TWI358455B - Nucleic acids encoding tgev and prrsv sequences fo - Google Patents

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TWI358455B
TWI358455B TW095144370A TW95144370A TWI358455B TW I358455 B TWI358455 B TW I358455B TW 095144370 A TW095144370 A TW 095144370A TW 95144370 A TW95144370 A TW 95144370A TW I358455 B TWI358455 B TW I358455B
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tgev
prrsv
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Sanches Luis Enjuanes
Lucas Sonia Zuniga
Gurpegui Isabel Sola
Duran Joan Plana
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Consejo Superior Investigacion
Fort Dodge Veterinaria S A
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1358455 ·. 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 • 纟發明係相關於-種核酸，包含-複製勝任傳染性胃 ； 腸炎病4(TGEV)序列，料列編碼-TGEV複製酶，在表 ‘ 5 %調控序狀控制下’使得該複製酶於含魏酸之細胞中 之表現可啟動該核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中 之數目。本發明之核酸更編碼PRRSV之0RF5之至少一中和 φ 性表位，以及一或多種其他可增進對抗PRRSV之免疫反應 之多胜肽。使用編碼二種不同pRRSV蛋白之核酸，可提供 1〇具有增進之體外穩定度之病毒建構物。本發明更相關於使 用廷些核酸製備醫藥組成物之用途，用於製備具增進效率 之一般性與特異性疫苗。 C先前技術】 發明背景 、 15 涉及功能性基因置入細胞中以達到療效之醫療方法， • 稱之為基因療法’因為是以基因作為藥物。基因療法為一 種主要用於矯正對應於疾病發展之基因缺陷之技術。 載劑分子亦稱為載體，係用於傳遞治療性基因至病患 標的細胞中。目前最常用之載體為病毒，其已經基因工程 20改變’可攜帶人類或動物基因。病毒涉及以致病方式包覆 與傳送其基因至人類或動物細胞中。因此，科學家利用此 能力之優點，操作病毒基因體，移除致病基因，並插入具 療效之基因。 這些病毒性载體係用於表現會導致接受該載體之個體 5 1358455 . 免疫反應之異源性基因，因而使該個體免疫。在此情況 下，病毒性載體係作為疫苗。 傳染性胃腸炎病毒為冠狀病毒家族成員之一。冠狀病 毒為ssRNA(+)病毒’為目前RNA病毒具有最大基因體者， 5 具有 25 與 31kb 之長度（請見 Siddell S.G. 1995，The Coronaviridae)。當冠狀病毒感染一細胞，該基因體RNA (gRNA)會在細胞質中複製，並產生一組具正與負極性之次 基因體RNAs (sgRNA) (Sethna ei α/.，1989; Sawicki & Sawicki，1990; and Van der Most and Spaan，1995)。 10 由於冠狀病毒會於細胞質中複製，使用冠狀病毒作為 基因治療之載體與疫苗已被報導(Enjuanes ei fl/.，2003)。特 別的是’冠狀病毒之缺陷干擾(DI)基因體會被製造出。這些 DI基因體為缺失突變株，其需要互補或辅助病毒存在，以 複製及/或轉錄(請見Chang ei α/·，1994; W097/34008 ;西班 15 牙專利申請案Ρ9600620; Izeta d α/., 1999; S人nchez α/.， 1999)。 冠狀病毒之完整基因體係以感染性cDNA方式複製出 (Almazan w β/.，2000 and WO01/39797)。完整基因體之複 製可允許製備感染性載體，其含有適於於宿主細胞中大量 20 表現之異源性序列。 該複製出之病毒性基因體表現異源性序列之潛力，係 回顧於Enjuanes w α/.，2003。 使用複製出之病毒，該基因之結構，以及感染用之冠 狀病毒性基因之流行程度，便可利用製偫缺失突變株而評 6 1358455 估。已發現基因3a、3b與7為病毒性核酸複製非必要，且該 基因之缺失會降低病毒之致病性(Ortego d ίζ/·，2002 and 2003; Sola da/_, 2003)。 豬繁殖與呼吸综合症病毒(PRRSV)於1991年首度辨識 5 出，為豬隻新疾病之致病劑（Wensvoort ei 〇/·, 1991)。自 此’ PRRSV便成為全世界豬隻經營損失之主要因素之一， 目前公認為豬隻最重要之感染疾病，會導致成熟動物生殖 衰竭，以及新生豬隻之嚴重肺炎。PRRSV為drieWWrWae家 族成員之一 ’屬於Μ·ί/ο病毒性疾病。已辨識出兩種基因型 10 (美洲型與歐洲型）（Murtaugh eia/·, 1995)。PRRSV為一種 封包病毒，具有單股正向RNA基因體，為14.5 Kb。三分之 二之5’基因體編碼該複製酶多蛋白（pp 13與pp 1 ab)，其餘的 基因體RNA則編碼三個次要膜結合醣蛋白（gp2、Gp3與 Gp4)，以及三個主要結構蛋白（gp5、Μ與N)。 15 豬隻一般會在黏膜表面或呼吸道暴露於病毒下而感染 PRRSV。豬隻對PRRSV之抗體反應標記主要為非中和性抗 體’會在感染早期偵測到，之後為低度中和性抗體效價， 出現於感染後3週《最近幾年之實驗數據已顯示中和性抗體 在對抗PRRSV感染上之重要性(L〇PEZ and 〇s〇RI〇, 2〇〇4, 20 ANSARI 2006)。PRRSV聽蛋白Gp5含有大部分中和病 毒表位。PRRSV之蛋白質〇1)4與]^亦會誘發中和性蛋白，然 而，Gp5特異性抗體則會更有效地中*pRRSV，與其他病 毒性蛋白之結合相較(OSTROWSKI ei β/.，2002)。PRRSV 感染亦會誘發較弱及延遲之T細胞媒介免疫反應，與其他病 7 毒引起之免疫反應有關。二者反應皆需要完全之病毒清除β 雖然我們較不瞭解PRRSV之免疫反應，但已有某些市 售之疫苗。目前對抗PRRSV之疫苗具有數種缺點epRRsV， 不論是野生型或減毒性，皆接會誘發低量之細胞_媒介免疫 反應(MEIER扣α/·，2003)，且中和性抗體(NA)直至感染晚 期才會形成（MEIER ei β/.，2003, VEZINA ei α/.，1996, YOON Wa/.，1995)。此外’ PRRSV之基因歧異度被認為會 影響疫苗效率，在野外條件下（LABRQUE w以，2004, PESCH ei W·，2005) ’雖然會存在某些程度之交叉保護 (MENGELING ei α/·，2003 a, 2003b)。經修飾之活疫苗可保 護同源性單株體之感染，但一般對於異源性病毒有限制 (MENG，2000)。此外，活疫苗對於臨床疾病提供部分保護， 但無法預防感染（OSPRIO以α/., 1998)，更重要的是，他們 可轉變毒性(BOTNER 以 α/·，1997, NIELSEN d α/.，2001)。 另一方面，殺死之PRRSV疫苗已證實對於感染與疾病二者 提供之保護較小（OSTROESKI wa/.，2002)。 因此，本發明所要解決之問題便是提供一種有效率之 疫苗載體，具有良好之安全性，以及對抗pRRSV之免疫增 強作用。 【明内容】 發明概要 依據本發明之第一觀點，係提供一種核酸，包含： (a) —複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序 列蝙碼_TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，其中該 1358455 . 複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動該核酸之複製，因 此增加該核酸在該細胞中之數目：以及 (b) —編碼豬繁殖與呼吸综合症病毒(pRRSV) 〇RF5之 至少一中和性表位之序列，該序列包括一雙硫鍵形成殘 5 基；以及 (c) 一序列，該序列係編碼至少一其他可增進對抗 PRRSV之免疫反應之多胜肽。 依據本發明之第二觀點，係提供一種核酸，包含： (a) —複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序 H)列編碼-TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該 複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動核酸之複製，因 此增加該核酸在該細胞中之數目；以及 (b) 編碼PRRSV之-或多個0RF5中和性表位之多聚合 體(multimers)，以及至少一其他可增進對抗叹讀之免疫 15 反應之多胜肽之序列。 依據本發明之第三觀點，係提供一種核酸，包含： (a) —複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序 列編碼-TGEV複製酶，在表現_相之控制下，使得該 複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製， 2〇 因此增加該核酸在該細胞中之數目；以及 (b) -編碼豬繁殖與輕综合症病毒(PRRSV) 0RF5之 至少一中和性表位之序列；以及 ⑷-序列，該序列係編碼至少—其他可增進對抗 PRRSV之免疫反應之多胜肽，其可穩定(b)之序列之表現， 9 < S ) 1358455 使得大於60%之經此核酸序列感染之細胞，可表現作)序列 之基因產物，至體外病毒分代20代之後。 在一較佳實施例中’該中和性表位係定義為胺基酸序 列 TYQYIYN (SEQ ID NO: 10)。 5 在另一較佳實施例中，該核酸包含PRRSV之ORF5與 ORF 6，每一者皆在個別之表現調控序列控制下。 在一較佳實施例中’該核酸係由（1) PRRSV之ORF5序 列’在基因3a之轉錄調控序列控制下' (2) prrsv之ORF6 序列，在如SEQ ID NO: 19之轉錄調控序列trs22N之控制 10下，以及⑶S基因序列，衍生自TGEV之PTV減毒株，組成。 該複製勝任TGEV序列不一定需要，但可更編碼其他 TGEV蛋白。IS)此’該TGEV序歹(J可編碼一完全感染性TGEV 病毒’且該中和性表位多聚合體之序列恰好包含一複製勝 任核酸。本發明更相關於一種載體，包含個別之核酸與包 15含該載體之宿主細胞。該宿主細胞可補足本發明核酸刪除 之TGEV基因。因此，宿主細胞可為組裝好之細胞株，或可 含有表現TGEV基因辅助病毒，使得TGEV病毒顆粒可形成 含有至少一 PRRSV中和性表位之序列。由TGEV外殼蛋白與 本發明之複製勝任但無感染性之核酸組合而得之病毒顆 20粒，為本發明之特佳實施例（相對應之病毒顆粒亦稱之為偽 -病毒）。 最後’本發明亦相關於該核酸之醫藥用途，該病毒載 體與侣主細胞特別使用作為一疫苗，用於治療與保護動 物，如豬，對抗感染性疾病。因此，該疫苗可投藥至動物， 10 以降低或解除野生型病毒感染後之症狀。 較佳實施例之詳細說明 因此’本發明係相關於一種核酸，包含： (a) —複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序 列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，其中該 複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動核酸之複製，因而 増加該核酸在該細胞中之數目；以及 (b) —編碼豬繁殖與呼吸综合症病毒(pRRSV)之〇RF5 之至少一中和性表位之序列，該序列包括一雙硫鍵形成殘 基；以及 (c) 一序·列’該序列係編碼至少一其他可增進對抗 PRRS V之免疫反應之多胜肽。 本發明更令人意外地發現表現PRRSV之0RF5之表位 之至少一中和性表位或多聚合體，以及至少一其他多胜 狀’可增加對抗PRRSV之免疫反應，其中該TGEV載體骨架 可產生一有效且相當安全之疫苗對抗PRRSv，具有增進之 藥效。 因此，本發明更相關於一種核酸，包含： (a) —複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序 列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該 複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製， 因而增加該核酸在該細胞中之數目； (b) —編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)之0RF5 1358455 之至少一中和性表位之序列；以及 (C) 一序列’該序列係编碼至少一其他可増進封护 PRRSV之免疫反應之多胜肽，其可穩定(b)之序列之表現， 使得大於60%之經此核酸序列感染之細胞，可表現(b)序列 5 之基因產物，至體外病毒分代20代之後。 在一實施例中，該核酸可經由至少一其他多胜狀穩 定，其可增加對抗PRRSV之免疫反應程度，使得至少65%、 70%、75%、80%、85%、90%，或100%之經本發明核酸序 列感染之細胞’在病毒體外繁衍20代之後仍可表 10之〇RF5之至少一中和性表位。在一較佳實施例中，至少8〇% 之細胞會在病毒體外繁衍20代之後仍可表現PRRSV之 ORF5之至少一中和性表位。 在本申請書中，術語“分代，，係指一過程，其中培養凰， 如Petri dish，上之單層TGEV敏感細胞(如st細胞），係經病 15毒感染，病毒複製如24小時後，收集該上清液，並轉移至 新鮮之單層細胞上》該分代過程可包括複製步驟，如轉染， 以獲得由該DNA植株(使用如BHK細胞），或由病毒溶菌斑 純化而得之病毒。 使用含TGEV之載體可允許該表位物傳送至所希望之 20組織’其具有南度抗原表現量，且該載體可經基因工程操 作產生安全之疫苗。 PRRSV感染期間之問題之一為該豬隻僅分泌低量之 IFN-γ，在感染之非常晚期。第I型干擾素(IFN a/p)之誘發 為促進抗病毒細胞（PFEFFER打a/·，1998)與體液免疫反應 12 1358455 (LEBON以α/·，2001)所必須。更描述了 ifn 〇^il i2涉及τ 細胞刀化為IFN-y抗原if寺異性分泌細胞之過程（c〇usens以 α/·，1999)。然而，已顯示TGEV為一強效之IFN a誘發物。 TGEV誘發IFN ’為河蛋白媒介之過程— Laude, 5 I988; Laude ei α/·，1990)。此外，TGEV載體呈現抗原於黏
膜位置，引發黏膜性與系統性免疫反應。因此，使用TGEV 為PRRSV表位之載體，優點為可增進誘發對抗pRRSV之保 護反應。 含TGEV之載體可具有一經修飾之載體_趨性。在本發 10明之一實施例中，該載體為呼吸道相關載體。此可藉由使 用呼吸道病毒之棘蛋白（S)基因而達成。在另一實施例中， 該載體為腸道引導載體。此可藉由使ffiTGEV腸内株之；5基 因而獲得。該S基因更可為一引導載體至呼吸道與腸道之序 歹1J(請見第9圖）。
15 在一較佳實施例中，係使用經修飾之S基因（SEQ ID N〇:l)，其提供腸内與呼吸道趨性，且培養豬睪丸(ST)細胞 分代時相當穩定。此基因為一嵌合性蛋白質，衍生自Tgev 植株Cn之S蛋白（其為劇毒’具有腸内與呼吸道趨性），並複 製PTV。重組s蛋白係經基因工程改造，使用TGEVCn S基 20因之前12〇8 nt，以及PTV病毒嵌合序列之剩餘部分。最終 之嵌合蛋白可藉由使用重組病毒攜帶此蛋白至豬隻上，並 回收具有嵌合性序列如SEQ ID NO: 1之病毒。此蛋白提供 TGEV腸内與呼吸道趨性，且培養豬睪丸(ST)細胞分代時相 當穩定’提供高效價(>108)之TGEV，當培養於ST細胞之組 (S ) 13 織培養物中時’且不會解除體外之雙重趨性（亦請見第9圖）。 就最廣之觀點而言，本發明之核酸特徵為一編碼複製 勝任TGEV序列之核酸，該序列編碼一TGEV複製酶，在表 現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中 5之表現可啟動該核酸之複製，因此增加該核酸在該細胞中 之數目。一旦細胞經本發明核酸感染，該複製酶之基因將 了表現，且該核酸將被複製。愈多複製核酸出現於細胞中， 便有愈多之表位物會被表現。 術語“轉錄調控序列，，，於此使用係指一序列或序列片 1〇段’可驅動並轉錄調控序列結合之次基因體病毒性RNAs之 合成。此轉錄調控序列為天然轉錄_調節序列（TRS)，與病 毒性RNAs結合。在一較佳實施例中，該trs為基因3a之 TRS ’在編碼兩抗原之雙順反子(dicistr〇njc)載體中，該第 二個TRS為合成TRS，衍生自N基因（TRS22N; SEQ ID NO: 15 19) ’其可在微基因體與全長cDNA表現系統中，使基因表 現最佳化(Alonso ei α/·, 2002)。 依據本發明，“中和性表位”係指一表位，其涉及病毒 中和作用。可辨識PRRSV Gp5 (由ORF5編碼)之抗體可更有 效地中和PRRSV，與特異於其他病毒性蛋白者相較 2〇 (Ostrowski ei α/.，2002)。應瞭解為，本發明之核酸編碼 PRRSV之0RF5之至少一中和性表位，但亦編碼更多之中和 性表位，或ORF5之更大部分，例如整個Gp5蛋白。 在一較佳實施例中，該中和性表位係定義為胺基酸序 歹丨JTYQYIYN (SEQ ID NO: 10)。 14 1358455 在一實施例中，本發明核酸係編碼PRRSV之0RF5之至 少一中和性表位，以及一雙硫鍵形成殘基，其可連結另一 多胜肽至該中和性表位上。例如，一〇RF6之表位，其編碼 PRRSV之iv[蛋白，或完全μ蛋白可經由雙硫鍵耦合至〇RF 5 5 之表位。 在另一實施例中，本發明之核酸會編碼0RF5中和性表 位之多聚合體。“多聚合體，，包含至少一表位之二複製物。 一“多聚合體，，可包含Gp5之重複，或其他PRRSV衍生蛋白序 列誘發之中和用PRRSV抗體。此定義包括衍生自PRRSV 10 Gp5之合成蛋白區域(或胜肽），或其他PRRSV蛋白，具有點 突變之經修飾序列，可產生免疫原結構，提供更高之保護， 由於強化之中和反應或移除誘餌表位所致。 一般而言，編碼多聚合體之核酸包含2至5個重複序 列’該序列編碼PRRSV之ORF5之表位。這些多聚合體可與 15 一核酸序列連結，該序列編碼一彈性聯結子（flexible linker) ’為2至8個胺基酸’較佳3至6個胺基酸。這些“聯結 基殘基”可增進表位之彈性^特佳之聯結基為序列
Gly-Gly-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 15)。 在另一實施例中，編碼ORF5中和性表位之核酸，其經 20修衝5刪除醣化位置，最近一篇報導描述缺乏該醣化位置可 增加誘發中和PRRSV之抗體(Ansari β/.，2006)。在一較 佳實施例中’此醣化位置為Gp5胺基酸46及/或53，得自 PRRSV Olot 91株。
Gp5蛋白表位之醣化可影響抗體之誘發，導致免疫反應 15 1358455 下降。因此，由本發明核酸編碼之表位可提供增進之免疫 反應刺激效應，與天然發生之表位相較。 在本發明之一較佳實施例中’該核酸編碼PRRSV之 0RF5與ORF6之至少一中和性表位，但非其他PRRSV多胜 5 肽。因此，在本發明之另一實施例中，該核酸包含PRRSV 之0RF5之一中和性表位，以及0RF6之至少一表位。在另 一實施例中，該核酸係由PRRSV之0RF5之一中和用表位， 以及ORF6之一中和用表位組成。在另一較佳實施例中，該 核酸係由PRRSV之0RF5之一中和性表位，以及整段〇RF 6 10 組成。 此可產生非常有效對抗PRRSV之疫苗。在另一較佳實 施例中，該核酸編碼整段ORF5與ORF6，但無其他PRRSV 多胜肽。 在另一較佳實施例中，該核酸編碼ORF5之一中和性表 15 位’以及整段ORF6，但無其他PRRSV多胜肽。在另一較佳 實施例中，ORF5之中和性表位係定義為SEQ ID NO: 10。 在另一較佳實施例中，該核酸編碼0RF5之至少一中和 性表位、整段0RF6，以及額外地，Gp4之至少一中和性表 位。 20 僅包含PRRSV之Gp5之疫苗，已證實對於保護小豬對 抗PRRSV感染非常有效。此由感染prrsv後，接種疫苗之 小豬可防止體重減輕而得知（請見第1圖），且接種疫苗之小 豬亦可預防被PRRSV感染（請見第2圖）。然而，僅包含Gp5 之重組病毒已證實為不穩定，在將病毒於組織培養中分代 16 1358455 時。如同第3圖所示，Gp5 mRNA無法在組織培養分代5次 後(p5)，於感染重組病毒之ST細胞中偵測到，其在分代2 次後(p2)仍可於感染重組病毒之ST細胞中偵測到。此現象 係由於在病毒分代時會產生缺失所致。 5 相對地，使用編碼PRRSV之Gp5 (0RF5)與M (0RF6)之 核酸，已顯示可提供具有實質上增進穩定性之建構物。更 特別的是，除了提供保護對抗PRRSV感染外，包含編碼 PRRSV之Gp5 (0RF5)與M (0RF6)之核酸之雙順反子建構 物為更穩定，甚至在組織培養中分代2〇次之後仍是(請見第 10 5、6與8圖）。該病毒更可由經感染之小豬中取得。該建構 物之穩定性可更進一步由RT-PCR分析顯示（請見第7圖），其 顯示轉錄ORF5與ORF6二基因，可由體外分代2〇次之§τ細 胞中偵測到病毒植株。此資料清楚地顯示本發明之雙順反 子建構物’包含碼PRRSV之Gp5與Μ之核酸，不僅可提供在 15細胞培養20次分代後仍維持其能力之病毒’亦可在20次分 代後仍表現由該雙順反子建構物編碼之二蛋白。此在細胞 培養中增進之穩定性’對於用於疫苗製備之體外重組病毒 之繁殖相當重要。此外’由於增進之穩定性，亦可由接種 疫％小豬之肺部與腸組織中回收表現有pRRSV 〇ρ5與μ之 20重組TGEV，可更進一步使用ST細胞進行細胞培養繁殖(請 見第9與10圖）。 其他可被表現以誘發保護性免疫反應之pRRSV衍生蛋 白為醣蛋白GP2、GP3與GP4。已顯示這些蛋白可加入病毒 粒子（vidons)中成為多聚合體複合體（Wissink w 乂, < S > 17 2005)，為病毒感染性所必須。因此，在本發明之另一實施 例中，該核酸編碼Gp5至少一中和性表位，以及Gp2、Gp3 或Gp4之至少一表位。在一較佳實施例中，該核酸編碼gp5 與Gp2之一中和性表位。在另一實施例中，該核酸編碼gp5 與Gp3之一中和性表位，而在另一實施例中，該核酸編碼 Gp5與Gp4之一中和性表位。其他實施例則包含Gp5與Gp2 及Gp3之組合，Gp5與Gp2及Gp4之組合，或Gp5與Gp3及Gp4 之組合。 在本發明之另一實施例中，該核酸包含一核酸，其包 含： (a) —複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)之序列，該 序列編碼一TGEV複製酶’在表現調控序列之控制下，其中 該複製酶係於宿主細胞中表現’並會啟動該核酸之複製， 因而增加該核酸在該細胞中之數目； (b) SEQ ID NO: 2之殘基118至138，或一具有與這些殘 基90%相似度之序列，在—表現調控序列之控制下；以及 (c) SEQIDNO: 3，或一具有與SEQDDN0: 3 90%相似 度之序列’在一表現調控序列之控制下；其中 (a)與(b)與(c)之每一序列皆在不同表現調控序列之控 制下。 在一實施例中’該核酸之特徵為SEQ ID NO: 2之特定 殘基，SEQ ID NO: 3更包含核酸序列SEQ ID NO: 12，其 編碼溶酶體貫穿性膜蛋白屯（LIMPII)之溶酶體標靶訊號’ 或具有與SEQIDNO: 12相似度90%之序列。LIMP-II會引導 1358455 . 融合蛋白至溶酶體(請見第21圖）。引導至溶酶體之抗原係由 MHC 11呈現’會增進體液免疫反應（Rodriguez d a/·, 2001)。該編碼LIMIMI蛋白之序列較佳係融合至SE(^D no: 2 ’使得該核酸可表現含有PRRSV之ORF5序列與LIMP-II序 5列之融合蛋白。在本實施例之一觀點中，該核酸可包含編碼 0RF5表位多聚合體之序列，如上所述（即具有SEQ ID NO: 2 之殘基118至138序列之2至5重複，選擇性地插入2至8個， 較佳3至6個胺基酸之連結基），以及SEQ ID NO: 3，但該核 酸不包含任一其他衍生自PRRSV之序列’即，無其他序列 10具有與PRRSV Olot 91已知序列80%、較佳90或95%之相似 度0 使用劇毒或減毒病毒，以及PRRSV之重組抗原，可導 致延遲病毒中和性抗體之誘發。在本發明之一實施例中， 該核酸編碼多胜肽，其增進抗原之呈現。在一較佳實施例 15中’該溶酶體貫穿性膜蛋白-II (LIMPII)之溶酶體標靶訊號 係使用於此目的。在另一實施例中，係使用該完整之 LIMP-II蛋白’而其他實施例則包括含有含溶酶體標靶訊號 之LIMP-II之任一片段。在一較佳實施例中，含有LIMpn 之溶酶體標靶訊號，以及ORF5及/或ORF6，或至少一中和 20 性表位之融合蛋白，係由本發明核酸所編碼，其中該LIMPII 之溶酶體標靶訊號可融合至ORF5或ORF6，在二者，〇RF5 與ORF6，皆存在之情況下，該LIMPII之溶酶體標靶訊號係 融合至其中之一，而ORF5與ORF6，或其中和性表位，則 以雙硫鍵聯結。 < S ) 19 1358455 在另一實施例中，該可增加對抗PRRSV之免疫反應之 多胜肽為介白素。最近報導IL· 1 〇與IL-12在肺部防禦機制上 扮演一重要角色，在小豬中對抗PRRSV之感染(Chung and Chae, 2003)。豬隻應付PRRSV感染之能力可能與感染期間 5 IFN-γ之低含量有關（SURADHAT ei β/.，2003)。IL-12為可誘 發性細胞激素，係由二聯結之次單元(ρ35與ρ40)組成，其可 誘發IFN於Τ細胞與天然殺手細胞中表現。因此，較佳之介 白素為，如IL-2、IL-10或IL-12。在一較佳實施例中，其為 介白素12 (IL-12)，而在一最佳實施例中，其僅為IL-12之ρ35 10 次單元。 複製勝任TGEV載體可為感染性或非感染性。含有至少 所有核酸複製所需之序列乏核酸，可產生一或數種外殼蛋 白，且會將外殼蛋白與病毒顆粒組合，對其他細胞產生感 染性，稱之為感染性核酸，依據本發明。 15 在一較佳觀點中，本發明係提供一種病毒顆粒，其包 含上述核酸，以及至少一TGEV外殼蛋白。該病毒顆粒可包 含大於一種，甚至所有之TGEV外殼蛋白。相對應之病毒顆 粒可進入宿主細胞，藉由感染方式。然而，此種病毒顆粒 之核酸可為感染性或非感染性，由於其不需要編碼所有製 20 造病毒顆粒所、需之TGΕV外殼蛋白。若該核醆為非感染性核 酸，符合本申請書’該病毒顆粒係利用組裝宿主細胞，或 互補於TGEV基因之輔助病毒而製備。使用組裝之宿主細胞 或辅助病毒，以獲得含有不完整病毒基因體之病毒顆粒， 為技術上已知。此方法具有特定之優點’由於病毒顆粒本 < S ) 20 身便具感染性(即，可一次感染一細胞），但該核酸無法產生 其他感染性病毒顆粒。換句話說，衍生自TGEV之該序列並 不編碼可與核酸組合形成新病毒顆粒之蛋白。因此，這些 病毒顆粒非常安全，且會提供高度免疫反應對抗該核酸表 5 現出之表位物。 依據本發明之另一實施例，該TGEV蛋白與該核酸序列 多且合而成之TGEV感染性病毒顆粒，為減毒病毒顆粒。此具 有優點為，使用本發明核酸治療之個體，接種疫苗後可同 時對抗TGEV以及PRRSV。 10 本發明之核酸可包含編碼TGEV所有蛋白之序列。此 外，該核酸可包含僅編碼複製勝任TGEV載體所需之TGEV 蛋白之序列。因此，該核酸較佳編碼TGEV複製酶。依據一 特佳實施例’該核酸編碼一複製勝任，但非感染性之TGEV 载體，其包含編碼TGEV複製酶與TGEV N蛋白，並無其他 15 TGEV蛋白之序列。此載體具有特定之優點，TGEV體可在 宿主細胞中大量複製，因而製造大量之表位物。同時，此 載體相當安全，因為其為非感染性。 術語“核酸編碼TGEV蛋白”使用於此係指一核酸序 列，如同PENZESdfl/. (2001)所揭示者，或與這些序列具有 20 至少60%，較佳至少75%，最佳至少95%相似度之核酸序 列。例如’特定之另一序列可用於分辨TGEV疫苗接種動 物，與經TGEV感染動物（如同下列詳細敘述）。在本發明示 範之TGEV基礎載體中，相對應之核苷酸取代基已使用 RT-PCR，分別導入位置6752、18997、20460與21369。特 21 別的是’使用於此之編碼TGEV複製酶，或tgev之N蛋白' Μ蛋白、E蛋白或S蛋白之核酸序列，係指如PENZES α/ 2001所揭示之核酸序列（具有或不具上述之修正）。當然，亦 可使用其他TGEV株，或包括其他刪除、取代、插入或加入 至該核酸序列。因此’依據另一觀點，該TGEV序列不同於 PENZES ei α/_所揭示之序列，但仍具有與這些序列至少 60% ’較佳至少75%，最佳至少95%相似度。 術語“編碼PRRSV蛋白之核酸”使用於此係指prr§v野 生型核酸序列，或與這些序列具有至少60%，較佳至少 75%，最佳至少95%相似度之序列。 用於本申請案之目的，序列相似度係使用Clustalw電 腦程式’得自於European Bioinformatics Institute (EBI)，決 定，除非另有指出。 感染性TGEV載體不需包含基因3a、3b與7，如同已知 為非必需者。由TGEV之基因3a、3b與7編碼之蛋白，可調 節對抗TGEV之免疫反應，且希望調節TGEV與宿主之交互 作用，這些基因可維持於TGEV載體中。 此外’感染性TGEV載體已經改造，表現PRRSV抗原於 TGEV基因體之不同位置’如取代nsp2蛋白’或介於複製骑 多蛋白nspl與nsp2蛋白間，類似者係描述於MHV與 HCoV-229E (Graham βί α/.，2005; Hertzig e，α/., 2004)。 此外’由於PRRSV感染後中和性抗體之延遲出現，可 歸因於誘餌表位（高抗原性)之出現，或由調控T細胞辨識出 之表位之出現，會抑制強免疫反應，其他感染性TGEV載體 1358455 已改造為表現PRRSV Μ與Gp5之經修飾版本。在此經改造 之Gp5蛋白中，該誘餌表位與τ_調控細胞表位已經剔除，維 持經突變之Gp5之能力，與μ蛋白交互作用，因此，增進重 組病毒之穩定性。 5 本發明具有該核酸之蛋白編碼序列，較佳係聯結至宿 主細胞或生物體中控制些基因表現之序列上。這些編碼 表位或其他多胜肽之基因，可，例如，側接轉錄調控序列 (TRS)及/或内部核醣體進入位置(ires)序列，以增加蛋白編 碼序列之轉錄及/或轉譯。TRS與IRES序列為技術上已知。 10較佳該TRS為基因3a之TRS，其中若雙順反子載體編碼二抗 原’第二TRS較佳為合成之TRS，衍生自N基因（TRS22N; SEQ ID NO: 19)。 本發明之核酸可為DNA或RNA形式。在本發明範_ 中’係包含特定之重組RNA分子，其由上述核酸之一所編 15 碼。 在一較佳實施例中，該核酸包含PRRSV之ORF5與 ORF6序列’每一者皆在個別之表現調控序列控制下。 在一較佳實施例中，該核酸係由（1) PRRSV之ORF5序 列’在基因3a之轉錄調控序列之控制下、（2) PRRSV之ORF6 20 序列，在如SEQ ID NO: 19之轉錄調控序列TRS22N之控制 下’以及(3) S基因序列，衍生自TGEV之PTV減毒株，組 成。此S蛋白之一範例為SEQHDNO: 1。 依據本發明之另一觀點，本發明係相關於一種載體， 包含任一上述核酸。該載體可為cDNA載體，較佳為BAC衍 < S > 23 1358455 生載體’如bac-tgevfl。該載體較佳可在特定宿主細胞或 數種宿主細胞中複製核酸。 宿主細胞，其包含一載體，含有任一上述核酸，為本 - 發明之另一目的。該細胞可為細菌細胞'酵母菌細胞、昆 • 5蟲細胞、動物細胞或人類細胞❹依據一較佳實施例，該細 胞為豬睪丸（ST)細胞株，如寄存於ATCC CRL_1746之細胞 株。 φ 本發明更相關於一種多胜肽，包含0RF5與0RF6之中 和性表位》在一實施例中，此多胜肽係由〇RF5與〇RF6之 10中和性表位所組成，並由SEQ ID NO:13所編碼，或由具有 與SEQ ID NO: 13相似度90%之序列所編碼。在另一實施例 中’此多胜肽係由ORF5與〇RF6之中和性表位，以及LIMp_n 之溶酶體標無序列所組成。在一較佳實施例中，此多胜狀 係由ORF5與ORF6之中和性表位，以及UMp iI之溶酶體標 -15靶序列所組成，且由seqidno: 14所編碼，或由具有與 • SEQ ID NO: 14相似度90%之序列所編碼。 本發明更相關於-種醫藥組成物，包含本發明核酸、 病毒性RNAs、多胜肽或載體之任一者，或上述之宿主細 胞。該醫藥組成物更可包含一或多種醫藥上可接受之載 20劑、賦形劑，及/或佐劑。 ^在本發明之—尤佳實施例中，係相關於—種疫苗，可 保。蔓動物對抗由感染性病毒引起之疾病，包含本發明之核 酸=毒性RNA '載體、多胜肽或宿主細胞之任一者: 該疫田亦可包含-或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑， 24 1358455 及/或佐劑。
適用於經由黏膜路徑投藥基因性疫苗與免疫原之佐劑 與載劑，為技術上已知》—般之載劑與佐劑，可回顧於， 如Kiyono ei α/·，1996。加入趨化素(chemokines)，其可用於 5調節免疫反應，亦包含於本發明範疇中《個別之化合物與 其醫療用途可回顧於T〇KAei α/.，2004。其優點為可使用顆 粒細胞/巨嗟體菌落-刺激因子、介白素_2 (il-2) ' IL-12、 IL-18。IL-12為可誘發之細胞激素，由二聯結之次單元(ρ35 與Ρ40)組成，其可誘發IFN於Τ細胞與天然殺手細胞中表 10現。已報導重組单鍵IL-12 (IL-12)可作為佐劑，與強化之 PRRSV-特異性INF-γ產生細胞之prrsv疫苗株共投藥（Foss α/.，2002)。IL-12亦可降低PRRSV在細胞培養物中之效 價’並降低經PRRSV-感染之動物之病毒血症，顯示il_i2 可強化抗原特異性細胞媒介免疫之發展，並促進正^丫在經
I5 PRRSV感染動物肺部之產生（Carter and Curiel，2005)。 IL-12投藥之一限制為p40次單元之過量表現，相對於05次 單元’且顯然，p4〇雙體會結合至IL-12受體，並作用為il_12 20 拮抗劑。最近已發現IL-12 p35次單元作為分子佐劑之表 現，可增強體液與細胞-媒介之免疫反應，與IL_12p4〇無關 (Osorio and Ghiasi，2005)。利用數種細胞激素與趨化素之 組合療法亦可使用。此外，由於T細胞之記憶性發育所需， 涉及關鍵細胞激素如IL-15與IL-23之強化劑，可證實對於^己 憶池(memory pool)之長期維持是有助益的。 該疫苗較佳適用於治療一動物，例如豬。較佳係接種 25 (S ) 1358455 至母豬。 依據本發明，係提供一種疫苗，其較佳可誘發系统性 免疫與黏膜性免疫反應，對抗PRRSV及/或TGEV。 該疫苗更可為多價疫苗，其可提供保護對抗一或多種 5 其他豬隻病原體。因此，多價疫苗更包含衍生自其他病毒 性及/或細菌性病原體及/或蛋白之抗原，其可提供免疫性對 抗病原體。其他病毒性病原體之抗體範例包含衍生自緒流 感病毒、豬細小病毒、豬環病毒第2型、典型豬痕、非洲豬 盘、口蹄疫、偽狂犬病毒、豬環病毒第1型、豬腺病毒、諸 10 腸病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬輪狀病毒、腦心肌炎病 毒、豬流行性腹瀉病毒、藍眼症病毒、E型肝炎病毒，及/ 或西尼羅病毒、立百（Nipah)病毒之抗原。較佳使用衍生自 其他病毒性病原體，選自於豬流感病毒、豬細小病毒、豬 環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟，及/或口蹄疫之—或 15 多者之抗原。 細菌性病原體之抗原範例包括衍生自細菌病原體，選 自於豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎 玫線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬 放線桿菌（Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌（Haemophilus 20 Parasuis)、A型巴斯德桿菌（pasteurella multocida type A)(毒 素）、D型巴斯德桿菌（pasteurella multocida type D)(毒素）、 支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica)、豬等抱球 蟲（Isospora suis) '豬痢疾蛇形螺旋菌（Brachyspira hyodysemeriae)、結腸菌毛樣短螺旋體（Brachyspira < S ) 26 1358455
pilosicoli)、胞内勞森菌（Lawsonia intracellularis)、红斑丹 毒絲狀菌（Ery.sipelotbrix rhusiopathiae)、大腸.桿菌 (Escherichia coli)、沙門氏腸炎桿菌（Salmonella enterica)、 肘徵漿菌（Mycoplasma hyorinis) ' 豬鏈球菌（Streptococcus 5 suis)、格蘭氏陽性產抱菌（Clostridium perfringens)、梭狀芽 胞桿 g (Clostridium difficile) ' 諾氏梭菌（Clostridium novyi)、布氏桿菌（Brucella abortus)，及/或暫定螺旋菌 (Candidatus helicobacter suis)。較佳使用一或多種抗原，衍 生自細菌病原體’選自於豬肺炎支原體（Mycoplasma 10 hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線桿菌（Actinobacillus suis)、副豬嗜 jk 桿菌（Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿 菌（Pasteurella multocida type A)(毒素）、D型巴斯德桿菌 (Pasteurella multocida type D)(毒素）、支氣管敗血波氏桿 I5 菌（Bordetella bronchiseptica)、豬等抱球蟲（isospora suis)、 豬痢疾蛇形螺旋菌（Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛 樣短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)、胞内勞森菌（Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌（Erysipd〇thdx rhusiopathiae)、大腸桿菌（Escherichia coli)，及/或沙門氏腸 20 炎桿菌（Salmonella enterica) 〇 其他病毒性或細菌性抗原可存在於多價疫苗中，作為 減毒或去活性病毒或細菌。此外，該多價疫苗可包含一核 酸序列’編碼一或數種其他病毒性或細菌性抗原。該序列 可位於同一核酸分子中’其亦編碼TGEV與PRRSV序 27 列H存在於疫苗中’作為單獨之紐分子。 多價疫苗可更包含一核酸序列，其編碼對抗諸隻病房 之蛋白M®別之核酸序列可編碼_或數種抗體，具有細菌 性，病毒性錢料性。此外_外地，肺酸可編瑪諸 曰叩蛋白之序列，且可用於作為對抗由普昂蛋白引起之疾 病之疫田。同樣地’編碼該可提供保護對抗豬隻病原之蛋 白之序列’可位於亦編碼tge^prrsv序列之同一核酸 分子中，或可存在於疫苗巾，作為單狀減分子。^ ^些疫苗可依據數種技術上常用之方法投藥。特別的 是’疫田可經肌内、靜脈内、鼻内、陰道内、口鼻投藥， 或技術上任一其他常用方法投藥。 該疫苗可為經修飾之活疫苗，或去活性(死）疫苗。 經修飾之活疫苗（MLV)可由病毒或細菌中單離出而 得。該病毒可經減毒，係指其無法致病，但仍可於宿主細 胞中複製，因而可刺激免疫反應（pANLEY a/, I%} PASTORET ei α/., 1997)。 去活性（死）疫苗可藉由培養病毒或細菌，之後去活化或 殺死生物體’使用加熱或化學物質，而得。在去活性（死） 疫苗中，佐劑係加入該死亡生物體之抗原相，以支持免疫 系統之刺激’由於死亡之病毒或細菌，在缺乏佐劑之情況 下’無法輕易地被免疫系統辨識出。該佐劑更可維持死亡 之生物體於注射位置，因此提供足夠之時間給免疫細胞反 應（PANLEY ei fl/·，1989; PASTORET ei α/_, 1997)。去活性之疫 苗可為死病毒、死細菌（亦稱之為bacterins)，或死毒素（或類 毒素）。 在較佳實施例中，該疫苗為去活性疫苗，以豬環病 毒(PCV)第1型·第2型去活性疫苗稀釋（FENAUX心，2〇03, 2〇〇4)，其已具有硫化脂質環糊精佐劑。在—較佳實施例 中，該去活性疫苗係以豬環病毒(PCV)第1型-第2型去活性 疫苗稀釋，其已具有2G %之硫化脂質-環糊精佐劑。在另- 較佳貫把例中，該去活性疫苗係經緒環病毒(PCV)第1型-第2型去活性疫苗以1:3稀釋。 、疫田較佳含有TGEV/PRRSV核酸，以製造活病喜， ^賈範圍為_4㈣9，最佳為約1〇5至Π)8。該活病毒之效 4貝係以ST細胞中溶菌斑形成單元決定。 本發明之疫苗可允許此技術領域者，診斷一動物是否 ^野生型病毒感染’或已被接種疫苗。因此，依據另-觀 點本發明係相關於診斷一動物是否經病毒感染，或已接 種本發明疫田’該方法包含數個步驟，其中該診斷係使用 特異於野生型病4，而非由疫苗株(即3a、3b、7或E)表現之 抗體。接種TGEV^苗之祕與經TGEV感染之動物之差異 性，亦可使用RT-PCR決定，序列標記係於位置6752、 刪7、2〇46〇與21369引入重組T(}Ev基因體，其分別編碼 G、C、。 接種疫苗動物與經野生型PRRSV感染之動物之差 異’可使用特異於重組病毒中未出現之蛋白之抗體而決定。 棘蛋白（S)基因-般具有缺點，僅提供呼吸道或腸道之 者之趨性。然而，技術上所述之植株則可提供呼吸道與 腸道雙重趨性。然而’此S基因並未提供相對應病毒於細胞 培養物中或體内高效價之表現，或缺乏雙重趨性，A細吟 培養數代後。目前為止，並無S基因描述可提供呼吸道與腸 道雙重趨性，在豬睪丸（ST)細胞組織培養中分代相當穩 5定，並提供TGEV之高效價（>108)，當培養於st細胞之組織 培養物時，且不會喪失體外雙重趨性。 因此，在本發明之另一觀點係相關於一種核酸，其包 含一序列，具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列，其 中該與SEQ ID NO: 1具有至少95%相似度之序列所編碼之 !〇 蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在 時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染 之特徵為具有至少lxlO7 PFU之病毒效價於經TGEV感染之 ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸 道組織；以及具有至少lxl〇6 PFU之病毒效價於經TGEV感 15 染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物 腸道組織。更佳為，該核酸包含如SEQ ID NO: 1所示之序 列。 TGEV感染動物呼吸道與腸道組織之能力’係以範例17 所述決定，使用ST細胞上之溶菌班效價測定試驗’其中培 2〇 養之ST細胞係經由感染後2天之感染動物體組織所得之病 毒感染。在此情況下，由ST細胞獲得之病毒效價，可作為 經感染動物體内重組TGEV之活性指標。 在另一實施例中，上述之核酸包含一序列，具有與SEQ 田NO: 1至少95%相似度之序列，其中該與SEQ ID NO: 1 30 1358455 _ 具有至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘 蛋白，當以TGEV病毒之-部分存在時，可誘發諸隻呼硬道 與腸道中之TGEV感染’其十該感染之特徵為具有至少 1x107PFU之病毒效價於經TGEV感染之5丁細胞中該病毒 衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；以及具有 至少IxlO6 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中了該 病毒衍生自感染後2天之動物之丨克動物腸道組織不包含
編碼PRRSV之ORF5之序列或編碼其中和性表位之片段 在本發明之另一觀點中，係相關於一種載體，包含上 10述核酸’具有與SEQID NO: 1至少95%相似度之序列，其中 該具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列所編碼之蛋 白為棘蛋白’該棘蛋白’當以TGEV病毒之一部分存在時， 可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特 徵為具有至少lxlO7 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細 15 胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組 織；以及具有至少lxlO6 PFU之病毒效價於經TGEV感染之 ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道 組織。在一較佳實施例中，這些載體可為cDNA載體，更隹 為BAC-TGEV載體。在另一較佳實施例中，該載體可於宿 20 主細胞中複製該核酸。本發明亦相關於一種宿主細胞，包 含上述之載體。
本發明之另一觀點為，該棘蛋白係由具有與SEQ 10 NO: 1至少95%相似度之序列編碼，該棘蛋白，當以TGEV 病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV (S> 31 1358455 感染，其中該感染之特徵為具有至少lxio7 PFU之病毒效價 於經TGEV感染之ST細胞中’該病毒衍生自感染後2天之動 物之1克動物呼吸道組織；具有至少lxl〇6 PFU之病毒效價 於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動 5 物之1克動物腸道組織。
本發明更相關於一種病毒顆粒，包含如上所述之核酸。 此外，一包含上述核酸之醫藥製劑，該核酸具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列，其中該與seq id NO: 1 至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋 10 白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與 腸道中之TGEV感染’其中該感染之特徵為具有至少ιχ1〇7 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生 自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；以及具有至少 1x106PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒 15 衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織、一包含此核 酸之載體、一包含此載體之宿主細胞，或由此核酸編碼之 棘蛋白，皆為本發明之觀點。 此外，本發明更包含一疫苗，含有具有與SEQ ID NO: 1 至少95%相似度之序列，其中該與SEQ ID NO: 1至少95%相 20 似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV 病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV 感染’其中該感染之特徵為具有至少lxl〇7 PFU之病毒效價 於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動 物之1克動物呼吸道組織；以及具有至少lxl〇6 PFU之病毒 32 1358455 效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天 之動物之1克動物腸道組織、一包含此核酸之載體、一包含 此載體之宿主細胞，或由此核酸編碼之棘蛋白。 圖示簡要說明： 5 第1圖顯示小豬在體内接種表現PRRSV Gp5之rTGEVs 後’體重測量之結果。小豬係接種表現Gp5之rTGEVs，使用 丁1^3303-丁11533-〇1^5;方形標記)或丁1^咖（八3-丁1^221^〇1^5; 三角形標記）。小豬體重係於感染PRRSV後1、2、3與4週測 量。接種表現PRRSV Gp5之重組病毒之小豬會有效地增加 1〇 體重（即正常發育）’其中該接種控制組(“C·”)之小豬則顯示 出發育缺陷，僅有些許體重增加。 第2圖顯示ELISA試驗之結果，偵測特異於prrsv N (ORF7)之抗體。經表現PRRSV Gp5之rTGEVs (不論是 △3-TRS3a-ORF5或M-TRSwORFS)感染之小緒，或是經未 15表現〇RF5與ORF6之病毒載體感染之小豬（未接種疫苗控制 組)之jk清樣本’係於PRRSV感染後2、3與4週後收集。無 或僅有少量之PRRSV蛋白N可於接種疫苗小豬中偵測到， 在小豬經PRRSV感染後，與未接種疫苗控制組相較。因此， 當△S-TRSh-ORFS可提供對抗PRRSV之完整保護， 20 △S-TRSkn-ORFS則可提供對抗PRRSV之部分保護。相對 地，控制組之動物並無法提供對抗PRRSV之保護。 第3圖顯示北方墨潰(Northern-blot)之分析，顯示表現 PRRSV Gp5之rTGEVs之穩定度。表現Gp5之重組TGEV病毒 (使用不論是TRS^或TRS22N)係於組織培養物中分代。§丁細 (5 ) 33 1358455 胞係以第2代(p2)與第5代(p5)之病毒感染。如圖所示，P2病 毒會表現Gp5mRNA，其中p5病毒含有缺失現象，不會表現 Gp5 mRNA 〇 第 4 圖顯示編碼 pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-〇RF5- 5 TRS22n_〇RF6(c3〇6t)之cDNA之圖不結構。如圖所不，異源性 PRRSV基因0RF5與0RF6係選殖至同一 rTGE V病毒性載體 上。 第5圖顯示PRRSV之Gp5 (0RF5)於ST細胞中之表現， 該細胞經表現PRRSV Gp5與Μ蛋白之TGEV 10 (pBAC-TGEVFL-SpTv-TRS3a_〇RF5-TRS22N_〇RF6(c3〇6T))感 染，以免疫螢光分析評估（係使用特異於TGEV N蛋白之抗 體觀察病毒（紅色），以及使用特異於？11113¥01^5(〇?5)蛋 白之抗體觀察Gp5表現細胞（綠色））。在組織培養20代之後 (包括複製步驟），該病毒係回收，並使用於感染ST細胞。 15 此分析顯示80%之感染細胞會表現Gp5，以及100。/。之這些 細胞為Μ蛋白陽性（圖上未顯示）。此圖亦顯示該雙順反子建 構物具有增進之體外穩定性，並在培養中分代20代之後仍 維持穩定。
第6圖顯示第5圖經感染細胞之FACS分析結果。特異於 2〇 TGEV N蛋白之抗體係用於偵測重组病毒，其中Gp5表現細 胞係使用特異於Gp 5之多價抗體觀察。此資料清楚顯示8 0 % 經表現有PRRSV Gp5與Μ蛋白之重組TGEV (pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T))感染 之細胞，在組織培養分代20代之後（包括複製步驟），仍會表 < S > 34 1358455 現PRRSV Gp5。此現象再度顯示表現蛋 白之rTGEV之體外穩定性。 第7圖為RT-PCR分析之結果，顯示表現有〇RF5與〇RF6 (Μ)之重組TGEV之穩定性，在ST細胞中分代後。該重組 5 TGEV係於組織培養物中分代20次。由培養細胞中回收之病 毒為溶菌斑植株，且6個植株(cl至C6)表現之mRNA，係以 RT-PCR決定。如圖所示’ 100%之植株皆表現mRNA-ORF5 與mRNA-ORF6。此結果顯示表現有〇RF5與ORF6之重組 TGEV之基因體，可於細胞培養物中分代2〇次後，仍維持穩 10 定。 第8圖顯示西方墨潰（Western blot)分析結果，偵測 PRRSV Gp5蛋白（0RF5 ;左方墨潰）與Μ蛋白（0RF6 ;右方 墨潰）於豬睪丸細胞之細胞裂解物中之表現，該細胞經重組 病毒 rTGEV-SpTv-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6(c3〇6T)(圖中縮 15 寫為rTGEV-SPTV-ORFs5+6)，或控制組病毒(rTGEV-SPTV-FL) 感染。此外，數個控制組係用於西方墨潰（“mock” ：無病 毒感染之豬睪丸細胞；“PRRSV” ：經純化與濃縮之野生型 PRRS病毒；“MA104+PRRSV” ：非洲綠猿腎細胞株，經野 生型PRRS病毒感染）。各蛋白可於裂解物中偵測，得自經重 20 組病毒 rTGEV-SpTvTRS3a_〇RF5-TRS22N_〇RF6(c306T)感染之 細胞、經PRRSV病毒感染之細胞，以及經MA104+PRSSV 感染之細胞），如箭頭所示。
第9圖顯示體内接種後，表現PRRSV Gp5與Μ之重組 TGEV成長分析。使用於此分析之病毒含有S基因，如SEQ 35 1358455 · ID NO: 1所示，提供腸道與呼吸道趨性。該圖顯示病毒於 取自接種疫苗之小豬之肺部（圓形標記）與腸道（方形標記） 之ST細胞中之成長動力學。組織樣本係於接種表現PRRSV Gp5與Μ之重組TGEV後1、2、3與4天後收集。
5 第10圖顯示表現PRRSV Gp5與Μ之重組TGEV (pBAC-TGEVFL-SpTv-TRS3a-〇RF5-TRS22N-ORF6(c3〇6T))之穩 定性分析結果，在體内投以回收自豬隻之病毒後。抗體係 使用於免疫螢光試驗中，以偵測PRRSV Gp5 (上圖之綠色部 分）、PRRSV Μ (下圖之綠色部分），及TGEV N (红色部分) 10 陽性ST細胞’經回收自接種疫苗小豬之肺部之病毒感染。 結果顯示表現PRRSV Gp5與Μ之重組TGEV相當穩定，甚至 在體内接種並自接種疫苗動物體内回收後仍是。該資料顯 示80%之經感染細胞會表現(3p5蛋白，且1 〇〇%之經感染細 胞亦會表現Μ蛋白。 15 第U圖為流程圖，顯示使用重組病毒 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)，組成二疫苗 配方。 第12圖為一表格，顯示重組病毒 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)，在經由鼻内 20 路控接種2xl07 pfu/ml之兩天大小豬之目標組織中（肺)之複 製與繁殖之評估。此結果由病毒效價測定與組織學決定。 第13圖為免疫組織化學圖，分別得自第1組與第2組豬 隻之肺部組織切片，顯示冠狀病毒感染之間質性肺炎。該 切片特徵為肺泡壁增厚，由於淋巴球與巨噬體滲入，且肺 36 泡空間被單核球渗人物填滿(淋巴球與巨健），有時是多形 核嗜中性白血球。 第14圖顯示競爭性ELISA之結果，使肢聊抗體， 於接種經修飾活疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物 相較DO PV之吸收係用於計算每一血清中之結合百分比， 使用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗_印5抗體 存在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間 之吸收值差異與結合百分比’符合統計相關性㈣試：p值 <0.05) 〇 1〇 第15圖顯示特異性免疫過氧化酶單層試驗(IPMA)之結 果，用於偵測豬肺泡肺噬菌體中之PRRSV，該豬隻經得自 接種疫苗與控制組豬隻之血清樣本感染。 第16圖顯示抗-TGEV(圖A)與抗-Prs sV抗體（圖B)之偵 測結果，藉由間接ELISA，以有色受質之吸收波長展現。 15 Vacc.代表由接種疫苗動物獲得之血清，“ctr】，，代表由未 接種疫苗動物獲得之血清，“CP”與“CN”分別代表陽性與陰 性控制組。由接種疫苗與控制組動物獲得之血清係稀釋6〇· 倍0 第17圖反映對於TGEV與PRSSV有陽性免疫反應之動 20物百分比，使用丨:仙之稀釋倍數。圖A為一摘錄結果之表 格，其中該圖顯示陽性動物之百分比，以圖示形式（圖B為 抗-TGEV，圖C為抗-PRRSV)。“Vacc.”代表由接種疫苗動物 獲得之血清，“Ctrl.”代表由未接種疫苗動物獲得之血清。 第18圖顯示競爭性ELISA之結果，使用抗_gp5抗體，於 37 1358455 接種去活性疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物相 較。D Ο P V之吸收係用於計算每一血清中之結合百分比，使 用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗-gp5抗體存 ' 在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間之 ' 5吸收值差異與結合百分比，符合統計相關性(t測試： <0.05)。 第19圖顯示定量即時RT-PCR (qRT-PCR)之結果，用於 φ 定量血清樣本中之PRRSV效價，該樣本或得自接種疫苗或 未接種疫苗之動物中。 10 第20圖顯示編碼ORF5-LIMP-II融合蛋白之①取，以 及其對於感染細胞抗原呈現之作用。 第21圖顯不編碼Ub-ORF5融合蛋白之cDNA，以及兑 對於感染細胞抗原呈現之作用。 第22圖顯示重組TGEV與嵌合性S蛋白之建構。該圖顯 15示S基因與原始TGEV單離物TGEV-P.UR46-PTV與 • TGEV-PUR46-C11，其5’序列區域之差異性（請見左圖上 方）。圖中標示出之核苷酸反映了該二序列之不同，而右圖 垂直部分則代表三個核苷酸被刪除。核苷酸之位置係由圖 最上方數字指出。該圖更顯示數個s基因突變物之序列， 20與原始TGEV單離物TGEV-PUR46-PTV相較❶每一重組病毒 之體内效價’在經感染新生小豬之腸道與肺部，亦於圖中 指出。 第23圖顯示原始TGEV與重組TGEV-PUR46-S7.1之成 長動力學。新生三天小豬接種3xi〇8 pfu每隻小豬劑量後， 38 1358455 係測量這些病毒之成長。動物係於指定天數下犧牲，每克 組織之病毒效價，係以ST細胞上之溶菌斑效價測定數決 定。（) ’肺部之病毒；（*) ’腸道之病毒。所指出之數值係 對應於三獨立實驗之中間值。 5 下列範例係說明本發明核酸之建構與使用。 範例1 真核細胞生長 TGEV的生長、效價測定與純化係於ST(豬睪丸）細胞 内進行’其為緒隻胎兒睪丸表皮細胞株（McClurkin與 10 Norman ’ 1966)。ST細胞得自 L. Kemeny (National Animal Disease Centre，Ames，Iowa，USA)。 質體轉染作用分析於幼體倉鼠腎臟細胞(BHK-21)内進 行，係穩定表達緒胺胜肽酶N(aminopeptidase N) (ΒΗΚ-ρΑΡΝ)的基因（Laude等人，1990)。ST細胞培養於 15 DMEM (杜氏培養液），其添加10%胎牛血清（FCS) (GIBCO-BRL)、50 mg/mL慶大黴素、2mM麵醯胺酸與1% 非必需胺基酸。 將豬胺胜肽酶N譯碼基因穩定轉染於BHK-21 (ΒΗΚ-ρΑΡΝ)並培養於DMEM (杜氏培養液），其添加10% 20 胎牛血清(FCS)(GIBCO-BRL)、50 mg/mL慶大黴素、2 mM 麵驢胺酸與1%非必需胺基酸，並以Geneticine (G418) (1.5 mg/ml)為篩選試劑。 範例2 利用質體電穿孔法進行細菌轉形作用 39 1358455 菌種： 以大腸桿菌 DH10B (Gibco/BRL)(HANAHAN等人，1991) 作為所有欲建構質體之宿主。本菌種之基因型為：F-mcrAA (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(1/<2ΓΖΔΜ15 AlacX.14 deo^i recA\ 5 araD139 (izrajew) 7697 容β/U ga/K λ- aiw/?G。 製備電穿孔法腺杯細a : 欲增量與生產電穿孔法勝任co/i DH10B細菌，將細 菌培養於SOB培養基。將新鮮培養皿中挑出之菌落培殖 於10 mL SOB培養基中（20 g/L胰化蛋白、5 g/L酵母菌萃取 10物、〇.5 g/L NaCl) ’並於37°C下搖晃培養12 h。取2 mL培 養液加入1 L SOB培養基中繼續培養，並於37。(：下培養至 600 nm光學密度值介於0.8與〇.9吸光單位之間。隨後培養基 於冰上冷卻20分鐘，且細菌於4°C下以Sorvall GSA轉子進行 4.000xg離心15分鐘。將細菌再懸浮於1 l冷的10%甘油中。 15細菌懸浮液再次離心，並再懸浮於500 mL冷的10%甘油 中。細菌經沈降並再懸浮於250 mL冷的10%甘油中。最後， 細菌經離心並再懸浮於3 mL 10%甘油。最終懸浮液以50 及100 μί體積分裝，並保存於_7(TC直到電穿孔法進行。細 菌轉形作用效率之計算係利用電穿孔法並以一已知濃度之 20 PBluescript質體做為參考，發現其效率為每微克DNA約1〇9 菌落且具再現性。 以質體電穿孔法進行細菌韓形作用： 以50 pL轉形作用勝任細菌混合1 的各反應混合 物，或將10 ng之經純化質體加入細菌中，並於冰上培養1 40 1358455 分鐘。隨後，將混合物移至0.2 cm電穿孔E(Bio-Rad)中， 並於“基因脈衝”電穿孔儀(Bio-Rad)上，以2.5 kV電脈衝、25 pF與200 Ω進行轉形反應。在加入1 mL冷的LB培養基之 後’細菌於37°C下搖晃培養1 h。以50至100 μι之間的.經轉 5 形細菌懸浮液種植於LB (Luria-Bertani培養基）固體培養皿 (15 g/L瓊脂）’其添加胺苄青黴素(ampiciiiin)( 1 〇〇 pg/mL)或 氯黴素(chloramphenicol)(34 pg/mL)。細菌於37。(：下生長 16 h (Bullock等人，1987)。 在質體的產生與純化方面，細菌以質體進行轉形作 10用’具備胺苄青黴素或氣黴素抵抗力者可於培養皿上形成 單獨菌落，並於液體LB培養基中繼續培養，其添加1〇〇 pg/mL胺苄青黴素或34pg/mL氣黴素。 範例3 PCR產物之選殖質體 15 以PGEM-T (Promega)質體選殖PCR產物。此質體含有 T7與SP6細菌病毒驅動子並被LacZ基因隔開，且在多重選 殖序列内存在兩個突出的T序列。此質體以胺苄青黴素抵抗 基因進行篩選。. 範例4 20 DNA操作 選殖與限劁醢： 在DNA操作與選殖方面，限制酶、5心I、5//7 I、五co RI、Af/W I、I、心所I、恐<? I係購自R0Che或 New England Biolabs。DNA末端去磷酸化之進行係利用蝦 41 1358455 鹼性磷酸酶（SAP) (USB)。DNA接合酶使用如T4病毒DNA 接合酶(New England Biolabs)。所有限制酶、去磷酸化反 應與DNA接合作用的進行係採用標準程序，如前人所述 (Sambrook等人，1989)。 5 聚合醢連鎖反應(PCR): 欲由模板或常見之質體進行DNA增量，以50-100 ng質 體DNA混合相應之募核苷酸（10 μΜ)、0.25 mM脫氧核苷三 填酸(ATP、GTP、TTP與 CTP) ' 1.25 mM MgCl2、PCR缓 衝液（10 mM Tris-HC卜 pH 8.3、50 mM KC1)與2.5 U Taq 10 Gold DNA聚合酶（水生棲熱菌）（Roche)使最終體積為50 gL。反應以 GeneAmp PCR System 9600熱循環機（Perkin Elmer)進行。 以琯膠電泳分離DNA : 欲分離DNA片段，使用1%瓊膠與溴化乙錠（1 pg/mL) 15 並溶於IX TAE緩衝溶液（40 mM Tris-乙酸鹽、ImM EDTA)。 DNA純化： 以抗生素篩選生長之細菌質體，其純化係利用 “Qiaprep Spin Miniprep kit”（Qiagen)製備小量質體DNA， 20 或 “Qiafilter Midi-Plasmid Kit” 系統(Qiagen)製備大量質體 DNA。由瓊膠上取得的DNA，其純化係利用“QiaEx II Gel Extraction Kit”系統（Qiagen)。PCR產物之純化，係利用 “QIA quick PCR Purification Kit”（Qiagen)進行。所有過程 均依操作說明進行。 42 1358455 範例5 RNA分析 以TGEV殖株PUR46-MAD感染所產生的RNA分析方 面，以60 mm直徑培養jm(NUNC)培養，並鋪滿單層ST (豬 5 睪丸)細胞，並以MOI [感染增殖率]=1之病毒接種數進行 感染。細胞於16 hpi [感染後時數]進行溶解，係利用 “RNeasy Mini Kit”（Qiagen)並依操作說明進行(Qiagen)。 RNA經純化並且再懸浮於40 μί經DEPC [焦碳酸二乙酯]與 20 U RNAse抑制劑(Roche)處理之水中。 10 範例6 感染性TGEV之cDNA殖株轉染作用與回收 ΒΗΚ-ρΑΡΝ細胞（Delmas，1994)於杜氏培養液 (DMEM)中生長，其添加2%胎牛血清（FCS)並以 Geneticin (G418) (1.5 mg/ml)作為篩選試劑。 15 ΒΗΚ-ρΑΡΝ細胞於直徑35-mm培養皿内長至60%滿，並 以 15 μΐ或 12 μΐ lipofectin (GIBCO Life Technologies) 或 lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染 10pg 或 4pg pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T) 質體，係依據操作說明進行。細胞培養於37〇C、5%C02達 20 6 h後，以新鮮並含有5% (vol/vol) FCS的DMEM更換轉染培 養基。兩天後（意指第〇代），收集細胞上清液，並分代 (passaged)新鮮的ST單層細胞四次，以增加rTGEV效價 (titer)。病毒效價之決定係利用溶菌斑效價測定（piaque titration)。 (S ') 43 1358455 或者，ST細胞培養於25 cm2培養角瓶並於含1〇% FCS (杜氏培養液）中長至9〇%滿，每個細胞以Mo〗[感 染增殖率]=1之溶菌斑形成單位[pfu]進行感染。上清液於 48小時後回收，並以溶菌斑限制稀釋法進行效價測定。 5 溶菌斑效僧測宗：
病毒之效價測定係利用溶菌斑限制稀釋分析法，以定 量st細胞的感染顆粒數。ST細胞培養於24孔培養皿中達 90%滿。重組TGEV病毒依序稀釋1〇倍（1〇£1、、 勝3、10E_4、10E_5、10E_6等)。將不同的病毒稀釋液加 10 入24孔培養皿的每孔内，並於37。〇、5% c〇2條件下抖養丄 小時。之後，移除含病毒ST單層細胞之上清液，並迅速將 瓊膠覆蓋於單層細胞上《覆蓋瓊膠之製備係使用丨部分2χ DMEM (杜氏培養液）與1部分丨％經純化之填膠並溶於 ddH2〇。細胞覆蓋後，多孔培養亚於室溫下靜置匕分鐘以固 15 化凝膠，隨後放入37°C、5% C〇2之經控管培養箱中48小時。 欲計數病毒溶菌斑，以10%福馬林固定經感染的5丁單 層細胞，再以0.1%結晶紫染色30分鐘。計算溶菌斑數之 前，每孔以去離子水清洗並於室溫下乾燥，並決定病毒效 價。 免疫螢光 20 TGEV與PRRSV蛋白表達之分析係利用標準 分析法。 範例7 rTGEV之產生 豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)屬於Purdue株族群，1946 44 < S ) 年取自美國印第安那(Doyle與Hutchings，1946)。病毒已 適應於細胞培養(Haelterman與Pensaert，1967)並由E.H. Bohl提供（Ohio State University，Wooster Ohio)。本發明 TGEV分離株已於ST細胞中分代115次，並經Luis Enjuanes 博士實驗室連續選殖五次（Centro Nacional de Biotecnologia ’ Madrid，Spain)。所篩選之殖株稱為 PUR46-CC120-MAD，簡稱PUR46-MAD。其為減毒病毒， 並可於細胞培養中生長良好，且效價介於1〇8與1〇9 PFU/mL之間。 rTGEV病毒產自pBAC-TGEV建構物，其含有TGEV有 毒種PUR-C11 (SC11)之S基因，如所述(Alamazan等人， 2000 ; Gonzalez等人，2002)。減毒品系ptv (SPTV)之S基 因病毒（譯碼TGEV棘蛋白）係源自相應之pBAC-TGEV載 體，其所攜帶之Sen基因經呼吸道種之sPTV基因置換。 範例8 表達PRRSV Gp5與Μ蛋白之重組TGEV載體之建構 欲增加TGEV單基因體之選殖能力’係剔除全長cdna 殖株中的非必需基因〇RF3a與ORF3b，產生一經刪除之 TGEV基因體。將編碼PRRSV蛋白Gp^M之異種〇RF5與 ORF6基因插入cDNA建構物中，取代經刪除之Tgev ORFs 3a與3b。
將 ORF5 (606nt) (SEQ ID NO: 2)選殖至 cDNA 建構物’以置換TGEV基因3a與3b。基因以pcr進行 増ΐ ，使用券核普酸PpUMi_〇RF5 V$ 1358455 (5’-AACAGGTCCTACCATGAGATGTTCTCACAAATTGGGG -3’）（SEQ ID NO: 4)與 Blp-〇RF5 RS mut (5，-CCGCTAAGCCTAGGCTTCCCATTGCTCAGCCGAAGTCC-3’）(SEQ ID NO: 5)。PCR產物以PpMI與5//;I切割並選殖 5 至質體pSL-TGEV-Avrll之相同限制酶位置，其包含TGEV 3a與3b刪除之基因體nt 22965至25865，並產生質體 pSL-AvrII-A3-PpuMI-ORF5。欲取得具感染性CDNAs，質體 以ZvrII切割，並將含有ORF5之插入子選殖至pBAC-Scn4 pBAC-SPTV(PacI/MluI)之相同限制酶位置，以分別取得具備 10 腸道内與呼吸道内趨性(tropism)之載體。PBAC質體與具感 染性TGEV ' cDNA殖株之基因序列如先前所揭示 (WO01/39797)。
PRRSV 01ot91 種之ORF6 (SEQ ID NO: 3)係以重疊法 PCR進行增量，由於選殖上的限制，故導入一β亞突變（siient 15 mutation)以剔除JvrII限制酶位置，並考慮scro/α密碼子 的使用。在初步PCR部分，使用寡核苷酸BlpI〇RF6 VS (5，-CGGCTGAGCAATGGGAAGCCTAGAAAATTATTAC ΑΤΑΤΟΟΤΑΤΑΑΟΤΑΑΑΟΑΑΑΑΤΟΟΓτΑΑΓτΓ,ΓΤΑΓτΑΓΓτ ATTTTTG-3’）（SEQ ID ΝΟ:6)，劃底線序列為 TRS22n& 20 ORF6-C306T-RS (5，-GCCGGCCTAG4CAACACAATC-3，) (SEQ ID NO: 7)。利用類似步驟，在二次PCR中，使用寡核苷 酸 ORF6-C306T-VS (S^GATTGTGTTGTCTAGGCCGGC -3，）(SEQ ID NO: 8)及 BlpIORF6rs new (5，-GCTAAGCTTACCGGCCATACTTGACGAGG-3，）(SEQ ID 46 1358455 NO: 9)。利用這些PCR產物及寡核苷酸BlpI0RF6 VS 與BlpI〇RF6rs new，以獲得最終產物（574 nt)»此PCR 產物以 切割並選殖至 pSL-AvrII-A3-PpuMI-ORF5 之相同限制酶位置，產生質體 5 pSL-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)。欲獲得具感染性 cDNA pBAC-SpTv-TRS3a_〇RF5-TRS22N_〇RF6(c3〇6T) ’ 質體 pSL-TRS3a-〇RF5-TRS22N_〇RF6(c306T)係以切割，並將含 ORF5與ORF6之插入子選殖至pBAC-SPTV (Pacl/Mlul)之相 同限制酶位置（第4圖）。利用相同選殖步驟，以獲得編碼腸 10 道内趨性TGEV之cDNA (適應於細胞培養），可表達PRRSV Gp5與 Μ 〇 具呼吸道内趨性之重組病毒 ， rTGEV-SpTv_TRS3a_〇RF5-TRS22N_〇RF6(c3〇6T)，係經回收 並進行三次溶菌斑選殖。ORF5與ORF6之mRNAs表現以 15 RT-PCR確認。篩選具表達能力之殖株，經細胞培養兩 代後，分別偵測ORF5與ORF6之mRNA表現，確認病毒 穩定存在。儘管如此，欲改善表現量，將重組病毒適應 於ST細胞，再進行兩次溶菌斑選殖步驟。病毒殖株Gp5 表達之評估係利用免疫螢光分析（請見第5圖），並定量表 20 達Gp5之經感染細胞。經篩選之病毒 (rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C3〇6T))可於 80% 之 經感染豬睪丸(ST)細胞中大量表達Gp5,係以螢光激發細胞 分選法(FACS)進行評估。 < S ) 47 1358455 範例9 體外研究以確認TGEV病毒 rTGEV-SpTv_TRS3a_〇RF5-TRS22N_〇RF6(c3〇6T) 欲確認重組TGEV病毒rTGEV-SPTV-TRS3a-5 〇RF5-TRS22N-ORF6(c3〇6T) ’進行免疫螢光分析與西方墨點 分析’以偵測病毒載體所產生不同PRRSV蛋白gP5與Μ之表 達。 免疫螢光分妍 ST細胞於8或12孔培養皿中長至30%滿。以ΜΟΙ = 5 pfu/ 10細胞進行感染，細胞於37〇C之MEME (最小需求培養基）中 生長’内含2%胚胎殖株in血清(購自HyCi〇ne)。感染8小時 後，移除接種體(inoculum) ’細胞以PBS清洗並於室溫下加 入4%二聚曱醛固定3〇分鐘。在雙標定方面，其中一級抗體 源自小鼠與兔子’ 一級抗體於含PBS-SFB 20%/0.2%之皂苷 15稀釋劑中混合。抗體於室溫下吸附90分鐘，隨後細胞以PBS 清洗三次。其後’細胞於室溫下培養於1:1〇〇〇稀釋之抗_兔 子與抗-小鼠二級抗體中達3〇分鐘，其連接羅丹明 (rhodamine)與螢光素伽肌似⑻）。培養孤以pBS清洗五 次，固定後進行螢光顯微鏡分析。 20 西方墨點分析 ST細胞於12.5 cm2組織培養角瓶内長至1〇〇%滿。以 MOI-5pfu/細胞進行感染8小時，細胞於37<>〇2μΕμε(最 小需求培養基）中生長，内含2%胚胎殖株III血清 (Hyclone)。細胞以1χ上樣緩衝液破壞。細胞裂解液以丨2 5〇/〇 48 1358455 梯度之十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分析。經分離之蛋白以0.02% SDS轉移至PDVF薄膜（100 V ; Amp限值0.30 ;時間1:30小時）。轉移至PDVF薄膜後， 室溫下以PBS:牛奶5%進行阻斷(blocking) 2小時，隨後4°C 5 隔夜培養於1:100稀釋之Gp5 PRRSV蛋白（8676)多株抗體或 1:50稀釋之M PRRSV蛋白（7718)多株抗體。反應後，PDVF 薄膜以PBS:牛奶5%:0.05 Tween-20清洗三次。PDVF薄膜隨 後培養於山羊-抗-兔子抗體1小時，其連接過氧化酶，之後 以PBS:牛奶5%:0.05 Tween-20清洗五次。經結合抗體以 10 Inmobilon Western Chemiluminescent HRP 受質（Millipore) 偵測。結果顯示於第8圖。 PRRSV gp5與Μ蛋白可於經重組病毒感染之ST細胞或 經PRRS野生病毒感染之ΜΑ104細胞裂解液中測出。 ΜΑ104細胞亦可作為控制組，此系統較類似細胞感染培養 15 模式，亦即，經rTGEV-ORF5-ORF6病毒感染之ST細胞。 重組 TGEV 病毒 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)，於組織培養分代20次後仍維持穩定，即使自感 染小豬中回收亦是如此(請見第5與6圖）。在組織培養分代20 次以後，病毒仍表現PRRSV ORF5與ORF6基因（請見第7 20 圖）。 範例10 經修飾活疫苗（MLV)之產生 反應始於rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6之 主要種子（Master Seed)病毒，此經修飾活疫苗含有豬 < S ) 49 1358455 * 睪丸（ST)細胞上清液，係經重組rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6感染並表達重組PRRSV蛋白gp5與Μ， 其產生如下（亦請見第11圖）： rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6病毒係取自十 5 個100 cm2培養皿之感染ST細胞，其主要種子病毒具備 MOI =1 [感染增殖率]之高感染力。上清液經移除、離心並 冷凍於-80°C(±10°C)。重組病毒以效價測定方式取得。所 得上清液重組病毒以1:10 DMEM培養基稀釋產生最終劑型 〜lxlO7 PFU/m卜 10 此疫苗配方所組成MLV進一步以活體内實驗評估（請 見範例12與13)*» 範例11 去活性（死）疫苗之產生 含有裂解之豬睪丸(ST)細胞萃取物之去活性疫苗，該 15 豬隻經表現重組PRRSV蛋白gp5與Μ之重組 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6感染，其產生如下 (亦請見第11圖）： 該 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6抗原係得自 以高MOI [感染增殖率]3之主要種子病毒，感染10盤100 20 cm2培養孤之ST細胞。細胞經回收，以磷酸鈉緩衝溶液 (PBS)清洗，並沈澱。細胞沈澱物係凍於-80°C(±1(TC)。考 慮到約70%之經感染ST細胞會產生gp5與Μ重組蛋白，該 沈澱物係懸浮於pH 8.3之碳酸氫鈉水溶液中，濃度為 3.9xl06經感染生產細胞/mL。細胞經裂解，細胞萃取物於4 50 1358455 °C，以15000xg離心30分鐘。 上清液以雙乙亞胺(ΒΕΙ)去活性，最終濃度為5%，期 間為72 h，於37°C連續攪拌。
去活性抗原係以1:3比例’經豬隻環狀病毒（PCV)第1 5型-第2型去活性疫苗稀釋（Fenaux等人，2003 ; Fenaux 等人，2004) ’其已具有20%之硫化脂質-環糊精佐劑 (SLCD ;得自 Fort Dodge，Iowa，USA)，如下：32 mL > ST-rTGEV-SPTV-TRS3a-〇RF5-TRS22N-〇RF6去活性抗原，具 3.7xl06經感染生產細胞/mL，與64 mL之PCV Typel-Type2 10 疫苗混合。該混合物係於室溫下攪拌3.25 h。 此疫苗配方（去活性）已經體内實驗（請見範例14)評 估。 範例12 表現二異源性PRRSV蛋白之重組病毒rTGEV-SPTV--15 TRS3a-〇RF5-TRS22N-〇RF6之小緒體内疾病評估 > 此評估係進行，以評估rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5 -TRS22n-ORF6在標的組織(腸與肺臟)之體内複製與繁 殖，藉由病毒效價測定，及免疫組織化學分析，以及異源 性PRRSV蛋白（Gp5與M)之表現，且這些組織之TGEV基因 20 體’係以免疫組織化學分析評估。該評估更進一步確認， rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6 會於兩天大小緒之 肺部複製’該小豬經由鼻内路徑接種2xl07pfu/ml之病毒。 係評估肺部與組織病理學切片之病毒效價。 17隻兩天大小豬’為Large White X Belgian Land race 51 1358455 混種，不含對抗TGEV與PRRSV之抗體，係經挑選並分為三 組。第1組之豬隻(7動物）係接種2xl〇7 pfu/ml之控制組病毒 rTGEV-SPTV-FL’第2組豬隻(7動物）係接種2xl〇7 pfu/ml之重 組病毒rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6，而第3組豬 5 隻(3動物)代表控制組。 自接種後0天起，每一組之動物係犧牲並切片，如表i 所示。
於接種後第1、2、3與4天，第1组與第2組之豬隻係犧 牲’而第3組豬隻則於接種後第4天犧牲。 在肺臟切片後，係以巨觀方式檢驗。該肺臟切片之形 狀與内容係描述’並依據描述於Hannan等人，1982之評分 系统評估。一般稱之為肺臟切片之肺部積分，係如第12圖 15所示。 由這些動物獲得之肺臟組織樣本，係以PBS均質化， 以決定標的組織(肺臟)之重組病毒效價。回收自肺臟組織之 病务係於st細胞單層細胞上，以溶菌斑形成單位（pfu/ml) 進行效價測定。 組織樣本亦置於甲醛（10%經緩衝-福馬林），用於組織 52 1358455 · 病理學研究。2-3 mm之組織樣本係分配於塑膠盒中，於一 系列分級酒精中脫水，並以石蠟包埋，使用自動組織處理 器系統(Cytadel)。組織塊係製備，並由這些組織塊中切下 4-5 μιη切片，使用自動化切片機(Finesse)。這些切片係以蘇 5 木素-伊紅(hematoxylin-eosin)染色，使用自動化染色機 (Linistain GLX)。 其他之石蠟包埋切片係置於矽化載玻片中，並製備用 於免疫組織化學分析（IHC)技術，以偵測重組病毒表現之 TGEV與PRRSV抗原。該切片係加熱至60°C，1〇分鐘，直至 10 石蠟融化。之後該樣本係浸入對二曱苯1〇分鐘二次，以及 絕對乙醇10分鐘二次。在將樣本於黑暗中浸入内生性過氧 化酶抑制溶液（曱醇+3% (v/v)過氧化氫(H202)) 30分鐘後， 樣本以Tris-Saline緩衝溶液(TBS) (0.05 M)清洗三次，之後 將樣本浸入檸檬酸鈉溶液中15分鐘，該溶液預先以微波加 15 熱，之後以Tris-Saline緩衝溶液(TBS) (0.05 M)清洗三次。 之後，該樣本係浸入TBS (0.05 M)-BSA溶液中10分鐘，以 阻斷非特異性結合。在加入一級抗體之前，係加入2滴Avidin
Solution (Vector Laboratories，Blocking Kit)至樣本中，之 後靜置15分鐘’之後加入2滴Biotin Solution (Vector 20 Laboratories，Blocking Kit)，並靜置 15分鐘。該樣本之後 浸入一級抗體溶液3BB3單株抗體，對抗TGEV Μ蛋白（1/100 稀釋），並於4°C培養至隔日。該樣本以Tris-Saline緩衝溶液 (TBS) (0.05 M)清洗三次，之後浸入二級抗體溶液抗小鼠
IgG (Vector Laboratories，Vectastain ABC Kit) (1/100稀釋） 53 1358455 中1小時。以Tris-Saline緩衝溶液（TBS) (0.05 Μ)清洗三次 後’將其浸入Avidin-Biotin-過氧化酶溶液（Vect〇r
Laboratories，Vectastain ABC Kit)中 1小時，再以Tris_Saline 緩衝溶液(TBS) (0.05 Μ)清洗三次。將樣本浸入dab (3,3，_ 5 二胺基聯苯胺，SIGMA)溶液中7分鐘，以Tris-Saline緩衝溶 液(TBS) (0.05 M)清洗三次，將其浸入蒸餾水1〇分鐘。該樣 本之後以Hematoxylin染色1-2分鐘，浸入蒸餾水中丨〇分鐘， 浸入96%乙醇中5分鐘’浸入100%乙醇中5分鐘，最後浸入 xylol中5分鐘。在以光學顯微鏡評估該樣本之前，該樣本 10 係以疏水性置放介質（mounting medium)製備，並覆蓋上玻 璃。 TGEV載體S蛋白之偵測，該樣本得自第1組與第2組豬 隻，係以免疫組織化學分析確認，顯示該重組病毒於豬隻 肺臟中複製，在經由鼻内路徑接種疫苗後(請見第12圖）。肺 15 臟樣本與組織病理學切片中偵測之病毒效價，發現於組織 切片中，確認了這些結果。由組織病理學檢鲞偵測出之間 質性肺炎，可與病毒感染相關，且為冠狀病毒感染之特徵 切片（第1組與第2組豬隻之一之組織切片免疫組織化學分 析範例，顯示第13圖）。 20 免疫組織化學分析TGEV抗原之同步偵測，以及病毒效 價測定重組病毒之高效價，確認了肺臟重組病毒之複製。
此外，由於增進之穩定性，重組TGEV病毒可自接種疫 苗小豬之肺臟與腸組織回收。由這些組織收回之病毒可繼 續繁殖於ST細胞培養(請見第9圖），該經回收病毒感染之ST 54 細胞會表現Gp5 (約80%經感染細胞）與Μ (約100%經感染細 胞；請見第10圖）。 範例13 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6經修飾活疫苗於豬 5 隻中對抗牧場單離PRRSV株Olot/91感染之效用評估 進行此評量，以評估rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22n-ORF6之功效，其表達不同異源性prrsv蛋白之經 修飾活疫苗（MLV)，以預防一週大小豬之生殖與呼吸道病 變’係以鼻内途徑投藥後進行牧場單離PRRSV株Olot/91感 10 染。疫苗之功效係評估血清中所產生抗體（以ELISA、IPMA 與血清中和反應分析）。 將39隻血清反應陰性或低TGEV與PRRSV抗體效價之 一週大小豬分成三組。第1組豬隻（17隻動物)接種控制組病 毒rTGEV-SPTV-FL，第2組豬隻（17隻動物）接種重組病毒 15 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6，而第 3 組豬隻（5 隻 動物）則代表控制組。 豬隻接種疫苗之進行係依據表2之實驗設計，其中“D0” 代表一週大猪隻之第一接種日。 表2 組別 豬隻數 Ist接種曰(D〇) 2nd接種日(Dq+3w) 感染(D〇+6av) # 1 15 rT GE V- S ρτ v~F L iTGEV-Sptv-FL -----_ PRRSV #2 15 rTGEV-SpTv-TRS3a- 0RF5-TRS22n-0RF6 rTGEV-SpTV-TRS3a- ORF5-TRS22N-〇RF6 PRRSV #3 5 — ---- 55 20 豬隻每個鼻孔接種0·5 ml病毒懸浮液，兩次鼻内途徑接 種之體積共1 ml/小豬，第一次接種於一週大時進行，且第 二次接種(再接種)於四週大時進行。選擇鼻内途徑可增加重 組病毒於受感染緒隻標的組織(肺臟)的複製與繁殖。豬隻係 隨機分組。所有豬隻均於首次接種後十週進行感染，感染 時豬隻年齡為11週大。豬隻係經鼻内途徑感染pRRSV西班 牙種(Olot/91)且104 M〇(8 TCID5。/豬隻。感染係以站姿進行 而非鎮靜狀態’並使用1() mL注射針。將接種物分成兩等 分’每個鼻孔各-。採取鼻内途徑，因其被視為一般的感 染途徑。 在接種與感染後，每日觀察豬隻臨床表徵以確認疫苗 之安全性◊一旦發現任何異常，即進行完整的臨床檢查。 在感染後DO、D21與D28 PI進行血液樣本採集並取得 血清，以決定血清效價並研究抗TGEV與pRRSVi免疫反 應。 PRRSV感染之效用評估係利用競爭性eusa INGEZIM PRRS gp5 Compac (INGENASA)測定特定抗gp5 抗體之表現。利用一呈色受質（chr〇mogenic substrate) ’可 偵測DO PV (接種後）、DO PI、D14 PI與D28 PI之經接種與 控制組動物血清中特定抗gp5抗體之存在（第14圖）。利用do PV (其中未出現競爭現象)之吸光值計算每一血清樣本中的 結合百分比，公式如下： %結合=血清中Dx之吸收值 、口口 ϋί中DO PV之吸收值 1358455 血清檢測樣品中，愈低之結合百分比代表愈高表現量 之抗gp5抗體。如第I4圖所示，感染14天後，相較於未接種 控制組動物’經接種動物具備較高的抗gp5效價與較快速的 抗體反應。 5 進行特定免疫過氧化酶單層細胞分析（IPMA)，其如
Wens voort等人（198 6)所述’以偵測經感染豬隻肺泡巨噬細 胞之PRRSV，其中血清樣本係取自本範例中之不同豬隻。 WENSVOORT等人（1986)所描述方法之唯一差別在於使用蛋 白-A結合辣根(horseradish)過氧化酶作為二級抗體，而非綿 10羊抗豬之免疫球蛋白結合辣根過氧化酶。所得結果顯示於 第14圖。 如第15圖所示，大多數豬隻在D28 PI時對於PRRSV呈 現血清反應陽性。然而，在MLV接種動物組中，D14 PI時， 16隻動物中有5隻(相符於31%)對於PRRSV呈現血清反應陽 15 性，然而接種之控制組動物，D14 Π時未 發現有血清反應陽性，顯示經接種動物對於PRRSV產生較 . 快速的抗體反應。 範例14 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6死疫苗於豬隻中對 2〇 抗牧場單離PRRSV株Olot/91感染之效用評估 進 4亍此 3平量’以評估 rTGEV-SpTv_TRS3a-〇RF5-TRS22n-ORF6去活性次單元疫苗（死疫苗）之功效，其表達不 同異種PRRSV之蛋白。使用去活性疫苗以預防豬隻生殖與 呼吸道症候群(PRRS)，係以肌内（IM)途徑給予次單元疫苗 < S ) 57 後進行牧場單離PRRSV株Olot/91感染。疫苗之功效係評估 預防情形或間質性肺炎（interstitial pneumonia)、病毒血症 (viremia)以及血清中抗體誘發能力（以elisa、血清中和分 析(SN)等評估）。 在本效用分析中，表達PRRSV gp5與Μ蛋白之 rTGEV-SPTV_TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 去活性次單元疫 苗，其產生係如範例11所述。 接種 將27隻六至七週大的豬隻分成兩組。第i組豬隻（14隻 動物）接種PRRSV去活性-PCV疫苗（3m卜以IM途徑進行）兩 次(分別為6-7週大時與3週後），而第2組豬隻（13隻動物)係未 接種疫苗之控制組豬隻。 接種後’每日觀察豬隻臨床表徵以確認疫苗之安全 性。一旦發現任何異常，即進行完整的臨床檢查。 在血清學研究方面’接種後(pV) D〇、D21與D49進行 血液樣本採集並取得血清，進行PRRSV、TGEV與PCV2之 血清學檢查(請見以下所示）。 由 rTGEV_SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6 疫苗所誘發 之體液反應(humoral response)係利用間接式PRRSV elisa 分析，係利用PRRSV偵測抗§?5與抗]\4抗體，並以超高速離 心濃縮作為塗佈抗原（第16圖B與第17圖C)。 PRRSV稀釋抗原於5 i 3 C隔夜陪養。清洗後，每孔表 面以PBS、5%BSAFraction V進行阻斷反應，並於37± rc 下陪養lh。在D0、D21與D42PV時，經接種與控制組動物 1358455 以及PRRSV陽性與陰性控制組之血清以PBs、Tween_2〇 0.05%稀釋，並於37 ± TC下培養1 h。清洗後，加入經PBS、 Tween-20 0.05% (1:1000)稀釋之過氧化酶_結合蛋白a，並於 37 ± It下培養1 h。最終清洗後，每孔加入呈色受質（鄰苯 5二胺（OPD))。反應因加入3N H2S04而停止。培養皿利用 £115八微讀盤儀於450-11111濾鏡下判讀》 由 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6 疫苗所誘發 之體液反應係以上述之相同方法分析，並進行間接式 > PRRSV ELISA ’其利用超高速離心濃縮TGEV作為塗佈抗 10 原，而非PRRSV (第16圖A與第17圖B)。 欲評估 rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6 去活性 疫苗中豬隻環狀病毒(PCV)第1型·第2型疫苗產生之體液反 應，利用 IPMA分析DO PV、D49 PV與DO PI (D63 PV)時之 抗PCV2 0RF2抗體表現（請見上述）。此免疫學技術可定量 - 15經重組BAC-ORF2 PCV2桿狀病毒感染Sf9細胞中抗pcv2 棘蛋白（ORF2產物)抗體之表現。 > 以感染增殖率=1 (MOI)之重組桿狀病毒Bac_〇RF2 PCV2感染Sf9細胞。經感染細胞於27 ± 0.5°C下生長4天後固 定。經接種與控制組動物之血清經PBS、Tween-80 〇.〇5〇/0稀 20釋並於37 土 1。〇下培養1 h »清洗後，過氧化酶·結合蛋白A經 PBS、Tween-20 0.05% (1:1000)稀釋並於37 ± l°c 下择養 1 匕 最終清洗後，每孔加入呈色受質（3-胺-9-乙基咔唑）。反應因 PBS清洗兩次而終止。當經感染細胞之細胞質呈現紅色時， 表示反應為陽性。抗體效價與最高稀釋濃度倒數相符時即 59 1358455 顯示為陽性反應。 在DO PV時，大多數動物的抗PCV2抗體表現呈陰性（經 接種動物為58%且控制組動物為92%)。在第二次免疫注射 後（D49 PV與D63 PV)，控制組未經接種動物仍維持血清 5 PCV2陰性反應，而經接種動物血清則轉換為PCV2 (請見表 3)。 表3 :
第1組 rTGEV-SpTv-TRS3a-〇RF5-TRS22N-〇RF6 第2組 未經接種動物 豬隻 編號# DO PV D49 PV DO PI (D63PV) 豬隻 編號# DO PV D49PV DO PI (D63PV) 294 320 320 320 293 320 ND <20 295 320 320 80 301 <20 <20 <20 296 320 1280 1280 303 <20 <20 <20 297 1280 320 320 306 <20 <20 <20 298 320 320 80 831 <20 <20 <20 299 <20 5120 5120 833 <20 <20 320 300 <20 320 320 834 <20 20 320 304 <20 <20 320 835 <20 <20 <20 305 <20 320 320 836 <20 <20 <20 828 <20 1280 1280 837 <20 <20 <20 832 <20 1280 1280 838 <20 <20 <20 841 <20 320 320 839 <20 <20 <20 ND :未定 840 <20 <20 <20 60 1358455 感染 第二次接種六週後，兩组之所有豬隻均利用鼻内（IN) 途徑感染牧場單離PRRSV株Olot/91 (104·7-104·8 TCID50/豬 隻）。 5 在第0、7、12、20與27 PI天採血取血清以決定血清效 價’並研究抗PRRSV之免疫反應（利用ELISA測定抗gP5與N 蛋白抗體，以及SN檢測）。血清亦用於測量PRRSV之病毒血 症，係利用定量式RT-PCR。 A清學研贫 10 血清中和性抗體(NAb)係取自經接種與控制組動物D0 PV、DOPI、D12PI與D27PI之血液，並以血清中和分析法 '進行分析(SN ;請見表4)。於感染前(D0PV與D0H)，任何 組別均偵測不到Nab。在D12 PI時，某些動物產生NAb (第1 組(經接種動物）有2丨4%，且第2組(未經接種動物）有23%)， 15然而，感染後27天可觀察到更高的Nab效價及更高數目的陽 性動物（第1組有75%陽性，第2組有46%陽性）。 61 1358455
表4 第1組 第2組 rTGEV-SpTV-TRS3aORF5-TRS22N~〇RI76 未 經接種 動物 豬隻 编號# D0PV D0PI D12PI D27PI 豬隻 编號# D0PV D0PI D12PI D27PI 294 <2 <2 <2 4 293 <2 <2 4 4 295 <2 <2 <2 16-32 301 <2 <2 <2 <2 296 <2 <2 <2 <2 303 <2 <2 2 <2 297 <2 <2 16 16-32 306 <2 <2 <2 <2 298 <2 <2 <2 16 831 <2 <2 <2 <2 299 <2 <2 2 4-8 833 <2 <2 <2 (D7PI) ND 300 <2 <2 <2 4 834 <2 <2 <2 <2 304 <2 <2 2 2 835 <2 <2 <2 4 305 <2 <2 <2 2 836 <2 <2 <2 8 828 <2 <2 <2 <2 837 <2 <2 <2 4 829 <2 <2 <2 ND 838 <2 <2 <2 <2 830 <2 <2 <2 ND 839 <2 <2 <2 4-8 832 <2. <2 <2 32-128 840 <2 <2 4 8-16 841 <2 <2 <2 <2 陽性 % 0 0 21.4 75 陽性 % 0 0 23 46 ND :未定 特定抗gp5抗體之表現係以競爭式ELISA INGEZIM 5 PRRS gp5 Compac (INGENASA)分析，並依據操作說明進 行。本方法係測量豬隻血清與經抗gp5-過氧化酶標定單株 抗體(MAb)之間競爭結合重組gp5蛋白之能力，其事先塗佈 於欲測試培養皿表面上。利用一呈色受質，偵測經接種與 62 控制組動物之DO PV、D〇 PI、D14 PI、D21 ?1與〇28 ρι血清 中特定抗卯5抗體之表現(請見第18圖）。利用DO PV (其中未 出現競爭現象）之吸光值計算每一血清樣本中的結合百分 比，公式如下： %結合_ 血清中Dx之吸收值 、。口 PV之吸收值 較低結合百分比代表受測血清中含有較高量的抗gp 5 抗體。如第18圖所示，相較於未經接種控制組動物，感染 後14天’經接種動物具備較高的抗gp5效價與較快的抗體反 應。. 欲定量血清（病毒血症）與肺部灌洗液中的PRRSV，於 DO、D3、D7、D14、D20與D28 PI採血及分離血清，並保 存於-80 ± l〇°C供分析之用。另外，於D27 PI時所有豬隻均 犧牲並檢驗屍體。評估肺臟整體損害並進行肺部灌洗。欲 取得肺灌洗液，找出肺臟並以100 mLPBS經由氣管導入肺 臟’隨後溫和地按摩並將PBS吸至無菌試管中。肺臟灌洗液 經分裝並保存於-80 ± 10。(：。 由血清與肺臟灌洗液中純化RNA，係利用Nucle〇spin
96 RNA (Macherey-Nagel)套組，並依據操作說明進行。rnA 樣本保存於·8〇 ± l〇°c。 欲定量PRRSV，進行即時RT-PCR技術（qRT-PCR)。 首先，特定引子（順向引子（01ot91F): 5,
TTCCCTCTGCTTGCAATCG 3,（SEQ ID NO: 16)與逆向引 子（01ot91R): 5’ GGATGAAAGCGACGCAGTTC 3,（SEQ ID 1358455 Ν〇: Π))，及 MGB® 探針（探針（〇l〇t91S): 5, 6-FAM-ACGGCTTTTAATCAACtGC-MGB 35 (SEQ TD NO: 18))其5’端含有6-FAM作為報導染劑且3,端含有一MGB (次 要溝部結合物）片段作為非螢光性中止劑，以上設計均使用 5 Applied Biosystems’ Primer Express program進行 PRRSV Olot/91基因體之67 bp片段增量反應。其次，純化PRRSV感 染株之RNA，以獲得標準RNA，並將其調整至1〇4 PRRSV Τα〇5〇/μ1 RNA。將RNA分裝並保存於-80 ± 10°C。試劑濃 度與反應條件之最佳化係使用套組RNA UltraSense™ 10 One-Step qRT-PCR System (Invitrogen) ° 以純化之病毒RNA作為模板，於50°C下進行逆向轉錄 反應30分鐘，並於95°C下進行本質改變反應5分鐘。PCR條 件包含95 t：、20秒的40個循環之去活性反應 (denaturation)，及56°C、40 秒之黏合反應（annealing)。 15 qRT-PCR於7500 Real-Time PCR System熱循環儀内進行。所 得結果以SDS 1.2軟體(Applied Biosystems)分析（請見第19 圖）。 如第19圖所示，接種後，經接種動物於D14 Π時可觀 察到血清PRRSV效價明顯下降（由911 PRRSV TCID5〇/ml降 20 至 144 PRRSV TCID50/ml)。於D20與D28 PI A時可觀察到更 明顯的下降情形。 豬肺泡巨噬細胞取自經接種豬隻之肺臟灌流液，其所 含病毒(9606.74卩111^¥丁(：1〇5()/1111灌流液)遠低於控制組豬 隻(71518.33 PRRSV TCID50/ml灌流液）。值得注意的是，經 64 接種豬隻肺臟切片中PRRSV的含量（25%)低於控制組豬隻 (66.6%)，顯示去活性疫苗降低PRRSV於標的組織中複製的 能力。 在D27 PI時犧牲動物以取出肺臟，進行肺損傷之顯微 5 鏡檢，並依據Hannan等人（1982)所述之方法進行評分。表5 係肺部評分之平均值，顯示控制組與經接種動物之間具有 統計上差異。相較於經接種豬隻，控制組動物具備較高平 均之肺部評分。 表5 組別 肺部評分(平均值） 控制組 8.956 經接種動物 4.801 P-值 顯著相關性(〇.〇184) 10 範例15 表達ORF5-LIMP-II融合蛋白之載體 該重組載體係經改造，使用如上所述之相同選殖步 驟。融合蛋白之表現係由TRS-3a引導，該載體係設計為具 15 腸道内趨性。該載體pBAC-SCll-TRS3a-ORF5-LIMPII (請 見第20圖）係由選殖PRRSV ORF5，融合至豬隻LIMP-II (GeneBank取得號AAS55916)之末20 aa (SEQ ID NO: 11)， 其含有此蛋白之溶酶體標靶序列，而得。 穩定之重組病毒係回收自pBAC-SCll-TRS3a-ORF5- 20 LIMPII cDNA 0 65 1358455
Gp5-LIMPII之表現係以西方墨潰與免疫螢光分析偵 測’使用溶酶體pH之特異性抑制劑（亦即，氯喹 (chloroquine)、ΝΗπΐ)。可觀察到高量與穩定之抗原表現。 此特異性融合蛋白亦由表現Gp5 LIMPII與M蛋白之 5 TGEV載體表現。此會對雙順反子載體之穩定性產生更進 一步之增進。 範例16 具S基因突變之重組TGEV殖株之建構 係建構重組TGEVs之群聚物，僅於5, s基因不同，但其 10餘皆具有相同之序列。所有重組病毒皆產生自具感染性之 相同TGEV cDNA殖株’具有如almazan等人(2〇〇〇)描述之 序列’除了 S蛋白係衍生自TGEV-PUR46-PTV單離物，具呼 吸道内趨性(PENZES等人，2001)。該重組TGEVs係如前所述 建構(AlmazAn等人，2000)，使用具感染性cDNA ’作為細 15 菌人造染色體(BAC)。 二原始TGEV單離物TGEV-PUR46-PTV (其感染呼吸道) 與TGEV-PUR46-C11 (其感染腸道與呼吸道），在s基因之5, 不同，如同第22圖（請見左圖上方）。標示出之核苷酸反映了 該二序列間之不同’而右方垂直部分代表三個核苷酸缺 20 失。此外，某些殖株亦具有6個核苷酸缺失，已存在於 TGEV-PUR46-PTV之 S基因之 S蛋白中（Penzes等人，2001)。 起始自病毒rTGEV-SPTV，重組病毒之聚集物係以連續 引入存在於TGEV-PUR46-C11之S基因之序列而產生，而非 將PTV引入rTGEV-SPTV之S基因之序列（請見第22圖之序 66 1358455 列）。深色框中之核苷酸代表該核苷酸已經修正。 該重組病毒係經s τ細胞上之溶菌斑純化三次 些細胞上進行二次額外的分代細胞。由此獲得之 液係使用作為Working Stocks [WS分代〇 WS(P〇)]。在病毒於ST細胞上繁殖後，回收單離物 決定，並如第22圖所示。
’並於這 病毒儲存 acronym 之序列係 該病毒係供應至3天大之新生小豬。係顯示每—重組病 t在感染2-3天後，於肺臟或腸中之介質病毒效價。' 該殖株稱之為“R7殖株1”（或Su)，顯示在小豬感染2一3 10 天後，於肺臟或腸中呈現最高活性。 範例17 經挑選具S基因突變之重組TGEV殖株之生長動力學 重組 TGEV 病毒 rTGEV-PUR46-PTV，rTGEV-PUR46-C 11 與TGEV-PUR46-S7.1之生長，係以ST細胞進行體外評估， 15 並以小豬進行體内評估。 就體外研究而言，係評估TGEV-PUR46-C11 (TGEV C11)與 TGEV-PUR46-S7.1 (TGEV7.1)感染 ST細胞之效價。 該ST細胞係接種來自Working Stock之病毒(於〇代，请見上 述範例16) ’或於ST細胞上額外分代6次之病毒。病毒效價 2〇 係經效價測定，使用ST細胞上之溶菌斑試驗。結果顯示於 表6，代表三次單獨實驗之中間值。 67 1358455 表6 效價(PFU/ml) 病毒 WS (P0) 分代6次 rTGEV-PUR46-Cl 1 3χ107 4xl〇8 TGEV-PUR46-S7.1 5χ108 3 xlO8 如表 6所示，TGEV-PUR46-C11 與TGEV-PUR46-S7.1 二 者皆於ST細胞之細胞培養物上成長為高效價，即使在6代後 5 仍無明顯活性喪失。 就體内研究而言，3天大新生小豬係接種3χ108 pfu TGEV-PUR46-C11 (TGEV C11)與 TGEV-PUR46-S7.1 (TGEV7.1)於每隻小豬。小豬係以來自Working Stock之病 毒(P0)，或於ST細胞上額外分代6次之病毒感染胞。動物係 10 於接種後第2天犧牲，每克動物組織(腸或肺臟)之病毒效價 係經效價測定，使用溶菌斑於ST細胞上。結果顯示於表7， 代表三次單獨實驗之中間值》 效價(PFU/g組織） WS (P0) 第6代 病毒 肺臟 腸 肺臟 腸 rTGEV-PUR46-Cll 5χ106 5χ106 2χ106 5x10s TGEV-PUR46-S7.1 4χ107 8χ106 8χ106 4x106 15 顯示於表7之結果說明，二病毒在肺臟與腸中皆生長得 很好，當動物經得自Working Stock (P0)之病毒感染後。此 68 1358455 外，該病毒在感染前係於st細胞上分代六次，生長為在二 斋官中具高效價。然而，在二器官中，S7 !提供明顯較sCM 高之效價。 在另一實驗中，三天大新生小豬係接種3xl〇8 pfu 5 之 rTGEV-PUR46-PTV 、 TGEV-PUR46-C11 與 TGEV-PUR46-S7.1 ’每隻小豬。動物係分別於接種後第丄、 2、3與4天犧牲’每克組織之病毒效價係以§τ細胞上之溶菌 斑進行效價測定(請見第23圖）。 如第23圖所示，rTGEV-PUR46-PTV僅具呼吸道趨性。 10 此外，該病毒效價在體内四天並不穩定’而是逐;靳降低（請 見第 22 圖左圖）。TGEV-PUR46-C11 與 TGEV-PUR46-S7.1 二 者皆具雙重趨性，並可於呼吸道(肺臟)與腸道(腸)成長(請見 第23圖）。然而，二器官中之TGEV-PUR46-C11效價於小豬 體内四天内明顯降低，而TGEV-PUR46-S7.1之效價卻可維 持幾乎穩定(在肺臟），或僅降低些許，與TGEV-PUR46C11 (腸）相較。在任一情況下，由TGEV-PUR46-S7.1所得之病毒 效價在二器官中較高，與得自TGEV-PUR46-C11者相較，亦 即’該包含S基因S7.丨之重組TGEV，較TGEV-PUR46-C11具 有更高之體外與體内穩定性。 69 1358455
Bibliography:
Alama/an F,. Gonzales J=M=5 Penzes Zs, Izeta A,, Calvo Plana-Duran J.，Enjuanes L. (2000). Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5516-5521.
Alonso S., Izeta A., Sola I., Enjuanes L. (2002). Transcription regulatory sequences and mRNA expression levels in the coronavirus transmissible gastroenteritis virus. J. Virol. 76:1293-1308.
Ansari I.H., Kwon B., Osorio F.A., Pattnaik A.K. (2006). Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies. J Virol. 80(8):3994-4004.
Botner A., Strandbygaard B., Sorensen K.J., Have P., Madsen K.G., Madsen E.S., Alexandersen S. (1997). Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine. Vet. Rec. 141:497-499.
Bullock W., Fernandez J.M., Short J.M. (1987). XLl-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA E.coli strain with P-galactosidase selection. Biotechniques 8:26-27.
Carter Q 丄.，Curiel R.E. (2005). Interleukin-12 (IL-12) ameliorates the effects of porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV) infection. Vet Immunol Immunopathol 107:105-118.
Chang K.-Y., Tinoco I. (1994). Characterization of a "kissing" (S ) 70 1358455 . hairpin complex derived from the human immunodeficiency virus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8705-8709.
Charley B., Laude H. (1988). Induction of alpha-interferon by transmissible gastroenteritis coronavirus: Role of transmembrane glycoprotein El. J. Virol. 62:8-10.
Chung H.K., Chae C. (2003). Expression of interleukin-10 and interleukin-12 in piglets experimentally infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). J. Comp. Path. 129(2-3):205-212.
Cousens L.P., Peterson R., Hsu S., Dorner A., Altman J.D., Ahmed R., Biron C.A. (1999). Two roads diverged: interferon alpha/beta- and interleukin 12-mediated pathways in promoting T cell interferon gamma responses during viral infection. J. Exp. Med 189:1315-1328.
Delmas B, Gelfi J., Kut E., Sjostrom H., Noren 0., Laude H. (1994). Determinants essential for the transmissible gastroenteritis virus-receptor interaction reside within a domain of aminopeptidase-N that is distinct from the enzymatic site. J Virol. 68(8):5216-24.
Doyle L.P., Hutchings L.M. (1946). A transmissible gastroenteritis in pigs· */· dmer. Med. 乂55〇匕 108:257-259.
Enjuanes L·，et al. (2003). Virus based vectors for gene expression in mammalian cells; Coronaviruses; in Gene transfer and expression in mammalian cells', Ed. S.C. Makrides, p. 151-158.
Fenaux M., Opriessnig T., Halbur P.G., Meng X.J. (2003).
(S 71 1358455
Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs. 7. Virol. 77(20):11232-43.
Fenaux M., Opriessnig T., Halbur P.G., Elvinger F., Meng X.J. (2004). A chimeric porcine circovirus (PCV) with the immunogenic gene of the pathogenic PCV type 2 (PCV2) cloned into the genomic backbone of the non-pathogenic PCV 1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs. J. Virol. 78(12):6297-6303.
Foss D丄.，Zilliox M.J·，Meier W.，Zuckermann F., Murtaugh M.P. (2002). Adjuvant danger signals increase the immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Viral Immunol. 15(4): 557-566.
Gonzalez J.M., Penzes Z., Almazan F., Calvo E., Enjuanes L. (2002). Stabilization of a full-length infectious cDNA clone of transmissible gastroenteritis coronavirus by the insertion of an intron. J. Virol 76:4655-4661.
Graham R.L., Sims A.C., Brockway S.M., Baric R.S., Denison M.R. (2005). The nsp2 replicase proteins of murine hepatitis virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus are dispensable for viral replication. 7. Virol. 79:13399-13411
Haelterman E.O., Pensaert M.B. (1967). Pathogenesis of transmissible gastroenteritis of swine. Proc. 18th World Vet. Congress 2:569-572.
Hanahan D., lessee J., Bloom F.R. (1991). Plasmid 72 1358455 transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 204:63-113.
Hannan P.C., Bhogal B.S., Fish J.P. (1982). Tylosin tartrate and tiamutilin effects on experimental piglet pneumonia induced with pneumonic pig lung homogenate containing mycoplasmas, bacteria and viruses. Res. Vet. Sci. 33:76-88
Hertzig T., Scandella E., Schelle B., Ziebuhr J., Siddell S.G., Ludewig B.，Thiel V. (2004). Rapid identification of coronavirus replicase inhibitors using a selectable replicon RNA. J. Gen. Virol 85:1717-1725.
Izeta A., Smerdou C., Alonso S., Penzes Z., Mendez A.,
Plana-Duran J., Enjuanes L. (1999). Replication and packaging of transmissible gastroenteritis coronavirus-derived synthetic minigenomes. 7. Virol. 73:1535-1545.
Kiyono et al. (1996). Mucosal Vaccines. Academic Press, New
York.
Labarque G·, Reeth K.V·，Nauwynck H.，Drexler C.，Van Gucht S.， Pensaert S. (2004). Impact of genetic diversity of European-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain on vaccine efficacy. Vaccine 22:4183-4190.
Laude H., Rasschaert D., Delmas B., Godet M., Gelfi J., Bernard C. (1990). Molecular biology of transmissible gastroenteritis virus. Vet. Microbiol. 23:147-154.
Le Bon A.，Schiavoni G., D'Agostino G·，Gresser I·，Belardelli F.， 73 1358455
Tough D.F. (2001). Type I interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity 14: 461-470.
Lopez O.J., Osorio F.A. (2004). Role of neutralizing antibodies in PRRSV protective immunity. Vet Immunol Immunopathol 102:155-163.
McClurkin A.W., Noman J.O. (1966). Studies on transmissible gastroenteritis of swine. II. Selected characteristics of a cytopathogenic virus common to five isolates from transmissible gastroenteritis. Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. 30:190-198.
Meier W.A., Galeota J., Osorio F.A., Husmann R.J., Schnitzlein W.M., Zuckermann F.A. (2003). Gradual development of the interferon-gamma response of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection or vaccination. Virology 309:18-31.
Meng X.J. (2000). Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development. Vet. Microbiol. 74:309-329.
Mengeling W.L., Lager K.M., Vorwald A.C., Koehler K.J. (2003a). Strain specificity of the immune response of pigs following vaccination with various strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet. Microbiol. 93(1):13-24.
Mengeling W.L., Lager K.M., Vorwald A.C., Clouser D.F. (2003b). Comparative safety and efficacy of attenuated single-strain 74 1358455 and multi-strain vaccines for porcine reproductive and respiratory syndrome. Vet. Microbiol. 93(1):25-38.
Murtaugh M.P., Xiao Z., Zuckermann F. (1995). Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus. Arch. Virol. 140:1451-1460.
Nielsen H.S., Oleksiewicz M.B., Forsberg R., Stadejek T., Botner A., Storgaard T. (2001). Reversion of a live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine investigated by parallel mutations. J. Gen. Virol. 82:1263-1272.
Ortego J., Escors D., Laude H., Enjuanes L. (2002). Generation of a replication-competent, propagation deficient virus vector based on the transmissible gastroenteritis coronavirus genome. J. Virol. 76:11518-11529.
Ortego J., Sola I., Almazan F., Ceriani J.E., Riquelme C., Balach M., Plana-Duran J., Enjuanes L. (2003). Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influences in vivo replication and virulence. Virology 308:13-22.
Osorio F.A., Zuckermann F., Wills R., Meier W., Christian S., Galeota J., Doster A.R. (1998). PRRSV: comparison of commercial vaccines in their ability to induce protection against current PRRSV strains of high virulence. In Allen D. Lennart Swine Conf., pp. 179-182.
Osorio Y., Ghiasi H. (2005). Recombinant herpes simplex virus type 1 (HSV-1) codelivering interleukin-12p35 as a molecular 75 1358455 adjuvant enhances the protective immune response against ocular HSV-1 challenge. J. Virol. 79(6): 3297-3308.
Ostrowski M., Galeota J.A., Jar A.M., Platt K.B., Osorio F.A., Lopez O.J. (2002). Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain. J. Virol. 76:4241-4250.
Panley R., Hoglund S., Prasad G. (Eds.) (1989). Progress in Vaccinology. Veterinary Vaccines Volume 4, Springer Verlag.
Pastoret P.P., Blancou P., Vannier, Verschueren C. (Eds.) (1997) Veterinary Vaccinology, Elsevier Science B.V.
Penzes Z.，Gonzales J.M., Calvo E., Izeta A.，Smerdou C” Mendez A., Sanches C.M., Sola I., Almazan F., Enjuanes L. (2001). Complete genome sequence of Transmissible Gastroenteritis Coronavirus PUR46-MAD clone and evolution of the purdue virus cluster. Virus Genes 23(1):105-118.
Pesch S., Meyer C., Ohlinger V.F. (2005). New insights into genetic diversity of European porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Vet. Microbiol. 107:31-48.
Pfeffer L.M., Dinarello C.A., Herberman R.B., Williams B.R., Borden E.C., Bordens R., Walter M.R., Nagabhushan T.L., Trotta P.P., Pestka S. (1998). Biological properties of recombinant alpha-interferons: 40th anniversary of the discovery of interferons. Cancer Res. 58:2489-2499.
Rodriguez F., Harkins S., Redwine J.M., De Pereda J.M., Whitton 76 1358455 J.L. (2001). CD4+ T cells induced by a DNA vaccine: immunological consequences of epitope-specific lysosomal targeting. J. Virol. 75(21):10421-10430.
Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed Cold Spring Harbor Laboratory.
Sanchez C.M., Izeta A., Sanchez-Morgado J.M., Alonso S., Sola I., Balasch M., Plana-Duran J., Enjuanes, L. (1999). Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissible gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enteric tropism and virulence./. Virol. 73:7607-7618.
Sawicki & Sawicki (1990). Coronavirus transcription: subgenomic mouse hepatitis virus replicative intermediates function in RNA synthesis. J. Virol. 64(3):1050-6.
Sethna P.B., Hung S.-L., Brian D.A. (1989). Coronavirus subgenomic minus-strand RNAs and the potential for mRNA replicons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5626-5630.
Siddell S.G. (1995). "The Coronaviridae：' The Viruses (H.
Fraenkel-Conrat, and R. R. Wagner, Eds.) Plenum Press, New York.
Sola I, Alonso S., Ziiniga S.， Balasch M·, Plana-Duran J.， Enjuanes L. (2003). Engineering the transmissible gastroenteritis virus genome as an expression vector inducing lactogenic immunity. J. Virol. 77:4357-4369.
Suradhat S·, Thanawongnuwech R·，Poovorawan Y. (2003). Upregulation of IL-10 gene expression in porcine peripheral blood 77 1358455 mononuclear cells by porcine reproductive and respiratory syndrome virus. ,/. Gen. Virol. 84:453-459.
Thacker E.L., Halbur P.G., Ross R.F., Thanawongnuwech R., Thacker B.J. (1999). Mycoplasma hyopneumoniae potentiation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus-induced pneumonia. J Clin Microbiol. 37(3):620-627.
Thacker E.L., Thacker B.J., Young T.F., Halbur P.G. (2000). Effect of vaccination on the potentiation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)-induced pneumonia by Mycoplasma hyopneumoniae. Vaccine 18(13):1244-52.
Toka F.N. et al. (2004). Molecular adjuvants for mucosal immunity. Immunol Rev. 199:100-112. van der Most R.G., Spaan W.J.M. (1995). Coronavirus replication, transcription, and RNA recombination. In ''The Coronaviridaen (S. G. Siddell, Ed.), pp. 11-31. Plenum Press, New York.
Vezina S.A., Loemba H., Fournier M., Dea S., Archambault D. (1996). Antibody production and blastogenic response in pigs experimentally infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet. Q. 13:121-130.
Wensvoort G., Terpstra C., Boonstra J., Bloemraad M., Van Zaane D. (1986). Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12(2):101-108
Wensvoort G., Terpstra C., Pol J.M., ter Laak E.A., Bloemraad M., 78
I 1358455 de Kluyver E.P., Kragten C., van Buiten L., den Besten A., Wagenaar F., et al. (1991). Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Vet. Q. 13:121-130.
Wissink E.H.J., Kroeke M.V., van Wijk H.A.R., Rijsewijk F.A.M., Meulenberg Rottier P.J.M. (2005). Envelope protein requirements for the assembly of infectious virions of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Virol. 79(19):12495-12506.
Yoon K.J., Zimmernan J.J., Swenson S.L., McGinley M.J., Eernisse K.A., Brevik A., Rhinehart L丄.，Frey M丄.，Hill H.T., Platt K.B. (1995). Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) virus infection. J. Vet. Diagn. Invest. 7:305-312.
< S ) 79 1358455 【圖式簡單説明】 第1圖顯示小豬在體内接種表現PRRSV Gp5之rTGEVs 後，體重測量之結果。小豬係接種表現Gp5之rTGEVs，使用 丁1^3“么3-丁1«33-01^5;方形標記)或丁1^221^〇13-丁1^2抓-01^5; 5 三角形標記）。小豬體重係於感染PRRSV後1、2、3與4週測 量。接種表現PRRSV Gp5之重組病毒之小豬會有效地增加 體重（即正常發育），其中該接種控制組(“C-”)之小豬則顯示 出發育缺陷，僅有些許體重增加。 第2圖顯示ELISA試驗之結果，偵測特異於prrsv N 10 (ORFO之抗體。經表現PRRSV Gp5之rTGEVs (不論是 △3-TRS3a-ORF5或Δ3-ΤΚ·822ν-〇Κ·Ρ5)感染之小豬，或是經未 表現0RF5與ORF6之病毒載體感染之小豬（未接種疫苗控制 組)之血清樣本，係於PRRSV感染後2、3與4週後收集。無 或僅有少量之PRRSV蛋白N可於接種疫苗小豬中偵測到， 15在小豬經PRRSV感染後，與未接種疫苗控制組相較。因此， 當M-TRSh-ORFS可提供對抗PRRSV之完整保護， △3-TRS22n-ORF5則可提供對抗PRRSV之部分保護。相對 地’控制組之動物並無法提供對抗PRRSV之保護。 第3圖顯示北方墨潰（Northern-blot)之分析，顯示表現 20 PRRSV Gp5之rTGEVs之穩定度。表現Gp5之重組TGEV病毒 (使用不論是TRS^TRS^n)係於組織培養物中分代。§丁細 胞係以第2代(p2)與第5代(P5)之病毒感染。如圖所示，口2病 毒會表現Gp5mRNA，其中p5病毒含有缺失現象，不會表現 Gp5 mRNA 〇 80 1358455 第 4 圖顯示編碼 pBAC-TGEVFL-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6(C306T)之cDNA之圖示結構。如圖所示，異源性 PRRS V基因0RF5與0RF6係選殖至同一 rTGEV病毒性載體 5 第5圖顯示PRRSV之Gp5 (0RF5)於ST細胞中之表現，
該細胞經表現PRRSV Gp5與Μ蛋白之TGEV (pBAC-TGEVFL-SpTv-TRS3a-〇RF5-TRS22N-ORF6(C3〇6T))感 染’以免疫螢光分析評估（係使用特異於TGEV N蛋白之抗 體觀察病毒（紅色），以及使用特異於PRRSV ORF5 (Gp5)蛋 10 白之抗體觀察Gp5表現細胞（綠色））。在組織培養20代之後 (包括複製步驟），該病毒係回收，並使用於感染ST細胞。 此分析顯示80%之感染細胞會表現Gp5，以及100%之這些 細胞為Μ蛋白陽性（圖上未顯示）。此圖亦顯示該雙順反子建 構物具有增進之體外穩定性，並在培養中分代20代之後仍 15 維持穩定。 第6圖顯示第5圖經感染細胞之FACS分析結果。特異於 TGEV N蛋白之抗體係用於偵測重組病毒，其中Gp5表現細 胞係使用特異於Gp5之多價抗體觀察。此資料清楚顯示80% 經表現有PRRSV Gp5與Μ蛋白之重組TGEV 20 (pBAC-TGEVFL-SpTv_TRS3a-ORF5-TRS22N_〇RF6(c3〇6T))感染 之細胞，在組織培養分代20代之後（包括複製步驟），仍會表 現PRRSV Gp5。此現象再度顯示表現有PRRSV Gp5與Μ蛋 白之rTGEV之體外穩定性。 第7圖為RT-PCR分析之結果，顯示表現有ORF5與ORF6 81 1358455 (Μ)之重組TGEV之穩定性，在ST細胞中分代後。該重組 TGEV係於組織培養物中分代2〇次。由培養細胞中回收之病 毒為溶菌斑植株，且6個植株(cl至c6)表現之mRNA，係以 RT-PCR決定。如圖所示’ 1〇〇%之植株皆表現mRNA-ORF5 5 與mRNA-ORF6。此結果顯示表現有〇RF5與ORF6之重組 TGEV之基因體’可於細胞培養物中分代2〇次後，仍維持穩 定0 第8圖顯示西方墨潰（Western blot)分析結果，偵測 PRRSV Gp5蛋白（0RF5 ;左方墨潰）與Μ蛋白（ORF6 ;右方 10墨潰)於豬睪丸細胞之細胞裂解物中之表現，該細胞經重組 病毒 rTGEV-SpTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)(圖中縮 寫為rTGEV-SPTV-ORFs5+6) ’ 或控制組病毒(rTGEV-SPTv-FL) 感染。此外’數個控制組係用於西方墨潰（“mock” ：無病 毒感染之豬睪丸細胞；“PRRSV” ：經純化與濃縮之野生型 15 PRRS病毒；“MA104+PRRSV” ：非洲綠猿腎細胞株，經野 生型PRRS病毒感染）。各蛋白可於裂解物中偵測，得自經重 組病毒rTGEV-SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(c贿)感染之 細胞、經PRRSV病毒感染之細胞，以及經mai〇4+prssv 感染之細胞），如箭頭所示。 20 第9圖顯示體内接種後，表現PRRSV Gp5與Μ之重組
TGEV成長分析。使用於此分析之病毒含有s基因，如SEQ ID NO: 1所示，提供腸道與呼吸道趨性。該圖顯示病毒於 取自接種疫苗之小豬之肺部（圓形標記）與腸道（方形標記） 之ST細胞中之成長動力學。組織樣本係於接種表現PRRSV 82 1358455
Gp5與Μ之重組TGEV後1、2、3與4天後收集。
第10圖顯示表現PRRSV Gp5與Μ之重組TGEV (pBAC-TGEV -SpTv_TRS3a_〇RF5-TRS22Nr〇RF6(c3〇6T))之穩 定性分析結果，在體内投以回收自豬隻之病毒後。抗體係 5 使用於免疫螢光試驗中，以偵測PRRSVGp5 (上圖之綠色部 分）、PRRSV Μ (下圖之綠色部分），及TGEV N (紅色部分) 陽性ST細胞，經回收自接種疫苗小豬之肺部之病毒感染。 結果顯示表現PRRSV Gp5與Μ之重組TGEV相當穩定，甚至 在體内接種並自接種疫苗動物體内回收後仍是。該資料顯 10 示80%之經感染細胞會表現Gp5蛋白，且1〇〇%之經感染細 胞亦會表現Μ蛋白。 第11圖為流程圖，顯示使用重組病毒 rTGEV-SpTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6(c3〇6T) ’ 組成二疫苗 I己方。 15 第12圖為一表格，顯示重組病毒 rTGEV-SpTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-〇RF6(C3〇6T) ’ 在經由鼻内 路徑接種2xl〇7 pfu/ml之兩天大小豬之目標組織中（肺）之複 製與繁殖之評估。此結果由病毒效價測定與組織學決定。 第13圖為免疫組織化學圖，分別得自第1組與第2組豬 20隻之肺部組織切片，顯示冠狀病毒感染之間質性肺炎。該 切片特徵為肺泡壁增厚，由於淋巴球與巨噬體滲入，且肺 泡空間被單核球滲入物填滿（淋巴球與巨噬體），有時是多形 核嗜中性白血球。 第14圖顯示競爭性ELISA之結果，使用抗-gp5抗體， 83 1358455 於接種經修飾活疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物 相較。DO PV之吸收係用於計算每—血清中之結合百分比， 使用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗_gp5抗體 存在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間 5之吸收值差異與結合百分比，符合統計相關性(t測試：p值 <0.05) 〇 第15圖顯示特異性免疫過氧化酶單層試驗(IpMA)之結 果，用於偵測豬肺泡肺噬菌體中之PRRSV，該豬隻經得自 接種疫苗與控制組豬隻之血清樣本感染。 10 第16圖顯示抗-TGEV(圖A)與抗-PRSSV抗體（圖B)之偵 測結果，藉由間接ELISA，以有色受質之吸收波長展現。
Vacc.代表由接種疫苗動物獲得之血清，“匸匕丨，，代表由未 接種疫苗動物獲得之血清，“CP”與“CN”分別代表陽性與陰 性控制組。由接種疫苗與控制組動物獲得之血清係稀釋6〇_ 15 倍。 第17圖反映對於TGEV與PRSSv有陽性免疫反應之動 物百分比，使用1:60之稀釋倍數。圖A為一摘錄結果之表 格，其中該圖顯示陽性動物之百分比，以圖示形式（圖8為 抗-TGEV，圖C為抗-PRRSV)e “Vacc.”代表由接種疫苗動物 20獲得之血清，“Ctrl.”代表由未接種疫苗動物獲得之血清。 第18圖顯示競爭性ELISA之結果，使用抗_§{)5抗體於 接種去活性疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物相 較。D 0 P V之吸收係用於計算每一血清中之結合百分比，使 用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗_gp5抗體存 84 1358455 在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間之 吸收值差異與結合百分比，符合統計相關性（t測試：口值 <0.05)。 第19圖顯示定量即時RT_PCR (qRT_PCR)之結果，用於 5定量血清樣本中之PRRSV效價，該樣本或得自接種疫苗或 未接種疫苗之動物中。 第20圖顯示編碼〇Rf5-LIMP-II融合蛋白之cdNA，以 及其對於感染細胞抗原呈現之作用。 第21圖顯示編碼ub_〇RF5融合蛋白之cDNA，以及其 10對於感染細胞抗原呈現之作用。 第22圖顯示重組TGEV與嵌合性5蛋白之建構。該圖顯 不s基因與原始TGEV單離物TGEV_pUR46_PTv與 TGEV-PUR46-C11 ’其5’序列區域之差異性（請見左圖上 方）。圖中標示出之核苷酸反映了該二序列之不同，而右圖 15垂直部分則代表三個核苷酸被刪除。核苷酸之位置係由圖 最上方數字指出。該圖更顯示數個s基因突變物之序列， 與原始TGEV單離物TGEV_PUR46_pTV相較。每一重組病毒 之體内效價，在經感染新生小豬之腸道與肺部，亦於圖中 指出。 20 第23圖顯示原始TGEV與重組TGEV-PUR46-S7.1之成 長動力學。新生三天小豬接種3xl〇8 pfu每隻小豬劑量後， 係測量這些病毒之成長。動物係於指定天數下犧牲，每克 組織之病毒效價，係以ST細胞上之溶菌斑效價測定數決 定。（)，肺部之病毒；（·），腸道之病毒。所指出之數值係 85 1358455 對應於三獨立實驗之中間值。 【主要元件符號說明】 (無）
86 1358455 序列表 <110> 康桑喬卓越投資公司（Consejo Superior de Investigaciones Cientificas) <l2〇>編碼有TGEV序列與PRRSV序列以改善PRRSV序列之表現的核酸 <130> P71617 <150> EP05026255 <151> 2005-12-01
<160> 19 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 4350 <212> DNA <213> PRRSV <400> 1 atgaaaaaac tatttgtggt tttggtcgta etgccattga tttatggaga caattttcct 60
tgttctaaat tgactaatag aactataggc aaccagtgga atctcattga aaccttcctt 120 ctaaactata gtagtaggtt accacctaat tcagatgtgg tgttaggtga ttattttcct 180 actgtacaac cttggtttaa ttgcattcgc aataatagta atgaccttta tgttacactg 240 gaaaatctta aagcattgta ttgggattat gctacagaaa atatcacttg gaatcacaga 300 caacggttaa acgtagtcgt taatggatac ccatactcca tcacagttac aacaacccgc 360 aattttaatt ctgctgaagg tgctattata tgcatttgta agggctcacc acctactacc 420 480 accacagaat ctagtttgac ttgcaattgg ggtagtgagt gcaggttaaa ccataagttc 1 540 540
1358455 cctatatgtc cttctaattc agaggcaaat tgtggtaata tgctgtatgg cctacaatgg tttgcagatg aggttgttgc ttatttacat ggtgctagtt accgtattag ttttgaaaat caatggtctg gcactgtcac atttggtgat atgcgtgcga caacattaga agtcgctggc acgcttgtag acctttggtg gtttaatcot gtttatgatg tcagttatta tagggttaat aataaaaatg gtactaccgt agtttccaat tgcactgatc aatgtgctag ttatgtggct aatgttttta ctacacagcc aggaggtttt ataccatcag attttagttt taataattgg ttccttctaa ctaatagctc cacgttggtt agtggtaaat tagttaccaa acagccgtta ttagttaatt gcttatggcc agtccctagc tttgaagaag cagcttctac attttgtttt gagggtgctg gctttgatca atgtaatggt gctgttttaa ataatactgt agacgtcatt aggttcaacc ttaattttac tacaaatgta caatcaggta agggtgccac agtgttttca ttgaacacaa cgggtggtgt cactcttgaa atttcatgtt ataatgatac agtgagtgac tcgagctttt tcagttacgg tgaaattccg ttcggcgtaa ctgatggacc acggtactgt tacgtacact ataatggcac agctcttaag tatttaggaa cattaccacc tagtgtcaag gagattgcta ttagtaagtg gggccatttt tatattaatg gttacaattt ctttagcaca tttcctattg attgtatatc ttttaatttg accactggtg atagtgacgt tttctggaca atagcttaca catcgtacac tgaagcatta gtacaagttg aaaacacagc tattacaaag gtgacgtatt gtaatagtca cgttaataac attaaatgct ctcaaattac tgctaatttg aataatggat tttatcctgt ttcttcaagt gaagttggtc ttgtcaataa gagtgttgtg 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 2
1358455 ttactaccta gcttttacac acataccatt gttaacataa ctattggtct tggtatgaag cgtagtggtt atggtcaacc catagcctca acattaagta acatcacact accaatgcag gatcacaaca ccgatgtgta ctgtattcgt tctgaccaat tttcagttta tgttcattct acttgcaaaa gtgctttatg ggacaatatt tttaagcgaa actgcacgga cgttttagat gccacagctg ttataaaaac tggtacttgt cctttctcat ttgataaatt gaacaattac ttaactttta acaagttctg tttgtcgttg agtcctgttg gtgctaattg taagtttgat gtagctgccc gtacaagaac caatgagcag gttgttagaa gtttgtatgt aatatatgaa gaaggagaca acatagtggg tgtaccgtct gataatagtg gtgtgcacga tttgtcagtg ctacacctag attcctgcac agattacaat atatatggta gaactggtgt tggtattatt agaaaaacta acaggacgct acttagtggc ttatattaca catcactatc aggtgatttg ttaggtttta aaaatgttag tgatggtgtc atctactctg taacgccatg tgatgtaagc gcacaagcag ctgttattga tggtaccata gttggggcta tcacttccat taacagtgaa ctgttaggtc taacacattg gacaacaaca cctaattttt attactactc tatatataat tacacaaatg ataggactcg tggcactgca attgacagta atgatgttga ttgtgaacct gtcataacct attctaacat aggtgtttgt aaaaatggtg cttttgtttt tattaacgtc acacattctg atggagacgt gcaaccaatt agcactggta atgtcacgat acctacaaac tttaccatat ccgtgcaagt cgaatatatt caggtttaca ctacaccagt gtcaatagac tgttcaagat atgtttgtaa tggtaaccct aggtgtaaca aattgttaac acaatacgtt tctgcatgtc aaactattga gcaagcactt gcaatgggtg ccagacttga aaacatggag 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 3
1358455 gttgattcca tgttgtttgt ttctgaaaat gcccttaaat tggcatctgt tgaagcattc aatagttcag aaactttaga ccctatttac aaagaatggc ctaatatagg tggttcttgg ctagaaggtc taaaatacat acttccgtcc cataatagca aacgtaagta tcgttcagct atagaggact tgctttttga taaggttgta acatctggtt taggtacagt tgatgaagat tataaacgtt gtacaggtgg ttatgacata gctgacttag tatgtgctca atactataat ggcatcatgg tgctacctgg tgtggctaat gctgacaaaa tgactatgta cacagcatcc cttgcaggtg gtataacatt aggtgcactt ggtggaggcg ccgtggctat accttttgca gtagcagttc aggctagact taattatgtt gctctacaaa ctgatgtatt gaacaaaaac cagcagattc tggctagtgc tttcaatcaa gctattggta acattacaca gtcatttggt aaggttaatg atgctataca tcaaacatca cgaggtcttg ctactgttgc taaagcattg gcaaaagtgc aagatgttgt caacatacaa gggcaagctt taagccacct aacagtacaa ttgcaaaata atttccaagc cattagtagt tctattagtg acatttataa taggcttgac gaattgagtg ctgatgcaca agttgacagg ctgatcacag gaagacttac agcacttaat gcatttgtgt ctcagactct aaccagacaa gcggaggtta gggctagtag acaacttgcc aaagacaagg ttaatgaatg cgttaggtct cagtctcaga gattcggatt ctgtggtaat ggtacacatt tgttttcact cgcaaatgca gcaccaaatg gcatgatttt ctttcacaca gtgctattac caacggctta tgaaactgtg actgcttggc caggtatttg tgcttcagat ggtgatcgca cttttggact tgtcgttaaa gatgtccagt tgactttgtt tcgtaatcta 2760 2820 2880 2340 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 4
1358455 gatgacaagt tctatttgac ccccagaact atgtatcagc ctagagttgc aactagttct gactttgttc aaattgaagg gtgcgatgtg ctgtttgtta atgcaactgt aagtgatttg cctagtatta tacctgatta tattgatatt aatcagactg ttcaagacat attagaaaat tttagaccaa attggactgt acctgagttg acatttgaca tttttaacgc aacctattta aacctgactg gtgaaattga tgacttagaa tttaggtcag aaaagctaca taacaccact gtagaacttg ccattctcat tgacaacatt aacaatacat tagtcaatct tgaatggctc aatagaattg aaacctatgt aaaatggcct tggtatgtgt ggctactaat aggcttagta gtaatatttt gcataccatt actgctattt tgctgttgta gtacaggttg ctgtggatgc ataggttgtt taggaagttg ttgtcactct atatgtagta gaagacaatt tgaaaattac gaaccaattg aaaaagtgca cgtccattaa
<210> 2 <211> 606 <212> DMA <213> PRRSV <400> 2 atgagatgtt ctcacaaatt ggggcgtttc ttgactcctc actcttgctt ctggtggctt tttttgctgt gtaccggctt gtcctggtcc tttgtcgctg gcagcggcag cagctcgaca taccaataca tatataactt aacgatatgc gagctgaatg ggaccgactg gttgtccaac cattttgatt gggcagtcga gacctttgtg ctttacccgg ttgccactca tatcctctca ctgggttttc tcacaacaag ccattttttt gacgcgctcg gtctcggcgc tgtgtccact 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4350 60 120 180 240 300 5 360 1358455 acaggatttg ttggcgggcg gtatgtactc agcagcgtgt acggcgcttg tgctttcgca gcgctcgtat gttttgtcat ccgtgctgtt aaaaattgca tggcttgccg ctatgcccac acccggttta ccaacttcat tgtggacgac cgggggagaa tccatcggtg gaagtctcca atagtggtag agaaattggg caaagctgaa gtcggtggcg accttgtcac catcaaacat gtcgtcctcg aaggggttaa agctcaaccc ttgacgagga cttcggctga gcaatgggaa gcctag 420 480 540 600 606
<210> 3 <211> 522 <212> DNA <213> PRRSV <400> 3 at999aa9cc tagacgattt ttgcaatgat tctaccgccg cacaaaagct tgtgctagcc tttagcatta catatacacc tataatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgactc ctggggctgt tgcacatcct aatattcctg aattgttctt tcacattcgg atacatgaca tatgtgcgtt ttcaatccac caaccgtgtc gcacttactc tgggggctgt tgtcgccctt ctgtggggtg tttacagctt cacagagtca tggaagtttg ttacttccag atgcagattg tgttgcctag gccggcgata cattctggcc cctgcccatc acgtagaaag tgctgcaggt ctccattcaa tcccagcgtc tggtaaccga gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca tcagtgaacg gcactctagt tccaggactt cggagcctcg tgctgggcgg caaacgagct gttaaacgag gagtggttaa cctcgtcaag tatggccggt aa 60 120 180 240 300 360 420 480 522 6 1358455 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> 寡核苷酸引子 <400> 4 aacaggtcct accatgagat gttctcacaa attgggg
<210> 5 <211> 38 <212> DNA <213>人造 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 5 ccgctaagcc taggcttccc attgctcagc cgaagtcc
<210> 6 <211> 77 <212> DNA <213> <220> <223> 寡核苷酸引子 <400> 6 cggctgagca atgggaagcc tagaaaatta ttacatatgg tataactaaa caaaatggga agcctagacg atttttg 1358455 <210> 7 <2·11> 21 <212> DNA <213> Ait <220> <223〉暮^苷酸引子 <400> 7 gccggcctag acaacacaat c 21
<210> 8 <211> 21 <212> ΌΝΑ <213> AJ4 <220> <223>勒玄苷酸引子 <400> 8 gattgtgttg tctaggccgg c 21
<210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Ait <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 9 gctaagctta ccggccatac ttgacgagg 29
<210> 10 <211> 7 <212 > PRT
<213 > PRRSV 8 1358455 <400> 10
Thr Tyr Gin Tyr lie Tyr Asn 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> 野豬(Sus scrofa) <400> 11
Arg Gly Gin Gly Ser Met Asp Glu Gly Thr Ala Asp Glu Arg Ala Pro 15 10 15
Leu lie Arg 20 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> 触野猪(Sus <400> 12 a9aggaca9g gatccatgga tgagggaact gcagacgaac gagcacccct catacgaacc 60 <210> 13 <211> 564 <212> DNA <213> AJ4 <220> <223> 中和性 PRRSV 表位 ORF5-ORF6 <400> 13 tcgacatacc aatacatata taacttaacg atatgcgagc tgatgggaag cctagacgat 60 9 120 120
1358455 ttttgcaatg attctaccgc cgcacaaaag cttgtgctag cctttagcat tacatataca cctataatga tatacgccct taaggtgtca cgcggccgac tcctggggct gttgcacatc ctaatattcc tgaattgttc tttcacattc ggatacatga catatgtgcg ttttcaatcc accaaccgtg tcgcacttac tctgggggct gttgtcgccc ttctgtgggg tgtttacagc ttcacagagt catggaagtt tgttacttcc agatgcagat tgtgttgcct aggccggcga tacattctgg cccctgccca tcacgtagaa agtgctgcag gtctccattc aatcccagcg tctggtaacc gagcatacgc tgtgagaaag cccggactaa catcagtgaa cggcactcta gttccaggac ttcggagcct cgtgctgggc ggcaaacgag ctgttaaacg aggagtggtt aacctcgtca agtatggccg gtaa <210> 14 <211> 624 <212> DNA <213> Ait <223 > 表位 ORF5-ORF6-LIMP-II <400> 14 tcgacatacc aatacatata taacttaacg atatgcgagc tgatgggaag cctagacgat ttttgcaatg attctaccgc cgcacaaaag cttgtgctag cctttagcat tacatataca cctataatga tatacgccct taaggtgtca cgcggccgac tcctggggct gttgcacatc ctaatattcc tgaattgttc tttcacattc ggatacatga catatgtgcg ttttcaatcc 180 240 300 360 420 480 540 564 60 120 180 10 240 1358455 accaaccgtg tcgcacttac tctgggggct gttgtcgccc ttctgtgggg tgtttacagc ttcacagagt catggaagtt tgttacttcc agatgcagat tgtgttgcct aggccggcga
300 360 420 480 540 600 624 tacattctgg cccctgccca tcacgtagaa agtgctgcag gtctccattc aatcccagcg tctggtaacc gagcatacgc tgtgagaaag cccggactaa catcagtgaa cggcactcta gttccaggac ttcggagcct cgtgctgggc ggcaaacgag ctgttaaacg aggagtggtt aacctcgtca agtatggccg gagaggacag ggatccatgg atgagggaac tgcagacgaa cgagcacccc tcatacgaac ctaa <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Aii <220> <223〉雜聯結基 <400> 15
Gly Gly Pro Gly Gly 1 5 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Aii <220> <223 >寡核苷酸引子 <400> 16 11 1358455 19 ttccctctgc ttgcaatcg <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Ait <220> <223〉寡核苷酸引子
<400> 17 ggatgaaagc gacgcagttc 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Aik <220> <223>寡核微探針(MG蛾針)
<400> 18 acggctttta atcaaggc 18 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Ait <220> <223>衍生自N基因之人造序列 <400> 19 31 aaaattatta catatggtat aactaaacaa a 12

Claims (1)

  1. 第095144370號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：100年11月2曰 十、申請專利範圍： 1. 一種核酸，包含： 紅并· 0子修(更)正本 公告本 (a) —複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該 序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下， I358455__ 5 其中該複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動核酸之複 製’因而增加該核酸在該細胞中之數目；以及 (b) —編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒（pRRS v)之 0RF5之至少-中和性表位之序列，該序列包括一雙硫 鍵形成殘基；以及 10 (C)序列，5亥序列係編碼至少一其他可增進對抗 PRRSV之免疫反應之多胜肽； 其中編碼該QRF5之中和性表位之序列已經修飾，以剔 除(knock out)會干擾抗體誘發之醣化位置。 2.如申請專利範圍第旧之核酸，其中該核酸編碼 一 TGEV 15 複製酶’以及一編碼TGEVN蛋白之序列。 3·如申叫專利範圍第1項之核酸，其中該複製勝任載 體為非感染性。 4.如申咕專利範圍第2項之核酸，其中該複製勝任tgev載 體為非感染性。 2〇 5.如申請專利範圍第1項之核酸，其中該複製勝任TGEV載 體為感染性。 如申明專利|已圍第2項之核酸，其中該複製勝任TOW載 體為感染性。 如申π專利圍第5項之核酸，其中該核酸更包含下列 1 1358455 TGEV基因之一或多者：S、E、Μ及/或N。 8. 如申請專利範圍第6項之核酸，其中該核酸更包含下列 TGEV基因之一或多者：S、E、Μ及/或N。 9. 如申請專利範圍第5項之核酸，其中該TGEV感染性病毒 5 顆粒可藉由結合TGEV蛋白與該核酸序列而得，為減毒 性病毒顆粒。 10. 如申請專利範圍第6項之核酸，其中該TGEV感染性病毒 顆粒可藉由結合TGEV蛋白與該核酸序列而得，為減毒 i生病毒顆粒。 10 11 ·如申請專利範圍第7項之核酸，其中該T G E V感染性病毒 顆粒可藉由結合TGEV蛋白與該核酸序列而得，為減毒 性病毒顆粒。 12. 如申請專利範圍第8項之核酸，其中該TGEV感染性病毒 顆粒可藉由結合TGEV蛋白與該核酸序列而得，為減毒 15 性病毒顆粒。 13. 如申請專利範圍第7項之核酸，其中該S基因係衍生自呼 吸道病毒。 14. 如申請專利範圍第8項之核酸，其中該S基因係衍生自呼 吸道病毒。 20 15.如申請專利範圍第11項之核酸，其中該S基因係衍生自 呼吸道病毒。 16. 如申請專利範圍第12項之核酸，其中該S基因係衍生自 呼吸道病毒。 17. 如申請專利範圍第7項之核酸，其中該S基因係衍生自 2 TGEV之腸内株。 18·如申請專利範圍第8項之核酸，其中該S基因係衍生自 TGEV之腸内株。 19‘如申請專利範圍第n項之核酸，其中奶基因係衍生自 TGEV之腸内株。 2〇.如申請專利範圍第12項之核酸，其中該S基因係衍生自 TGEV之腸内株。 21·如申請專利範圍第7項之核酸’其中該S基因已經修飾， 並具有如SEQ ID NO: 1之序列。 22‘如申請專利範圍第8項之核酸，其中該5基因已經修飾， 並具有如SEQ ID NO: 1之序列。 23. 如申請專利範圍第丨至^項任—項之核酸’其中該序列 包含PRRSV之ORF5之一中和性表位，以及〇RF6之至少 一表位。 24. 如申請專利範圍第1至22項任一項之核酸，其中該序列 包含PRRSV之ORF5之一中和性表位，以及〇RF"6之一中 和性表位。 25. 如申請專利範圍第23項之核酸，其中該序列係由pRRsv 之0RF5之一中和性表位，以及整段〇RF6組成。 26. 如申請專利範圍第24項之核酸，其中該序列係由pRRSV 之0RF5之一中和性表位，以及0RF6之一中和性表位組 成。 27. 如申請專利範圍第1至22項任一項之核酸’其中該核酸 包含PRRSV之0RF5與0RF6序列，每一者皆在個別之表 1358455 現調控序列控制下。 28. 如申請專利範圍第27項之核酸，其中該序列係由（1) PRRSV之0RF5序列，在基因3a之轉錄調控序列控制 下、（2) PRRSV之0RF6序列，在如SEQ ID NO·· 19之轉 5 錄調控序列TRS22N控制下，以及(3) S基因序列，衍生自 TGEV之PTV減毒株，組成。 29. 如申請專利範圍第1至22項任一項之核酸，其中該核酸 更編碼溶酶體貫穿性膜蛋白-II (LIMI>II)之溶酶體標靶 訊號。 10 30·如申請專利範圍第29項之核酸，其中該核酸編碼一融合 蛋白，係由LIMPII與PRRSV之ORF5及/或ORF6組成。 31. 如申請專利範圍第1至22項任一項之核酸，其中該核酸 更編碼IL-12之p35次單元或其他介白素。 32. —種重組RNA，由如申請專利範圍第1至31項任一項之 15 核酸所編碼。 33. —種載體’包含如申請專利範圍第1至31項任一項之核 酸0 34·如申請專利範圍第33項之載體，其中該載體為(：01^八載 體。 20 35.如申請專利範圍第34項之載體，其中該載體為 BAC-TGEVFL載體。 36·如申凊專利範圍第35項之載體，其中該bac tgevfl載 體包含如申請專利範圍第30或31項之核酸。 37.如申請專利範圍第33至36項任_項之載體，其中該載體 4 可於宿主細胞中複製該核酸。 38‘~~種宿主細胞，包含如申請專利範圍第33至37項任一項 之載體》 39.如申請專利範圍第38項之宿主細胞，其中該細胞為細菌 、”田胞、酵母菌細胞、昆蟲細胞、動物細胞或人類細胞。 4〇.如申請專利範圍第39項之宿主細胞，其中該細胞為豬睪 丸細胞株，如寄存於ATCC CRL-1746之細胞株。 41. —種病毒顆粒，包含如申請專利範圍第1至31項任一項 之核酸，以及至少一TGEV外殼蛋白。 42. 如申請專利範圍第41項之病毒顆粒，包含自然tgEV病 毒顆粒之所有TGEV外殼蛋白。 43. —種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第丨至31項任一 項之核酸。 44. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第32項之重組 RNA。 45. —種醫藥組成物’包含如申請專利範圍第33至37項任一 項之載體。 46. —種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第38至40項任一 項之宿主細胞。 47. —種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第41或42項之病 毒顆粒。 48. 如申請專利範圍第43至47項任一項之醫藥組成物，更包 含一醫藥上可接受之載劑、賦形劑，及/或佐劑。 49. 一種疫苗’可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請 1358455 專利範圍第1至31項任一項之核酸。 50. —種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請 專利範圍第32項之重組RNA。 51. —種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請 5 專利範圍第33至37項任一項之載體。 52. —種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請 專利範圍第38至40項任一項之宿主細胞。 53. —種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請 專利範圍第41或42項之病毒顆粒。 10 54.如申請專利範圍第49至53項任一項之疫苗，其中該疫苗 為多價疫苗，可提供保護，對抗PRRSV之外之一或多種 緒病原體。 55. 如申請專利範圍第54項之疫苗，更包含衍生自其他病毒 及/或細菌病原體之抗原，及/或可提供對抗病原體之免 15 疫性的蛋白。 56. 如申請專利範圍第54項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自其他病毒性病原體，選自於緒流感病毒、諸細小 病毒、豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟、口蹄疫、 偽狂犬病毒、豬環病毒第1型、豬腺病毒、豬腸病毒、 20 猪呼吸道旭狀病毒、緒輪狀病毒、腦心肌炎病毒、豬流 行性腹瀉病毒、藍眼症病毒、E型肝炎病毒，及/或西尼 羅(West Nile)病毒、立百（Nipah)病毒。 57. 如申請專利範圍第55項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自其他病毒性病原體，選自於豬流感病毒、緒細小 6 1358455 病毒、豬環病毒第2型 '典型豬瘟、非洲豬瘟、口蹄疫、 偽狂犬病毒、豬環病毒第丨型、豬腺病毒、豬腸病毒、 豬呼吸道冠狀病毒 '豬輪狀病毒、腦心肌炎病毒、豬流 行性腹瀉病毒、藍眼症病毒、E型肝炎病毒，及/或西尼 5 羅(West Nlle)病毒、立百(Nipah)病毒。 58.如申請專利範圍第56項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自其他病毒性病原體，選自於豬流感病毒、豬細小 病毒 '豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟，及/或口 蹄疫。 10 59.如申請專利範圍第57項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自其他病毒性病原體，選自於豬流感病毒、豬細小 病毒 '豬環病毒第2型 '典型豬瘟、非洲豬瘟，及/或口 蹄疫。 60.如申請專利範圍第54項之疫苗，更包含一或多種抗原， 15 衍生自細菌性病原體，選自於豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線 桿菌（Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌（Pasteurella multocida type A) 20 (毒素）、D型巴斯德桿菌（Pasteurella multocida type D) (毒素）、支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲（Isospora suis)、豬痢疾蛇 形螺旋菌（Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛樣短螺 旋體（Brachyspira pilosicoli)、胞内勞森菌（Lawsonia 7 1358455 intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌（Escherichia coli)、沙門氏腸炎 桿菌（Salmonella enterica)、肘黴漿菌（Mycoplasma hyorinis)、豬鏈球菌（Streptococcus suis)、格蘭氏陽性產 孢菌（Clostridium perfringens)、梭狀芽胞桿菌 (Clostridium difficile)、諾氏梭菌（Clostridium novyi)、布 氏桿菌（Brucella abortus)，及/或暫定螺旋菌（Candidatus
    helicobacter suis) ° 61.如申請專利範圍第55項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自細菌性病原體，選自於豬肺炎支原體、胸膜肺炎 放線桿菌、溶血性毒素豬放線桿菌、副豬嗜血桿菌、A 型巴斯德桿菌（毒素）、D型巴斯德桿菌（毒素）、支氣管敗 血波氏桿菌、豬等孢球蟲、豬痢疾蛇形螺旋菌、結腸菌 毛樣短螺旋體、胞内勞森菌、紅斑丹毒絲狀菌、大腸桿 菌、沙門氏腸炎桿菌、肘黴漿菌、豬鏈球菌、格蘭氏陽 性產抱菌、梭狀芽胞桿H、諾氏梭菌、布氏桿菌，及/ 或暫定螺旋菌。 &如申請專利範圍第56項之疫苗，更包含—或多種抗原， 何生自細ϋ性病原體，選自於豬肺炎支原體、胸膜肺炎 放線才干菌、溶血性毒素豬放線桿菌、副豬嗜血桿菌、A 型巴斯德桿® (毒素）、D型巴斯德賴(毒素）、支氣管敗 血波氏桿菌、豬等孢球蟲、豬痢疾蛇形螺旋菌、結腸菌 毛樣短螺旋體、胞内勞森菌、紅斑丹毒絲狀菌、大腸桿 菌、沙門氏腸炎桿菌、肘黴聚菌、豬鏈球菌、格蘭氏陽 8 1358455 5
    10 15
    20 性產孢菌、梭狀芽胞桿菌、諾氏梭菌、布氏桿菌及/ 或暫定螺旋菌。 63·如申請專利範圍第57項之疫苗，更包含—或多種抗原， 何生自細菌性病原體，選自於豬肺炎支原體、胸膜肺炎 放線桿菌、溶血性毒素豬放線桿菌、副豬嗜金桿菌、A 型巴斯德桿菌（毒素）、D型巴斯德桿菌（毒素）、支氣管敗 血波氏桿菌、豬等孢球蟲、豬痢疾蛇形螺旋菌、結腸菌 毛樣短螺旋體、胞内勞森菌、紅斑丹毒絲狀菌、大腸桿 菌、沙門氏腸炎桿菌、肘黴漿菌、豬鏈球菌、格蘭氏陽 性產孢菌、梭狀芽胞桿菌、諾氏梭菌、布氏桿菌，及/ 或暫定螺旋菌。 64.如申請專利範圍第54項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自細菌性病原體’選自於豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線 桿菌（Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌（Pasteurella multocida type A) (毒素）、D型巴斯德桿菌（Pasteurella multocida type D) (毒素）、支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲(Isospora suis)、豬痢疾蛇 形螺旋菌（Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛樣短螺 旋體（Brachyspira pilosicoli)、胞内勞森菌（Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌（Escherichia coli)，及/或沙門 9 1358455 氏腸炎桿菌（Salmonella enterica)。 65. 如申請專利範圍第55項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自細菌性病原體，選自於豬肺炎支原體、胸膜肺炎 放線桿菌、溶血性毒素豬放線桿菌、副豬嗜血桿菌、A 5 型巴斯德桿菌（毒素）、D型巴斯德桿菌（毒素）、支氣管敗 血波氏桿菌、豬等孢球蟲、豬痢疾蛇形螺旋菌、結腸菌 毛樣短螺旋體、胞内勞森菌、紅斑丹毒絲狀菌、大腸桿 菌，及/或沙門氏腸炎桿菌。 66. 如申請專利範圍第56項之疫苗，更包含一或多種抗原， 10 衍生自細菌性病原體，選自於豬肺炎支原體、胸膜肺炎 放線桿菌、溶血性毒素豬放線桿菌、副豬嗜血桿菌、A 型巴斯德桿菌（毒素）、D型巴斯德桿菌（毒素）、支氣管敗 血波氏桿菌、豬等孢球蟲、豬痢疾蛇形螺旋菌、結腸菌 毛樣短螺旋體、胞内勞森菌、紅斑丹毒絲狀菌、大腸桿 15 菌，及/或沙門氏腸炎桿菌。 67. 如申請專利範圍第57項之疫苗，更包含一或多種抗原， 衍生自細菌性病原體，選自於豬肺炎支原體、胸膜肺炎 放線桿菌、溶血性毒素豬放線桿菌、副豬嗜血桿菌、A 型巴斯德桿菌（毒素）、D型巴斯德桿菌（毒素）、支氣管敗 20 血波氏桿菌、豬等孢球蟲、豬痢疾蛇形螺旋菌、結腸菌 毛樣短螺旋體、胞内勞森菌、紅斑丹毒絲狀菌、大腸桿 菌，及/或沙門氏腸炎桿菌。 68. 如申請專利範圍第54項之疫苗，其中該其他病毒性或細 菌性抗原係以減毒性或去活性病毒或細菌，或以編碼一 10 69. 70. 71. 72. 或多種其他病毒與細菌抗原之核酸序列，存在於該多價 疫苗中。 如申請專利範圍第54項之疫苗，更包含—核酸序列，其 編碼可提供保護對抗豬病原體之蛋白，如編碼〆或多種 對於細菌或病毒疾病具有特異性之抗體之核酸序列，或 編碼豬普昂（prion)蛋白之核酸序列β 如申請專利範圍第49至53項任一項之疫苗，更包含一醫 藥上可接受之載劑、賦形劑及/或佐劑。 如申請專概圍第49至53項任-奴疫苗，其中該疫苗 適用於接種疫苗於豬隻，較佳為母豬。 如申請專雖@第49至53独-叙疫苗，其中該疫苗 可誘發對抗感染性病毒㈣之“性免疫反應與黏膜 性免疫反應。 1358455
    感染後天數 1358455
    卜LLidoaoBI^s
    感染後天數 1358455
    1358455 pBAC-TGEVFL-SpTV-TRS3a-〇RF5-TRS22N-〇RF6 (C306T)
    1b TRS3a-ORF5 / S TRS22n-ORF6 E
    Μ N 7UTR AAA
    1358455
    1358455 MOCK rTGEV -ORF5-ORF6
    6 圆 1358455 Mw c1 c2 c3 c4 c5 c6 C C+
    1018 l 517 IWWf ^HWr vHp Mi mRNA-ORF5
    mmm» 1018 517 mmm mRNA-ORF6 1358455
    1358455 1 E+08
    <B/nu.dry·^ 1.E+07 E+06 1.E+04 1.E+03 1.E+02 1.E+01
    接種後天數 1358455
    第1Q S 1358455 ϋοιί ,\---c>:s>=rl-二 rs>ll ;_·ν«ν-!「.-(fir {Mill \ 1-----:-.,--: ~ I 一-一 S Λ-Μ.1 IE ul-厂三_/'±*_ Ξ.50 i> 二 VI-二一 Iv-uv(一) -f-s ---sl-l.\-s-{- --¾ mus-ds--" ΐ.·--^1—lv^- i--o— MS佚哆/i--"--ol\-,:js--;->K%s-.I-' 一 s-Λ-ί)-, --ϋ-5,'ν-- t---.s->---i-s I --••-r;J--(-..---=「，-'-:-5M^?「 ~f 1|「卜> d-y',;f<n.3.l31*-s-.o^r<f -a-I> τ 涨谈奢 .ΞΗΗ /ί- wi^iLJXT -3-P〕.|::5穿「'. >52¾ 11 1358455
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    £;〆》Η-πί.ϊέϋ 筇 為 £ ϊί-寸 εζτ-寸ΓΟεπ^ΓΟζτ- β / ndd β〇Ι
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US20110150770A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent vaccine against porcine teschovirus and other disease causing organisms in swine
CN102115755A (zh) * 2010-10-11 2011-07-06 洛阳普莱柯生物工程有限公司 酵母表达猪圆环病毒2型orf2蛋白与亚单位疫苗
EP2457583A1 (en) 2010-11-26 2012-05-30 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acids encoding PRRSV GP5-ecto and M protein
CN102727883B (zh) * 2011-05-27 2014-05-14 华威特（北京）生物科技有限公司 猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟二联疫苗及其用途
CN102727882B (zh) * 2011-10-27 2014-05-14 华威特（北京）生物科技有限公司 猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病的三联活疫苗及其制备方法
MX347210B (es) 2011-05-27 2017-04-19 Sinovet (Beijing) Biotechnology Co Ltd Vacunas combinadas para prevención de infecciones por virus porcino.
CN102727884B (zh) * 2011-10-27 2014-05-14 华威特（北京）生物科技有限公司 猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗及其制备方法
CN105327344B (zh) * 2011-08-01 2019-03-05 普莱柯生物工程股份有限公司 含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用
CN103157100B (zh) * 2011-12-08 2014-09-24 普莱柯生物工程股份有限公司 副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及其制备方法
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
CN102715132A (zh) * 2012-05-04 2012-10-10 吉林大学 猪繁殖与呼吸综合症病毒受体cd163敲除猪及培育方法
KR101641865B1 (ko) * 2013-12-13 2016-07-22 한남대학교 산학협력단 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 전염성 위장염 바이러스의 정량 검출방법
US20160008457A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Merial, Inc. Inactivated Vaccine for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
CN104745578A (zh) * 2015-04-21 2015-07-01 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒二重荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途
CN106929480B (zh) * 2015-12-29 2021-04-27 普莱柯生物工程股份有限公司 猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用
CN106755576A (zh) * 2016-12-27 2017-05-31 湖南新南方养殖服务有限公司 一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光rt‑pcr试剂盒及其用途
CN107266581B (zh) * 2017-06-13 2021-07-09 四川大学 藏猪il-12重组质粒增强pcv2疫苗免疫佐剂的制备方法及应用
CN109232736B (zh) * 2017-07-10 2021-11-09 洛阳普泰生物技术有限公司 特异性结合猪传染性胃肠炎病毒的单克隆抗体、药物组合物、试剂盒及其应用
CN107880120B (zh) * 2017-11-06 2018-10-12 陕西诺威利华生物科技有限公司 一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体及其制备方法
CN110616201A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株核酸标准物质及其制备方法
CN109735551A (zh) * 2018-12-26 2019-05-10 河南农业大学 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组质粒及其构建方法
CN110055251B (zh) * 2019-04-25 2022-05-27 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种调控pcv2病毒增殖的序列及其应用
CN111996213A (zh) * 2020-02-06 2020-11-27 广西大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
CN112812177B (zh) * 2020-08-18 2022-12-09 安徽九川生物科技有限公司 一种鼠源性抗猪传染性胃肠炎病毒的单链抗体及其制备方法
CN112089804A (zh) * 2020-09-17 2020-12-18 楚雄彝族自治州动物疫病预防控制中心 一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法
CN116445454B (zh) * 2023-05-23 2023-11-17 中农种源(深圳)科技有限公司 一种用于培育抗tgev感染的猪品种的成套系统及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2078187B1 (es) * 1994-05-13 1996-07-16 Cynamid Iberica S A Proteinas recombinantes de prrs, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes.
GB2289279B (en) * 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
ES2109189B1 (es) * 1996-03-14 1998-05-16 Iberica Cyanamid Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas.
US6451592B1 (en) * 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
CA2678259C (en) * 1998-12-09 2016-10-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services A recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
PL360096A1 (en) * 2000-05-24 2004-09-06 Merial Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) recombinant avipoxvirus vaccine
US6673580B2 (en) * 2000-10-27 2004-01-06 Genentech, Inc. Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides
MXPA03010427A (es) * 2001-05-17 2004-12-06 Univ Utrecht Particulas del tipo del virus corona que comprenden genomas funcionalmente eliminados.
EP2295590A1 (en) * 2004-09-03 2011-03-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
US7608272B2 (en) * 2005-08-30 2009-10-27 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods and compositions for vaccination of animals with PRRSV antigens with improved immunogenicity
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)

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