CN113527477B

CN113527477B - 猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv及其表达载体、构建方法和应用

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Publication number: CN113527477B
Application number: CN202110836754.0A
Authority: CN
Inventors: 魏战勇; 王林青; 宋月; 张艺璇; 刘中原; 刘石
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2041-07-23
Also published as: CN113527477A

Abstract

本发明属于分子生物学领域领域，涉及猪源抗PDCoV‑N蛋白的scFv，特别是指猪源抗PDCoV‑N蛋白的scFv及其表达载体、构建方法和应用。猪源抗PDCoV‑N蛋白的scFv，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述scFv包括重链可变区V_H和轻链可变区V_L，其中重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明筛选表达的特异性scFv‑25既可以用于PDCoV诊断治疗试剂的开发，同时也能为N蛋白机制的进一步研究提供帮助。

Description

猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv及其表达载体、构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域领域，涉及猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv，特别是指猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv及其表达载体和构建方法和应用。

背景技术

冠状病毒属成员极易在传播时发生变异从而增强毒力，因此近年来多有冠状病毒的暴发且防控时有一定困难。PDCoV属于δ冠状病毒属，主要感染猪，但也可跨种传播感染鸡或小鼠。PDCoV自2014年在美国猪群暴发之后迅速传播到世界各地，对养猪业造成了巨大的损失。由于PDCoV常与其他猪肠道病原体混合感染，且目前没有针对PDCoV的疫苗或特效药物，其致病机制及各个蛋白的具体功能也尚不清晰，因此抗体在病毒的研究、诊断及治疗中有不可缺少的作用。由于PDCoV发现和流行的时间较晚，因此病毒抗体方面的研究比较有限，目前研发的针对PDCoV的抗体多为多克隆血清和杂交瘤scFv，多抗容易制备，但特异性较差，例如专利CN201611180957.4公开了抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法及其应用，该方法采用先制备伪狂犬病毒的杂交瘤细胞，以杂交瘤细胞为模板进行克隆；传统scFv特异性好，但其为鼠源性，因此在治疗中可能会产生免疫排斥，由于scFv的分子量比较大，也会出现不能顺利进入细胞的情况。

相比传统方法制备的scFv，scFv有许多优点，比如在筛选时不需要细胞融合，大大降低了操作难度；可以通过大肠杆菌系统快速表达，节约了时间和经济成本，且通过基因定点突变就可以提高抗体的亲和力；分子量小，穿透力强，易于进入靶细胞发挥功能。

本研究利用充分融合了ScFv的优点及PDCoV-N蛋白的位置分布特性，制备了一种特异性的针对PDCoV-N蛋白的scFv。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv及其表达载体、构建方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述scFv包括重链可变区V_H和轻链可变区V_L，其中重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述重链可变区V_H的等位基因为IGHV1-6*01 F，其三个CDR氨基酸序列分别为：CDR1序列为GFDFSDNA，CDR2序列为IASSDYDGST，CDR3序列为AIGEGDL；轻链可变区V_L的等位基因为IGKV2-13*01 F，其三个CDR氨基酸序列分别为：CDR1序列为QSLEIYGNNF，CDR2序列为EAT，CDR3序列为QQNKESVV。

编码所述的scFv的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

包含有所述的核酸分子的scFv重组表达载体。

所述的scFv重组表达载体的构建方法，步骤如下：

（1）提取猪脾脏的总RNA并反转录制备cDNA；

（2）以步骤（1）的cDNA为模板，分别扩增V_H和V_L基因，并回收扩增产物；

（3）采用重叠延伸PCR拼接scFv基因，并进行纯化回收；

（4）将步骤（3）回收的目的片段与载体pSEX81连接，转化并构建噬菌体抗体库；

（5）利用PDCoV-N蛋白对步骤（4）的噬菌体抗体库进行筛选，获得与N蛋白结合力较强的scFv基因；

（6）以步骤（5）筛选得到的scFv基因为模板，构建scFv的scFv重组表达载体。

所述步骤（2）中扩增V_H和V_L基因的引物序列分别为VH-1F序列如SEQ ID NO.5所示、VH-2F序列如SEQ ID NO.6所示、VH-3F序列如SEQ ID NO.7所示、VH-1R序列如SEQ ID NO.8所示、VH-2R序列如SEQ ID NO.9所示、VH-3R序列如SEQ ID NO.10所示、VLκ-1F序列如SEQID NO.11所示、VLκ-2F序列如SEQ ID NO.12所示、VLκ-3F序列如SEQ ID NO.13所示、VLκ-1R序列如SEQ ID NO.14所示、VLκ-2R序列如SEQ ID NO.15所示、VLλ-1F序列如SEQ ID NO.16所示、VLλ-1R序列如SEQ ID NO.17所示。

所述步骤（3）中重叠延伸PCR拼接scFv基因采用的引物序列分别为：scFv-F序列如SEQ ID NO.18所示，scFv-R序列如SEQ ID NO.19所示。

所述步骤（2）中扩增V_H和V_L基因的程序为：以步骤（1）获得的cDNA为模板，用V_H和V_L的上下游引物（见表1）分别进行扩增获得V_H和V_L基因；PCR反应体系（25μL）为：2×TaqMaster Mix 12μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，去离子水11μL。PCR反应条件为：95℃预变性 5 min，然后按照95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s循环30次，最后72 ℃延伸10 min，样品取出后4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行目的条带的鉴定和纯化回收。

所述步骤（3）中扩增scFv基因的程序为：首先加入V_H和V_L基因各100ng，2×TaqMaster Mix 25μL，补去离子水至48μL，反应条件为95℃预变性 5 min，然后按照95 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环10次，取出PCR管，加入scFv-F和scFv-R（序列见表1）各1μL，按上述循环条件再进行20个循环，最后72 ℃延伸 10 min，样品取出后4 ℃保存。

本发明具有以下有益效果：

1、ScFv基因经酶切后连接至噬菌粒质粒，并转化大肠杆菌感受态细胞。为了提高电转效率，本实验选用了高效的电转化方法，希望能降低转化过程中的基因损失。对电转化过程中可能影响转化效率的条件进行摸索和优化（如电转杯规格、感受态细胞体积、连接产物量、甘油洗涤次数等），最终经过多次转化获得了能够满足筛选条件的库容。由于抗体轻链有两个分型（κ和λ），且在猪的抗体中两种类型的比例约为1:1，因此通过电转化建立了两个抗体基因库，分别由重链可变区基因与κ和λ型轻链可变区基因连接而成，将两个抗体库按比例混合，尽可能接近天然状态下κ和λ型的比例，混合后的抗体库作为初级scFv基因文库。用M13KO7辅助感染初级基因库构建噬菌体单链抗体库，特异性scFv可以在亲和淘选过程中直接与靶蛋白结合。

2、本实验采用微孔板筛选法，包被PDCoV N蛋白对单链抗体库进行淘选，基本流程为“噬菌体库与抗原亲和孵育—洗去未结合的非特异性噬菌体—洗脱特异性结合的噬菌体—扩增噬菌体抗体”，一般经过3-5轮便可富集特异性噬菌体抗体。随着淘选的进行，洗去未结合噬菌体的次数也需增加，比如第一轮用PBST洗板5次，第二轮洗10次，往后可以逐步增加洗涤次数，以减少非特异性噬菌体的影响。本试验共进行了四轮富集筛选，经过对四轮的噬菌体出入库比进行计算，单链抗体库的最终富集倍数约为310倍。

3、表达纯化后的scFv经ELISA、WB和间接免疫荧光试验验证，结果显示抗体亲和力与反应性良好。Western blot试验证明了scFv的确是针对于PDCoV N蛋白的抗体，而不与病毒的其他结构蛋白反应（图11）。IFA试验表明两株抗体都能特异性识别PDCoV（图12），scFv-25的荧光主要分布于细胞核，说明scFv-25靶向于细胞核。相比传统方法制备的scFv，scFv有许多优点，比如在筛选时不需要细胞融合，大大降低了操作难度；可以通过多种表达系统进行表达，节约了时间和经济成本，且通过基因定点突变就可以提高抗体的亲和力；分子量小，穿透力强，易于进入靶细胞发挥功能等。本发明筛选表达的两个特异性scFv既可以用于PDCoV诊断治疗试剂的开发，同时也能为N蛋白机制的进一步研究提供帮助。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为凝胶电泳检测V_H和V_L基因PCR产物，其中M：DNA Marker DL5000；V_H：V_H基因；V_Lκ：V_Lκ基因；V_Lλ：V_Lλ基因。

图2为凝胶电泳检测scFv基因SOE-PCR扩增结果，其中M：DNA Marker DL5000；1：V_H-V_Lκ拼接成的scFv；2：V_H-V_Lλ拼接成的scFv。

图3为凝胶电泳检测pSEX81质粒的提取及酶切结果。

图4为凝胶电泳检测抗体库插入片段的PCR扩增结果，其中M：DNA Marker DL5000；1-24：V_H-V_Lκ初级库单菌落；25-48：V_H-V_Lλ初级库单菌落。

图5为 PDCoV-N蛋白表达形式的鉴定，其中M：蛋白Marker；1：诱导6h后全菌；2：空载对照；3：破碎后沉淀；4：破碎后上清；5：上清中N蛋白纯化后。

图6为 Western Blot检测纯化后N蛋白。

图7为 phage-ELISA检测重组噬菌体抗体的亲和性。

图8为Wsetern Blot检测scFv重组蛋白的表达水平，其中1，3，5：分别为pFUSE-scFv-25，pFUSE-scFv-27，pFUSE-scFv-53转染细胞后上清；2，4，6：分别为pFUSE-scFv-25，pFUSE-scFv-27，pFUSE-scFv-53转染后细胞总蛋白。

图9为SDS-PAGE检测纯化后的scFv，其中M：蛋白Marker；1：scFv-25；2：scFv-53。

图10为ELISA检测scFv特异性。

图11为Western Blot 鉴定scFv的结合能力图，其中A：scFv-25与N蛋白和PDCoV的反应情况 B：scFv-53与N蛋白和PDCoV的的反应情况。

图12为 IFA检测scFv的反应性。

图13为三个scFv的氨基酸序列对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：PDCoV猪源噬菌体单链抗体库的构建

1.2方法

1.2.1 猪脾脏总RNA的提取

猪脾脏总RNA利用TRIzol法提取，具体操作步骤如下：

（1）取-80℃保存的脾脏组织，切下小部分放于灭菌且预冷过的研钵中，加1mLTRIzol研磨充分，转移研磨后液体于1.5mL离心管中，静置5min。

（2）加入200μL氯仿，震荡混匀，静置3min，4℃ 12000r/min 离心10min。

（3）抽取上层水相于新的1.5mL离心管，加500μL异丙醇，剧烈震荡混匀后静置20min，4℃ 12000r/min 离心10min。

（4）弃上清，加入1mL70%乙醇，重悬沉淀，4℃ 12000r/min 离心10min。此步骤重复一次。

（5）尽量弃干净上清，超净台风干5min，沉淀用30μL DEPC水溶解并于-20℃保存备用。

1.2.2 cDNA的合成

以上步提取的总RNA为模板，以Oligo（dT）₁₈为引物，按照HiScriptⅡ 1st StrandcDNA Synthesis Kit说明书进行操作，具体步骤如下：

（1）在PCR管中配制反应体系：上一步的RNA 7μL，Oligo（dT）₁₈1μL。

（2）混匀后，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并冰上静置2min。

（3）取出PCR管，向其中加入2×RT Mix 10μL，HiScriptⅡ Enzyme Mix 2μL。

（4）混匀后，50℃反应45min、 85℃反应2min取出，测浓度后-20℃保存备用。

1.2.3 重链可变区（V_H）基因和轻链可变区（V_L）基因的扩增

以上步获得的cDNA为模板，用V_H和V_L的上下游引物分别进行扩增获得V_H和V_L基因。

PCR反应体系（25μL）为：2×Taq Master Mix 12μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，去离子水11μL。PCR反应条件为：95℃预变性 5 min，然后按照95 ℃ 30 s，56 ℃ 30s，72 ℃ 20 s循环30次，最后72 ℃延伸 10 min，样品取出后4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行目的条带的鉴定和纯化回收。

以1.2.2中得到的cDNA为模板，用相应引物分别扩增V_H和V_L基因，所用的引物见表1，用1%琼脂糖凝胶鉴定PCR产物，结果如图1所示，条带位置在350bp左右，与预期相符。

1.2.4 PCR产物的纯化与回收

使用庄盟DNA凝胶回收试剂盒对目的片段进行纯化回收，具体操作步骤如下：

（1）在蓝光下切下含目的片段的琼脂糖凝胶放于1.5mLEP管中进行称重，每100mg凝胶加100μL溶胶液，55℃水浴5—10min直至凝胶完全融化。

（2）将溶液全部转移至吸附柱中，静置1min后，室温12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体。

（3）加入600μLWashing Buffer，室温12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体。该步骤重复一次。

（4）室温12000r/min 空离2min，将吸附柱转移到干净的1.5mLEP管中，加20μL TE以溶解DNA，静置2min后室温12000r/min 离心1min收集DNA溶液，-20 ℃保存。

1.2.5 重叠延伸PCR（SOE-PCR）拼接scFv基因

以回收得到的V_H和V_L基因为模板，利用SOE-PCR将其连接为scFv，总反应体系为50μL，首先加入V_H和V_L基因各100ng，2×Taq Master Mix 25μL，补去离子水至48μL，反应条件为95℃预变性 5 min，然后按照95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环10次，取出PCR管，加入scFv-F和scFv-R各1μL，按上述循环条件再进行20个循环，最后72 ℃延伸 10 min，样品取出后4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行目的条带的鉴定并按照1.2.4步骤进行纯化回收。

通过SOE-PCR将回收得到的V_H和V_L基因拼接成scFv，用1%琼脂糖凝胶鉴定PCR产物，结果如图2所示，条带位置在750bp左右，与预期相符。

表1 扩增猪源抗体可变区基因的引物

1.2.6 重组载体pSEX-scFv连接产物的制备

1.2.6.1 噬菌粒载体pSEX的制备

取1μL pSEX质粒加入100μL DH5α感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min，42℃ 热击90sec，冰浴5min，加入900μL 2×YT培养基于37℃振荡培养1h，取200μL培养液涂布2×YT-A平板，37℃倒置培养16h。

次日挑取平板上的单菌落，接种于5mL 2×YT-A培养基，37℃振荡培养16h，使用OMEGA E.Z.N.A.^TM plasmid Mini KitⅠ根据说明书进行质粒提取，具体步骤如下：

（1）室温12000r/min 离心1min富集菌体，上清弃干净。

（2）加入250μL SolutionⅠ，震荡重悬菌体。

（3）缓慢加入250μL SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀，静置3min。

（4）缓慢加入350μL SolutionⅢ，轻柔颠倒混匀，此时出白色絮状沉淀。

（5）室温12000r/min 离心10min，小心抽取上清至HiBind DNA Mini Column中，12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体。

（6）加入500μL HBC Buffer，室温12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体。

（7）加入700μL DNA Wash Buffer，室温12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体。此步骤重复1次，然后室温12000r/min 空离2min。

（8）将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央滴加30μL ElutionBuffer，静置2min，室温12000r/min 离心1min，收集质粒溶液-20 ℃保存。

pSEX转化DH5α感受态后，挑取单菌落提取质粒，pSEX质粒和scFv基因同时经sfiⅠ酶切，结果如图3所示，并通过T4连接酶连接为pSEX-scFv，连接产物脱盐处理后用于电转化。

1.2.6.2 scFv和载体pSEX的酶切

将噬菌粒载体pSEX和1.2.5中得到的scFv基因同时用sfiⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切体系（50μL）为：DNA 1μg，sfiⅠ1μL，Cutsmart Buffer 5μL，补去离子水至总体积50μL，反应条件为50℃ 3h。反应后各取5μL用1%琼脂糖凝胶进行鉴定，其余部分进行凝胶电泳后按照1.2.4步骤纯化回收。

1.2.6.3 scFv酶切片段和载体pSEX的连接

将回收得到的目的基因和载体进行连接，反应体系（100μL）为：scFv基因500ng，pSEX 600ng，T4 DNA Ligase 10μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 10μL，补去离子水至总体积100μL。混匀后16℃ 连接3h，连接产物用QIAgen PCR纯化回收试剂盒进行除盐，以备电转化使用。具体操作步骤为：将连接产物转移至1.5mL 离心管，加入3倍体积Buffer PE，混匀后转移液体至吸附管中，室温12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体；加500μL BufferPB，室温12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体，重复该步骤一次；室温12000r/min空离2min，将吸附柱放于干净的1.5mL离心管，加30μL去离子水，静置2min后室温12000r/min离心收集溶液，-20℃保存。

1.2.7重组pSEX-scFv连接产物的转化

1.2.7.1 E.coli XL1-Blue电转化感受态细胞的制备

（1）用XL1-Blue菌液在2×YT平板划线，37℃培养16h。

（2）挑取单菌落接种于2mL新鲜2×YT培养基中，37℃震荡培养5h，将菌液加入至500mL 新鲜2×YT培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀为0.45左右时取出，置于冰上摇晃15min，使其冷却。

（3）4℃ 4000r/min 离心10min，弃去上清，加入灭菌预冷的10%甘油重悬菌体，4℃4000r/min 离心10min，弃上清。重复此步骤3-4次，最后一次离心前静置10min。

（4）弃干净上清，加1mL10%甘油充分重悬菌体，分装100μL/管，-80℃保存。

1.2.7.2 pSEX-scFv连接产物的电转化

取出冻存的感受态细胞置于冰上融化，加入1.2.6中制备的连接产物2μL，轻轻混匀后冰上静置3min，将混合液加入预冷后的电转杯（0.2mm），确保杯内无气泡，外壁无冷凝水后将电转杯放入电转仪。参数设置：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间5ms。电转结束后立即加入1mL 37℃预热的新鲜2×YT培养基，重悬细胞并转移到新的离心管中，37℃震荡复苏1h。

取复苏后菌液100μL，10倍梯度稀释后涂2×YT-A平板，37℃培养过夜计算库容。其余菌液全部涂布13×13cm 2×YT-A平板，37℃培养15h后用细胞刮板将菌落刮下，加入10mL含20%甘油的2×YT培养基重悬菌体，分装1mL/管，-80℃保存。

scFv（V_H-V_Lκ和V_H-V_Lλ）和pSEX的连接产物分别电转化XL1-Blue感受态细胞，按照电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω的条件进行电击，复苏后涂板，次日菌落计数以计算电转效率。按照相同条件共进行20次电转化，得到库容为6.5 × 10⁷CFU的V_H-V_Lκ初级库和库容为1.7 × 10⁸CFU的V_H-V_Lλ初级库。各随机挑选24个单菌落用pSEX载体通用引物进行PCR鉴定，图4显示插入片段大小的正确率约为80%。将两个初级库混合以备淘选使用。

1.2.7.3 库容估算与初步鉴定

对菌液梯度稀释后涂布的平板进行菌落计数，估算转化后库容，并从平板上随机挑取24个单菌落，用载体通用引物进行PCR，初步鉴定阳性克隆。

1.2.8噬菌体抗体库的构建

（1）从-80℃取出一支保存的细菌库，待融化后不断取少量加入40mL 2×YT-A培养基中直至OD₆₀₀为0.5左右，37℃震荡复苏30min。

（2）加入80μL M13KO7 hyper phage，37℃ 120r/min培养1h。

（3）室温4000r/min离心10min收集沉淀，用80mL 2×YT-AK重悬，30℃ 260r/min培养12h。

（4）4℃ 8000r/min离心15min，收集上清。

（5）加入20mL 5×PEG8000/NaCl 溶液冰浴2h，4℃ 10000r/min离心20min。

（6）弃上清，沉淀用1mL PBS重悬，转移重悬液至1.5mL离心管，静置10min后，4℃12000r/min离心5min，收集上清，即为重组噬菌体抗体库。

1.2.9 重组噬菌体滴度的测定

（1）取50μL XL1-Blue菌液接种到5 mL新鲜2×YT培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5左右。

（2）取1μL制备好的噬菌体抗体库加入1mL XL1-Blue菌液，37℃ 120r/min培养1h后10倍梯度稀释涂2×YT-A平板，37℃培养过夜计算。

次日，根据平板上不同稀释度的菌落数计算滴度。

实施例2：噬菌体单链抗体库的富集筛选

2.2方法

2.2.1 PDCoV-N蛋白的表达纯化

2.2.1.1 PDCoV-N蛋白的原核表达

（1）取1μL实验室保存的 pET28a-PDCoV-N质粒加入100mL BL21（DE3）感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min，42℃ 热击90sec，冰浴5min，加入900μL LB培养基于37℃振荡培养1h，取200μL培养液涂布LBA平板，37℃倒置培养16h。

（2）挑取过夜生长的平板上的单菌落，接种于5mL LB-A培养基，37℃振荡培养5h后全部接种于200mL新鲜LB-A培养基，37℃继续振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。

（3）加入诱导剂IPTG 1mL，即终浓度为0.8mM，37℃振荡诱导6h。

（4）4℃ 8000r/min离心10min收集菌体，加30mL PBS重悬洗涤菌体一次后，4℃8000r/min离心10min。

（5）洗涤后菌体加10mL PBS重悬，置于冰上进行超声破碎，超声条件为：工作3s，停6s，持续15min。

（6）4℃ 8000r/min离心10min分离上清和沉淀，沉淀用PBS重悬，上清和沉淀各取80μL，加20μL蛋白电泳上样缓冲液，样品经煮沸10min处理后进行SDS-PAGE，鉴定重组蛋白的表达形式。

pET28a-PDCoV-N重组载体转化BL21（DE3）后，挑取单菌落扩大培养进行原核表达，超声破碎后经SDS-PAGE鉴定，图5显示蛋白主要在上清中表达，蛋白大小为42kD左右，与预期相符。上清中蛋白经镍柱纯化后，用Western Blot进行检测，并以空载体作为阴性对照，如图6所示，说明蛋白表达正确，可以被His单抗识别。

2.2.1.2 PDCoV-N蛋白的纯化

使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒对PDCoV-N蛋白进行纯化，具体步骤如下：

（1）抽取1mL Ni琼脂糖凝胶树脂装填到重力柱中，用10倍柱体积去离子水洗去填料中乙醇，然后加10倍柱体积的10mM咪唑溶液平衡柱子。

（2）诱导后菌体经超声破碎后，收集上清用0.45μm滤膜过滤并加入柱子中，室温震荡孵育1h后，打开活塞使液体流出。

（3）加入10倍柱体积的50mM咪唑洗脱杂蛋白。

（4）每次加入1mL 200mM咪唑溶液洗脱与Ni结合的目的蛋白，用1.5mL离心管收集流出液，并用紫外分光光度计检测蛋白浓度，直至洗脱液中不含蛋白为止。

（5）加入5倍柱体积的500mM咪唑溶液洗脱所有与Ni结合的蛋白。

（6）用10倍柱体积去离子水冲洗填料，使其恢复中性环境后，加20%乙醇封柱，4℃保存。

（7）将洗脱的目的蛋白加入Millipore超滤管（10kD），4℃ 4000r/min离心进行超滤浓缩和PBS缓冲液替换，浓缩后蛋白用紫外分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。

2.2.1.3 Western Blot检测纯化后PDCoV-N蛋白

（1）使用凝胶快速配制试剂盒配制蛋白胶，室温放置30min待其完全凝固。

（2）取10μL纯化后N蛋白，加2μL蛋白上样缓冲液吹打混匀，煮沸3min后进行SDS-PAGE，同时以空载体诱导后菌液作为阴性对照。

（3）电泳结束后，切下蛋白marker及其对应区域条带，将蛋白胶、硝酸纤维（NC）膜、海绵一起浸透在转膜液中，并按照从上到下依次为海绵、蛋白胶、NC膜、海绵的顺序将其放置在转膜仪中，转膜条件为24V，25min。

（4）转膜结束后，取出NC膜， 5%脱脂奶室温封闭1h，PBST洗3遍，每遍5min。

（5）加入鼠抗His单抗（1:3000，5%脱脂奶稀释），4℃孵育过夜，PBST洗5遍，每遍5min。

（6）加入HRP标记羊抗鼠多抗（1:5000，5%脱脂奶稀释），37℃孵育1h，PBST洗5遍，每遍5min。

（7）避光向膜上滴加ECL显色液，利用ECL成像系统进行拍照。

2.2.2 微孔板筛选法筛选抗体库

（1）用碳酸盐缓冲液将纯化后的N蛋白包被到96孔ELISA板上，每孔100μL（1μg），4℃放置16h后，弃去包被液，加PBS 200μL/孔，洗板2次。

（2）加入5%脱脂奶200μL/孔，37℃封闭2h，弃去封闭液，加PBST 200μL/孔，洗板3次。

（3）加入新鲜制备的噬菌体抗体库，每孔100μL，37℃孵育2h（第一次孵育4h，第二轮以后每次孵育2h）。

（4）弃去孔中噬菌体，加PBST 200μL/孔，洗板5次（第一轮洗5次，第二轮以后每轮洗10次），除去未结合的噬菌体。

（5）每孔加100μL胰酶洗脱液，室温静置15min，期间吹打两次，以洗脱特异性结合的噬菌体。

（6）将洗脱液加入3mL对数生长期的XL1-Blue菌液，37℃ 120r/min 培养1h。

（7）取培养后菌液100μL，10倍梯度稀释后涂2×YT-A平板，37℃培养过夜计算滴度。其余菌液全部涂布13×13cm 2×YT-A平板，37℃培养15h后用细胞刮板将菌落刮下，加入10mL含20%甘油的2×YT培养基重悬菌体，分装1mL/管，-80℃保存。

（8）取出保存菌液，按照2.2.8的方法制备噬菌体，并按照1.2.9的步骤测滴度，以投入第二轮淘选使用。

（9）以上步骤共重复五轮，记录每次加入96孔板和洗脱下来的噬菌体滴度。

使用96孔微孔板筛选法对重组噬菌体抗体库进行筛选，共进行四轮“吸附-洗脱-扩增”的过程，并检测每轮加入噬菌体（input phage）和洗脱噬菌体（output phage）的滴度，如表2所示。

表2 噬菌体抗体库筛选中投入噬菌体与产出噬菌体的滴度

2.2.3 重组噬菌体的鉴定

2.2.3.1 重组噬菌体的PCR鉴定及测序分析

从最后一轮淘选中用来测滴度的2×YT-A平板上挑取数个单菌落接种于1mL 2×YT-A培养基中，37℃振荡培养5h后，用载体通用引物进行PCR鉴定，将鉴定条带大小正确的菌落送去测序。测序结果用IMGT网站（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/input）进行比对分析。

将phage-ELISA鉴定结合力较强3株抗体序列在IMGT网站进行在线序列比对分析，结果显示筛选所得到的scFv基因为猪源抗体且符合抗体可变区结构及基因特征如图13所示，其等位基因及互补决定区（complementary determining region，CDR）如表3所示。

表3 噬菌体抗体库筛选到的scFv基因

2.2.3.2 重组噬菌体的小量制备

（1）取2.2.3.1中鉴定及序列分析正确的菌液，1:100接种于15mL 2×YT-A培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5。

（2）加入30μL M13KO7 hyper phage，37℃ 120r/min培养1h。

（3）室温4000r/min离心10min收集沉淀，用30mL 2×YT-AK重悬，30℃ 260r/min培养12h以上。

（4）次日，4℃ 8000r/min离心15min，收集上清。

（5）加入7.5mL 5×PEG8000/NaCl 溶液，冰浴2h，4℃ 10000r/min离心20min。

（6）弃上清，沉淀用500μL PBS重悬，转移重悬液至1.5mL离心管，静置10min后，4℃12000r/min离心5min，收集上清，即为重组噬菌体抗体，并按照1.2.9的步骤进行滴度测定。

2.2.3.3 重组噬菌体的phage-ELISA鉴定

以纯化后的PDCoV-N蛋白为抗原，制备的重组噬菌体为一抗，检测重组噬菌体与抗原的结合情况，具体步骤如下：

（1）包被纯化后的N蛋白至96孔ELISA板上，每孔100μL（300ng），同时包被1%BSA作为阴性对照，PBS作为空白对照，4℃放置16h。

（2）PBS洗2次后，加入5%脱脂奶，每孔200μL，37℃封闭2h。

（3）弃去封闭液，PBST洗3遍，加入制备的重组噬菌体100μL（提前用PBS将待检测的噬菌体稀释至同一滴度），37℃孵育2h，并设置不加噬菌体的阴性孔。

（4）弃去噬菌体，PBST洗5遍，加入HRP-anti-M13抗体（1:5000，PBST稀释），37℃孵育1h.

（5）弃去二抗，PBST洗5遍，每孔加100μL TMB显色液显色15min后，加浓硫酸终止，并用酶标仪测定OD₄₅₀吸光值。

（6）对ELISA结果进行分析，实验组与阴性组OD比值大于2.1的判定为阳性。

将最后一轮洗脱的噬菌体侵染对数生长期的XL1-Blue菌液，而后涂布2×YT-A平板，过夜培养后挑取平板上的单克隆菌落进行PCR鉴定。共鉴定了96个单克隆菌落，其中11个条带大小正确，将这11个菌落扩大培养送测序，测序成功且不包含终止密码子的有5个，将这5个菌株扩大培养后加入辅助噬菌体侵染以制备重组噬菌体抗体。ELISA板包被纯化后N蛋白，以BSA作为阴性对照，PBS作为空白对照，对重组噬菌体抗体进行phage-ELISA验证。结果显示scFv-25，scFv-27和scFv-53可以与N蛋白结合，其中scFv-25结合效果最好。

实施例3：特异性单链抗体的表达和功能鉴定

3.2方法

3.2.1 scFv真核重组表达载体的构建

将筛选所得的3个特异性菌株扩大培养，并按照试验一中1.2.6.1的步骤提取质粒，重组pSEX-scFv质粒和真核表达载体pFUSE质粒同时用sfiⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切体系（50μL）为：DNA 1μg，sfiⅠ1μL，Cutsmart Buffer 5μL，补去离子水至总体积50μL，反应条件为50℃ 3h。反应后各取5μL用1%琼脂糖凝胶进行鉴定，其余部分进行凝胶电泳后按照试验一中1.2.4步骤分别纯化回收。

将回收得到的目的基因和pFUSE载体进行连接，反应体系（10μL）为：scFv基因50ng，pFUSE 60ng，T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，补去离子水至总体积10μL。混匀后16℃ 连接3h。

连接产物加入100μL DH5α感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min，42℃ 热击90sec，冰浴5min，加入900μL LB培养基于37℃振荡培养1h，室温4000r/min 离心5min，弃900μL上清，沉淀用剩余上清重悬后涂布LS-LB-Z平板，37℃倒置培养16h。次日，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，测序鉴定，并提取质粒再以sfiⅠ进行酶切鉴定。

使用限制性内切酶sfiⅠ对真核表达载体pFUSE和筛选得到的pSEX-scFv同时进行消化酶切，酶切产物回收后经T4连接酶连接并转化DH5α感受态细胞，单菌落经PCR和测序鉴定为阳性后提取质粒，经sfiⅠ酶切鉴定，酶切条带在750bp左右，与预期相符。成功构建三个scFv重组真核表达载体，分别命名为pFUSE-scFv-25，pFUSE-scFv-27，pFUSE- scFv-53。

3.2.2 scFv重组蛋白的表达及纯化

3.2.2.1 scFv重组质粒的提取

测序正确的菌液按1:100接种至LS-LB-Z培养基，37℃震荡培养16h后，按照OMEGAendo-free E.Z.N.A.^TM plasmid DNA Mini Kit 试剂盒进行去内毒素质粒提取，具体步骤如下：

（1）室温12000r/min 离心1min富集菌体，上清弃干净。

（2）加入250μL SolutionⅠ/RNase A，震荡重悬菌体。

（3）缓慢加入250μL SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀4-6次，静置3min。

（4）加入150μL Buffer N3，轻柔颠倒混匀，此时出现白色絮状沉淀。

（5）室温12000r/min 离心10min，小心抽取上清至新的1.5mL离心管中，加入0.1倍体积的ETR Solution，轻柔颠倒数次后冰上静置10min。

（6）42℃水浴5min，室温12000r/min 离心3min。

（7）将上清转移至新的1.5mL离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，轻柔颠倒混匀4-6次，静置2min。

（8）将溶液转移至DNA吸附柱中，室温12000r/min 离心1min。

（9）弃去收集管中液体，加入500μL HBC Buffer，室温12000r/min 离心1min。

（10）弃去收集管中液体，加入700μL DNA Wash Buffer，室温12000r/min 离心1min，弃去收集管中液体。此步骤重复1次，然后室温12000r/min 空离2min.

（11）将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央滴加40μL ElutionBuffer，静置2min，室温12000r/min 离心1min，收集质粒溶液-20 ℃保存。

3.2.2.2 scFv重组质粒转染293T细胞

（1）293T细胞接种6孔板，置于37℃ 5%CO₂细胞培养箱中直至长满单层。

（2）取3.2.2.1中提取的质粒4μg加入100μL OPTI-MEM中，静置5min。

（3）抽取10μL Lipofectamine^TM2000加入100μL OPTI-MEM中，静置5min。

（4）将步骤（3）的混合液缓慢滴入步骤（2）的混合液中，轻轻混匀后静置25min。

（5）向6孔板中加入D-Hank’s溶液缓慢清洗细胞2次后，每孔加入800μL OPTI-MEM。

（6）将步骤（4）的混合液缓慢加入6孔板中，轻轻混匀，置于37℃ 5%CO₂细胞培养箱，6h后弃去板中液体，每孔加2mL细胞维持液（4%血清DMEM）。36h后收集上清和细胞检测蛋白是否表达。

使用去内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒，用脂质体转染法转染293T细胞以获得重组蛋白。转染36h分别收取上清和细胞总蛋白，利用Western blot检测蛋白表达水平，结果如图8所示：pFUSE-scFv-25，pFUSE- scFv-53在上清和细胞内均有表达，而pFUSE-scFv-27未表达。

3.2.2.3 scFv重组蛋白表达水平检测

重悬细胞并转移至1.5mL离心管中，4℃ 2000r/min离心2min，转移上清至新的1.5mL离心管中，4℃暂存。向细胞沉淀加入100μL含1%PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，直至溶液用枪头挑起无丝状为止；4℃ 12000r/min离心10min，收集上清，即为细胞总蛋白。

取转染后收集的细胞上清和细胞总蛋白各50μL，加入10μL蛋白上样缓冲液，煮沸3min后进行SDS-PAGE，电泳结束后，切下蛋白marker及其对应区域条带，用于Western Blot鉴定，具体步骤如下：

（1）将蛋白胶、硝酸纤维（NC）膜、海绵一起浸透在转膜液中，并按照从上到下依次为海绵、蛋白胶、NC膜、海绵的顺序将其放置在转膜仪中，转膜条件为24V，25min。

（2）转膜结束后，取出NC膜，5%脱脂奶室温封闭1h，PBST洗膜3遍，每遍5min。

（3）加入HRP标记羊抗人多抗（1:5000，5%脱脂奶稀释），37℃孵育1h，PBST洗膜5遍，每遍5min。

（4）避光向膜上滴加ECL显色液，利用ECL成像系统进行拍照。

3.2.2.4 scFv重组蛋白的纯化与浓缩

使用Protein A琼脂糖纯化树脂对scFv重组质粒转染后细胞上清进行抗体纯化，具体步骤如下：

（1）抽取1mL Protein A装填到重力柱中，用10倍柱体积去离子水洗去填料中乙醇，然后加10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。

（2）将转染后收集的细胞上清全部加入重力柱中，室温孵育1h后，打开活塞使液体流出。

（3）加入10倍柱体积的结合缓冲液洗脱杂蛋白。

（4）每次加入1mL Glycine-HCl缓冲液（pH3.0）洗脱与Protein A结合的目的蛋白，用1.5mL离心管收集流出液，并用紫外分光光度计检测蛋白浓度，直至洗脱液中不含蛋白为止。（离心管中事先加入50μL Tris-HCl缓冲液（pH9.0），防止抗体在过酸环境下失活）

（5）加入10倍柱体积的去离子水冲洗填料，使环境恢复中性，最后加入5mL 20%乙醇封柱，4℃保存。

（6）洗脱液加入Millipore超滤管（10kD），4℃ 4000r/min离心进行超滤浓缩，浓缩后抗体用紫外分光光度计测定浓度。

（7）取浓缩后抗体4μg，加入蛋白上样缓冲液，煮沸3min后进行SDS-PAGE，检测纯化结果。

使用Protein A琼脂糖纯化树脂对pFUSE-scFv-25，pFUSE-scFv-53转染后上清进行纯化，并对蛋白洗脱液进行超滤浓缩，浓缩后scFv经SDS-PAGE分析，结果如图9所示，55kD左右为抗体重链，25 kD左右为抗体轻链，与预期相符，证明scFv与载体上的Fc标签成功融合表达。

3.2.3 ELISA检测scFv特异性

（1）PDCoV，PEDV，TGEV，PSV细胞毒包被96孔ELISA板上，每孔100μL，并设置各自未接毒细胞作为阴性对照，4℃放置16h后，弃去病毒液，加PBS 200μL/孔，洗板2次。

（3）加入纯化浓缩后scFv（50μg/mL）100μL/孔，37℃孵育2h，加PBST 200μL/孔，洗板5次。

（4）加入HRP标记羊抗人IgG（1:7000，PBST稀释），37℃孵育1h，加PBST 200μL/孔，洗板5次。

（5）每孔加100μL TMB显色液显色15min后，加浓硫酸终止，并用酶标仪测定OD₄₅₀吸光值。

3.2.4 Western blot检测scFv的结合能力

取10μL纯化后N蛋白和10μL PDCoV HNZK-04细胞毒，加入2μL蛋白上样缓冲液，煮沸3min后进行SDS-PAGE，电泳结束后，切下蛋白marker及其对应区域条带，用于WesternBlot鉴定，具体步骤如下：

（1）转膜、封闭步骤与3.2.2.3中步骤（1）（2）相同。

（2）一抗孵育：加入纯化浓缩后scFv（100μg/mL），4℃孵育过夜，PBST洗膜5遍，每遍5min。

（3）二抗孵育：加入HRP标记羊抗人IgG（1:5000，5%脱脂奶稀释），37℃孵育1h，PBST洗膜5遍，每遍5min。

（4）避光向膜上滴加ECL显色液，利用ECL成像系统进行拍照。

分别用PDCoV，PEDV，TGEV，PSV细胞毒包被96孔ELISA板，以纯化后scFv为一抗，HRP标记羊抗人IgG为二抗，验证抗体的特异性。结果如图10所示，scFv重组蛋白与PDCoV的亲和力明显高于其他病毒，证明所表达抗体特异性良好。

纯化后N蛋白以及PDCoV细胞毒进行SDS-PAGE分析，待电泳结束后将目的条带转印至NC膜上，以纯化后scFv为一抗，HRP标记羊抗人IgG为二抗，验证抗体的结合能力。结果如图11所示，scFv-25和scFv-53既能与基因工程表达的N蛋白结合，同时也能识别并结合病毒，有良好的结合能力。

3.2.5 间接免疫荧光试验

LLC-PK1细胞接种12孔板，置于37℃ 5%CO₂培养箱中长满单层后，接种PDCoV（MOI=1），同时设不接毒正常细胞对照，具体操作步骤如下：

（1）试验孔接种病毒后（对照孔加无血清MEM），37℃ 5%CO₂培养箱吸附1h，弃掉孔中液体，每孔加细胞维持液1mL。

（2）待细胞病变约为20%左右时，弃掉维持液，每孔加无水乙醇1mL，4℃固定细胞5h以上。

（3）弃去无水乙醇，每孔加5%BSA 500μL，37℃封闭2h。

（4）弃去封闭液，PBST洗板3遍，每遍5min，而后每孔加200μL纯化浓缩后scFv（200μg/mL），4℃孵育过夜。

（5）回收scFv至离心管中（-20℃保存），PBST洗板5遍，每遍10min，而后避光加200μL FITC标记羊抗人IgG（1:400，5%BSA稀释），37℃孵育1h。（此步开始注意避光）

（6）回收抗体（-20℃保存），PBST洗板5遍，每遍10min。

（7）加入DAPI溶液，室温作用10min，对细胞核进行染色。

（8）弃去DAPI，PBST洗板3遍，每遍3min。

（9）滴加封片剂以防止荧光衰减，在倒置荧光显微镜下观察结果并拍照。

LLC-PK1细胞按MOI=1接种PDCoV，同时设置不接毒细胞对照，接毒约24 h后弃去病毒液，进行间接免疫荧光检测。结果如图12所示，scFv-25和scFv-53都能与病毒反应，但scFv-25的荧光主要分布于细胞核，而scFv-53的荧光主要分布于细胞间质，说明它们结合N蛋白的机制与病毒感染过程中N蛋白的分布位置可能有关。

实施效果例分析

为了获得有功能的scFv，本试验又采用了哺乳动物细胞真核表达系统。scFv的优点之一是分子量小，然而这也导致其稳定性和亲和力不如完整抗体，因此尝试将其与抗体Fc段连接，以scFv-Fc的形式融合表达增加其亲和力。目前抗体工程中也经常将蛋白与Fc融合表达，通过Fc循环可以延长药理学相关蛋白的半衰期。pFUSE-hIgG-Fc2是常用来表达抗体的一种真核表达载体，其克隆位点前有促进分泌表达的信号肽，克隆位点后带有人IgGFc基因。将scFv基因克隆到pFUSE载体上，并转染293T细胞，经WB检测有两株抗体（scFv-25和scFv-53）既在细胞内表达也可以分泌表达到上清中，而scFv-27无论真核还是原核都没有表达，具体原因尚不明确。转染后细胞上清中的scFv用protein A琼脂糖凝胶树脂进行纯化。Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能够特异性地结合多种IgG的Fc段，与琼脂糖凝胶结合后可用于抗体的亲和纯化。Protein A经过基因改造后，减少了对Fab片段和抗原结合的影响，增加了与Fc区结合的特异性，而因此广泛应用于抗体的纯化。

纯化后的scFv经ELISA、WB和间接免疫荧光试验验证，结果显示抗体亲和力与反应性良好。ELISA特异性试验中，scFv不与除PDCoV外的其他病毒反应，这些病毒包括PEDV、TGEV和PSV，都是能在临床上引起猪腹泻的病原体，所表达的scFv特异性良好表明其可以用于诊断试剂的开发，从而为病毒的临床诊断提供帮助。Western blot试验证明了scFv的确是针对于PDCoV N蛋白的抗体，而不与病毒的其他结构蛋白反应，原核表达的N蛋白由于包含载体上的一部分蛋白和His标签，所以比天然状态的N蛋白要大，条带在NC膜上的位置也要稍高。IFA试验表明两株抗体都能特异性识别PDCoV，但根据荧光的分布来看，scFv-25主要定位于细胞核，而scFv-53主要定位于细胞间质，说明两株抗体结合的N蛋白分布位置不同。据之前的研究，冠状病毒的感染周期主要发生在细胞间质中，因此N蛋白主要分布在细胞间质，但细胞核上通常也有N蛋白，表明病毒感染时N蛋白也具有重要的非结构功能，其分布位置与病毒感染时间有一定的关系，但具体机制尚不明确，因此本试验筛选表达的两个特异性scFv既可以用于诊断治疗试剂的开发，同时也能为N蛋白机制的进一步研究提供思路。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南农业大学

<120> 猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv及其表达载体、构建方法和应用

<141> 2021-07-23

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gccatcgtgc tgacccagtc tccactctcc ctgtcagtca gccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtccagtca gagccttgag atatatggaa acaatttttt gagttggtac 120

cagcagaaac caggtcagtc tccacagctc ctgatctatg aggctaccaa cagggcctct 180

ggggtcccag acaggttcag tggcagtggg tcaggcacag atttcaccct gaaaatcagc 240

agggtggagg ctgaggatgc aggcgtttac tactgccagc aaaataaaga atcggttgtg 300

ttcggtagcg ggaccaagct ggaaatcaaa cgggctgatg ccaagccatc cgtcttcggt 360

ggttcctcta gatcttcctc ctctggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg ggaggtgaag 420

ctggtggagt ctggaggagg cctggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgtc 480

ggctctggat tcgacttcag tgacaacgct ttcagctggg tccgccaggc tccagggaag 540

gggctggagt gggtcgcagc cattgctagt agtgactatg acggtagcac ctactacgca 600

gactctgtga agggccgatt caccatctcc agcgacaact cccagaacac ggtgtatctg 660

caaatgaaca gcctcagaac cgaagacacg gcccggtatt actgtgcgat aggtgagggg 720

gatctctggg gcccaggcat cgaagtcgtc gtgactagt 759

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Ala Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Ile Tyr

20 25 30

Gly Asn Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys

85 90 95

Glu Ser Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105 110

Asp Ala Lys Pro Ser Val Phe Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val

145 150 155 160

Gly Ser Gly Phe Asp Phe Ser Asp Asn Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Ala Ser Ser Asp

180 185 190

Tyr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Asp Asn Ser Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser

210 215 220

Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Ile Gly Glu Gly

225 230 235 240

Asp Leu Trp Gly Pro Gly Ile Glu Val Val Val Thr Ser

245 250

<210> 3

<211> 348

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ctggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgtcg gctctggatt cgacttcagt gacaacgctt tcagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcagcc attgctagta gtgactatga cggtagcacc 180

tactacgcag actctgtgaa gggccgattc accatctcca gcgacaactc ccagaacacg 240

gtgtatctgc aaatgaacag cctcagaacc gaagacacgg cccggtatta ctgtgcgata 300

ggtgaggggg atctctgggg cccaggcatc gaagtcgtcg tgactagt 348

<210> 4

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

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ttcggtagcg ggaccaagct ggaaatcaaa cgggctgatg ccaagccatc cgtcttc 357

<210> 5

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

ggtggttcct ctagatcttc ctcctctggt ggcggtggct cgggcggtgg tggggaggwg 60

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

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<210> 7

<211> 72

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ggtggttcct ctagatcttc ctcctctggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggsaggtg 60

cagctgktgg ag 72

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

cctggccggc ctggccacta gtcacgacga cttcaacgcc tgg 43

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

cctggccggc ctggccacta gtcacgacga cttcraygcc tgg 43

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

cctggccggc ctggccacta gtcacgacga cttcrackcc tgg 43

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

gggcccaggc ggccgagctc gccmtygtgc tgacccagtc tcca 44

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

gggcccaggc ggccgagctc gagmtcgtsa tgacccagtc tcca 44

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

gggcccaggc ggccgagctc gmcatccrgw tgacccagtc tcca 44

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

ggaagatcta gaggaaccac ctttgakytc cagcttggtc cc 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

ggaagatcta gaggaaccac ctttgatatc cactttggtc cc 42

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 16

gggcccaggc ggccgagctc tcttctaagc tgactcagcc cccgggggtg t 51

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 17

ggaagatcta gaggaaccac cccgtgggag yggccttggg ctgacc 46

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 18

gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c 41

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 19

gaggaggagg aggaggagcc tggccggcct ggccactagt 40

<210> 20

<211> 786

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 20

gagctcgccc tcgtgctgac ccagtctcca ctctccctgt cagtcagccc tggagagccg 60

gcctccatct cctgcaggtc cagtcagagc cttgaggaat atggaaaaaa ttggttgagt 120

tggtaccagc agaaaccagg ccagtcgcca aggctcctga tctatgaggc taccaacagg 180

gcctcttggg tcccagagag gttcagtggc agtgggtcag gcacagattt caccctgaaa 240

atcagcaggg tggaggctga ggatgcaggc gtttattact gccagcaata taaagaattt 300

cctcctggtt tcggcgcggg gaccaagctg gagctcaaac gggctgatgc caagccatcc 360

gtcttcggtg gttcctctag atcttcctcc tctggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 420

ggggagaagc tggtggagtc tggaggaggc ctggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 480

tcctgtgtcg gctctggatt caccttcagt agtacctaca ttaactgggt ccgccaggct 540

ccagggaagg ggctggagtg gcttgcagct attagtacta gtggtggtag cacctactac 600

acagactctg tggagggccg attcaccatc tccaaagaca actcccagaa cacggcctat 660

ctgcaaatga acagcctgag aacagaagac acggcccgct attactgtgc aacaggctat 720

agcggttgct atagcggtta ctgtggggat ctctggggcc cagagttcga agtcgtcgtg 780

actagt 786

<210> 21

<211> 262

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 21

Glu Leu Ala Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser

1 5 10 15

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu

20 25 30

Glu Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Asn Arg Ala Ser Trp Val

50 55 60

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Lys Glu Phe Pro Pro Gly Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg Ala Asp Ala Lys Pro Ser Val Phe Gly Gly Ser Ser Arg Ser

115 120 125

Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Lys Leu

130 135 140

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

145 150 155 160

Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Thr Tyr Ile Asn Trp

165 170 175

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Ala Ile Ser

180 185 190

Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe

195 200 205

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Gln Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn

210 215 220

Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Tyr

225 230 235 240

Ser Gly Cys Tyr Ser Gly Tyr Cys Gly Asp Leu Trp Gly Pro Glu Phe

245 250 255

Glu Val Val Val Thr Ser

260

Claims

1.猪源抗PDCoV-N蛋白的scFv，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述的scFv的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.包含有权利要求2所述的核酸分子的scFv重组表达载体。

4.权利要求1所述的scFv在制备用于诊断PDCoV冠状病毒试剂中的应用。