。
圖14A至圖14C顯示藉由ProWV ELISA(圖14A)、ProS1 ELISA(圖14B)及VarS1 ELISA(圖14C)測試針對美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系的抗血清。在各分析中，實心黑線指示呈陽性的樣品高於S/P比率； 圓點黑線指示呈陰性的樣品低於S/P比率；S/P比率在實心黑線與圓點黑線之間的樣品為可疑樣品。ProWV ELISA：基於美國PEDV原型品系全病毒之ELISA；ProS1 ELISA：基於美國PEDV原型品系S1之ELISA；VarS1 ELISA：基於美國PEDV S-INDEL-變異型品系S1之ELISA。
圖15顯示針對美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系之抗血清的病毒中和抗體測試。頂圖顯示平均VN抗體效價且底圖顯示VN抗體陽性樣品的數目。Pro VN：基於美國PEDV原型品系之VN；Var VN：基於美國PEDV S-INDEL-變異型品系之VN。
圖16顯示一個表，其為在細胞培養物中連續繼代期間，美國原型PEDV分離株USA/IN19338/2013之核苷酸與胺基酸變化的比較。
圖17顯示美國PEDV原型分離株USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75及P100在Vero細胞中的生長曲線。
圖18為顯示不同接種群組在接種後(DPI)0至7天期間之直腸拭子之病毒排出的圖。不同字母指示顯著差異。
圖19顯示接種PEDV USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75及P100之不同豬崽群在接種後第3天之小腸顯微鏡下病灶嚴重度分數。無相同字母的標記指示顯著差異，例如A與B的差異顯著，但A與AB的差異不顯著。
圖20顯示接種PEDV USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75及P100之不同豬崽群在接種後第3天之小腸的纖毛高度與腺管深度平均比率。不同字母指示顯著差異。
圖21顯示接種PEDV USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75及P100之不同豬崽群在接種後第3天之小腸、盲腸及結腸的免疫組織化學平均分數。
圖22A至圖22C顯示根據本發明之例示性具體實例的序列。圖22A顯示2014020697-P8R1繼代8譜系2 ORF1a/1b多蛋白之序列(SEQ ID NO：17)；2014020697-P8R1繼代8譜系2刺突蛋白之序列(SEQ ID NO：18)、2014020697-P8R1繼代8譜系2 ORF 3蛋白之序列(截短)(SEQ ID NO：19)、2014020697-P8R1繼代8譜系2被膜蛋白之序列(SEQ ID NO：20)、2014020697-P8R1繼代8譜系2膜蛋白之序列(SEQ ID NO：21)，及2014020697-P8R1繼代8譜系2核衣殼蛋白之序列(SEQ ID NO：22)。圖22B顯示2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b ORF1a/1b多蛋白(SEQ ID NO：23)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b刺突蛋白(SEQ ID NO：24)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b ORF3蛋白(截短)(SEQ ID NO：25)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b被膜蛋白(SEQ ID NO：26)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b膜蛋白(SEQ ID NO：27)及2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b核衣殼蛋白(SEQ ID NO：28)。圖22C為2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a ORF1a/1b多蛋白(SEQ ID NO：29)；2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a刺突蛋白(SEQ ID NO：30)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a ORF 3蛋白(截短)(SEQ ID NO：31)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a被膜蛋白(SEQ ID NO：32)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a膜蛋白(SEQ ID NO：33)，及2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a核衣殼蛋白(SEQ ID NO：34)。
圖23A至圖23C顯示根據本發明之例示性具體實例的序列。圖23A顯示2014020697-P8R1繼代8譜系2之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：35)，圖23B顯示2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b全基因組核苷酸序列 (SEQ ID NO：36)；圖23C顯示2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a全基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：37)。
圖24為顯示不同繼代之INDEL序列比較的圖表。
圖25為2014020697-P45繼代45譜系1之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：39)。
圖26為2014020697-P5繼代5譜系1(P5)之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：8)、2014020697-P7R1繼代7譜系2之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：15)、2014020697-P8R1繼代8譜系2之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：35)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系G8b之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：36)、2014020697-P18R1繼代18譜系2純系F6a之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：37)及2014020697-P45繼代45譜系1之基因組核苷酸序列(SEQ ID NO：39)的比較。
圖27顯示根據本發明之例示性具體實例的序列。圖示為2014020697-P45繼代45譜系1 ORF1a/1b多蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：40)；2014020697-P45繼代45譜系1刺突蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：41)；2014020697-P45繼代45譜系1 ORF3蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：42)；2014020697-P45繼代45譜系1被膜蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：43)；2014020697-P45繼代45譜系1膜蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：44)；及2014020697-P45繼代45譜系1核衣殼蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：45)。
圖28A至圖28B顯示糞便病毒排出效價。圖28A顯示各組之各時間點的糞便病毒排出效價，其中上部顯示標準誤差條。圖28B顯示在D0-D28及D28-D56，直腸拭子中之總體病毒排出效價的統計分析。在D0-D28期間， N/N、N/V及N/P群組接受相同接種物且作為相同處理組加以分析，V/V及V/P群組以及P/V及P/P群組類似。不同字母指示各組之間的病毒排出量存在統計學顯著差異。
圖29A至29B：肉眼病理學分數。圖29A為D4(第1次接種後的第4天)之群組平均肉眼病理學分數，其中顯示有標準誤差條。圖29B為D34(D28攻毒後的第6天)之群組平均肉眼病理學分數，其中顯示有標準誤差條。圖示為小腸、盲腸及結腸含量分數以及小腸、盲腸及結腸器官之肉眼病變分數。不同字母指示統計學顯著差異，此利用各組之間的相同參數觀測到。突出顯示的黃色為V品系攻毒豬之統計資料，且突出顯示的綠色為P品系攻毒豬之統計資料。
圖30A至圖30B顯示D4之組織病理學量測結果。圖30A顯示末端空腸及迴腸之纖毛高度/腺管深度比率之群組平均值，其中顯示標準誤差條。圖30B顯示末端空腸、迴腸、盲腸及結腸之PEDV IHC分數的群組平均值，其中顯示有標準誤差條。不同字母指示統計學顯著差異，此在各組之間的相同組織中觀測到。
圖31A至圖31B顯示D34之組織病理學量測結果。圖31A顯示末端空腸及迴腸之纖毛高度/腺管深度比率之群組平均值，其中顯示標準誤差條。圖31B顯示末端空腸、迴腸、盲腸及結腸之PEDV IHC分數的群組平均值，其中顯示有標準誤差條。不同字母指示統計學顯著差異，此在各組之間的相同組織中觀測到。突出顯示的黃色為V品系攻毒豬之統計資料，且突出顯示的綠色為P品系攻毒豬之統計資料。
圖32A至圖32B顯示針對P品系病毒或V品系病毒之血清IFA抗體效 價。圖32A顯示針對P品系病毒之血清IFA效價的群組平均值，其中顯示有標準誤差條。圖32B顯示針對V品系病毒之血清IFA效價的群組平均值，其中顯示有標準誤差條。
圖33A至圖33B顯示針對P品系病毒或V品系病毒之血清VN抗體效價。圖33A顯示針對P品系病毒之血清VN效價的群組平均值，其中顯示有標準誤差條。圖33B顯示針對V品系病毒之血清VN效價的群組平均值，其中顯示有標準誤差條。
以下定義及介紹性事項適用於本說明書中。
除非上下文另有明確指示，否則單數術語「一(a/an)」及「該(the)」包括多個指示物。類似地，除非上下文另有明確指示，否則「或」一詞意欲包括「及」。「或」一詞意謂特定清單中的任一個成員且亦包括該清單之成員的任何組合。
術語「佐劑」係指增強疫苗有效性且可添加至包括免疫藥劑之調配物中的化合物。佐劑提供增強的免疫反應，甚至在投予僅單劑之疫苗之後。佐劑可包括例如胞壁醯基二肽、吡啶、氫氧化鋁、二甲基二(十八基)溴化銨(dimethyldioctadecyl ammonium bromide；DDA)、油類、水包油型乳液、皂苷、細胞激素及此項技術中已知的其他物質。適合佐劑之實例描述於美國專利申請公開案第US2004/0213817 A1號中。「有佐劑」係指合併佐劑或與佐劑組合的組成物。
「抗體(Antibodies)」係指多株及單株抗體、嵌合抗體及單鏈抗體，以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表現文庫之產物。就抗 體而言，術語「免疫特異性(immunologically specific)」係指結合至所關注蛋白質之一或多個抗原決定基的抗體，但其實質上不識別及結合含有抗原性生物分子之混合群體之樣品中的其他分子。
如本文所用，「減毒(attenuated)」PEDV係指能夠在易感宿主中感染及/或複製、但對於易感宿主而言無病原性或病原性較弱的PEDV。舉例而言，相較於野外分離之相關品系，減毒病毒不會引起可觀測/可偵測的臨床表現，或引起的臨床表現較少或嚴重臨床表現較少，或展現的病毒複製效率及/或感染性降低。PEDV感染的臨床表現可包括(不限於)臨床下痢、嘔吐、嗜睡、體虛及脫水。
「抗原決定基(epitope)」為具免疫活性的抗原決定子，使得投予宿主後，其能夠引起體液型(B細胞)及/或細胞型(T細胞)免疫反應。此等物為分子上具抗原性的特定化學基團或肽序列。抗體特異性結合多肽上的特定抗原性抗原決定基。在動物中，大部分抗原將同時呈遞若干個或甚至許多個抗原性決定子。此類多肽亦可適合作為免疫原性多肽且可如另外所述來鑑別抗原決定基。
如本文所用，術語「免疫原性片段(immunogenic fragment)」係指多肽或多肽片段，或編碼其的核苷酸序列，其包含對偶基因特異性基元、抗原決定基或其他序列，使得該多肽或片段將結合MHC分子且針對免疫原性多肽或免疫片段所來源之抗原誘導細胞毒性T淋巴細胞(「CTL」)反應及/或B細胞反應(例如抗體產生)，及/或T輔助淋巴細胞反應，及/或延遲型過敏(DTH)反應。DTH反應為一種免疫反應，其中T細胞依賴性巨噬細胞活化及發炎引起組織損傷。針對抗原皮下注射的DTH反應往往用作 細胞介導性免疫的分析。
術語「誘導免疫保護性反應」意謂一種(體液及/或細胞型)免疫反應，相較於健康對照者，其減少或消除所感染個體之一或多種疾病症狀，亦即臨床徵象、病變、組織中之細菌分泌及細菌複製。較佳地，相較於對照者，症狀之該減少具統計學顯著性。
出於本發明之目的，「感染性DNA分子(infectious DNA molecule)」為編碼用於在適合宿主細胞中進行病毒複製、轉錄及轉譯成功能性病毒粒子所需之元件的DNA分子。
術語「分離(isolated)」用於表示細胞、肽或核酸與其原生環境分離。經分離之肽及核酸可為實質上純的，亦即基本上不含其在自然界中可結合之其他物質。
出於實施本發明之所有態樣之目的，熟習此項技術者已熟知，在免疫分析中，就根據暴露於特定抗原或病原體呈血清反應陰性的動物及呈血清反應陽性(已暴露於疫苗或病原體)的動物而言，不存在絕對的免疫邊界。然而，熟習此項技術者將認識到，在血清中和分析中，呈血清反應陽性的動物通常在至少高達1：1000血清稀釋度的情況下仍會偵測到，而呈血清反應陰性的動物在約1：20或1：10之較高稀釋度下預期不會發生中和。
出於本發明的目的，在第二聚核苷酸分子的核苷酸序列所編碼之聚胺基酸與第一聚核苷酸分子所編碼之聚胺基酸相同(基於遺傳密碼之簡併)的情況下，或當其編碼的聚胺基酸與第一聚核苷酸分子之核苷酸序列所編碼之聚胺基酸足夠類似以便適用於實施本發明時，第二聚核苷酸 分子(RNA或DNA)的核苷酸序列與第一聚核苷酸分子的核苷酸序列「同源」，或與該第一聚核苷酸分子具有「一致性」。同源聚核苷酸序列亦指有義股及反義股，且在所有情況下是指任何此類股的補體。出於本發明之目的，聚核苷酸分子適用於實施本發明，且因此具同源性或具有一致性，其中其可作為診斷探針用於偵測所感染豬的體液或組織樣品中PEDV或病毒聚核苷酸的存在，例如藉由標準雜交或擴增技術。一般而言，如基於BLASTN算法(美國國立衛生研究院(United States National Institute of Health)的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)，另稱為NCBI(Bethesda,Md,USA))，若第二聚核苷酸分子的核苷酸序列與第一聚核苷酸分子的核苷酸序列具有至少約70%核苷酸序列一致性，則該第二聚核苷酸分子與第一聚核苷酸分子的核苷酸序列同源。在根據本發明之實務的特定計算實例中，參考BLASTP 2.2.6[Tatusova TA及TL Madden,"BLAST 2 sequences--a new tool for comparing protein and nucleotide sequences."(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250.]。簡言之，使用空位開放罰分10、空位延伸罰分0.1以及Henikoff及Henikoff之「blosum62」計分矩陣來比對兩個胺基酸序列以使比對分數最佳化(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 325 89：10915-10919.1992)。接著如下計算一致性百分比：一致匹配的總數×100/除以較長序列的長度+為了比對兩個序列而引入較長序列中之空位數。
較佳地，同源核苷酸序列具有至少約75%核苷酸序列一致性，甚至更佳至少約80%、85%、90%及95%核苷酸序列一致性。由於遺傳密碼簡併，因此同源核苷酸序列可包括任意數目個「靜默」鹼基變化，亦即仍然編碼相同胺基酸的核苷酸取代。
同源核苷酸序列可另外含有非靜默突變，亦即在所編碼的聚胺基酸中導致胺基酸差異的鹼基取代、缺失或添加，只要該序列保持與由第一核苷酸序列所編碼之聚胺基酸至少約70%一致或原本適用於實施本發明。就此而言，可進行通常認為不使總體蛋白質功能不活化的某些保守胺基酸取代，諸如關於帶正電荷的胺基酸(且反之亦然)：離胺酸、精胺酸及組胺酸；關於帶負電荷的胺基酸(且反之亦然)：天冬胺酸及麩胺酸；以及關於帶中性電荷之某些胺基酸群組(且在所有情況下，亦反之亦然)：(1)丙胺酸及絲胺酸，(2)天冬醯胺、麩醯胺酸及組胺酸，(3)半胱胺酸及絲胺酸，(4)甘胺酸及脯胺酸，(5)異白胺酸、白胺酸及纈胺酸，(6)甲硫胺酸、白胺酸及異白胺酸，(7)苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸及酪胺酸，(8)絲胺酸及蘇胺酸，(9)色胺酸及酪胺酸，以及(10)例如酪胺酸、色胺酸及苯丙胺酸。可根據物理特性及對二級與三級蛋白質結構的影響來對胺基酸進行分類。因此，保守取代在此項技術中公認為一種胺基酸被具有類似特性的另一種胺基酸取代，且例示性保守取代可見於1997年3月13日公開的WO 97/09433第10頁(PCT/GB96/02197，1996年9月6日提申)。或者，保守胺基酸可如Lehninger(Biochemistry，第二版；Worth Publishers公司，NY：NY(1975)，第71-77頁)中所述進行分類。可使用Vector NTI Advance 11.5及CLUSTAL 2.1多重序列比對來比對蛋白質序列。如本文所用，特定胺基酸或核苷酸序列的敍述應包括關於核酸序列的所有靜默突變及關於胺基酸序列的任何及所有保守性修飾變異體。
可藉由比較核苷酸序列，例如使用上述BLASTN來確定同源核苷酸序列。或者，可藉由選定條件下的雜交來確定同源核苷酸序列。 舉例而言，若第二聚核苷酸分子的核苷酸序列與SEQ ID NO：1之補體在中等嚴格條件下雜交，例如在65℃、在0.5M NaHPO4 、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中雜交以過濾所結合之DNA，且在42℃、在0.2×SSC/0.1% SDS中洗滌(參見Ausubel等人編，Protocols in Molecular Biology,Wiley and Sons,1994，第6.0.3至6.4.10頁)，或在原本將引起編碼如下文所定義之PEDV病毒之序列雜交的條件下雜交，則第二聚核苷酸分子的核苷酸序列與SEQ ID NO：1(或任何其他特定的聚核苷酸序列)同源。可憑經驗確定或基於探針的長度及鳥苷/胞嘧啶(GC)鹼基配對的百分比來準確計算雜交條件的修改。可如Sambrook等人(編),Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，第9.47頁至第9.51頁所述計算雜交條件。
在另一個具體實例中，如此項技術中已知，若第二核苷酸序列與SEQ ID NO：1之補體在高度嚴格條件下雜交，例如在65℃、在0.5M NaHPO4 、7% SDS、1mM EDTA中雜交以過濾所結合的DNA且在68℃、在0.1×SSC/0.1% SDS中洗滌，則該第二核苷酸序列與SEQ ID NO：1(或本發明之任何其他序列)同源。
此外應瞭解，本發明的經分離之聚核苷酸分子及經分離之RNA分子包括合成分子與經由重組技術(諸如活體外選殖及轉錄)所得的分子。
應注意，本發明的多種疫苗(能夠使PEDV病毒減毒)含有ORF3蛋白質之實質性缺失，此由ORF3核苷酸序列中的減毒性突變引起，該等突變導致實質性內部缺失且/或最典型地導致出現來自讀框轉移的截短 轉譯所得物及出現終止密碼子。因此應注意，在本發明實務內，比對及一致性百分比計算及所述一致性結果(不論核苷酸或胺基酸序列)可在參考或不參考有缺失ORF3序列的情況下計算。
「哺乳動物」包括哺乳動物類別的任何溫血脊椎動物，包括人類。
「醫藥學上可接受之載劑」意謂醫藥學上可接受之任何習知載劑、媒劑或賦形劑，其在此項技術中用於生產及投予疫苗。醫藥學上可接受之載劑典型地為無毒、惰性固體或液體載劑。
術語「豬科動物(Porcine)」及「豬(swine)」在本文中可互換使用且指作為豬科成員的任何動物，諸如豬(pig)。
如本文所用，「易感」宿主係指可被PEDV感染的細胞或動物。引入易感動物時，減毒的PEDV亦可誘導針對PEDV或其抗原的免疫反應，且藉此使得動物具有針對PEDV感染的免疫力。
術語「疫苗」係指一種抗原性製劑，其用於產生針對疾病的免疫力，以便預防或改善感染後果。疫苗典型地使用免疫學上有效量之免疫原與有效增強所接種個體針對免疫原之免疫反應之佐劑的組合來製備。
疫苗調配物將含有「治療有效量」之活性成分，亦即能夠誘使組成物所投予之個體中誘導免疫保護反應的量。舉例而言，治療及預防PEDV疾病時，「治療有效量」較佳為增強所接種個體對新感染之抗性及/或降低疾病之臨床嚴重度的量。此類保護作用將根據經PEDV感染之個體通常所呈現之症狀的減少或缺乏、更快的康復時間及/或降低的病毒顆粒計數來證明。感染之前可投予疫苗，作為針對PEDV的預防性措施。或者，可 在個體已感染疾病之後投予疫苗。暴露於PEDV之後所得到的疫苗能夠減輕疾病，從而引發比天然感染本身更優的免疫反應。
疫苗調配物/免疫組成物
本發明亦關於適用作疫苗的免疫組成物，其包含本發明之變異型PEDV品系。本發明之免疫組成物誘發針對PEDV之特異性體液免疫反應，包含中和性抗體。
基於本文所揭示之變異型品系的較佳免疫組成物可提供活減毒病毒，其展現高免疫原性，同時不產生危險的病原性或致死性作用。
本發明之免疫組成物然而不限於任何特定類型或製備方法。此等物包括(但不限於)感染性DNA疫苗(亦即使用質體、載體或其他習知載劑將DNA直接注入豬中)、活疫苗、經修飾之活疫苗、不活化疫苗、次單位疫苗、減毒疫苗、基因工程改造之疫苗等。此等疫苗係藉由此項技術中已知的標準方法製備。
本發明較佳包括包含本發明之活減毒變異型PEDV及醫藥學上可接受之載劑的疫苗組成物。如本文所用，表述「本發明之活減毒PEDV」涵蓋任何活減毒PEDV品系，包括本文所述之一或多種變異體。醫藥學上可接受之載劑可為例如水、穩定劑、防腐劑、培養基或緩衝液。包含本發明之減毒PEDV的疫苗調配物可以懸浮液形式或以凍乾形式或以冷凍形式製備。若冷凍，則可添加甘油或其他類似製劑以在冷凍時增強穩定性。活減毒疫苗的優點大體包括感染物之所有相關免疫原性決定子均以其天然形式呈遞給宿主免疫系統，及由於免疫藥劑能夠在所接種宿主中擴增而需要的該藥劑之量相對較小。
用於活疫苗之病毒的減毒以使得其病原性不足以實質上傷害所接種目標動物，可藉由已知程序(較佳包括連續繼代)完成。以下參考文獻提供用於冠狀病毒減毒的各種通用方法，且適於實施本發明所用之任一種品系的減毒或進一步減毒：B.Neuman等人，Journal of Virology，第79卷，第15期，第9665-9676頁，2005；J.Netland等人，Virology，第399(1)卷，第120-128頁，2010；Y-P Huang等人，「Sequence changes of infectious bronchitis virus isolates in the 3' 7.3 kb of the genome after attenuating passage in embryonated eggs,Avian Pathology，第36(1)卷，(摘要),2007；及S.Hingley等人，Virology,第200(1)卷1994，第1-10頁；參見美國專利3,914,408；及Ortego等人，Virology,第308(1)卷，第13-22頁，2003。
本發明中需要的其他經基因工程改造之疫苗係藉由此項技術中已知的技術製得。此類技術包括(但不限於)重組DNA向重組蛋白質之胺基酸序列之進一步操縱、修飾或取代及其類似者。
基於重組DNA技術之經基因工程改造之疫苗是藉由例如鑑別出編碼負責誘導豬發生較強免疫或保護反應之蛋白質(例如來源於M、GP2、GP3、GP4或GP5等之蛋白質)之病毒基因的替代部分來製備。可對病毒蛋白質基因之各種亞型或分離株進行DNA改組方法。所得異源嵌合病毒蛋白質可廣泛用於保護性次單位疫苗中。或者，可將此類嵌合病毒基因或免疫顯性片段選殖入標準蛋白質表現載體(諸如桿狀病毒載體)中，且用於感染適當宿主細胞(參見例如O'Reilly等人，"Baculovirus Expression Vectors：A Lab Manual,"Freeman & Co.,1992)。培養宿主細胞，從而表現所要疫苗蛋白質，其可純化至所要程度且調配成適合疫苗產物。
若純系保持任何非所要之天然致病能力，則亦可鑑別病毒基因組中之導致任何殘餘毒力之核苷酸序列且經由例如定點突變誘發對病毒進行基因工程改造而變成無毒的。定點突變誘發能夠進行一或多個核苷酸的添加、缺失或變化(參見例如Zoller等人，DNA 3：479-488,1984)。合成含有所要突變的寡核苷酸且與單股病毒DNA的一部分黏接。該程序所產生的雜交分子用於使細菌轉型。接著使用經分離之含有適當突變的雙股DNA，藉由與全長DNA之限制性片段連接、隨後轉染至適合細胞培養物中來產生該全長DNA。基因組連接至適用於轉移的載體中可經由一般技術者已知的任何標準技術完成。載體轉染至宿主細胞中以便產生病毒後代可使用任一種習知方法進行，諸如磷酸鈣或DEAE-聚葡萄糖介導性轉染、電穿孔、原生質體融合及其他熟知技術(例如Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual,」Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。所選殖病毒接著展現所要突變。或者，可合成含有適當突變的兩種寡核苷酸。可將此等物黏接而形成雙股DNA，該雙股DNA可插入病毒DNA中以產生全長DNA。
將免疫學上有效量之本發明疫苗投予需要預防病毒感染之豬。接種豬之免疫有效量或免疫原性量可容易確定或容易藉由常規測試滴定。有效量為達成疫苗之足夠免疫反應以保護暴露於PEDV病毒之豬的量。較佳地，豬的保護程度為病毒疾病之不良生理學症狀或作用之一至全部均顯著減少、改善或完全得到預防。
本發明的疫苗可依循公認的約定調配以包括動物可接受之載劑，諸如標準緩衝液、穩定劑、稀釋劑、防腐劑及/或增溶劑，且亦可經 調配以促進持續釋放。稀釋劑包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。等張性添加劑尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白。其他適合疫苗媒劑及添加劑，包括特別適用於調配經修飾之活疫苗的彼等物，為熟習此項技術者已知或顯而易見的。參見例如Remington's Pharmaceutical Science，第18版，1990,Mack Publishing，該等文獻以引用的方式併入本文中。
本發明疫苗可另外包含一或多種其他免疫調節組分，尤其諸如佐劑或細胞激素。可用於本發明疫苗中的佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統(Ribi公司，Hamilton,Mont.)、明礬、礦物凝膠(例如氫氧化鋁凝膠)、水包油型乳液、油包水型乳液(例如弗氏完全及不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvants))、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta,Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech公司，Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、AMPHIGEN®佐劑、皂苷、Quil A或其他皂苷溶離份、單磷醯基脂質A、離子性多醣以及阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑。適用於本發明疫苗的水包油型乳液之非限制性實例包括經修飾之SEAM62及SEAM 1/2調配物。經修飾之SEAM62為一種水包油型乳液，其含有5%(v/v)角鯊烯(Sigma)、1%(v/v)SPAN® 85清潔劑(ICI界面活性劑)、0.7%(v/v)TWEEN® 80清潔劑(ICI界面活性劑)、2.5%(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml膽固醇以及0.5%(v/v)卵磷脂。經修飾之SEAM 1/2為一種水包油型乳液，其包含5%(v/v)角鯊烯、1%(v/v)SPAN® 85清潔劑、0.7%(v/v)Tween 80清潔劑、2.5%(v/v)乙醇、100μ g/ml Quil A以及50μ g/ml膽固醇。可包括於疫苗中的其他免疫調節劑包括例如一或多種介白素、干擾素或其他 已知細胞激素。
其他佐劑系統允許實現T輔助細胞與B細胞抗原決定基之組合，產生一或多種類型的共價T-B抗原決定基連接結構，其可另外進行脂質化，諸如WO2006/084319、WO2004/014957及WO2004/014956中所述之彼等物。
在本發明之一個較佳具體實例中，ORFI PEDV蛋白質或其他PEDV蛋白質或其片段是用5% AMPHIGEN®調配，如下文中所論述。
佐劑組分
本發明之疫苗組成物可或可不包括佐劑。詳言之，基於經口感染性病毒的本發明之經修飾之活疫苗可在無佐劑的情況下結合無菌載劑使用。可用於經口投予的佐劑包括基於CT樣免疫調節劑的彼等物(rmLT、CT-B，亦即大腸桿菌之重組突變體熱不穩定性毒素、霍亂毒素-B次單元)；或經由聚合物及海藻酸鹽囊封，或使用黏膜黏著劑，諸如聚葡萄胺糖，或經由脂質體。有佐劑或無佐劑之較佳疫苗劑量在最小保護劑量下經由疫苗釋放可提供約10與約106 log10 TCID50 之間的病毒/劑，或更高的病毒/劑。「TCID50」係指「組織培養感染劑量」且定義為感染50%指定批次之所接種細胞培養物所需之病毒稀釋度。可使用多種方法來計算TCID50，包括在通篇本說明書中所用的斯皮爾曼-卡勃方法(Spearman-Karber method)。關於斯皮爾曼-卡勃方法之描述，參見B.W.Mahy及H.O.Kangro,Virology Methods Manual，第25-46頁(1996)。佐劑(若存在)可以乳液形式提供，更常見的是選擇非經口投予，但不應使初始效價降低大於0.7logs(80%降幅)。
在一個實例中，利用輕質礦物油中之卵磷脂與氫氧化鋁組分 之組合來提供佐劑組分。關於Amphigen®(作為代表性卵磷脂/礦物油組分)之組成物及調配物的詳情如下。
較佳佐劑可於緩衝溶液中以2ML劑量提供，該緩衝溶液另外包含約5%(v/v)Rehydragel®(氫氧化鋁凝膠)及約25%(v/v)最終濃度之「20% Amphigen®」。Amphigen®大體上描述於美國專利5,084,269中且提供溶解於輕質油中之脫油卵磷脂(較佳為大豆)，接著將其以水包油型乳液形式分散於抗原之水溶液或懸浮液中。Amphigen已根據美國專利6,814,971(參見其第8-9欄)之方案得到改良，從而提供適用於本發明之最終有佐劑疫苗組成物中之所謂「20% Amphigen」組分。因此，10%卵磷脂及90%載劑油(DRAKEOL®,Penreco,Karns City,PA)之儲備混合物用0.63%磷酸鹽緩衝鹽水溶液1：4稀釋，藉此使卵磷脂及DRAKEOL組分分別減少至2%及18%(亦即其初始濃度之20%)。向組成物中添加Tween 80及Span 80界面活性劑，其中代表性且較佳之最終量為5.6%(v/v)Tween 80及2.4%(v/v)Span 80，其中Span最初在儲備液DRAKEOL組分中提供且Tween最初在緩衝鹽水組分中提供，使得鹽水及DRAKEOL組分之混合物產生所要之界面活性劑最終濃度。DRAKEOL/卵磷脂與鹽水溶液之混合物可使用管線內Slim乳化設備(型號405,Charles Ross and Son,Hauppauge,NY,USA)獲得。
疫苗組成物亦包括Rehydragel® LV(儲備材料中之約2%氫氧化鋁含量)作為其他佐劑組分(可獲自Reheis,NJ,USA及ChemTrade Logistics,USA)。在使用0.63% PBS進一步稀釋的情況下，最終疫苗組成物每2ML劑量含有以下組成量；5%(v/v)Rehydragel® LV；25%(v/v)「20%Amphigen」，亦即其進一步進行4倍稀釋)；及0.01%(w/v)硫柳汞 (merthiolate)。
如此項技術中所理解，可改變組分之添加順序以提供等效的最終疫苗組成物。舉例而言，可製備病毒於緩衝液中之適當稀釋液。接著可在摻合下添加適量Rehydragel® LV(約2%氫氧化鋁含量)儲備溶液，以便使Rehydragel® LV在實際最終產物中之濃度達成所要之5%(v/v)。一經製備，即將此中間儲備物與適量的「20% Amphigen」儲備液(如上文大體所述，且已含有必需量之Tween 80及Span 80)合併，從而再次達成具有25%(v/v)「20% Amphigen」之最終產物。最後可添加適量的10%硫柳汞。
本發明之疫苗組成物允許改變所有成分，使得抗原之總劑量相較於上述抗原劑量較佳可改變100倍(向上或向下)，且最佳改變10倍或小於10倍(向上或向下)。類似地，界面活性劑濃度(不論Tween或Span)可彼此獨立地改變高達10倍，或其可完全缺失，用適當濃度之類似物質置換，如此項技術中所充分瞭解。
最終產物中之Rehydragel®濃度可首先藉由使用可獲自許多其他製造商(亦即Alhydrogel®,Brenntag；Denmark)之等效物，或藉由使用Rehydragel®產品系列之其他變異體(諸如CG、HPA或HS)來改變。使用LV作為實例，其最終使用濃度包含0%至20%，其中2-12%為更佳且4-8%為最佳。類似地，雖然Amphigen之最終濃度(以「20% Amphigen」之%表示)較佳為25%，但此量可為5-50%不等，較佳為20-30%且最佳為約24-26%。
根據本發明之實務，本發明之佐劑調配物中所用之油較佳為礦物油。如本文所用，術語「礦物油」係指經由蒸餾技術自石蠟脂獲得之液態烴之混合物。該術語與「液化石蠟」、「液體石蠟脂」及「白色礦物油」 同義。該術語亦意欲包括「輕質礦物油」，亦即，類似地藉由石蠟脂之蒸餾獲得、但比重略低於白色礦物油的油。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pa.：Mack Publishing公司，1990，第788頁及第1323頁)。礦物油可自各種商業來源獲得，例如J.T.Baker(Phillipsburg,Pa.)、USB公司(Cleveland,Ohio)。較佳礦物油為可以名稱DRAKEOL®市購之輕質礦物油。
典型地，油相以疫苗組成物之50體積%至95體積%之量；較佳以大於50%至85% v/v之量；更佳以大於50%至60% v/v之量；且更佳以大於50-52% v/v之量存在。若存在任何此類乳化劑，則油相包括油及乳化劑(例如SPAN® 80、TWEEN® 80等)。
適用於本發明佐劑調配物之非天然合成乳化劑亦包括基於脫水山梨糖醇之非離子型界面活性劑，例如經脂肪酸取代之脫水山梨糖醇界面活性劑(可以名稱SPAN®或ARLACEL®市購)、聚乙氧基化山梨糖醇之脂肪酸酯(TWEEN®)、來自諸如蓖麻油之來源之脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR®)；聚乙氧基化脂肪酸(例如可以名稱SIMULSOL® M-53獲得之硬脂酸)、聚乙氧基化異辛基苯酚/甲醛聚合物(TYLOXAPOL®)、聚氧乙烯脂肪醇醚(BRIJ®)；聚氧乙烯壬基苯基醚(TRITON® N)、聚氧乙烯異辛基苯基醚(TRITON® X)。較佳合成界面活性劑為可以名稱SPAN®及TWEEN®獲得之界面活性劑，諸如TWEEN®-80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)及SPAN®-80(脫水山梨糖醇單油酸酯)。一般而言，乳化劑可以0.01體積%至40體積%、較佳0.1%至15%、更佳2%至10%之量存在於疫苗組成物中。
在本發明之一個替代性具體實例中，最終疫苗組成物含有SP-Oil®及Rehydragel® LV作為佐劑(或其他Rehydragel®或Alhydrogel®產品)，其中較佳量為約5-20% SP-Oil(v/v)及約5-15% Rehydragel LV(v/v)，且最佳量分別為5%及12%。就此而言，應瞭解，Rehydragel %係指儲備市售產品之稀釋百分比。(SP-Oil®為流體化油乳液，其包括聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic® L121,BASF公司)、角鯊烯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween® 80,ICI Americas)及緩衝鹽溶液。)
應注意，本發明亦可以使用其中佐劑組分僅為Amphigen®來成功地實施。
在本發明之另一具體實例中，最終疫苗組成物含有TXO作為佐劑；TXO大體描述於WO 2015/042369中。其中揭示的所有TXO組成物適用於製備本發明之疫苗。在TXO中，免疫刺激性寡核苷酸(「T」)、較佳ODN、較佳含有回文序列且視情況存在經修飾之主鏈，以每50μ L疫苗組成物0.1至5μ g(例如每50μ L組成物0.5-3μ g，或更佳地，每50μ L組成物0.09-0.11μ g)之量存在。其較佳種類為SEQ ID NO：8，如WO2015/042369公開案(PCT/US2014/056512)中所列(第17頁)。聚陽離子載劑(「X」)以1-20μ g/50μ L(例如，3-10μ g/50μ L或約5μ g/50μ L)之量存在。輕質礦物油(「O」)亦為TXO佐劑之組分。
在某些具體實例中，TXO佐劑如下製備：a)將脫水山梨糖醇單油酸酯、MPL-A及膽固醇溶解於輕質礦物油中。無菌過濾所得油溶液；b)將免疫刺激性寡核苷酸、聚葡萄糖DEAE及聚氧乙烯(20)脫水山梨 糖醇單油酸酯溶解於水相中，從而形成水溶液；以及c)將該水溶液在連續均質化下添加至油溶液中，從而形成佐劑調配物TXO。
本發明之所有佐劑組成物皆可結合本發明所涵蓋之任一種PEDV品系及分離株使用。
適用於本發明之實務中的其他佐劑包括Prezent-A(大體參見美國公開專利申請案US20070298053)；及「QCDCRT」或「QCDC」型佐劑(大體參見美國公開專利申請案US20090324641)。
賦形劑
本發明之免疫組成物及疫苗組成物可另外包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑(參見例如Remington：The Science and practice of Pharmacy,2005 Lippincott Williams)，其呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對接受者無毒，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如汞((鄰羧基苯基)硫基)乙基鈉鹽(硫柳汞(THIOMERSAL))；氯化十八烷基二甲基苯甲銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，諸如 EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)、TWEEN或PLURONICS。
本發明疫苗可視情況調配以用於本發明之病毒、感染性DNA分子、質體或病毒載體的持續釋放。此類持續釋放型調配物的實例包括病毒、感染性DNA分子、質體或病毒載體與生物相容性聚合物(諸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纖維素、玻糖醛酸、膠原蛋白及其類似物)複合物的組合。藥物遞送媒劑中之可降解聚合物的結構、選擇及使用已評述於若干出版物中，包括A.Domb等人，1992,Polymers for Advanced Technologies 3：279-292，該文獻以引用的方式併入本文中。關於醫藥調配物中之聚合物之選擇及使用的其他指導可見於此項技術中已知的文本中，例如M.Chasin及R.Langer(編),1990,"Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems"於：Drugs and the Pharmaceutical Sciences，第45卷，M.Dekker,NY，該文獻以引用的方式併入本文中。或者或另外，病毒、質體或病毒載體可加以微囊封以改良投藥及功效。對抗原進行微囊封的方法在此項技術中已熟知，且包括例如以下文獻中所述的技術：美國專利第3,137,631號；美國專利第3,959,457號；美國專利第4,205,060號；美國專利第4,606,940號；美國專利第4,744,933號；美國專利第5,132,117號；及國際專利公開案WO 95/28227，該等文獻皆以引用的方式併入本文中。
脂質體亦可用於使得病毒、質體、病毒蛋白質或病毒載體達成持續釋放。關於如何製備及使用脂質體調配物的詳情尤其可見於美國專利第4,016,100號；美國專利第4,452,747號；美國專利第4,921,706號；美國 專利第4,927,637號；美國專利第4,944,948號；美國專利第5,008,050；以及美國專利第5,009,956中，該等文獻皆以引用的方式併入本文中。
任一種上述疫苗的有效量可藉由習知方式確定，初始為低劑量的病毒、病毒蛋白質質體或病毒載體，接著增加劑量、同時監測效果。可在單次投予疫苗之後或在多次投予疫苗之後獲得有效量。確定每種動物的最佳劑量時，可考慮已知因素。此等因素包括動物的物種、體型、年齡以及一般狀況、動物中之其他藥物的存在及其類似因素。較佳在考慮其他動物研究之結果之後選擇實際劑量。
偵測是否已達成足夠免疫反應的一種方法為在接種疫苗之後測定動物中的血清轉化及抗體效價。接種疫苗的時機及加打次數(若存在)較佳將由醫生或獸醫基於所有相關因素的分析來確定，其中一些因素已描述如上。
本發明之病毒、蛋白質、感染性核苷酸分子、質體或病毒載體的有效劑量可使用已知技術，考慮可由一般技術者確定的因素(例如待接種疫苗之動物的體重)來確定。本發明疫苗中之本發明病毒的劑量較佳在約101 pfu至約109 pfu(空斑形成單位)範圍內，更佳在約102 pfu至約108 pfu範圍內，且最佳在約103 pfu至約107 pfu範圍內。本發明疫苗中之本發明質體的劑量較佳在約0.1μg至約100mg範圍內，更佳在約1μg至約10mg範圍內，甚至更佳在約10μg至約1mg範圍內。本發明疫苗中之本發明感染性DNA分子的劑量較佳在約0.1μg至約100mg範圍內，更佳在約1μg至約10mg範圍內，甚至更佳在約10μg至約1mg範圍內。本發明疫苗中之本發明病毒載體的劑量較佳在約101 pfu至約109 pfu範圍內，更佳在約102 pfu 至約108 pfu範圍內，且甚至更佳在約103 pfu至約107 pfu範圍內。適合的劑量在約0.5ml至約10ml範圍內，且更佳在約1ml至約5ml範圍內。
根據本發明的實務，病毒蛋白或肽疫苗的適合劑量範圍一般為1至50微克/劑或高於50微克/劑，如可藉由標準方法確定，其中佐劑的量藉由關於各種此類物質的公認方法確定。在關於疫苗接種豬的一個本發明較佳實例中，動物的最佳年齡目標是在約1天與21天之間，在斷奶之前，亦可相應地執行其他疫苗接種時程，諸如針對豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)之疫苗接種。另外，育種大母豬之較佳疫苗接種時程包括類似劑量，及每年再接種時程。
給藥
較佳臨床指示為育種大母豬與分娩前小母豬的治療、控制及預防，隨後對豬崽進行疫苗接種。在代表性實例(適用於大母豬與小母豬)中，使用兩次2ML劑量之疫苗，然而實際劑量體積當然與疫苗如何調配有關，其中實際量範圍為0.1ML至5ML，亦考慮動物體型。單劑疫苗接種亦為適當的。
第一劑可早在育種前至分娩預5週投予，第二劑較佳在分娩前約1-3週投予。疫苗劑量較佳使得病毒物質的量對應於約106 與108 之間、更佳在約107 與107.5 之間之TCID50 (組織培養感染性劑量)，且可進一步改變，如此項技術中所認知。加打劑可在任何隨後分娩之前的兩週至四週給予。較佳為肌肉內疫苗接種(所有劑)，然而一或多劑可皮下給予。經口給予亦較佳。疫苗接種亦可有效地用於初始動物，及完成計劃或天然感染的非初始動物。
在另一較佳實例中，大母豬或小母豬在分娩前5週，接著在分娩前2週肌肉內或經口接種疫苗。在此等條件下，在PEDV陰性之接種大母豬中可展示保護免疫反應，因為其產生具有中和活性的抗體(經由血清樣品中的螢光焦點中和效價來量測)，且此等抗體被動地轉移至其豬崽。本發明之方案亦適用於治療已呈血清反應陽性之大母豬及小母豬以及豬崽及公豬。亦可加打接種疫苗且此等疫苗接種可經由不同投藥路徑。雖然較佳為大母豬在任何隨後分娩之前再接種疫苗，但本發明之疫苗組成物仍然可經由抗體之持續被動轉移為豬崽提供保護，即使大母豬僅在先前分娩時接種疫苗。
應注意，豬崽接著可早在生命第1天接種疫苗。舉例而言，豬崽可在第1天接種疫苗，在3週齡時接種加打劑，尤其是大母豬(雖然育種前已接種疫苗)在分娩前未接種疫苗時。若大母豬由於天然或計劃感染而先前不為初始動物，則疫苗接種豬崽亦可為有效的。當母親先前即未暴露於病毒、亦未在分娩前接種疫苗時，疫苗接種豬崽亦可為有效的。公豬(典型地為了育種目的而維持)應每6個月接種疫苗一次。劑量之變更充分屬於此項技術之實務範圍內。應注意，本發明的疫苗安全用於懷孕動物(所有三月期)及新生豬。本發明之疫苗減毒至可接受之安全水準(亦即無死亡，僅為暫時輕度臨床徵象或新生豬之正常徵象)，即使再次對於最敏感動物(包括新生豬)亦如此。當然，就保護豬群防止PEDV傳染及持久性低含量PEDV發生的觀點而言，大母豬持續接種疫苗的方案非常重要。應瞭解，經PEDV MLV免疫的大母豬或小母豬被動地轉移免疫力至豬崽，包括PEDV特異性IgA，從而保護豬崽防止PEDV相關疾病及死亡。另外， 一般而言，對於經PEDV MLV免疫之豬，其糞便中的排出PEDV之量及/或持續時間減少，或其受到保護而防止排出PEDV，且另外，經PEDV MLV免疫之豬受到保護而防止體重減輕及因PEDV所致之不能增加加權，且此外，PEDV MLV將有助於終止或控制PEDV傳播週期。
亦應注意，接種本發明疫苗之動物對於人類消費而言亦為直接安全的，而無任何顯著的屠宰不許可，諸如21天或小於21天。
以治療劑提供時，在偵測到實際感染徵象後，提供有效量的疫苗。適用於治療現有感染之劑量包括每次劑量約10與約106 log10 TCID50 或高於106 log10 TCID50 之間的病毒(疫苗釋放的最小免疫劑量)。若組成物投予可為接受者所耐受，則該組成物稱為「醫藥學上可接受的」。若投予量為生理學上顯著的，則稱此組成物以「治療或預防有效量」投予。
至少一種本發明疫苗或免疫組成物可藉由達成預定目的之任何方式，使用如本文中所述之醫藥組成物投予。舉例而言，此組成物之投予路徑可為非經腸、經口、口鼻、鼻內、氣管內、局部、皮下、肌肉內、經皮、皮內、腹膜內、眼內及靜脈內投予。在本發明之一個具體實例中，組成物藉由肌肉內投予。非經腸投予可為快速注射或隨時間逐漸灌注。可使用任何適合裝置來投予組成物，包括注射器、滴管、無針注射裝置、貼片及其類似物。選用的路徑及裝置將視佐劑之組成、抗原及個體而定，且此已為熟習此項技術者所熟知。較佳為經口或者皮下投予。經口投藥可為直接的、經由水或經由飼料(固體或液體飼料)。以液體形式提供時，疫苗可經凍乾及復原，或以糊狀物提供，以便直接添加至飼料中(拌種機內或頂部混合)或以其他方式添加至水或液體飼料中。
產生適用於大規模製造病毒的Vero細胞
本發明之病毒宜在經核準用於製造疫苗的Vero細胞儲備液中生長。為了產生安全及經核準的細胞儲備液，對一瓶Vero細胞另外進行繼代。使細胞在PMEM w/小麥中繼代四次以產生主細胞儲備液(Master Cell Stock；MCS)，批次「1834430」。根據PGM-生物學品質控制；Lincoln,NE中的9CFR及EP要求來測試MCS。MCS的無菌性、不含黴漿菌及外來媒介物經測試為令人滿意的。因此，PF-Vero MCS批次「1834430」視為適於提交至獸醫學生物製劑實驗室中心(Center for Biologics Laboratories；CVB-L)進行證實性測試。
接種來源及繼代史如下。預先冷凍總體Vero細胞之前主細胞儲備液。為了產生細胞儲備液，使細胞在含有1%牛血清(物品#00-0710-00，BSE順應性)及3mM L-麩醯胺酸的PMEM(Lincoln物品#00-0779-00)中生長。其來源於Vero WCS繼代#136，批次#071700 MCS+3，2000年7月28日。新的前主細胞儲備液在繼代#166時冷凍，其為來自原始總體Vero主細胞儲備液的MCS+33。MCS「1833440」是由前主細胞儲備液(標識為Vero KZO前主細胞儲備液，批次)產生。所有培養物在PMEM w/小麥、1.0% L-麩醯胺酸及1.0%小牛血清中生長。2008年8月14日，在150cm2 T形瓶中接種細胞(繼代#167)。燒瓶在5.0% CO2中、在36 1 C培育7天，接著擴增。(繼代#168)4天後，在燒瓶達到100%匯合之後，使培養物在850cm2滾瓶中繼代(#169)。滾瓶以0.125-0.250rpm、在36 1 C且無CO2的情況下培育。4天後進行滾瓶之最後繼代(#170)。2008年9月2日，藉由將10.0%小牛血清及10.0%二甲亞碸(DMSO)添加至濃縮的細胞懸浮液 中來完成低溫保存。小瓶用繼代層次#170標記。將總共231個含有4.2ml的容器置放於速率可控的冷凍機中，接著轉移至液氮槽中用於長期氣相儲存。MCS在不使用抗生素的情況下製得。製備MCS所用的所有試劑來源於Pfizer Global Manufacturing，其用於國內及全球市場中特許之抗原製備。MCS是由Pfizer的Master Seed Facility,Lincoln,Nebraska製備。
無菌性測試如下。根據9CFR(026-ST0)及EP 2.6.1測試2008年9月29日至2008年10月13日的主細胞儲備液。發現MCS不含細菌及真菌污染。
黴漿菌測試及外來物測試如下完成。根據9CFR(028-PU0)及EP 2.6.7測試MCS。發現MCS不含任何黴漿菌污染。使用NL-BT-2(牛科動物)、Vero、NL-ED-5(馬科動物)、NL-ST-1(豬科動物)、NL-DK(犬科動物)、NL-FK(貓科動物)細胞，根據9CFR 113.52完成外來物測試。MCS對於MGG、CPE及HAd呈陰性且根據FA測試，對於BVD、BRSV、BPV、BAV-1、BAV-5、狂犬病、Reo、BTV、ERV、馬科動物動脈炎、PPV、TGE、PAV、HEV、CD、CPV、FPL及FIP呈陰性。藉由ELISA測試MCS針對FIV且發現令人滿意。
根據5.2.4(52-2002)測試EP外來物。使用牛科動物NL-BT-2及EBK(主要)、Vero、NL-ED-5(馬科動物)、NL-ST-1(豬科動物)、MARC MA 104、NL-DK(犬科動物)、NL-FK(貓科動物)細胞進行的外部測試對於MGG、CPE、HAd呈陰性且藉由FA測試，對於BVD、BPV、BAV-1、BAV-5、牛科動物冠狀病毒、牛科動物輪狀病毒、BHV-3、PI3、IBR、BRSV及BEV-1、Reo、BTV、ERV、馬科動物動脈炎、PPV、PRV、TGE、HEV、PAV、P.rota A1、rota A2、PRRSV、CD、CPI、CAV-2、麻疹、C.rota、狂犬病、CCV、FP、FCV、FVR、FIP及FeLV呈陰性。
本發明之多肽及聚核苷酸
本發明之代表性具體實例包括經分離之聚核苷酸序列，其包含選自由以下組成之群的聚核苷酸：(a)(SEQ ID NO：1、2、3、8、15、35、36、37、39及/或59-77)；或其片段，其編碼ORF1a/1b多蛋白、PEDV刺突蛋白(較佳為域1)、ORF3蛋白、被膜蛋白、膜蛋白、核衣殼蛋白或該等蛋白質之片段；(b)(a)中之任何序列的補體；(c)在嚴格條件下與(a)或(b)之序列雜交的聚核苷酸，該等嚴格條件定義為在65℃、在0.5M NaHPO4 、7% SDS、1mM EDTA中雜交以過濾所結合的DNA且在68℃、在0.1×SSC/0.1% SDS中洗滌；(d)與(a)或(b)之聚核苷酸至少70%一致的聚核苷酸；(e)與(a)或(b)之聚核苷酸至少80%一致的聚核苷酸；(f)與(a)或(b)之聚核苷酸至少90%一致的聚核苷酸；及(g)與(a)或(b)之聚核苷酸至少95%一致的聚核苷酸。在一個較佳具體實例中，聚核苷酸包括第二異源聚核苷酸序列。
本發明亦提供由SEQ ID NO：1、2、3、8、15、35、36、37、39、59-77之基因型之任一個開放閱讀框架編碼的多肽或與其或其片段至少90%一致的多肽，包括其他原本一致胺基酸經保守性取代置換的選項。
本發明亦提供由本發明之變異型PEDV品系之任一個開放閱讀框架編碼的多肽，較佳為刺突蛋白或更佳為刺突蛋白S1域，或與其或其片段至少90%一致的多肽，包括其他原本一致胺基酸經保守性取代置換的選項。
在一個較佳具體實例中，多肽是自本發明之變異型PEDV品系之刺突蛋白之S1區域的開頭1170個核苷酸表現。
在另一較佳具體實例中，另外提供基於PEDV多肽的疫苗，其中抗原定義為：由SEQ ID NO：1、2、3、8、15、35、36、37、39、59-77之開放閱讀框架編碼的蛋白質或其免疫原性片段。其他具體實例包括其中抗原由SEQ ID NO：23-34、40-58之核苷酸編碼的胺基酸序列。
其他基因操縱
本發明提供的聚核苷酸及胺基酸序列資訊亦允許對病毒基因之結構及功能以及其所編碼的基因產物進行系統性分析。瞭解編碼本發明之病毒基因產物的聚核苷酸亦可獲得識別編碼本發明之多肽或其片段之聚核苷酸且與其雜交的反義聚核苷酸。就此而言，全長反義聚核苷酸及反義聚核苷酸片段為適用的。一般技術者將瞭解，本發明之反義分子片段包括(i)特異性地識別特定RNA(如根據編碼本發明之病毒多肽之DNA的序列比較所確定)且與該特定RNA雜交的彼等物以及(ii)識別所編碼蛋白質之RNA編碼變異體且與該等變異體雜交的彼等物。與編碼其他PEDV肽之RNA/DNA雜交的反義聚核苷酸亦可經由可鑑別特徵的序列比較或分子家族之標誌序列、PEDV多肽中之抗原域在研究中的其他用途來鑑別，且亦可用於區分環病毒科之弱相關非PEDV成員對宿主動物的感染。
熟習此項技術者大體已知用於增強本發明之構築體在酵母及大腸桿菌中之表現之有效密碼子最佳化規則。
抗體
本發明亦涵蓋抗PEDV抗體(例如單株及多株抗體、單鏈抗 體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、豬科動物抗體及CDR移植抗體，包括包含特異性識別本發明之PEDV多肽之CDR序列的化合物)。術語「特異性針對」表示本發明抗體之可變區排他性地識別且結合PEDV多肽(亦即能夠區分單一PEDV多肽與相關多肽，儘管發現多肽家族中存在序列一致性、同源性或相似性)，且(視情況)允許與其他蛋白質(例如金黃色葡萄球菌(S.aureus)蛋白質A或ELISA技術中的其他抗體)發生相互作用，此經由與抗體可變區外部之序列且尤其與Ab分子恆定區中之序列的相互作用發生。測定本發明抗體之結合特異性的篩選分析在此項技術中已熟知且已常規地實施。關於此類分析的全面論述，參見Harlow等人(編),Antibodies A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)，第6章。亦涵蓋識別且結合本發明之PEDV多肽之片段的抗體，其限制條件為該等抗體首先且最主要特異性針對該片段所來源之如上文所定義之本發明PEDV多肽。
為了清楚起見，「抗體(antibody)」係指一種免疫球蛋白分子，其由於針對特定抗原的免疫反應而可結合至該抗原。免疫球蛋白為由具有「恆定」區及「可變」區之多肽「輕鏈」及「重鏈」組成的血清蛋白質且基於恆定區之組成而分類(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。抗體可以多種形式存在，包括例如Fv、Fab'、F(ab')2 以及單鏈，且包括含有一或多個抗體單鏈多肽序列之全部或一部分的合成多肽。
診斷套組
本發明亦提供診斷套組。該套組對於區分經野外PEDV病毒品系天然感染之豬科動物與經任一種本文所述PEDV疫苗接種之豬科動物 而言可為有價值的。套組具有價值的原因亦可在於，潛在地經野外PEDV病毒品系感染之動物可在臨床症狀存在之前偵測到且自畜群中移除，或與初始動物或已接種疫苗動物保持隔離。套組包括用於分析豬科動物樣品中之針對特定PEDV病毒之特定組分之抗體存在的試劑。本發明的診斷套組可包括來自本發明之變異型PEDV品系之肽作為組分A，該或該等肽存在於野外品系中，而非存在於所關注的疫苗中，或反之亦然，且此類適合肽域的選擇可藉由廣泛胺基酸測序來達成。如此項技術中所知，本發明套組可替代性地包括經由融合蛋白提供之肽作為組分A。用於本發明之目的之術語「融合肽」或「融合蛋白」意謂由PEDV病毒蛋白質之至少一部分(較佳為ORF1或ORF3)及異源肽或蛋白質組成的單一多肽鏈。
以下實施例意欲說明上述本發明且不應理解為縮窄其範疇。熟習此項技術者容易認識到，實施例表明本發明可以許多其他方式實施。應瞭解可進行諸多變更及潤飾，而此等變更及潤飾仍屬於本發明之範疇內。
本文所揭示之所有發明均在本發明人之相應受讓人Iowa State University與Zoetis Services有限責任公司之間簽訂之聯合研究協定(Joint Research Agreement)(如35 USC 100(h),37 CFR 1.9(e)所定義)下進行，且本發明因此符合根據37 CFR 1.104(c)(4)(5)之審查保護。
實施例
實施例1
為了有助於確定美國豬中之PEDV之基因相關性及分子流行病學，進行PEDV S1(刺突蛋白基因之開頭2.2kb部分)測序。2014年1 月，在ISU VDL，對15個PEDV個案進行測序。其中，得自10個個案(ISU個案6-15)的PEDV S1序列彼此類似且與2013年在美國豬中所鑑別的PEDV品系類似(99.1-100%核苷酸一致)。相比之下，得自其餘5個個案(ISU個案1-5)之PEDV S1序列與先前在2013年在美國豬中所鑑別之PEDV品系僅具有93.9-94.6%核苷酸一致性。
然而，基於S1序列，此等5個PEDV個案彼此間具有99.6-100%核苷酸一致性。基於S1序列的譜系學分析證明，前述10個PEDV個案(ISU個案6-15)與2013年4月在美國所鑑別之PEDV品系聚為同類。然而，所聚類的前述5個PEDV個案(ISU個案1-5)與先前在美國豬中所鑑別的PEDV品系極不相同(圖1)。序列比對顯示，此等5個PEDV個案之S1序列相較於先前在美國所鑑別之PEDV病毒而言具有一些缺失及插入。
已測定此新病毒分離株之S1基因且在本文中以SEQ ID NO：1報導。基於當前可獲得的資料，此品系似乎不太可能為先前在美國豬中所鑑別之PEDV演變而成的突變體。在ISU VDL提供的PEDV即時RT-PCR是靶向核衣殼(N)基因。N基因已知為PEDV基因組的保守部分。迄今，在ISU VDL執行的PEDV N基因即時RT-PCR似乎容易偵測到此等新PEDV。已測定新PEDV之全長N基因序列且類似於先前在美國所鑑別的PEDV。
圖2顯示基於S1部分序列及全基因組序列的譜系樹。參見附件。可見，除美國豬之外，亦已在南韓、加拿大及墨西哥偵測到美國原型樣品系；已在南韓、墨西哥及德國偵測到美國變異型INDEL樣品系。
實施例2
在美國已鑑別至少兩種在基因學上不同的豬流行性下痢病毒(PEDV)品系：美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系。此研究之目標為比較美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系在處於實驗性感染下之新生豬崽中的病原性差異。將五十隻PEDV陰性5日齡豬分成5組，每組10隻豬且口胃分別接種三種美國PEDV原型分離株(IN19338/2013 P7、NC35140/2013-P7及NC49469/2013-P7)、S-INDEL-變異型分離株(2014020697-P7)及病毒陰性培養基，病毒效價為104 TCID50/ml，每隻豬10ml。此研究中所測試的所有三種PEDV原型分離株(不論其譜系學分枝系)具有類似病原性且在5日齡豬中引起嚴重腸疾病，如臨床徵象、糞便病毒排出以及肉眼病變及組織病理學病變所證明。相較於接種三種美國PEDV原型分離株的豬，接種S-INDEL-變異型分離株之豬的臨床徵象、糞便病毒排出、小腸、盲腸及結腸中之肉眼病變、小腸中之組織病理學病變及迴腸中之免疫組織化學染色顯著減少。美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系誘導所接種豬中出現類似的病毒血症程度。PEDV原型及S-INDEL-變異型品系之全基因組序列已測定，但此等PEDV品系之間之毒力差異的分子基礎仍使用逆遺傳學方法闡明。
結果
美國PEDV之分離及序列比較
在Vero細胞中分離出三種美國PEDV原型分離株USA/NC35140/2013、USA/IA49379/2013及USA/NC49469/2013。觀測到典型的PEDV細胞病變效應(包括融合體形成及細胞拆分)且藉由免疫螢光染 色來證實病毒生長。所有分離株在Vero細胞中有效生長且前十個繼代的感染性效價在103-106 TCID50/ml範圍內。
測定三種美國PEDV原型分離株USA/NC35140/2013-P7、USA/IA49379/2013-P7及USA/NC49469/2013-P7的全基因組序列且與上述美國PEDV原型分離株USA/IN19338/2013及美國PEDV S-INDEL-變異型分離株USA/IL20697/2014之全基因組序列進行比較，結果彙總於表3中。PEDV基因組組織示意圖及病毒蛋白質之推定功能描述於圖12中。原型分離株USA/IN19338/2013-P7、USA/NC35140/2013-P7、USA/IA49379/2013-P7及USA/NC49469/2013-P7皆具有28,038個核苷酸長度之基因組且在全基因組層次上彼此間具有99.75-99.91%核苷酸(nt)一致性(26-69nt差異)。此等原型分離株之刺突蛋白基因皆具有4,161個核苷酸長度且彼此間具有99.54-99.88%nt一致性(5-19nt差異)。S-INDEL-變異型分離株2014020697-P7具有28,029個核苷酸長度之基因組且在全基因組層次上與此研究中所評價之四種原型分離株具有99.08-99.22% nt一致性(220-259nt差異)。其中，約64-96nt差異位於ORF1a/1b區域中，尤其nsp12及nsp16區域；然而，在胺基酸層次上，位於nsp12及nsp16之大部分此等nt變化為同義(靜默)變化(表3)。美國PEDV原型與S-INDEL-變異型分離株之間的驚人差異位於刺突蛋白基因(96.25-96.37% nt一致性；151-156nt差異)，尤其位於S1部分(93.14-93.32% nt一致性；148-152nt差異)；S1部分的核苷酸變化導致所推定胺基酸之變化(表3)。相較於原型分離株，變異型分離株2014020697-P7的S基因具有三個特徵性缺失(位置167之G之1nt缺失、位置176-186之AGGGTGTCAAT之11nt缺失，及位置416-418之ATA之3nt缺失)及一個 插入(位置474與475之間之CAGGAT的6nt插入)。
此研究中所述之PEDV分離株的譜系學分析及45種PEDV參考序列提供於圖6中。在基於全基因組序列之鄰近歸併樹圖6A中，美國PEDV原型樣品系聚為同類，其可進一步分成分枝系1及分枝系2；然而，美國PEDV S-INDEL-變異型樣品系分別聚類。在基於全基因組序列之最大似然樹圖6B中，美國PEDV原型樣品系亦聚類成分枝系1及分枝系2；然而，S-INDEL-變異型樣品系在分枝系2內形成各別亞譜系。相比之下，基於S1序列之鄰近歸併樹圖6C與最大似然樹圖6D中的譜系學叢集類似。在圖6C與圖6D中，美國PEDV原型樣品系聚為同類，其可進一步分成分枝系1及分枝系2，此類似於基於全基因組序列之鄰近歸併樹圖6A；美國PEDV S-INDEL-變異型樣品系形成與一些經典PEDV分離株(諸如歐洲/CV777、南韓/SM98及中國/SD-M)之關係更密切的各別分枝，其S基因與美國PEDV S-INDEL-變異型樣品系具有相同的插入及缺失型態。
原型分離株IN19338及IA49379屬於分枝系1且分離株NC35140屬於分枝系2，不論基於全基因組之樹圖6A、6B或基於S1之樹圖6C、6D。然而，原型分離株NC49469在基於全基因組之樹圖6A、6B中屬於分枝系1，但在基於S1之樹圖6C、6D中屬於分枝系2。選擇三種原型分離株USA/IN19338/2013-P7(SEQ ID NO：59)、USA/NC35140/2013-P7(SEQ ID NO：60)及USA/NC49469/2013-P7(SEQ ID NO：61)及一種S-INDEL-變異型分離株2014020697-P7(SEQ ID NO：62)，以比較其在豬中的致病機制(表4)。
臨床評估
G1(USA/IN19338/2013-P7)、G2(USA/NC35140/2013-P7)及G3(USA/NC49469/2013-P7)中的所有豬自1DPI開始出現軟下痢至水樣下痢且持續至6或7DPI。相比之下，在G4(IL20697)中，僅1隻豬在1DPI崽有輕度下痢伴軟糞便。平均下痢分數概述於圖7A中。總體而言，如下文‘材料及方法’章節中所述，當分析0-7DPI下痢分數時，G1(P=0.001)及G3(P<0.0001)中之豬的平均下痢分數顯著高於G2中的豬。接種原型PEDV分離株之G1-G3中之豬的平均下痢分數總體上顯著高於接種PEDV變異型分離株之G4(P<0.0001)及G5(陰性對照組，P<0.0001)。G4與G5之間平均下痢分數差異不顯著(P=1)。
在整個研究期間，未觀測到任何豬出現嘔吐。在接種原型分 離株的G1-G3中：1)幾乎所有豬在研究期期間失去食慾且須投予管餵食；2)觀測到所有豬出現嚴重脫水、毛髮蓬亂、側腹扁平或較瘦，約4DPI時出現最嚴重的身體病狀；3)自1DPI至研究結束，觀測到不同程度的嗜睡，包括耷拉著頭及伏臥。相比之下，在接種變異型分離株的G4中：1)所有豬均具有正常食慾；2)未觀測到脫水或嗜睡；3)90%豬在1DPI或2DPI具有輕度扁平側腹，但在4DPI之後恢復正常。在研究期期間，所有G5豬均為活躍的，無下痢、脫水、嗜睡或厭食。
自(-1)至3DPI，接種PEDV之豬(G1-G4)的平均日增重(ADG，P0.0001)顯著低於G5(陰性對照組)中之豬，但G1-G4之間的ADG則無顯著差異(P值範圍為0.089-1)(圖7B)。自(-1)至7DPI，G1-G3(原型分離株)的ADG顯著低於G4(變異型分離株)(P值範圍為0.01-0.037)，但G1、G2、G3或G4中無一者與G5(陰性對照組)之ADG存在顯著差異(P值範圍為0.078-0.847)(圖7B)。
病毒排出及分佈
在1DPI直至研究結束，偵測到G1-G3(原型分離株)中之所有豬的直腸拭子樣品中均出現PEDV RNA。在G4(變異型分離株)中，在1、2、3、4、5、6及7DPI，分別在5/10、8/10、10/10、5/5、5/5、3/5及2/5豬的直腸拭子中偵測到PEDV RNA。直腸拭子中之病毒排出之平均基因組複本數/毫升概述於圖7C中。G1及G2中之豬自1-7DPI之糞便病毒排出含量類似(P=0.601)，該量範圍為107.2-9.0個基因組複本/毫升，對應於Ct值16-22。G3中之豬在1-2DPI的糞便病毒排出含量最高(約109個基因組複本/毫升，Ct 16)且糞便病毒排出在7DPI逐漸下降至約105.4個基因組複 本/毫升，對應於Ct值28。相比之下，G4中之豬在1DPI具有約102.3個基因組複本/毫升(Ct 31.8)糞便病毒排出；糞便病毒排出逐漸增加且在5DPI達至峰值(105.4個基因組複本/毫升，Ct 28.8)，接著在7DPI下降至約101.3個基因組複本/毫升(Ct 36.3)。
統計學分析表明，G1-G3(原型分離株)之直腸拭子中之病毒RNA排出量顯著大於G4(變異型分離株)(P<0.0001)。
在3DPI屍體剖檢之G1-G4所有豬的血清樣品中偵測到PEDV RNA，平均Ct值為33.2(G1)、30.5(G2)、31.9(G3)及28.4(G4)。G1-G4血清中之平均PEDV基因組複本數在3DPI不存在顯著差異[P值範圍為0.077-0.646，圖7D]。在7DPI，G1-G4中之5分之3至4豬之血清樣品中偵測到PEDV RNA，平均Ct值(僅針對PCR陽性豬)為33.5(G1)、34.2(G2)、37.4(G3)及35.8(G4)。在7DPI，G4血清中之PEDV(變異型分離株)的平均基因組複本數與G1-G3(原型分離株)中的平均基因組複本數無顯著差異(P值範圍為0.050-0.717)，圖7D。
組織中之病毒分佈概述於表5中。在3DPI，不論G1、G2、G3或G4，迴腸、盲腸、結腸及腸系膜淋巴結中的平均PEDV RNA濃度高於相同接種組內之其他組織中的濃度。比較四個接種組在3DPI之各類型組織中的病毒RNA濃度時，G4(變異型分離株)之盲腸及結腸中的病毒RNA濃度在總體上顯著低於G1-G3(原型分離株)之盲腸及結腸中的病毒RNA濃度；然而，G4之其他組織中的病毒RNA濃度類似於G1-G3之相應組織中的病毒RNA濃度；G1-G3中之相同組織類型具有類似的病毒RNA含量。7DPI之資料總體上支持類似於3DPI的結論，但盲腸及結腸中之病毒基因 組複本數比G4中之迴腸及腸系膜淋巴結中之基因組複本數低得多。
在整個研究期期間，根據PEDV即時RT-PCR，得自G5(陰性對照組)的所有直腸拭子、血清及組織樣品呈陰性。
縮寫：DPI，接種後天數；MLN，腸系膜淋巴結；PCR，聚合酶鏈反應；Ct，週期臨限值。* 後腿肌肉。+ 平均Ct為PCR陽性豬(PCR Ct<45之豬)之平均Ct值。基因組複本數/毫升為所有豬之基因組複本數/毫升之幾何平均值(PCR陽性豬與PCR陰性豬)。針對G1-G4組的相同組織類型進行統計學分析且不同字母表示顯著差異。
肉眼病理學
在3DPI，觀測到接種PEDV原型分離株之大部分豬(G1-G3)的小腸、盲腸及結腸組織中出現透明薄壁，有時被氣體及/或淡黃色體液脹大。另外，G1-G3中之幾乎所有豬的小腸、盲腸及結腸中均含有水樣內容物。相比之下，可觀測到接種PEDV變異型分離株之3/5豬(G4)之小腸出現僅輕度的薄壁；G4豬之盲腸或結腸中未觀測到明顯的肉眼病變。又，在G4中，僅1/5豬的小腸、盲腸及結腸中具有水樣內容物；兩隻其他豬的盲腸中具有半水樣內容物。根據統計資料，所有G1-G3(原型分離株)之小腸、盲腸及結腸內容物分數顯著高於G4(變異型分離株)及G5(陰性對照組)(P值範圍為<0.0001至0.0127)，圖8A。未觀測到G1-G3之小腸、盲腸及結腸內容物分數有顯著差異(P值範圍為0.3722-1)，圖8A。對於G4而言，僅盲腸內容物分數顯著高於G5(P=0.003)，而小腸或結腸內容物分數則不然[P值範圍為0.5259-1；圖8A]。所有原型分離株接種組(G1-G3)之小腸、盲腸及結腸的組織病變分數顯著高於變異型分離株接種組(G4)及陰性對照組(G5)(P值範圍為0.0012-0.049)，圖8B。在G1-G3之間(P值範圍為0.1585-1)，或在G4與G5之間[P值範圍為0.4766-1；圖8B]，未觀測到小腸、盲腸及結腸病變分數有顯著差異。
在7DPI，G1-G3中的大部分豬仍具有薄壁及/或氣體脹大的小腸，但G1-G3中之豬僅約50%具有薄壁及/或氣體脹大的盲腸及結腸。G1及G2中之所有豬及G3中之4/5豬的小腸具有水樣內容物。G1-G3中之約 60-100%豬在盲腸及結腸中具有半水樣或水樣內容物。在G4中，僅1/5豬的小腸壁較薄且沒有一隻豬的盲腸及結腸具有肉眼病變。在G4中，5/5、1/5及0/5豬分別在小腸、及結腸中具有半水樣或水樣內容物。在G5中，1/5豬的小腸、盲腸及結腸具有薄壁；3/5豬的小腸、盲腸及結腸中具有半水樣或水樣內容物。在一些群組之間觀測到組織內容物分數及組織病變分數有在(圖8)。
在3DPI及7DPI收集的直腸拭子經證實對PDCoV、TGEV及豬科動物輪狀病毒呈陰性(群組A、B及C)且對溶血性大腸桿菌及沙門氏菌屬(Salmonella spp.)呈陰性。
組織病理學
在3DPI或7DPI，未觀測到所有豬崽(G1-G5)之胃、盲腸、結腸、扁桃體、腸系膜淋巴結、心臟、肺、肝臟、脾臟及腎臟切片中出現顯著的顯微鏡下病變。
在3DPI及7DPI屍體剖檢之G1-G3(原型分離株)所有豬之小腸切片(十二指腸、空腸及迴腸)中均觀測到與病毒腸炎一致的嚴重病變(例如纖毛狀腸上皮細胞腫大、纖毛狀萎縮、固有層塌陷等)。在3DPI屍體剖檢之G4(變異型分離株)豬之小腸切片中觀測到與病毒腸炎一致的輕度顯微鏡下病變；然而，在7DPI屍體剖檢之G4豬之小腸切片中未出現顯著的顯微鏡下病變。在3DPI或7DPI，G5(陰性對照組)豬之小腸切片中未出現明顯的顯微鏡下病變。在3DPI屍體剖檢之G1-G5豬之經H&E染色迴腸切片的代表性影像顯示於圖9A-圖9E中。
量測且比較5個接種組之小腸切片上的纖毛高度、腺管深度 及纖毛高度與腺管深度比率。在3DPI，與G4(變異型分離株)及G5(陰性對照組)中之豬相比，G1-G3(原型分離株)中之豬的十二指腸、近端空腸、中部空腸、遠端空腸及迴腸具有顯著降低的平均纖毛高度、增加之平均腺管深度以及較低的平均纖毛/腺管比率，其中有一些例外(圖10)；例外包括G2及G4之十二指腸的纖毛高度及纖毛/腺管比率以及G1及G4之中部空腸中的腺管深度。在3DPI，接種原型分離株之三個群組G1-G3之小腸切片之平均纖毛高度、腺管深度及纖毛/腺管比率在總體上類似(圖10)。在3DPI，所有小腸切片之平均腺管深度在G4(變異型分離株)與G5(陰性對照組)之間無顯著差異；然而，相較於G5中之豬，G4中之豬之十二指腸、中部及遠端空腸及迴腸的平均纖毛高度在3DPI顯著降低且平均纖毛/腺管比率較低(圖10)。
在7DPI，三個群組G1-G3之小腸切片的平均纖毛高度及纖毛/腺管比率在總體上類似，圖11A-11D。在7DPI，與G4及G5中之豬相比，G1-G3中之豬之小腸切片在總體上具有顯著降低的平均纖毛高度及較低的平均纖毛/腺管比率(圖11A、圖11C)。有趣的是，在7DPI之平均纖毛高度在G4(變異型分離株)與G5(陰性對照組)之間無顯著差異，或G4顯著高於G5(圖11A)。近端、中部及遠端空腸以及迴腸在7DPI之平均纖毛/腺管比率在G4與G5之間無顯著差異，但十二指腸中之平均纖毛/腺管比率在G4與G5之間具有顯著差異(圖10C)。在7DPI之平均腺管深度之比較呈現於圖11B中。所有小腸切片中的平均腺管深度在原型分離株接種組G2與G3之間均類似；G2與G3均具有比陰性對照組G5顯著更長的腺管深度。另一個原型分離株接種組G1的平均腺管深度值介於陰性對照組G5與原型 分離株接種組G2及G3之間。變異型分離株接種組G4之十二指腸、近端及遠端空腸相較於陰性對照組G5而言具有顯著增加的平均腺管深度，而G4之大部分小腸切片具有與G1、G2及G3類似的平均腺管深度。
免疫組織化學(IHC)
在3DPI，對所有5個接種組之迴腸、盲腸及結腸之系列切片進行PEDV特異性IHC染色。G5(陰性對照組)中之5隻豬的迴腸、盲腸或結腸均不呈IHC陽性。G1-G4每一組中之所有5隻豬的迴腸均呈IHC陽性，平均IHC分數為3.9(G1)、3.7(G2)、3.8(G3)及2.5(G4)。G1-G3之迴腸的平均IHC分數類似，但顯著高於G4(圖10D)。就盲腸之IHC染色而言，5/5(G1)、4/5(G2)、5/5(G3)及3/5(G4)豬呈陽性，G1-G4之平均IHC分數無顯著差異(圖10D)。就結腸而言，5/5(G1)、4/5(G2)、4/5(G3)及2/5(G4)豬的IHC染色呈陽性，但G1-G4之平均IHC分數無顯著差異(圖10D)。代表性PEDV IHC染色影像顯示於圖9F-圖9T中。
在7DPI，針對迴腸之系列切片僅進行PEDV IHC染色。觀測到G1及G2中出現輕度/不足的IHC染色，但未觀測到G3、G4及G5中出現染色(圖11D)。
論述
序列分析表明，至少兩種在基因學上不同的PEDV品系已在美國流行(Vlasova等人，2014；Wang等人，2014)，且其稱為美國PEDV原型品系及美國PEDV S-INDEL-變異型品系。美國原型PEDV可在譜系學上進一步分成分枝系1及分枝系2。在基於全基因組序列之譜系學分析中，美國S-INDEL-變異型樣PEDV在鄰近歸併樹中分別聚類為分枝系1及分枝系2， 但其在最大似然樹中、在分枝系2內形成各別亞譜系(圖6A、圖6B)。此表明，譜系學分析工具及樹構築方法可使得分析結果產生一些差異；因此，應謹慎地藉由清晰指出譜系學分析所用的工具及方法來得出結論。在美國原型PEDV中，一些始終屬於分枝系1或分枝系2，不論基於全基因組之樹或基於S1之樹；然而，一些(例如NC49469及Minnesota62)在基於全基因組之樹中屬於分枝系1，但在基於S1之樹中屬於分枝系2(圖6)。此原因可能為NC49469及Minnesota62 PEDV之S1序列與分枝系2更密切相關，但剩餘基因組序列與分枝系1 PEDV更密切相關。本發明人研究組已在細胞培養物中分離出屬於上述各類別的各種PEDV，其使得本發明人能夠比較各種美國原型及S-INDEL-變異型PEDV之致病機制。
研究已表明，新生豬崽比斷奶豬更易發生PEDV感染且PEDV感染誘導新生豬產生的疾病嚴重程度大於斷奶豬(Jung等人，2015a；Thomas等人，2015)。因此，選擇敏感的5日齡新生豬崽模型用於此研究中的致病機制比較。在三種美國PEDV原型分離株(USA/IN19338/2013、USA/NC35140/2013及USA/NC49469/2013)中，USA/NC35140/2013-P7分離株誘導的平均下痢分數低於USA/IN19338/2013-P7及USA/NC49469/2013-P7分離株誘導的平均下痢分數；然而，三種原型分離株具有類似的病毒排出、肉眼病變、組織病理學病變及IHC染色。總體而言，本發明人得出結論：此研究中所評價的三種美國PEDV原型分離株在新生豬崽中具有類似的病原性，不論其譜系學分枝系。相比之下，本發明研究中的資料清晰表明，相較於三種美國PEDV原型分離株USA/IN19338/2013-P7、USA/NC35140/2013-P7及USA/NC49469/2013-P7，美國PEDV S-INDEL-變異 型分離株2014020697-P7使得小腸、盲腸及結腸之臨床徵象、糞便病毒排出、肉眼病變、小腸之組織病理學病變及迴腸之IHC分數顯著減少。其他組的近期實驗性研究亦表明，3-4日齡豬或1週齡豬之S-INDEL PEDV的病原性在總體上低於美國原型品系(Lin等人，2015a；Yamamoto等人，2015)。然而，在Lin等人的研究中，其觀測到接種美國S-INDEL Iowa106品系的三隻幼仔豬崽具有零死亡率，但接種相同病毒品系的一隻幼仔豬崽具有75%死亡率(Lin等人，2015a)。其假設大母豬健康狀況可直接影響初乳/乳汁產生且因此影響其豬崽之感染結果(Lin等人，2015a)。野外所觀測之S-INDEL PEDV毒力因農場及國家而異。在美國，S-INDEL變異型品系OH851感染僅引起農場上之乳仔豬崽產生最少或無臨床徵象(Wang等人，2014)。在德國，用在全基因組層次與美國S-INDEL變異型OH851具有99.4%核苷酸一致性的S-INDEL PEDV感染兩個大母豬農場；然而，乳仔豬崽的臨床徵象嚴重程度及死亡率在兩個農場之間具有顯著差異(Stadler等人，2015)。導致矛盾研究結果的因素尚未得到明確地鑑別。但病毒(野生型或細胞培養適應性病毒)之來源、接種/感染劑量、動物/環境條件及S-INDEL PEDV之核苷酸/胺基酸變異體可引起各種實驗性研究及野外爆發之觀測差異。另外，PEDV病原性可具有年齡依賴性。確保進一步研究S-INDEL PEDV變異體在斷奶豬、育成豬、小母豬及大母豬中之病原性。
研究已顯示，在美國PEDV原型分離株感染之急性階段中，可發生病毒血症(Jung等人，2014；Madson等人，2016)。在本發明研究中，亦偵測到血清樣品中出現PEDV RNA。另外，PEDV變異型分離株及三種原型分離株在此研究條件下具有類似的病毒血症程度。PEDV為感染纖毛狀腸 上皮細胞、導致纖毛萎縮及吸收不良型下痢的腸病原性冠狀病毒。一些量的PEDV可經由未完全瞭解的機制吸收至血流中。但咸信PEDV不會主動地在血液中複製且病毒血症程度可能不一定與毒力/病原性相關。在本發明研究中，在接種原型或S-INDEL-變異型PEDV的豬中，偵測到小腸、盲腸、結腸及腸系膜淋巴結中出現高含量的PEDV RNA，而在非腸組織(扁桃體、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟及肌肉)中偵測到的PEDV RNA含量較低。先前研究表明，在小腸、腸系膜淋巴結及一些結腸及脾臟組織中可偵測到PEDV病毒抗原(美國原型分離株)(Jung等人，2015b；Jung等人，2014；Madson等人，2016)，而其他非腸組織(諸如肺、心臟、腎臟及肝臟)對PEDV抗原皆呈陰性(Madson等人，2016)。因此，偵測PEDV RNA不一定意謂PEDV在所有此等非腸組織中均複製。考慮到在收集各器官之前未排出血液，因此不能排除此等組織中之病毒來自血液的可能性。
在本發明研究中，PEDV IHC染色僅針對所接種豬之迴腸、盲腸及結腸進行。在接種PEDV的四個群組中(三組為原型分離株且一組為變異型分離株)，在3DPI觀測到100%迴腸、60-100%盲腸及40-100%結腸中出現PEDV IHC染色。變異型分離株接種豬之迴腸之平均IHC分數顯著低於原型分離株接種豬，此符合小腸之病理學及組織病理學肉眼病變的觀測結果。雖然變異型分離株接種豬之盲腸及結腸的平均IHC分數在數值上低於三種原型分離株接種豬，但差異不顯著。然而，PEDV變異型分離株接種豬之盲腸及結腸之肉眼變化比原型分離株接種豬少。因此，可能需要進一步闡明盲腸及結腸變化與PEDV毒力/病原性的相關性。
所有四個接種PEDV之群組G1-G4(三組為原型分離株且一 組為變異型分離株)在3DPI的纖毛高度相較於陰性對照組G5而言顯著縮短且G1-G3(原型分離株)的纖毛高度相較於G4(變異型分離株)而言顯著縮短。由此表明美國原型分離株與變異型PEDV分離株均可感染且摧毀小腸之纖毛上皮，但美國PEDV變異型分離株引起的纖毛萎縮嚴重程度小於原型分離株。腸腺管上皮細胞用以置換毀壞的纖毛狀腸上皮細胞。在3DPI，G4(變異型分離株)之平均腺管深度與G5(陰性對照組)無顯著差異，但G1-G3(原型分離株)之平均腺管深度顯著長於G4及G5。由此可表明，在3DPI，美國PEDV變異型分離株引起的輕度纖毛萎縮尚未引發顯著的腸腺管增殖及伸長；然而，在原型分離株接種組G1-G3中，腸腺管開始進行一些程度的伸長以修復嚴重纖毛狀萎縮。在7DPI，原型分離株接種組的平均腺管深度比陰性對照組長，表明腺管持續伸長以置換損傷的纖毛腸上皮細胞，但纖毛上皮尚未恢復至正常。在7DPI，G4(變異型分離株)之一些小腸切片的平均腺管深度顯著長於G5(陰性對照組)，表明相較於原型分離株接種組G1-G3，G4中隨後發生腺管伸長。在G4中，增殖的腺管最終使所毀壞的纖毛腸上皮細胞在3DPI明顯恢復。IHC染色亦支持此等觀測結果。
研究已顯示，針對美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系的抗體可與兩種品系活體外交叉反應及活體外交叉中和兩種品系(Chen等人，2016；Lin等人，2015b)。活體內研究(Goede等人，2015)顯示，7個月前暴露於S-INDEL-變異型PEDV感染的大母豬可向經美國PEDV原型品系攻毒的新生豬崽提供部分保護作用。另一項活體內研究(Lin等人，2015a)表明，暴露於S-INDEL-變異型PEDV的3-4日齡豬崽可部分地防禦隨後美 國原型PEDV之攻毒。申請人亦有資料表明，美國PEDV原型與S-INDEL-變異型品系可在斷奶豬模型中提供針對兩種病毒品系的同源及異源保護作用。在本發明研究中，已表明在新生豬中，美國PEDV S-INDEL-變異型品系的毒力比美國PEDV原型品系小。此等資料總體表明，美國PEDV S-INDEL-變異型品系可潛在地為針對PED之經修飾之活病毒疫苗候選物，但需要其他評價工作。
美國原型PEDV與S-INDEL-變異型PEDV之間驚人的序列差異位於刺突蛋白基因中，尤其位於S1部分中。刺突蛋白基因中之序列差異可引起美國原型PEDV與S-INDEL-變異型PEDV之間的毒力差異。
材料及方法
病毒分離株及細胞
美國PEDV原型分離株USA/IN19338/2013及S-INDEL-變異型分離株USA/IL20697/2014之分離及表徵已有描述(Chen等人，2014；Chen等人，2016)。獲得三種其他美國PEDV原型分離株USA/NC35140/2013、USA/IA49379/2013及USA/NC49469/2013用於此研究，此等分離株皆來自呈遞至愛荷華州立大學獸醫學診斷實驗室(Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory；ISU VDL)之存檔豬崽糞便，以便依循上述病毒分離程序進行常規診斷(Chen等人，2014)。所有PEDV分離、繁殖及滴定均針對Vero細胞(ATCC CCL-81)進行，如所述(Chen等人，2014)。此研究中所用的所有PEDV分離株證實對豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus；PDCoV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及豬科動物輪狀病毒(群組A、B及C)、豬科動物生殖及呼吸症候群病毒，以及豬科動物環狀病毒呈陰性。
病毒測序、比較性序列分析及譜系學分析
此研究中所述之PEDV分離株的全基因組序列是藉由使用Illumina MiSeq平台且裝配SeqMan Pro 11.2.1版(DNAstar公司，Madison，WI)的下一代測序技術測定，如先前所述(Chen等人，2014)。此等PEDV分離株之序列資料用以下登錄編號存取於GenBank：USA/IN19338/2013[KF650371]、USA/NC35140/2013-P7[KM975735]、USA/IA49379/2013[KM975736]、USA/NC49469/2013-P7[KM975737]及2014020697-P7[KT860508]。
使用比較基因相似性的ClustalX 2.0版(Larkin等人，2007)及BioEdit 7.0.4.1版(Hall,1999)，對此研究中所用之所有PEDV分離株的全基因組序列及個別基因序列(核苷酸及胺基酸序列)進行比對。使用此研究中所述之PEDV分離株以及代表性全球PEDV之全基因組及S1部分(S基因核苷酸1至2205，根據序列KF650371)核苷酸序列(全部50個序列)進行譜系學分析。譜系樹分別使用基於距離之鄰近歸併法及MEGA 6版最大似然法構築(Tamura等人，2013)。針對1,000個複製資料集進行靴帶式分析。
實驗設計
動物研究方案由愛荷華州立大學實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准(批准編號6-14-7821-S；2014年7月10日核準)。自習知育種農場購買五十隻5日齡豬崽且遞送至愛荷華州立大學實驗室動物資源機構(Laboratory Animal Resources facilities)。所有豬在送達後肌肉內注入一定劑量的Excede®(Zoetis,Florham Park,New Jersey,USA)且藉由對直腸拭子進行病毒特異性PCR來證實對PEDV、PDCoV、TGEV及豬科動物輪狀病毒呈陰性(群組A、B及C)且藉由在ISU VDL對血清樣品進行病毒特異性間接螢光抗體(indirect fluorescent antibody；IFA)分析來證實對PEDV抗體呈陰性。豬根據體重圍封，接著隨機分成5組，每組10隻豬，一組一間房，實心地板。豬餵食Esbilac(Hampshire,IL)液體代乳品與乳酪之混合物且讓其自由取水。馴化1天(豬崽為6日齡)之後，群組1至5(G1-G5)中之豬分別口胃接種三種美國PEDV原型分離株USA/IN19338/2013-P7(G1)、USA/NC35140/2013-P7(G2)、USA/NC49469/2013-P7(G3)、一種美國S-INDEL-變異型分離株2014020697-P7(G4)，或病毒陰性培養基(G5)(10毫升/豬；所有病毒在細胞培養物中均處於第7次繼代，效價為104 TCID50/ml)(表4)。
每日根據嘔吐及下痢、嗜睡及身體病狀之臨床徵象之存在來評價豬崽。利用以下標準來對下痢嚴重程度評分：0=正常，1=軟(牛糞)，2=液體伴有一些固形物，3=水樣無固形物。嗜睡程度分類為正常、輕度嗜睡(行動緩慢，耷拉著頭)、中度嗜睡(站立，但想要躺下)或嚴重嗜睡(躺著，瀕死)。身體狀況分類為：正常、輕度減輕(扁平側腹)、中度(側腹捲起)或重度(骨架/肋部突出)。
記錄接種之前及接著在接種後(DPI)第3及7天的體重。計算豬自(-1)至3DPI及(-1)至7DPI的平均每日增重(average daily gain；ADG)。在0、3及7DPI收集血清樣品。自0DPI至屍體剖檢，每日收集各豬的直腸拭子且收集之後立即浸沒於1ml PBS中。在3DPI自各組隨機選擇五隻豬，且剩餘豬在7DPI進行屍體剖檢。屍體剖檢時收集的新鮮且經福 馬林固定之樣品包括：扁桃體、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、後腿骨骼肌、胃、腸系膜淋巴結、十二指腸、近端空腸、中部空腸、遠端空腸、迴腸、盲腸及結腸。如先前所述收集不同的腸節段(Madson等人，2014)。
屍體剖檢時，由對處理組不知情的獸醫學病理學家檢查盲腸及結腸中的肉眼病變。組織病變分類為正常、薄壁及/或氣體脹大。薄壁腸或氣體脹大器官之存在分別算1分；薄壁與氣體脹大均存在算2分。檢查小腸、盲腸及結腸之內容物且評分標準：0=正常，1=液體伴有一些固體(半水樣)，2=水樣。
為了排除其他病原體並行感染之可能性，藉由病毒特異性PCR測試屍體剖檢之前在3DPI及7DPI收集之直腸拭子中的PDCoV、TGEV及豬科動物輪狀病毒(群組A、B及C)且在ISU VDL根據常規細菌培養物來測試其中的溶血性大腸桿菌及沙門氏菌屬。
如藉由基於PEDV N基因之定量即時RT-PCR所檢查的病毒排出
自直腸拭子、血清及10%組織勻漿中萃取病毒RNA，如先前所述(Chen等人，2014)。PCR裝置中使用五微升各RNA模板，總反應體積為25μl，使用Path-IDTM 多工式一步RT-PCR套組(Thermo Fisher Scientific)。為了產生基於PEDV N基因之定量即時RT-PCR之標準曲線而使用的引子、探針及活體外轉錄RNA已有描述(Lowe等人，2014；Madson等人，2014；Thomas等人，2015)。基於標準曲線來計算所測試樣品中的病毒濃度(單位為基因組複本數/毫升)。基於PCR陽性樣品來計算平均週期臨限(Ct)值，且基於群組內的所有豬(PCR陽性豬與陰性豬)來計算平均病毒濃度。
組織病理學
扁桃體、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、腸系膜淋巴結、胃、十二指腸、近端空腸、中部空腸、遠端空腸、迴腸、盲腸及結腸組織於10%福馬林中固定，包埋，切片且用蘇木精及曙紅(hematoxylin and eosin；H&E)染色，且由對個別動物標識及處理組不知情的獸醫學病理學家來檢查。依循上述程序(Madson等人，2014)，使用電腦化影像系統量測十二指腸、近端空腸、中部空腸、遠端空腸及迴腸之三個代表性纖毛及腺管的纖毛長度及腺管深度。各組織的纖毛高度與腺管深度(纖毛/腺管)比率是以平均纖毛長度除以平均腺管深度之商計算。
免疫組織化學
如先前所述(Madson等人，2014)，使用PEDV特異性單株抗體(BioNote,Hwaseong-si,Gyeonggi-do,Korea)，藉由免疫組織化學(IHC)評價3DPI屍體剖檢時之迴腸、盲腸及結腸之系列切片中的PEDV抗原。在7DPI屍體剖檢時，針對迴腸之系列切片僅進行IHC染色。如先前所述(Chen等人，2015)，對IHC抗原偵測進行半定量評分，標準如下：0=無染色；1=約1-10%腸上皮細胞出現陽性染色；2=約10%-25%腸上皮細胞出現陽性染色；3=約25%-50%腸上皮細胞出現陽性染色；4=約50%-100%腸上皮細胞出現陽性染色。
統計學分析
所有統計學比較均使用普遍化線性混合(GLIMMIX)模型，使用統計學分析系統(Statistical Analysis System；SAS)9.3版(SAS研究所，Cary,NC)。p值<0.05定義為統計學顯著。評估0-7DPI之處理中之總體糞便 病毒排出量[Log10(基因組複本數/毫升)]的P值，其中DPI及處理為相互作用的變數，且在下痢分數之分析中為類似的。
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實施例3
在美國已鑑別至少兩種在基因學上不同的豬流行性下痢病毒(PEDV)品系(美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系)。在獸醫學診斷實驗室提供之用於偵測PEDV特異性抗體的本發明血清學分析係基於美 國PEDV原型品系。此研究之目標為：1)在細胞培養物中分離美國PEDV S-INDEL-變異型品系；2)藉由實驗性感染斷奶豬來產生針對美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系的抗血清；3)確定各種PEDV血清學分析是否可偵測針對美國PEDV S-INDEL-變異型品系的抗體且反之亦然。在此研究中，在細胞培養物中分離美國PEDV S-INDEL-變異型品系。三組PEDV陰性3週齡豬(每組五隻豬)經口接種美國PEDV原型分離株(先前在本發明人之實驗室中分離)、S-INDEL-變異型分離株或病毒陰性培養基。在接種後0、7、14、21及28天收集的血清樣品藉由以下PEDV血清學分析加以評價：1)使用原型及S-INDEL-變異型品系作為指標病毒的間接螢光抗體(indirect fluorescent antibody；IFA)分析；2)針對原型及S-INDEL-變異型病毒的病毒中和(virus neutralization；VN)測試；3)基於PEDV原型品系全病毒的ELISA；4)基於PEDV原型品系S1的ELISA；及5)基於PEDV S-INDEL-變異型品系S1的ELISA。針對原型品系的陽性抗血清與原型病毒及S-INDEL-變異型病毒均反應且中和原型病毒與S-INDEL-變異型病毒，針對S-INDEL-變異型品系的陽性抗血清亦與原型病毒及S-INDEL-變異型病毒均反應且中和原型病毒與S-INDEL-變異型病毒，如根據IFA抗體分析及VN測試所檢查。針對兩種PEDV品系的抗體可藉由所有三個ELISA偵測，但偵測速率發生一些程度的變化。
申請人顯示，針對美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系的抗體與兩種品系均在活體外發生交叉反應及交叉中和。基於美國PEDV原型品系之本發明血清學分析可偵測針對兩種美國PEDV品系的抗體。
豬流行性下痢病毒(PEDV)所致的豬流行性下痢(PED) 首次記錄於20世紀70年代早期的英格蘭且其後已散佈至其他歐洲及亞洲國家[1]。在北美洲，PEDV首次於2013年4月在美國(U.S.)偵測到[2]且隨後在加拿大[3]及墨西哥[4]有報導。PEDV為被膜單股正義RNA病毒，其屬於巢狀病毒目(Nidovirale )、冠狀病毒科、冠狀病毒亞科(Coronavirinae )、α冠狀病毒屬[5]。PEDV基因組長度為約28kb且包括編碼複製酶多蛋白的ORF1a及ORF1b以及編碼四種結構蛋白[刺突蛋白(S)、被膜(E)、膜(M)及核衣殼(N)]以及一種非結構蛋白NS3B(由ORF3編碼)的其他開放閱讀框架(ORF)[1]。
在美國，鑑別出在初始PED爆發期間出現的高毒力PEDV品系(美國PEDV原型品系)[2、6、7]。近來，基於野外觀測結果，在具有輕度臨床徵象的美國豬中鑑別出相較於美國原型品系而言在刺突蛋白基因中具有插入及缺失(INDEL)的PEDV變異型品系[8]。相較於美國PEDV原型品系，此美國PEDV變異型品系(亦稱為S INDEL品系[4])形成不同的譜系學叢集[4、8、9]。在細胞培養物分離PEDV期間發現N末端S蛋白質中具有197-aa缺失的一種PEDV分離株(PC177)；然而，此PEDV分離株在譜系學上仍與美國PEDV原型品系聚類且不視為S-INDEL-變異型品系之一[10]。Marthaler等人[11]報導美國豬中之‘第三’PEDV品系(Minnesota188)，其在刺突蛋白基因中具有6個核苷酸缺失(2個胺基酸缺失)(不同於美國S-INDEL-變異型品系)。然而，PEDV Minnesota188在基因學上與美國PEDV原型品系密切相關且其是否應稱為美國‘第三’PEDV品系仍存爭議。PEDV PC177及Minnesota188可能為美國PEDV原型品系之突變體。因此，美國豬中當前流行至少兩種在基因學上不同的PEDV品系： 美國PEDV原型品系及S-INDEL-變異型品系。
若干個研究組已成功地在細胞培養物中分離及繁殖美國PEDV原型品系[7、10、12、13]。為了偵測PEDV特異性抗體，已開發出多種血清學分析，包括間接螢光抗體(IFA)分析、病毒中和(VN)測試、基於全病毒之酶聯免疫吸附分析(ELISA)、基於重組S1蛋白質之ELISA，及基於重組核衣殼蛋白之ELISA[14-18]。所有此等血清學分析係基於美國PEDV原型品系。
在此研究中，申請人在細胞培養物中分離出美國PEDV S-INDEL-變異型品系。豬以實驗方式分別接種美國PEDV原型品系及新分離之美國PEDV S-INDEL-變異型品系，以產生品系特異性抗血清。隨後，對所產生的豬抗血清進行兩種品系之間之血清學交叉反應性及交叉中和的活體外評價。特定言之，1)進行PEDV IFA抗體分析(分別使用原型及S-INDEL-變異型品系作為指標病毒)及ELISA(基於PEDV原型品系全病毒之ELISA、基於PEDV原型品系S1之ELISA，及基於PEDV S-INDEL-變異型品系S1之ELISA)，以評價兩種美國品系之抗體交叉反應性；及2)使用原型及S-INDEL-變異型品系作為指標病毒，進行VN測試，以評價兩種美國品系之活體外交叉中和。
材料及方法
在細胞培養物中分離出美國PEDV S-INDEL-變異型品系
選擇六十八個臨床樣品(27個糞便拭子、24個糞便、13個小腸及4個口腔流體)，以試圖依循上述程序[7]分離出Vero細胞(ATCC CCL-81)中的病毒，該等樣品在愛荷華州立大學獸醫學診斷實驗室(ISU VDL)藉由基於PEDV N基因之即時RT-PCR[17、19]測試呈陽性且藉由S1測序證實對美國PEDV S-INDEL-變異型品系呈陽性，但對美國原型品系呈陰性。
在對美國PEDV S-INDEL-變異型品系呈陽性的前述68個臨床樣品中，在三隻未經PEDV處理之3週齡斷奶豬中口胃接種(每隻豬10ml)來自位於伊利諾州(Illinois)之豬的一種小腸勻漿(基於PEDV N基因之即時RT-PCR週期臨限值(Ct)為16.1)[17、19]。用於接種的勻漿在ISU VDL藉由病毒特異性RT-PCR證實對傳染性胃腸病毒(TGEV)、豬科動物輪狀病毒A、B、C組及豬δ冠狀病毒(PDCoV)呈陰性。一天兩次自各接種豬收集直腸拭子及糞便且在同一天藉由PEDV即時RT-PCR測試。一旦直腸拭子之RT-PCR Ct值<15，則對豬實施安樂死且在24小時內屍體剖檢。收集小腸組織及盲腸內容物以便如先前所述試圖在細胞培養物中分離出病毒[7]。此動物研究是根據愛荷華州立大學實驗動物照護及使用委員會(IACUC，批准編號3-14-7766-S)批准的程序進行。
如先前所述[7]，使用Illumina MiSeq平台、藉由下一代測序(NGS)技術測定此研究中所獲得之美國PEDV S-INDEL-變異型品系細胞培養分離株USA/IL20697/2014的全基因組序列。依循上述程序[7]，藉由桑格測序(Sanger sequencing)測定分離株USA/IL20697/2014及該病毒分離株所來源之臨床樣品中的PEDV S1部分序列。
產生針對美國原型及S-INDEL-變異型PEDV的抗血清。
如藉由對直腸拭子進行即時RT-PCR及藉由對血清進行IFA抗體分析所證實對PEDV呈陰性的十五個3週齡豬根據體重隨機分成3組， 每組5隻豬，每組平均體重類似。馴化3天之後，三組豬分別口胃接種美國PEDV原型細胞培養分離株USA/IN19338/2013-P7(原型組)(SEQ ID NO：59)[7]、美國PEDV S-INDEL-變異型細胞培養分離株USA/IL20697/2014-P7(SEQ ID NO：62)(變異體組)及病毒陰性培養基(陰性組)，病毒效價為104 TCID50/ml，每隻豬10ml。在0與7DPI之間且接著在10、14、21及28DPI，每日收集所有豬的直腸拭子，且藉由基於PEDV N基因之定量即時RT-PCR[20]測試以證實感染。在接種後(DPI)的0、7、14、21及28天收集所有豬的血清樣品以便進行交叉反應性及交叉中和評價。此動物研究是根據愛荷華州立大學IACUC委員會(批准編號6-14-7809-S)所批准的程序進行。
在此研究中，藉由各種血清學分析來測試在0、7、14、21及28DPI自原型組(原型抗血清)收集的二十五個血清樣品、自變異體組(變異體抗血清)收集的25個血清樣品及自陰性組(陰性抗血清)收集的25個血清樣品。另外，為了評價，此研究中包括一個針對歐洲PEDV CV777品系的豬抗血清、一個針對TGEV Purdue品系的豬抗血清、一個針對豬科動物血凝性腦脊髓炎病毒(heamagglutinating encephalomyelitis virus；PHEV)的豬抗血清、一個針對豬科動物呼吸冠狀病毒(porcine respiratory coronavirus；PRCV)的豬抗血清及一個針對PDCoV的豬抗血清。針對PEDV CV777、TGEV Purdue及PHEV品系的抗血清購自國家獸醫學服務實驗室(National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA)。針對PRCV及PDCoV的抗血清為獲自ISU VDL的陽性對照血清。
間接螢光抗體(Indirect fluorescent antibody；IFA)分析。
依循上述程序[20]，藉由基於PEDV原型品系之IFA(Pro IFA)及基於S-INDEL-變異型品系之IFA(Var IFA)來測試八十個血清樣品。PEDV原型分離株USA/IN19338/2013在Pro IFA分析中用作指標病毒且S-INDEL-變異型分離株USA/IL20697/2014在Var IFA分析中用作指標病毒。血清稀釋度為1：40或高於1：40的陽性信號視為IFA抗體陽性。
用於抗體偵測之PEDV ELISA。
開發出基於美國PEDV原型品系全病毒之間接ELISA(ProWV ELISA)且在ISU VDL根據PEDV特異性IgG抗體之偵測來驗證[15、16]。依循已詳細描述的程序[20]，藉由此ProWV ELISA測試所有血清樣品。樣品陽性比率(S/P)>0.8視為抗體陽性，S/P比率在0.6-0.8之間視為可疑，且S/P比率<0.6視為陰性。
在此研究中，依循上述程序[14]，使用公開之基於美國PEDV原型品系S1之間接ELISA(ProS1 ELISA)測試所有血清樣品。S/P比率>0.2視為抗體陽性，0.14-0.2視為可疑，且S/P比率<0.14視為陰性。
在此研究中開發基於美國PEDV S-INDEL-變異型品系S1之間接ELISA(VarS1 ELISA)。編碼美國PEDV S-INDEL-變異型品系之S1部分(aa 1-735)的區域進行密碼子最佳化且經由添加5' Kozac序列、5'真核信號序列及3' 6×-His標籤、藉由GeneArt®基因合成(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)來合成。所得2,358個鹼基對DNA片段選殖入Zoetis 專有的真核表現載體(pZOE15)中。藉由測序證實插入序列在重組質體中之真實性及取向。重組質體使用Zoetis專有的PEI轉染方法短暫轉染至人類胚腎(HEK)293細胞中。轉染後第7天，收集培養物上清液且過濾滅菌。 重組蛋白質經由Ni-NTA純化系統(Thermo Fisher Scientific)純化。用於VarS1 ELISA的最佳抗原濃度及最佳血清稀釋度是使用棋盤滴定來確定。聚苯乙烯96孔微量滴定盤(Nunc®,Thermo Fisher Scientific)用PEDV變異型S1蛋白質塗佈(每孔100μl)且在4℃培育隔夜。用PBS洗滌5次之後，滴定盤在25℃用含有1%牛血清白蛋白的PBS(Jackson ImmunoResearch公司，West Grove,PA,USA)(每孔300微升)阻斷2小時。滴定盤在37℃乾燥4小時且在4℃、在具有乾燥劑包之密封袋中儲存直至使用。血清樣品1：50稀釋且添加至所塗盤中(100微升/孔)。滴定盤在25℃培育1小時，接著用PBS洗滌5次。隨後添加1：25,000稀釋之100μl結合過氧化酶之山羊抗豬科動物IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch公司，West Grove,PA,USA)且滴定盤在25℃培育1小時。洗滌步驟之後，添加100μl四甲基聯苯胺-過氧化氫受質(TMB,Dako North America公司，Carpinteria,CA,USA)。滴定盤在室溫下培育5分鐘且藉由添加50μl終止溶液(IM硫酸)來終止反應。使用用商業軟體操作的ELISA讀盤器(Biotek®Instruments公司，Winooski,VT,USA)，根據450nm之光學密度(optical density；OD)量測反應。血清抗體反應是以樣品陽性比率(S/P)呈現，其如下計算：S/P比率=(樣品OD-陰性對照組平均OD)/(陽性對照組平均OD-陰性對照組平均OD)。使用自記錄有暴露於美國PEDV S-INDEL-變異型品系之農場收集之29個野外血清樣品(自29隻斷奶豬收集血清樣品，一個月後藉由PCR發現其對S-INDEL-變異型品系呈陽性)及20個PEDV陰性野外血清樣品驗證PEDV VarS1 ELISA。S/P比率>0.3視為抗體陽性，0.2-0.3為可疑，且<0.2為陰性。
病毒中和(VN)測試。
依循上述程序[20]，藉由基於美國PEDV原型品系之VN(Pro VN)及基於美國PEDV S-INDEL-變異型品系之VN(Var VN)來測試血清樣品。PEDV原型分離株USA/IN19338/2013在Pro VN分析中用作指示病毒且S-INDEL-變異型分離株USA/IL20697/2014在Var VN分析中用作指示病毒。相較於陰性血清對照物，引起染色減少>90%之最高血清稀釋度的倒數定義為血清樣品之VN效價。VN效價8視為陽性。
統計學分析
利用普遍化線性混合模型(generalized linear mixed model；GLIMMIX)分析藉由Pro IFA及Var IFA所測試之原型抗血清及變異體抗血清的Log2(IFA效價/10)。接種後的天數及抗原用作獨立變數，且豬ID及豬ID與抗原之相互作用設定為隨機效應。以類似方式分析藉由Pro VN及Var VN所測試之原型抗血清及變異體抗血清的Log2(VN效價)。在ELISA分析中，ELISA抗原、豬ID及DPI用作獨立變數。所有統計學分析均使用統計學分析系統(Statistical Analysis System；SAS)9.3版(SAS研究所，Cary,NC,USA)進行，其中p值<0.05視為顯著差異。
結果
在細胞培養物中分離出美國PEDV S-INDEL-變異型品系
首先嘗試對在ISU VDL接收之經測試對美國PEDV S-INDEL-變異型品系呈陽性的68個臨床樣品進行病毒分離，但在細胞培養物中嘗試分離病毒卻未成功。隨後，使用PEDV S-INDEL-變異型品系陽性腸勻漿接種三隻3週齡豬。一隻豬之直腸拭子在2DPI具有PEDV RT-PCR Ct<15且在3DPI對豬實施安樂死且進行屍體剖檢。其他兩隻豬之直腸拭子 在3DPI具有PEDV RT-PCR Ct<15且在4DPI對兩隻豬實施安樂死且進行屍體剖檢。使用在屍體剖檢時收集的小腸組織及盲腸內容物，嘗試分離Vero細胞中的病毒。成功地自收集自所有3隻豬之小腸勻漿及盲腸內容物中分離出美國PEDV S-INDEL-變異型品系。觀測到典型的PEDV細胞病變效應，包括融合體形成及細胞拆分，且使用PEDV特異性單株抗體SD6-29、藉由免疫螢光染色來證實病毒生長。
選擇一種美國PEDV S-INDEL-變異型分離株(標識為USA/IL20697/2014)用於進一步繁殖及表徵。此分離株在Vero細胞中連續繼代且前十個繼代的感染效價範圍為103-105 TCID50/ml。分離株2014020697-P5繼代5譜系1之全基因組序列(SEQ ID NO：8)與GenBank中可獲得之其他美國PEDV S-INDEL-變異型序列具有99.3-99.9%核苷酸一致性。USA/IL20697/2014細胞培養物分離株P5之S1序列與該病毒分離株所來源之原始腸勻漿具有99.8%核苷酸一致性(僅有4個核苷酸差異)。在ISU VDL測試USA/IL20697/2014分離株且藉由病毒特異性PCR證實對TGEV、PRCV、PDCoV、豬科動物輪狀病毒A、B、C、流感A型病毒、豬科動物生殖及呼吸症候群病毒以及豬科動物環狀病毒2呈陰性。
產生針對美國原型及S-INDEL-變異型PEDV的抗血清。
美國PEDV原型分離株USA/IN19338/2013-P7(SEQ ID NO：59)及S-INDEL-變異型分離株2014020697-P7(SEQ ID NO：62)已建立於所有接種豬中，如藉由PCR測試直腸拭子所證明。在原型組中，在2、4、7、10、14、21及28DPI，分別有4/5、5/5、5/5、5/5、5/5、5/5及3/5豬的直腸拭子中有病毒排出，如藉由PEDV即時RT-PCR所測試。在S-INDEL-變異 型組中，在2、4、7、10、14、21及28DPI，分別有3/5、5/5、5/5、5/5、4/5、3/5及1/5豬之直腸拭子中有病毒排出。陰性對照豬之直腸拭子在整個研究期期間仍呈PEDV PCR陰性。總而言之，在0、7、14、21及28DPI，自原型品系接種豬收集25份抗血清(原型抗血清)，自變異型品系接種豬收集25份抗血清且自陰性對照組收集25份抗血清(陰性抗血清)。
藉由PEDV IFA抗體分析評價針對美國PEDV原型品系及S-INDEL-變異型品系之抗體的交叉反應性。
如圖13所示，根據基於原型品系之IFA抗體分析(Pro IFA)，原型抗血清測試抗體在0及7DPI呈陰性(0/5)且在14、21及28DPI呈100%陽性(5/5)。基於變異型品系之IFA(Var IFA)針對原型抗血清得到類似結果，但在14DPI收集的一份血清根據Var IFA分析呈陰性。比較抗體效價時，陽性原型抗血清在Pro IFA分析中的總體反應比Var IFA分析好，其中平均效價高於1.4 log2(圖13)。根據Pro IFA與Var IFA抗體分析，變異體抗血清在0及7DPI測試呈陰性(0/5)且在14、21及28DPI呈100%陽性(5/5)。比較抗體效價時，陽性變異體抗血清在Pro IFA分析中的反應類似於Var IFA分析，其中平均效價差異小於0.1 log2(圖13)。
根據PEDV Pro IFA與Var IFA分析，自陰性對照組收集的抗血清(陰性抗血清)在整個研究中對抗體呈陰性。針對歐洲PEDV CV777品系之豬抗血清在Pro IFA分析中的抗體效價(效價320)與在Var IFA分析中的抗體效價(效價160)類似。針對TGEV Purdue、PHEV、PDCoV及PRCV病毒的抗血清在PEDV Pro IFA與Var IFA分析中均呈陰性。
藉由各種PEDV ELISA評價針對美國PEDV原型品系及S-INDEL-變異 型品系之抗體的交叉反應性。
如圖14所示，根據ProWV ELISA、ProS1 ELISA及VarS1 ELISA，在0及7DPI收集的原型抗血清對於所有抗體均呈陰性。對於在14DPI收集的原型抗血清而言，根據ProWV ELISA，2份血清呈陽性且3份在可疑範圍內；根據ProS1 ELISA，3份呈陽性且1份為可疑的；根據VarS1 ELISA，2份呈陽性且1份為可疑。在21及28DPI收集的原型抗血清根據三種ELISA均呈陽性。藉由各種ELISA比較14、21及28DPI時之陽性原型抗血清之總數時，在偵測針對美國PEDV原型品系之抗體的三種ELISA中無顯著差異。
在0及7DPI收集的變異體抗血清根據所有三種ELISA均對抗體呈陰性，但7DPI之一種血清根據ProS1 ELISA處於可疑範圍內(圖14)。在14、21及28DPI收集之變異體抗血清根據三種ELISA具有可變數目個陽性、可疑及陰性結果(圖14)。總體上，就變異體抗血清而言，ProWV ELISA偵測到14份血清對抗體呈陽性、1份為可疑且10份呈陰性；ProS1 ELISA偵測到8種血清呈陽性、5份為可疑且12份呈陰性；VarS1 ELISA偵測到12份血清呈陽性、3份為可疑且10份呈陰性。比較藉由各種ELISA所得之14DPI、21DPI及28DPI之陽性變異體抗血清之總數時，ProWV ELISA就偵測針對美國PEDV S-INDEL-變異型品系之抗體而言顯著優於ProS1 ELISA(p=0.0079)。然而，就偵測針對美國PEDV S-INDEL-變異型品系之抗體而言，ProWV ELISA與VarS1 ELISA之間無顯著差異(p=0.3643)，或ProS1 ELISA與VarS1 ELISA之間無顯著差異(p=0.0723)。
在整個研究期0-28DPI期間，自陰性對照組(陰性抗血清) 收集的抗血清根據所有三種PEDV ELISA對抗體均呈陰性。針對歐洲PEDV CV777品系之豬抗血清根據所有三種PEDV ELISA均對抗體呈陽性。針對TGEV Purdue、PHEV、PDCoV及PRCV病毒之抗血清根據三種PEDV ELISA均呈陰性。
藉由病毒中和測試來評價針對美國PEDV原型品系及S-INDEL-變異型品系之抗體的交叉中和。
如圖15所示，早在7DPI，在接種原型品系或S-INDEL-變異型品系之大部分豬之血清中偵測到VN抗體，不論藉由Pro VN或Var VN分析加以測試。在14、21及28DPI自接種PEDV原型品系或S-INDEL-變異型品系之所有豬收集的血清樣品根據Pro VN與Var VN分析對VN抗體呈陽性。
根據Pro VN及Var VN分析，陽性原型抗血清具有類似的VN抗體效價，且兩種分析之間無顯著差異。陽性變異體抗血清在Pro VN及Var VN分析中具有類似的VN抗體效價且兩種分析之間在總體上無顯著差異(p=0.42)，但變異體抗血清在21及28DPI之平均VN抗體效價在Var VN分析中稍微高於Pro VN分析(圖15)。
同源Pro VN分析所測試之陽性原型抗血清的VN抗體效價平均而言比藉由同源Var VN分析所測試之陽性變異體抗血清之VN抗體效價高0.8 log2(圖15)。
在整個研究期0-28DPI期間，自陰性對照組收集的抗血清(陰性抗血清)在Pro VN與Var VN分析中對抗體均呈陰性。針對歐洲PEDV CV777品系的豬抗血清在Pro VN分析(效價64)中及在Var VN分析(效 價16)中對抗體呈陽性。針對TGEV Purdue、PHEV、PDCoV及PRCV病毒的抗血清在PEDV Pro VN與Var VN分析中均呈陰性。
論述
申請人先前已在Vero細胞中分離出美國PEDV原型品系[7]。為了獲得美國PEDV S-INDEL-變異型品系之細胞培養分離株以產生供評價用的品系特異性抗血清，首先使用呈遞至ISU VDL之68個PEDV S-INDEL-變異型品系陽性臨床樣品嘗試分離出Vero細胞中的病毒。然而，在此等樣品之細胞培養物中分離S-INDEL-變異型病毒卻未成功。此可歸因於多種因素，諸如病毒在樣品中的濃度低、一些樣品的細胞毒性，及收集後之臨床樣品的儲存條件變化。接著，在68個臨床樣品中，將一種含有S-INDEL-變異型PEDV的腸勻漿接種於豬中以產生病毒負荷豐裕之更新鮮材料供嘗試分離出細胞培養物中的病毒。使用此方法，成功地在Vero細胞中分離出美國S-INDEL-變異型PEDV。據推測，樣品中之病毒的濃度高及針對新鮮樣品之即刻病毒分離嘗試為成功分離細胞培養物中之病毒的關鍵。對於其他病毒在分離直接來自天然感染動物之臨床樣品之細胞培養物中之彼等病毒存在困難之情形下而言，可考慮此研究中所述之方法，亦即使病毒在宿主動物中擴增以獲得病毒濃度較高之新鮮樣品供嘗試分離細胞培養物中之病毒。
自豬農場收集的一些野外血清樣品呈遞至ISU VDL用於PEDV抗體偵測。然而，由於此等個案缺乏明確的暴露史且可能被多種病原體感染或被超過一種PEDV品系感染，因此此等野外血清樣品對於評價不同PEDV品系之血清學交叉反應性而言不為理想的。因此，在本發明研究 中，斷奶豬在嚴格實驗條件下產生針對美國PEDV原型及S-INDEL-變異型品系的抗血清，用於藉由各種血清學分析評價交叉反應性。
針對原型品系之陽性抗血清與原型病毒及S-INDEL-變異型病毒均反應，且針對S-INDEL-變異型品系之陽性抗血清亦與原型病毒及S-INDEL-變異型病毒均反應，如藉由IFA抗體分析所檢查。考慮抗體效價時，針對原型品系之抗體與Pro IFA分析的反應性優於Var IFA分析，而針對S-INDEL-變異型品系的抗體與Var IFA及Pro IFA分析的反應性類似。因此，在獸醫學診斷實驗室提供的本發明基於美國PEDV原型品系之IFA抗體分析可用於可靠地偵測針對兩種美國PEDV品系的抗體。
先前已開發出ProWV ELISA及ProS1 ELISA且經驗證可偵測PEDV特異性抗體[14-16]。在此研究中開發出PEDV VarS1 ELISA。然而，在此研究中測試實驗方式所產生之抗血清之前，僅使用有限數目個針對美國PEDV S-INDEL-變異型品系之野外抗血清驗證此VarS1 ELISA。為了確定此分析之效能，需要使用大量血清樣品進一步驗證此VarS1 ELISA。所有三種PEDV ELISA均與原型抗血清及變異體抗血清反應。三種ELISA以類似方式偵測原型抗血清。然而，就在此研究條件下偵測針對美國PEDV S-INDEL-變異型品系之抗體而言，此研究中所用的ProS1 ELISA似乎不如ProWV ELISA及VarS1 ELISA有效。
針對美國原型品系的抗體及針對美國S-INDEL-變異型品系的抗體均以類似的效價中和兩種病毒品系。當前在實驗室中運作的基於美國PEDV原型品系之測試可用於偵測針對兩種美國PEDV品系之抗體。
在此研究中，自14DPI開始，原型與S-INDEL-變異型PEDV 接種豬的血清中出現可偵測的IFA及ELISA抗體。相比之下，自7DPI開始，兩組豬均出現低含量的血清中和抗體。此研究中的IFA及ELISA分析偵測到IgG抗體；VN測試可潛在地偵測具有中和活性的任何抗體同型。此是否有助於早期偵測到所觀測之低含量VN抗體仍不明確。在先前研究中，亦已報導PEDV VN抗體可早在7DPI偵測到[20]。
美國原型與S-INDEL-變異型PEDV之間的明顯基因差異位於S1區域(根據原型品系USA/IN19338/2013中之位置，對應於aa 1-738之核苷酸1-2214，GenBank登錄編號KF650371)，特別言之，位於S基因之N末端區域(對應於aa 1-390之核苷酸1-1170)，而基因組的剩餘部分在兩種美國品系之間相對具有保守性[4、8、10]。ProS1 ELISA所用的PEDV原型品系S1蛋白質與VarS1 ELISA所用的PEDV S-INDEL-變異型品系S1蛋白質具有92%胺基酸一致性。所報導的PEDV中和抗原決定基位於S蛋白質胺基酸殘基499-638、744-759、756-771及1368-1374[1、21]。含有中和抗原決定基之此等位置中的蛋白質序列在美國原型與S-INDEL-變異型PEDV之間具有保守性。此可解釋針對兩種PEDV品系之抗體為何能夠與兩種病毒品系發生交叉中和。使用重組PEDV S1蛋白質(aa 1-738)開發ProS1及VarS1 ELISA。雖然美國原型與S-INDEL-變異型PEDV的aa 1-390有相當大的差異，但此兩種品系在此區域中仍具有一些共同抗原決定基。另外，兩種PEDV品系之重組S1蛋白質的aa 390-738(包括此區域中的中和抗原決定基)具有相對保守序列。此可為ProS1及VarS1 ELISA為何可偵測到針對兩種美國PEDV品系之抗體的原因，儘管各分析之間可能存在靈敏度差異。IFA抗體分析及ProWV ELISA應該可偵測到針對PEDV之多種抗原性蛋白質的抗體 且因此預期其可偵測到針對美國原型與S-INDEL-變異型PEDV之抗體。考慮到核衣殼蛋白在PEDV中相當保守，因此預期基於核衣殼蛋白之ELISA應偵測到針對兩種美國PEDV品系的抗體。申請案亦包括一種針對經典歐洲PEDV CV777品系之豬抗血清用於評價且藉由此研究中所評價的所有血清學分析來偵測PEDV CV777抗體。然而，針對TGEV Purdue、PHEV、PDCoV及PRCV之抗血清與此研究中所評價的PEDV血清學分析無交叉反應性。
林等人[22]產生針對美國PEDV原型品系、美國PEDVS-INDEL-變異型品系、TGEV Purdue品系及TGEV Miller品系的高免疫豬抗血清，且藉由細胞培養物免疫螢光(cell culture immunofluorescence；CCIF)分析(類似於本發明人的IFA抗體分析)及螢光焦點減少病毒中和(fluorescent focus virus neutralization；FFRVN)分析(類似於本發明人之VN測試)來測試。發現針對美國PEDV原型品系、S-INDEL-變異型品系及歐洲CV777品系的抗血清在CCIF及FFRVN分析中皆具有交叉反應性。本發明人之發現與其結果一致。除Lin等人所用類似的血清學分析之外，本發明人亦經由三種PEDV ELISA評價PEDV血清學反應性。又，本發明人測試以實驗方式感染兩種美國PEDV品系之豬之連續血清樣品(0-28DPI)，從而提供關於斷奶豬中之PEDV抗體產生之動力學的適用資訊。林等人之研究中的受人關注之發現為，針對TGEV Miller品系而非TGEV Purdue品系之高免疫抗血清在CCIF分析中與所有PEDV品系均發生反應，但在FFRVN分析中則不然。
結論
本發明研究中的資料表明，針對美國PEDV原型及S-INDEL- 變異型品系之抗體與兩種品系均發生活體外交叉反應及交叉中和。基於美國PEDV原型品系之本發明血清學分析可偵測針對兩種美國PEDV品系的抗體。然而，此等兩種PEDV品系之交叉保護功效需要藉由豬活體內研究來確定。Goede等人[23]顯示，7個月前暴露於S-INDEL-變異型PEDV感染的大母豬可向美國PEDV原型品系攻毒的新生豬崽提供部分保護作用。然就此而言，需要更多的活體內研究來揭露是否應使用美國PEDV原型品系或S-INDEL-變異型品系或兩者來開發疫苗以便提供針對美國豬中流行之兩種PEDV品系的保護作用。
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實施例4
根據PEDV之當前較大傳染性及有效疫苗的缺乏，本發明的重大成就為提供基於INDEL型變異體(其另一實例為OH851，如俄州農業局首次所述，L.Wang等人，Emerg.Infect.Dis.,2014，第20卷，第917-919頁)的經修飾之活疫苗，其有效針對當前全世界範圍內的傳染，且特定而言，針對所謂的原型病毒(實例為熟知的USA/Colorado/2013，其序列可根據Genbank登錄編號KF272920獲得)(所有該等病毒均如上文大體所述，其已導致豬群發生毀滅性損失)具有交叉保護作用。本發明的全新一流疫苗在劑量及給藥時序方面亦具有實質靈活性，從而有效投予例如妊娠之前與妊娠期間之大母豬及投予豬崽，包括初始大母豬所生之豬崽。對於公豬而言，亦提供有效性。因此，此類疫苗的有佐劑形式與無佐劑形式均可向PEDV(包括原型及新出現的INDEL型分離株)攻毒之大母豬、小母豬、豬崽、肉豬及公豬提供保護作用。本發明疫苗因此將提供先前未獲得的保護益處，包括以下成就：(1)疫苗接種妊娠大母豬及小母豬用於保護、預防、有助於預防或有助於控制PEDV所致的疾病(厭食、體重減輕、脫水、發熱、下痢、嘔吐、不良泌乳表現)；(2)疫苗接種妊娠大母豬及小母豬用於保護、預防、有助於預防或有助於控制豬崽中發生PEDV所致的疾病及死亡；(3)疫苗接種1日齡或大於1日齡的豬用於保護、預防、有助於預防或有助於控制PEDV所致的疾病；(4)加打疫苗，其在大母豬後續分娩之前投予大 母豬或每年投予大母豬；(5)健康豬可接種PEDV MLV，接著加打PEDV不活化疫苗；及(6)通常用於保護豬以防PEDV引起體重減輕或不能增加體重，以及其所有及類似成就。
原型品系USA/IN19338/2013之減毒
在2013年4月出現於美國以來，豬流行性下痢病毒(PEDV)已快速散佈於整個國家且第一年導致死亡的豬估計有8百萬，造成經濟損失$9億至$18億[1]。另外，PEDV最近已出現於或再出現於多個國家，包括中國、日本、南韓、菲律賓、泰國、越南、加拿大、墨西哥、德國、比利時、法國及葡萄牙[2-10]。因此，PEDV仍給全球養豬業帶來巨大挑戰。當前在美國，存在兩種商業PEDV疫苗(死疫苗及RNA顆粒疫苗)。然而，一些研究顯示，此等PEDV疫苗誘導先前暴露於PEDV的畜群發生良好的IgG及IgA免疫反應，但在疫苗接種之後的初始豬未誘導良好的IgA反應[11-12]。經修飾之活病毒(Modified live virus；MLV)PEDV疫苗就誘導黏膜免疫力而言比死疫苗或次單位疫苗更有效。然而，針對新出現之美國品系之此類安全且有效MLV PEDV疫苗在當前並不存在。此研究之目標為，對美國毒性PEDV原型分離株在細胞培養物中連續繼代之後發生的基因組及病原性變化進行特性化，且確定任何所產生病毒是否可為針對PED的潛在MLV疫苗候選物。
材料及方法
先前在吾人實驗室[13]中分離的美國PEDV原型品系細胞培養物分離株USA/IN19338/2013在Vero細胞中連續繼代，繼代100次。評價所選病毒在新生豬模型中的病原性變化。將不含PED病毒及抗體的六十隻 豬崽(5日齡)隨機分成6組，每組10隻豬。豬餵養代乳品。第1組至第5組(G1-5)分別經口接種繼代7(SEQ ID NO：59)、繼代25(SEQ ID NO：71)、繼代50(SEQ ID NO：72)、繼代75(SEQ ID NO：74)及繼代100(SEQ ID NO：75)之PEDV USA/IN19338/2013(104 TCID50/ml，每隻豬10ml)且第6組(G6)接受相同體積的無病毒培養基作為陰性對照組(表6)。記錄臨床觀測結果。送達時且每日收集直腸拭子，且藉由基於PEDV核衣殼基因之定量即時RT-PCR14來測試。每組中的五隻豬分別在接種後(DPI)第3天及第7天進行屍體剖檢。檢查小腸、盲腸及結腸之肉眼病變及顯微鏡下病變且進行免疫組織化學(IHC)染色。顯微鏡下病變嚴重程度分類為：0=無病變，1=最小纖毛狀萎縮，2=輕度纖毛狀萎縮，3=中度纖毛狀萎縮且4=嚴重纖毛狀萎縮。IHC染色如下評分：0=無信號，1=最小染色，2=輕度染色，3=中度染色且4=嚴重染色。使用下一代測序技術測定原始組織勻漿中之病毒以及繼代P3、P7、P9、P25、P50、P65、P75及P100之病毒的全基因組序列[13]。
結果及論述
經連續繼代，病毒對細胞培養物變得更適應。PEDV USA/IN19338/2013在P50、P75及P100之較高繼代生長更有效且達成較高的感染性效價(圖17)。
陰性對照組豬崽在整個研究期期間保持陰性。接種P7、P25、P50、P75或P100病毒的豬崽在1-4DPI皆具有水樣下痢且在5-7DPI具有輕度至中度下痢。接種P7、P25、P50、P75或P100病毒之豬崽的直腸拭子中皆發現排出病毒，接種較高繼代病毒之豬崽具有病毒排出量較低的傾向(圖18)。特定言之，病毒排出量為：P7>P25>P50、P75、P100>陰性對照組(>意謂顯著較高；P50、P75及P100群組之間無顯著差異)。接種更低繼代病毒之豬崽存在纖毛狀萎縮更嚴重的傾向。如圖19所示，在3DPI，十二指腸中之顯微鏡下病變嚴重程度為P7、P25>P50、P75、P100、陰性對照組；空腸中之顯微鏡下病變嚴重程度為P7、P25、P50>P75、P100>陰性對照組；且迴腸中之顯微鏡下病變嚴重程度為P7、P25、P50>P75、P100、陰性對照組。在3DPI，纖毛高度與腺管深度比率在空腸中為：P7、P25、P50<P75、P100<陰性對照組，且在迴腸中為P7、P25、P50<P75、P100、陰性對照組(圖20)。在3DPI，空腸中之IHC染色為：P7、P25、P50、P75>P100>陰性對照組；迴腸中之IHC染色為：P7、P25、P50>P75、P100、陰性對照組；在盲腸或結腸中之不同病毒之間，IHC分數無顯著差異(圖21)。在7DPI，各群組之間的差異不是很明顯。
不僅測定繼代P7、P25、P50、P75、P100之病毒的全基因組序列，而且測定存在於原始組織勻漿中之病毒以及繼代P3、P9及P65之病毒的全基因組序列。如圖16所示，比較全基因組序列揭露，在連續繼代高 達P100期間發生的核苷酸變化及所推定胺基酸變化mainly位於複製酶非結構蛋白(non-structural protein；nsp)2、nsp3、nsp4、nsp5、nsp6、nsp15、刺突蛋白(S)、ORF3、被膜(E)、膜(M)及核衣殼(N)蛋白質。值得注意的是，自P25開始，ORF3中發生位於24908A>T的點突變，其由於所推定之胺基酸轉譯之早期終止密碼子而產生截短的ORF3蛋白質；此點突變被攜帶至P100之病毒。考慮到連續繼代期間發生的序列變化與病毒毒力變化，15個位置發生的胺基酸變化潛在地可能與在細胞培養物中連續繼代期間發生的病毒減毒有關。此等15個位置包括：ppla蛋白質1564Ser>Phe、1896Thr>Ile、2600Asn>Tyr、3247Leu>Phe及3473Ala>Val；S蛋白質326Thr>Ile、491Asn>Tyr、888Gly>Arg、1277Leu>Phe、1399Ile>Thr及1358Cys>Leu；截短的ORF3轉譯；E蛋白質69Leu>Ile；M蛋白質208Ala>Thr；及N蛋白質439Thr>Ile。
總之，美國PEDV原型毒力分離株USA/IN19338/2013在細胞培養物中連續繼代期間的病原性變得逐漸減弱。臨床觀測結果、直腸拭子病毒排出、組織病理學病變及IHC染色資料表明，P75及P100病毒的減毒程度比P7、P25及P50病毒更大。然而，P75及P100病毒仍可引起下痢且減毒程度可能已不足以成為MLV疫苗候選物。為了獲得完全減毒的疫苗候選病毒，需要病毒在細胞培養物中連續繼代。十六個胺基酸變化在此研究之條件下似乎與病毒減毒有關。此研究為開發MLV PEDV疫苗及瞭解病毒減毒之分子機制提供堅實基礎。
熟習此項技術者很快將認識到，雖然在不同分離株之間，核苷酸及胺基酸序列存在變化，且可能出現缺失及插入，然而序列比對技術 已熟知，因此可使PEDV蛋白質中的任何胺基酸位置與其他分離株中的適當胺基酸位置對映。用於此目的之較佳算法及比對程式包括ClustalX 2.0版．(Larkin等人，Bioinformatics 23,2947-2948(2007))、BioEdit 7.0.4.1版(Hall,Nucl Acids Symp Ser 41,95-98(1999))，及Lasergene軟體套件(DNASTAR公司，Madison WI)，包括用於多個序列比對以比對序列及比較序列相似性及差異的Clustal W算法。
圖16顯示以下胺基酸變化較佳為提供疫苗功效、同時展現實質性安全、用於產生經適當減毒之PEDV分離株的彼等變化：在ORF1 a及b中，胺基酸位置814(Val)、1076(Val)、1564(Phe)、1896(Ilu)、2310(His)、2600(Tyr)、3247(Phe)、3473(Val)、3522(Arg)；在刺突蛋白基因中，胺基酸位置257(Asn)、326(Ile)、375(Phe)、491(Tyr)、881(Arg)、888(Arg)、1277(Phe)、1339(Thr)、1358(Leu)；在ORF3中，對應於胺基酸位置39或其後的位置，提供終止密碼子的任何核苷酸變化；在基因組區域E中，所編碼被膜蛋白之位置69(Ile)；在基因組區域M中，所編碼膜蛋白之位置208(Thr)；及在基因組區域N中，所編碼核衣殼蛋白之位置141(Leu)、418(Glu)、424(Asp)及439(Ile)。除可單獨或組合使用之此等變化之外，熟習此項技術者將認識到，通常可獲得等效的胺基酸變化，例如可用帶正電殘基取代帶正電殘基(Arg、Lys、His)，可用帶負電殘基取代帶負電殘基(Glu、Asp)，或可基於極性或官能基進行等效取代(諸如用Thr取代Ser且反之亦然；用Try取代Trp且反之亦然；Ileu、Val、Leu皆可彼此間取代，以及其所有及類似變化)。
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美國S-INDEL-變異型品系USA/IL20697/2014(2014020697)之減毒
圖24以及表1及表2提供關於胺基酸變化的某些資訊，該等變化對應於變異型品系USA/IL20697/2014之減毒株。變異型分離株USA/IL20697/2014在細胞培養物中以兩個獨立譜系連續繼代。
在第一譜系中，病毒在細胞培養物中繼代至第60次繼代(P60)；不同繼代的病毒命名為2014020697-P1、2014020697-P2、2014020697-P3……2014020697-P60。其中，測定且比較病毒2014020697-P3(SEQ ID NO：63)、2014020697-P5(SEQ ID NO：8)、2014020697-P7(SEQ ID NO：62)、2014020697-P18(SEQ ID NO：64)、2014020697-P30(SEQ ID NO：65)、2014020697-P45(SEQ ID NO：39)及2014020697-P60(SEQ ID NO：66)的全基因組序列。
在第二譜系中，病毒在細胞培養物中連續傳送且一些繼代的病毒亦經空斑(群落)純化。其中，測定且比較病毒2014020697-P3R1(SEQ ID NO：67)、2014020697-P5R1(SEQ ID NO：68)、2014020697-P7R1(SEQ ID NO：15)、2014020697-P8R1(SEQ ID NO：35)、2014020697-P18R1純系89G8b(SEQ ID NO：36)、2014020697-P18R1純系94F6a(SEQ ID NO：37)及2014020697-P18R1純系92F6a(SEQ ID NO：37)的全基因組序列(應注意，P18R1 94F6a及P18R1 92F6a(SEQ ID NO：37)為根據核驗目的而運作的相同純系之複製物，參見表1及表2)。另外，2014020697-P18R1 G8b及2014020697-P18R1 F6a繼代成為後續繼代19及20保持與其相應純系在繼代18R1的基因一致性。根據所有已認知的試驗終點，所產生的病毒提供所需的臨床安全，且就類似變異型(INDEL)品系的攻毒而言，保持高度保護作用，且就高病理性原型品系而言保持交叉保護作用。
參看圖24及表2之「胺基酸變化」部分，可見所編碼之胺基酸位置551之ORF1a/1b提供白胺酸。實際上，PEDV分離株(不論原型或變異型INDEL)中之位於此位置的白胺酸似乎幾乎不變，原因為在約500個隨機選擇之所公開比較序列中，發現白胺酸代表殘基551。雖然2014020697-P18R1 F6a(SEQ ID NO：37)與2014020697-P18R1 G8b(SEQ ID NO：36)的臨床資料均顯示安全及功效具有顯著水準，但應注意2014020697-P18R1 F6a在安全與功效方面更強，使得其成為可高度商業化的物質。2014020697-P18R1 F6a在位置551提供脯胺酸(一種熟知可中斷或界定肽二級結構域類型之間邊界的胺基酸)，且因此預期Pro 551促成最終表型。鑒於PEDV基因組中之此位置不變地使用Leu，因此將Pro殘基插入位 置551或緊鄰其上游或下游插入(在其約2-3個胺基酸殘基內插入)為本發明的另一個具體實例。使用熟知算法建立模型(參見P.Y.Chou等人，「Prediction of Protein Conformation」,Biochemistry,13(2)，第222-245頁，1974；J.Garnier等人，J.Mol.Biol.,第120卷，第97-120頁，1978；及J.Garnier 等人，Methods Enzymology，第266卷，第540-543頁，1996)預測一種α螺旋域，其至少包括緊鄰551位置L上游之殘基DEDAT，其中L落在(但仍促成)此第二域結構特徵之接近C末端端部。脯胺酸插入實質上中斷此α螺旋狀特徵。甘胺酸殘基作為ORF1a/b之胺基酸551插入亦屬於本發明之實務，其中再次預期所產生的疫苗經高度減毒、又安全，且甘胺酸殘基可類似地位於內位置551上游或下游約2-3個胺基酸殘基內。所有此類取代適用於所有PEDV純系，不論原型或變異型(INDEL)。
現轉而參考刺突蛋白之2014020697-P18R1 G8b與2014020697-P18R1 F6a在位置973所反映的胺基酸變化，可見野生型胺基酸酪胺酸已經組胺酸置換，此實質上促成此等純系產生有價值的表型。因此，本發明之一個具體實例為在PEDV之所有基因組中提供組胺酸，大體在此基因座提供組胺酸，其經修飾或選擇可提供安全且有效的疫苗，不論原型或變異型(INDEL)品系。
此等突變實質上促成本發明的疫苗減毒株產生臨床上有效的最終表型，且如上述，參看普通比對程式及算法，容易複製於所有原型及變異型(INDEL)品系之相應蛋白質的胺基酸序列中。在所有情況下，保守胺基酸置換(而非具體命名的殘基變化)亦為適當的。
本文中關於繼代的其他資訊如下。自2014020697-P7R1(SED ID NO：15)物質進行後續繼代(8至19)。相較於2014020697-P7R1，2014020697-P8R1共同序列在胺基酸層次未顯示任何變化。2014020697-P8R1接著進一步繼代成為2014020697-P11R1，其中在每個步驟對後續繼代11至14進行純系選擇，隨後進行後續繼代至2014020697-P18R1，收集大量物質以便運作臨床試驗。2014020697-P18R1 G8b及2014020697-P18R1 F6a之開放閱讀框架胺基酸序列分別顯示於圖22B(SEQ ID NO：23-28)及22C(SEQ ID NO：29-34)中，2014020697-P18R1 G8b及201402697-P18R1 F6a之相應全長核苷酸序列分別顯示於圖23B(SEQ ID NO：36)及23C(SEQ ID NO：37)中。2014020697-P18R1 F6a之臨床結果報導為顯著且成功的。就此而言，參見實施例5及實施例6，其顯示此等疫苗物質具有顯著的安全及交叉保護功效。
亦應注意，「繼代7」2014020697-P7譜系1(SEQ ID NO：62)及「繼代60」2014020697-P60繼代60譜系1(SEQ ID NO：39)胺基酸序列)胺基酸序列突變資訊亦報導於圖24及表2中，且其中揭示負責此物質之安全及功效的突變。根據實施例5及實施例6中所報導的2014020697-P38(2014020697-P60的前驅物)之臨床資料以及實施例2之臨床資料及論述(比較2014020697-P7變異型品系內之引起減毒的突變)，該物質亦為安全且有效之交叉保護疫苗的極佳候選物亦為顯而易見的。
就2014020697-P38(SEQ ID NO：78)而言，相較於SEQ ID NO：65(繼代30)，核苷酸位置15550-15551存在GT成為TC之突變，從而使胺基酸「V」變為「S」；核苷酸位置18704存在A成為G之突變，從而使胺基酸「N」變為「S」；在核苷酸位置24808-24823，繼代38具有16個核苷酸缺失(CACGATTGACACAGTT，在SEQ ID NO：65內)，導致在胺基酸「Y」 出現終止密碼子；在核苷酸位置25199-25201，繼代38具有3個核苷酸缺失(TAT，在SEQ ID NO：65內)，導致胺基酸「Y」缺失；在核苷酸位置25624，存在C成為T之突變，從而使胺基酸「S」變為「F」；且在核苷酸位置26224，存在G成為A之突變，從而使胺基酸「V」變為「I」。
實施例5
(兩劑研究)在約1日齡及21日齡時經口投予PEDV INDEL病毒、隨後進行毒力PEDV攻毒的安全及交叉保護作用
研究目標為確定來源於變異型(INDEL)PED品系USA/IL/2014-20697之PEDV分離株之特定減毒繼代當經口投予3(+/-2)日齡(第0天)豬崽且在第21天投予、隨後在第35天(+/-2)進行毒性PEDv攻毒時之安全及交叉保護作用。根據第0天及第21天之與接種後PEDv有關之死亡及臨床徵象的發生率來確定安全。根據與攻毒後毒性PEDv有關之死亡及臨床徵象的發生率來確定交叉保護之示度。所測試的病毒為由如下DNA序列編碼的病毒：(a)SEQ ID NO：36(指定純系G6b，其繼代18與19之間保持不變)；(b)SEQ ID NO：37(指定純系F6，其繼代18與19之間保持不變)；及(c)一組不同繼代，其來源於USA/IL/2014-2069祖先：其繼代38(SEQ ID NO：78)。應注意，SEQ ID NO 36與37彼此不同之處僅在於，多蛋白1a/1b之所編碼胺基酸位置551為位置551之L或P(參見SEQ ID NO：46中緊鄰DAT之後)。
活減毒株之疫苗接種劑量(對照物僅為培養基)為1x104 TCID50，每次經口劑量使用2ML。「TCID50 」係指「組織培養感染劑量」且定義為感染50%指定批次之所接種細胞培養物所需之病毒稀釋度。可使用 多種方法來計算TCID50，包括在通篇本說明書中所用的斯皮爾曼-卡勃方法。關於斯皮爾曼-卡勃方法之描述，參見B.W.Mahy及H.O.Kangro,Virology Methods Manual，第25-46頁(1996)。
實際攻毒物質(具有1x105 TCID50/5ML劑量之濃度)與USA/Colorado/2013(Genbank登錄編號KF272920)密切相關，特定言之，其為明尼蘇達大學獸醫學診斷實驗室(University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory)自愛荷華州(Iowa)農場獲得之現代北美流行性分離株(登錄編號D13-031630)，為活物質。樣品對於輪狀病毒A、B及C、TGE、艱難梭菌毒素(Clostridium difficile toxin)及產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)呈陰性。
藉由RTqPCR分析對糞便排出進行PCR評估，其中對於排出病毒而言，報導值為40呈陰性(等於對照)且值小於35呈陽性。報導次數為偵測所用之循環次數，其中40為聲明未偵測時之最大值。所依循的方案大體如本說明書原樣所述，且類似達成如下成就。將糞便拭子收集於3毫升DMEM培養基中且在-80℃儲存直至使用。樣品在4℃解凍且藉由渦旋5秒來混合。自管中移出一毫升樣品且置放於96孔台架中且以3200rpm離心10分鐘以使糞便微粒物質沈降。使用Qiagen QIAsymphony自動化操作機上之Qiagen DSP病毒/病原體小型套組或QIA立方體HT機器上之Qiagen cador病原體96套組，依循製造商說明書，使用兩百微升糞便樣品上清液進行核酸萃取。使用Path-ID多工型一步RT-PCR套組(Applied Biosystems/Life Technologies)及PEDV N-基因引子及探針，藉由RT-QPCR分析來測定循環臨限值。PEDV正向引子：PEDV N基因-F5'-GAATTCCCAAGGGCGAAAAT-3' [100uM]；反向引子：PEDV N基因-R 5'-TTTTCGACAAATTCCGCATCT-3'[100uM]；PEDV探針6FAM 5'-CGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCA 3' TAMRA。使用PEDV N-基因PCR擴增子產生標準曲線且基於標準曲線、使用Ct值確定各樣品的複本數之值。括弧中所報導的值顯示，分子為各組中之對病毒呈陽性之豬崽數目，分母顯示該特定群組(尚未處死用於屍體剖檢)中剩餘豬崽在指定日之總數。結果如下：
應注意(表7)，繼代38物質導致少量的早期死亡，但後續不明顯，其後續繼代60(SEQ ID NO：66)的產生緩解此情形。
參看表8，經由PCR量測糞便排出。參看「35」對照值(無排出)，但可發現，相較於僅接受培養基作為疫苗接種的攻毒對照組，所有純系均保護豬崽。應注意，純系F6a的保護作用大於純系G8b，此與存在於此純系中的完全獨特脯胺酸殘基(Orf1a/b蛋白質之位置551)一致。
類似地，如表9所示(再次與未接種疫苗之對照組相比)，攻毒之後，所有3種病毒分離株實質上防止排出，其中F6a純系再次顯示優於純系G8b的結果。
實施例6
單劑於日齡豬崽中之功效及安全
與SEQ ID NO：36(純系G8b)及SEQ ID NO：37(純系F6a)對應(由其編碼)的減毒PEDV病毒顯示作為疫苗的顯著功效，從而針對日後之北美原型毒力病毒(例如由USA/Colorado/2013表示，Genbank登錄編號KF272920)之攻毒提供交叉保護作用。此保護作用僅用單劑之疫苗便可達成，其早在豬崽生命第1天便提供給豬崽，即使母親大母豬未感染PEDV，亦即血清反應陰性，其既未暴露於野生型病毒，亦從來未接種疫苗。就大母豬及豬崽接種疫苗時管理豬操作的方式而言，此功效水準賦予生產者很大靈活性，且亦使得生產者能夠接種大母豬群或豬崽而無需進行在疫苗接種之前測定任何動物之血清狀態的分析。此等結果具有重要作用，原因在於豬崽在出生時，PEDV感染病變最嚴重且隨著動物年齡增長而疫苗接種減少(的確需要如此或意義在於此)。應注意，豬崽出生之前，無論母親大母豬是否呈血清反應陽性或血清反應陰性，併有SEQ ID NO：36及37病毒的疫苗均為適用的，且無論母親大母豬是否先前感染野生型品系、疫苗品系(包括藉此感染豬崽)或接種活或死疫苗(在任一情況下為一或多次， 包括育種前及分娩前)，初乳源母本抗體均無礙於本發明疫苗之有效性。亦可指定豬崽的第二劑，必要時由生產者指定。
因此，適用於實施本發明之疫苗接種方案之代表性實例包括：治療或預防豬崽之PEDV所致疾病的方法，包含當該豬崽為約1至7日齡時，向該豬崽投予第一劑之疫苗組成物，另外或視情況在該豬崽為約2至5週齡時投予第二劑之該疫苗。無論是否向豬崽投予1或2劑，在替代方案中，親代大母豬可在育種前或分娩前接種疫苗，或在該兩個時間點接種疫苗，無論母親大母豬是否已呈血清反應陽性(此起因於先前感染)。如前所述，替代性地，母親大母豬呈血清反應陰性。
本發明研究目標因此為測定來源於變異型(INDEL)PED品系USA/IL/2014-20697之兩種繼代PEDV分離株(SEQ ID NO：36及37)經口投予1日齡(第0天)豬崽、隨後在第21天(22日齡)進行毒力PEDv攻毒的安全及交叉保護作用。根據與接種後之PEDv相關之死亡及臨床徵象的發生率來確定安全。根據與攻毒後之毒力PEDv相關之死亡及臨床徵象及腸病變的發生率來確定交叉保護作用之示度。
疫苗接種劑量(對照物僅為培養基)為1x104 TCID50 ，每次經口劑量使用2ML。「TCID50」係指「組織培養感染劑量」且定義為感染50%指定批次之所接種細胞培養物所需之病毒稀釋度。可使用多種方法來計算TCID50，包括在通篇本說明書中所用的斯皮爾曼-卡勃方法。關於斯皮爾曼-卡勃方法之描述，參見B.W.Mahy及H.O.Kangro,Virology Methods Manual，第25-46頁(1996)。
各組內之豬崽另外依三種結果之一分配：在第6天處死用於 屍體剖檢、在第28天處死用於屍體剖檢，或豬崽完成研究且報導直至第40天。
實際攻毒物質(具有1x105 TCID50 /5ML劑量之濃度)與USA/Colorado/2013(Genbank登錄編號KF272920)密切相關，特定言之，其為明尼蘇達大學獸醫學診斷實驗室自愛荷華州農場獲得之現代北美流行性分離株(登錄編號D13-031630)。樣品對於輪狀病毒A、B及C、TGE、艱難梭菌毒素及產氣莢膜梭菌呈陰性。
下表中提供藉由糞便排出分數所示的代表性結果。下文日期是自第0天(亦即1日齡，接種G8b或F6a減毒病毒之日期)計算。
藉由RTqPCR分析對糞便排出進行PCR評估，其中對於排出病毒而言，報導值為40呈陰性(等於對照)且值小於40呈陽性。報導次數為偵測所用之循環次數，其中40為聲明未偵測時之最大值。所依循的方案大體如本說明書原樣所述，且類似達成如下成就。將糞便拭子收集於3毫升DMEM培養基中且在-80℃儲存直至使用。樣品在4℃解凍且藉由渦旋5秒來混合。自管中移出一毫升樣品且置放於96孔台架中且以3200rpm離心10分鐘以使糞便微粒物質沈降。使用Qiagen QIAsymphony自動化操作機上之Qiagen DSP病毒/病原體小型套組或QIA立方體HT機器上之Qiagen cador病原體96套組，依循製造商說明書，使用兩百微升糞便樣品上清液進行核酸萃取。使用Path-ID多工型一步RT-PCR套組(Applied Biosystems/Life Technologies)及PEDV N-基因引子及探針，藉由RT-QPCR分析來測定循環臨限值。PEDV正向引子：PEDV N基因-F 5'-GAATTCCCAAGGGCGAAAAT-3'[100uM]；反向引子：PEDV N基因-R 5'-TTTTCGACAAATTCCGCATCT-3'[100uM]；PEDV探針6FAM 5'-CGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCA 3' TAMRA。使用PEDV N-基因PCR擴增子產生標準曲線且基於標準曲線、使用Ct值確定各樣品的複本數之值。括弧中所報導的值顯示，分子為各組中之對病毒呈陽性之豬崽數目，分母顯示該特定群組(尚未處死用於屍體剖檢)中剩餘豬崽在指定日之總數。第27天及第30天的結果顯示，數目相當多的經攻毒(但未接種疫苗)之對照動物排出病毒，而接種減毒株G8b及F6a之豬崽明顯受到良好保護。
實施例7
前言
2013年4月首次在美國(U.S.)偵測到豬流行性下痢病毒(PEDV)[1]。當前已鑑別出至少兩種在基因學上不同且在美國豬中共流行的PEDV品系(美國PEDV原型品系及S-INDEL-變異型品系)[2-4]。在先前研究中，已在實驗上證實美國S-INDEL-變異型品系在5日齡豬崽中的病原性比美國原型品系弱[5]。然而，PEDV病原性可與年齡相關[6-7]。本發明研究之目標為：1)評價兩種美國PEDV品系在斷奶豬中的致病機制差異；及2)檢查兩種品系在斷奶豬中的交叉保護功效。
材料及方法
自習知育種農場購買八十五隻3週齡豬且遞送至愛荷華州立大學實驗室動物資源機構。所有豬在送達時，肌肉內注射一定劑量的 Excede®，且藉由對直腸拭子進行病毒特異性PCR而證實對PEDV、豬δ冠狀病毒及傳染性胃腸炎病毒呈陰性且藉由對血清樣品進行病毒特異性間接螢光抗體(IFA)分析而證實對PEDV抗體呈陰性。
豬根據體重圍封，接著隨機分成7組，每組15或10隻豬(表11)。豬在第0天(D0)口胃接種病毒陰性培養基(N)、PEDV原型分離株USA/IN19338/2013-P7(P-原型品系)或PEDV S-INDEL-變異型分離株USA/IL20697/2014-P7R1(V-變異型品系)，隨後在D28攻毒。每隻豬在各時間點使用10ml接種物接種，該接種物含有104 TCID50/ml病毒接種體。七個群組根據第1次接種/第2次接種來標示：P/V(15隻豬)、V/V(15隻豬)、N/V(15隻豬)、P/P(10隻豬)、V/P(10隻豬)、N/P(10隻豬)、N/N(10隻豬)。
在D4，對P/V、V/V及N/V群組的五隻豬進行屍體剖檢以便比較兩種PEDV品系之間的肉眼病變及顯微鏡下病變。第2次接種之後的第6天(D34)對所有7個群組的五隻豬進行屍體剖檢，以根據肉眼病變 及顯微鏡下病變來評價交叉保護功效。每組中的其餘5隻豬維持至第2次接種後的第4週(D56)，以評價病毒排出及攻毒後的抗體反應。
記錄臨床觀測結果。在D0、D2、D4、D7、D10、D14、D21、D28、D30、D32、D34、D38、D42、D49及D56收集直腸拭子且藉由基於PEDV N基因之定量即時RT-PCR來測試。在D0、D7、D14、D21、D28、D35、D42、D49及D56收集血清樣品且使用兩種PEDV品系作為指示病毒、分別藉由間接螢光抗體(IFA)分析及病毒中和(VN)分析來測試。收集小腸用於組織病理學評價及免疫組織化學(IHC)染色。
使用統計學分析系統(SAS)9.3版(SAS研究所，Cary,NC)，使用普遍化線性混合(GLIMMIX)模型分析病毒排出效價Log10(gc/ml)、IFA及VN Ab效價、臨床觀測分數、病理學分數、纖毛高度與腺管深度比率(VH/CD)在群組之間的差異。在D0-D28期間，N/N、N/V及N/P群組接受相同接種物且作為相同處理組加以分析，V/V及V/P群組以及P/V及P/P群組類似。統計學分析之前，將IFA效價換算成log2([IFA效價]/10)，且將VN效價換算成log2(VN效價)。p值<0.05定義為統計學顯著差異。
結果
美國PEDV原型品系與S-INDEL-變異型品系於3週齡豬中之致病機制的比較。在D0至D28期間，將7組豬分成3類：P-品系接種(P/V及P/P群組)、V-品系接種(V/V及V/P群組)，及陰性培養基接種(N/V、N/P及N/N群組)。
3週齡豬第1次接種(D0)之後，接種P-品系的兩組(P/V及P/P)在D2與D4之間出現半水樣至水樣下痢；接種V品系的一組(V/P) 在D2至D4期間具有輕度軟糞便且接種V-品系的另一組(V/V)自D5至D7出現水樣下痢。對於第1次接種時接種病毒陰性培養基的其他3組(N/N、N/V及N/P)而言，未觀測到下痢直至D28。
如圖28所示，陰性對照豬(N/N、N/V及N/P群組)在D0至D28期間的直腸拭子未出現任何病毒排出，如定量PEDV rRT-PCR所測試。P-品系接種組(P/V及P/P)的糞便排出在D4達到峰值水準，接著逐漸下降。相比之下，V-品系接種組(V/V及V/P)之糞便排出在前幾天逐漸增加且在D7達到峰值水準。D0至D28，接種P-品系之豬(P/V及P/P群組)的糞便病毒排出量總體上顯著高於接種V-品系的豬(V/V及V/P群組)(P=0.0396)。
接種P-品系(P/V組)、接種V-品系(V/V組)及接種陰性培養基(N/V組)的五隻豬在D4(第1次接種後的第4天)進行屍體剖檢，以比較P-品系及V-品系在3週齡豬中所致的宏觀及微觀病理學病變。P-品系接種豬的小腸、盲腸及結腸之平均內容物分數在數值上高於V-品系及模擬物接種豬，但差異不顯著(圖29A)。V-品系接種豬與模擬物接種豬之小腸及盲腸的平均肉眼病變分數無顯著差異，但嚴重程度顯著低於P品系接種豬(圖29A)。P-品系接種豬之遠端空腸及迴腸中的纖毛高度與腺管深度比率(VH/CD)顯著低於V品系接種豬，表明P-品系所致的纖毛狀萎縮比V-品系更嚴重(圖30A)。在V-品系接種組與模擬物接種組之間，遠端空腸及迴腸中之平均VH/CD比率無顯著差異(圖30A)。
對於D4之IHC染色而言，P-品系接種豬之遠端空腸及迴腸的平均IHC分數分別為4及4，顯著高於V-品系接種豬，V-品系接種豬之 遠端空腸及迴腸的平均IHC分數分別為1.4及1.4(圖29B)。有趣的是，在接種P-品系之3隻豬之盲腸上皮細胞(分數為1、1及2)及1隻豬之結腸上皮細胞(分數為1)中亦觀測到PEDV IHC染色。在V-品系接種豬結腸盲腸及結腸中未觀測到PEDV IHC染色。在模擬物接種豬之任何組織(小腸、盲腸及結腸)中未觀測到PEDV IHC染色。
美國PEDV原型品系與S-INDEL-變異型品系於7週齡豬中之致病機制的比較。D28第2次接種(豬在此時為7週齡)之後，對N/V、N/P及N/N組進行比較，以評價P-品系及V-品系於7週齡斷奶豬中的致病機制。
第2次接種之後，N/P及N/N組未患有下痢，而N/V組在D33至D38(第2次接種後的5至10天)期間出現水樣下痢。N/N組之直腸拭子在D28至D56未偵測到任何病毒。在D28至D56期間，N/V組之直腸拭子中之病毒排出量在總體上顯著高於N/P組(P=0.0359)(圖28)。
對N/N、N/V及N/P組在D34(第2次接種後的第6天)屍體剖檢的五隻豬進行比較，以評價P-品系及V-品系於7週齡豬中之宏觀及微觀病理學病變。總體上，所有三組豬中的宏觀病理學變化較小。在P-品系接種豬與模擬物接種豬之間，小腸、盲腸及結腸之平均內容物分數類似，但顯著低於V-品系接種豬(圖29B)。在P-品系、V-品系及模擬物接種豬之間，小腸的平均肉眼病變分數無顯著差異(圖29B)；但V-品系接種豬之盲腸及結腸的平均肉眼病變分數顯著高於P-品系及模擬物接種豬(圖29B)。在D34，N/V組之遠端空腸與迴腸中之VH/CD比率在數值上低於N/N及N/P組，但差異不顯著(圖31A)。
在D34，僅N/V組之遠端空腸、迴腸及盲腸以及N/P組之盲腸對PEDV IHC染色呈陽性。N/V組之遠端空腸及迴腸之平均IHC分數顯著高於N/P及N/N組(圖31B)。
交叉保護功效之評價。在D28第2次接種之後，對7個群組(P/V、V/V、N/V、P/P、V/P、N/P及N/N)進行比較，以評價先前暴露(在D0第1次接種)對隨後攻毒(在D28第2次接種)之結果的影響。
第2次接種(D28)之後，在D33與D38之間，僅在V/V及N/V組中觀測到水樣下痢，且在任何其他組中未觀測到下痢。
在D28第2次接種之後，比較7個群組之間的糞便病毒排出(圖1)。在V-品系攻毒的3個群組中，P/V與V/V組在D28至D56期間的總體病毒排出量類似(P=0.9422)；但P/V與V/V組的病毒排出量顯著低於N/V組(P<0.0001)。在P-品系攻毒的3個群組中，V/P及P/P組在D28至D56期間的病毒排出量顯著低於N/P組(P<0.0001)，然而病毒排出量在D34顯著高於其他日期的V/P組在D28至D56的病毒排出顯著多於P/P組(P=0.0001)。
在D34(攻毒後第6天)，在V-品系攻毒的3個群組(N/V、V/V及P/V組)中，在N/V組中僅觀測到一些較小的宏觀病理學變化，但在V/V及P/V組中不明顯。在N/V、V/V及P/V組之間，小腸中的平均內容物分數及器官病變無顯著差異。然而V/V及P/V組之盲腸及結腸的平均內容物分數以及結腸的平均病變分數顯著低於N/V組(圖29B)。V/V及P/V組之遠端空腸及迴腸的平均VH/CD比率在數值上高於N/V組；然而，在N/V與V/V組之間，僅觀測到遠端空腸及迴腸VH/CD比率有顯著差異，且 在V/V與P/V組之間，僅觀測到遠端空腸VH/CD比率有顯著差異(圖31A)。V/V與P/V組之遠端空腸及迴腸之平均IHC分數均顯著高於N/V組(圖31B)。
在D34，在經P-品系攻毒的3個群組(N/P、V/P及P/P組)中，任何群組中的宏觀及顯微鏡下病理學變化均不明顯，且就平均內容物分數及組織病變(圖29B)、平均VH/CD比率(圖31A)或平均IHC分數(圖31B)而言，觀測到任何群組之間無顯著差異。
抗體反應。
第1次接種之後，接種P-品系(P/P及P/V組)或V-品系(V/V及V/P組)的所有豬自D7開始至D14呈現IFA及VN抗體，不論使用何種病毒品系作為指示病毒(圖32A、32B、33A、33B)。所有PEDV接種組的平均抗體效價在D21及D28均達到峰值。在D28攻毒之後，此等四個群組的PEDV抗體效價稍微增大，接著維持至研究結束(D56)。N/P及N/V組對PEDV抗體呈陰性直至D42(第2次接種後的第14天)，此時IFA及VN抗體變得可偵測且維持直至D56。N/N組自D0至56保持PEDV抗體陰性。
概述
在3週齡豬中，美國PEDV原型品系的糞便病毒排出量似乎高於S-INDEL-變異型品系，但在7週齡豬中觀測到相反結果。然而，此觀測結果需要進一步證實。美國PEDV原型品系在斷奶豬中針對同源品系與異源品系之攻毒提供保護作用；美國PEDV S-INDEL-變異型品系在斷奶豬中針對同源品系攻毒提供保護作用且針對異源(原型)品系攻毒提供至少部分的保護作用。
參考文獻
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7. Jung K, Annamalai T, Lu Z & Saif LJ. (2015). Comparative pathogenesis of US porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strain PC21A in conventional 9-day-old nursing piglets vs. 26-day-old weaned pigs. Veterinary Microbiology 178, 31-40.
雖然上文已參照所揭示之具體實例及實施例描述特定具體實例，但此等具體實例僅具說明性且不限制本發明之範疇。一般技術者可在如以下申請專利範圍所限定之較寬態樣中進行變更及潤飾而不背離本發明。
所有公開案、專利和專利文獻均以引用的方式併入本文中，如同以引用的方式個別地併入一般。本發明已參照各種特定及較佳具體實例及技術來描述。然而，應瞭解，可進行多種變更及潤飾，而此等變更及潤飾仍屬於本發明之精神及範疇內。
本發明已如此描述，顯然，其可以多種方式變化。此類變化形式不應視為背離本發明之精神及範疇。
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Claims (61)

  1. 一種經分離之豬流行性下痢病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus；PEDV)，其由在全長核苷酸層次上與SEQ ID NO：67至少95%一致的DNA聚核苷酸編碼，且包括一或多個以下胺基酸特徵：(a)多蛋白1a/1b之位置551之L或P(緊鄰DAT之後)，如參考SEQ ID NO：46或其保守性取代所確定；(b)刺突蛋白(spike protein)之位置1009之P(緊鄰NIT之後)，如參考SEQ ID NO：47或其保守性取代所確定；(c)刺突蛋白之位置973之H(緊鄰PFS之後)，如參考SEQ ID NO：47或其保守性取代所確定；及(d)導致ORF3轉譯發生早期終止之ORF3之編碼序列的修飾。
  2. 如申請專利範圍第1項之病毒，其由具有SEQ ID NO：35、36或37中所述之序列的聚核苷酸編碼。
  3. 如申請專利範圍第1項之病毒，其中編碼該病毒的該DNA聚核苷酸在全長核苷酸層次上與SEQ ID NO：67至少98%一致。
  4. 如申請專利範圍第1項之病毒，其中編碼該病毒的該DNA聚核苷酸在全長核苷酸層次上與SEQ ID NO：67至少99%一致。
  5. 如申請專利範圍第1項之病毒，其中編碼該病毒的該DNA聚核苷酸在全長核苷酸層次上與SEQ ID NO：67至少99.5%一致。
  6. 如申請專利範圍第1項之病毒，其中該ORF3之修飾包含產生位置138-143之胺基酸LTANPL的缺失(在SEQ ID NO：48中緊鄰NGKAA之後)及該ORF蛋白質中之位置143之後的截短。
  7. 如申請專利範圍第1項之病毒，其中該等所指定胺基酸中之一或多者的保守性取代係選自：(1)纈胺酸或異白胺酸取代白胺酸；(2)甘胺酸取代脯胺酸；及(3)離胺酸或精胺酸取代組胺酸。
  8. 一種疫苗組成物，其包含如申請專利範圍第1項之豬流行性下痢病毒(PEDV)及載劑，其中該組成物能夠保護豬以防PEDV之變異型品系與原型品系兩者之攻毒(challenge)，並預防或治療一或多種與PEDV感染相關之症狀，且其中保護作用之達成是根據選自由以下組成之群的終點來確定：預防或控制PEDV感染症狀脫水、發熱、下痢、嘔吐、不良泌乳表現、不良生殖表現、死亡中的任一者，以及預防或控制體重減輕或不能增加體重。
  9. 如申請專利範圍第8項之疫苗組成物，其中該病毒為活病毒或死病毒。
  10. 如申請專利範圍第8項之疫苗組成物，其中該載劑為稀釋劑。
  11. 如申請專利範圍第9項之疫苗組成物，其另外包含佐劑。
  12. 如申請專利範圍第8項之疫苗組成物，其中該經保護的豬包括大母豬(sow)、小母豬(gilt)、公豬(boar)、肉豬(hog)及豬崽(piglet)中的任一者。
  13. 如申請專利範圍第12項之疫苗組成物，其中該疫苗在單劑方案中為有效的。
  14. 如申請專利範圍第12項之疫苗組成物，其中該疫苗在兩劑方案中為有效的。
  15. 如申請專利範圍第14項之疫苗組成物，其中當該豬崽為約1至7日齡時，投予第一劑，且當該豬崽為2至5週齡時，投予第二劑。
  16. 如申請專利範圍第13項之疫苗組成物，其中該單劑是在約1至21日 齡、較佳在約1至7日齡時投予。
  17. 如申請專利範圍第8項中任一項之疫苗組成物，其中最小有效劑量是在約10與約106 log10TCID50之間。
  18. 如申請專利範圍第11項之疫苗組成物，其中該佐劑為脫油卵磷脂，其溶於油中，通常為輕質液體石蠟，及氫氧化鋁。
  19. 如申請專利範圍第11項之疫苗組成物，其中該佐劑為CpG/DEAE-聚葡萄糖/礦物油(dextran/mineral oil；TXO)。
  20. 一種經分離之豬流行性下痢病毒(PEDV)，其由在全長核苷酸層次上與SEQ ID NO：37至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列編碼，其中該核苷酸序列包含以下兩者之一：(1)在與SEQ ID NO：46中之位置551(緊鄰DAT之後)對應的胺基酸位置上具有脯胺酸殘基的ORF1a/1b蛋白質；及(2)在與SEQ ID NO：47中之位置973(緊鄰PFS之後)對應的胺基酸位置上具有組胺酸殘基的刺突蛋白。
  21. 一種治療或預防豬崽之起因於PEDV之疾病的方法，其包含當該豬崽為約1至7日齡時向該豬崽投予第一劑之如申請專利範圍第8項之疫苗組成物。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該投予另外包括當該豬崽為約2至5週齡時投予第二劑之該疫苗。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中向該豬崽投予2劑，且該親代大母豬雖然在育種前接種疫苗，但在分娩前不接種疫苗。
  24. 如申請專利範圍第22項之方法，其中向該豬崽投予2劑，且該親代大母豬在分娩前接種疫苗。
  25. 一種治療或預防豬崽之起因於PEDV之疾病的方法，其包含當該豬崽為約1至7日齡時，向該豬崽投予單一有效劑量之如申請專利範圍第8項之疫苗組成物，其中該母親大母豬未感染PEDV且在任何時間均未接種疫苗。
  26. 一種全長RNA聚核苷酸，其與如申請專利範圍第1項中之編碼DNA聚核苷酸或其互補序列對應。
  27. 如申請專利範圍第27項之RNA聚核苷酸，其為感染性純系。
  28. 一種質體或細菌人工染色體，其包含如申請專利範圍第1項中之編碼DNA聚核苷酸。
  29. 一種活減毒病毒組成物，其包含：繼代的(passaged)插入缺失變異型品系豬流行性下痢病毒(PEDV)，及載劑，其中該繼代的插入缺失變異型品系編碼具有一或多種以下胺基酸取代或缺失之一或多種以下蛋白質，或其經保守修飾之變異體：PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置633之離胺酸(K)(緊鄰TPKPL之後的K)、位置884之精胺酸(R)(緊鄰VYDPA之後的R)、位置959之丙胺酸(A)(緊鄰LIGGM之後的A)、位置345之纈胺酸(V)(緊鄰TNLSF之後)、位置48之白胺酸(L)(緊鄰APAVV之後的L)、位置1225之天冬胺酸(D)(緊鄰IESLV之後的D)、位置973之組胺酸(H)(緊鄰ALPFS之後的H)，及位置1272之蘇胺酸(T)(緊鄰DVFNA之後的T)；PEDV ORF 3蛋白質(SEQ ID NO：48)之位置189缺失白胺酸(L)(緊 鄰TANPL之後的L)、缺失138-144(緊鄰NGKAA之後)、位置8缺失酪胺酸(Y)(緊鄰LGLFO之後的Y)，及位置174-189之缺失(緊鄰LYLAI之後)；PEDV核衣殼(nucleocapsid)蛋白(SEQ ID NO：51)之位置27的組胺酸(H)(緊鄰LRVTN之後的H)；PEDV多蛋白1a/1b(SEQ ID NO：46)之位置1591之甲硫胺酸(M)(緊鄰VVKVS之後的M)、位置5087之絲胺酸(S)(緊鄰YLFST之後的S)，及位置6138之S(緊鄰WQTFS之後的S)；PEDV被膜(envelope)蛋白(SEQ ID NO：49)之位置62的苯丙胺酸(F)(緊鄰YRVYK之後的F)；及PEDV膜蛋白(SEQ ID NO：50)之位置5的丙胺酸(A)(緊鄰MSNG之後的A)及位置183之異白胺酸(I)(緊鄰IVYGG之後的I)。
  30. 如申請專利範圍第1項之活減毒病毒組成物，其中該繼代的插入缺失變異型品系編碼具有指定胺基酸取代之以下蛋白質或其經保守修飾之變異體：PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置633的K(緊鄰TPKPL之後的K)；及PEDV ORF 3蛋白質(SEQ ID NO：48)之位置189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)。
  31. 如申請專利範圍第1項之活減毒病毒組成物，其中該繼代的插入缺失變異型品系編碼具有指定胺基酸取代之以下蛋白質或其經保守修飾之變異體： PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置633之K(緊鄰TPKPL之後的K)及位置884之R(緊鄰VYDPA之後的R)；PEDV ORF 3蛋白質(SEQ ID NO：48)之位置189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)。
  32. 如申請專利範圍第1項之活減毒病毒組成物，其中該繼代的插入缺失變異型品系編碼具有指定胺基酸取代之以下蛋白質或其經保守修飾之變異體：PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置884的R(緊鄰VYDPA之後的R)及位置959的A(緊鄰LIGGM之後的A)；PEDV ORF 3蛋白質(SEQ ID NO：48)之位置189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)。
  33. 如申請專利範圍第1項之活減毒病毒組成物，其中該繼代的插入缺失變異型品系編碼具有指定胺基酸取代之以下蛋白質或其經保守修飾之變異體：PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置48之L(緊鄰APAVV之後的L)、位置345之V(緊鄰TNLSF之後)、位置884之R(緊鄰VYDPA之後的R)及位置959之A(緊鄰LIGGM之後的A)，PEDV ORF 3蛋白質(SEQ ID NO：48)之138-144之缺失(緊鄰NGKAA之後)及189缺失L(緊鄰TANPL之後的L)；及PEDV核衣殼蛋白(SEQ ID NO：51)之位置27之H(緊鄰LRVTN之後的H)。
  34. 如申請專利範圍第1項之活減毒病毒組成物，其中該繼代的插入缺失 變異型品系編碼具有指定胺基酸取代之以下蛋白質或其經保守修飾之變異體：PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置884之R(緊鄰VYDPA之後的R)、位置959之A(緊鄰LIGGM之後的A)、及位置1225之D(緊鄰IESLV之後的D)；PEDV ORF 3蛋白質(SEQ ID NO：48)之位置8缺失Y(緊鄰LGLFO之後的Y)、138-144之缺失(緊鄰NGKAA之後)，及位置174-189之缺失(緊鄰LYLAI之後)；PEDV多蛋白1a/1b(SEQ ID NO：46)之位置1591之M(緊鄰VVKVS之後的M)、位置5087之S(緊鄰YLFST之後的S)及位置6138之S(緊鄰WQTFS之後的S)；PEDV被膜蛋白(SEQ ID NO：49)之位置62之F(緊鄰YRVYK之後的F)；及PEDV膜蛋白之位置183之I(緊鄰IVYGG之後的I)。
  35. 如申請專利範圍第36項之品系，其中該品系包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：40、41、42、43、44或45的蛋白質或其經保守修飾之變異體。
  36. 如申請專利範圍第1項之活減毒病毒組成物，其中該繼代的插入缺失變異型品系編碼包含指定胺基酸取代之以下蛋白質或其經保守修飾之變異體：PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置884之R(緊鄰VYDPA之後)、位置959之A(緊鄰LIGGM之後)、位置973之H(緊鄰ALPFS之後的H)及位置1225之D(緊鄰IESLV之後的D)； PEDV ORF 3蛋白質(SEQ ID NO：48)之位置8缺失Y(緊鄰LGLFO之後的Y)、138-144之缺失(緊鄰NGKAA之後)，及位置174-189之缺失(緊鄰LYLAI之後)；PEDV多蛋白1a/1b(SEQ ID NO：46)之位置1591之M(緊鄰VVKVS之後的M)、位置5087之S(緊鄰YLFST之後的S)及位置6138之S(緊鄰WQTFS之後的S)；PEDV被膜蛋白(SEQ ID NO：49)之位置62之F(緊鄰YRVYK之後的F)；及PEDV膜蛋白之位置5之A(緊鄰MSNG之後的A)及位置183之I(緊鄰IVYGG之後的I)。
  37. 如申請專利範圍第1項之活減毒病毒組成物，其中該繼代的插入缺失變異型品系編碼包含指定胺基酸取代之以下蛋白質或其經保守修飾之變異體：PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO：47)之位置48之L(緊鄰APAVV之後)、位置345之V(緊鄰TNLSF之後)及位置1272之T(緊鄰DVFNA之後的T)；PEDV被膜蛋白(SEQ ID NO：49)之位置62之S(緊鄰YRVYK之後的S)；及PEDV核衣殼蛋白(SEQ ID NO：51)之位置27之H(緊鄰LRVTN之後的H)。
  38. 一種疫苗組成物，其包含活減毒變異型豬流行性下痢病毒(PEDV)及載劑，其中該品系編碼如申請專利範圍第30項中所列之取代或缺失中 之一或多者或其保守性變異體，其中該組成物能夠保護豬以防PEDV之變異型品系與原型品系兩者之攻毒，並預防或治療一或多種與PEDV感染相關之症狀，且其中該保護作用是根據選自由以下組成之群的終點來評估：脫水、發熱、下痢、嘔吐、不良泌乳表現、不良生殖表現、死亡，及預防或控制體重減輕或不能增加體重。
  39. 如申請專利範圍第30項之疫苗組成物，其中該載劑為稀釋劑。
  40. 如申請專利範圍第40項之疫苗組成物，其中該稀釋劑為無菌稀釋劑。
  41. 如申請專利範圍第40項之疫苗組成物，其另外包含佐劑。
  42. 如申請專利範圍第39項之疫苗組成物，其中該經保護的豬包括大母豬、小母豬、公豬、肉豬及豬崽中的任一者。
  43. 如申請專利範圍第43項之疫苗組成物，其在1日齡或大於1日齡的豬崽中為有效的。
  44. 如申請專利範圍第44項之疫苗組成物，其中該疫苗在單劑方案中為有效的。
  45. 如申請專利範圍第44項之疫苗組成物，其中該疫苗在兩劑方案中為有效的。
  46. 如申請專利範圍第46項之疫苗組成物，其中當該豬崽為約1至7日齡時，投予第一劑，且當該豬崽為2至5週齡時，投予第二劑。
  47. 如申請專利範圍第10項中任一項之疫苗組成物，其中最小有效劑量是在約10與約106 log10 TCID50 之間。
  48. 如申請專利範圍第42項之疫苗組成物，其中該佐劑為脫油卵磷脂，其溶於油中，通常為輕質液體石蠟，及氫氧化鋁。
  49. 如申請專利範圍第42項之疫苗組成物，其中該佐劑為CpG/DEAE-聚葡萄糖/礦物油(TXO)。
  50. 一種疫苗組成物，其包含活減毒變異型豬流行性下痢病毒(PEDV)及載劑，其中該組成物能夠保護豬以防PEDV之變異型品系與原型品系兩者之攻毒，並預防或治療一或多種與PEDV感染相關之症狀，且其中保護作用之達成是根據選自由以下組成之群的終點來確定：預防或控制PEDV感染症狀脫水、發熱、下痢、嘔吐、不良泌乳表現、不良生殖表現、死亡中的任一者，及預防或控制體重減輕或不能增加體重，其中該疫苗組成物中所用的病毒與PEDV SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：59至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
  51. 一種治療或預防豬崽之起因於PEDV之疾病的方法，其包含當該豬崽為約1至7日齡時向該豬崽投予第一劑之如申請專利範圍第39項之疫苗組成物，及當該豬崽為約2至5週齡時視情況投予第二劑之該疫苗。
  52. 如申請專利範圍第52項之方法，其中向該豬崽投予2劑，且該親代大母豬雖然在育種前接種疫苗，但在分娩前不接種疫苗。
  53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中向該豬崽投予1劑，且該親代大母豬在育種前與分娩前均接種疫苗。
  54. 一種治療或預防豬崽之起因於PEDV之疾病的方法，其包含首先向分娩前或育種前之該豬崽之大母豬投予如申請專利範圍第39項之疫苗組成物，隨後向出生後之該豬崽投予一或多劑的該疫苗組成物。
  55. 一種預防健康豬之起因於PEDV之疾病的方法，其包含首先用如申請專利範圍第39項之疫苗組成物接種該等豬，隨後每年或分娩前投予進 一步不活化之PEDV疫苗的劑。
  56. 如申請專利範圍第30項之組成物，其中該插入缺失變異型品系在3週齡豬中的毒力較大，但在7週齡豬中的毒力較小。
  57. 一種預防健康豬之起因於PEDV之疾病的方法，其包含首先在3週齡豬中用原型減毒活PEDV疫苗組成物接種該等豬，隨後用如申請專利範圍第30項之疫苗組成物第二次接種7週齡或大於7週齡的豬。
  58. 一種疫苗組成物，其包含減毒原型繼代PEDV品系及載劑，其中該PEDV品系包含編碼一或多種在以下位置具有取代之蛋白質的核酸序列：多蛋白1a/1b之位置814、1076、1564、1896、2310、2600、3247、3473或3522，如參考SEQ ID NO：52所確定；刺突蛋白之位置257、326、375、491、881、888、1277、1339或1358，如參考SEQ ID NO：54所確定；ORF 3之位置39或後續位置之截短，如參考SEQ ID NO：55所確定；被膜蛋白之位置69或62，如參考SEQ ID NO：56所確定；膜蛋白之位置208，如參考SEQ ID NO：57所確定；核衣殼蛋白之位置141、418、424或439，如參考SEQ ID NO：58所確定。
  59. 如申請專利範圍第59項之疫苗組成物，其中該PEDV品系包含一或多種以下取代或其保守性變異體：多蛋白1a/1b之位置814之V、位置1076之A、位置1564之F、位置1896之I、位置2310之H、位置2600之Y、位置3247之F、位置3473之V，或位置3522之R，如參考SEQ ID NO：52所確定；刺突蛋白之位置257之N、位置326之I、位置375之F、位置491之Y、 位置881之R、位置888之R、位置1277之F、位置1339之T或位置1358之L，如參考SEQ ID NO：54所確定；ORF 3之位置39或後續位置之截短，如參考SEQ ID NO：55所確定；被膜蛋白之位置69之I，如參考SEQ ID NO：56所確定；膜蛋白之位置208之T，如參考SEQ ID NO：57所確定；核衣殼蛋白之位置141之L、位置418之Q、位置424之N或位置439之I，如參考SEQ ID NO：58所確定。
  60. 一種疫苗組成物，其包含活減毒原型豬流行性下痢病毒(PEDV)；及載劑，其中該組成物能夠保護豬以防PEDV之變異型品系與原型品系兩者之攻毒，並預防或治療一或多種與PEDV感染相關之症狀，且其中保護作用之達成是根據選自由以下組成之群的終點來確定：預防或控制PEDV感染症狀脫水、發熱、下痢、嘔吐、不良泌乳表現、不良生殖表現、死亡中的任一者，及預防或控制體重減輕或不能增加體重，其中該病毒為如申請專利範圍第60項中之品系。
  61. 一種預防健康豬之起因於PEDV之疾病的方法，其包含首先在3週齡豬中用如申請專利範圍第59項之原型減毒活PEDV疫苗組成物接種該等豬，隨後用插入缺失變異型病毒之疫苗組成物第二次接種7週齡或大於7週齡之豬。
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