CN110016078A - 一种基于pedv n蛋白特异性纳米抗体的阻断elisa的检测方法及其应用 - Google Patents

一种基于pedv n蛋白特异性纳米抗体的阻断elisa的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方法及其应用，本发明以PEDV N蛋白包被酶标板，纳米抗体BioNb2为阻断抗体，通过待检血清样品抑制纳米抗体BioNb2与PEDV N蛋白结合，以检测血清中猪流行性腹泻病毒特异性抗体；本发明的阻断ELISA方法能够排除抗原中的杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性，且操作简单，易于大范围推广，在猪流行性腹泻病毒的血清诊断方面具有良好的应用前景；本发明通过大量的实验优化阻断ELISA反应条件，使该方法用于猪流行性腹泻病毒抗体检测具有良好的重复性、特异性和灵敏性，与目前已有的商品化试剂盒相比，具有简便、快速、成本低廉等优势。

Description

一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方 法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫工程技术领域，更具体的说是涉及一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方法及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪易感的急性高度接触性传染性肠道疾病，其主要特征为严重的水样腹泻、呕吐、脱水、少食或不食、哺乳仔猪死亡率为100％。该病是目前危害养殖业最严重的疾病之一，每年给全球养猪业带来巨大的经济损失。PEDV能够感染各个年龄段的猪，成年猪主要表现为体重下降和营养不良等，但对一周龄以内的哺乳仔猪是致死性。该病于1791年首次发生于英国并在欧洲流行。我国是1973年首次在上海猪群检测到该病毒，随后一直以散在形式发生，直到2010年10月，PEDV高毒力变异毒株的出现并迅速传遍全国，引起PED在中国的全面爆发，导致100多万头哺乳仔猪的死亡，给中国养猪业带来几乎毁灭性的打击。PEDV属于冠状病毒科的冠状病毒属(Coronavirus)成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，PEDV的基因组长度约为28kb，编码至少7个开放阅读框，包括非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)和结构蛋白(核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(M)，糖基化纤突蛋白(S)和包膜蛋白(E)。其中，PEDV N蛋白是一种与病毒复制、转录和组装相关的磷酸化的蛋白，在宿主免疫中具有重要的作用。已有研究报道，在PEDV感染早期，宿主能够产生高水平的抗N蛋白的抗体。此外，N蛋白高度保守，因此被认为是早期诊断和疫苗研发的靶蛋白之一。
过去几十年以来，大量检测PEDV的方法被报道。由于PED引起的临床症状与其他腹泻疾病的临床症状相似，比如传染性胃肠炎病，因此需要借助分子生物学和免疫学方法诊断该疾病。传统的PEDV诊断方法都是基于实验室检测的，包括病毒分离试验、反转录-聚合酶链式反应试验、间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。然而，这些传统的方法耗时、昂贵，低特异性和低灵敏性且需要专业的设备及专业的操作人员。此外，样品间的交叉污染和运输延误都有可能造成结果判断不准确等问题。间接ELISA和竞争或阻断ELISA已被广泛应用于PEDV临床样品的检测，但这些方法是建立在PEDV特异性单克隆抗体或多克隆抗体的基础上的，具有费用昂贵、耗时、产量低和不稳定性等缺点。
抗体介导的免疫检测方法因其方便灵敏而被广泛应用。纳米抗体是一种天然缺失轻链和重链第一个恒定区的特殊IgG，它存在于骆驼科动物体内。与传统抗体的抗原结合片段不同，纳米抗体的抗原结合片段由一个单独的结构域构成，即重链抗体可变区(variabledomains of Camellidae heavy chain-only antibodies，VHH)，VHH分子量较小，约15kDa左右，是已知的最小的具有完整抗原结合功能的抗体片段。与传统的抗体相比，纳米抗体具有稳定性高，可溶性好、结合抗原能力强、亲和力强、免疫原性小和能在细菌体内大量表达等特点。因此，基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体建立一种快速、灵敏、准确和低成本的诊断方法为临床监测宿主体内的抗体水平提供有力的工具，从而为养猪业的健康发展保驾护航，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N(PEDV N蛋白)的特异性纳米抗体BioNb2，建立了一种快速、灵敏、准确和低成本的阻断ELISA方法，用于猪流行性腹泻病毒抗体的监测，流行病学调查及疫苗免疫效果的评价等。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N的特异性纳米抗体BioNb2的构建方法，具体步骤如下：
(1)Nb2-Avi-Tag基因扩增
以pCANTAB-5E-Nb2为模板，pET21b-Nb2-F/pET21b-Nb2-R为引物PCR扩增获得Nb2-Avi-Tag基因；
(2)重组蛋白Nb2-Avi-Tag的原核表达和纯化
将步骤(1)获得的Nb2-Avi-Tag基因连入原核表达载体pET21b中，转入表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达和纯化，获得纯化的重组蛋白Nb2-Avi-Tag；
(3)纯化的Nb2-Avi-Tag重组蛋白进行生物素标记
将步骤(2)获得的纯化的重组蛋白Nb2-Avi-Tag调整为1mg/ml，利用生物素连接酶对重组蛋白Nb2-Avi-Tag进行生物素标记，将标记好的纳米抗体命名为BioNb2。
进一步，步骤(1)所述引物pET21b-Nb2-F/pET21b-Nb2-R的引物如下：
pET21b-Nb2-F：CGGGATCCGCAGGTCCAACTGCAGGAG；SEQ ID NO.2；
pET21b-Nb2-R：CCCAAGCTTTTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCGAAATATCGTTCAGACCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC；SEQ ID NO.3；
其中下划线分别标记BamHI和HindIII限制性内切酶位点；下游引物中斜体标记Avi-Tag序列。
进一步，一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体BioNb2的阻断ELISA的检测方法，包括以下步骤：
1)在酶标板上加入100ng/孔的PEDV N蛋白，包被缓冲液为0.1M pH 7.2的CBS，4℃包被过夜，使用包含0.5％Tween-20的PBS’T洗板5次；
2)每孔加入200μl含2.5％脱脂奶粉的PBS’T封闭液，25℃封闭1h，PBS’T洗3次；
3)将待检血清按照1：5的比例进行稀释后，100μl/孔，设置标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，25℃孵育2h，PBS’T洗3次；
4)将生物素标记的纳米抗体BioNb2进行1：8000稀释后，100μl/孔，25℃孵育30min，PBS’T洗3次；
5)将HRP标记的链和亲霉素二抗进行1：2000稀释后，25℃孵育1h，PBS’T洗3次；
6)加入TMB底物溶液，100μl/孔，25℃避光孵育15min，每孔加入终止液50μl 3MH2SO4终止反应；
7)在酶标仪中读取OD450值，计算阻断率PI值，PI(％)＝100％×[1-(待检血清OD450/阴性血清OD450)]；
8)判断标准如下：当阻断率≥29.27％时，判断为血清抗体阳性；当阻断率≤20.28％时判断为阴性；当29.27％＞阻断率＞20.28％，则判断为可疑，需要重复检测，如果仍低于29.27％，则判定为阴性。
进一步，一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体BioNb2的阻断ELISA的检测方法，在检测猪体内PEDV抗体水平中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方法及其应用，本发明以PEDV N蛋白包被酶标板，纳米抗体BioNb2为阻断抗体，通过待检血清样品抑制纳米抗体BioNb2与PEDV N蛋白结合，以检测血清中猪流行性腹泻病毒特异性抗体；本发明的阻断ELISA方法能够排除抗原中的杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性，且操作简单，易于大范围推广，在猪流行性腹泻病毒的血清诊断方面具有良好的应用前景；本发明通过大量的实验优化阻断ELISA反应条件，使该方法用于猪流行性腹泻病毒抗体检测具有良好的重复性、特异性和灵敏性，与目前已有的商品化试剂盒相比，具有简便、快速、成本低廉等优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明PCR扩增Nb2-Avi-Tag基因；
其中，M，DNA Marker；1，Nb2-Avi-Tag基因；
图2附图为本发明Nb2-Avi-Tag基因与pET21b载体分别进行双酶切后的电泳图；
其中，1，Nb2-Avi-Tag基因进行双酶切后的电泳图；2，pET21b载体进行双酶切后的电泳图；
图3附图为本发明菌落PCR鉴定重组质粒pET21b-Nb2-Avi-Tag；
其中，M，DNA Marker；4-12，重组质粒pET21b-Nb2-Avi-Tag；
图4附图为本发明重组蛋白Nb2-Avi-Tag表达SDS-PAGE电泳检测图；
其中，M，蛋白Marker；1，未诱导空载体菌体；2，IPTG诱导空载体菌体；3，未诱导Nb2-Avi-Tag菌体；4，IPTG诱导Nb2-Avi-Tag菌体；
图5附图为本发明重组蛋白Nb2-Avi-Tag纯化SDS-PAGE电泳检测图；
其中，M，蛋白Marker；1，纯化的重组蛋白Nb2-Avi-Tag；
图6附图为本发明纳米抗体BioNb2生物素标记Nb2(BioNb2)的特异性结果图；
图7附图为本发明基于BioNb2所建立的阻断ELISA方法的重复性结果图；
图8附图为本发明基于BioNb2所建立的阻断ELISA方法的特异性结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
限制性内切酶BamHI和HindIII、T4DNA连接酶均购自于NEB公司；HS酶购于Takara公司；感受态Trans5α和BL21(DE3)均购自于北京全式金生物科技有限公司；生物素连接酶购自于GeneCopoeia；HRP标记的链霉亲和素购自于Thermo FisherScientific。
利用本实验室已有的PEDV N蛋白原核表达载体进行PEDV N蛋白的表达纯化，纯化的PEDV N蛋白作为包被ELISA板的抗原。
实施例1原核表达载体pET21b-Nb2-Avi-Tag的构建
(1)扩增Nb2-Avi-Tag基因
根据本实验室保存“pCANTAB-5E-Nb2”质粒中Nb2的基因序列(SEQ ID NO.1)进行引物设计，分别在上下游引物5’端引入BamH I和Hind III限制性内切酶位点，由下划线标记；
引物序列如下：
pET21b-Nb2-F：CGGGATCCGCAGGTCCAACTGCAGGAG；SEQ ID NO.2；
pET21b-Nb2-R：CCCAAGCTTTTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCGAAATATCGTTCAGACCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC；SEQ ID NO.3；斜体标记Avi-Tag序列。
以pCANTAB-5E-Nb2质粒为模板，扩增Nb2-Avi-Tag基因，反应体系如下：
反应程序：94℃预变性3min；94℃15s，55℃5s，72℃45s，28个循环；72℃延伸4min；4℃停止反应。
将PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取400bp附近出现的目的条带(如图1所示)，用胶回收试剂盒EasyPμre Qμick Gel ExtractionKit按照说明书进行PCR产物的回收，并利用分光光度计测定回收产物浓度用于后续实验。
(2)双酶切载体及目的片段
A.pET21b载体的双酶切体系如下：
B.回收的PCR产物双酶切体系如下：
分别将上述步骤A和B配制的酶切体系置于37℃水浴中，酶切3h；产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定(结果如图2所示)；并按照胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel ExtractionKit进行酶切产物的回收，并利用分光光度计测定回收产物浓度用于后续实验。
C.用T4连接酶连接pET21b载体与Nb2-Avi-Tag目的片段，反应体系如下：
混匀后，瞬离，置于16℃连接仪中连接过夜，获得连接产物。
D.将步骤C所得到的连接产物转化入Trans5α感受态细胞中，按照感受态说明书进行操作；然后取200μL的菌夜凃于LB/AMP平板，放置于37℃恒温培养箱中过夜培养。
E.挑取形状圆润的单克隆，接种于1ml LB/AMP培养基中，置于37℃恒温摇床中200r/min培养6-8h后用于菌液PCR鉴定。
F.菌液PCR鉴定步骤E所挑取的克隆中是否含有阳性克隆，反应体系为：
反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s,72℃30s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保持。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆(结果如图3所示)。
将菌液PCR鉴定为阳性的克隆，随机挑选2个克隆，接种于5ml的LB/AMP中培养12h后提取质粒pET21b-Nb2-Avi-Tag，按照质粒提取试剂盒EasyPure HiPurePlasmidMiniPrep Kit说明书进行，并进行质粒浓度的测定，交由西安擎科生物科技有限责任公司进行测序。
实施例2pET21b-Nb2-Avi-Tag在大肠杆菌中的表达、可溶性鉴定、生物素标记及特异性验证
将测序正确的pET21b-Nb2-Avi-Tag质粒转化入BL21(DE3)表达感受态细胞中，按照感受态说明书进行操作；然后取200μl的菌夜凃于LB/AMP平板，放置于37℃恒温培养箱中过夜培养。同样的操作进行pET21b空载体的转化。
挑取形状圆润的单克隆(分别挑取pET21b-Nb2-Avi-Tag质粒和pET21b空载体质粒)，分别接种于1ml LB/AMP培养基中，置于37℃恒温摇床中200r/min培养8-10h；分别取出600μL培养物加入250μl无菌50％的甘油，混匀后，-20℃保存，剩余的培养物用于下一步实验。
分别取剩余的100μl上述培养物，接种于10ml LB/AMP培养基中，置于37℃220r/min恒温摇床中培养至对数期，取1ml培养物，12000g 4℃离心2min，收集菌体，进行SDS-PAGE电泳；
分别向上述剩余的9ml培养物中加入9μl IPTG贮存液(终浓度为1mM)，200r/min37℃诱导5h，取1ml培养物，12000g 4℃离心1min，收集菌体；通过SDS-PAGE电泳来确定重组蛋白Nb2-Avi-Tag的表达情况，结果如图4所示。
通过超声破碎表达重组蛋白Nb2-Avi-Tag的表达菌体，取超声后上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，确定Nb2-Avi-Tag是以可溶性形式还是包涵体形式存在；结果表明，重组蛋白Nb2-Avi-Tag是以包涵体的形式。按照Ni-NTA说明书进行目的蛋白的纯化，SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果如图5所示。
将纯化后的Nb2-Avi-Tag蛋白透析至PBS中，并调整终浓度为1mg/mL，利用生物素连接酶进行重组蛋白Nb2-Avi-Tag的生物素标记，反应体系如下：
混匀后，30℃孵育30min，加入终浓度为50％的甘油，-20℃保存；将标记好的纳米抗体命名为BioNb2，用于后续实验。
将PEDV N、PEDV S、TGEV N、PRRSV N、PCV Cap和PRV gE蛋白分别包被ELISA板，100ng/孔；4℃包被过夜，使用包含0.5％Tween-20的PBS’T洗板3次；每孔加入200μl含2.5％脱脂奶粉的PBS’T封闭液，25℃封闭1h，PBS’T洗3次；将生物素标记的纳米抗体BioNb2进行1：20、1：200、1：2000和1：4000稀释后加入不同抗原的孔中孵育1h，PBS’T洗3次；将HRP标记的链和亲霉素二抗进行1：2000稀释后，25℃孵育1h，PBS’T洗3次；加入新鲜的TMB底物溶液，100μl/孔，25℃避光孵育15min，每孔加入终止液50μl 3M H2SO4终止反应，在酶标仪中读取OD450值，结果如图6所示。结果显示，BioNb2不与PEDV S、TGEV N、PRRSV N、PCV Cap和PRV gE蛋白发生交叉反应，只与PEDV N蛋白发生反应，表明BioNb2具有良好的特异性。
实施例3基于BioNb2阻断ELISA方法的建立
(1)包被抗原量和BioNb2的确定
按棋盘方阵法进行，将实验室前期制备的纯化的PEDV N蛋白分别稀释至0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL；4℃包被过夜，使用包含0.5％Tween-20的PBS’T洗板3次；每孔加入200μl含2.5％脱脂奶粉的PBS’T(封闭液)，PBS’T洗板3次；洗涤后加入用PBS’T按1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000和1：8000稀释的纳米抗体BioNb2孵育1h，PBS’T洗3次；将HRP标记的链和亲霉素二抗进行1：2000稀释后，25℃孵育1h，PBS’T洗3次；加入新鲜的TMB底物溶液，100μl/孔，25℃避光孵育15min，每孔加入终止液50μl 3M H2SO4终止反应，在酶标仪中读取OD450值。结果如表1所示，包被抗原稀释至1μg/mL，BioNb2稀释至1：8000时OD450值为1.0，认为包被的抗原量和纳米抗体的稀释比例为最佳。
表1抗原包被浓度和BioNb2稀释度初次优化
(2)待检血清的最佳稀释度确定
按照上述优化的抗原和BioNb2的最佳工作浓度进行ELISA反应，加入封闭液，PBS’T洗板3次，先分别加入1：5、1：10、1：20和1：40稀释的PEDV抗体阳性血清和阴性血清，25℃孵育2h，PBS’T洗板3次，加入最佳浓度的BioNb2纳米抗体，按照上述方法加入显色液，终止液并进行读数，结果如表2所示；根据阴性和阳性血清的阻断率结果，1：5稀释血清为最佳稀释比例。
表2待检血清稀释比例选择
(3)待检血清室温孵育时间优化
按照上述步骤(2)的阻断ELISA步骤，每孔加入1：5最佳稀释比例的阴阳性血清，25℃孵育30min、60min、90min和120min，然后继续进行阻断ELISA反应，结果如表3所示；最后根据阴阳性血清的阻断率，确定最佳作用时间为2h。
表3待检血清孵育时间选择
(4)纳米抗体BioNb2的孵育时间
按照上述步骤(2)的阻断ELISA步骤，每孔加入1：5最佳稀释比例的阴阳性血清，室温孵育120min，PBS’T洗板3次，加入1：8000稀释的纳米抗体BioNb2，25℃孵育30min、60min、90min和120min，然后继续进行阻断ELISA反应，结果如表4所示；最后根据阴阳性血清的阻断率，确定纳米抗体BioNb2最佳作用时间为30min。
表4纳米抗体BioNb2最佳作用时间的选择
(5)HRP标记链和亲霉素二抗的孵育时间
按照上述步骤(2)的阻断ELISA步骤，每孔加入1：5最佳稀释比例的阴阳性血清，室温孵育120min，PBS’T洗板3次，加入1：8000稀释的纳米抗体BioNb2，25℃孵育30min，PBS’T洗板3次，加入1：2000稀释的HRP标记链和亲霉素25℃孵育30min、60min、90min和120min，然后继续进行阻断ELISA反应，结果如表5所示；最后根据阴阳性血清的阻断率，确定HRP标记链和亲霉素最佳作用时间为30min。
表5 HRP标记链和亲霉素二抗的孵育时间的选择
(6)阻断ELISA最佳反应条件
根据步骤(1)-(5)摸索的阻断ELISA最佳反应条件为：
在96孔酶标板上每孔加入终浓度为1μg/mL的PEDV N蛋白，100μl/孔，4℃包被过夜。第二天，使用包含0.5％Tween-20的PBS’T洗板3次；每孔加入200μl含2.5％脱脂奶粉的PBS’T封闭液，25℃封闭1h，PBS’T洗3次；每孔加入100μl 1：5稀释的待检血清(待检血清用含1％BSA的PBS稀释)，双孔复检，同时设立标准阳性血清对照和标准阴性血清对照，25℃孵育120min，PBS’T洗3次；每孔加入100μl 1：8000稀释的纳米抗体BioNb2，25℃孵育30min，PBS’T洗3次；每孔加入100μl 1：2000稀释的HRP标记的链和亲霉素二抗，25℃孵育30min，PBS’T洗3次；每孔加入100μl新鲜的TMB底物溶液，25℃避光孵育15min，每孔加入终止液50μl 3M H2SO4终止反应，在酶标仪中读取OD450值，计算阻断率PI值，PI(％)＝100％×[1-(待检血清OD450/阴性血清OD450)]。
实施例4临界值的确定
取100份PEDV抗体阴性血清样品(间接ELISA方法和商品化试剂盒检测均为PEDV阴性)，利用实施例3中步骤(6)最终的反应条件进行检测，计算阻断率，计算血清样品的平均阻断率(X)为2.29％，标准差(S)为8.99％。根据公式：临界值＝2.29％+3(或2)×8.99％，计算得出阴阳性判断标准的临界值为29.27％和20.28％；当样本阻断率≥29.27％时为阳性，当阻断率≤20.28％时为阴性；当样本阻断率20.28＜样本阻断率＜29.27％判断为可疑，需要重复检测，如果仍低于29.27％，则判断为阴性。
实施例5阻断ELISA的重复性试验
选用间接ELISA和商品化试剂盒检测均为PEDV N抗体阴性(2份)和阳性(4份)的血清，不同的操作人员在不同实验环境条件下利用实施例3中步骤(6)最终的反应条件进行检测这5份血清，检测其重复性，计算阻断率结果如图7所示。结果显示不同的操作人员在不同实验环境条件下5份血清结果均一致。
实施例6阻断ELISA方法的交叉反应性实验
按照实施例3中步骤(6)最终的反应条件对PEDV、TGEV、PPV、PRRSV、PRV、JEV、PCV2和CSFV等临床常见的8种疫病的阳性血清进行检测，结果如图8所示。结果显示，除PEDV阳性血清为阳性反应外，其余均为阴性反应，证明该阻断ELISA方法可特异性检测PEDV抗体，不与其他几种猪病的阳性血清发生反应。
实施例7阻断ELISA检测方法与商品化试剂盒的比较
用本发明建立的阻断ELISA检测方法与商品化试剂盒同时检测了150份临床血清样品，结果如表6所示；结果显示本发明的阻断ELISA方法和商品化试剂盒阳性符合率为100％，阴性符合率为93.18％，总符合率为94％；与商品化试剂盒具有较高的符合率，可用于临床检测PEDV血清样品。
表6阻断ELISA检测结果与商品化试剂盒检测符合率
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caggtccaac tgcaggagtc tgggggagac ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ccccttccga gattatggca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg aactcgagcg ggtctccact attagcaata gtggaataga gtcatactat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa caccctgtat 240
ctgcaattga acagcctgaa aactgaggac acggccatgt attactgtgc aaaagagcag 300
aactggtatt ataccggtaa ttacgacctc ccccatctcc agaggggcca ggggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgggatccgc aggtccaact gcaggag 27
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cccaagcttt tcgtgccatt cgattttctg agcttcgaaa tatcgttcag acctgaggag 60
acggtgacct gggtcc 76

Claims (4)

1.一种猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N的特异性纳米抗体BioNb2的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)Nb2-Avi-Tag基因扩增
以pCANTAB-5E-Nb2为模板，pET21b-Nb2-F/pET21b-Nb2-R为引物PCR扩增获得Nb2-Avi-Tag基因；
(2)重组蛋白Nb2-Avi-Tag的原核表达和纯化
将步骤(1)获得的Nb2-Avi-Tag基因连入原核表达载体pET21b中，转入表达菌株BL21(DE3)中进行诱导表达和纯化，获得纯化的重组蛋白Nb2-Avi-Tag；
(3)纯化的Nb2-Avi-Tag重组蛋白进行生物素标记
将步骤(2)获得的纯化的重组蛋白Nb2-Avi-Tag调整为1mg/ml，利用生物素连接酶对重组蛋白Nb2-Avi-Tag进行生物素标记，将标记好的纳米抗体命名为BioNb2。
2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N的特异性纳米抗体Nb2的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述引物pET21b-Nb2-F/pET21b-Nb2-R的引物如下：
pET21b-Nb2-F：CGGGATCCGCAGGTCCAACTGCAGGAG；SEQ ID NO.2；
pET21b-Nb2-R： SEQ ID NO.3；
其中下划线分别标记BamH I和Hind III限制性内切酶位点；下游引物中斜体标记Avi-Tag序列。
3.一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体BioNb2的阻断ELISA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在酶标板上加入100ng/孔的PEDV N蛋白，包被缓冲液为0.1M pH7.2的CBS，4℃包被过夜，使用包含0.5％Tween-20的PBS’T洗板5次；
2)每孔加入200μl含2.5％脱脂奶粉的PBS’T封闭液，25℃封闭1h，PBS’T洗3次；
3)将待检血清按照1：5的比例进行稀释后，100μl/孔，设置标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，25℃孵育2h，PBS’T洗3次；
4)将生物素标记的纳米抗体BioNb2进行1：8000稀释后，100μl/孔，25℃孵育30min，PBS’T洗3次；
5)将HRP标记的链和亲霉素二抗进行1：2000稀释后，25℃孵育1h，PBS’T洗3次；
6)加入TMB底物溶液，100μl/孔，25℃避光孵育15min，每孔加入终止液50μl 3M H2SO4终止反应；
7)在酶标仪中读取OD450值，计算阻断率PI值，PI(％)＝100％×[1-(待检血清OD450/阴性血清OD450)]；
8)判断标准如下：当阻断率≥29.27％时，判断为血清抗体阳性；当阻断率≤20.28％时判断为阴性；当29.27％＞阻断率＞20.28％，则判断为可疑，需要重复检测，如果仍低于29.27％，则判定为阴性。
4.一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体BioNb2的阻断ELISA的检测方法，在检测猪体内PEDV抗体水平中的应用。
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