JP6824177B2 - 豚流行性下痢ウイルス株及びそれから得られる免疫原性組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条の下で、2015年2月27日に出願された米国仮特許出願第62/121,955号、2015年8月24日に出願された米国仮特許出願第62/209,119号、2015年11月4日に出願された米国仮特許出願第62/250,961号、及び2016年1月7日に出願された米国仮特許出願第62/276,022号(参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる)に対する優先権を主張する。
(a)PEDVウイルス変異体をコードする配列番号8〜16、及び35〜39、またはその免疫原性断片、
(b)(a)の任意の配列の相補体、
(c)65℃の0.5M NaHPO4、7% SDS、1mM EDTA中でのフィルタ結合DNAとのハイブリッド形成、及び68℃の0.1×SSC/0.1% SDS中での洗浄として定義されるストリンジェントな条件下で、(a)または(b)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(d)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも70%同一なポリヌクレオチド、
(e)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも80%同一なポリヌクレオチド、
(f)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも90%同一なポリヌクレオチド、及び
(g)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも95%同一なポリヌクレオチド。
本発明はさらに、RNA及びDNA分子、それらの相補体、断片、ならびに任意のそのようなRNAまたはDNAのポリヌクレオチドの発現のため、及びそのようなヌクレオチド配列から発現されるPEDVウイルスのためのベクター及びプラスミドを提供し、前記ウイルスは生であるか、または完全にもしくは部分的に弱毒化される。
本発明はまた、本明細書に添付される表1に反映されるように、PEDVからの変異タンパク質をコードする核酸ORFも含む。表1の変化は、PEDV米国/IL20697/2014継代5代目に関して記載される。
弱毒生変異株の豚流行性下痢ウイルス(PEDV)、及び
担体を含むワクチン組成物を含み、前記組成物は、PEDVの変異株及びプロトタイプ株の両方によるチャレンジから豚を保護すること、及びPEDV感染に関連する症状のうちの1つ以上を予防または治療することが可能であり、保護の達成は、PEDV感染の症状である脱水、発熱、下痢、嘔吐、授乳能力の低下、生殖能力の低下、死亡のいずれかの予防または管理、及び体重減少もしくは体重増加失敗の予防または管理からなる群から選択されるエンドポイントによって決定され、前記株は、以下のアミノ酸の置換及びそれらの保存的変異体を有するタンパク質、ならびに特定の置換を有し、その配列の残りに対して99%の相同性を有するタンパク質をコードする。
酸置換は、以下またはそれらの保存的変異体を含む。
ポリタンパク質1a/1b(配列番号46):551位のP(DEDATの直後のP);
スパイクタンパク質(配列番号47):1009位のP(IGNITの直後のP)、973位のH(ALPFSの直後のH)、48位のL(APAVVの直後のL)、345位のV(TNLSFの直後のA);
ORF3(配列番号48):144位のIの欠失(YDGKSの直後のI)、174〜189の欠失(LYLAIの直後)、138〜143位のLTANPL(NGKAAの直後)、及び
ヌクレオカプシドタンパク質(配列番号51)27位のH(LRVTNの直後のH)。
スパイクタンパク質(配列番号47):1009位のP(IGNITの直後のP)、973位のH(ALPFSの直後のH)、48位のL(APAVVの直後のL)、345位のV(TNLSFの直後のA);
ORF3(配列番号48):144位のIの欠失(YDGKSの直後のI)、174〜189の欠失(LYLAIの直後)、138〜143位のLTANPL(NGKAAの直後)、及び
ヌクレオカプシドタンパク質(配列番号51)27位のH(LRVTNの直後のH)。
スパイクタンパク質(配列番号47):633位のK(TPKPLの直後のK);
ORF3(配列番号48):189位のLの欠失(TANPLの直後のL)。
スパイクタンパク質(配列番号47):633位のK(TPKPLの直後のK)、884位のR(VYDPAの直後のR);
ORF3(配列番号48):189位のLの欠失(TANPLの直後のL)。
スパイクタンパク質(配列番号47):884位のR(VYDPAの直後のR)、959位のA(LIGGMの直後のA);
ORF3(配列番号48):189位のLの欠失(TANPLの直後のL)。
スパイクタンパク質(配列番号47):48位のL(APAVVの直後のL)、345位のV(TNLSFの直後)、884位のR(VYDPAの直後のR)、959位のA(LIGGMの直後のA)、
ORF3(配列番号48):138〜144の欠失(NGKAAの直後)、189のLの欠失(TANPLの直後のL)、
ヌクレオカプシド(配列番号51)27位のH(LRVTNの直後のH)。
ポリタンパク質1a/1b(配列番号46):1591位のM(VVKVSの直後のM)、5087位のS(YLFSTの直後のS)、6138位のS(WQTFSの直後のS);
スパイクタンパク質(配列番号47):884位のR(VYDPAの直後のR)、959位のA(LIGGMの直後のA)、1225位のD(IESLVの直後のD);
ORF3(配列番号48):8位のYの欠失(LGLFOの直後のY)、138〜144の欠失(NGKAAの直後)、及び174〜189 189の欠失(LYLAIの直後)、
エンベロープタンパク質(配列番号49)62位のF(YRVYKの直後のF);
183位の膜タンパク質I(IVYGGの直後のI)。
ポリタンパク質1a/1b(配列番号46):1591位のM(VVKVSの直後のM)、5087位のS(YLFSTの直後のS)、6138位のS(WQTFSの直後のS);
スパイクタンパク質(配列番号47):884位のR(VYDPAの直後)、959位のA(LIGGMの直後)、973位のH(ALPFSの直後のH)、1225位のD(IESLVの直後のD);
ORF3(配列番号48):8位のYの欠失(LGLFOの直後のY)、138〜144の欠失(NGKAAの直後)、及び174〜189の欠失(LYLAIの直後)、
エンベロープタンパク質(配列番号49)62位のF(YRVYKの直後のF);
5位の膜タンパク質A(MSNGの直後のA)、183位の(IVYGGの直後のI)。
スパイクタンパク質(配列番号47):48位のL(APAVVの直後)、345位のV(TNLSFの直後);1272位のT(DVFNAの直後のT)
エンベロープタンパク質(配列番号49)62位のS(YRVYKの直後のS);
ヌクレオカプシドタンパク質(配列番号51):27位のH(LRVTNの直後のH)。
スパイクタンパク質(配列番号54):257のN、326のI、375のF、491のY、881のR、888のR、1277のF、1339のT、または1358のL;
39またはそれ以降でのORF3(配列番号55)終止;
エンベロープタンパク質(配列番号56)69のI位;
膜タンパク質(配列番号57)208のT位;
ヌクレオカプシドタンパク質(配列番号58)141のL、418のQ、424のN、439のI位。
単数形「a」、「an」、及び「the」は、内容がそうではないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「or」という語は、内容がそうではないことを明確に示さない限り、「and」を含むことが意図される。「or」という語は、特定のリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
「薬学的に許容される担体」は、ワクチンの製造及び投与のために当該技術分野で使用される、任意の従来の薬学的に許容される担体、ビヒクル、または賦形剤を意味する。薬学的に許容される担体は、典型的には、非毒性、不活性、固体、または液体の担体である。
ワクチン製剤/免疫原性組成物
本発明はまた、本発明による変異PEDV株を含む、ワクチンとして使用されるのに好適な免疫原性組成物にも関する。本発明による免疫原性組成物は、中和抗体を含むPEDVに対して特定の液性免疫応答を惹起する。
アジュバント組成物
本発明のワクチン組成物は、アジュバントを含んでも含まなくてもよい。具体的には、経口感染ウイルスに基づく場合、本発明の修飾生ワクチンは、滅菌担体を用いて、アジュバントを含まないで使用されてもよい。経口投与に使用され得るアジュバントは、CT様の免疫変調成分(rmLT、CT−B、すなわち、E.coliの組換え変異型熱不安定性毒素、コレラ毒素Bサブユニット)に基づくもの、またはポリマー及びアルギン酸を用いた、もしくはキトサン等の粘膜付着剤を用いた、もしくはリポソームによる封入によるものを含む。ワクチン放出による最小保護用量での好ましいアジュバント化または非アジュバント化ワクチンの用量は、用量当たり約10〜約106 log10 TCID50またはそれ以上のウイルスを提供し得る。「TCID50」は、「組織培養感染量」を指し、所与のバッチの接種細胞培養物の50%を感染させるのに必要なウイルスの希釈率として定義される。本明細書全体にわたって用いられるSpearman−Karber法を含む種々の方法が、TCID50を計算するために使用され得る。Spearman−Karber法の説明については、B.W.Mahy&H.O.Kangro,Virology Methods Manual,p.25−46(1996)を参照されたい。アジュバントは、存在する場合、エマルジョンとして提供されてもよく、より一般的には、非経口投与が選択される場合、出発力価の0.7log(80%の減少)を超えて減少するべきではない。
本発明はまた、アジュバント成分がAmphigen(登録商標)のみである条件を用いて成功裏に実施され得ることに留意されたい。
a)ソルビタンモノオレエート、MPL−A、及びコレステロールを軽鉱油に溶解させる。得られた油剤を滅菌濾過する。
b)免疫賦活性オリゴヌクレオチド、デキストランDEAE、及びポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートを水相に溶解させ、そうすることで水溶液を形成する。
c)連続的に均質化しながら水溶液を油剤に加え、そうすることでアジュバント製剤TXOを形成する。
本発明の実施において有用なさらなるアジュバントは、Prezent−A(米国公開特許出願第US20070298053号を概ね参照のこと)及び「QCDCRT」または「QCDC」型アジュバント(米国特許出願公開第US20090324641号を概ね参照のこと)含む。
賦形剤
本発明の免疫原性ワクチン組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び/または安定剤をさらに含むことができる(例えば、Remington:The Science and practice of Pharmacy,2005,Lippincott Williamsを参照のこと)。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、その投薬量及び濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(((o−カルボキシフェニル)チオ)エチル水銀ナトリウム塩(THIOMERSAL)、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド;フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール等);血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖類;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)、TWEEN、もしくはPLURONICS等の非イオン性界面活性剤を含み得る。
投薬
好ましい臨床的適応は、分娩前の繁殖用経産豚及び未経産豚の両方における治療、管理、及び予防であり、その後の子豚のワクチン接種である。代表的な例において(経産豚及び未経産豚の両方に適用可能)、2つの2ML用量のワクチンが使用されるが、当然、用量の実際の体積は、動物のサイズも考慮に入れながら、0.1〜5MLの範囲の実際の投与量を用いてワクチンがどのように製剤化されるかの関数である。単回用量のワクチン接種もまた適切である。
治療的に提供される場合、ワクチンは、実際の感染の徴候が検出されてから、有効量で提供される。既存の感染症を治療するための投与量は、用量当たり約10〜106 log10 TCID50またはそれ以上のウイルス(ワクチン放出の最小免疫量)を含む。組成物は、レシピエントがその投与に耐容性を示す場合に「薬理学的に」許容されると言える。そのような組成物は、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療的にまたは予防的に有効な量」で投与されると言える。
大規模ウイルス産生に適したVero細胞の作製
本発明のウイルスは、ワクチン産生のために承認されたVero細胞ストック中で都合よく増殖させることができる。安全かつ承認された細胞ストックを作製するために、Vero細胞のバイアルをさらなる継代に供した。コムギを含むPMEMに細胞を4回通過させ、マスター細胞ストック(Master Cell Stock(MCS))ロット「1834430」を生成した。MCSは、PGM−Biological Quality Control;Lincoln,NEにおけるCFR及びEPの9つの要件に従って検査した。MCSの試験は、無菌性、マイコプラズマを含んでいないこと、及び外来物質について満足の行くものであった。したがって、PF−Vero MCSロット「1834430」は、確認試験のためのCenter for Veterinary Biologics Laboratories(CVB−L)への提出に適していると見なされた。
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチド
本発明の代表的な実施形態は、(a)ORF1a/1bポリタンパク質、PEDVスパイクタンパク質(好ましくはドメイン1)、ORF3タンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、または前記タンパク質の断片(複数可)をコードする(配列番号1、2、3、8、15、35、36、37、39、及び/もしくは59〜77)、またはその断片;(b)(a)の任意の配列の相補体;(c)65℃の0.5M NaHPO4、7% SDS、1mM EDTA中でのフィルタ結合DNAとのハイブリッド形成、及び68℃の0.1×SSC/0.1% SDS中での洗浄として定義されるストリンジェントな条件下で、(a)または(b)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド;(d)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも70%同一なポリヌクレオチド;(e)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも80%同一なポリヌクレオチド;(f)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも90%同一なポリヌクレオチド;及び(g)(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも95%同一なポリヌクレオチド、からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、第2の異種ポリヌクレオチド配列を含む。
さらに好ましい実施形態において、抗原が、配列番号1、2、3、8、15、35、36、37、39、59〜77、それらの組み合わせ、またはその免疫原性断片のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質によって定義される、PEDVポリペプチドに基づくワクチンがさらに提供される。さらなる実施形態は、抗原が、配列番号23〜34、40〜58のヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。
さらなる遺伝子操作
本発明によって提供されるポリヌクレオチド及びアミノ酸配列情報は、ウイルス遺伝子及びそれらのコードされた遺伝子産物の構造及び機能の系統的解析も可能にする。本発明のウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに関する知識もまた、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを認識してそれにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドを利用可能にする。全長及び断片アンチセンスポリヌクレオチドが、この点において有用である。当業者は、本発明の断片アンチセンス分子が、(i)特定のRNAを特異的に認識してそれにハイブリダイズするもの(本発明のウイルスポリペプチドをコードするDNAの配列比較によって決定される)、及び(ii)コードされたタンパク質の変異体をコードするRNAを認識してそれにハイブリダイズするものを含むことを理解するであろう。他のPEDVペプチドをコードするRNA/DNAにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドもまた、分子群に関する特徴的な配列または代表的な配列を同定するための配列比較によって同定可能であり、さらにはPEDVポリペプチド中の抗原性ドメインの試験における使用に役立ち、サーコウイルス科の関連性の低い非PEDVメンバーによる宿主動物の感染と区別するためにも使用され得る。
抗体
本発明によってさらに企図されるのは、抗PEDV抗体(例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、豚抗体、及び本発明のPEDVポリペプチドを特異的に認識するCDR配列を含む化合物を含む、CDR移植抗体である。「〜に特異的」という用語は、本発明の抗体の可変領域が、PEDVポリペプチドのみを認識してそれに結合する(すなわち、ポリペプチド群において見られる配列の同一性、相同性、または類似性にもかかわらず、関連するポリペプチドから単一のPEDVポリペプチドを識別することができる)ことを示し、またこれは、抗体の可変領域の外側の配列、具体的にはAb分子の定常領域における配列との相互作用を介して、他のタンパク質(例えば、S.aureusタンパク質A、またはELISA技術における他の抗体)と相互作用することが(任意選択敵意)可能である。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは周知であり、当該技術分野においてルーチン的に実施されている。このようなアッセイの包括的な考察については、Harlow et al.(Eds),Antibodies A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory;Cold Spring Harbor,N.Y.(1988),Chapter 6を参照されたい。本発明のPEDVポリペプチドの断片を認識してそれに結合する抗体もまた企図されるが、但し、その抗体は、上に定義したように、断片が由来する本発明のPEDVポリペプチドに対して第一にかつ最も特異的であるものとする。
診断キット
本発明はまた、診断キットも提供する。キットは、PEDVウイルスの野外株に自然に感染した豚動物と、本明細書に記載されるPEDVワクチンのいずれかをワクチン接種した豚動物とを区別するために有益であり得る。キットはまた、PEDVウイルスの野外株に感染している可能性のある動物を、臨床症状が現れる前に検出して、群れから排除することができるか、またはナイーブなもしくはワクチン接種された動物から隔離しておくことができるため、有益であり得る。キットは、特定されたPEDVウイルスの特定の成分に対する抗体の存在について、豚動物から得られる試料を分析するための試薬を含む。本発明の診断キットは、野外株には存在するが、対象となるワクチンには存在しない、またはその逆である、本発明の変異PEDV株からの単数もしくは複数のペプチドを構成要素として含むことができ、そのような好適なペプチドドメインの選択は、広範なアミノ酸シーケンシングによって可能となる。当該技術分野において既知であるように、本発明のキットは、融合タンパク質を介して提供されるペプチドを構成要素として代わりに含むことができる。本発明の目的のための「融合ペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、PEDVウイルスタンパク質の少なくとも一部、好ましくはORF1またはORF3と、異種ペプチドまたはタンパク質とからなる、一本鎖ポリペプチドを意味する。
米国の豚におけるPEDVの遺伝的関連性及び分子疫学を決定するのに役立つように、PEDV S1(スパイク遺伝子の最初の2.2kbタンパク質)のシーケンシングを行った。シーケンシングは、2014年1月にISU VDLにおいて、15のPEDV症例に対して行われた。その中でも、10症例(ISU症例6〜15)からのPEDV S1配列は、互いに類似しており、また2013年に米国の豚において同定されたPEDV株にも類似していた(99.1〜100%のヌクレオチド同一性)。明らかに対称的に、他の5症例(ISU症例1〜5)からのPEDV S1配列は、2013年に米国の豚において以前に同定されたPEDV株に対して93.9〜94.6%のヌクレオチド同一性を有するのみであった。
実施例2
米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株の少なくとも2つの遺伝的に異なる豚流行性下痢ウイルス(PEDV)株が、アメリカ合衆国で同定されている。本試験の目的は、実験的感染下において、従来の新生子豚における米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株の病原性の違いを比較することである。50匹のPEDV陰性5日齢の豚を、各10匹の5つの群に分け、ウイルス力価104TCID50/mlの3つの米国PEDVプロトタイプ分離株(IN19338/2013−P7、NC35140/2013−P7、及びNC49469/2013−P7)、S−INDEL−変異分離株(2014020697−P7)、及びウイルス陰性培養培地を、それぞれ、豚1匹当たり10mlで経口胃的に接種した。本試験で検査した3つ全部のPEDVプロトタイプ分離株が、それらの分岐群に関係なく、同様の病原性を示し、糞便中へのウイルス排出、ならびに肉眼的及び組織病理学的病変といった臨床徴候によって裏付けられるように、5日齢の豚に重度の腸疾患を引き起こした。3つの米国PEDVプロトタイプ分離株を接種した豚と比較して、S−INDEL−変異分離株を接種した豚は、糞便中へのウイルス排出、小腸、盲腸、及び結腸における肉眼的病変、小腸における組織病理学的病変、ならびに回腸における免疫組織化学染色といった臨床徴候が有意に少なかった。米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株は、接種豚において同様のウイルス血症レベルを誘導した。PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株の全ゲノム配列は決定されたが、3つのPEDV株間のビルレンスの違いの分子基盤については、逆遺伝学アプローチを用いて今後解明されなければならない。本試験は、PEDVのビルレンス及びワクチンの弱毒化に寄与する分子機構を理解する強力な基盤を提供する。
結果
米国PEDVの単離及び配列比較
3つの米国PEDVプロトタイプ分離株である米国/NC35140/2013、米国/IA49379/2013、及び米国/NC49469/2013をVero細胞中で単離した。合胞体形成及び細胞剥離を含む典型的なPEDVの細胞変性効果が観察され、蛍光免疫染色によってウイルス増殖が確認された。全ての分離株は、Vero細胞中で効率的に増殖し、感染力価は、最初の10継代で103〜106TCID50/mlの範囲であった。
G1(米国/IN19338/2013−P7)、G2(米国/NC35140/2013−P7)、及びG3(米国/NC49469/2013−P7)の全ての豚が、1DPIから軟性〜水様性の下痢を発症し、6または7DPIまで持続した。対称的に、G4(IL20697)では、1DPIに、1匹の豚に軟便を伴う軽度の下痢が認められたのみであった。平均下痢スコアを図7Aにまとめる。全体として、後述の「材料及び方法」の項に記載されるように、0〜7DPは、Iの下痢スコアが分析されたときに、G1(P=0.001)及びG3(P<0.0001)の豚は、G2の豚よりも有意に高い平均下痢スコアを有していた。プロトタイプPEDV分離株を接種したG1〜G3の豚は、全体として、PEDV変異分離株を接種したG4(P<0.0001)及びG5(陰性対照、P<0.0001)よりも有意に高い平均下痢スコアを有していた。平均下痢スコアについては、G4とG5との間に有意差はなかった(P=1)。
ウイルスの排出及び分布
1DPIから試験終了まで、G1〜G3(プロトタイプ分離株)の全ての豚からの直腸スワブ試料中にPEDV RNAが検出された。G4(変異分離株)において、それぞれ、1、2、3、4、5、6、及び7DPIに、5/10、8/10、10/10、5/5、5/5、3/5、及び2/5匹の豚の直腸スワブ中にPEDV RNAが検出された。直腸スワブ中に排出されたウイルス1ml当たりの平均ゲノムコピー数を図7Cにまとめる。G1及びG2の豚に、1〜7DPIにかけて同様のレベル(P=0.601)の糞便中へのウイルス排出が見られ、ゲノムコピー/mlの数は107.2〜9.0の範囲であり、Ct値16〜22に対応する。1−2DPIに、G3の豚に最も高いレベルの糞便中へのウイルス排出が見られ(Ct16で約109ゲノムコピー/ml)、7DPIには、糞便中へのウイルス排出は、Ct値28に対応する約105.4ゲノムコピー/mlまで徐々に減少した。対称的に、G4の豚に、1DPIに約102.3ゲノムコピー/ml(Ct 31.8)の糞便中へのウイルス排出が見られた:糞便中へのウイルス排出は、徐々に増加し、5DPIにピークとなり(Ct 28.8で105.4ゲノムコピー/ml)、次いで、7DPIに約101.3ゲノムコピー/ml(Ct 36.3)まで減少した。
*後肢筋肉。+平均Ctは、PCR陽性豚(PCR Ct<45の豚)の平均Ctであった。
肉眼的所見
3DPIに、PEDVプロトタイプ分離株(G1〜G3)を接種したほとんどの豚において、小腸、盲腸、及び結腸組織に、時としてガス及び/または黄色味がかった液体によって拡張された、薄くて透明な壁が観察された。さらに、G1〜G3のほぼ全ての豚が、小腸、盲腸、及び結腸内に水様性内容物を含んでいた。対称的に、PEDV変異分離株(G4)を接種した3/5匹の豚の小腸には、軽度の薄壁が観察されたのみであり、G4の豚の盲腸または結腸には、明らかな肉眼的病変は観察されなかった。また、G4では、わずか1/5匹の豚が小腸、盲腸、及び結腸内に水様性内容物を含んでおり、他の2匹の豚は、盲腸内に半水様性含有物を有していた。統計的に、全てのG1〜G3(プロトタイプ分離株)が、G4(変異分離株)及びG5(陰性対照)よりも有意に高い小腸、盲腸、及び結腸の内容物スコアを有していた(P値は<0.0001〜0.0127の範囲であった)(図8A)。小腸、盲腸、及び結腸の内容物スコアについてG1〜G3間に有意差は観察されなかった(P値は0.3722〜1の範囲であった)(図8A)。G4では、盲腸の内容物スコアのみがG5よりも有意に高かったが(P=0.003)、小腸または結腸の内容物スコアはそうではなかった[P値は0.5259〜1の範囲であった;図8A]。全てのプロトタイプ分離株接種群(G1〜G3)が、変異分離株接種群(G4)及び陰性対照群(G5)よりも有意に高い小腸、盲腸、及び結腸の組織病変スコアを有していた(P値は0.0012−0.049であった、図8B)。G1〜G3間(P値は0.1585〜1の範囲であった)またはG4〜G5間に[P値は0.4766〜1の範囲であった;図8B]に、小腸、盲腸、及び結腸の病変スコアの有意差はなかった。
組織病理学
3DPIまたは7DPIのいずれにおいても、全ての子豚(G1〜G5)の胃、盲腸、結腸、扁桃腺、腸間膜リンパ節、心臓、肺、肝臓、脾臓、及び腎臓の切片に顕著な顕微鏡的病変は観察されなかった。
免疫組織化学(IHC)
3DPIに、5つ全ての接種群の回腸、盲腸、及び結腸の連続切片に対して、PEDV特異的IHC染色を行った。G5(陰性対照)の5匹の豚のいずれも、回腸、盲腸、または結腸においてIHC陽性ではなかった。G1〜G4の各々の5匹全部の豚は、回腸においてIHC陽性であり、平均IHCスコアは、3.9(G1)、3.7(G2)、3.8(G3)、及び2.5(G4)であった。回腸の平均IHCスコアは、G1〜G3にわたって類似していたが、G4よりも有意に高かった(図10D)。盲腸のIHC染色に関して、5/5(G1)、4/5(G2)、5/5(G3)、及び3/5(G4)匹の豚が陽性であり、G1〜G4の間の平均IHCスコアに有意差はなかった(図10D)。結腸の場合、5/5(G1)、4/5(G2)、4/5(G3)、及び2/5(G4)匹の豚がIHC染色陽性であったが、平均IHCスコアにはG1〜G4の間の有意差はなかった(図10D)。代表的なPEDVIHC染色画像を図9F〜9Tに示す。
考察
配列解析により、少なくとも2つの遺伝的に異なるPEDV株が米国で循環していることが立証されており(Vlasova et al.,2014;Wang et al.,2014)、それらは、米国PEDVプロトタイプ株及び米国PEDV S−INDEL変異株と称される。米国プロトタイプPEDVは、系統発生的に分岐群1及び分岐群2にさらに分割することができる。全ゲノム配列に基づく系統発生解析において、米国S−INDEL変異型PEDVは、近隣結合系統樹内では分岐群1及び分岐群2とは別個にクラスタ化されたが、最尤系統樹内では分岐群2内に別の亜系統を形成した(図6A、6B)。このことは、系統発生解析ツール及び系統樹構築法が、分析結果にある程度の違いをもたらし得ることを示唆している:したがって、系統発生解析に用いられるツール及び方法を明確に指示することによって慎重に結論が導き出されるべきである。米国プロトタイプPEDVの中でも、あるものは、全ゲノムに基づく系統樹であろうとS1に基づく系統樹であろうとそれに関係なく、常に分岐群1または分岐群2に属するが、あるもの(例えば、NC49469及びMinnesota62)は、全ゲノムに基づく系統樹内では分岐群1に属するが、S1に基づく系統樹内では分岐群2に属する(図6)。それはおそらく、NC49469及びMinnesota62 PEDVのS1配列は分岐群2により密接に関連しているが、残りのゲノム配列が分岐群1のPEDVにより密接に関連しているためである。我々のグループは、上記の各カテゴリーに属する種々のPEDVを細胞培養において単離してきたため、種々の米国プロトタイプ及びS−INDEL変異PEDVの病原性を比較することができる。
材料及び方法
ウイルス分離株及び細胞
米国PEDVプロトタイプ分離株である米国/IN19338/2013及びS−INDEL−変異分離株である米国/IL20697/2014の単離及び特徴付けは、既に記載されている(Chen et al.,2014、Chen et al.,2016)。さらなる3つの米国PEDVプロトタイプ分離株である米国/NC35140/2013、米国/IA49379/2013、及び米国/NC49469/2013は全て、以前に記載されたウイルス単離手順に従って(Chen et al.,2014)、ルーチン診断のためにIowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory(ISU VDL)に提出されて記録保存された子豚の糞便から、本試験のために得られた。PEDVの単離、増殖、及び滴定は全て、記載されたように(Chen et al.,2014)Vero細胞(ATCC CCL−81)中で行った。本試験で用いた全てのPEDV分離株は、豚デルタコロナウイルス(PDCoV)、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、及び豚ロタウイルス(A、B、及びC)、豚生殖器及び呼吸器症候群ウイルス、ならびに豚サーコウイルスに対して陰性であることが確認された。
ウイルスシーケンシング、比較配列解析、及び系統発生解析
以前に記載されたように(Chen et al.,2014)、Illumina MiSeqプラットフォームを用いた次世代シーケンシングにより、本試験において記載されるPEDV分離株の全ゲノム配列を決定し、SeqMan Proバージョン11.2.1(DNAstar Inc、Madison,WI)を用いて組み立てた。これらのPEDV分離株の配列データを、以下の受託番号でGenBankに寄託した:米国/IN19338/2013[KF650371]、米国/NC35140/2013−P7[KM975735]、米国/IA49379/2013[KM975736]、米国/NC49469/2013−P7[KM975737]、及び2014020697−P7[KT860508]。
実験デザイン
動物実験プロトコルは、Iowa State University Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された(承認番号6−14−7821−S、2014年7月10日承認)。50匹の5日齢の子豚を従来の飼育場から購入し、Iowa State University Laboratory Animal Resourcesの設備に送った。全ての豚は、到着時にExcede(登録商標)(Zoetis、Florham Park,New Jersey,USA)を筋肉内注射し、ISU VDLにおいて、直腸スワブのウイルス特異的PCRによってPEDV、PDCoV、TGEV、及び豚ロタウイルス(A、B、及びC群)に対して陰性であることを確認し、血清試料のウイルス特異的な間接蛍光抗体(IFA)法によってPEDV抗体に対して陰性であることを確認した。体重によって豚をひとまとめにし、次いで、各10匹の5つの群に無作為に分け、硬い床の部屋1つ当たり1つの群とした。動物にはEsbilac(Hampshire,IL)液体代用乳及びヨーグルトの混合物を与え、水を自由に摂取できるようにした。1日順化させた後(子豚は6日齢)、1〜5群(G1〜G5)の豚に、3つの米国PEDVプロトタイプ分離株である米国/IN19338/2013−P7(G1)、米国/NC35140/2013−P7(G2)、米国/NC49469/2013−P7(G3)、1つの米国S−INDEL−変異分離株2014020697−P7(G4)、またはウイルス陰性培養培地(G5)を、それぞれ経口胃的に接種した(10ml/豚;全てのウイルスは細胞培養において継代7代目であり、力価は104 TCID50/mlであった)(表4)。
PEDV N遺伝子に基づく定量的リアルタイムRT−PCRによって調べたウイルスの排出
ウイルスRNAを、直腸スワブ、血清、及び10%組織ホモジネートから、以前に記載されたように(Chen et al.,2014)抽出した。Path−ID(商標)Multiplex One−Step RT−PCR Kit(Thermo Fisher Scientific)を使用し、25μlの全反応のPCR設定で5μlの各RNA鋳型を用いた。PEDV N遺伝子に基づく定量的リアルタイムRT−PCRの標準曲線を作製するために使用したプライマー、プローブ、及びin vitro転写RNAは、記載されている(Lowe et al.,2014;Madson et al.,2014;Thomas et al.,2015)。標準曲線に基づいて、検査した試料中のゲノムコピー/mlの単位でウイルス濃度を算出した。平均サイクル閾値(Ct)は、PCR陽性試料に基づいて算出し、平均ウイルス濃度は、群内の全ての豚(PCR陽性及び陰性の両方の豚)に基づいて算出した。
組織病理学
扁桃腺、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、腸間膜リンパ節、胃、十二指腸、近位空腸、中位空腸、遠位空腸、回腸、盲腸、及び結腸の組織を、10%ホルマリンで固定し、包埋し、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色し、個々の動物の識別及び治療群を知らされていない獣医学病理学者が検査した。以前に記載された手順(Madson et al.,2014)に従ってコンピュータ画像システムを使用して、絨毛長及び陰窩深さを、十二指腸、近位空腸、中位空腸、遠位空腸、及び回腸の3つの代表的な絨毛及び陰窩から測定した。各組織の絨毛高さ対陰窩深さ(絨毛/陰窩)の比を、平均絨毛長を平均陰窩深さで除した商として算出した。
免疫組織化学
3DPIの剖検時の回腸、盲腸、及び結腸の連続切片を、以前に記載されたように(Madson et al.,2014)PEDV特異的モノクローナル抗体(BioNote、Hwaseong−si,Gyeonggi−do,Korea)を使用して、免疫組織化学(IHC)によりPEDV抗原について評価した。7DPIの剖検時に、IHC染色を回腸の連続切片に対してのみ行った。IHC抗原の検出は、以下の基準を用いて、以前に記載されたように(Chen et al.,2015)半定量的にスコア化した:0=染色なし;1=約1〜10%の腸細胞に陽性染色;2=約10%〜25%の腸細胞に陽性染色;3=約25%〜50%の腸細胞に陽性染色;4=約50%〜100%の腸細胞に陽性染色。
統計分析
Statistical Analysis System(SAS)バージョン9.3(SAS institute、Cary,NC)を用いた全ての統計的比較には、一般化線形混合(GLIMMIX)モデルを使用した。P値<0.05を統計的に有意であると定義した。全体的な糞便中へのウイルス排出レベルのP値[Log10(ゲノムコピー/ml)]を、DPI及び治療を相互作用変数として用いて、また下痢スコアの分析のために類似性を用いて、0〜7DPIの治療の間で評価した。
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実施例3
少なくとも2つの遺伝的に異なる豚流行性下痢ウイルス(PEDV)株が、アメリカ合衆国で同定されている(米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株)。PEDV特異的抗体の検出のために獣医学診断研究所で提供される現在の血清学的アッセイは、米国PEDVプロトタイプ株に基づいている。本試験の目的は、1)米国PEDV S−INDEL変異株を細胞培養においてに単離し、2)離乳豚を実験的に感染させることにより米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株に対する抗血清を作製し、3)種々のPEDV血清学的アッセイが、米国PEDV S−INDEL変異株に対する抗体を検出することができるかどうか、またはその逆を判定することである。本試験では、米国PEDV S−INDEL変異株を細胞培養において単離した。3つの群のPEDV陰性の3週齢の豚(群当たり5匹の豚)に、米国PEDVプロトタイプ分離株(我々の実験室で以前に単離した)、S−INDEL−変異分離株、またはウイルス陰性培養培地を経口接種した。摂取後0、7、14、21、及び28日に採取した血清試料を、以下のPEDV血清学的アッセイにより評価した:1)プロトタイプ株及びS−INDEL変異株を指示ウイルスとして用いた間接蛍光抗体(IFA)アッセイ、2)プロトタイプ及びS−INDEL変異ウイルスに対するウイルス中和(VN)試験、3)PEDVプロトタイプ株の全ウイルスに基づくELISA、4)PEDVプロトタイプ株のS1に基づくELISA、及び5)PEDV S−INDEL変異株S1に基づくELISA。プロトタイプ株に対する陽性抗血清は、プロトタイプ及びS−INDEL変異ウイルスの両方に反応してそれらを中和し、S−INDEL変異株に対する陽性抗血清もまた、IFA抗体アッセイ及びVN試験によって調べたところ、プロトタイプ及びS−INDEL変異ウイルスに反応してそれらを中和した。2つのPEDV株に対する抗体は、3つ全てのELISAによって検出され得るが、検出率はある程度異なっていた。
出願人は、米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株に対する抗体が、両方の株とin vitroで交差反応し、それらを交差中和したことを示す。米国PEDVプロトタイプ株に基づく現在の血清学的アッセイは、両方の米国PEDV株に対する抗体を検出することができる。
材料及び方法
細胞培養における米国PEDV S−INDEL変異株の単離
以前に記載された手順に従って[7]Vero細胞(ATCC CCL−81)中でウイルスの単離を達成するために、Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory(ISU VDL)において、PEDV N遺伝子に基づくリアルタイムRT−PCRで陽性であり[17、19]、米国PEDV S−INDEL変異株に対して陽性であると確認されたが、S1のシーケンシングにより米国プロトタイプ株に対して陰性であった68個の臨床試料(糞便スワブ27個、糞便24個、小腸13個、及び口腔液4個)を選択した。
米国プロトタイプ及びS−INDEL変異PEDVに対する抗血清の作製
直腸スワブのリアルタイムRT−PCRによって、及び血清のIFA抗体アッセイによってPEDVに対して陰性であることが確認された15匹の3週齢の豚を、3つの群に無作為に分け、1つの群当たり5匹の豚、及び1つの群当たり同様の平均体重となるようにした。3日間順化させた後、3つの群の豚に、米国PEDVプロトタイプ細胞培養分離株である米国/IN19338/2013−P7(Pro群)(配列番号59)[7]、米国PEDV S−INDEL変異細胞培養分離株である米国/IL20697/2014−P7(配列番号62)(Var群)、及びウイルス陰性培養培地(Neg群)を、それぞれ、104 TCID50/mlのウイルス力価、豚1匹当たり10mlで経口胃的に接種した。0〜7DPI、その後10、14、21、及び28DPIに、全ての豚から毎日直腸スワブを採取し、感染を確認するためにPEDV N遺伝子に基づく定量的リアルタイムRT−PCR[20]により検査した。摂取後(DPI)0、7、14、21、及び28日に、交差反応性及び交差中和の評価のために全ての豚から血清試料を採取した。、この動物実験は、Iowa State University IACUC committeeによって承認された手順に従って行われた(承認番号6−14−7809−S)。
間接蛍光抗体(IFA)法
以前に記載された手順に従って、PEDVプロトタイプ株に基づくIFA(Pro IFA)及びS−INDEL変異株に基づくIFA(Var IFA)により80個の血清試料を検査した[20]。PEDVプロトタイプ分離株である米国/IN19338/2013を、Pro IFAアッセイにおける指示ウイルスとして用いて、S−INDEL−変異分離株である米国/IL20697/2014を、Var IFAアッセイにおける指示ウイルスとして用いた。1:40またはそれ以上の血清希釈率における陽性シグナルを、IFA抗体陽性であると見なした。
抗体検出のためのPEDV ELISA
PEDV特異的IgG抗体の検出ために、ISU VDLで、米国PEDVプロトタイプ株の全ウイルスに基づく間接ELISA(ProWV ELISA)を開発及び検証した[15、16]。全ての血清試料は、詳細に記載された手順に従ってこのProWV ELISAによって検査した[20]。>0.8の試料対陽性(S/P)比を抗体陽性と見なし、0.6〜0.8のS/P比を疑い例と見なし、そして<0.6のS/P比を陰性と見なした。
ウイルス中和(VN)試験
以前に記載された手順に従って、米国PEDVプロトタイプ株に基づくVN(Pro VN)及び米国PEDV S−INDEL変異株に基づくVN(Var VN)により血清試料を検査した[20]。PEDVプロトタイプ分離株である米国/IN19338/2013をPro VNアッセイにおける指示ウイルスとして用い、S−INDEL−変異分離株である米国/IL20697/2014をVar VNアッセイにおける指示ウイルスとして用いた。陰性血清対照と比較して>90%の染色の減少をもたらす最も高い血清希釈率の逆数を、血清試料のVN力価として定義した。≧8のVN力価を陽性であると見なした。
統計分析
Pro IFA及びVar IFAによって検査したPro抗血清及びVar抗血清のLog2(IFA力価/10)を、一般化線形混合(GLIMMIX)において試験した。摂取後日数及び抗原は、独立した変数として使用し、豚ID及び豚IDと抗原との相互作用を変量効果として設定した。Pro VN及びVar VNによって検査したPro抗血清及びVar抗血清のLog2(VN力価)も同様に分析した。ELISA分析には、ELISA抗原、豚ID、及び豚DPIを、独立した変数として用いた。全ての統計分析は、Statistical Analysis System(SAS)バージョン9.3(SAS institute、Cary,NC,USA)を用いて行い、<0.05のP値を有意差と見なした。
結果
細胞培養における米国PEDV S−INDEL変異株の単離
最初、ウイルスの単離を、ISU VDLで受け取った、米国PEDV S−INDEL変異株に対して陽性を示した68個の臨床サンプルに対して試みたが、細胞培養におけるウイルスの単離は失敗に終わった。その後、PEDV S−INDEL変異株陽性の腸ホモジネートを用いて3匹の3週齢の豚に接種した。豚の直腸スワブは、2DPIにPEDV RT−PCR Ct<15を有しており、3DPIに豚を安楽死させて剖検した。他の2匹の豚の直腸スワブは、3DPIにPEDV RT−PCR Ct<15を有しており、4DPIに両方の豚を安楽死させて剖検した。剖検時に採取された小腸組織及び盲腸内容物を、Vero細胞中でウイルスの単離を行うために用いた。米国PEDV S−INDEL変異株は、3匹全ての豚から採取した小腸ホモジネート及び盲腸内容物からの単離に成功した。合胞体形成及び細胞剥離を含む典型的なPEDVの細胞変性効果が観察され、PEDV特異的モノクローナル抗体SD6−29を用いた蛍光免疫染色によってウイルス増殖が確認された。
米国プロトタイプ及びS−INDEL変異PEDVに対する抗血清の作製
直腸スワブのPCR試験によって裏付けられるように、米国PEDVプロトタイプ分離株である米国/IN19338/2013−P7(配列番号59)及びS−INDEL−変異分離株である2014020697−P7(配列番号62)は、全ての接種豚において確立された。PEDVのリアルタイムRT−PCRによって検査したところ、プロトタイプ群では、4/5、5/5、5/5、5/5、5/5、5/5、及び3/5匹の豚が、2、4、7、10、14、21、及び28DPIに、それぞれ、直腸スワブ中にウイルスを排出した。S−INDEL変異体群では、3/5、5/5、5/5、5/5、4/5、3/5、及び1/5匹の豚が、2、4、7、10、14、21、及び28DPIに、それぞれ、直腸スワブ中にウイルスを排出した。陰性対照豚の直腸スワブは、試験期間全体を通してPEDV PCR陰性のままであった。全体で、0、7、14、21、及び28DPIに、25個の抗血清をプロトタイプ株接種豚(Pro抗血清)から採取し、25個の抗血清を変異株接種豚(Var抗血清)から採取し、25個の抗血清を陰性対照群(Neg抗血清)から採取した。
PEDV IFA抗体アッセイによる米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株に対する抗体の交差反応性の評価
図13に示されるように、Pro抗血清は、プロトタイプ株に基づくIFA抗体アッセイ(Pro IFA)において、0及び7DPIには抗体陰性を示し(0/5)、14、21、及び28DPIには100%陽性を示した(5/5)。変異株に基づくIFA(Var IFA)は、Pro抗血清について同様の結果を示したが、例外として、14DPI日に採取された血清はVar IFAアッセイで陰性であった。抗体力価を比較した場合、陽性Pro抗血清は、全体的にVar IFAアッセイに対するよりもPro IFAアッセイに対して良好に反応し、平均すると力価は1.4 log2高かった(図13)。
種々のPEDV ELISAによる米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株に対する抗体の交差反応性の評価
図14に示されるように、0及び7DPIに採取したPro抗血清は、ProWV ELISA、ProS1 ELISA、及びVarS1 ELISAで全て抗体陰性であった。14DPIに採取されたPro抗血清の場合、ProWV ELISAでは2つの血清が陽性、3つが疑い例の範囲であり;ProS1 ELISAでは3つが陽性、1つが疑い例であり;VarS1 ELISAでは2つが陽性、1つが疑い例であった。21及び28DPIに採取されたPro抗血清は、3つのELISAで全て陽性であった。各ELISAにより14、21、及び28DPIに陽性であったPro抗血清の合計数を比較した場合、米国PEDVプロトタイプ株に対する抗体を検出するための3つのELISAの間に有意差はなかった。
ウイルス中和試験による米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株に対する抗体の交差中和の評価
図15に示されるように、Pro VNまたはVar VNアッセイによる検査にかかわらず、プロトタイプ株またはS−INDEL変異株のいずれかを接種したほとんどの豚の血清中に、早ければ7DPIにはVN抗体が検出された。PEDVプロトタイプ株またはS−INDEL変異株を接種した全ての豚から14、21、及び28DPIに接種した血清試料は、Pro VN及びVar VNアッセイの両方でVN抗体陽性であった。
考察
出願人は、以前にVero細胞中で米国PEDVプロトタイプ株を単離した[7]。評価のために株特異的抗血清を作製するための米国PEDV S−INDEL変異株の細胞培養分離株を得るために、最初、ウイルスの単離を、ISU VDLに提出された68個のPEDV S−INDEL変異株陽性の臨床試料を用いてVero細胞中で試みた。しかしながら、これらの試料から細胞培養においてS−INDEL変異ウイルスを単離することは失敗に終わった。これは、試料中のウイルス濃度が低かったこと、いくつかの試料の細胞毒性、及び採取後の臨床試料の様々な保管条件等の複数の要因による可能性がある。次に、68個の臨床試料のうち、S−INDEL変異PEDVを含有する1つの腸ホモジネートを豚に接種して、細胞培養におけるウイルス単離の試みのために十分なウイルス負荷を有するより新鮮な材料を作製した。この手法を用いて、米国S−INDEL変異PEDVをVero細胞中で成功裏に単離した。試料中のウイルス濃度が高いこと、及び新鮮な試料に対して即座にウイルス単離を試みることが、細胞培養におけるウイルス単離の成功への鍵であると推察される。自然感染動物の臨床試料から直接的に細胞培養においてそれらのウイルスを単離することが困難な状況にある他のウイルスの場合、本試験に記載される手法、すなわち、細胞培養においてウイルス単離を試みるための高濃度のウイルスを含む新鮮な試料を得るために、宿主動物においてウイルスを増幅することが、考慮され得る。
結論
本試験のデータは、米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株に対する抗体が、両方の株とin vitroで交差反応し、それらを交差中和したことを示唆している。米国PEDVプロトタイプ株に基づく現在の血清学的アッセイは、両方の米国PEDV株に対する抗体を検出することができる。しかしながら、これら2つのPEDV株の交差防御効果は、in vivoの豚試験によって決定される必要がある。Goedeら[23]は、7ヶ月前にS−INDEL変異PEDV感染に曝露した雌豚が、米国PEDVプロトタイプ株でチャレンジした新生子豚に部分的な保護を提供できたことを示した。しかしながら、この点に関して、米国の豚に循環している両方のPEDV株に対して保護を提供するためのワクチンを開発するために、米国PEDVプロトタイプ株またはS−INDEL変異株またはその両方が用いられるべきかどうかを明らかにするために、より多くのin vivo試験が必要である(この点に関するさらなる研究については実施例5及び6を参照されたい)。
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実施例4
現在のPEDVの大流行、及び有効なワクチンの欠如に対応して、本発明は、現在、世界規模で流行しているスペクトラムに対して有効であり、特に、全て上に概説したように、豚の群れに壊滅的な損失を引き起こしてきた、いわゆるプロトタイプウイルス(一例は周知の米国/Colorado/2013であり、その配列はGenBank受託番号KF272920の下に入手可能である)に対して交差防御性である、INDEL型変異体(そのさらなる例はOH851であり、Ohio Department of Agriculture,L.Wang et al.,Emerg.Infect.Dis.,2014,v.20,pp.917−919によって最初に記載された)に基づく、修飾生ワクチンの提供という大きな成果を提供する。完全に新規の、画期的医薬品である本発明のワクチンはまた、投薬及び投薬のタイミングに関してかなりの柔軟性を与え、例えば、妊娠前及び妊娠中の両方の雌豚への投与、ならびにナイーブな雌豚のもとに生まれた子豚を含む子豚への投与に有効である。種豚に関する有効性もまた提供される。結果的に、そのようなワクチンは、アジュバント化及び非アジュバント化形態の両方において、プロトタイプ及び新しく出現するINDEL型分離株を含むPEDVによるチャレンジに対して、経産豚、未経産豚、子豚、成豚、及び種豚に保護を提供する。本発明のワクチンは、したがって、以下を成功裏に達成することにより、以前は達成不可能であった保護効果を提供する。(1)PEDVによって引き起こされる疾患(食欲不振、体重減少、脱水、発熱、下痢、嘔吐、授乳能力の低下、生殖能力の低下)に対する保護、予防、予防における補助、または抑制における補助のための、妊娠中の経産豚及び未経産豚のワクチン接種、(2)PEDVによって子豚に引き起こされる疾患及び死亡に対する保護、予防、予防における補助、または抑制における補助のための、妊娠中の経産豚及び未経産豚のワクチン接種、(3)PEDVによって引き起こされる疾患に対する保護、予防、予防における補助、または抑制における補助のための、1日齢以上の豚のワクチン接種、(4)後続の分娩の前にまたは年に1回、雌豚に投与されるブースターワクチン接種、(5)健康な豚は、PEDV MLVを接種され、次いでPEDV不活化ワクチンによってブーストされ得ること、ならびに(6)一般的に、PEDVによって引き起こされる体重損失または体重増加失敗から豚を保護すること等。
プロトタイプ株である米国/IN19338/2013の弱毒化
2013年4月に米国で出現して以来、豚流行性下痢ウイルス(PEDV)は、急速に国中に広まり、最初の年には推定800万匹の豚を死に至らしめ、9億ドルから18億ドルの経済的損失をもたらした[1]。また、PEDVは、中国、日本、韓国、フィリピン、タイ、ベトナム、カナダ、メキシコ、ドイツ、ベルギー、フランス、及びポルトガルを含む多くの国々で、最近になって出現または再出現している[2〜10]。そのため、PEDVは、依然として世界中の養豚業界への重大な課題として残っている。現在、米国では、2つの市販のPEDVワクチン(不活化ワクチン及びRNA粒子ワクチン)が存在する。しかしながら、いくつかの実験により、これらのPEDVワクチンは、以前にPEDVに曝露された群れにおいて良好なIgG及びIgA免疫応答を誘導したが、ワクチン接種後のナイーブな豚には良好なIgA応答を誘導しなかったことが示された[11〜12]。修飾生ウイルス(MLV)PEDVワクチンは、粘膜免疫を誘導するための不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンよりも有効性が高い。しかしながら、新しく出現する米国株に対するそのような安全かつ有効なMLV PEDVワクチンは、現在のところ存在しない。本試験の目的は、細胞培養において連続継代した後に、米国の毒性PEDVプロトタイプ分離株のゲノム及び病原性変化を特徴付け、結果として得られたウイルスのいずれかがPEDに対する潜在的なMLVワクチン候補となり得るかどうかを決定することであった。
材料及び方法
以前に我々の実験室で単離された米国PEDVプロトタイプ株の細胞培養分離株である米国/IN19338/2013[13]を、Vero細胞中で100継代、連続継代した。選択されたウイルスの病原性変化を新生豚モデルにおいて評価した。PEDウイルス及び抗体を持たない60匹の子豚(5日齢)を、群当たり豚10匹の6つの群に無作為に分けた。豚には代用乳を与えた。1〜5群(G1〜G5)には、継代7代目(配列番号59)、継代25代目(配列番号71)、継代50代目(配列番号72)、継代75代目(配列番号74)、及び継代100代目(配列番号75)に、それぞれ、PEDV米国/IN19338/2013(104TCID50/ml、10ml/豚)を経口接種し、6群(G6)には、同じ体積のウイルス不含培養培地を陰性対照として投与した(表6)。臨床的観察を記録した。直腸スワブを到着時及び毎日採取し、PEDVヌクレオカプシド遺伝子に基づく定量的リアルタイムRT−PCR14によって検査した。各群から5匹の豚を、摂取後(DPI)3日及び7日にそれぞれ剖検した。小腸、盲腸、及び結腸の肉眼的及び顕微鏡的病変を調べ、免疫組織化学(IHC)染色を行った。顕微鏡的病変の重症度を以下のように分類した:0=病変なし、1=最小限の絨毛萎縮、2=軽度の絨毛萎縮、3=中程度の絨毛萎縮、及び4=重度の絨毛萎縮。IHC染色は、以下のようにスコア化した:0=シグナルなし、1=最小限の染色、2=軽度の染色、3=中程度の染色、及び4=激しい染色。元の組織ホモジネート中、ならびに継代P3、P7、P9、P25、P50、P65、P75、及びP100のウイルスの全ゲノム配列を、次世代シーケンシング技術を用いて決定した[13]。
連続継代するにつれて、ウイルスは細胞培養により適合するようになった。P50、P75、及びP100のPEDV米国/IN19338/2013のより高い継代は、より効率的に増殖し、より高い感染力価を達成した(図17)。
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米国S−INDEL変異株である米国/IL20697/2014(2014020697)の弱毒化
図24ならびに表1及び2は、変異株である米国/IL20697/2014の弱毒体に対応するアミノ酸変化に関する特定の情報を提供する。変異分離株である米国/IL20697/2014を、2つの独立した系統に細胞培養において連続継代した。
MFLGLFQYTIDTVVKDVSKSANLSLDAVQELELNVVPIRQASNVTGFLFTSVFIYFFALFKASSLRRNYIMLAARFAVIVLYCPLLYYCGAFLDATIICCTLIGRLCLVCFYSWRYKNALFIIFNTTTLSFLNGKAALTANPL。
実施例5
(2回投与試験)約1日齢及び21日齢に経口投与した後、病原性PEDVによるチャレンジを行ったPEDV INDELウイルスの安全性及び交差防御
本試験の目的は、3(+/−2)日齢(0日目)及び21日目に子豚に経口投与した後、35日目(+/−2)毒性PEDvによるチャレンジを行った場合に、PEDの変異(INDEL)株、米国/IL/2014−20697に由来するPEDV分離株の特定の弱毒継代の安全性及び交差防御を決定することであった。安全性は、0日目及び21日目の接種後PEDvに関連する死亡発生率及び臨床徴候によって決定した。交差防御の指標は、チャレンジ後の毒性PEDvに関連する死亡発生率及び臨床徴候によって決定した。検査したウイルスは、DNA配列からコードされたものである:(a)配列番号36(クローンG6bと称され、その継代18代目と19代目との間で変化しないままである);(b)配列番号37(クローンF6と称され、その継代18代目と19代目との間で変化しないままである);及び(c)米国/IL/2014−2069祖先からの異なるセットの継代に由来、その継代38代目(配列番号78)。配列番号36と37とは、ポリタンパク質1a/1bのコードされたアミノ酸の位置551が、551位でLまたはPのいずれかであるという点においてのみ、互いに異なることを留意されたい(配列番号46のDATの直後を参照)。
継代38代目の材料は、早期死亡数(その後明らかではない)が少ないことに寄与しており、その後続する継代60代目(配列番号66)は、この状況を緩和するために作製されたことに留意されたい(表7)。
1日齢の子豚における単回投与の有効性及び安全性
配列番号36(クローンG8b)及び配列番号37(クローンF6a)に対応する(からコードされた)弱毒PEDVウイルスは、ワクチンとして優れた有効性を示し、毒性の北米プロトタイプウイルス(例えば、米国/Colorado/2013、GenBank受託番号KF272920に代表される)による後のチャレンジに対する交差防御を提供する。たとえ母豚がPEDVナイーブであっても、すなわち、血清陰性であり、野生型ウイルスに曝露されたことがないか、またはワクチン接種されたことがないかのいずれかである場合でも、そのような防御は、早ければ生後1日目に子豚に提供される単回投与のワクチンのみで達成される。このレベルの有効性は、雌豚及び子豚がワクチン接種される場合に、どのように豚の操作が管理されるかという点において手順に多大な柔軟性を与え、また、ワクチン接種前の任意の動物の血清状態を決定するためのアッセイを行うことなく、雌豚の群れまたは子豚にワクチン接種する能力を手順に与える。PEDV感染の病状は出生時の子豚において最も深刻であり、動物の年齢とともにワクチン接種が減少する(必要性または価値も減少する)ことを考慮すると、これらの結果は重要である。配列番号36及び37のウイルスを組み込んだワクチンは、母豚が子豚の出生前に血清陽性であるか血清陰性であるかにかかわらず有用であり、初乳に由来する母親由来抗体は、本発明のワクチンが有効であることの妨げにはならず、母豚が以前に野生株、ワクチン株に感染したか(それによって子豚から感染することを含む)、または生ワクチンもしくは不活化ワクチンをワクチン接種されたかどうか(いずれの場合も種付け前及び分娩前を含む1回以上)にかかわらず、有用であることに留意されたい。生産者によって所望される場合、第2の用量が子豚に与えられてもよい。
実際のチャレンジ材料(1x105 TCID50/5ML用量の濃度を有する)は、米国/Colorado/2013、GenBank受託番号KF272920、具体的には、アイオワ州の農場からのUniversity of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory受託番号D13−031630からの現代の北米で流行する分離株と、密接に関連している。試料は、ロタウイルスA、B、及びC、TGE、Clostridium difficile毒素、ならびにClostridium perfringensに対して陰性である。
実施例7
序文
豚流行性下痢ウイルス(PEDV)は、2013年4月に最初にアメリカ合衆国(米国)で検出された[1]。現在、少なくとも2つの遺伝的に異なるPEDV株が同定されており、米国の豚において同時循環している(米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株)[2〜4]。以前の試験において、我々は、米国S−INDEL変異株は、5日齢の子豚において米国プロトタイプ株よりも病原性が低いことを実験的に確認した[5]。しかしながら、PEDVの病原性は年齢依存性であり得る[6〜7]。本試験の目的は、1)離乳豚において2つの米国PEDV株の病原性の違いを評価すること、及び2)離乳豚における2つの株の交差防御の有効性を調べることである。
材料及び方法
85匹の3週齢の豚を従来の飼育場から購入し、Iowa State University Laboratory Animal Resourcesの設備に送った。全ての豚は、到着時にExcede(登録商標)を筋肉内注射し、直腸スワブのウイルス特異的PCRによってPEDV、豚デルタコロナウイルス、及び伝染性胃腸炎ウイルスに対して陰性であることを確認し、血清試料のウイルス特異的な間接蛍光抗体(IFA)法によってPEDV抗体に対して陰性であることを確認した。
結果
3週齢の豚における米国PEDVプロトタイプ株及びS−INDEL変異株の病原性比較。D0〜D28に、7つの豚の群を3つに分類した:P株接種(P/V及びP/P群)、V株接種(V/V及びV/P群)、及び陰性培養培地接種(N/V、N/P、及びN/N群)。
D28の2回目接種後に、糞便中へのウイルス排出を7つの群間で比較した(図1)。V株でチャレンジした3つの群では、P/V及びV/V群が、全体としてD28〜D56に同様の量のウイルスを排出したが(P=0.9422)、P/V及びV/V群の両方が、N/V群よりも有意に少ない量のウイルスを排出した(P<0.0001)。P株でチャレンジした3つの群では、V/P及びP/P群が、D28〜D56にN/P群よりも有意に少ない量のウイルスを排出したが(P<0.0001)、D34に他の日よりも大幅に多い量のウイルスを排出したV/Pは、D28〜D56にP/P群よりも有意に多くのウイルスを排出していた(P=0.0001)。
抗体応答
1回目接種後、P株(P/P及びP/V群)またはV株(V/V及びV/P群)を接種した全ての豚が、どのウイルス株が指示ウイルスとして用いられたかに関係なく、D7〜D14からIFA及びVN抗体を生じた(図32A、32B、33A、33B)。平均抗体力価は、全てのPEDV接種群のD21及びD28にピークとなった。これらの4つの群のPEDV抗体力価は、D28のチャレンジ後にやや増加し、その後、試験の終了まで維持された(D56)。N/P及びN/V群は、D42(2回目接種後14日目)までPEDV抗体陰性であったが、その日にIFA及びVN抗体が検出可能となり、D56まで維持された。N/N群は、D0〜56までPEDV抗体陰性のままであった。
総括
米国PEDVプロトタイプ株は、3週齢の豚においてS−INDEL変異株よりも高いレベルの糞便中へのウイルス排出を達成したと考えられるが、7週齢の豚においてその反対が観察された。しかしながら、プロトタイプ及びINDELワクチンが成長した豚においてピーク有効性を提供する最適な年齢を決定するために、この観察はさらに裏付けられる必要がある。米国PEDVプロトタイプ株は、離乳豚において、相同株及び異種株の両方を用いたチャレンジに対する保護を提供し、米国PEDV S−INDEL変異株は、離乳豚において、相同株によるチャレンジに対する保護を提供し、異種(プロトタイプ)株によるチャレンジに対しては少なくとも部分的な保護を提供した。
1.Stevenson GW,Hoang H,Schwartz KJ,Burrough EB,Sun D,Madson D,Cooper VL,Pillatzki A,Gauger P,Schmitt BJ,Koster LG,Killian ML,and Yoon KJ.(2013).Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs,lesions,and viral genomic sequences.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 25(5): 649−654.
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非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
[態様1]
配列番号67と全長ヌクレオチドレベルで少なくとも95%同一であり、かつ以下のアミノ酸の特徴のうちの1つ以上を含むDNAポリヌクレオチドによってコードされる、単離された豚流行性下痢ウイルス(PEDV):
(a)配列番号46の参照によって決定されるポリタンパク質1a/1bの551位のLもしくはP(DATの直後)、またはその保存的置換、
(b)配列番号47の参照によって決定されるスパイクタンパク質の1009位のP(NITの直後)、またはその保存的置換、
(c)配列番号47の参照によって決定されるスパイクタンパク質の973位のH(PFSの直後)、またはその保存的置換、及び
(d)ORF3の翻訳の早期終止をもたらすORF3のコード配列の修飾。
[態様2]
配列番号35、36、または37に記載の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、態様1に記載のウイルス。
[態様3]
前記ウイルスをコードする前記DNAポリヌクレオチドは、配列番号67と全長ヌクレオチドレベルで少なくとも98%同一である、態様1に記載のウイルス。
[態様4]
前記ウイルスをコードする前記DNAポリヌクレオチドは、配列番号67と全長ヌクレオチドレベルで少なくとも99%同一である、態様1に記載のウイルス。
[態様5]
前記ウイルスをコードする前記DNAポリヌクレオチドは、配列番号67と全長ヌクレオチドレベルで少なくとも99.5%同一である、態様1に記載のウイルス。
[態様6]
前記ORF3の修飾は、138〜143位のアミノ酸LTANPL(配列番号48のNGKAAの直後)に生じる欠失、及び143位の後のORFタンパク質の切断を含む、態様1に記載のウイルス。
[態様7]
示されるアミノ酸のうちの1つ以上の保存的置換は、(1)ロイシンに対するバリンまたはイソロイシン、(2)プロリンに対するグリシン、及び(3)ヒスチジンに対するリジンまたはアルギニンから選択される、態様1に記載のウイルス。
[態様8]
組成物は、PEDVの変異株及びプロトタイプ株の両方によるチャレンジから豚を保護すること、及びPEDV感染に関連する1つ以上の症状を予防または治療することが可能であり、保護の達成は、PEDV感染の症状である脱水、発熱、下痢、嘔吐、授乳能力の低下、生殖能力の低下、死亡のいずれかの予防または管理、及び体重減少もしくは体重増加失敗の予防または管理からなる群から選択されるエンドポイントによって決定される、態様1に記載の豚流行性下痢ウイルス(PEDV)、及び担体を含む、ワクチン組成物。
[態様9]
前記ウイルスは、生または不活化ウイルスである、態様8に記載のワクチン組成物。
[態様10]
前記担体は、希釈剤である、態様8に記載のワクチン組成物。
[態様11]
アジュバントをさらに含む、態様9に記載のワクチン組成物。
[態様12]
前記保護される豚は、経産豚、未経産豚、種豚、成豚、及び子豚のいずれかを含む、態様8に記載のワクチン組成物。
[態様13]
前記ワクチンは、単回用量プログラムにおいて有効である、態様12に記載のワクチン組成物。
[態様14]
前記ワクチンは、2回用量プログラムにおいて有効である、態様12に記載のワクチン組成物。
[態様15]
第1の用量は、前記子豚が約1〜7日齢のときに投与され、第2の用量は、前記子豚が2〜5週齢のときに投与される、態様14に記載のワクチン組成物。
[態様16]
前記単回用量は、約1〜21日齢で、好ましくは約1〜7日齢で投与される、態様13に記載のワクチン組成物。
[態様17]
最小有効量は、約10〜約106 log10 TCID50である、態様8のいずれかに記載のワクチン組成物。
[態様18]
前記アジュバントは、油、通常は軽質流動パラフィンに溶解させた脱油レシチン、及び水酸化アルミニウムである、態様11に記載のワクチン組成物。
[態様19]
前記アジュバントは、CpG/DEAE−デキストラン/鉱油(TXO)である、態様11に記載のワクチン組成物。
[態様20]
ヌクレオチド配列は、(1)配列番号46の551位(DATの直後)に対応するそのアミノ酸位置にプロリン残基を有するORF1a/1bタンパク質、及び(2)配列番号47の973位(PFSの直後)に対応するそのアミノ酸位置にヒスチジン残基を有するスパイクタンパク質のうちの一方または両方を含む、配列番号37と全長ヌクレオチドレベルで少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なヌクレオチド配列によってコードされる単離された豚流行性下痢ウイルス(PEDV)。
[態様21]
PEDVによって子豚に引き起こされる疾患を治療または予防する方法であって、前記子豚が約1〜7日齢のときに、前記子豚に第1の用量の態様8に記載のワクチン組成物を投与することを含む、方法。
[態様22]
前記投与することは、前記子豚が約2〜5週齢のときに、第2の用量の前記ワクチンを投与することをさらに含む、態様21に記載の方法。
[態様23]
2つの用量が前記子豚に投与され、雌親豚は、種付け前にはワクチン接種されるが、分娩前にはワクチン接種されない、態様22に記載の方法。
[態様24]
2つの用量が前記子豚に投与され、前記雌親豚は分娩前にワクチン接種される、態様22に記載の方法。
[態様26]
PEDVによって子豚に引き起こされる疾患を治療または予防する方法であって、前記子豚が約1〜7日齢のときに、前記子豚に単回有効量の態様8に記載のワクチン組成物を投与することを含み、母豚は、PEDVに曝露されておらず、かついかなる時もワクチン接種されない、方法。
[態様27]
態様1に記載のコードするDNAポリヌクレオチドに対応する全長RNAポリヌクレオチド、またはその相補体。
[態様28]
感染性クローンである、態様27に記載のRNAポリヌクレオチド。
[態様29]
態様1に記載のコードするDNAポリヌクレオチドを含む、プラスミドまたは細菌人工染色体。
[態様30]
継代したINDEL変異株豚流行性下痢ウイルス(PEDV)と、
担体と、を含み、
前記継代したINDEL変異株は、以下のアミノ酸置換もしくは欠失のうちの1つ以上を有する以下のタンパク質のうちの1つ以上、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、弱毒生ウイルス組成物:
配列番号46の参照によって決定されるPEDVスパイクタンパク質、それに対応する相同体、またはその保存的置換の、633位のリジン(K)(KPLの直後のK)、884位のアルギニン(R)(DPAの直後のR)、959位のアラニン(A)(GGMの直後のA)、345位のバリン(V)(LSFの直後)、48位のロイシン(L)(AVVの直後のL)、1225位のアスパラギン酸(D)(SLVの直後のD)、973位のヒスチジン(H)(PFSの直後のH)、及び1272位のスレオニン(T)(FNAの直後のT);
配列番号48の参照によって決定されるPEDV ORF3タンパク質、それに対応する相同体、またはその保存的置換の、189位のロイシン(L)の欠失(NPLの直後のL)、138〜144の欠失(KAAの直後)、8位のチロシン(Y)の欠失(LFOの直後のY)、及び174〜189位の欠失(LAIの直後);
配列番号51の参照によって決定されるPEDVヌクレオカプシドタンパク質、それに対応する相同体、またはその保存的置換の27位ヒスチジン(H)(VTNの直後のH);
配列番号46の参照によって決定されるPEDVポリタンパク質1a/1b、それに対応する相同体、またはその保存的置換の、1591位のメチオニン(M)(KVSの直後M)、5087位のセリン(S)(FSTの直後のS)、及び6138位のS(TFSの直後のS);
配列番号49の参照によって決定されるPEDVエンベロープタンパク質、それに対応する相同体、またはその保存的置換の62位のフェニルアラニン(F)(VYKの直後のF);ならびに
配列番号45の参照によって決定されるPEDV膜タンパク質、それに対応する相同体、またはその保存的置換の5位のアラニン(A)(SNGの直後のA)及び183位のイソロイシン(I)(YGGの直後のI)。
[態様31]
前記継代したINDEL変異株は、示されるアミノ酸置換を有する以下のタンパク質、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、態様1に記載の弱毒生ウイルス組成物:
PEDVスパイクタンパク質(例えば、配列番号47)の633位のK(KPLの直後のK);及び
PEDV ORF3タンパク質(配列番号48)の189位のLの欠失(NPLの直後のL)。
[態様32]
前記継代したINDEL変異株は、示されるアミノ酸置換を有する以下のタンパク質、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、態様1に記載の弱毒生ウイルス組成物:
PEDVスパイクタンパク質(配列番号47)の633位のK(KPLの直後のK)及び884位のR(DPAの直後のR);
PEDV ORF3タンパク質(配列番号48)の189位のLの欠失(NPLの直後のL)。
[態様33]
前記継代したINDEL変異株は、示されるアミノ酸置換を有する以下のタンパク質、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、態様1に記載の弱毒生ウイルス組成物:
PEDVスパイクタンパク質(配列番号47)の884位のR(DPAの直後のR)及び959位のA(GGMの直後のA);
PEDV ORF3タンパク質(配列番号48)の189位のLの欠失(NPLの直後のL)。
[態様34]
前記継代したINDEL変異株は、示されるアミノ酸置換を有する以下のタンパク質、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、態様1に記載の弱毒生ウイルス組成物:
PEDVスパイクタンパク質(配列番号47)の、48位のL(AVVの直後のL)、345位のV(LSFの直後)、884位のR(DPAの直後のR)、及び959位のA(GGMの直後のA);
PEDV ORF3タンパク質(配列番号48)の138〜144の欠失(KAAの直後)及び189のLの欠失(NPLの直後のL);ならびに
PEDV ヌクレオカプシドタンパク質(配列番号51)の27位のH(VTNの直後のH)。
[態様35]
前記継代したINDEL変異株は、示されるアミノ酸置換を有する以下のタンパク質、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、態様1に記載の弱毒生ウイルス組成物:
PEDVスパイクタンパク質(配列番号47)の、884位のR(DPAの直後のR)、959位のA(LIGGMの直後のA)、及び1225位のD(SLVの直後のD);
PEDV ORF3タンパク質(配列番号48)の、8位のYの欠失(LFOの直後のY)、138〜144の欠失(KAAの直後)、及び174〜189位の欠失(LAIの直後);
PEDVポリタンパク質1a/1b(配列番号46)の、1591位のM(KVSの直後M)、5087位のS(FSTの直後のS)、及び6138位のS(TFSの直後のS);
PEDVエンベロープタンパク質(配列番号49)の62位のF(VYKの直後のF);ならびに
PEDV膜タンパク質の183位のI(YGGの直後のI)。
[態様36]
前記株は、配列番号40、41、42、43、44、または45のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれらの保存的に修飾された変異体を含む、態様36に記載の株。
[態様37]
前記継代したINDEL変異株は、示されるアミノ酸置換を含む以下のタンパク質、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、態様1に記載の弱毒生ウイルス組成物:
PEDVスパイクタンパク質(配列番号47)の、884位のR(DPAの直後)、959位のA(LIGGMの直後)、973位のH(PFSの直後のH)、及び1225位のD(SLVの直後のD);
PEDV ORF3タンパク質(配列番号48)の、8位のYの欠失(LGLFOの直後のY)、138〜144の欠失(KAAの直後)、及び174〜189位の欠失(LYLAIの直後)、
PEDVポリタンパク質1a/1b(配列番号46)の、1591位のM(KVSの直後のM)、5087位のS(FSTの直後のS)、及び6138位のS(TFSの直後のS);
PEDVエンベロープタンパク質(配列番号49)の62位のF(VYKの直後のF);ならびに
PEDV膜タンパク質の5位のA(SNGの直後のA)及び183位のI(YGGの直後のI)。
[態様38]
前記継代したINDEL変異株は、示されるアミノ酸置換を含む以下のタンパク質、またはその保存的に修飾された変異体をコードする、態様1に記載の弱毒生ウイルス組成物:
PEDVスパイクタンパク質(配列番号47)の、48位のL(AVVの直後)、345位のV(LSFの直後)、及び1272位のT(FNAの直後のT);
PEDVエンベロープタンパク質(配列番号49)の62位のS(VYKの直後のS);ならびに
PEDVヌクレオカプシドタンパク質(配列番号51)の27位のH(VTNの直後のH)。
[態様39]
弱毒生変異豚流行性下痢ウイルス(PEDV)及び担体を含むワクチン組成物であって、前記株は、態様30に列挙される置換もしくは欠失、またはそれらの保存的変異体のうちの1つ以上をコードし、前記組成物は、PEDVの変異株及びプロトタイプ株の両方によるチャレンジから豚を保護すること、及びPEDV感染に関連する1つ以上の症状を予防または治療することが可能であり、前記保護は、脱水、発熱、下痢、嘔吐、授乳能力の低下、生殖能力の低下、死亡、及び体重減少もしくは体重増加失敗の予防または管理からなる群から選択されるエンドポイントによって評価される、ワクチン組成物。
[態様40]
前記担体は、希釈剤である、態様30に記載のワクチン組成物。
[態様41]
前記希釈剤は、滅菌希釈剤である、態様40に記載のワクチン組成物。
[態様42]
アジュバントをさらに含む、態様40に記載のワクチン組成物。
[態様43]
前記保護される豚は、経産豚、未経産豚、種豚、成豚、及び子豚のいずれかを含む、態様39に記載のワクチン組成物。
[態様44]
1日齢以上の子豚に有効である、態様43に記載のワクチン組成物。
[態様45]
前記ワクチンは、単回用量プログラムにおいて有効である、態様44に記載のワクチン組成物。
[態様46]
前記ワクチンは、2回用量プログラムにおいて有効である、態様44に記載のワクチン組成物。
[態様47]
第1の用量は、前記子豚が約1〜7日齢のときに投与され、第2の用量は、前記子豚が2〜5週齢のときに投与される、態様46に記載のワクチン組成物。
[態様48]
最小有効量は、約10〜約106 log10 TCID50である、態様10のいずれかに記載のワクチン組成物。
[態様49]
前記アジュバントは、油、通常は軽質流動パラフィンに溶解させた脱油レシチン、及び水酸化アルミニウムである、態様42に記載のワクチン組成物。
[態様50]
前記アジュバントは、CpG/DEAE−デキストラン/鉱油(TXO)である、態様42に記載のワクチン組成物。
[態様51]
弱毒生変異豚流行性下痢ウイルス(PEDV)及び担体を含むワクチン組成物であって、前記組成物は、PEDVの変異株及びプロトタイプ株の両方によるチャレンジから豚を保護すること、及びPEDV感染に関連する1つ以上の症状を予防または治療することが可能であり、保護の達成は、PEDV感染の症状である脱水、発熱、下痢、嘔吐、授乳能力の低下、生殖能力の低下、死亡のいずれかの予防または管理、及び体重減少もしくは体重増加失敗の予防または管理からなる群から選択されるエンドポイントによって決定され、前記ワクチン組成物に使用される前記ウイルスは、PEDV配列番号39または配列番号59と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である、ワクチン組成物。
[態様52]
PEDVによって子豚に引き起こされる疾患を治療または予防する方法であって、前記子豚が約1〜7日齢のときに、前記子豚に第1の用量の態様39に記載のワクチン組成物を投与することと、任意選択的に、前記子豚が2〜5週齢のときに第2の用量の前記ワクチンを投与することと、を含む、方法。
[態様53]
2つの用量が前記子豚に投与され、前記雌親豚は、種付け前にはワクチン接種されるが、分娩前にはワクチン接種されない、態様52に記載の方法。
[態様54]
1つの用量が前記子豚に投与され、前記雌親豚は、種付け前及び分娩前の両方にワクチン接種される、態様52に記載の方法。
[態様55]
PEDVによって子豚に引き起こされる疾患を治療または予防する方法であって、最初に、分娩前または種付け前に前記子豚の母豚に態様39に記載のワクチン組成物を投与することと、その後、前記ワクチン組成物の1つ以上の用量を出生後の前記子豚に投与することと、を含む、方法。
[態様56]
PEDVによって健康な豚に引き起こされる疾患を予防する方法であって、最初に、前記豚に態様39に記載のワクチン組成物をワクチン接種することと、その後、さらなる用量の不活化PEDVワクチンを年1回または分娩前に投与することと、を含む、方法。
[態様57]
前記変異INDEL株は、3週齢の豚においてより毒性が高いが、7週齢の豚においてより毒性が低い、態様30に記載の組成物。
[態様58]
PEDVによって健康な豚に引き起こされる疾患を予防する方法であって、最初に、3週齢の豚である前記豚にプロトタイプ弱毒生PEDVワクチン組成物をワクチン接種することと、その後、7週齢以上の豚に態様30に記載のワクチン組成物を2回目にワクチン接種することと、を含む、方法。
[態様59]
PEDVの弱毒化プロトタイプ継代株及び担体を含むワクチン組成物であって、前記PEDVの株は、以下の位置に置換を有する1つ以上のタンパク質をコードする核酸配列を含む、ワクチン組成物:
配列番号52の参照によって決定されるポリタンパク質1a/1bの814、1076、1564、1896、2310、2600、3247、3473、または3522位;
配列番号54の参照によって決定されるスパイクタンパク質の257、326、375、491、881、888、1277、1339、または1358位;
配列番号55の参照によって決定されるORF3の39位以降の切断;
配列番号56の参照によって決定されるエンベロープタンパク質の69または62位;
配列番号57の参照によって決定される膜タンパク質の208位;
配列番号58の参照によって決定されるヌクレオカプシドタンパク質の141、418、424、または439位。
[態様60]
前記PEDVの株は、以下の置換またはそれらの保存的変異体を含む、態様59に記載のワクチン組成物:
配列番号52の参照によって決定されるポリタンパク質1a/1bの814位のV、1076位のA、1564位のF、1896位のI、2310位のH、2600位のY、3247位のF、3473位のV、または3522位のR;
配列番号54の参照によって決定されるスパイクタンパク質の257位のN、326位のI、375位のF、491位のY、881位のR、888位のR、1277位のF、1339位のT、または1358位のL;
配列番号55の参照によって決定されるORF3の39位以降の切断;
配列番号56の参照によって決定されるエンベロープタンパク質の69位のI;
配列番号57の参照によって決定される膜タンパク質の208位のT;
配列番号58の参照によって決定されるヌクレオカプシドタンパク質の141位のL、418位のQ、424位のN、または439位のI。
[態様61]
弱毒生プロトタイプ豚流行性下痢ウイルス(PEDV)及び担体を含むワクチン組成物であって、
前記組成物は、PEDVの変異株及びプロトタイプ株の両方によるチャレンジから豚を保護すること、及びPEDV感染に関連する1つ以上の症状を予防または治療することが可能であり、保護の達成は、PEDV感染の症状である脱水、発熱、下痢、嘔吐、授乳能力の低下、生殖能力の低下、死亡のいずれかの予防または管理、及び体重減少もしくは体重増加失敗の予防または管理からなる群から選択されるエンドポイントによって決定され、前記ウイルスは、態様60に記載の株である、ワクチン組成物。
[態様62]
PEDVによって健康な豚に引き起こされる疾患を予防する方法であって、最初に、3週齢の豚である前記豚に態様59に記載のプロトタイプ弱毒生PEDVワクチン組成物をワクチン接種することと、その後、7週齢以上の豚に変異INDELウイルスのワクチン組成物を2回目にワクチン接種することと、を含む、方法。
Claims (22)
- 配列番号36または配列番号37であるDNAポリヌクレオチドによってコードされる単離された豚流行性下痢ウイルス(PEDV)。
- 組成物は、PEDVの変異株及びプロトタイプ株の両方によるチャレンジから豚を保護すること、及びPEDV感染に関連する1つ以上の症状を予防または治療することが可能であり、保護の達成は、PEDV感染の症状である脱水、発熱、下痢、嘔吐、授乳能力の低下、生殖能力の低下、死亡のいずれかの予防または管理、及び体重減少もしくは体重増加失敗の予防または管理からなる群から選択されるエンドポイントによって決定される、請求項1に記載の豚流行性下痢ウイルス(PEDV)、及び担体を含む、ワクチン組成物。
- 前記ウイルスは、生または不活化ウイルスである、請求項2に記載のワクチン組成物。
- 前記担体は、希釈剤である、請求項2に記載のワクチン組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項2に記載のワクチン組成物。
- 前記保護される豚は、経産豚、未経産豚、種豚、成豚、及び子豚のいずれかを含む、請求項2に記載のワクチン組成物。
- 前記ワクチンは、単回用量プログラムにおいて有効である、請求項6に記載のワクチン組成物。
- 前記ワクチンは、2回用量プログラムにおいて有効である、請求項6に記載のワクチン組成物。
- 第1の用量は、前記子豚が約1〜7日齢のときに投与され、第2の用量は、前記子豚が2〜5週齢のときに投与される、請求項8に記載のワクチン組成物。
- 前記単回用量は、約1〜21日齢で投与される、請求項7に記載のワクチン組成物。
- 最小有効量は、約10〜約106 log10 TCID50/用量である、請求項2に記載のワクチン組成物。
- 前記アジュバントは、油に溶解させた脱油レシチン、及び水酸化アルミニウムである、請求項5に記載のワクチン組成物。
- 前記アジュバントは、CpG/DEAE−デキストラン/鉱油(TXO)である、請求項5に記載のワクチン組成物。
- PEDVによって子豚に引き起こされる疾患を予防する方法であって、請求項3のワクチン組成物を前記子豚に投与することを含み、前記ワクチンの第1の用量が、前記子豚が約1〜7日齢のときに投与される、前記方法。
- 前記投与することは、前記子豚が約2〜5週齢のときに、第2の用量の前記ワクチンを投与することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 2つの用量が前記子豚に投与され、雌親豚は、種付け前にはワクチン接種されるが、分娩前にはワクチン接種されない、請求項14に記載の方法。
- 2つの用量が前記子豚に投与され、前記雌親豚は分娩前にワクチン接種される、請求項14に記載の方法。
- 前記子豚に単回用量のみが投与され、そして、母豚は、PEDVに曝露されておらず、かついかなる時もワクチン接種されない、請求項14に記載の方法。
- A)配列番号37と全長ヌクレオチドレベルで少なくとも95%または99%同一でああり、ここにおいて当該ヌクレオチド配列は、(1)配列番号46の551位に対応するそのアミノ酸位置にプロリン残基を有するORF1a/1bタンパク質、及び(2)配列番号47の973位に対応するそのアミノ酸位置にヒスチジン残基を有するスパイクタンパク質の両方を含む;
あるいは、
B)配列番号37と全長ヌクレオチドレベルで少なくとも98%または99%同一でああり、ここにおいて当該ヌクレオチド配列は、(1)配列番号46の551位に対応するそのアミノ酸位置にプロリン残基を有するORF1a/1bタンパク質、及び(2)配列番号47の973位に対応するそのアミノ酸位置にヒスチジン残基を有するスパイクタンパク質のうちの一方または両方を含む、
であるDNAポリヌクレオチド配列、によってコードされる単離された豚流行性下痢ウイルス(PEDV)。 - 請求項1に記載のコードするDNAポリヌクレオチドに対応する全長RNAポリヌクレオチド、またはその相補体。
- 感染性クローンである、請求項20に記載のRNAポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のコードするDNAポリヌクレオチドを含む、プラスミドまたは細菌人工染色体。
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