CN112089804A

CN112089804A - 一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法

Info

Publication number: CN112089804A
Application number: CN202010979254.8A
Authority: CN
Inventors: 毕峻龙; 黄晓老; 尹革芬; 郑旺华; 杨培昌; 王蕾; 左庆威
Original assignee: Jinghong Animal Husbandry Technology Extension Station; Chuxiong Yi Autonomous Prefecture Animal Disease Prevention And Control Center; Yunnan Agricultural University
Current assignee: Jinghong Animal Husbandry Technology Extension Station; Yunnan Agricultural University; Chuxiong Normal University
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明公开了一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法，大黄藤10～20％；大黄20～30％；黄连5～15％；山奈4～10％；重楼0.1～1％；紫花茉莉3～7％；金银花1～3％；鱼腥草15～25％；板蓝根10～20％，本发明抗病毒、抗菌消炎、清热解毒、利尿消肿、通便的功效，能够通过治疗作用、预防作用和直接杀灭作用三种方式抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的增殖。

Description

一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法

技术领域

本发明涉及药物及其检测技术领域，尤其涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法。

背景技术

中兽医学起源于我国古代，为保障我国畜牧业的健康发展起到了重要作用。中药主要来源于天然药物和加工产品，是我国传统医学的宝贵财富。目前世界上有超过50％抗感染药物与天然植物来源相关。

因此需要体外细胞模型来评价药物对PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征)的体外药效作用及可能得作用机制，需要得到动物临床实验评价药物抑制PRRSV增殖效果，需要证明药物对猪繁殖与呼吸综合征的临床用药提供理论依据。

发明内容

本发明的提供一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法。

本发明的方案是：

一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物，包括下列重量份的原料：

作为优选的技术方案，包括下列重量份的原料：

本发明还提供了一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物检测方法，包括下列步骤：

1)药物提取，将10～20％重量份的大黄藤、20～30％重量份的大黄、5～15％重量份的黄连、4～10％重量份的山奈、0.1～1％重量份的重楼、3～7％重量份的紫花茉莉、1～3％重量份的金银花、15～25％重量份的鱼腥草与10～20％重量份的板蓝根进行破碎，破碎后的粉末进行混匀，然后取其中一定量的混合药物放入砂锅中，往砂锅内倒入适量的蒸馏水，用玻璃棒不断搅拌，直到蒸馏水完全淹没，用加热砂锅，用玻璃棒不断搅拌，待水沸腾，沸腾10min后，用粗纱布过滤混合药物，转移到一号烧杯中；向混合药物残渣中加入适量的水，继续加热，沸腾后10min，用粗纱布继续过滤，转移到二号烧杯中；继续向混合药物滤渣中加入适量的水，加热，沸腾10min后，粗纱布过滤，转移到三号烧杯中；将一号烧杯、二号烧杯与三号烧杯内的滤液合并一起，用抽滤瓶进行抽滤，然后放入烘箱中进行浓缩，浓缩到相应的体积，计算得到药物浓度，过滤分装后，于4℃保存备用，得到提取药物；

2)提取药物对Marc-145细胞的毒性处理，获得细胞抑制率与细胞存活率，得出提取药物的最大无毒浓度TC₀与半数毒性浓度TC₅₀；

3)多种给药方式评价提取药物体外抗猪繁殖与呼吸综合征效果，获得各种给药方式的提取药物的半抑制浓度；

4)多种给药方式对病毒毒力的影响，获得各种给药方式的提取药物的50％组织细胞感染量；

5)提取药物对病毒ORF7基因mRNA表达的影响，RT-qPCR特异性检测引物的设计与合成；不同有效浓度提取药物与不同给药方式作用猪繁殖与呼吸障碍综合征后病毒ORF7基因mRNA的表达变化；RNA提取；RNA定量、反转录和qPCR；

6)提取药物对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达的影响；

7)提取药物在临床上的实验，通过临床上的实验观察提取药物对猪繁殖与呼吸障碍综合征感染猪仔临床体征与病理变化影响，然后进行提取药物对肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征ORF7基因的表达变化影响，提取药物对肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达的影响，通过IHC检测猪繁殖与呼吸障碍综合征在肺脏组织中的表达，获得提取药物的检测结果。

作为优选的技术方案，所述步骤3)中多种给药方式包括预防作用给药、治疗作用给药与直接灭杀作用给药。

作为优选的技术方案，所述步骤4)中多种给药方式包括预防作用给药、治疗作用给药与直接灭杀作用给药。

作为优选的技术方案，所述步骤5)中RNA定量、反转录和qPCR包括下列步骤：a)总RNA浓度及纯度测定；b)将提取的RNA反转录为cDNA；c)将反转录产物cDNA作为qPCR的模板，用来扩增ORF7基因与GAPDH基因。

作为优选的技术方案，所述步骤7)中提取药物对肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达的影响，进行采集猪的肺脏，然后通过蛋白质印迹法检测肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达。

作为优选的技术方案，所述蛋白质印迹法检测肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达包括以下步骤：

1)蛋白样品的制备；

2)SDS-PAGE电泳与转膜；

3)抗体孵育；

4)化学发光与显影。

由于采用了上述技术方案，一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法，包括下列步骤：1)药物提取，将10～20％重量份的大黄藤、20～30％重量份的大黄、5～15％重量份的黄连、4～10％重量份的山奈、0.1～1％重量份的重楼、3～7％重量份的紫花茉莉、1～3％重量份的金银花、15～25％重量份的鱼腥草与10～20％重量份的板蓝根进行破碎，破碎后的粉末进行混匀，然后取其中一定量的混合药物放入砂锅中，往砂锅内倒入适量的蒸馏水，用玻璃棒不断搅拌，直到蒸馏水完全淹没，用加热砂锅，用玻璃棒不断搅拌，待水沸腾，沸腾10min后，用粗纱布过滤混合药物，转移到一号烧杯中；向混合药物残渣中加入适量的水，继续加热，沸腾后10min，用粗纱布继续过滤，转移到二号烧杯中；继续向混合药物滤渣中加入适量的水，加热，沸腾10min后，粗纱布过滤，转移到三号烧杯中；将一号烧杯、二号烧杯与三号烧杯内的滤液合并一起，用抽滤瓶进行抽滤，然后放入烘箱中进行浓缩，浓缩到相应的体积，计算得到药物浓度，过滤分装后，于4℃保存备用，得到提取药物；2)提取药物对Marc-145细胞的毒性处理，获得细胞抑制率与细胞存活率，得出提取药物的最大无毒浓度TC₀与半数毒性浓度TC₅₀；3)多种给药方式评价提取药物体外抗猪繁殖与呼吸综合征效果，获得各种给药方式的提取药物的半抑制浓度；4)多种给药方式对病毒毒力的影响，获得各种给药方式的提取药物的50％组织细胞感染量；5)提取药物对病毒ORF7基因mRNA表达的影响，RT-qPCR特异性检测引物的设计与合成；不同有效浓度提取药物与不同给药方式作用猪繁殖与呼吸障碍综合征后病毒ORF7基因mRNA的表达变化；RNA提取；RNA定量、反转录和qPCR；6)提取药物对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达的影响；7)提取药物在临床上的实验，通过临床上的实验观察提取药物对猪繁殖与呼吸障碍综合征感染猪仔临床体征与病理变化影响，然后进行提取药物对肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征ORF7基因的表达变化影响，提取药物对肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达的影响，通过IHC检测猪繁殖与呼吸障碍综合征在肺脏组织中的表达，获得提取药物的检测结果。

本发明的优点：

大黄藤、黄连、金银花和鱼腥草具有清热解毒、凉血止血、凉散风热、抗菌、抗肿瘤、抗凝血的功效，共为君药；大黄、紫花茉莉有泻下通便、退热、利胆、利胰，抗惊厥、抗菌、抗炎、清热利湿、利尿消肿、活血散淤的作用，为臣药；板蓝根，重楼具有清热解毒、抗病毒、消炎止痛、平喘止咳、熄风定惊、活血消肿，抑制真菌、止血、抗菌消炎和镇咳作用，为佐药；山奈行气温中、消食、止痛，黄酒通行十二经络，为使药，组方配伍具有抗病毒、抗菌消炎、清热解毒、利尿消肿、通便的功效；

实现了体外细胞模型来评价复本发明对PRRSV的体外药效作用及可能得作用机制，使用本动物临床实验评价本发明抑制PRRSV增殖效果，从而实现了本发明对猪繁殖与呼吸综合征的临床用药提供理论依据；

本发明能够通过治疗作用、预防作用和直接杀灭作用三种方式抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的增殖。

附图说明

图1为实施例4中药物对细胞的毒性试验图，(其中，A:200mg/ml；B：100mg/ml；C：50mg/ml；D:25mg/ml；E:12.5mg/ml；F:6.25mg/ml；G:3.13mg/ml；H:1.56mg/ml；I:0.78mg/ml；J:0.39mg/ml；K:0.195mg/ml；L:Control)；

图2为实施例4中Marc-145细胞在不同药物浓度下的存活率图；

图3为实施例4中本发明药物预防作用图；

图4为实施例4中替米考星预防作用图；

图5为实施例4中本发明药物直接杀灭作用图；

图6为实施例4中替米考星直接杀灭作用图；

图7为实施例4中本发明药物治疗作用图；

图8为实施例4中替米考星治疗作用图；

图9为实施例4中本发明药物对PRRSVORF7基因mRNA的影响图；

图10为实施例4中本发明药物对PRRSV N蛋白表达的影响图；

图11为实施例4中仔猪直肠提问记录图；

图12为实施例4中仔猪临床症状评分图；

图13为实施例4中接毒组较中药治疗组和治疗对照组PRRSV ORF7相对表达量变化图；

图14为实施例4中肺组织PRRSV N蛋白表达图；

图15为实施例4中仔猪临床体征、病理变化图。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物及其检测方法以解决上述背景技术中的问题。

包括下列重量份的原料：

1)药物提取，将10～20％重量份的大黄藤、20～30％重量份的大黄、5～15％重量份的黄连、4～10％重量份的山奈、0.1～1％重量份的重楼、3～7％重量份的紫花茉莉、1～3％重量份的金银花、15～25％重量份的鱼腥草与10～20％重量份的板蓝根进行破碎，破碎后的粉末进行混匀，然后取其中一定量的混合药物放入砂锅中，往砂锅内倒入适量的蒸馏水，用玻璃棒不断搅拌，直到蒸馏水完全淹没，用加热砂锅，用玻璃棒不断搅拌，待水沸腾，沸腾10min后，用粗纱布过滤混合药物，转移到一号烧杯中；向混合药物残渣中加入适量的水，继续加热，沸腾后10min，用粗纱布继续过滤，转移到二号烧杯中；继续向混合药物滤渣中加入适量的水，加热，沸腾10min后，粗纱布过滤，转移到三号烧杯中；将一号烧杯、二号烧杯与三号烧杯内的滤液合并一起，用抽滤瓶进行抽滤，然后放入烘箱中进行浓缩，浓缩到相应的体积，计算得到药物浓度，过滤分装后，于4℃保存备用，得到提取药物；2)提取药物对Marc-145细胞的毒性处理，获得细胞抑制率与细胞存活率；

3)多种给药方式评价提取药物体外抗猪繁殖与呼吸综合征效果，获得各种给药方式的提取药物的半抑制浓度，得出提取药物的最大无毒浓度TC₀与半数毒性浓度TC₅₀；

所述步骤3)中多种给药方式包括预防作用给药、治疗作用给药与直接灭杀作用给药。

所述步骤4)中多种给药方式包括预防作用给药、治疗作用给药与直接灭杀作用给药。

所述步骤5)中RNA定量、反转录和qPCR包括下列步骤：a)总RNA浓度及纯度测定；b)将提取的RNA反转录为cDNA；c)将反转录产物cDNA作为qPCR的模板，用来扩增ORF7基因与GAPDH基因。

所述步骤7)中提取药物对肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达的影响，进行采集猪的肺脏，然后通过蛋白质印迹法检测肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达。

所述蛋白质印迹法检测肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达包括以下步骤：

1)蛋白样品的制备；

2)SDS-PAGE电泳与转膜；

3)抗体孵育；

4)化学发光与显影。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

药物提取，将10％重量份的大黄藤、20％重量份的大黄、5％重量份的黄连、4％重量份的山奈、0.1％重量份的重楼、3％重量份的紫花茉莉、1％重量份的金银花、15％重量份的鱼腥草与10％重量份的板蓝根进行破碎，破碎后的粉末进行混匀。

实施例2：

药物提取，将20％重量份的大黄藤、30％重量份的大黄、15％重量份的黄连、10％重量份的山奈、1％重量份的重楼、7％重量份的紫花茉莉、3％重量份的金银花、25％重量份的鱼腥草与20％重量份的板蓝根进行破碎，破碎后的粉末进行混匀。

实施例3：

将15.5％重量份的大黄藤、25％重量份的大黄、10％重量份的黄连、7％重量份的山奈、0.5％重量份的重楼、5％重量份的紫花茉莉、2％重量份的金银花、20％重量份的鱼腥草与15％重量份的板蓝根进行破碎，破碎后的粉末进行混匀。

实施例4：

材料

药物和细胞

试验药物为实施例3中的混合药物，试验药物、病毒PRRSV YN-1株由云南农业大学动物传染病实验室提供，病毒在Marc-145细胞上的毒力为10-5.5TCID50/0.1ml。Marc-145细胞培养于6孔细胞培养板，在37℃、5％CO2培养箱中传代培养。

主要试剂和耗材

细胞培养试剂：DMEM液体培养基、青霉素-链霉素双抗和0.25％胰蛋白酶均、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；其它化学试剂由楚雄州动物疫病预防控制中心和云南农业大学动物传染病实验室提供，所有试剂级别均为分析纯。

分子生物学试剂：RNAiso Plus购自宝生物工程(大连)有限公司(Cat.No.9109)；DEPC购自Sigma公司(Cat.No.V900882)；qPCR相关试剂：反转录试剂iScriptTM cDNASynthesis Kit购自BIO-RAD公司(Cat.No.170-8891)；荧光染料SsoFastTMEva

Supermix购自BIO-RAD公司(Cat.No.

172-5201AP)。

Western blot实验相关试剂：SDS-PAFE试剂盒购自Biosharp公司(Cat.No.BL508A)，蛋白酶抑制剂(PMSF)细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜购自BIO-RAD公司(Cat.No.162-0177)；PRRSV核蛋白(N)抗体购自VMRD公司(Cat.No.080728–004)；羊抗兔(Cat.no.SA00001-2)二抗购自Proteintech公司。

IHC实验相关试剂：HE染色试剂盒(Cat.No.G1120)和柠檬酸钠抗原修复液50×购自北京索莱宝(Cat.No.C1032)，通用二步法检测试剂盒(小鼠/兔增强聚合物法检测系统)(Cat.No.PV-9000)和DAB显色液(Cat.No.Zli-9017)购自北京中杉金桥。石蜡、蜂蜡、甲醛、无水乙醇、二甲苯等购自国药集团化学试剂有限公司。

实验耗材：一次性PE手套、一次性灭菌橡胶外科手套、医用口罩和帽子购自上海科邦医用乳胶器材有限公司，移液器吸头、离心管和PCR管购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要仪器设备

1300ERIES A2生物安全柜(Thermo Scientific公司)；Forma SoriesⅡ型二氧化碳培养箱(Thermo公司)；生物倒置显微镜(OLYMPUS公司)；DHG-9240A型电热恒温型鼓风干燥箱(上海中友仪器设备有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；移液器(DRAGON公司)；5430R型高速冷冻离心机(Eppendorf)；721BR14290凝胶成像系统(Bio-RAD)；电泳仪(北京六一仪器厂)；C1000TouchPCR仪(MJ Bio-RAD)；恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)；NP968-S全自动核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)PHS-3D型PH计(上海精密科学仪器有限公司)等，均由楚雄州动物疫病预防控制中心提供。

方法

药物成份的提取

称取实施例3中混合药物50g放入砂锅中，加入50ml蒸馏水，用玻璃棒不断搅拌，直到蒸馏水完全淹没。用电炉加热砂锅，待水沸腾(期间用玻璃棒不断搅拌，防止药物溢出)，沸腾10min后，用粗纱布过滤药物，转移到新的烧杯中，记为滤液1；向药物残渣中加入适量的水，继续加热，沸腾后10min，用粗纱布继续过滤，转移到新的烧杯中，此时记为滤液2；继续向滤渣中加入适量的水，加热，沸腾10min后，粗纱布过滤，转移到新的烧杯中，此时记为滤液3。将滤液1、2、3合并一起，用抽滤瓶进行抽滤，然后放入烘箱中进行浓缩，浓缩到相应的体积，计算得到药物浓度，过滤分装后，于4℃保存备用，得到提取药物。

药物对Marc-145细胞的毒性

待Marc-145细胞长至致密单层时，用DMEM培养基对上述实验中的提取药物做2倍梯度稀释，浓度依次为：100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.13mg/ml、1.56mg/ml、0.78mg/ml、0.39mg/ml和0.195mg/ml，每个稀释度做3个重复，设正常细胞对照。将添加药物的细胞于二氧化碳培养箱中培养48h后，将每一孔细胞培养液吸弃，统一用DMEM溶液轻轻冲洗细胞培养孔，每孔加入100μL DMEM，再向每孔中加入30μL MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑内盐)溶液，将96孔板放到振荡器上混匀1-2min，使MTS试剂与Marc-145细胞充分接触，然后放入细胞培养箱内孵育3h，孵育结束之后，再用振荡器振荡1-2min，用酶标仪测定493nm处的吸光值，采用SPSS处理数据，数据用Mean±SD表示，各药物浓度与正常细胞组进行T检验比较，计算方式如下：

(1)细胞抑制率(％)＝[(对照组吸光值-实验组吸光值)/对照组吸光值]×100％；

(2)细胞存活率(％)＝100％–细胞抑制率(％)

药物对药物对细胞的毒性实验结果

Marc-145细胞经不同浓度药物处理后72h，显微镜观察细胞的损伤程度如图1(200×)与下表1所示。从图1可知高浓度药物对Marc-145细胞具有一定的毒性，细胞损伤严重，随着浓度的降低，细胞损伤程度逐渐减弱。通过OD值计算药物作用细胞后细胞的存活率(见图2)，用SPSS分析处理数据结果显示，药物的最大无毒浓度TC₀为1.56mg/ml，半数毒性浓度TC₅₀为38.3mg/ml。

表1 MTS法测定药物对Marc-145细胞的毒性

Table1 The cytotoxic effects of Dai medicine on Marc-145cells by MTS

注：“a”表示差异极显著(P＜0.01)，“b”表示差异显著(P＜0.05)。

三种不同给药方式评价药物体外抗PRRSV效果

给药方式一(预防作用给药)：从最大无毒浓度开始，用DMEM培养基将药物倍比稀释4个浓度，加到Marc-145单层细胞上，每孔100μL，每个稀释度做5个重复，37℃作用4h，弃去药物，然后每孔加入100TCID50的PRRSV，同时设置病毒对照组、正常细胞对照组和阳性药物替米考星对照组，37℃培72h，并观察细胞病变，用Reed-Muench两氏法计算提取药物和替米考星化合物的IC₅₀。

给药方式二(治疗作用给药)：当Marc-145细胞长至80％时，加入100TCID₅₀的PRRSV，37℃感作1h，然后弃去病毒液，加入各倍比稀释的药物，设置病毒对照组、正常细胞对照组和阳性药物替米考星对照组，37℃培养72h，观察细胞病变，用Reed-Muench两氏法计算药物和替米考星化合物的IC₅₀。

给药方式三(直接杀灭作用给药)：将各稀释度的药物分别与等体积100TCID₅₀病毒量的PRRSV混合，37℃作用4h，同时病毒对照组37℃作用4h，然后加到Marc-145单层细胞上，每孔100μL，设置病毒对照组、正常细胞对照组和阳性药物替米考星对照组，37℃培养72h，每天观察细胞病变，用Reed-Muench两氏法计算药物和替米考星化合物的IC₅₀。

IC₅₀和SI计算公式参照文献《抗病毒药物及其研究方法》：

(1)距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)；

(2)lgIC₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数；

(3)选择指数SI＝TC₅₀/IC₅₀。

三种不同给药方式评价药物体外抗PRRSV效果

用显微镜观察细胞的CPE，采用Reed-Muench法计算药物在Marc-145细胞上抑制PRRSV的半数抑制浓度(IC₅₀)，病毒致细胞CPE如下所示(200×)，结果表明：本发明能够通过治疗作用、预防作用和直接杀灭作用三种方式抑制病毒的增殖，IC₅₀分别为0.265mg/ml、0.300mg/ml和0.282mg/ml，选择指数SI分别为144.53、127.67和135.82，选择指数SI显著高于对照药物。

(图3、图5和图7浓度和标识均为：A：1.56mg/ml；B：0.78mg/ml；C：0.39mg/ml；D：0.195mg/ml；E：Virus control；F：Normal control；图4、图6和图8浓度和标识均为A：50μM；B：25μM；C：12.5μM；D：6.25μM；E：Virus control；F：Normal control)

三种不同给药方式对病毒毒力(TCID₅₀)的影响

三种不同给药方式分别采用预防作用给药、治疗作用给药与直接灭杀作用给药，进行病毒毒力(TCID₅₀)测定方法。

用显微镜观察细胞CPE，采用Reed-Muench方法计算三种不同给药方式对病毒毒力(TCID₅₀)的影响，结果表明：本发明药物在治疗、预防和直接杀灭作用三种方式下，病毒毒力分别为10^-3.39/100μL、10^-3.12/100μL和10^-2.59/100μL，均能降低病毒毒力(10^-5.39/100μL)2个滴度，见表2、表3、表4、表5与表6。

表2 PRRSV对Marc-145细胞的病变效应(CPE)

Table2 Cytopathological effects(CPE)of Marc-145cells induced by PRRSVinfection

注：距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝(70-50)/(70-18.2)＝0.59；lgTCID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝0.39×(-1)+(-5)＝-5.39；TCID₅₀＝10^-5.39/100μL。

表3预防作用给药后PRRSV对Marc-145细胞的病变效应(CPE)

Table3Cytopathological effects(CPE)of Marc-145cells after preventivetreatment with medicine

注：距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝(66.7-50)/(66.7-9)＝0.29；lgTCID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝0.29×(-1)+(-3)＝-3.39；TCID₅₀＝10^-3.39/100μL。

表4直接杀灭作用给药后PRRSV对Marc-145细胞的病变效应(CPE)

Table4Cytopathological effects(CPE)of Marc-145cells after directvirus-killing treatment with medicine

注：距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝(55.6-50)/(55.6-8.30)＝0.12；lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝0.12×(-1)+(-3)＝-3.14。TCID₅₀＝10^-3.12/100μL。

表5治疗作用给药后PRRSV对Marc-145细胞的病变效应(CPE)

Table5Cytopathological effects(CPE)of Marc-145cells after therapeutictreatment with medicine

注：距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝(90-50)/(90-22.2)＝0.59；lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝0.59×(-1)+(-2)＝-2.59；TCID₅₀＝10^-2.59/100μL。

表6不同给药方式作用对PRRSV TCID₅₀的影响

Table6The effects of different treatment modes on PRRSV TCID₅₀

药物对病毒ORF7基因mRNA表达的影响

(1)RT-qPCR特异性检测引物的设计与合成

根据GenBank中公布的猴源GAPDH基因序列(NM_001319428.1)，利用Primer5.0和Oligo 6软件分别设计猴源GAPDH基因检测引物GAPDH-F和GAPDH-R，PRRSV ORF7基因检测引物ORF7-F和ORF7-R参照表1.6。ORF7基因检测引物可用于qPCR荧光染料法。引物由大连宝生物公司合成，见表7。

表7引物序列

Table7Primer sequences

(2)不同有效浓度药物和不同给药方式作用PRRSV后病毒ORF7基因mRNA的表达变化

按照药物对Marc-145细胞的毒性中稀释药物的操作方法稀释提取药物，使药物浓度为1.56mg/ml、0.78mg/ml、0.39mg/ml、0.195mg/ml；按照治疗作用、预防作用和直接杀灭作用方式给药，共3个重复，在培养箱中培养72h，收集细胞样品用于检测ORF7基因的mRNA表达变化。针对每种给药方式的细胞样品和阳性药物进行RNA提取，反转录时RNA定为450ng，用RT-qPCR检测ORF7基因的mRNA表达变化，以GAPDH为内参，计算ORF7基因mRNA的相对和绝对表达量。采用SPSS软件处理数据，数据用Mean±SD表示，并进行统计学分析。

(3)RNA提取

按照磁珠法试剂说明书提取实验组、病毒对照组、正常对照组、阳性对照组的细胞总RNA。

(4)RNA定量、反转录和qPCR

(A)总RNA浓度及纯度测定

先取适量RNA用DEPC水稀释40倍，再取DEPC水冲洗100μL石英杯2次，然后用100μLDEPC水调零，在石英杯中加入100μL RNA稀释液，即可用核酸定量仪测定其在260nm/280nm处的吸光值和核酸浓度，RNA纯度根据A260/A280比值判定，比值1.8～2.0说明纯度较高，可用于后续实验。

(B)根据反转录试剂盒(iScriptTM cDNA Synthesis Kit)操作说明，将所提取的RNA反转录为cDNA，反转录体系如下表8所示：

表8 PRRSV特异性基因扩增反转录体系

Table8 PRRSV Reverse Transcription System

反转录程序：37℃ 15min，85℃ 30s，结束后放于4℃备用。

(C)将(B)中所得到的反转录产物cDNA作为qPCR的模板，参考SsoFastTMEva

Supermix(荧光试剂盒)说明，分别扩增ORF7基因和GAPDH基因，qPCR体系如表9所示：

表9 PRRSV特异性基因PCR扩增体系

Table9 PRRSV PCR amplification system

通过对扩增ORF7和GAPDH基因的引物退火温度进行优化，最终得出适合扩增目标基因的qPCR反应程序，95℃预变性120s；95℃变性30s，60℃退火30s；循环35次。收集整理读板后的实验数据。

使用qPCR方法检测药物处理组、病毒对照组ORF7基因的mRNA，以GAPDH为内参，反转录时RNA量定为450ng，计算药物处理组与病毒对照组ORF7基因mRNA相对表达量变化，如图3.9所示，药物的4种有效浓度都能抑制蓝耳病毒的增殖，抑制效果呈现正相关关系，1.56mg/ml的药物浓度作用病毒后，ORF7基因mRNA的相对表达量最低，反正浓度越低，ORF7基因mRNA相对表达量越高(见图9)

药物对PRRSV N蛋白表达的影响

待Marc-145细胞密度达到80％时，接种100TCID50的PRRSV，感作1h后添加浓度分别为1.56mg/ml、0.78mg/ml、0.39mg/ml、0.195mg/ml的药物，并设置正常对照、病毒对照组和阳性药物处理组，在添加药物48h后用于IFA检测。先用37℃预温的1×PBS(PH7.4)漂洗细胞3遍(每次浸泡2min)。

4％多聚甲醛固定细胞：向漂洗干净的细胞中缓慢加入100μL预冷的4％多聚甲醛，放入4℃冰箱中固定30min。固定结束后用冷的1×PBS(pH7.4)漂洗3遍(每次浸泡2min)，自然干燥。0.3％Triton X-100穿透：经上面步骤清洗过后，用0.3％Triton X-100穿透15min。用1％脱脂奶粉封闭：每孔加入1％的脱脂奶粉，把96孔全部浸泡即可，4℃封闭2h；然后加一抗处理。

一抗处理：滴加终浓度为5μg/ml PRRSV一抗，每孔50μL，4℃过夜，清洗、晾干，吸去一抗，用1×PBS漂洗3次(每次浸泡5min)，自然干燥。

二抗处理：滴加FITC标记的羊抗鼠二抗100μL(浓度为5μg/ml)，37℃孵育1h；吸取二抗后用1×PBS漂洗3次(每次浸泡5min)。所有操作避光操作，以防荧光淬灭。二抗处理完之后，每孔加入DAPI，50μL/孔，室温孵育10min，1×PBS洗3遍，每次5min，然后用荧光显微镜进行观察并拍照记录。

间接免疫荧光(IFA)结果可见，与病毒对照组发出强烈绿色荧光相比，1.56mg/ml浓度药物作用病毒后，PRRSV N蛋白的绿色荧光信号较弱，随着药物浓度降低时，绿色荧光信号逐渐增多(图10)，但均低于病毒对照组，抑制效果呈现正相关关系。

药物体内抗病毒活性实验

从环境相对隔离的云南农村散养户中购买3-4周龄的仔猪，通过RT-PCR和ELISA筛选16头PRRSV抗原和抗体均为阴性的仔猪用于动物实验。16头仔猪随机分成4个组，即中药治疗组、治疗对照组、接毒对照组和正常对照组，每组4头仔猪。每组分别在不同的隔离室中饲养。中药治疗组、治疗对照组、接毒对照组的12头仔猪经肌肉注射接种3ml PRRSV YN-1株(10-5.5TCID50/0.1ml)，正常对照组经肌肉注射接种3ml细胞培养上清液。同时，中药治疗组按照1g/kg/头/天的量将中药拌到饲料中进行治疗，对照治疗组按照0.01g/kg/头/天的量将替米考星拌到饲料中进行治疗。

药物对PRRS感染仔猪临床体征和病理变化的影响

每天观察并记录仔猪的精神状态、采食、饮水、发病情况等。每天测量仔猪的直肠温度，按照总临床评分(GCS)、呼吸临床评分(RCS)和神经体征评分(NSS)标准进行临床体征评分。分别在第2天、第4天、第6天、第8天解剖一头仔猪，观察记录病理变化。

药物对PRRS临床体温变化的影响，攻毒24h后，仔猪体温开始上升。接毒组仔猪体温快速上升到41℃，并在之后一直维持在41℃左右，体温最高时达到41.8℃。中药治疗组体温总体低于接毒组仔猪体温，体温基本维持在40.5℃左右。治疗对照组体温最高为40.8℃，低于接毒对照组，略高于中药治疗组。正常对照组仔猪的直肠温度保持在40℃以下(图11)。表明中药具有一定降低发病仔猪体温的效果。

药物对临床评分的影响，按照临床症状评分系统对实验组总临床评分(GCS)、呼吸临床评分(RCS)和神经体征评分(NSS)进行评分。接毒对照组仔猪出现较为严重临床症状，包括精神萎靡、厌食、嗜睡，皮肤发红、耳朵发绀、呼吸困难、颤抖和共济失调，并有两头仔猪因为呼吸困难而死亡。中药治疗组和治疗对照组的仔猪在实验过程中也出现了精神萎靡、厌食、嗜睡、皮肤发红、呼吸困难等临床症状，但临床症状和评分均明显低于接毒对照组(图12)药物治疗对仔猪临床体征影响，接种PRRSV 24h后，接毒对照组仔猪体温开始升高，体温很快上升到41℃以上，出现喜卧、采食量减少的症状；接种病毒2天后，仔猪出现呼吸急促，并伴有腹泻的症状；接种病毒4天后，仔猪开始嗜睡；接种病毒6天，仔猪阴囊发绀；接种病毒8天，仔猪出现呼吸困难、双眼肿胀、肌肉震颤、共济失调、昏睡、前肢水肿、耳朵发绀等典型的PRRSV临诊症状，1头仔猪因呼吸困难死亡。

治疗对照组仔猪接毒后，也表现出类似症状，主要的临床症状为采食、饮水量下降，随着病程延长仔猪出现皮肤发红、精神沉郁、呼吸急促、呼吸困难、昏睡等临床症状，但临床症状轻于接毒对照组，未出现仔猪死亡。中药治疗组接种PRRSV 24h，仔猪体温升高，维持在40.5℃左右。接种病毒2天后，仔猪能正常采食，随着病程延长，第8天仔猪出现腹泻、皮肤发红、精神沉郁、呼吸困难、嗜睡等临床症状，但未出现肌肉震颤、共济失调、运动障碍等症状，相对于接毒对照组和治疗对照组，症状较轻。正常对照仔猪精神状态良好，采食饮水正常，呈健康状态(图15A)

药物对肺脏组织中PRRSV ORF7基因的表达变化影响

分别在第2天、第4天、第6天、第8天解剖一头仔猪，采集实验组和对照组的肺脏组织，通过RT-PCR检测肺部组织中PRRSV ORF7基因的表达，RT-PCR检测方法同药物对上述病毒ORF7基因mRNA表达的影响实验中的RT-PCR检测方法操作方法。

提取实验组仔猪的肺脏组织总RNA，使用RT-qPCR方法检测接毒组与治疗对照组、中药治疗组肺脏组织中PRRSV ORF7基因mRNA表达变化。通过2^-△△Ct方法分析实验数据。试验结果详见图13，可见治疗对照组和接毒对照组的仔猪肺组织中的PRRSV表达明显高于中药治疗组，提示：本发明药物具有有明显的抑制PRRSV作用。

药物对肺脏组织中PRRSV N蛋白表达的影响

分别采集第2天、第4天、第6天、第8天实验组和对照组猪的肺脏，采用Westernblot检测肺脏组织中PRRSV N蛋白表达，实验过程如下：

(1)蛋白样品的制备。将组织研磨碎后，按照每20mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液充分裂解，高速离心后去上清，通过Bicinchoninic acid(BCA)法测定提取的蛋白样品浓度，加入上样缓冲液和0.4％溴酚蓝溶液后混匀，置于沸水中使蛋白质充分变性，蛋白上样量为10μg。

(2)SDS-PAGE电泳和转膜。灌胶与上样：玻璃板对齐后垂直卡于架上准备灌胶；按照SDS-PAGE试剂盒说明配制10％分离胶，用1ml加样枪灌胶，每块胶约4.5ml，加完分离胶后用异丙醇液封闭30min，倒去胶上层异丙醇。按照SDS-PAGE试剂盒说明配制5％的浓缩胶，每块胶约需1ml。浓缩胶灌满后将梳子插入浓缩胶中，待充分凝固后拔出。置于电泳仪中，每孔加入10μL样品。使用60V恒压电泳大约25min后，改用90V恒压继续电泳3h，将分离胶置于湿转缓冲液中，采用湿转发法转膜，200mA转膜1h后关闭电源，取出PVDF膜。

(3)抗体孵育。使用5％脱脂奶粉对PVDF膜封闭1小时，加入一抗4℃孵育过夜后，用TBST在室温摇床上洗三次，每次10min。加入二抗室温下孵育1-2h后，用TBS在摇床上洗三次，每次10min，进行化学发光反应。

(4)化学发光和显影。发光液的配置：ECL A液及B液按1:1配制，充分混匀。将曝光的膜放于发光液中1min，置于曝光盒进行胶片曝光显影。

使用Western blot方法检测肺脏中PRRSV N蛋白表达变化，可见接毒4天后，接毒对照组可以检测到PRRSV N蛋白，随后PRRSV N蛋白开始大量表达。相对于接毒组，治疗对照组PRRSV N蛋白在第4天开始表达，但是表达量明显的低于接毒对照组，中药治疗组PRRSV N蛋白明显低于治疗对照组和接毒对照组，提示：本发明药物能有效抑制病毒增殖(图14)。

IHC检测PRRSV在肺脏组织中的表达

采用免疫组织化学(IHC)法检测PRRSV在肺脏组织中的表达，步骤如下。固定：使用10％中性福尔马林固定新鲜肺脏组织，一般固定时间不少于48h。脱水透明：使用由低浓度到高浓度酒精(75％-85％-95％-100％)作脱水剂逐渐脱去组织块中的水份，再将组织块置于既能溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，用二甲苯替换出组织块中的酒精。浸蜡：将透明好的组织块浸于蜡缸中，58℃～60℃，左蜡缸1h，右蜡缸1h。包埋：提前打开包埋机，包埋组织块。切片、展片：用切片机连续切片，厚度为4μm，展片台展片，于65℃烤片机中烤片2h以上，用于HE和IHC。脱蜡：分别使用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ和100％酒精各浸泡5min，95％酒精、80％酒精和70％酒精各浸泡5min，自来水冲洗2min，实验保证切片不干。HE染色：苏木素染色1～8min，2min后冲洗观察。染色结束后自来水冲洗5min。1％盐酸乙醇分化7～10s。水洗5min。返蓝(饱和LiCO3)8s。严格控制时间，水洗1min。伊红染色：染色30s，水洗1min。85％乙醇15s、95％乙醇Ⅰ15s、95％乙醇Ⅱ10s、100％乙醇Ⅰ30s、100％乙醇Ⅲ30s、二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min、二甲苯Ⅲ5min、封片：滴加中性树胶，加盖玻片，放置干燥，镜检观察拍照。

IHC：脱蜡结束后，将切片浸泡在抗原修复液(1×)中，95-100℃加热约15min，加入内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min。加入一抗37℃孵育60min后清洗，滴加反应增强液室温孵育20min后清洗，滴加增强酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物：室温孵育20min清洗，加入AEC显色液，室温孵育5min。苏木素复染结束后，滴加中性树胶封片，加盖玻片，放置干燥，镜检观察拍照。

药物治疗对仔猪肺脏病理形态变化的影响，将接毒对照组死亡仔猪解剖后，肺部可见弥漫性间质性肺炎，肺间质增宽，出血水肿，尖叶、心叶发生虾肉样变，肺门淋巴结水肿。将HE染色的肺脏放于显微镜下观察组织病理学变化，发现接毒组肺脏呈现广泛的出血、浆液性肺炎，肺泡壁增厚，细支气管、肺泡隔和肺泡间隙周围的炎性细胞浸润。治疗对照组仔猪剖解可见弥漫性间质性肺炎，肺水肿、肺门淋巴结水肿，组织病理学观察可见肺泡壁增厚，细支气管、肺泡隔和肺泡间隙周围的炎性细胞浸润。中药治疗组仔猪剖解可见弥漫性间质性肺炎，肺水肿，组织病理学观察可见肺脏有散在的浆液性肺炎，细支气管、肺泡隔和肺泡间隙周围的炎性细胞浸润。病理变化较接毒对照组和治疗对照组轻。正常对照组无明显病理变化(图15B、图15C)。

药物治疗对仔猪肺脏免疫组织化学检查的影响，将肺组织固定于10％福尔马林中，石蜡包埋制备切片，通过免疫组织化学检查仔猪的肺组织中PRRSV的增殖情况。如图15D所示，PRRSV接种组中仔猪肺脏充满了PRRSV阳性信号，这些阳性信号分布在支气管，细支气管和肺泡隔周围的肺泡和隔膜巨噬细胞中。治疗对照组中PRRSV阳性信号广泛分布在泡隔周围的肺泡和隔膜巨噬细胞中，但是阳性信号弱于接毒对照组。在中药治疗组中的肺组织中PRRSV阳性信号弱于接毒对照组和治疗对照组。正常对照组仔猪的肺中未见PRRSV阳性信号。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

Claims

1.一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染药物，其特征在于，包括下列重量份的原料：

2.如权利要求1所述的一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染药物，其特征在于，包括下列重量份的原料：

3.一种如权利要求1或2所述的抗猪繁殖与呼吸综合征感染药物的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

4.如权利要求3所述的一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物检测方法，其特征在于：所述步骤3)中多种给药方式包括预防作用给药、治疗作用给药与直接灭杀作用给药。

5.如权利要求3所述的一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物检测方法，其特征在于：所述步骤4)中多种给药方式包括预防作用给药、治疗作用给药与直接灭杀作用给药。

6.如权利要求3所述的一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物检测方法，其特征在于，所述步骤5)中RNA定量、反转录和qPCR包括下列步骤：a)总RNA浓度及纯度测定；b)将提取的RNA反转录为cDNA；c)将反转录产物cDNA作为qPCR的模板，用来扩增ORF7基因与GAPDH基因。

7.如权利要求3所述的一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物检测方法，其特征在于：所述步骤7)中提取药物对肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达的影响，进行采集猪的肺脏，然后通过蛋白质印迹法检测肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达。

8.如权利要求7所述的一种抗猪繁殖与呼吸综合征感染的药物检测方法，其特征在于，所述蛋白质印迹法检测肺脏组织中猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单抗蛋白表达包括以下步骤：

1)蛋白样品的制备；

2)SDS-PAGE电泳与转膜；

3)抗体孵育；

4)化学发光与显影。