ES2353952T3 - Ácidos nucleicos que codifican para vacunas contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (prrsv). - Google Patents

Ácidos nucleicos que codifican para vacunas contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (prrsv). Download PDF

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Abstract

Ácido nucleico que comprende: (a) las secuencias de un virus de la gastroenteritis transmisible competente para la replicación (TGEV), codificando dichas secuencias para una replicasa de TGEV bajo el control de secuencias reguladoras de la expresión, en el que la replicasa es expresada en una célula huésped e iniciará la replicación del ácido nucleico y aumentará así el número de ácidos nucleicos en la célula; y (b) una secuencia que codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), incluyendo dicha secuencia un residuo de formación de puente disulfuro; y (c) una secuencia que codifica para por lo menos un polipéptido adicional que puede aumentar una respuesta inmunitaria contra el PRRSV, en el que se ha modificado la secuencia que codifica para dicho epítopo neutralizante de ORF 5 para desactivar los sitios de glicosilación que interfieren en la inducción de anticuerpos.

Description

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que comprenden: secuencias de un virus de la gastroenteritis transmisible competente para la replicación (TGEV) y una secuencia que codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 del virus del 5 síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), incluyendo dicha secuencia un residuo de formación de puente disulfuro y habiéndose modificado para desactivar los sitios de glicosilación que interfieren en la inducción de anticuerpos.
La presente invención se refiere además a vectores, células huésped y partículas 10 virales que comprenden estas secuencias así como a la utilización de las secuencias para la preparación de composiciones farmacéuticas en general y específicamente para la preparación de vacunas con eficacia mejorada.
15
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
Los enfoques de terapia que implican la inserción de un gen funcional en una célula para lograr un efecto terapéutico también se denominan enfoques de terapia génica, dado que el gen actúa como fármaco. La terapia génica es una técnica 20 principalmente para corregir los genes defectuosos responsables del desarrollo de enfermedades.
Se utiliza una molécula portadora también denominada vector para suministrar el gen terapéutico a las células diana del paciente. En la actualidad, el vector más común es 25 un virus que se ha alterado genéticamente para portar genes humanos o animales. Los virus han desarrollado un modo de encapsular y suministrar sus genes a células humanas o animales de una manera patógena. Los científicos han aprovechado esta capacidad y manipulan el genoma del virus para eliminar los genes causantes de enfermedades e insertan genes terapéuticos. 30
Estos vectores virales se utilizaron para expresar genes heterólogos que provocan una respuesta inmunógena en el sujeto que recibe el vector y así inmunizar a ese sujeto. En ese caso el vector viral actúa como vacuna.
35
El virus de la gastroenteritis transmisible es un miembro de la familia de los coronavirus. Los coronavirus son virus de ARNss(+) que presentan el genoma más grande encontrado hasta el momento en los virus de ARN con una longitud de entre 25 y 31 kilobases kb (véase SIDDELL S.G. 1995, The Coronaviridae). Cuando un coronavirus infecta una célula, el ARN genómico (ARNg) se replica en el citoplasma y se produce un 40 conjunto de ARN subgenómicos (ARNsg) de polaridad positiva y negativa (SETHNA et al., 1989; SAWICKI & SAWICKI , 1990; y VAN DER MOST y SPAAN, 1995).
Debido al hecho de que los coronavirus se replican en el citoplasma, se ha sugerido la utilización de los coronavirus como vector para terapia génica y vacunación 45 (ENJUANES et al., 2003). Específicamente, se produjeron genomas de interferencia defectuosa (DI) de coronavirus. Estos genomas DI son mutantes de deleción que requieren la presencia de un virus de complementación o auxiliar para la replicación y/o transcripción (véase CHANG et al., 1994; documento WO97/34008; solicitud de patente española P9600620; IZETA et al., 1999; SÁNCHEZ et al., 1999).
Se clonó todo el genoma de un coronavirus en forma de un ADNc infeccioso (ALMAZAN et al., 2000 y el documento WO01/39797). La clonación de todo el genoma 5 permitió la preparación de vectores infecciosos que contienen secuencias heterólogas adecuadas para la expresión de proteínas grandes en una célula huésped. El documento WO01/39797 y PLANA-DURBAN - et al., 2003 (Int. Symposium on Emerging and Re-Emerging Pig Diseases, 2003, páginas 115-116) también sugieren expresar las secuencias de PRRSV a partir del vector de ADNc infeccioso de coronavirus. 10
El potencial del genoma viral clonado para la expresión de secuencias heterólogas se revisó en ENJUANES et al., 2003.
Utilizando el virus clonado, se evaluaron la estructura del genoma y la relevancia 15 de los genes coronavirales para la infección preparando mutantes de deleción. Se encontró que los genes 3a, 3b y 7 no son esenciales para la replicación del ácido nucleico viral y que la ausencia de los genes reduce la patogenicidad del virus (ORTEGO et al., 2002 y 2003; SOLA et al., 2003).
20
El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) se identificó por primera vez en 1991 como el agente causante de una nueva enfermedad en los cerdos (WENSVOORT et al., 1991). Desde entonces, el PRRSV se ha convertido en una de las causas principales de pérdidas económicas en explotaciones porcinas en todo el mundo y en la actualidad se acepta como la enfermedad infecciosa más importante del cerdo, que 25 provoca fallos en la reproducción en animales adultos y neumonía grave en cerdos neonatos. El PRRSV es un miembro de la familia Arteriviridae que pertenece al orden de los Nidovirales. Se reconocen dos genotipos (americano y europeo) (MURTAUGH et al., 1995). El PRRSV es un virus encapsulado con un genoma de ARN de sentido positivo monocatenario de 14,5 Kb. Los dos tercios en el sentido de 5’ del genoma codifican para 30 las poliproteínas de replicasa (ppla y pplab), el resto del ARN genómico codifica para tres glicoproteínas asociadas a la membrana secundarias (Gp2, Gp3 y Gp4) y las tres proteínas estructurales principales (Gp5, M y N). Generalmente los cerdos se infectan con PRRSV tras la exposición de la superficie de la mucosa o las vías respiratorias al virus. Un distintivo de la respuesta de los anticuerpos porcinos contra PRRSV son los anticuerpos 35 no neutralizantes abundantes detectados de manera temprana en la infección, seguido de un título bajo de anticuerpos neutralizantes que aparece más de 3 semanas tras la infección. En los últimos años se han recogido datos experimentales que muestran la importancia de los anticuerpos neutralizantes en la protección contra la infección por PRRSV (LOPEZ y OSORIO, 2004, ANSARI et al., 2006). La glicoproteína Gp5 de PRRSV 40 contiene la mayoría de los epítopos neutralizantes del virus. Las proteínas Gp4 y M de PRRSV también inducen anticuerpos neutralizantes, sin embargo, los anticuerpos específicos para Gp5 neutralizan más eficazmente PRRSV que los que se unen a otras proteínas virales (OSTROWSKI et al., 2002). La infección por PRRSV también induce unas respuestas inmunitarias mediadas por células T más débiles y retardadas en relación 45 con las provocadas por otros virus. Ambas respuestas se requieren para completar el aclaramiento de virus.
Se ha observado que las proteínas ORF5 de PRRSV son portadoras de cadenas de polilactosaminoglicano, sin embargo, en ese momento se desconocía la relevancia de estas cadenas para la neutralización de anticuerpos (CHEN et al., Virology, vol. 266, 2000, páginas 88-98).
Aunque la respuesta inmunitaria frente a PRRSV se entiende muy poco, se están 5 comercializando algunas vacunas. Las vacunas actuales contra PRRSV presentan varios inconvenientes. El PRRSV, ya sea de tipo natural o atenuado, induce un nivel bajo de inmunidad mediada por células (MEIER et al., 2003) y los anticuerpos neutralizantes (NA) no se desarrollan hasta una fase tardía de la infección (MEIER et al., 2003, VEZINA et al., 1996, YOON et al., 1995). Además, se cree que la diversidad genética del PRRSV influye 10 en la eficacia de la vacuna en las condiciones de campo (LABARQUE et al., 2004, PESCH et al., 2005), aunque existe cierto grado de protección cruzada (MENGELING et al., 2003 a, 2003b). Las vacunas vivas modificadas protegen contra la exposición a aislados homólogos, pero generalmente presentan un efecto limitado contra la exposición a virus heterólogos (MENG, 2000). Además, las vacunas vivas proporcionan protección parcial 15 contra la enfermedad clínica, pero no prevenían la infección (OSORIO et al., 1998) y, de manera más importante, pueden revertir a virulencia (BONER et al., 1997, NIELSEN et al., 2001). Por otra parte, las vacunas de PRRSV destruido, han demostrado ser menos eficaces en la prevención tanto de infección como de enfermedad (OSTROWSKI et al., 2002). 20
El problema que subyace a la presente invención consiste por tanto en proporcionar vectores de vacuna eficaces con buena seguridad e inmunogenicidad contra PRRSV.
25
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden: 30
(a) secuencias de un virus de la gastroenteritis transmisible competente para la replicación (TGEV), codificando las secuencias para una replicasa de TGEV bajo el control de secuencias reguladoras de la expresión, expresándose la replicasa en una célula huésped e iniciará la replicación del ácido nucleico y por tanto 35 aumentará el número de ácidos nucleicos en la célula; y
(b) una secuencia que codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), incluyendo la secuencia un residuo de formación de puente disulfuro; y 40
(c) una secuencia que codifica para por lo menos un polipéptido adicional que puede aumentar una respuesta inmunitaria frente a PRRSV,
en los que se ha modificado la secuencia que codifica para dicho epítopo neutralizante de 45 ORF 5 para desactivar sitios de glicosilación que interfieren con la inducción de anticuerpos.
En una forma de realización preferida, el epítopo neutralizante se define por la secuencia de aminoácidos TYQYIYN (SEC ID nº: 10).
En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico comprende las secuencias de ORF5 y ORF 6 de PRRSV cada una bajo el control de una secuencia reguladora de la expresión separada. 5
En una forma de realización más preferida, el ácido nucleico está constituido por (1) la secuencia de ORF5 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la transcripción del gen 3a, (2) la secuencia de ORF6 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la expresión TRS22N expuesta como SEC ID nº: 19 y (3) la 10 secuencia del gen S derivado de la cepa atenuada PTV de TGEV.
Las secuencias de TGEV competente para la replicación no necesitan pero pueden codificar además para otras proteínas de TGEV. Por tanto, las secuencias de TGEV pueden codificar para un virus TGEV completamente infeccioso y las secuencias del 15 epítopo neutralizante o multímeros de epítopos neutralizantes sólo comprenden ácido nucleico competente para la replicación. La presente invención se refiere además a vectores que comprenden un ácido nucleico respectivo y células huésped que comprenden el vector. Las células huésped pueden complementar los genes de TGEV que pueden haberse eliminado a partir de los ácidos nucleicos de la presente invención. 20 Por tanto, la célula huésped puede ser una línea celular de empaquetamiento o puede contener un virus auxiliar que expresa genes de TGEV, de modo que se forme una partícula de virus TGEV que comprende las secuencias de por lo menos un epítopo neutralizante de PRRSV. Las partículas de virus obtenidas mediante la asociación de las proteínas de la cubierta de TGEV con los ácidos nucleicos competentes para la replicación 25 pero no infecciosos de la presente invención son una forma de realización especialmente preferida de la presente invención (las partículas de virus correspondientes también se han denominado seudovirus).
Finalmente, la presente invención también se refiere a la utilización médica de los 30 ácidos nucleicos, los vectores de virus y las células huésped específicamente a la utilización como vacuna para tratar o proteger animales, tales como un cerdo frente a enfermedades infecciosas. Por tanto, la vacuna puede administrarse a un animal para reducir o eliminar los síntomas de una infección posterior de un virus de tipo natural.
35
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Por tanto, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos tal como se describieron anteriormente. 40
En la presente solicitud el término “pase” se utiliza para hacer referencia a un procedimiento, en el que se infecta con el virus una monocapa de células sensibles a TGEV (tales como células ST) en un recipiente de cultivo, tal como una placa Petri, se recoge el sobrenadante tras la replicación del virus, por ejemplo tras 24 horas, y se 45 transfieren a una nueva monocapa de células. La realización del pase puede incluir etapas de clonación, por ejemplo transfección para obtener virus a partir de clones de ADN (utilizando por ejemplo células BHK) o purificación en placa del virus.
Uno de los problemas durante la infección con PRRSV es que los cerdos sólo secretan bajas cantidades de IFN-γ muy tarde durante la infección. La inducción de interferón (IFN-α/β) de tipo 1 es esencial para promover respuestas inmunitarias humorales y celulares antivirales (PFEFFER et al., 1998) (LE BON et al., 2001). Además se ha descrito que el IFN-α y la IL-12 están implicados en la diferenciación de células T en 5 células secretoras de IFN-γ específicas de antígeno (COUSENS et al., 1999). Sin embargo, se ha mostrado que el TGEV es un potente inductor de IFN-α. La inducción de IFN por TGEV es un proceso mediado por la proteína M (CHARLEY y LAUDE, 1988; LAUDE et al., 1990). Además, los vectores de TGEV presentan antígenos en sitios de la mucosa, provocando respuestas inmunitarias de mucosa y sistémicas. Por tanto, la 10 utilización de TGEV como vector para los epítopos de PRRSV mejorará ventajosamente la inducción de protección frente al PRRSV.
El vector a base de TGEV puede mostrar un tropismo de vector modificado. En una forma de realización de la invención, el vector es un vector dirigido a las vías respiratorias. 15 Esto se logra utilizando el gen de espiga (S) de un virus respiratorio. En una forma de realización alternativa, el vector es un vector dirigido al tracto intestinal. Esto se logra utilizando el gen S de una cepa intestinal de TGEV. El gen S además puede ser una secuencia que dirige el vector tanto al tracto respiratorio como al intestinal (véase la figura 9). 20
En una forma de realización preferida, se utiliza un gen S modificado (SEQ ID No:1), que proporciona tropismo intestinal y respiratorio y es muy estable en el pase en células de testículo de cerdo (ST) en cultivo. Este gen es una proteína quimérica derivada de la proteína S del clon C11 de TGEV (que es virulento con tropismo intestinal y 25 respiratorio) y el clon de PTV. La proteína S recombinante se diseñó por ingeniería genética utilizando los primeros 1208 nt del gen S de C11 de TGEV y el resto de la secuencia quimérica del virus PTV. Se obtuvo la proteína quimérica final proporcionando un virus recombinante portador de esta proteína a los cerdos y la recuperación de un virus que presenta la secuencia quimérica tal como se expone como SEC ID nº: 1. Esta 30 proteína proporciona tropismo intestinal y respiratorio al TGEV, es muy estable en el pase en cultivo tisular en testículo de cerdo (ST), proporciona altos títulos (>108) para el TGEV cuando se hace crecer en cultivo tisular en células ST y no pierde el tropismo dual in vitro (tal como puede apreciarse a partir de la figura 9).
35
En un aspecto el ácido nucleico de la presente invención se caracteriza como un ácido nucleico que codifica para secuencias de TGEV competentes para la replicación que significa secuencias que codifican para una replicasa de TGEV bajo el control de secuencias reguladoras de la expresión de modo que la expresión de la replicasa en una célula que contiene el ácido nucleico iniciará la replicación del ácido nucleico y por tanto 40 aumentará el número de ácidos nucleicos en la célula. Una vez se infecta una célula con los ácidos nucleicos de la presente invención, se expresará el gen para la replicasa y se replicará el ácido nucleico. Cuantas más copias del ácido nucleico estén presentes en la célula más epítopos se expresarán.
45
La expresión “secuencia reguladora de la transcripción”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa una secuencia o un fragmento de una secuencia que puede impulsar la síntesis de ARN virales subgenómicos asociados con la secuencia reguladora de la transcripción. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras de la transcripción son las secuencias que regulan la transcripción (TRS) asociadas de manera natural con los ARN virales. En una forma de realización preferida, la TRS será la TRS del gen 3a y en el caso de un vector dicistrónico que codifica para dos antígenos, la segunda TRS será una TRS sintética derivada del gen N (TRS22N; SEC ID nº: 19) que se optimizó para la expresión génica tanto en los sistemas de expresión de minigenoma como de ADNc de 5 longitud completa (ALONSO et al., 2002).
Según la presente invención “epítopo neutralizante” significa epítopos que están implicados en la neutralización de virus. Los anticuerpos que reconocen Gp5 (codificado por ORF5) de PRRSV neutralizan PRRSV más eficazmente que los específicos para otras 10 proteínas virales (OSTROWSKI et al., 2002). Debe apreciarse que el ácido nucleico de la invención codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 de PRRSV, pero también puede codificar para más epítopos neutralizantes o una parte más grande de ORF5, por ejemplo la proteína Gp5 completa.
15
En una forma de realización preferida, el epítopo neutralizante se define mediante la secuencia de aminoácidos TYQYIYN (SEC ID nº: 10).
En una forma de realización, los ácidos nucleicos de la invención codifican para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 de PRRSV y un residuo de formación de 20 puente disulfuro que puede usarse para conectar un polipéptido adicional a dicho epítopo neutralizante. Por ejemplo, un epítopo de ORF6, que codifica para la proteína M de PRRSV, o puede acoplarse la proteína M completa al epítopo de ORF 5 a través de un puente disulfuro.
25
En otra forma de realización, los ácidos nucleicos según la invención codifican para multímeros de epítopos neutralizantes de ORF5. Un “multímero” comprende por lo menos 2 copias de un epítopo. Un “multímero” puede comprender repeticiones de Gp5 u otras secuencias de proteínas derivadas de PRRSV que inducen anticuerpos neutralizantes frente a PRRSV. Esta definición incluye dominios de proteína sintéticos (o péptidos) 30 derivados de Gp5 de PRRSV u otras proteínas de PRRSV con una secuencia modificada mediante mutagénesis puntual que conduce a una estructura inmunogénica que proporciona mayor protección debido a una respuesta neutralizante potenciada o la eliminación de epítopos señuelo.
35
Normalmente, un ácido nucleico codificará para multímeros que comprenden de 2 a 5 repeticiones de la secuencia que codifica para el epítopo neutralizante de ORF5 de PRRSV. Estos multímeros pueden estar conectados mediante una secuencia de ácido nucleico que codifica para un conector flexible de 2 a 8, preferentemente de 3 a 6 aminoácidos. Estos “residuos conectores” mejorarán la flexibilidad de los epítopos. Un 40 conector específicamente preferido es la secuencia Gly-Gly-Pro-Gly-Gly (SEC ID nº: 15).
Se han modificando los ácidos nucleicos que codifican para epítopos neutralizantes de ORF5 para desactivar sitios de glicosilación, a partir de un informe reciente que describe que la falta de glicosilación conduce a un aumento en la inducción de anticuerpos 45 neutralizantes frente a PRRSV (ANSARI et al., 2006). En una forma de realización preferida, tales sitios de glicosilación son los aminoácidos 46 y/o 53 de Gp5 de la cepa Olot 91 de PRRSV.
La glicosilación de los epítopos de proteína Gp5 puede interferir con la inducción de los anticuerpos dando como resultado una disminución de la respuesta inmunitaria. Por tanto, los epítopos codificados por los ácidos nucleicos de la invención pueden proporcionar un aumento de los efectos estimuladores de la respuesta inmunitaria en comparación con los epítopos que se produce de manera natural. 5
En una forma de realización preferida de la invención, el ácido nucleico codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 y ORF6 pero no polipéptidos de PRRSV adicionales. Por tanto, en otras formas de realización preferidas de la invención el ácido nucleico comprende un epítopo neutralizante de ORF5 y por lo menos un epítopo de 10 ORF 6 de PRRSV. En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico comprende un epítopo neutralizante de ORF5 y un epítopo neutralizante de ORF 6 de PRRSV. Aún en otra forma de realización, el ácido nucleico está constituido por un epítopo neutralizante de ORF5 y un epítopo neutralizante de ORF 6 de PRRSV. Aún en otra forma de realización preferida, el ácido nucleico está constituido por un epítopo neutralizante de ORF5 y ORF 6 15 completo de PRRSV.
Esto da como resultado una vacuna muy eficaz contra PRRSV. En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico codifica para el ORF5 y ORF6 completos pero para ningún polipéptido de PRRSV adicional. 20
En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico codifica para un epítopo neutralizante de ORF5 y el ORF6 completo pero para ningún polipéptido de PRRSV adicional. Aún en otra forma de realización preferida, el epítopo neutralizante de ORF5 se define mediante la SEC ID nº: 10. 25
En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5, ORF6 completo y adicionalmente por lo menos un epítopo neutralizante de Gp4.
30
Las vacunas que comprenden Gp5 de PRRSV solo han demostrado ser eficaces con respecto a la protección de cochinillos frente a la infección por PRRSV. Esto se demostró mediante la prevención de la pérdida de peso en cochinillos vacunados tras la infección con PRRSV (véase la figura 1) y mediante la prevención de una infección con PRRSV en cochinillos vacunados (véase la figura 2). Sin embargo, el virus recombinante 35 que comprende Gp5 solo ha demostrado ser inestable tras la realización del pase del virus en el cultivo tisular. Tal como puede observarse a partir de la figura 3, el ARNm de Gp5 ya no pudo detectarse en células ST infectadas con el virus recombinante del pase 5 en el cultivo tisular (p5), mientras que aún puede detectarse en células ST infectadas con el virus recombinante del pase 2 (p2). Esto puede deberse a deleciones que se producen en 40 el virus durante los pases.
Por el contrario, la utilización de ácidos nucleicos que codifican para Gp5 (ORF5) y M (ORF6) de PRRSV ha mostrado que proporciona constructos con estabilidad sustancialmente mejorada. Más específicamente, además de conferir protección contra la 45 infección por PRRSV, los constructos dicistrónicos que comprenden ácidos nucleicos que codifican para Gp5 y M de PRRSV son más estables incluso tras haberse pasado 20 veces en el cultivo tisular (véanse las figuras 5, 6 y 8). Además, el virus podría rescatarse de cochinillos infectados. La estabilidad del constructo se mostró adicionalmente mediante análisis de RT-PCR (véase la figura 7), que muestra que los transcritos tanto del gen de ORF5 y como del ORF6 podrían detectarse para los clones de virus rescatados de las células ST tras 20 pases in vitro. Estos datos muestran claramente que los constructos dicistrónicos de la presente invención que comprenden ácidos nucleicos que codifican para Gp5 y M de PRRSV no sólo pueden proporcionar un virus que conserva su 5 capacidad tanto de hacer crecer, en cultivos celulares incluso tras 20 pases, sino también aún expresa ambas proteínas codificadas por el constructo dicistrónico tras 20 pases. Esta estabilidad mejorada en el cultivo celular es especialmente importante para la propagación del virus recombinante in vitro para fines de vacunación. Además, debido a la estabilidad mejorada, también es posible recuperar TGEV recombinante que expresa Gp5 y M de 10 PRRSV de tejidos de pulmón e intestino de cochinillos vacunados que pueden propagarse adicionalmente en cultivo celular utilizando células ST (véanse las figuras 9 y 10).
Otras proteínas derivadas de PRRSV que podrían expresarse para inducir una respuesta inmunitaria protectora son las glicoproteínas Gp2, Gp3 y Gp4. Se ha 15 demostrado que estas proteínas se incorporan en viriones como complejo multimérico (WISSINK et al., 2005) y son esenciales para la infectividad del virus. Por tanto, en otra forma de realización de la invención los ácidos nucleicos codifican para por lo menos un epítopo neutralizante de Gp5 y por lo menos un epítopo neutralizante de Gp2, Gp3 o Gp4. En una forma de realización preferida, los ácidos nucleicos codifican para un epítopo 20 neutralizante de Gp5 y Gp2. En otra forma de realización, los ácidos nucleicos codifican para un epítopo neutralizante de Gp5 y Gp3 y aún en otra forma de realización, los ácidos nucleicos codifican para un epítopo neutralizante de Gp5 y Gp4. Otras formas de realización comprenden las combinaciones Gp5 con Gp2 y Gp3, Gp5 con Gp2 y Gp4 o Gp5 con Gp3 y Gp4. 25
La utilización de virus virulentos o atenuados y de antígenos recombinantes de PRRSV puede conducir a un retraso en la inducción de anticuerpos neutralizantes frente al virus. En una forma de realización de la invención, los ácidos nucleicos codifican para polipéptidos que mejoran la presentación de antígenos. En una forma de realización 30 preferida, se utiliza para tal fin la señal de direccionamiento lisosómico de la proteína II integral de membrana lisosómica (LIMP-II). En otra forma de realización, se utiliza la proteína LIMP-II completa y otras formas de realización comprenden cualquier fragmento de LIMP-II que contiene la señal de direccionamiento lisosómico. En una forma de realización más preferida, una proteína de fusión que comprende la señal de 35 direccionamiento lisosómico de LIMP-II y ORF5 y/u ORF6, o por lo menos un epítopo neutralizante de la misma, se codifica en los ácidos nucleicos de la invención, estando la señal de direccionamiento lisosómico de LIMP-II o bien fusionada con el ORF5 o bien con el ORF6 y en el caso de que ambos, ORF5 y ORF6, estén presentes, la señal de direccionamiento lisosómico de LIMP-II se fusiona con uno de ellos mientras que el ORF5 40 y ORF6, o los epítopos neutralizantes de los mismos, se conectan mediante un puente disulfuro.
En otra forma de realización, el polipéptido que puede aumentar una respuesta inmunitaria contra PRRSV es una interleucina. Recientemente, se ha descrito que IL-10 e 45 IL-12 desempeñan un papel en los mecanismos de defensa pulmonar contra infección por PRRSV en cochinillos (CHUNG y CHAE, 2003). La incapacidad del cerdo para resolver una infección por PRRSV podría relacionarse con los bajos niveles de IFN-γ durante la infección (SURADHAT et al., 2003). La IL-12 es una citocina inducible compuesta de dos subunidades unidas (p35 y p40) que inducen la expresión de IFN por las células T y las células citolíticas naturales. Por consiguiente, interleucinas preferidas son por ejemplo IL-2, IL-10 o IL-12. En una forma de realización preferida, es la interleucina 12 (IL-12) y en una forma de realización todavía más preferida, es sólo la subunidad p35 de IL-12.
5
El vector de TGEV competente para la replicación puede ser infeccioso o no. Según la presente invención se denomina ácido nucleico infeccioso un ácido nucleico que contiene por lo menos todas las secuencias necesarias para la replicación del ácido nucleico, produce una o varias proteínas de la cubierta y se asocia con las proteínas de la cubierta para proporcionar una partícula viral que permitirá la infección de otras células. 10
En un aspecto especialmente preferido, la presente invención proporciona una partícula de virus que comprende el ácido nucleico anterior y por lo menos una proteína de la cubierta de TGEV. La partícula de virus puede comprender más de una e incluso todas las proteínas de la cubierta de TGEV. Una partícula de virus correspondiente podrá entrar 15 en una célula huésped por medio de una infección. Sin embargo, el ácido nucleico de una partícula de virus de este tipo aún puede ser infeccioso o no infeccioso, dado que no necesita codificar para todas las proteínas de la cubierta de TGEV necesarias para producir una partícula de virus. Si el ácido nucleico es un ácido nucleico no infeccioso en el sentido de la presente solicitud, la partícula de virus se prepara utilizando una célula 20 huésped de empaquetamiento o un virus auxiliar que complementa los genes de TGEV. La utilización de las células huésped de empaquetamiento o virus auxiliares para obtener partículas de virus que comprenden un genoma incompleto de un virus se conoce bien en la materia. Esta modo de proceder presenta ventajas específicas, dado que la partícula de virus es infecciosa per se (es decir, puede infectar una célula una vez), pero el ácido 25 nucleico no puede producir partículas de virus infecciosas adicionales. En otras palabras, las secuencias derivadas de TGEV no codifican para proteínas que podrán asociarse con el ácido nucleico para formar una nueva partícula de virus. Por tanto, estas partículas de virus son extremadamente seguras y aún proporcionan una alta respuesta inmunogénica contra los epítopos expresados por los ácidos nucleicos. 30
Según una forma de realización alternativa de la presente invención, las partículas virales infecciosas de TGEV que pueden obtenerse a partir de la asociación de proteínas de TGEV y las secuencias de ácido nucleico son partículas virales atenuadas. Esto presenta la ventaja de que el sujeto que va a tratarse utilizando los ácidos nucleicos de la 35 presente invención se vacunará al mismo tiempo contra TGEV y contra PRRSV.
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender secuencias que codifican para todas las proteínas de TGEV. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias que sólo codifican para las proteínas de TGEV necesarias 40 para un vector de TGEV competente para la replicación. Por tanto, el ácido nucleico preferentemente codifica para la replicasa de TGEV. Según una forma de realización especialmente preferida, el ácido nucleico codifica para un vector de TGEV competente para la replicación, pero no infeccioso, que comprende secuencias que codifican para la replicasa de TGEV y la proteína N de TGEV y ninguna de las otras proteínas de TGEV. 45 Este vector presenta la ventaja específica de que el vector de TGEV se amplificará en gran medida en la célula huésped y por tanto producirá grandes cantidades de los epítopos. Al mismo tiempo, este vector es extremadamente seguro, ya que no es infeccioso.
La expresión “ácidos nucleicos que codifican para proteínas de TGEV” se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a secuencias de ácido nucleico tal como se dan a conocer en PENZES et al. (2001), o a secuencias de ácido nucleico que presentan una similitud de por lo menos el 60%, preferentemente por lo menos el 75% y todavía más 5 preferentemente por lo menos el 95% con estas secuencias. Por ejemplo, pueden utilizarse secuencias alternativas específicas para diferenciar entre animales vacunados contra TGEV y animales infectados con TGEV (tal como explica con mayor detalle a continuación). En el vector a base de TGEV proporcionado a título de ejemplo en la presente solicitud, se han introducido sustituciones de nucleótidos correspondientes 10 utilizando RT-PCR en las posiciones 6752, 18997, 20460 y 21369, respectivamente. Especialmente las secuencias de ácido nucleico que codifican para la replicasa de TGEV, la proteína N, proteína M, proteína E o proteína S de TGEV tal como se utilizan en la presente memoria significa secuencias de ácido nucleico tal como se dan a conocer en PENZES et al., 2001 (con o sin las enmiendas mencionadas anteriormente). De hecho, 15 también es posible utilizar otras cepas de TGEV o incluir deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones adicionales en la secuencia de ácido nucleico. Según un aspecto adicional, las secuencias de TGEV difieren por tanto de las secuencias dadas a conocer en PENZES et al. pero aún presentan una similitud de por lo menos el 60%, preferentemente por lo menos el 75% y todavía más preferentemente por lo menos el 95% 20 con estas secuencias.
La expresión “ácidos nucleicos que codifican para proteínas de PRRSV” se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a secuencias de ácido nucleico de tipo natural de PRRSV o secuencias de ácido nucleico que presentan una similitud de por lo 25 menos el 60%, preferentemente por lo menos el 75% y todavía más preferentemente por lo menos el 95% con estas secuencias.
En el contexto de la presente solicitud, se determina la similitud de secuencia utilizando el programa de informático ClustalW disponible del European Bioinformatics 30 Institute (EBI), a menos que se indique lo contrario.
El vector de TGEV infeccioso no necesita contener los genes 3a, 3b y 7, dado que se conoce que éstos no son esenciales. Las proteínas codificadas por los genes 3a, 3b y 7 de TGEV pueden modular la respuesta inmunitaria contra TGEV y cuando se desea 35 modular la interacción de TGEV con el huésped, estos genes pueden mantenerse en el vector de TGEV.
Adicionalmente, se ha diseñado por ingeniería genética el vector de TGEV infeccioso, expresando antígenos de PRRSV en diferentes posiciones del genoma de 40 TGEV, tal como sustituyendo la proteína nsp2 o entre proteínas nsp1 y nsp2 de las poliproteínas de replicasa, de manera similar a la descrita para MHV y HCoV-229E (GRAHAM et al., 2005; HERTZIG et al., 2004).
Además, dado que el retraso en la aparición de anticuerpos neutralizantes tras la 45 infección con PRRSV podría deberse a la presencia de epítopos señuelo (inmunodominantes) o a la presencia de epítopos reconocidos por las células T reguladoras que inhiben una fuerte respuesta inmunitaria, se han diseñado por ingeniería genética vectores de TGEV infecciosos adicionales que expresan proteína M de PRRSV y versiones modificadas de Gp5. En estas proteínas Gp5 diseñadas por ingeniería genética, se han delecionado el epítopo señuelo y los epítopos de células T reguladoras, manteniendo la capacidad de la Gp5 mutada para interaccionar con la proteína M y, por tanto, mejorando la estabilidad de los virus recombinantes.
5
Las secuencias que codifican para proteínas dentro de los ácidos nucleicos de la presente invención preferentemente se unen a secuencias que controlan la expresión de estos genes en las células u organismos huésped. Los genes que codifican para los epítopos u otros polipéptidos pueden, por ejemplo, estar flanqueados por secuencias reguladoras de la transcripción (TRS) y/o secuencias del sitio interno de entrada al 10 ribosoma (IRES) para aumentar la transcripción y/o traducción de las secuencias que codifican para proteínas. Las secuencias TRS e IRES respectivas se conocen bien en la materia. Preferentemente, la TRS es la TRS del gen 3a, mientras que en el caso de un vector dicistrónico que codifica para dos antígenos, la segunda TRS preferentemente será una TRS sintética derivada del gen N (TRS22N; SEC ID nº: 19). 15
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar en forma de ADN o ARN. Dentro del alcance de la presente invención, están comprendidas específicamente moléculas de ARN recombinante que se codifican por uno de los ácidos nucleicos anteriores. 20
En una forma de realización preferida, el ácido nucleico comprende las secuencias de ORF5 y ORF 6 de PRRSV, cada una, bajo el control de una secuencia reguladora de la expresión separada.
25
En una forma de realización más preferida, el ácido nucleico está constituido por (1) la secuencia de ORF5 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la transcripción del gen 3a, (2) la secuencia de ORF 6 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la expresión TRS22N expuesta como SEC ID nº: 19 y (3) la secuencia del gen S derivada de la cepa atenuada PTV de TGEV. Un ejemplo de una 30 proteína S de este tipo es la de SEC ID nº: 1.
Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a vectores que comprenden uno de los ácidos nucleicos anteriores. El vector puede ser un vector de ADNc y preferentemente es un vector derivado de BAC, tal como BAC-TGEVFL. El vector 35 preferentemente puede replicar el ácido nucleico dentro de una célula huésped específica o varias células huésped.
Las células huésped, que comprenden un vector que comprende uno de los ácidos nucleicos anteriores son otro objeto de la presente invención. La célula puede ser una 40 célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de animal o una célula humana. Según una forma de realización preferida, la célula es una línea celular porcina de testículo de cerdo (ST), tal como la línea celular depositada bajo ATCC CRL1746.
45
La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden uno de los ácidos nucleicos, ARN virales, polipéptidos o vectores de la presente invención o una célula huésped tal como se describió anteriormente. La composición farmacéutica puede comprender además uno o más vehículo(s), excipiente(s) y/o adyuvante(s) farmacéuticamente aceptable(s).
En una forma de realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a vacunas que pueden proteger un animal contra PRRSV que comprenden un ácido nucleico, un ARN viral, un vector, un polipéptido o una célula huésped de la presente 5 invención. La vacuna también puede comprender uno o más vehículo(s), excipiente(s) y/o adyuvante(s) farmacéuticamente aceptable(s).
En la técnica se conocen adyuvantes y los vehículos adecuados para administrar vacunas genéticas e inmunógenos a través de la vía mucosa. Los vehículos y adyuvantes 10 convencionales se revisan por ejemplo en KIYONO et al., 1996. La presente invención comprende asimismo la adición de quimiocinas que se utilizan para modular respuestas inmunitarias. Los compuestos respectivos y su utilización médica se han revisado en TOKA et al., 2004. Es específicamente ventajoso utilizar uno de entre factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos, interleucina-2 (IL-2), IL-12, IL-18. La IL-12 es una 15 citocina inducible compuesta por dos subunidades unidas (p35 y p40) que inducen la expresión de IFN por las células T y las células citolíticas naturales. Se ha descrito que la coadministración de IL-12 de cadena sencilla recombinante (rIL-12) como adyuvante con una cepa de vacuna de células productoras de INF-γ específica para PRRSV mejorada con PRRSV (Foss et al., 2002). La IL-12 también redujo el título de PRRSV en cultivo 20 celular y disminuyó la viremia en animales infectados con PRRSV, lo que sugirió que la IL-12 potenciaba el desarrollo de la inmunidad mediada por células específica de antígenos y promovía la producción de IFN-γ en los pulmones de animales infectados con PRRSV (CARTER y CURIEL, 2005). Una limitación de la administración de IL-12 es que la subunidad p40 se expresa en exceso en relación con la subunidad p35 y, aparentemente, 25 los dímeros de p40 se unen al receptor de IL-12 y actúan como un antagonista de IL-12. Recientemente, se ha mostrado que la expresión de la subunidad p35 de IL-12 como adyuvante molecular que potenciaba tanto las respuestas inmunitarias humorales como las mediadas por células sin las preocupaciones asociadas con p40 de IL-12 (OSORIO y GHIASI, 2005). También pueden aplicarse enfoques combinatorios que utilizan varias 30 citocinas y quimiocinas. Además, a medida que se descubre más sobre los requisitos para el desarrollo de memoria de las células T, las administraciones de refuerzo que implican citocinas clave tales como IL-15 y IL-23 pueden resultar beneficiosas para el mantenimiento a largo plazo de la reserva de memoria.
35
La vacuna preferentemente es adecuada para tratar a un mamífero, por ejemplo un cerdo. Resulta especialmente preferida la vacunación de cerdas.
Según la presente invención, se proporcionan vacunas, que preferentemente pueden inducir tanto una respuesta inmunitaria sistémica como una respuesta inmunitaria 40 en la mucosa contra PRRSV y/o TGEV.
La vacuna puede ser además una vacuna multivalente que puede proporcionar protección contra uno o varios patógenos de cerdo distintos. Por tanto, la vacuna multivalente puede comprender además antígenos derivados de otras proteínas y/o 45 patógenos virales y/o bacterianos que proporcionarán inmunidad contra patógenos. Los ejemplos de antígenos de patógenos virales adicionales comprenden antígenos derivados de uno de virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino de tipo 2, peste porcina clásica, peste porcina africana, glosopeda, virus de seudorrabia, circovirus porcino de tipo 1, adenovirus porcinos, enterovirus porcinos, coronavirus respiratorio porcino, rotavirus porcino, virus de encefalomiocarditis, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la enfermedad del ojo azul, virus de la hepatitis E y/o virus del Nilo Occidental, virus Nipah. Específicamente resulta preferida la utilización de antígenos derivados de uno o varios de virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino de tipo 2, peste 5 porcina clásica, peste porcina africana y/o glosopeda.
Los ejemplos de antígenos de patógenos bacterianos comprenden antígenos derivados de uno de entre Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida tipo 10 A (toxinas), Pasteurella multocida tipo D (toxinas), Bordetella bronchiseptica, Isospora suis, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Mycoplasma hyorinis, Streptococcus suis, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium novyi, Brucella abortus y/o Candidatus helicobacter suis. Específicamente resulta preferida la 15 utilización de antígenos derivados de uno o varios de Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida tipo A (toxinas), Pasteurella multocida tipo D (toxinas), Bordetella bronchiseptica, Isospora suis, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli y/o Salmonella 20 enterica.
El antígeno viral o bacteriano adicional puede estar presente en la vacuna multivalente como un virus o una bacteria atenuado o inactivado. Alternativamente, la vacuna multivalente puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para 25 uno o varios de los antígenos virales o bacterianos adicionales. Esa secuencia puede estar dentro de la misma molécula de ácido nucleico que también codifica para las secuencias de TGEV y PRRSV o puede estar presente en la vacuna como una molécula de ácido nucleico separada.
30
La vacuna multivalente puede comprender además secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas que conferirán protección contra patógenos de cerdo. Las secuencias de ácido nucleico respectivas pueden por ejemplo codificar para uno o varios anticuerpos que tienen especificidad para enfermedades bacterianas o virales. Alternativa o adicionalmente, el ácido nucleico puede codificar para la secuencia de la proteína 35 priónica porcina y por tanto puede utilizarse para vacunar contra enfermedades provocadas por priones. De nuevo, las secuencias que codifican para proteínas que conferirán protección contra patógenos de cerdo pueden estar dentro de la misma molécula de ácido nucleico que también codifica para las secuencias de TGEV y PRRSV o pueden estar presentes en la vacuna como una molécula de ácido nucleico separada. 40
Estas vacunas pueden administrarse según métodos utilizados conocidos en la técnica. Específicamente la vacuna puede administrarse mediante administración intramuscular, intravenosa, intranasal, intravaginal, buconasal o cualquier otro método común conocido en la técnica. 45
La vacuna puede ser una vacuna viva modificada o una vacuna inactivada (de organismos destruidos).
Las vacunas vivas modificadas (MLV) se producen a partir de un aislado de virus o bacterias. Los virus se atenúan, lo que significa que no pueden provocar enfermedad, pero aún pueden replicarse en las células huésped y por tanto estimular la inmunidad (PANLEY et al., 1989; PASTORET et al., 1997).
5
Las vacunas inactivadas (de organismos destruidos) se producen haciendo crecer los virus o las bacterias y posteriormente inactivando o destruyendo los organismos utilizando o bien calor o bien compuestos químicos. En vacunas inactivadas (de organismos destruidos), se añade un adyuvante a la fase antigénica de los organismos destruidos para apoyar la estimulación del sistema inmunitario, dado que el sistema 10 inmunitario no reconoce fácilmente virus o bacterias muertos en ausencia de un adyuvante. Además el adyuvante mantiene los organismos destruidos en el sitio de inyección y por tanto proporciona tiempo suficiente para que las células inmunitarias le respondan (PARLEY et al., 1989; PASTORET et al., 1997). Las vacunas inactivadas puede ser virus destruidos, bacterias destruidas (también conocidas como bacterinas), o 15 toxinas destruidas (o toxoides).
En una forma de realización preferida, la vacuna es una vacuna inactivada diluida con vacuna inactivada de circovirus porcino (PCV) de tipo1-tipo2 (FENAUX et al., 2003, 2004) que se adyuvó previamente con sulfolipo-ciclodextrina. En una forma de realización 20 preferida, se diluye la vacuna inactivada con vacuna inactivada de PCV de tipo1-tipo2 que se adyuvó previamente con sulfolipo-ciclodextrina al 20%. En una forma de realización especialmente preferida adicional, se diluye la vacuna inactivada 1:3 con la vacuna inactivada de circovirus porcino (PCV) de tipo1-tipo2.
25
La vacuna contiene preferentemente los ácidos nucleicos de TGEV/PRRSV en una concentración que produce un título viral vivo en el intervalo de aproximadamente 104 a 109, todavía más preferentemente de aproximadamente 105 a 108. El título viral vivo se determina como unidades formadoras de placa (ufp) en células ST.
30
Las vacunas de la presente invención permiten que un experto en la materia diagnostique si un animal está infectado con un virus de tipo natural o si ha sido vacunado. Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere por tanto a métodos para diagnosticar si un animal está infectado con un virus o si ha sido vacunado utilizando una vacuna de la presente invención, métodos que comprenden etapas, en los que el 35 diagnóstico utiliza anticuerpos específicos para proteínas del virus de tipo natural no expresadas por la cepa de vacuna (es decir, 3a, 3b, 7 o E). La diferenciación de los animales vacunados contra TGEV de los animales infectados con TGEV puede llevarse a cabo alternativamente utilizando RT-PCR y marcadores de secuencia introducidos en el genoma de TGEV recombinante en las posiciones 6752, 18997, 20460, y 21369, que 40 deben codificar para G, C, T y C, respectivamente.
La diferenciación entre animales vacunados y animales infectados con PRRSV de tipo natural puede llevarse a cabo utilizando anticuerpos específicos para proteínas no presentes en el virus recombinante. 45
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 representa los resultados de las mediciones de peso de cochinillos tras la inoculación in vivo con rTGEV que expresan Gp5 de PRRSV. Se inocularon los cochinillos con rTGEV que expresan Gp5 utilizando TRS3a (∆3-TRS3a-ORF5; símbolo 5 cuadrado) o TRS22N (∆3-TRS22N-ORF5; símbolo triangular). Se midió el peso de los cochinillos a 1, 2, 3 y 4 semanas tras la exposición a PRRSV. Los cochinillos vacunados con virus recombinante que expresa Gp5 de PRRSV aumentan de peso corporal eficazmente (es decir, se desarrollan normalmente), mientras que los cochinillos vacunados con un control (“C-”) muestran un desarrollo dañado con sólo 10 aumento mínimo de peso corporal.
La figura 2 representa los resultados de un ensayo ELISA que detecta anticuerpos específicos para N de PRRSV (ORF7). Se recogieron muestras de suero de cochinillos infectados con rTGEV que expresan Gp5 de PRRSV (o bien ∆3-TRS3a-ORF5 o bien 15 ∆3-TRS22N-ORF5) o cochinillos infectados con un vector de virus que no expresa ORF5 ni ORF6 (control no vacunado) a las 2, 3 y 4 semanas tras la exposición a PRRSV. No pudo detectarse ninguna o sólo cantidades minoritarias de anticuerpos frente a la proteína N de PRRSV en cochinillos vacunados tras la exposición de los cochinillos a PRRSV en comparación con el control no vacunado. 20
Por tanto, mientras que ∆3-TRS3a-ORF5 puede proporcionar protección completa frente a PRRSV, ∆3-TRS22N-ORF5 proporciona protección parcial frente a PRRSV. Por el contrario, los animales del grupo control no se protegieron frente a la infección por PRRSV. 25
La figura 3 representa los resultados del análisis por transferencia de tipo Northern de la estabilidad de los rTGEV que expresan Gp5 de PRRSV. Se sometieron a pases en cultivo tisular virus TGEV recombinantes que expresan Gp5 (utilizando o bien TRS3a o bien TRS22N). Se infectaron las células ST con el virus del pase 2 (p2) y 5 (p5). Tal 30 como se observa en la figura, el virus de p2 expresaba ARNm de Gp5, mientras que el virus de p5 contiene deleciones y no expresaba ARNm de Gp5.
La figura 4 representa la estructura esquemática del ADNc que codifica para el pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T). Tal como se muestra, se clonaron los 35 genes de PRRSV heterólogos ORF5 y ORF6 en el mismo vector viral de rTGEV.
La figura 5 representa la expresión de Gp5 (ORF5) de PRRSV en células ST infectadas con TGEV recombinante que expresa proteínas Gp5 y M de PRRSV (pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)) tal como se evaluaron mediante 40 análisis por inmunofluorescencia (se utilizaron anticuerpos específicos para la proteína N de TGEV para visualizar el virus (color rojo) y se utilizaron anticuerpos específicos para la proteína ORF5 (Gp5) de PRRSV para visualizar las células que expresan Gp5 (color verde)). Tras 20 pases en cultivo tisular (incluyendo las etapas de clonación), se recuperó el virus y se utilizó para la infección de células ST. Este análisis mostró que 45 el 80% de las células infectadas expresaba Gp5, y que el 100% de estas células eran positivas para la proteína M (no mostrado en el gráfico). Este gráfico también muestra que el constructo dicistrónico ha mejorado la estabilidad in vitro y es estable incluso tras 20 pases en cultivo.
La figura 6 representa los resultados de un análisis FACS de las células infectadas de la figura 5. Se utilizaron anticuerpos específicos para la proteína N de TGEV para detectar el virus recombinante, mientras que se visualizaron las células que expresan Gp5 utilizando un anticuerpo polivalente específico para Gp5. Los datos muestran 5 claramente que el 80% de las células infectadas con TGEV recombinante que expresa proteínas Gp5 y M de PRRSV (pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)) sometidas a pase 20 veces en cultivo tisular (incluyendo las etapas de clonación) expresan Gp5 de PRRSV. Esto demuestra de nuevo la estabilidad mejorada in vitro del rTGEV recombinante que expresa proteínas Gp5 y M de PRRSV. 10
La figura 7 representa los resultados en un análisis de RT-PCR de la estabilidad del TGEV recombinante que expresa ORF5 y ORF6 (M) tras someterse a pase en células ST. El TGEV recombinante se sometió a pase 20 veces en cultivo tisular. Se clonó en placa el virus recuperado de las células de cultivo y se determinó la expresión de 15 ARNm para seis clones (c1 a c6) mediante RT-PCR. Tal como se muestra en la figura, el 100% de los clones expresaron ARNm-ORF5 y ARNm-ORF6. Esto muestra que el genoma del TGEV recombinante que expresa ORF5 y ORF6 permanece estable tras 20 pases en cultivo celular.
20
La figura 8 representa los resultados de un análisis por inmunotransferencia de tipo Western para la detección de la expresión de proteína Gp5 de PRRSV (ORF5; transferencia de la izquierda) y proteína M (ORF6; transferencia de la derecha) en lisados celulares de células de testículo de cerdo infectadas con el virus recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T) (abreviado como rTGEV-SPTV-ORFs5+6 25 en la figura) o un virus control (rTGEV-SPTV-FL). Además, se utilizan varios controles en la inmunotransferencia de tipo Western (“simulado”: células de testículo de cerdo sin infección viral; “PRRSV”: virus PRRS purificado y concentrado de tipo natural; “MA104+PRRSV”: línea celular de riñón de mono verde africano infectada con virus PRRS de tipo natural). Pudo detectarse la proteína respectiva en lisados obtenidos de 30 células infectadas con el virus recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T), células infectadas con el virus PRRSV y células infectadas con MA104+PRSSV) tal como se indica mediante las flechas.
La figura 9 representa los resultados de un análisis del crecimiento de TGEV 35 recombinante que expresa Gp5 y M de PRRSV tras inoculación in vivo. El virus utilizado para este análisis contiene el gen S tal como se expone en SEC ID nº: 1 que proporciona tropismo intestinal y respiratorio. La figura representa la cinética de crecimiento del virus en células ST tras su recuperación del pulmón (símbolo circular) e intestino (símbolo cuadrado) de cochinillos vacunados. Se recogieron muestras de 40 tejido 1, 2, 3 y 4 días tras la inoculación con TGEV recombinante que expresa proteínas Gp5 y M de PRRSV.
La figura 10 representa los resultados de un análisis adicional de la estabilidad del TGEV recombinante que expresa Gp5 y M de PRRSV (pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-45 ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)) tras administración in vivo del virus recuperado de los cerdos. Se utilizaron anticuerpos en un ensayo de inmunofluorescencia para detectar células ST positivas para Gp5 de PRRSV (color verde en el panel superior), M de PRRSV (color verde en el panel inferior) y N de TGEV (color rojo) infectadas con virus recuperado del pulmón de cochinillos vacunados. Los resultados muestran que el rTGEV recombinante que expresa proteínas Gp5 y M de PRRSV es estable incluso tras inoculación in vivo y recuperación de animales vacunados. Los datos indican que el 80% de las células infectadas expresa proteína Gp5, y el 100% de las células infectadas también expresa proteína M. 5
La figura 11 representa el esquema seguido para la configuración de dos formulaciones de vacuna utilizando el virus recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T).
10
La figura 12 representa una tabla que representa los resultados de una evaluación de la replicación y propagación del virus recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T) en tejidos diana (pulmón) de cochinillos de dos días de edad inoculados con 2 x 107 ufp/ml por vía intranasal. Los resultados se obtuvieron mediante la titulación del virus e histopatología. 15
La figura 13 representa ejemplos de inmunohistoquímica realizados en secciones de tejido de pulmón obtenidas de cerdos del grupo #1 y #2, respectivamente, que muestran neumonía intersticial característica de la infección por coronavirus. Las secciones se caracterizan por el engrosamiento de las paredes alveolares debido a la 20 infiltración de linfocitos y macrófagos y espacios alveolares llenos de infiltración mononuclear (linfocitos y macrófagos) y ocasionalmente de neutrófilos polimorfonucleares.
La figura 14 representa los resultados del ELISA de competición utilizado para detectar 25 anticuerpos antigp5 específicos en animales vacunados con vacuna viva modificada en comparación con animales no vacunados.
Se utilizó la absorbancia en D0 PV para calcular el porcentaje de unión en cada suero utilizando un cálculo específico. Los menores porcentajes de unión representan 30 mayores niveles de anticuerpos antigp5 en los sueros sometidos a prueba. Las diferencias en los valores de absorbancia y el % de unión de los mismos entre los animales del grupo vacunado y los animales del grupo no vacunado son estadísticamente relevantes (prueba de la t: valor de p < 0,05).
35
La figura 15 muestra los resultados de un ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa específico (IPMA) realizado para la detección de PRRSV en macrófagos de pulmón alveolares porcinos infectados con las muestras de suero obtenidas de cerdos vacunados y control.
40
La figura 16 muestra los resultados de la detección de antígenos antiTGEV (imagen A) y antiPRSSV (imagen B) mediante ELISA indirecto presentados como absorbancia del sustrato cromogénico. “Vac.” designa sueros de animales vacunados, “Ctrl.” designa sueros de animales control no vacunados, “CP” y “CN” designa controles positivos y negativos, respectivamente. Los sueros de animales vacunados y control se diluyeron 45 60 veces.
La figura 17 representa el porcentaje de animales que presentan una respuesta inmunológica positiva contra TGEV y PRSSV utilizando una dilución de 1:60. El panel A es una tabla que resume los resultados, mientras que los gráficos muestran los porcentajes de animales positivos en forma gráfica (gráfica B para anticuerpo antiTGEV y gráfica C para anticuerpo antiPRRSV). “Vac.” designa sueros de animales vacunados, “Ctrl.” designa sueros de animales control no vacunados.
5
La figura 18 muestra los resultados del ELISA de competición utilizado para detectar anticuerpos antigp5 específicos en animales vacunados con vacuna inactivada en comparación con animales no vacunados. Se utilizó la absorbancia en D0 PV para calcular el porcentaje de unión en cada suero utilizando un cálculo específico. Los menores porcentajes de unión representan mayores niveles de anticuerpos antigp5 en 10 los sueros sometidos a prueba. Las diferencias en los valores de absorbancia y el % de unión de los mismos entre animales del grupo vacunado y animales del grupo no vacunado son estadísticamente relevantes (prueba de la t: valor de p < 0,05).
La figura 19 muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-15 PCR) utilizada para la cuantificación de los títulos de PRRSV en muestras de suero obtenidas de animales vacunados y no vacunados.
La figura 20 muestra la estructura esquemática del ADNc que codifica para una proteína de fusión ORF5-LIMP-II y su efecto sobre la presentación de antígenos por la 20 célula infectada.
La figura 21 muestra la estructura esquemática del ADNc que codifica para una proteína de fusión Ub-ORF5 y su efecto sobre la presentación de antígenos por la célula infectada. 25
La figura 22 muestra la construcción de TGEV recombinantes con proteínas S quiméricas. La figura representa las diferencias entre las regiones de la secuencia en 5’ de los genes S entre los aislados de TGEV parentales TGEV-PUR46-PTV y TGEV-PUR46-C11 (véase el recuadro superior en el lado izquierdo). Los nucleótidos 30 resaltados en la figura reflejan las diferencias entre estas dos secuencias, mientas que el recuadro vertical claro representa una deleción de tres nucleótidos. Las posiciones de los nucleótidos se indican por los números en la parte superior de las figuras. La figura representa además la secuencia de varios mutantes del gen S en comparación con la del aislado de TGEV parental TGEV-PUR46-PTV. En la figura también se indica 35 el título de cada virus recombinante in vivo en el intestino y en el pulmón de cochinillos recién nacidos infectados.
La figura 23 muestra la cinética de crecimiento de los TGEV parentales y el TGEV-PUR46-S7.1 recombinante. Se determinó el crecimiento de estos virus tras la 40 inoculación de cochinillos recién nacidos de tres días de edad con 3 x 108 ufp por cochinillo. Se sacrificaron los animales en los días indicados y se determinaron los títulos de virus por gramo de tejido mediante titulación en placa en células ST. (), virus en los pulmones; (•), virus en el intestino. Los valores indicados corresponden a valores medios de tres experimentos independientes. 45
Los ejemplos siguientes ilustran la construcción y la utilización de los ácidos nucleicos según la invención.
EJEMPLO 1
Crecimiento de células eucariotas
Se realizaron el crecimiento, la titulación y la purificación de TGEV en células ST 5 (testículo de cerdo), una línea celular obtenida a partir de células epiteliales de testículos de cerdo fetal (McCLURKIN y NORMAN, 1966). Se obtuvieron células ST de L. KEMENY (National Animal Disease Centre, Ames, Iowa, EE.UU.).
Se realizaron ensayos de transfección de plásmidos en células de riñón de hámster 10 neonato (BHK-21) transformadas de manera estable con el gen que codifica para la aminopeptidasa N porcina (BHK-pAPN) (LAUDE et al., 1990). Se cultivaron células ST en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10% (GIBCO-BRL), gentamicina 50 mg/ml, glutamina 2 mM y aminoácidos no esenciales al 1%. 15
Se hicieron crecer las BHK-21 transformadas de manera estable con el gen que codifica para la aminopeptidasa N porcina (BHK-pAPN) en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 2% (GIBCO-BRL), gentamicina 50 mg/ml, glutamina 2 mM y aminoácidos no esenciales al 1% 20 y geneticina (G418) (1,5 mg/ml) como agente de selección.
EJEMPLO 2
25
Transformación de bacterias mediante electroporación de plásmidos
Cepas bacterianas:
Escherichia coli DH10B (Gibco/BRL) (HANAHAN et al., 1991) fue el huésped para 30 todos los plásmidos construidos. El genotipo de esta cepa bacteriana es: F-mcr A ∆ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 endA1 araD139 (ara,leu) 7697 galU galK λ- rspL nupG.
Preparación de bacterias competentes para la electroporación: 35
Para la amplificación y producción de bacterias E. coli DH10B competentes para la electroporación, se hicieron crecer las bacterias en un medio SOB. Se inocularon 10 ml de medio SOB (triptona 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 0,5 g/l) con una colonia a partir de una placa nueva y se incubaron durante 12 h a 37ºC con agitación. Con 2 ml de 40 este cultivo, se inoculó 1 l de medio SOB, y se hizo crecer el cultivo a 37ºC hasta una densidad óptica de 600 nm entre 0,8 y 0,9 unidades de absorbancia. Entonces, se enfrió el cultivo en hielo durante 20 min., y se centrifugaron las bacterias en el rotor Sorvall GSA a 4.000 X g durante 15 min. a 4ºC. Se resuspendieron las bacterias en 1 l de glicerol al 10% frío. Se centrifugó de nuevo la suspensión de bacterias y se resuspendió en 500 ml de 45 glicerol al 10% frío. Se sedimentaron las bacterias y se resuspendieron en 250 ml de glicerol al 10% frío. Finalmente, se centrifugaron las bacterias y se resuspendieron en 3 ml de glicerol al 10%. Se dividió la suspensión final en alícuotas de 50 µl y 100 µl y se mantuvieron a -70ºC hasta que se utilizaron para su electroporación. Se calculó la eficacia de transformación de las bacterias mediante electroporación con una concentración conocida de un plásmido pBluescript como referencia, y se encontró que podía reproducirse a aproximadamente 109 colonias/µg de ADN.
Transformación de bacterias mediante electroporación de plásmidos: 5
Se mezclaron 50 µl de bacterias competentes para la transformación con 1 µl de cada mezcla de reacción, o se añadieron 10 ng de plásmido purificado a las bacterias y se incubaron en hielo durante 1 min. Entonces, se transfirió la mezcla a placas para electroporación de 0,2 cm (Bio-Rad) y se transformaron mediante un pulso eléctrico de 2,5 10 kV, 25 µF y 200 Ω en un electroporador “Gene Pulser” (Bio-Rad). Tras añadir 1 ml de medio LB frío, se incubaron las bacterias a 37ºC con agitación durante 1 h. Se sembraron entre 50 y 100 µl de la suspensión de bacterias transformadas en placas de Petri con LB (medio Luria-Bertani) en un medio sólido (agar 15 g/l) complementado con ampicilina (100 µg/ml) o cloranfenicol (34 µg/ml). Las bacterias crecieron durante 16 h a 37ºC (BULLOCK 15 et al., 1987).
Para la producción y purificación de plásmidos, se hicieron crecer las bacterias transformadas con plásmidos que conferían resistencia a ampicilina o cloranfenicol a partir de una colonia aislada en una placa en medio LB líquido complementado con 100 µg/ml 20 de ampicilina o 34 µg/ml de cloranfenicol.
EJEMPLO 3
25
Plásmidos para clonar productos de PCR
Se utilizó el plásmido pGEM-T (Promega) para clonar productos de PCR. Este plásmido contiene los promotores de los bacteriófagos T7 y SP6 separados por el gen LacZ, interrumpidos por dos secuencias de T protuberantes entre secuencias de clonación 30 múltiple. Este plásmido confiere resistencia a ampicilina para su selección.
EJEMPLO 4
35
Manipulación de ADN
Clonación y enzimas de restricción:
Para la manipulación y clonación de ADN, se adquirieron las enzimas de restricción 40 BamHI, Bbs I, Blp I, Eco RI, Mlu I, Swa I, Xcm I, Xho I de Roche o de New England Biolabs. Se realizó la desfosforilación de los extremos terminales de ADN con fosfatasa alcalina de camarón (SAP) (USB). Se utilizó una ADN ligasa tal como ADN ligasa de fago T4 (New England Biolabs). Se llevaron a cabo todos los tratamientos con enzimas de restricción, desfosforilación y ligación de ADN utilizando protocolos convencionales 45 descritos anteriormente (SAMBROOK et al., 1989).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
Para amplificar ADN a partir de un molde, frecuentemente plásmidos, se mezclaron 50-100 ng de plásmido de ADN con los correspondientes oligonucleótidos (10 µM), desoxinucleótidos trifosfato (ATP, GTP, TTP y CTP) 0,25 mM, MgCl2 1,25 mM, tampón 5 para PCR (Tris-HCl, 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM) y 2,5 U de ADN polimerasa Taq Gold (Thermus aquaticus) (Roche) en un volumen final de 50 µl. Se llevaron a cabo las reacciones en el termociclador GeneAmp PCR System 9600 de Perkin Elmer.
Separación de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa: 10
Para separar fragmentos de ADN, se utilizaron geles de agarosa al 1% con bromuro de etidio (1 µg/ml) en un tampón TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM).
Purificación de ADN: 15
Se purificaron los plásmidos bacterianos que se hicieron crecer en presencia de los antibióticos de selección utilizando o bien el “kit Qiaprep Spin Miniprep” (Qiagen) para preparar cantidades pequeñas de ADN de plásmido, o bien el sistema “kit Qiafilter Midi-Plasmid” (Qiagen) para preparar cantidades medias de ADN de plásmido. Se purificó el 20 ADN obtenido a partir de geles de agarosa utilizando el sistema “kit de extracción en gel QiaEx II” (Qiagen). Se llevó a cabo la purificación de los productos de PCR por medio del sistema “kit de purificación de PCR QIA quick” (Qiagen). En todos los casos, se siguieron las instrucciones del fabricante.
25
EJEMPLO 5
Análisis de ARN
30
Para el análisis del ARN producido en infecciones con el clon de TGEV PUR46-MAD, se infectaron monocapas confluentes de células ST (testículo de cerdo) que se hicieron crecer en placas de cultivo de 60 mm de diámetro (NUNC) con inóculos virales a una MOI [multiplicidad de infección] de 1. Se lisaron las células a 16 hpi [horas tras la infección] utilizando un “kit RNeasy Mini” (Qiagen), siguiendo el protocolo proporcionado 35 por el fabricante (Qiagen). Se purificó el ARN y se resuspendió en 40 µl de agua tratada con DEPC [pirocarbonato de dietilo] y 20 U de inhibidor de ARNasa (Roche).
EJEMPLO 6 40
Transfección y recuperación de TGEV infeccioso a partir de clones de ADNc
Se hicieron crecer células BHK-pAPN (DELMAS, 1994) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 2% 45 y que contenía geneticina (G418) (1,5 mg/ml) como agente de selección. Se hicieron crecer células BHK-pAPN hasta una confluencia del 60% en placas de 35 mm de diámetro y se transfectaron con 10 µg o 4 µg de plásmido pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T) con 15 µl o 12 µl de lipofectina (GIBCO Life Technologies) o lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las especificaciones del fabricante. Se incubaron las células a 37ºC, CO2 al 5% y tras 6 h se reemplazó el medio de transfección por DMEM nuevo que contenía FCS al 5% (vol/vol). Dos días después (denominado pase 0), se recogieron los sobrenadantes celulares y se pasaron cuatro veces en monocapa de ST nueva para aumentar el título de rTGEV. Se determinaron los títulos de virus mediante titulación en 5 placa.
Alternativamente, se hicieron crecer células ST en frascos de cultivo de 25 cm2 utilizando DMEM (medio esencial mínimo de Dulbecco), FCS al 10% a una confluencia del 90% y se infectaron a una MOI [multiplicidad de infección] de 1 unidad formadora de 10 placas [ufp] por célula. Se recuperó el sobrenadante tras 48 horas y se tituló mediante dilución límite en placa.
Titulación en placa: 15
Se realizó la titulación de disoluciones madre virales mediante el ensayo de dilución límite en placa en células ST para cuantificar el número de partículas infectivas. Se hicieron crecer células ST en una placa de cultivo de 24 pocillos múltiples a una confluencia del 90%. Se diluyeron en serie virus TGEV recombinantes 10 veces (10E-1, 20 10E-2, 10E-3; 10E-4, 16E-5, 10E-6, etc.). Se añadieron las diferentes diluciones de virus a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incubaron durante 1 hora a 37ºC, CO2 al 5%. Tras esa hora, se retiró el sobrenadante que contenía el virus de la monocapa de ST y rápidamente se añadió un agar de recubrimiento sobre la monocapa. Se preparó el agar de recubrimiento utilizando 1 parte de DMEM 2X (medio esencial mínimo de Dulbecco) y 1 25 parte de agar purificado al 1% en ddH2O. Tras recubrir las células, se mantuvo la placa de múltiples pocillos durante 15 minutos a temperatura ambiente para solidificar la agarosa y entonces se colocó en un incubador controlado durante 48 horas a 37ºC, CO2 al 5%.
Con el fin de contar las placas virales, se fijaron las monocapas de células ST 30 infectadas con formol al 10% y se tiñeron con violeta cristal, al 0,1%, durante 30 minutos. Se lavó el pocillo con agua destilada y se secó a temperatura ambiente antes de contar finalmente las placas para determinar el título de virus.
Se analizó la expresión de proteínas de TGEV y PRRSV mediante técnicas de 35 inmunofluorescencia convencionales.
EJEMPLO 7
40
Generación de rTGEV
El virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV) utilizado en la presente memoria pertenece al grupo de aislados de Purdue y se obtuvo en Indiana en 1946 (DOYLE y HUTCHINGS, 1946). Se adaptó el virus para que creciera en cultivos celulares 45 (HAELTERMAN y PENSAERT, 1967) y se proporcionó por E.H. BOHL (Ohio State University, Wooster Ohio). Se ha pasado este aislado de TGEV en células ST 115 veces, y se ha clonado cinco veces consecutivamente en el laboratorio del Dr. Luis Enjuanes (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, España). Se marcó el clon seleccionado PUR46-CC120-MAD, abreviado PUR46-MAD. Es un virus atenuado que crece bien en cultivos celulares, y alcanza títulos entre 108 y 109 UFP/ml.
Se generaron virus rTGEV a partir de constructos de pBAC-TGEV que contenían el gen S de la cepa de TGEV virulenta PUR-C11 (SC11) tal como se describió (ALAMAZAN et 5 al., 2000; GONZALEZ et al., 2002). Se derivaron los virus que contenían el gen S (que codifica para la proteína de espiga de TGEV) de la cepa atenuada PTV (SPTV) a partir de los vectores pBAC-TGEV correspondientes portadores de SC11 reemplazando este gen por SPTV de la cepa respiratoria.
10
EJEMPLO 8
Construcción de un vector de TGEV recombinante que expresa
la proteína Gp5 y M de PRRSV 15
Con el fin de aumentar la capacidad de clonación del genoma individual de TGEV, se eliminaron los genes no esenciales ORF3a y ORF3b del clon de ADNc de longitud completa, creándose una deleción en el genoma de TGEV. Se insertaron los genes heterólogos ORF5 y ORF6 que codificaban para las proteínas Gp5 y M de PRRSV en el 20 constructo de ADNc reemplazando los ORF 3a y 3b de TGEV delecionados.
Se clonó el ORF5 (606 nt) (SEC ID nº: 2) en constructos de ADNc reemplazando los genes 3a y 3b de TGEV. Se amplificó el gen mediante PCR utilizando los oligonucleótidos PpuMI-ORF5 VS (5’-AACAGGTCCTACCA-TGAGATGTTCT-25 CACAAATTGGGG-3’) (SEC ID nº: 4) y Blp-ORF5 RS mut (5’-CCGCTAAGCCTAGGCTTCCCATTGCT-CAGCCGAAGTCC-3’) (SEC ID nº: 5). Se digirió el producto de PCR con PpuMI y BlpI y se clonó en los mismos sitios de restricción del plásmido pSL-TGEV-AvrII, que comprende los nt 22965 a 25865 del genoma de TGEV incluyendo la deleción de 3a y 3b, generando el plásmido pSL-AvrII-∆3-PpuMI-ORF5. Para 30 obtener los ADNc infecciosos, se digirió este plásmido con AvrII y se clonó el inserto que contenía ORF5 en el mismo sitio de restricción de pBAC-SC11 o pBAC-SPTV(PacI/MluI) para obtener vectores con tropismo intestinal y respiratorio, respectivamente. Se han notificado anteriormente las secuencias de plásmidos pBAC y del clon de ADNc de TGEV infeccioso (documento WO01/39797). 35
Se amplificó ORF6 procedente de la cepa Olot91 de PRRSV (SEC ID nº: 3) mediante PCR de solapamiento para introducir una mutación silenciosa eliminando un sitio de restricción AvrII debido a restricciones de clonación, teniendo en cuenta la utilización del codón de Sus scrofa. En una primera PCR, se utilizaron los oligonucleótidos BlpIORF6 40 VS (5’-CGGCTGAGCAATGGGAAGCCTAGAAAATTAT-TACATATGG-TATAACTAAACAAAATGGGAAGCCTAGACGATTTTTG-3’) (SEC ID nº:6), siendo la secuencia subrayada el TRS22N, y ORF6-C306T-RS (5’-GCCGGCCTAGACAACACAATC-3’) (SEC ID nº: 7). Utilizando un procedimiento similar, en una segunda PCR se utilizaron los oligonucleótidos ORF6-C306T-VS (5’-GATTGTGTTGTCTAGGCCGGC-3’) (SEC ID nº: 45 8) y BlpIORF6rs nuevo (5’-GCTAAGCTTACCGGCCATACTTGACGAGG-3’) (SEC ID nº: 9). Utilizando estos productos de PCR y los oligonucleótidos BlpIORF6 VS y BlpIORF6rs nuevo, se obtuvo el producto final (574 nt). Se digirió este producto de PCR con BlpI y se clonó en el mismo sitio de restricción de pSL-AvrII-∆3-PpuMI-ORF5, generando el plásmido pSL-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T). Para obtener el pBAC-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T) de ADNc infeccioso, se digirió el plásmido pSL-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T) con AvrII y se clonó el inserto que contenía ORF5 y ORF6 en los mismos sitios de restricción de pBAC-SPTV(PacI/MluI) (figura 4). Se utilizó el mismo procedimiento de clonación para obtener el ADNc que codificaba para el TGEV con tropismo intestinal 5 (adaptado para crecer en cultivo celular) que expresaba Gp5 y M de PRRSV.
Se rescató el virus recombinante con tropismo respiratorio, rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T), y se clonó en placa tres veces. Se confirmó la presencia de los ARNm para ORF5 y ORF6 mediante RT-PCR. Se seleccionó un clon de expresión y, tras 10 dos pases en cultivo celular, se detectó el ARNm de ORF5 y ORF6, respectivamente, indicando que el virus era estable. No obstante, para mejorar los niveles de expresión adaptando el virus recombinante para que crezca en células ST, se realizaron dos etapas más de clonación en placa. Se evaluó la expresión de Gp5 por los clones virales mediante inmunofluorescencia (véase la figura 5) y se cuantificó la cantidad de células infectadas 15 que expresaban Gp5. El virus seleccionado (rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)) expresaba altas cantidades de Gp5 en el 80% de las células de testículo de cerdo (ST) infectadas tal como se evaluó mediante citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS).
20
EJEMPLO 9
Estudios in vitro para caracterizar el virus de
TGEV rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T) 25
Para caracterizar el virus de TGEV recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T), se realizaron ensayos de inmunofluorescencia y análisis de inmunotransferencia de tipo Western con el fin de detectar la expresión de las diferentes proteínas gp5 y M de PRRSV por el vector viral. 30
Ensayos de inmunofluorescencia
Se hicieron crecer células ST hasta una confluencia del 30% en cámaras de 8 ó 12 pocillos. Se infectaron las células a una MOI de 5 ufp/célula a 37ºC en MEME (medio 35 esencial mínimo de Earle) que contenía suero FetalClone III al 2% (adquirido de Hyclone). Ocho horas tras la infección, se extrajo el inóculo y entonces se lavaron las células con PBS y se fijaron mediante adición de paraformaldehído al 4% durante 30 min. a TA. Para un doble marcaje en el que un anticuerpo primario se derivó de ratón y el otro de conejo, se combinaron los anticuerpos primarios en un diluyente que contenía PBS-SFB al 40 20%/saponina al 0,2%. Se permitió que los anticuerpos se adsorbieran durante 90 min. a TA y entonces se lavaron las células tres veces con PBS. Después, se incubaron las células durante 30 min. a temperatura ambiente con una dilución 1:1.000 de anticuerpos secundarios antirratón y anticonejo conjugados con rodamina y fluoresceína. Se lavaron las cámaras de la placa cinco veces con PBS, se montaron y se analizaron mediante 45 microscopía de fluorescencia.
Análisis por inmunotransferencia de tipo Western
Se hicieron crecer células ST hasta una confluencia del 100% en frascos de cultivo tisular de 12,5 cm2. Se infectaron las células a una MOI de 5 a 37ºC en MEME (medio esencial mínimo de Earle) que contenía suero FetalClone III al 2% (Hyclone) durante 8 5 horas. Se rompieron las células con tampón de carga de muestra 1 X. Se analizaron los lisados celulares mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida con un gradiente del 12,5% (SDS-PAGE). Se transfirieron las proteínas separadas sobre una membrana de PDVF utilizando SDS al 0,02% (100 V; límite de amp. 0,30; tiempo 1:30 horas). Tras la transferencia, se bloquearon las membranas de PDVF con PBS:leche al 10 5% durante 2 horas a TA y entonces se incubaron durante la noche a 4ºC con una dilución 1:100 de anticuerpo policlonal específico para la proteína Gp5 de PRRSV (8676) o una dilución 1:50 de un anticuerpo policlonal específico para la proteína M de PRRSV (7718). Tras esta incubación, se lavaron las membranas de PDVF tres veces con PBS:leche al 5%:Tween-20 al 0,05%. Entonces se incubaron las membranas de PDVF con anticuerpo 15 de cabra anticonejo conjugado con peroxidasa durante 1 hora y se lavaron después cinco veces con PBS:leche al 5%:Tween-20 al 0,05%. Se detectaron los anticuerpos unidos con sustrato para HRP quimioluminiscente de tipo Western Inmobilon (Millipore). Los resultados se muestran en la figura 8.
20
Se detectaron proteínas gp5 y M de PRRSV en lisados obtenidos a partir de células ST infectadas con el virus recombinante o células MA104 infectadas con virus de tipo natural de PRRS. También se utilizaron las células MA104 como control, porque este sistema está más relacionado con el modelo de infección en cultivo celular, es decir células ST infectadas con virus rTGEV-ORF5-ORF6. 25
El virus TGEV recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORS5-TRS22N-ORF6(C306T) es estable tras haberse pasado 20 veces en cultivo tisular y también tras el rescate de cochinillos infectados (véanse las figuras 5 y 6). Tras 20 pases en cultivo tisular, el virus todavía expresa los genes ORF5 y ORF6 de PRRSV (véase la figura 7). 30
EJEMPLO 10
Producción de una vacuna viva modificada (MLV) 35
Partiendo de un virus de semilla maestra de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6, se produjo la vacuna viva modificada que contenía el sobrenadante de células de testículo de cerdo (ST) infectadas con el rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 recombinante que expresaba las proteínas gp5 y M de PRRSV recombinantes como se 40 expone a continuación (véase también la figura 11):
se obtuvo el virus rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 a partir de la infección de diez placas de cultivo de 100 cm2 de células ST con el virus de semilla maestra a una alta MOI [multiplicidad de infección] de 1. Se recuperaron los sobrenadantes, se 45 centrifugaron y se congelaron a -80ºC (± 10ºC). Se tituló el virus recombinante obtenido. Se ha diluido 1:10 el virus recombinante obtenido a partir de los sobrenadantes con medio de cultivo DMEM hasta obtener una dosis final de ∼1 X 107 UFP/ml.
Se ha evaluado esta formulación de vacuna designada MLV en experimentos in vivo adicionales (véanse los ejemplos 12 y 13).
5
EJEMPLO 11
Producción de una vacuna inactivada (de organismos destruidos)
Se produjo la vacuna inactivada que contenía extractos de células de testículo de 10 cerdo (ST) lisadas infectadas con el rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 recombinante que expresaba las proteínas gp5 y M de PRRSV recombinantes como se expone a continuación (véase también la figura 11):
se obtuvo el antígeno de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 a partir de la 15 infección de diez placas de cultivo de 100 cm2 de células ST con el virus de semilla maestra a una alta MOI [multiplicidad de infección] de 3. Se recuperaron las células, se lavaron con tampón fosfato de sodio (PBS) y se sedimentaron. Se congeló el sedimento celular a -80ºC (± 10ºC). Considerando que aproximadamente el 70% de las células ST infectadas están produciendo proteínas recombinantes gp5 y M, se 20 resuspendió el sedimento en bicarbonato de sodio, pH 8,3, a una concentración de 3,9 X 106 células productoras infectadas/ml. Se lisaron las células y se centrifugó el extracto celular 30 min. a 15000 X g y 4ºC.
Se inactivaron los sobrenadantes mediante etilenimina binaria (BEI) a una 25 concentración final del 5% durante 72 h con agitación continua a 37ºC.
Se diluyó 1:3 el antígeno inactivado con vacuna inactivada de circovirus porcino (PCV) de tipo1-tipo2 (FENAUX et al., 2003; FENAUX et al., 2004) adyuvada previamente con sulfolipo al 20%-ciclodextrina (SLCD; obtenido de Fort Dodge, Iowa, EE.UU.) tal como 30 se expone a continuación: se mezclaron 32 ml de antígeno inactivado de ST-rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 con 3,7 X 106 células productoras infectadas/ml con 64 ml de vacuna de PCV de tipo1-tipo2. Se agitó la mezcla durante 3,25 h a TA.
Se ha evaluado esta formulación (inactivada) de vacuna en un experimento in vivo 35 (véase el ejemplo 14).
EJEMPLO 12
40
Evaluación de la patogenicidad in vivo en cochinillos del virus recombinante
rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 que expresa dos proteínas
de PRRSV heterólogas
Se realizó esta evaluación para evaluar la replicación y propagación de rTGEV-45 SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 en tejidos diana (intestino y pulmón) in vivo mediante titulación de virus y mediante inmunohistoquímica así como se evaluó la expresión de las proteínas de PRRSV heterólogas (Gp5 y M) y el genoma de TGEV en estos tejidos mediante inmunohistoquímica. Se realizó adicionalmente la evaluación para confirmar que rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 se replica en pulmones de cochinillos de dos días de edad inoculados con 2 X 107 ufp/ml por vía intranasal. También se evalúan los títulos de virus en lesiones histopatológicas y de pulmón.
Se seleccionaron 17 cochinillos de dos días de edad, híbridos de Large White y 5 Landrace belga, libres de anticuerpos frente a TGEV y PRRSV, y se dividieron en tres grupos. Se inocularon los cerdos del grupo #1 (7 animales) con 2 X 107 ufp/ml del virus control rTGEV-SPTV-FL, se inocularon los cerdos del grupo n.º 2 (7 animales) con 2 X 107 ufp/ml del virus recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6, mientras que los cerdos del grupo # 3 (3 animales) representan el grupo control. 10
Tras la inoculación en el día 0, se sacrificaron los animales de cada grupo y se realizó la autopsia tal como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1 15
Grupo
Número de cerdos D0 + 1d D0 + 2d D0 + 3d Do + 4d
#1
7 1 2 2 2
#2
7 1 2 2 2
#3
3 -- -- -- 3
En los días 1, 2, 3 y 4 tras la inoculación, se han sacrificado los cerdos de los grupos #1 y #2, mientras que se han sacrificado los cerdos del grupo #3 sólo en el día 4 20 tras la inoculación.
Tras la autopsia, se examinaron macroscópicamente secciones de pulmón. Se describieron el tipo y la magnitud de las lesiones de pulmón y se evaluaron siguiendo el sistema de puntuación descrito por HANNAN et al., 1982. La denominada puntuación de 25 neumonía de las lesiones de pulmón se presenta en la figura 12.
Se homogenizaron muestras de tejido de los pulmones de estos animales con PBS con el fin de determinar el título del virus recombinante en el tejido diana (pulmón). Se titularon los virus recuperados de los tejidos de pulmón en monocapas de células ST como 30 unidades formadoras de placas (ufp/ml).
También se colocaron muestras de tejido en formaldehído (formalina tamponada al 10%) para estudios histopatológicos. Se distribuyeron muestras de tejido de 2-3 mm en casetes de plástico, se deshidrataron en series de alcohol graduado y se incrustaron en 35 parafina utilizando un sistema de procesador de tejidos automático (Cytadel). Se prepararon bloques de tejido y se cortaron secciones de 4-5 µm de estos bloques utilizando un microtomo automático (Finesse). Se tiñeron las secciones con hematoxilina-eosina utilizando un equipo de tinción automático (Linistain GLX).
40
Se tomaron secciones incrustadas en parafina adicionales en portaobjetos silanizados y se prepararon para una técnica de inmunohistoquímica (IHC) para detectar antígenos de TGEV y PRRSV expresados por el virus recombinante. Se calentaron las secciones hasta 60ºC durante 10 minutos hasta que se funde la parafina. Entonces se sumergieron las muestras dos veces en xilol durante 10 minutos y dos veces en etanol absoluto durante 10 minutos. Tras sumergir las muestras en una disolución para la inhibición de peroxidasa endógena (metanol + peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3% (v/v)) durante 30 minutos en la oscuridad, se lavaron las muestras tres veces en tampón Tris-solución salina (TBS) (0,05 M), antes de sumergir las muestras durante 15 minutos en una 5 disolución de citrato de sodio calentada previamente en el horno de microondas, seguido por lavado de las muestras tres veces en tampón Tris-solución salina (TBS) (0,05 M). Después, se sumergieron las muestras en disolución de TBS (0,05 M)-BSA durante 10 minutos para bloquear la unión no específica. Antes de añadir el anticuerpo primario, se añadieron dos gotas de disolución de avidina (Vector Laboratories, kit de bloqueo) a las 10 muestras seguido por incubación durante 15 minutos, seguido por la adición de dos gotas de disolución de biotina (Vector Laboratories, kit de bloqueo) e incubación durante 15 minutos. Entonces se sumergieron las muestras en la disolución de anticuerpo primario anticuerpo monoclonal 3BB3 frente a la proteína M de TGEV (dilución 1/100) y se incubaron durante la noche a 4ºC. Se lavaron las muestras tres veces en tampón Tris-15 solución salina (TBS) (0,05 M) y entonces se sumergieron durante 1 hora en la disolución de anticuerpo secundario IgG antirratón (Vector Laboratories, kit Vectastain ABC) (dilución 1/100). Tras lavar las muestras tres veces en tampón Tris-solución salina (TBS) (0,05 M), se sumergieron en disolución de avidina-biotina-peroxidasa (Vector Laboratories, kit Vectastain ABC) durante 1 hora, de nuevo seguido por 3 lavados en tampón Tris-solución 20 salina (TBS) (0,05 M). Tras sumergir las muestras en disolución de DAB (3,3’-diaminobencidina, SIGMA) durante 7 minutos, lavar las muestras tres veces en tampón Tris-solución salina (TBS) (0,05 M), se sumergieron en H2O destilada durante 10 minutos. Entonces se tiñeron las muestras con hematoxilina durante 1-2 minutos, se sumergieron en H2O destilada durante 10 minutos, se sumergieron en etanol al 96% durante 5 minutos, 25 se sumergieron en etanol al 100% durante 5 minutos y finalmente se sumergieron en xilol durante 5 minutos. Antes de evaluar las muestras con un microscopio óptico, se prepararon las muestras con medio de montaje hidrófobo y cubreobjetos.
La detección de la proteína S del vector de TGEV en las muestras de cerdos de los 30 grupos #1 y #2 tal como se confirmó mediante inmunohistoquímica muestra que el virus recombinante se replica en el pulmón de los cerdos tras la vacunación por vía intranasal (véase la figura 12). Los títulos de virus detectados en las muestras de pulmón y lesiones histopatológicas encontradas en las secciones de tejido confirman estos resultados. La neumonía intersticial detectada mediante examen histopatológico puede estar asociada 35 con la infección viral y es una lesión característica de una infección por coronavirus (ejemplos de inmunohistoquímica de secciones de tejido de un cerdo del grupo #1 y #2 se representan en la figura 13).
La detección simultánea del antígeno de TGEV mediante inmunohistoquímica y 40 altos títulos de virus recombinante mediante titulación de virus confirma la replicación del virus recombinante en el pulmón.
Además, debido a la estabilidad mejorada del virus TGEV recombinante puede recuperarse de tejidos de pulmón e intestino de cochinillos vacunados. El virus rescatado 45 de estos tejidos puede propagarse adicionalmente en cultivos de células ST (véase la figura 9) y las células ST infectadas con el virus rescatado expresan tanto Gp5 (aproximadamente el 80% de las células infectadas) y M (aproximadamente el 100% de las células infectadas; véase la figura 10).
EJEMPLO 13
Evaluación de la eficacia de la vacuna viva modificada de rTGEV-SPTV-TRS3a-
ORF5-TRS22N-ORF6 en cerdos contra la exposición a la cepa Olot/91
de PRRSV de aislado de campo 5
Se realizó esta evaluación para evaluar la eficacia del rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 que expresaba diferentes proteínas de PRRSV heterólogas como vacuna viva modificada (MLV) en la prevención de enfermedad respiratoria y reproductiva en cochinillos de una semana de edad inoculados por vía intranasal y entonces expuestos a 10 la cepa Olot/91 de PRRSV de aislado de campo. Se evaluó la eficacia de la vacuna mediante la producción de anticuerpos en suero (se valoró mediante ELISA, IPMA y neutralización en suero).
Se seleccionaron 39 cochinillos de una semana de edad, seronegativos o con 15 bajos títulos de anticuerpo con respecto a TGEV y PRRSV, y se dividieron en tres grupos. Se vacunaron los cerdos del grupo #1 (17 animales) con el virus control rTGEV-SPTV-FL, se vacunaron los cerdos del grupo #2 (17 animales) con el virus recombinante rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6, mientras que los cerdos del grupo #3 (5 animales) representan el grupo control. 20
Se realizó la vacunación de los cerdos siguiendo el diseño experimental mostrado en la tabla 2, representando “D0” el primer día de vacunación de los cerdos de una semana de edad.
25
Tabla 2
Grupo
Número de cerdos 1ª vacunación (D0) 2ª vacunación (D0+3s) Exposición (D0+6s)
#1
15 rTGEV-SPTV-FL rTGEV-SPTV-FL PRRSV
#2
15 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 PRRSV
#3
5 --- --- ---
Se vacunan los cerdos con 0,5 ml de suspensión viral en cada orificio nasal para 30 obtener un volumen total de 1 ml/cochinillo en cada vacunación por vía intranasal dos veces, teniendo lugar la primera vacunación a una semana de edad y teniendo lugar la segunda vacunación (revacunación) a las 4 semanas de edad. Se eligió la vía intranasal con el fin de potenciar la replicación y propagación en los tejidos diana (pulmón) del virus recombinante en los cerdos inoculados. Se asignaron aleatoriamente los cerdos a cada 35 grupo de tratamiento. Se expusieron todos los cerdos diez semanas tras la primera vacunación, teniendo los cerdos 11 semanas de edad en el momento de la exposición. Se inocularon los cerdos con la cepa española de PRRSV (Olot/91) a 104,7-104,8 TCID50/cerdo por vía intranasal. Se llevó a cabo la inoculación en posición erguida sin sedación y utilizando una jeringuilla de 10 ml. Se dividió el inóculo en dos partes iguales, una para 40 cada orificio nasal. Se seleccionó la vía intranasal, porque se considera que es la vía natural de infección.
Tras la vacunación y tras la exposición, se observaron los cerdos diariamente para detectar signos clínicos para comprobar la seguridad de la vacuna. Tras la observación de cualquier anomalía, se llevó a cabo un examen clínico completo por el investigador principal. 5
Se extrajeron muestras de sangre en los D0, D21 y D28 PI en tubos para obtener suero para la determinación de títulos serológicos y para estudiar la respuesta inmunitaria frente a TGEV y PRRSV.
10
Se evaluó el efecto de la exposición a PRRSV midiendo la presencia de anticuerpos antigp5 específicos utilizando el ELISA de competición INGEZIM PRRS gp5 Compac (INGENASA). Utilizando un sustrato cromógeno, se detectó la presencia de anticuerpos antigp5 específicos en sueros de animales control y vacunados extraídos en los días D0 PV (tras la vacunación), D0 PI, D14 PI y D28 PI (figura 14). Se utilizó la 15 absorbancia en el D0 PV (cuando no ha tenido lugar ninguna competición) para calcular el porcentaje de unión en cada uno de los sueros tal como sigue:
100 x PV D de suero de aabsorbanciDx de suero en aabsorbanciunión de %0=
20
Los porcentajes de unión inferiores representan niveles superiores de anticuerpos antigp5 en los sueros sometidos a prueba. Tal como puede observarse en la figura 14, los animales vacunados desarrollaron títulos de anticuerpo antigp5 superiores y una respuesta de anticuerpos más rápida a los 14 días tras la exposición que los animales control no vacunados. 25
Se realizó un ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa específico (IPMA) esencialmente tal como se describe en WENSVOORT et al. (1986) para la detección de PRRSV en macrófagos de pulmón alveolares porcinos infectados con las muestras de suero obtenidas a partir de diferentes cerdos incluidos en este ejemplo. La única 30 diferencia con el método descrito por WENSVOORT et al. (1986) es la utilización de proteína-A conjugada con peroxidasa del rábano como anticuerpo secundario en lugar de una inmunoglobulina de oveja anticerdo conjugada con peroxidasa del rábano. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 14.
35
Tal como puede observarse a partir de la figura 15, la mayoría de los cerdos fueron seropositivos con respecto a PRRSV en el D28 PI. Sin embargo, en el grupo de animales vacunados con la MLV 5 de los 16 animales (que correspondían al 31%) fueron seropositivos con respecto a PRRSV incluso en el D14 PI, mientras que ninguno de los animales control vacunados con rTGEV-SPTV-FL fue seropositivo en el D14 PI, lo que 40 indicaba una respuesta de anticuerpos más rápida contra PRRSV en los animales vacunados.
EJEMPLO 14
Evaluación de la eficacia de una vacuna de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 destruido en cerdos contra la exposición a la cepa Olot/91
de PRRSV de aislado de campo 5
Se realizó esta evaluación para evaluar la eficacia de la vacuna de subunidades inactivadas (vacuna de organismos destruidos) derivada de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 que expresaba diferentes proteínas de PRRSV heterólogas. Se utilizó la vacuna inactivada para la prevención o reducción del síndrome reproductivo y respiratorio 10 porcino (PRRS) en cochinillos inoculados con la vacuna de subunidades por vía intramuscular (IM) expuestos a la cepa Olot/91 de PRRSV de aislado de campo. Se evaluó la eficacia de la vacuna mediante la prevención de neumonía intersticial, viremia y también mediante la capacidad de inducir anticuerpos en suero (evaluado mediante ELISA, ensayo de seroneutralización (SN), etc.). 15
Se produjo la vacuna de subunidades inactivadas derivada de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 que expresa las proteínas gp5 y M de PRRSV utilizada para este estudio de eficacia tal como se describe en el ejemplo 11.
20
Vacunación
Se seleccionaron 27 cerdos de seis a siete semanas de edad y se dividieron en dos grupos. Se vacunaron los cerdos del grupo #1 (14 animales) dos veces (a las 6-7 semanas de edad y 3 semanas más tarde) con la vacuna con PCV inactivada de PRRSV 25 (3 ml por vía IM), mientras que se mantuvieron los cerdos del grupo #2 (13 animales) como cerdos control no vacunados.
Tras la vacunación, se observaron los cerdos diariamente para detectar signos clínicos para comprobar la seguridad de la vacuna. Tras la observación de cualquier 30 anomalía, se llevó a cabo un examen clínico completo por el investigador principal.
Para los estudios de serología, se extrajeron adicionalmente muestras de sangre en los D0, D21 y D49 tras la vacunación (PV) y se utilizaron los sueros obtenidos a partir de estas muestras para realizar análisis serológicos con respecto a PRRSV, TGEV y 35 PCV2 (véase a continuación).
Se analizó la respuesta humoral inducida por la vacuna de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 mediante ELISA indirecto para PRRSV que detectaba anticuerpos tanto antigp5 como antiM utilizando PRRSV concentrado mediante ultracentrifugación 40 como antígeno de recubrimiento (imagen B en la figura 16 e imagen C en 17).
Se incubó el antígeno diluido de PRRSV durante la noche a 5 ± 3ºC. Tras lavar, se bloqueó la superficie vacía de los pocillos con PBS, fracción V de BSA al 5% y se incubó 1 h a 3,7 ± 1ºC. Se diluyeron los sueros de animales control y vacunados en los D0, D21 y 45 D42 PV así como los controles positivos y negativos para PRRSV en PBS, Tween-20 al 0,05% y se incubaron a 37 ± 1ºC durante 1 h. Tras lavar, se incubó la proteína A conjugada con peroxidasa diluida en PBS, Tween-20 al 0,05% (1:1000) a 37 ± 1ºC durante 1 h. Tras un lavado final, se añadió el sustrato cromógeno (o-fenilendiamina (OPD)) a los pocillos. Se detuvo la reacción añadiendo H2SO4 3 N. Se leyeron las placas con un lector de microplacas de ELISA utilizando un filtro de 450 nm.
Se analizó la respuesta humoral frente al vector de TGEV inducida por la vacuna de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 de la misma manera que se describió 5 anteriormente para el ELISA indirecto para PRRSV utilizando TGEV concentrado mediante ultracentrifugación como antígeno de recubrimiento en lugar de PRRSV (imagen A en la figura 16 e imagen B en 17).
Con el fin de evaluar la respuesta humoral provocada contra la vacuna de 10 circovirus porcino (PCV) de tipo1-tipo2 incluida en la vacuna inactivada de rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6, se analizó la presencia de anticuerpos antiPCV2 de ORF2 en los D0 PV, D49 PV y D0 PI (D63 PV) mediante IPMA (véase anteriormente). Esta técnica inmunológica cuantifica los anticuerpos frente a la proteína de la cápsida de PCV2 (producto de ORF2) presente en células Sf9 infectadas con el baculovirus recombinante 15 BAC-ORF2 PCV2.
Se infectaron las células Sf9 con el baculovirus recombinante Bac-ORF2 PCV2 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1. Se hicieron crecer las células infectadas a 27 ± 0,5ºC durante 4 días y entonces se fijaron. Se diluyeron los sueros de animales control y 20 vacunados en PBS, Tween-80 al 0,05% y se incubaron a 37 ± 1ºC durante 1 h. Tras lavar, se incubó la proteína A conjugada con peroxidasa diluida en PBS, Tween-20 al 0,05% (1:1000) a 37 ± 1ºC durante 1 h. Tras un lavado final, se añadió el sustrato cromógeno (3-amino-9-etilcarbazol) a los pocillos. Se detuvo la reacción mediante dos lavados con PBS. La reacción era positiva cuando el citoplasma de las células infectadas mostraba una 25 tinción roja. El título de anticuerpos corresponde a la inversa de la dilución más alta que muestra una reacción positiva.
En el D0 PV, la mayoría de los animales fueron negativos con respecto a anticuerpos frente a PCV2 (el 58% de los animales vacunados y el 92% de los animales 30 del grupo control). Tras la segunda inmunización (D49 PV y D63 PV), los animales no vacunados del grupo control permanecieron casi seronegativos con respecto a PCV2, mientras que los animales vacunados habían experimentado seroconversión con respecto a PCV2 (véase la tabla 3).
35
Tabla 3
Grupo n#1 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6
Grupo #2 animales no vacunados
cerdo #
D0 PV D49 PV D0 PI (D63PV) cerdo # D0 PV D49 PV D0 PI (D63PV)
294
320 320 320 293 320 ND <20
295
320 320 80 301 <20 <20 <20
296
320 1280 1280 303 <20 <20 <20
297
1280 320 320 306 <20 <20 <20
298
320 320 80 831 <20 <20 <20
299
<20 5120 5120 833 <20 <20 320
300
<20 320 320 834 <20 20 320
304
<20 <20 320 835 <20 <20 <20
305
<20 320 320 836 <20 <20 <20
828
<20 1280 1280 837 <20 <20 <20
832
<20 1280 1280 838 <20 <20 <20
841
<20 320 320 839 <20 <20 <20
840 <20 <20 <20
ND: no determinado
Exposición 5
Seis semanas tras la segunda vacunación, se expusieron todos los cerdos de ambos grupos a la cepa Olot91 de PRRSV (104,7 - 104,8 TCID50/cerdo) por vía intranasal (IN).
10
Se extrajeron muestras de sangre los días 0, 7, 12, 20 y 27 PI en tubos para obtener suero para la determinación de títulos serológicos y para estudiar la respuesta inmunitaria contra PRRSV (ELISA para medir anticuerpos frente a proteínas gp5 y N, y prueba de SN). También se utilizaron los sueros para medir la viremia de PRRSV mediante RT-PCR cuantitativa. 15
Estudios serológicos
Se analizó la producción de anticuerpos neutralizantes (AcN) en sueros obtenidos a partir de sangre extraída en los D0 PV, D0 PI, D12 PI y D27 PI de animales control y 20 vacunados mediante ensayo de seroneutralización (SN; véase la tabla 4). Antes de la exposición (D0 PV y D0 PI), no se detectó ningún AcN en ningún grupo. En el D12 PI, algunos animales desarrollaron AcN (el 21,4% en el grupo #1 (animales vacunados) y el 23% en el grupo #2 (animales no vacunados)), pero incluso se observaron títulos de AcN superiores y un número superior de animales positivos en el día 27 tras la exposición (el 25 75% de positivos en el grupo #1, el 46% de positivos en el grupo #2).
Tabla 4
Grupo #1 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6
Grupo #2 animales no vacunados
cerdo #
D0 PV D0 PI D12 PI D27 PI cerdo # D0 PV D0 PI D12 PI D27 PI
294
<2 <2 <2 4 293 <2 <2 4 4
295
<2 <2 <2 16-32 301 <2 <2 <2 <2
296
<2 <2 <2 <2 303 <2 <2 2 <2
297
<2 <2 16 16-32 306 <2 <2 <2 <2
298
<2 <2 <2 16 831 <2 <2 <2 <2
299
<2 <2 2 4-8 833 <2 <2 <2 (D7 PI) ND
300
<2 <2 <2 4 834 <2 <2 <2 <2
304
<2 <2 2 2 835 <2 <2 <2 4
305
<2 <2 <2 2 836 <2 <2 <2 8
828
<2 <2 <2 <2 837 <2 <2 <2 4
829
<2 <2 <2 ND 838 <2 <2 <2 <2
830
<2 <2 <2 ND 839 <2 <2 <2 4-8
832
<2 <2 <2 32-128 840 <2 <2 4 8-16
841
<2 <2 <2 <2
% de positivos
0 0 21,4 75 % de positivos 0 0 23 46
ND: no determinado 5
Se analizó la presencia de anticuerpos antigp5 específicos mediante el ELISA de competición INGEZIM PRRS gp5 Compac (INGENASA) según las instrucciones del fabricante. Este método mide la competición entre los sueros problema porcinos y un anticuerpo monoclonal (AcM) marcado con peroxidasa antigp5 para determinar su unión a 10 una proteína gp5 recombinante previamente aplicada sobre la superficie de los pocillos de una placa de prueba. Utilizando un sustrato cromógeno, se detectó la presencia de anticuerpos antigp5 específicos en sueros de animales control y vacunados extraídos en los D0 PV, D0 PI, D14 PI, D21 PI y D28 PI (véase la figura 18). Se utilizó la absorbancia en el D0 PV (cuando no ha tenido lugar ninguna competición) para calcular el porcentaje 15 de unión en cada uno de los sueros tal como sigue:
100 x PV D de suero de aabsorbanciDx de suero en aabsorbanciunión de %0=
Porcentajes de unión inferiores representan niveles superiores de anticuerpos 20 antigp5 en los sueros sometidos a prueba. Tal como puede observarse en la figura 18, los animales vacunados desarrollaron títulos antigp5 superiores y una respuesta de anticuerpos más rápida a los 14 días tras la exposición que los animales control no vacunados.
Para la cuantificación de PRRSV en suero (viremia) y en lavados pulmonares, se 5 extrajeron muestras de sangre en los D0, D3, D7, D14, D20 y D28 PI en tubos para aislar suero y se mantuvieron a -80 ± 10ºC hasta su posterior análisis. Además, en el D27 PI se sacrificaron todos los cerdos y se les realizó la autopsia. Se evaluaron lesiones macroscópicas de pulmón y se realizaron lavados pulmonares. Para obtener los lavados pulmonares, se extrajeron los pulmones y se introdujeron 100 ml de PBS por la tráquea 10 hacia los pulmones seguido por un masaje leve y recuperación del PBS en tubos estériles mediante decantación. Se mantuvieron alícuotas de los lavados pulmonares a -80 ± 10ºC.
Se realizó la purificación de ARN a partir del suero y a partir de los lavados pulmonares utilizando el kit Nucleospin 96 RNA (Macherey-Nagel) siguiendo las 15 instrucciones del fabricante. Se mantuvieron las muestras de ARN a -80 ± 10ºC.
Para la cuantificación de PRRSV, se ha establecido una técnica de RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR). En primer lugar, se diseñaron cebadores específicos (cebador directo (Olot91F): 5’ TTCCCTCTGCTTGCAATCG 3’ (SEC ID nº: 16) y cebador inverso 20 (Olot91R): 5’ GGATGAAAGCGACGCAGTTC 3’ (SEC ID nº: 17)) y una sonda MGB® (sonda (Olot91S): 5’ 6-FAM-ACGGCTTTTAATCAAGGC-MGB 3’ (SEC ID nº: 18)) que comprendía 6-FAM como colorante indicador en el extremo 5’ y un resto MGB (ligando de unión al surco menor) en el extremo 3’ que servía como extintor no fluorescente utilizando el programa Primer Express de Applied Biosystems para la amplificación de una 25 fragmento de 67 pb del genoma de Olot/91 de PRRSV. En segundo lugar, se preparó ARN patrón purificando ARN a partir de la cepa de exposición de PRRSV y ajustando el mismo a 104 TCID50 de PRRSV /µl de ARN. Se dividió el ARN en alícuotas y se mantuvieron a -80 ± 10ºC. Se optimizaron la concentración de reactivos y condiciones de reacción utilizando el kit de sistema de qRT-PCR de una etapa UltraSense™ para ARN 30 (Invitrogen).
Se utilizó el ARN viral purificado como molde, se transcribió mediante transcripción inversa a 50ºC durante 30 min. y se desnaturalizó a 95ºC durante 5 min. El programa utilizado para la PCR consistió en 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 20 s e 35 hibridación a 56ºC durante 40 s. Se llevó a cabo la qRT-PCR en un termociclador PCR System 7500 en tiempo real. Se analizaron los resultados con el software SDS 1.2 (Applied Biosystems) (véase la figura 19).
Tal como puede observarse a partir de la figura 19, debido a la vacunación puede 40 observarse una clara disminución de los títulos de PRRSV en suero (desde 911 TCID50 de PRRSV/ml hasta 144 TCID50 de PRRSV/ml) en el D14 PI en los animales vacunados. Puede observarse una disminución adicional en los D20 y D28 PI.
Los macrófagos alveolares porcinos obtenidos a partir de cerdos vacunados 45 realizando lavados de pulmón contenían mucho menos virus (9606,74 TCID50 de PRRSV/ml de lavado) que los de los cerdos control (71518,33 TCID50 de PRRSV/ml de lavado). Debe apreciarse, que la presencia de PRRSV en secciones de pulmón también era inferior en cerdos vacunados (25%) que en cerdos control (66,6%), lo que indicaba la capacidad de la vacuna inactivada de reducir la replicación de PRRSV en su tejido diana.
En los pulmones obtenidos de los animales sacrificados en el D27 PI, se analizaron lesiones de pulmón macroscópicas y se puntuaron según el procedimiento descrito por HANNAN et al. (1982). La tabla 5 muestra las medias de la puntuación de neumonía que 5 revelan diferencias estadísticas entre animales del grupo control y animales vacunados. Los animales del grupo control presentaron puntuaciones de neumonía medias superiores a los cerdos vacunados.
Tabla 5 10
Grupo
Puntuación de neumonía (valor medio)
grupo control
8,956
animales vacunados
4,801
valor de p
estadísticamente relevante (0,0184)
EJEMPLO 15
15
Vector que expresa la proteína de fusión ORF5-LIMP-II
Se diseñó por ingeniería genética el vector recombinante utilizando el mismo protocolo de clonación que se describió anteriormente. Se dirigió la expresión de la proteína de fusión por TRS-3a, y se diseñó el vector con tropismo intestinal. Se obtuvo el 20 vector pBAC-Sc11-TRS3a-ORF5-LIMPII (véase la figura 20) clonando el ORF5 de PRRSV fusionado a los últimos 20 aa (SEC ID nº: 11) de LIMP-II porcina (número de registro de GeneBank AAS55916), que contenía la secuencia de direccionamiento lisosómica de esta proteína.
25
Se recuperó virus recombinante estable a partir del ADNc de pBAC-Sc11-TRS3a-ORF5-LIMPII.
Se detectó la expresión de Gp5-LIMPII mediante inmunotransferencia de tipo Western e inmunofluorescencia utilizando inhibidores específicos del pH lisosómico (es 30 decir, cloroquina, NH4Cl). Se encontró una expresión alta y estable del antígeno.
También se expresó esta proteína de fusión específica del vector de TGEV que expresaba la proteína Gp5-LIMPII y M. Esto dio como resultado una mejora adicional de la estabilidad del vector dicistrónico. 35
EJEMPLO DE REFERENCIA 16
Construcción de clones de TGEV recombinantes con genes S mutados 40
Se construyó una colección de TGEV recombinantes que sólo difieren en el gen S en 5’, pero por lo demás presentan una secuencia idéntica. Se generaron todos los virus recombinantes partiendo del mismo clon de ADNc infeccioso de TGEV, que presentaba la secuencia tal como se describió por ALMAZÁN et al. (2000) con la excepción de que la proteína S se derivó del aislado de TGEV-PUR46-PTV con un tropismo exclusivamente respiratorio (PENZES et al., 2001). Se construyeron los TGEV recombinantes tal como se describió previamente (ALMAZÁN et al., 2000) utilizando un ADNc infeccioso clonado 5 como cromosoma artificial bacteriano (BAC).
Los dos aislados de TGEV parentales TGEV-PUR46-PTV (que infecta el tracto respiratorio) y TGEV-PUR46-C11 (que infecta el tracto respiratorio e intestinal) difieren en el extremo 5’ del gen S tal como se muestra en la figura 22 (véase el recuadro superior en 10 la columna izquierda). Los nucleótidos resaltados reflejan diferencias entre las dos secuencias, mientras que el recuadro vertical claro representa una deleción de tres nucleótidos. Además, algunos clones también presentan una deleción de 6 nucleótidos ya presentes en la proteína S del gen S de TGEV-PUR46-PTV (PENZES et al., 2001).
15
Partiendo del virus rTGEV-SPTV, se generó una colección de virus recombinantes introduciendo sucesivamente secuencias presentes en el gen S de TGEV-PUR46-C11 pero no en PTV en la secuencia del gen S del rTGEV-SPTV (véanse las secuencias en la figura 22). Los nucleótidos en los recuadros oscuros representan los nucleótidos que se han modificado. 20
Se sembraron en placa los virus recombinantes, se purificaron tres veces en células ST y amplificaron mediante dos pases adicionales en estas células. Se utilizaron las disoluciones madre de virus obtenidas como disoluciones madre de trabajo [pase 0 con WS, acrónimo WS(P0)]. Tras propagar los virus en células ST, se determinó la 25 secuencia de los aislados recuperados y es tal como se indica en la figura 22.
Se administraron los virus a cochinillos recién nacidos de 3 días de edad. Se muestran los títulos de virus medios en los pulmones o el intestino 2-3 días tras la infección para cada virus recombinante. 30
El clon denominado “clon 1 de R7” (o S7.1) muestra la actividad más alta tanto en el pulmón como en el intestino de los cochinillos tras 2-3 días tras la infección.
35
EJEMPLO DE REFERENCIA 17
Cinética del crecimiento de clones de TGEV recombinantes
seleccionados con genes S mutados
40
Se evaluó adicionalmente el crecimiento de virus TGEV recombinantes rTGEV-PUR46-PTV, rTGEV-PUR46-C11 y TGEV-PUR46-S7.1 in vitro en células ST e in vivo en cochinillos.
Para los estudios in vitro, se evaluó el título de células ST infectadas con 45 cualquiera de TGEV-PUR46-C11 (TGEV C11) y TGEV-PUR46-S7.1 (TGEV7.1). Se inocularon las células ST o bien con virus de la disolución madre de trabajo (en el pase 0; véase el ejemplo 16 anteriormente) o bien con virus tras 6 pases adicionales en células ST. Se titularon los títulos de virus utilizando un ensayo en placa en células ST. Los resultados se muestran en la tabla 6 y representan valores medios de tres experimentos independientes.
Tabla 6
5
Título (UFP/ml)
Virus
WS (P0) Pase 6
rTGEV-PUR46-C11
3 X 107 4 X 108
TGEV-PUR46-S7.1
5 X 108 3 X 108
Tal como puede observarse a partir de la tabla 6, tanto TGEV-PUR46-C11 como TGEV-PUR46-S7.1 crecen hasta títulos altos en cultivo celular en células ST sin ninguna pérdida significativa de actividad incluso tras 6 pases.
10
Para estudios in vivo, se inocularon cochinillos recién nacidos de 3 días de edad con 3 X 108 ufp por cochinillo de TGEV-PUR46-C11 (TGEV C11) y TGEV-PUR46-S7.1 (TGEV7.1). Se infectaron los cochinillos o bien con virus de la disolución madre de trabajo (P0) o bien con virus obtenidos tras 6 pases adicionales en células ST. Se sacrificaron los animales en el día 2 tras la inoculación y se titularon los títulos de virus por gramo de 15 tejido animal (intestino o pulmón) utilizando un ensayo en placa en células ST. Los resultados se muestran en la tabla 7 y representan valores medios de tres experimentos independientes.
Tabla 7 20
Título (UFP/g de tejido)
WS (P0)
Pase 6
Virus
Pulmón Intestino Pulmón Intestino
rTGEV-PUR46-C11
5 X 106 5 X 106 2 X 106 5 X105
TGEV-PUR46-S7.1
4 X 107 8 X 106 8 X 106 4 X106
Los resultados representados en la tabla 7 ilustran que ambos virus crecieron bien tanto en el pulmón como en el intestino, cuando se infectaron los animales con virus de la 25 disolución madre de trabajo (P0). Además, también el virus pasado seis veces en células ST antes de la infección creció hasta títulos altos en ambos órganos. Sin embargo, en ambos órganos el S7.1 proporciona títulos significativamente más altos que el SC11.
En un experimento adicional, se inocularon cochinillos recién nacidos de tres días 30 de edad con 3 X 108 ufp por cochinillo de rTGEV-PUR46-PTV, TGEV-PUR46-C11 y TGEV-PUR46-S7.1. Se sacrificaron los animales en los días 1, 2, 3 y 4 tras la inoculación, respectivamente, y se determinaron los títulos de virus por gramo de tejido mediante titulación en placa en células ST (véase la figura 23).
35
Tal como puede observarse a partir de la figura 23, el rTGEV-PUR46-PTV sólo presenta tropismo respiratorio. Además, el título de virus no es estable durante los cuatro días in vivo sino que disminuye lentamente (véase el gráfico izquierdo de la figura 22). Tanto el TGEV-PUR46-C11 como el TGEV-PUR46-S7.1 presentan tropismo doble y crecen en el tracto respiratorio (pulmón) e intestinal (intestino) (véase la figura 23). Sin embargo, mientras que el título del TGEV-PUR46-C11 en ambos órganos disminuye 5 significativamente durante los cuatro días en el cochinillo, el título de TGEV-PUR46-S7.1 permanece casi estable (en el pulmón) o disminuye hasta un grado menor que el TGEVPUR46-C11 (intestino). En cualquier caso, los títulos de virus obtenidos para TGEV-PUR46-S7.1 son superiores en ambos órganos a los obtenidos para TGEV-PUR46-C11, es decir el TGEV recombinante que comprende el gen S S7.1 es más estable in vitro e in 10 vivo que el TGEV-PUR46-C11.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas
<120> Ácidos nucleicos que codifican para secuencias de TGEV y PRRSV para la 5 expresión mejorada de secuencias de PRRSV
<130> P71617
<150> Documento EP05026255 10
<151> 01-12-2005
<160> 19
<170> PatentIn versión 3.3 15
<210> 1
<211> 4350
<212> ADN
<213> PRRSV 20
<400> 1
<210> 2
<211> 606
<212> ADN 5
<213> PRRSV
<400> 2
10
<210> 3
<211> 522
<212> ADN
<213> PRRSV
5
<400> 3
<210> 4
<211> 37 10
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador de oligonucleótido 15
<400> 4
<210> 5 20
<211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 25
<223> cebador de oligonucleótido
<400> 5
<210> 6
<211> 77 5
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador de oligonucleótido 10
<400> 6
<210> 7 15
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20
<223> cebador de oligonucleótido
<400> 7
25
<210> 8
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
30
<220>
<223> cebador de oligonucleótido
<400> 8
35
<210> 9
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial 40
<220>
<223> cebador de oligonucleótido
<400> 9 45
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> PRRSV 5
<400> 10
<210> 11 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 11 15
<210> 12
<211> 60
<212> ADN 20
<213> Sus scrofa
<400> 12
25
<210> 13
<211> 564
<212> ADN
<213> Artificial
30
<220>
<223> epítopo neutralizante ORF5-ORF6 de PRRSV
<400> 13
<210> 14
<211> 624
<212> ADN 5
<213> Artificial
<220>
<223> Epítopo ORF5-ORF6-LIMP-II
10
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT 5
<213> Artificial
<220>
<223> conector peptídico
10
<400> 15
<210> 16
<211> 19 15
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador de oligonucleótido
<400> 16
ttccctctgc ttgcaatcg 19
5
<210> 17
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
10
<220>
<223> cebador de oligonucleótido
<400> 17
ggatgaaagc gacgcagttc 20 15
<210> 18
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial 20
<220>
<223> sonda de oligonucleótido (sonda MGB)
<400> 18 25
acggctttta atcaaggc 18
<210> 19
<211> 31
<212> ADN 30
<213> Artificial
<220>
<223> secuencia artificial derivada del gen N
35
<400> 19
aaaattatta catatggtat aactaaacaa a 31

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Ácido nucleico que comprende:
    5
    (a) las secuencias de un virus de la gastroenteritis transmisible competente para la replicación (TGEV), codificando dichas secuencias para una replicasa de TGEV bajo el control de secuencias reguladoras de la expresión, en el que la replicasa es expresada en una célula huésped e iniciará la replicación del ácido nucleico y aumentará así el número de 10 ácidos nucleicos en la célula; y
    (b) una secuencia que codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), incluyendo dicha secuencia un residuo de formación de puente 15 disulfuro; y
    (c) una secuencia que codifica para por lo menos un polipéptido adicional que puede aumentar una respuesta inmunitaria contra el PRRSV,
    20
    en el que se ha modificado la secuencia que codifica para dicho epítopo neutralizante de ORF 5 para desactivar los sitios de glicosilación que interfieren en la inducción de anticuerpos.
    25
  2. 2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico codifica para una replicasa de TGEV y una secuencia que codifica para la proteína N de TGEV.
  3. 3. Ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, en el que el vector de TGEV 30 competente para la replicación no es infeccioso.
  4. 4. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de TGEV competente para la replicación es infeccioso. 35
  5. 5. Ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico comprende además uno o más de los genes de TGEV siguientes: S, E, M y/o N.
    40
  6. 6. Ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, en el que las partículas virales infecciosas de TGEV que pueden obtenerse de la asociación de las proteínas de TGEV y las secuencias de ácido nucleico son partículas virales atenuadas.
    45
  7. 7. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el gen S se deriva de un virus respiratorio.
  8. 8. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el gen S deriva de una cepa intestinal de TGEV.
    5
  9. 9. Ácido nucleico según la reivindicación 5, en el que se ha modificado el gen S y presenta la SEC ID nº: 1.
  10. 10. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la 10 secuencia comprende un epítopo neutralizante de ORF5 y por lo menos un epítopo de ORF 6 de PRRSV.
  11. 11. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la 15 secuencia comprende un epítopo neutralizante de ORF5 y un epítopo neutralizante de ORF 6 de PRRSV.
  12. 12. Ácido nucleico según la reivindicación 10, en el que la secuencia está 20 constituida por un epítopo neutralizante de ORF5 y la totalidad del ORF 6 de PRRSV.
  13. 13. Ácido nucleico según la reivindicación 11, en el que la secuencia está constituida por un epítopo neutralizante de ORF5 y un epítopo neutralizante de ORF 6 de 25 PRRSV.
  14. 14. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el ácido nucleico comprende las secuencias de ORF5 y ORF6 de PRRSV cada una bajo el 30 control de una secuencia reguladora de la expresión separada.
  15. 15. Ácido nucleico según reivindicación 14, en el que la secuencia está constituida por (1) la secuencia de ORF5 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la 35 transcripción del gen 3a, (2) la secuencia de ORF6 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la transcripción TRS22N expuesta como SEC ID nº: 19 y (3) la secuencia del gen S derivado de la cepa atenuada PTV de TGEV.
    40
  16. 16. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el ácido nucleico codifica además para la señal de direccionamiento lisosómico de la proteína II integral de membrana lisosómica (LIMPII).
    45
  17. 17. Ácido nucleico según la reivindicación 16, en el que dicho ácido nucleico codifica para una proteína de fusión constituida por LIMPII y ORF5 y/u ORF6 de PRRSV.
  18. 18. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el ácido nucleico codifica además para la subunidad p35 de IL-12 u otras interleucinas.
  19. 19. ARN recombinante codificado por un ácido nucleico según cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 18.
  20. 20. Vector que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 19. 10
  21. 21. Vector según la reivindicación 20, en el que el vector un vector de ADNc.
    15
  22. 22. Vector según la reivindicación 21, en el que el vector es un vector BAC-TGEVFL.
  23. 23. Vector según la reivindicación 22, en el que el vector BAC-TGEVFL contiene la 20 secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 17 ó 18.
  24. 24. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el vector puede replicar el ácido nucleico dentro de una célula huésped. 25
  25. 25. Célula huésped que comprende un vector según una de las reivindicaciones 20 a 24.
    30
  26. 26. Célula huésped según la reivindicación 25, en la que la célula es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula animal o una célula humana.
    35
  27. 27. Célula huésped según la reivindicación 26, en la que la célula es una línea celular porcina de testículo de cerdo, tal como la línea celular depositada como ATCC CRL-1746.
    40
  28. 28. Partícula de virus que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y por lo menos una proteína de la cubierta de TGEV.
    45
  29. 29. Partícula de virus según la reivindicación 28, que comprende todas las proteínas de la cubierta de TGEV de la partícula de virus de TGEV natural.
  30. 30. Preparación farmacéutica que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 18, un ARN viral o un vector según una de las reivindicaciones 19 a 24 o una célula huésped según una de las reivindicaciones 25 a 27 o una partícula de virus según la reivindicación 28 ó 29.
    5
  31. 31. Preparación farmacéutica según la reivindicación 30, que comprende además un vehículo, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
    10
  32. 32. Vacuna que puede proteger un animal contra PRRSV que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 18, un ARN o vector viral según una de las reivindicaciones 19 a 24, una célula huésped según una de las reivindicaciones 25 a 27 o una partícula de virus según la reivindicación 28 ó 29.
    15
  33. 33. Vacuna según la reivindicación 31, en el que la vacuna es una vacuna multivalente que puede proporcionar protección contra uno o varios patógenos de cerdo distintos de PRRSV.
    20
  34. 34. Vacuna según la reivindicación 33, que comprende además los antígenos derivados de otras proteínas y/o patógenos virales y/o bacterianos que proporcionarán inmunidad contra los patógenos.
    25
  35. 35. Vacuna según la reivindicación 33 ó 34, que comprende además uno o varios antígenos derivados de otros patógenos virales seleccionados de virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino de tipo 2, peste porcina clásica, peste porcina africana, glosopeda, virus de seudorrabia, circovirus porcino de tipo 1, adenovirus 30 porcinos, enterovirus porcinos, coronavirus respiratorio porcino, rotavirus porcino, virus de encefalomiocarditis, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la enfermedad del ojo azul, virus de la hepatitis E y/o virus del Nilo Occidental, virus Nipah.
    35
  36. 36. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende además uno o varios antígenos derivados de otros patógenos virales seleccionados de entre virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino de tipo 2, peste porcina clásica, peste porcina africana y/o glosopeda.
    40
  37. 37. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende además uno o varios antígenos derivados de patógenos bacterianos seleccionados de entre Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida tipo A (toxinas), Pasteurella multocida tipo D 45 (toxinas), Bordetella bronchiseptica, Isospora suis, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Mycoplasma hyorinis, Streptococcus suis, Clostridium
    perfringens, Clostridium difficile, Clostridium novyi, Brucella abortus y/o Candidatus helicobacter suis.
  38. 38. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende 5 además uno o varios antígenos derivados de patógenos bacterianos seleccionados de entre Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida tipo A (toxinas), Pasteurella multocida tipo D (toxinas), Bordetella bronchiseptica, Isospora suis, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia 10 coli y/o Salmonella enterica.
  39. 39. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38, en la que el antígeno viral o bacteriano adicional está presente en la vacuna multivalente como un virus o 15 bacteria atenuado o inactivado o como una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno o varios de los antígenos virales o bacterianos adicionales.
  40. 40. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, que comprende 20 además las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas que conferirán protección contra los patógenos de cerdo, tales como las secuencias de ácido nucleico que codifican para uno o varios anticuerpos que presentan especificidad para las enfermedades bacterianas o virales o las secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína priónica porcina. 25
  41. 41. Vacuna según una de las reivindicaciones 32 a 40 que comprende además un vehículo, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
    30
  42. 42. Vacuna según una de las reivindicaciones 32 a 41, en la que la vacuna resulta apropiada para vacunar un cerdo, preferentemente una cerda.
    35
  43. 43. Vacuna según una de las reivindicaciones 32 a 41, en la que la vacuna puede inducir tanto una respuesta inmunitaria sistémica como una respuesta inmunitaria de la mucosa contra los agentes virales infecciosos.
    - - - 40
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