CN114438040A

CN114438040A - 一种分泌具有pedv中和活性抗体的单克隆细胞株及其应用

Info

Publication number: CN114438040A
Application number: CN202011216592.2A
Authority: CN
Inventors: 曹永长; 薛春宜; 柳玉芳
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明公开了一种分泌具有PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株及其应用，属于生物技术领域。该单克隆细胞株名称为杂交瘤细胞株2B11，保藏编号为CCTCC NO：C2020188，于2020年9月26日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。其能用于制备具有PEDV中和活性抗体。本发明还提供了一种检测PEDV疫苗效价的方法，特异性好，灵敏度高，操作简便，能够快速、批量检测免疫猪血清中PEDV中和抗体水平，能够对PEDV疫苗免疫效果进行评价，补充了目前快速PEDV抗体水平方法上的空缺。

Description

一种分泌具有PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一种分泌具有PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

PEDV是猪流行性腹泻(PED)的病原，为单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目、冠状病毒科、α冠状病毒属。这种病毒感染后会导致断奶仔猪腹泻、哺乳仔猪脱水，且使猪小肠壁变薄、绒毛萎缩、严重情况下会直接死亡。感染这种病毒后的症状与其它冠状病毒感染症状非常类似，因而临床诊断无法区分。这使得腹泻在临床生产中的控制变得极为困难，同时对疫苗的临床使用提出了巨大挑战。该病可以感染各年龄段的猪群，哺乳仔猪的发病率和死亡率较高，尤其是7日龄以内的哺乳仔猪，感染后死亡率可达100％。

疫苗是防控PED的主要手段，但如何有效评估免疫后抗体水平是困扰全行业的难题。ELISA因其可大批量快速检测样品的优点，已经被多次证明是一个理想的抗体水平评估工具。目前，市面上关于PEDV的ELISA抗体检测试剂盒主要有两个，一个是由加拿大BIOVET公司生产的抗N蛋白的抗体检测试剂盒，可用于评估猪群PEDV的感染情况。另一个是由韩国安捷公司生产的针对乳汁中IgA抗体的定量检测试剂盒，可用于评估母猪乳汁中IgA的水平。

抗体分为中和抗体和非中和抗体，中和抗体与病毒保护之间的关系已经在很多病毒疫苗筛选过程中得到了证明。IgA和抗N蛋白的抗体含量并不足以评估疫苗的有效性，两者与免疫保护之间的相关性缺乏理论依据。虽然噬斑减少试验是检测PEDV中和抗体水平的金标准，此方法具有特异性好，灵敏度高等优点，但同时存在试验周期长，需要操作活病毒和细胞、实验环境要求高等缺点，十分不利于在猪场等简易条件下大规模应用。由于冠状病毒的特殊性，检测PEDV的中和抗体ELISA检测试剂盒，始终未被开发出来。因此中和抗体竞争ELISA方法的建立是解决PEDV免疫后抗体监测和评估难的理想方案。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种分泌具有 PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株。

本发明的另一目的在于提供一种单克隆细胞株的应用。

本发明的再一目的在于提供上述检测方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种分泌具有PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株，名称为杂交瘤细胞株 2B11，保藏编号为CCTCC NO：C2020188，于2020年9月26日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

所述的分泌具有PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株在制备具有PEDV中和活性抗体中的应用。

一种具有PEDV中和活性抗体，由上述单克隆细胞株制备得到。

所述的具有PEDV中和活性抗体在检测PEDV疫苗效价中的应用。

所述的PEDV疫苗效价指的是PEDV疫苗免疫猪后血清中含有的中和抗体水平。

一种检测PEDV疫苗效价的方法，包括如下步骤：

(1)将显色标记物标记具有PEDV中和活性抗体，得到标记抗体；

(2)将标记抗体与待测血清共同与PEDV反应，根据OD_450mm计算阻断前和阻断后抑制率，判断待测血清的阴阳性；

(3)根据待测血清的抑制率和标准曲线，计算得到PEDV疫苗效价。

步骤(1)中所述的显色标记物优选为辣根过氧化物酶(HRP)。

步骤(1)中所述的标记优选为通过使用显色标记物标记试剂盒进行操作。

所述的显色标记物标记试剂盒优选为辣根过氧化物酶抗体标记试剂盒。

步骤(2)优选具体包括如下步骤：

1)包被抗原：将包被抗原PEDV全病毒包被于酶标板，封闭，清洗，得到含PEDV的酶标板；

2)将待测血清和标记抗体加入含PEDV的酶标板中进行反应；

3)反应完毕后，清洗；加入显色剂，避光显色和加入终止液，然后测定 OD_450mm；

4)根据OD_450mm计算阻断前和阻断后抑制率，判断待测血清的阴阳性。

步骤1)中所述的包被的具体步骤如下：将含PEDV的溶液加入酶标板中， 4℃包被过夜，PBST清洗。

所述的含PEDV的溶液优选为使用包被液稀释PEDV浓缩液得到的溶液。

所述的包被液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

所述的清洗的次数优选为3次。

步骤1)中所述的封闭优选为使用3％(w/v)BSA溶液封闭2h。

步骤1)中所述的清洗优选为使用PBST清洗3次。

步骤1)中所述的PEDV的包被浓度优选为20μg/mL。

步骤2)中所述的标记抗体的浓度优选为0.2μg/mL。

所述的PEDV和所述的标记抗体的加入量为各100μL。

步骤2)中所述的加入的方式优选为：将待测血清和标记抗体混合后再加入含PEDV的酶标板；更优选为：将待测血清用PBS进行倍比稀释，将得到的稀释液分别和标记抗体等体积混合后再加入含PEDV的酶标板。

步骤2)中所述的反应的条件优选为37℃孵育1h。

步骤3)中所述的清洗优选为用PBST清洗。

步骤3)中所述的显色剂优选为TMB显色。

步骤3)中所述的显色剂优选通过如下步骤制备得到：将TMB干粉溶于 DMSO，得到TMB母液，避光保存于-20℃；使用前将浓度为0.2mol/L的Na₃HPO₄溶液与浓度为0.1mol/L柠檬酸溶液按体积比混匀后加入TMB母液和H₂O₂溶液，得到TMB工作液(即显色剂)，其中，TMB的浓度为0.1mg/mL，H₂O₂的浓度为9×10^-3％(v/v)。

所述的TMB母液的浓度优选为1mg/mL。

步骤3)中所述的终止液优选为H₂SO₄；更优选为浓度为2mol/mL的H₂SO₄。

步骤4)中所述的抑制率按如下公式计算得到：抑制率＝(1-OD₄₅₀待测样品 OD值/空白对照OD值)*100％。

步骤4)中所述的判断标准优选如下：阴性血清抑制率的平均值

为18.6，标准差(SD)为2.28；取

为阴性临界值，为21.9；

为阳性临界值，为23.6；介于两者之间的为可疑，需进行二次检测，若二次结果仍为可疑，则确定为阳性。

步骤(3)中所述的标准曲线是依据已知效价的血清和标记抗体按步骤(2) 操作反应，得到中和效价和抑制率相关的曲线；优选如下：Y＝14.48x+17.626， X为中和效价，Y为抑制率。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明建立了一种可检测猪群免疫后猪群猪流行性腹泻病毒(PEDV)中和抗体水平的方法，特别地，该方法特异性好，灵敏度高，操作简便，能够快速、批量检测免疫猪血清中PEDV 中和抗体水平，能够对PEDV疫苗免疫效果进行评价，补充了目前快速PEDV 抗体水平方法上的空缺。

附图说明

图1是PEDV病毒粒子纯化鉴定结果图；其中，A为PEDV蔗糖密度梯度超速离心照片，B为SDS-PAG检测结果，C为Western blot检测结果；B和C 中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为蔗糖密度梯度离心40％-60％的产物，泳道 2为蔗糖密度梯度离心20％-40％的产物。

图2是cELISA敏感性测试结果图。

图3是cELISA与中和试验相关性的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

PEDV猪阳性血清由温氏食品集团股份有限公司研究院周庆丰博士惠赠； PEDVGDS01由本实验室分离，保藏(PEDV GDS01已在文献“Neutralizing antibodies againstporcine epidemic diarrhea virus block virus attachment andinternalization.Gong et al.Virology Journal(2018)15:133”中公开)；SP2/0细胞由武汉病毒研究所鄢慧民研究员赠送(SP2/0细胞可通过CCTCC购买得到)。SPF级 BABL/c小鼠购自中山大学实验动物中心；Vero细胞由本实验室传代保存(Vero 细胞可通过CCTCC购买得到)；无EDTA胰酶购自Invitrogen公司；DMEM培养基、胰酶、胎牛血清购自GIBCO公司；低熔点琼脂糖购自TaKaRa公司；EZ-Link^TM Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit购自Thermo公司。

实施例1

(1)PEDV全病毒扩繁：

提前铺好细胞培养瓶t175，待单层的Vero细胞长满，使用PBS(pH7.4、 0.01mol/L)洗三次，再加入不含血清的DMEM培养基19mL和1mL的PEDV GDS01病毒液(病毒滴度是10⁷TCID₅₀/mL)以及200μg无EDTA的胰酶，使病毒吸附进入细胞，37℃培养箱孵育1h；弃上清，加入20mL不含血清的DMEM 培养基及200μg无EDTA胰酶，37℃培养箱继续孵育1-2d，直到病变达到90％时，将维持液和病变细胞用离心管收集起来，冻融2-3次；

(2)PEDV全病毒浓缩：

将大量培养的PEDV GDS01病毒液，10000rpm、4℃离心30min去细胞碎片。本实验采用聚乙二醇(PEG 6000)浓缩病毒，蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒。具体操作为：在除去细胞碎片的病毒液中加入6％-7％(w/v)的PEG 6000，4℃过夜；10000rpm、4℃离心1h，用少量PBS洗脱。配制20％、40％、60％三个不连续蔗糖浓度梯度，最上层加入病毒浓缩液进行离心。40000rpm、4℃离心2h，收集各层条带。PBS稀释各层条带，用30KD超滤管超滤病毒以洗去蔗糖。PEG 浓缩和超滤管超滤有效减少了病毒超离的次数，避免了因超离时间过长导致病毒纤突蛋白脱落。保证冠状病毒粒子完整性有利于免疫实验的成功进行。各层样品经SDS-PAGE和Western blot鉴定病毒粒子的纯化效果，结果如图1所示，表明经过纯化，病毒被浓缩，且病毒蛋白完好。

(3)PEDV单克隆抗体制备

纯化的病毒经0.5％(v/v)β-丙内酯灭活后，经弗氏佐剂乳化后对6-8周龄的BALB/c雌性小鼠进行免疫，具体免疫途径、免疫剂量及佐剂选择见表1。四次免疫后，取小鼠脾脏细胞，与SP2/0细胞融合。融合前需准备饲养层细胞，方法如下：取8周龄的雌性SPF BALB/c小鼠，摘眼球放血，此血清为阴性血清。脱颈椎处死后置于75％酒精中浸泡10min。于超净工作台中剪开腹部皮肤，露出腹膜，注射器吸3mL含20％胎牛血清的DMEM培养基注入腹腔，原位吸出放于50mL离心管中，取新鲜培养基重复操作一次获取所需的巨噬细胞。剪开腹膜，无菌取出脾脏放入匀浆器中。在匀浆器中加3mL含20％胎牛血清的培养基，研磨分离脾细胞，加3mL含20％胎牛血清的培养基混匀后静置5min，移液枪吸取3mL上清于 50mL离心管，继续加3mL含20％胎牛血清的培养基于匀浆器中，研磨混匀后静置，吸取3mL上清，重复洗涤2次。将收集的上清放入巨噬细胞管中。1000rpm 离心10min去上清，PBS重悬后细胞计数，稀释至10⁵/mL铺于96孔板，每孔100μL，细胞培养箱过夜培养备用。

取经过加强免疫的BALB/c小鼠，摘眼球放血(阳性血清)后颈椎脱臼处死。用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开腹膜，暴露出脾脏。用镊子夹住脾脏，放入无菌的匀浆器中。加3mL含20％胎牛血清的培养基于匀浆器中，研磨出脾细胞，加3mL含20％胎牛血清的培养基，静置5min，吸取3mL含20％胎牛血清的上清于 50mL离心管，继续加3mL含20％胎牛血清的培养基于匀浆器中，混匀后静置 5min，再吸取3mL上清，如此重复洗涤2次。1000rpm离心10min去上清，PBS重悬细胞后计数。将SP2/0细胞与脾细胞按细胞数1：5比例混匀，1500rpm离心10min。弃上清，指尖轻敲管底，沉淀微微松动后，将离心管置于37℃水浴锅中保持温度，向其缓慢加入1mL预温的50％(w/v)PEG，边加边用枪头微微搅拌，此过程必须在1min内完成。其后在3min内匀速加入10mL预温的培养基。1000rpm 离心5min，去上清，37℃放置8min。用HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中， 250μL/孔。37℃、5％CO₂培养箱中培养。

融合10天，待细胞上清微微变黄后。每孔取100μL细胞上清，为待筛选的单抗，通过用间接免疫荧光法检测。具体步骤为：Vero细胞传代至96孔板中，待细胞长至90％-100％融合度，以每孔100TCID50/mL的量接种病毒；待细胞明显病变(约24-36h)，弃上清，PBS洗3次，4％的多聚甲醛固定15min；弃上清，PBS洗3次，加入100μL浓度为0.5％(v/v)Triton X-100进行细胞通透15min；弃上清，PBS洗3次，加入3％BSA，37℃封闭1h；弃上清，PBS 洗3次，加入上述待筛选的细胞上清100μL，37℃孵育1h；弃上清，PBS洗3 次，加入100μL用PBS按体积比1：500稀释的二抗(该二抗为Proteintech公司的Cy3标记羊抗鼠IgG抗体)，37℃孵育1h；弃上清，PBS洗3次，荧光显微镜进行观察，拍照。

通过该方法筛选到10株PEDV单抗。将阳性杂交瘤细胞稀释至每板少于100 个细胞数，接种至96孔板筛选单克隆杂交瘤细胞。再将单克隆杂交瘤细胞腹腔注射回10-12周雌性小鼠腹腔制备腹水，约10天后对腹部明显鼓胀、行动迟滞的小鼠抽取腹水，12000rpm离心10min收集上清，冻于-80℃保存备用。

表1小鼠免疫程序

(4)单克隆抗体的Protein G柱纯化

按照Protein G Sepharose 4Fast Flow说明书中步骤，柱子经20％(v/v)乙醇溶液浸泡过液，用3倍柱体积ddH₂O、3倍柱体积结合缓冲液(Binding Buffer) 冲洗。2mL腹水用预冷的结合缓冲液稀释至10mL，用0.45μm滤器过滤掉脂肪等杂质。向纯化层析柱中缓慢加入样品，同时收集纯化后的流出液。用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗，再用预冷的洗脱液(Elute Buffer)10mL洗脱收集，用加有 1mL Tris-HCl溶液(pH9.0、1mol/mL)的15mL离心管收集洗脱液，在收集洗脱液的同时，逐滴加入2mL Tris-HCl，以免抗体变性失活。纯化结束之后，取少量抗体电泳检测抗体的纯化效果，纯度合格后，BCA定量。稀释至一定浓度后按1：100加入蛋白酶抑制剂，分装，标记、冷冻保存。

(5)单克隆抗体中和活性及其效价的测定

首先将PEDV GDS01病毒液用碳酸盐缓冲液(pH9.6、0.05mol/L)稀释至200 PFU/mL。单克隆抗体进行倍比稀释后各梯度稀释抗体与病毒液按体积比1：1混合(共计1mL)，37℃孵育1h，接种至长满单层Vero细胞的6孔板中，37℃孵育 1h，PBS洗去未特异性结合的病毒，并加入含1％低熔点琼脂糖的病毒生长培养基，静置20min，待其凝固后37℃细胞培养箱倒置培养，36h后用0.03％中性红染色30min，噬斑计数，取不产生斑的抗体最高稀释度为单克隆抗体的中和效价。根据国际标准，通过该方法，成功筛选到两株高结合活性的中和抗体2B11 (2.5μg/mL＜NC50＜5μg/mL)、2G8(5μg/mL＜NC50<10μg/mL)。将分泌2B11 抗体的单克隆细胞株命名为杂交瘤细胞株2B11，保藏编号为CCTCC NO： C2020188，于2020年9月26日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

(6)辣根过氧化物酶标记单克隆中和抗体

按照EZ-Link^TM Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit说明书步骤，取10mL偶联缓冲液加入90mL PBS配制成MCB。加100μL MCB至6mg的 2-MEA。加5mg纯化后的2B11抗体至2-MEA小瓶中，37℃孵育90min。使用 30mL MCB平衡柱子，待混合物冷却至室温，上柱，加入MCB洗脱，第6-10个 0.5mL回收抗体效率高，Nanodrop检测回收浓度。回收后的抗体加入活化的HRP (activated HRP)，室温孵育1-2h。透析过夜，稀释至5mL，取样检测，其余的加入50％(v/v)的甘油和0.03％(w/v)的叠氮钠，BCA定量，放至-80℃备用。

(7)酶标记单克隆抗体质量鉴定

取0.3mL未加入甘油的HRP-2B11稀释10倍，全波长酶标仪在280nm和 403nm波长下进行吸光度检测，带入公式确定HRP-2B11酶结合物量。酶结合量(mg/mL)＝A₄₀₃×0.40×稀释倍数。HRP 2B11含量 (mg/mL)＝(A₂₈₀-A₄₀₃×0.3)×0.62×稀释倍数。

代入公式计算偶联效率：

HRP含量＝0.213*0.4*10＝0.852mg/mL。

HRP-2B11的含量＝(0.194-0.213*0.3)*0.62*10＝0.806mg/mL。

标记抗体总量与总抗体比＝标记抗体总量/抗体总量＝0.806mg/mL*5mL/5mg*100％＝80.6％。

(8)ELISA确定抗原最佳包被量及酶标抗体使用浓度

按步骤(1)和(2)大量扩繁PEDV GDS01，浓缩病毒100倍，经蔗糖梯度纯化得到包被抗原，BCA法定总蛋白量。采用棋盘法，每个待测样品重复3次。包被液(pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)倍比稀释抗原，起始稀释浓度为 80μg/mL。纵向加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜。次日弃上清，200μL PBST洗3次。200μL 3％(w/v)的BSA，室温封闭2h，PBST洗3次。分别加入 1：2稀释阳性血清(3号中和效价为1:32，通过噬斑减少实验测得)和阴性血清(33号)，每孔100μL，室温孵育1h，PBST洗3次。横向加入按体积比1:500、 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释经过HRP-2B11(每孔100μL)，37℃孵育1 h。洗3次，100μL TMB显色，50μLH₂SO₄(浓度为2mol/L)终止反应，酶标仪测定OD450nm值。选择阳性血清抑制率/阴性血清抑制率最大的为最佳包被量和酶标抗体工作浓度。显色剂的配制为30mg TMB干粉(购自生工)溶于30mL DMSO(购自Thermo公司)，避光保存于-20℃；使用前将4.5mL 0.2mol/L的 Na₃HPO₄与4.5mL 0.1mol/L柠檬酸混匀后加入1ml配好的TMB溶液及3μl 30％(v/v)H₂O₂。

ELISA中相应的抗原包被浓度和酶标抗体的工作浓度均会影响该方法的灵敏度和准确度，而且两者之间有一定的关联性。如表2显示当包被抗原与酶标抗体的浓度为特定值时，阳性血清和阴性血清的比值最大，此条件为两者的最佳反应浓度。抑制率计算公式为：抑制率＝(1-OD₄₅₀待测样品OD值/空白对照OD值) *100％。根据试验结果，当包被浓度20μg/mL、酶标HRP-2B11(初始浓度是 0.806mg/mL)浓度稀释1：4000时，P/N差异最大，此为二者的最佳稀释度。

表2最佳包被浓度及HRP-2B11稀释度的确定(％)

(9)血清稀释度的确定

根据上面确定的酶标抗体工作浓度，将两份血清样品分别设1：1、1：2、1： 4、1：8样品稀释度检测(设3个重复)，阳性血清抑制率/阴性血清抑制率比值最大时的稀释度为血清样品的最佳稀释度。

取PEDV阳性血清、阴性血清，按体积比1：1、1：2、1：4、1：8样品稀释度检测，当血清标本稀释度为1：2时，P/N差异最大，为最佳血清稀释度(表 3)。

表3最佳包被浓度及样本稀释度的确定(％)

(11)PEDV抗体竞争ELISA检测方法的检测

1)cELISA阴阳性判断标准的确定

用已建立的方法检测10份PEDV阴性血清(该阴性血清是没有接种疫苗取得的样本，通过RT-PCR和IFA检测确定为阴性)，测定其OD_450nm值，带入公式换算成抑制率

每个样品测定3次，计算标准差(SD)，然后建立相关标准进行判断。根据统计学原理设置

和

分别为阴、阳性临界值，介于两者之间的为可疑，进行二次检测，若二次结果仍为可疑，则确定为阳性。取10 份阳性血清绘制阳性数值分布图。分析阳性血清是否满足临界值的设定，结果见表4。阴性血清抑制率的平均值

为18.6，标准差(SD)为2.28。取

为阴性临界值，为21.9。

为阳性临界值，为23.6。介于两者之间的为可疑，需进行二次检测，若二次结果仍为可疑，则确定为阳性。阳性样品测定结果均高与阳性设定值，符合要求。

表4 cELISA检测10份阴性样品结果

2)敏感性

取中和效价1：64的猪血清，用PBS进行倍比稀释，得到1：32、1：16、 1：8、1：4、1：2的一系列稀释血清；50μL各稀释度血清与等体积HRP-2B11 (1：4000)混匀；PBST洗全病毒包被过夜的ELISA板3次，每孔加入100μL 混合液，37℃孵育1h；弃上清，PBST洗3次，TMB显色，H₂SO₄中止反应， OD_450nm读值。EXCEL软件建立吸光值和效价标准曲线。见图2。曲线呈线性关系，在抗体中和效价在1：2以上，线性回归方程为Y＝-4.8951X+6.144，决定系数R²＝0.9878。

3)特异性

按照已建立的反应条件检测TGEV、SIV、PDCoV、PEAV、PrV和PRRSV等6 种背景来源清晰的阳性血清(病毒感染)，换算成抑制率均低于21.9％(表5)，证明两者之间无交叉反应性，说明酶标抗体的检测特异性良好。

表5 cELISA检测不同血清交叉反应性(n＝5)

4)重复性

批内重复系数：取3份样品，使用同批次的酶标板，同等条件下连续检测5 天，每天1次，计算批内变异系数；

批间重复系数：取3份样品，使用不同批次的酶标板，同等条件下连续检测5天，每天1次，计算批间变异系数；

变异系数CV(Coefficient of Variance)＝标准偏差(SD)/平均值

结果显示批内和批间变异系数均小于10％(表6)，说明该方法稳定性和重复性良好。

表6 c-ELISA测得样品板内板间变异系数分析

(12)PEDV抗体竞争ELISA检测方法的初步应用

(1)检测血清样本中的抗体效价

取阴阳性血清各5份与PEDV在37℃孵育1h后进行cELISA检测，根据反应前后阴阳性血清的抑制率变化情况对阻断效果进行判断。结果如表7，经过病毒阻断之后的阳性血清，cELISA换算结果显示抑制率出现了显著的降低。

表7阻断试验结果

用已建立的反应条件检测背景来源清晰、中和效价(噬斑确定的效价)不同的PEDV阳性血清(30份)和阴性血清(10份)，在此基础上确定抑制率与中和效价两者之间的关系。两者之间线性方程如图3所示，为Y＝14.48x+17.626(X 为中和效价，Y为抑制率)，拟合度为0.9591。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种分泌具有PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株，其特征在于：所述的单克隆细胞株的名称为杂交瘤细胞株2B11，保藏编号为CCTCC NO：C2020188，于2020年9月26日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述的分泌具有PEDV中和活性抗体的单克隆细胞株在制备具有PEDV中和活性抗体中的应用。

3.一种具有PEDV中和活性抗体，其特征在于：由权利要求1所述的单克隆细胞株制备得到。

4.权利要求3所述的具有PEDV中和活性抗体在检测PEDV疫苗效价中的应用。

5.一种检测PEDV疫苗效价的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将显色标记物标记具有PEDV中和活性抗体，得到标记抗体；

6.根据权利要求5所述的检测PEDV疫苗效价的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的显色标记物为辣根过氧化物酶；

步骤(1)中所述的标记为通过辣根过氧化物酶抗体标记试剂盒进行操作。

7.根据权利要求5所述的检测PEDV疫苗效价的方法，其特征在于：

步骤(2)具体包括如下步骤：

2)将待测血清和标记抗体加入含PEDV的酶标板中进行反应；

3)反应完毕后，清洗；加入显色剂，避光显色和加入终止液，然后测定OD_450mm；

8.根据权利要求7所述的检测PEDV疫苗效价的方法，其特征在于：

步骤1)中所述的包被的具体步骤如下：将含PEDV的溶液加入酶标板中，4℃包被过夜，PBST清洗；

步骤1)中所述的封闭为使用3％(w/v)BSA溶液封闭2h；

步骤1)中所述的清洗为使用PBST清洗3次；

步骤1)中所述的PEDV的包被浓度为20μg/mL；

步骤2)中所述的标记抗体的浓度为0.2μg/mL；

所述的PEDV和所述的标记抗体的加入量为各100μL；

步骤2)中所述的加入的方式为：将待测血清和标记抗体混合后再加入含PEDV的酶标板；

步骤2)中所述的反应的条件为37℃孵育1h；

步骤3)中所述的清洗为用PBST清洗；

步骤3)中所述的显色剂为TMB显色；

步骤3)中所述的终止液为H₂SO₄；

步骤4)中所述的抑制率按如下公式计算得到：抑制率＝(1-OD₄₅₀待测样品OD值/空白对照OD值)*100％；

步骤4)中所述的判断标准如下：阴性血清抑制率的平均值

为18.6，标准差(SD)为2.28；取

为阴性临界值，为21.9；

9.根据权利要求8所述的检测PEDV疫苗效价的方法，其特征在于：

所述的含PEDV的溶液为使用包被液稀释PEDV浓缩液得到的溶液；

所述的包被液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

10.根据权利要求5所述的检测PEDV疫苗效价的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的标准曲线如下：Y＝14.48x+17.626，X为中和效价，Y为抑制率。