CN1237995C - 能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调节人体体液性气质的药物及其制备方法,特别是能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物及其制备方法,其中成熟剂是以破布木果、牛舌草、甘草、铁线蕨、地锦草等十味药材按比例配制,进行煎煮、浸泡、过滤、稀释,然后制成成药;清除剂是以清泻山豆、刺糖、菟丝草、西青果、番泻叶等21味药材按比例配制,按每味药材的不同特性,按工艺要求,陆续加入,进行煎煮、浸泡、静置、再煎煮、过滤、稀释,然后制成成药。本发明配方及制作方法和疗效独特。先使体内致病的异常黑胆质成熟和堆积,然后排出体外,使气质复原、体液平衡,为治疗人体体液性气质失调而产生的疑难疾病(如高血压、类风湿性关节炎、银屑病、白癜风、哮喘、肿瘤等)的治疗奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于调节人体体液性气质的药物及其制备方法,特别是能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物及其制备方法。
背景技术
目前,对于高血压、类风湿性关节炎、银屑病、白癜风、哮喘、肿瘤等疑难杂症的治疗都有相应的药物对症下药进行治疗。上述疑难杂症治疗的疗程长,很难根治,症状好转后,易复发。
维吾尔医学认为机体气质(干、寒、湿、热)的失调是疾病产生的根本,气质的失调可分为非体液性气质失调和体液性气质失调。其中体液性气质失调包括胆液质、血液质、粘液质、黑胆质等的异常变化。
异常黑胆质是体液性气质失调的一种类型,其作为胆液质、血液质、粘液质、黑胆质被“燃烧”(是指内外致病因素导致体液的质发生极度变化并在“热”的作用下产生异常黑胆质的过程),继而沉淀的最终产物或表现形式,经常导致高血压、类风湿性关节炎、银屑病、白癜风、哮喘、肿瘤等疑难杂症。异常黑胆质所致疾病的治疗原则是首先使用相应的成熟剂使异常黑胆质成熟和堆积,而后使用相应的清除剂使已成熟的异常黑胆质排除体外,使气质复原、体液平衡,为本脏的治疗奠定基础。因此,治疗中使用异常黑胆质成熟剂和清除剂是取得临床疗效的关键。此法为维吾尔医独有,故无法与其它医学的用药相比较。
发明内容本发明的目的在于提供一种能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物,其二者的作用密切相关并且在临床上联合使用,可以使机体内的异常黑胆质成熟和堆积,并且使已成熟的异常黑胆质排出体外,使气质复原、体液平衡。具有提高机体抗氧化酶活性,抑制脂质过氧化物损伤,清除自由基,提高线粒体ATP酶浓度,抑制线粒体膜脂质过氧化,保护DNA氧化损伤,诱导T淋巴瘤细胞凋亡,提高机体免疫功能,为高血压、类风湿性关节炎、银屑病、白癜风、哮喘、肿瘤等疑难杂症的治疗奠定基础。本发明的另一个目的是提供能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物的制备方法。
异常黑胆质根据所导致原因的不同主要分为:
1.黑胆质的“燃烧”而产生的异常黑胆质;
2.血液质的“燃烧”而产生的异常黑胆质;
3.粘液质的“燃烧”而产生的异常黑胆质;
4.胆液质的“燃烧”而产生的异常黑胆质。
本发明的异常黑胆质的成熟剂和清除剂为复方维吾尔药制剂,其配方如下:
本发明的异常黑胆质成熟剂由破布木果1-30份,红枣1-30份、牛舌草1-15份、蜜蜂花1-15份、甘草1-30份、薰衣草1-15份、铁线蕨1-15份、小茴香1-15份、地锦草1-15份、刺糖10-80份等10味维吾尔药组成。
本发明的异常黑胆质清除剂由清泻山扁豆1-90份、刺糖1-90份、玫瑰花1-30份、菟丝草1-30份、诃子1-30份、西青果1-30份、欧亚水龙骨1-20份、甘草1-20份、小茴香1-20份、薰衣草1-30份、铁线蕨1-30份、地锦草1-30份、牛舌草1-30份、蜜蜂花1-30份、天山堇菜1-30份、睡莲花1-30份、葡萄干1-60份、破布木果10-60份、玫瑰花糖膏10-60份、巴旦仁1-60份、番泻叶5-60份等21味维吾尔药组成。
将上述各组份制成本发明药物的制备方法是:
(1)异常黑胆质成熟剂的制备:
将相应原料中除刺糖外其它药材剪碎,加3-15倍水,加热煎煮5-30分钟后停止加热,浸泡,静置12-24小时,再温火加热煎煮1-3小时。过滤,滤液趁热加刺糖搅拌溶解,再过滤,使最终加蒸馏水稀释至3-7倍,即得。可制成口服液、汤剂、糖浆剂、颗粒剂、片剂、胶囊或丸剂。
(2)异常黑胆质清除剂的制备:
将相应原料中,除番泻叶、玫瑰花、菟丝草、薰衣草、天山堇菜、睡莲花、清泻山扁豆、刺糖、玫瑰花糖膏外药材剪碎,加3-15倍水,加热煎煮5-30分钟后停止加热,浸泡,静置12-24小时。第二天,菟丝草装入布袋内浸泡于药液中,用温火加热煎煮1-3小时,加入薰衣草,再加热煎煮1-2小时。过滤前5-15分钟加入番泻叶、玫瑰花、天山堇菜、睡莲花炖煎5-15分钟,过滤,滤液趁热加刺糖和玫瑰花糖膏搅拌溶解,再过滤,得滤液。清泻山扁豆另外浸泡于80℃热水中,静置12-24小时,过滤,并与前述滤液合并,最终加蒸馏水稀释至3-7倍,即得。可制成口服液、汤剂、糖浆剂、颗粒剂、片剂、胶囊或丸剂。
附图说明:图1为异常黑胆质的成熟剂和清除剂对线粒体膜结构的保护作用电镜照片,图2为异常黑胆质成熟剂和清除剂对OH*引起的PBR322质粒DNA链断裂的保护作用的电泳图谱,图3为流式细胞仪鉴定异常黑胆质成熟剂和清除剂对T淋巴瘤细胞DNA含量变化影响的组方图,图4为异常黑胆质的成熟剂和清除剂处理24小时对P53,FaS及bcl-2基因表达影响电泳图谱,图5为异常黑胆质成熟剂和清除剂处理前P53,FaS及bcl-2基因表达的电泳图谱。
异常黑胆质成熟剂和清除剂处方中的各药材的来源如下:
以下18中药材的出处为:中华人民共和国卫生部药品标准:维吾尔药分册/中华人民共和国卫生部药典委员会编.-乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社(W),1999.8。ISBN7-5372-2170-7,中国版本图书馆CIP数据核字(1999)第40607号。
1.破布木果:本品为紫草科植物破布木Cordia dichotoma Forst.f.的干燥成熟果实。P85
2.牛舌草:本品为紫草科植物意大利牛舌草Anchusa italica Retz.的干燥全草。P14
3.薰衣草:本品为唇形科植物狭叶薰衣草Lavandula angustifolia Mill.的干燥地上部分。P112
4.甘草:为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza galabra L.的干燥根及根茎。P208
5.铁线蕨:为铁角蕨科植物铁线蕨Aspleniaceae capillus-veneris L.的干燥全草。P213
6.小茴香:为伞科植物茴香Foeniculum vulgare Mill.的干燥成熟果实。P208
7.地锦草:为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbiamaculata L.的干燥全草。P208
8.刺糖:本品为豆科植物骆驼刺Alhagi pseudoalhagi(M.B.)Desv.茎枝的糖质分泌物。P51
9.清泻山扁豆:为豆科植物腊肠树Cassia fistula L.的干燥荚果。P213
10.玫瑰花:为蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thunb.的干燥花蕾。P209
11.菟丝草:为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥地上部分。P91
12.诃子:为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果实。P209
13.欧亚水龙骨:为水龙科植物欧亚水龙骨Polypodium vulgare L.的干燥根茎。P212
14.天山堇菜:为堇菜科植物天山堇菜Viola tianshanica Maxim.的干燥全草。P8
15.睡莲花:为睡莲科植物雪白睡莲Nymphaea candida Presl.的干燥花蕾。P111
16.玫瑰花糖膏:本品为新鲜玫瑰花经加工制成的糖膏。具有舒心爽神,健胃止痛等功能。卫生部批准文号为:WS3-BW-0150-98。P153
17.巴旦仁:本品为蔷薇科植物甜巴旦Amygdalus communis L.的干燥成熟种子。P17
18.番泻叶:为豆科植物狭叶番泻Cassia angustifolia Vahl或尖番泻Cassiaacutifolia Delile的干燥小叶。P210
以下两种药材的出处为:中药大辞典,上海科学技术出版社出版,1986年第1版,1994年第7次印刷。
1.大枣(红枣):为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实。上册,P101
2.葡萄干:为葡萄科植物葡萄Vitis Vinifera L.的干燥成熟果实。下册,P2314
以下两种药材的出处为:维吾尔医大专试用教材——维吾尔医常用药材学,新疆科技卫生出版社(W),1993年,第1版。
1.蜜蜂花:本品为唇形科植物蜜蜂花Melissa Officinalis L.的干燥全草。上册,P176
2.西青果:为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz.的干燥未成熟果实。下册,P61
经过研究发现异常黑胆质的成熟剂和清除剂具有以下作用特点:
本发明的二种制剂作用密切相关,在临床上联合使用,具有调节机体干寒性气质,成熟和清除异常黑胆质型体液的功能。
一、临床应用
1.临床研究对象:作为研究对象的病人为患有异常黑胆质所导致的高血压、类风湿性关节炎、银屑病、白癜风、哮喘、肿瘤等疾病的患者,均为生长在新疆的维吾尔族,于1996年6月至2000年年底到新疆维吾尔自治区维吾尔医研究所和新疆维吾尔自治区维吾尔医医院门诊及住院患者1081例,其中男514人,女567人,年龄在18-60岁,平均年龄:43.45±10.76。正常对照组36例,经体检均无心、肺、肝、肾等疾病的健康人,为在新疆生活的维吾尔族,其中男19人,女17人,年龄在23-55岁,平均年龄:40.31±4.82。各种疾病的诊断严格按照WHO诊断标准进行,并根据《维吾尔医诊断学》进行了维医异常体液分型。
2.仪器:R-114i旋转蒸发仪:瑞典Buchi产品;SHG-1型生物化学发光仪:上海上立检测仪器厂;精密移液器:法国Gilson公司;低温冰箱:日本Sanyo公司;721-型分光光度计:上海第三分析仪器厂;PHS-25型PH计:上海雷磁仪器厂;TGL-16B型台式高速离心机:上海安亭科学仪器厂。
3.试剂:刀豆蛋白A(美国Sigma公司产品);植物血球凝集素(上海市医学化验所产品);淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产);鲁米诺,酵母多糖(美国Sigma公司产品);三乙胺,无水乙醇(上海试剂三厂产品);D-Hanks营养液(自制);SOD,GSH-Px,MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)。磷酸缓冲液(PBS)(自配)。
4.方法:
4.1采血:符合诊断标准的患者,等级造表,做好填写。各组患者均在早晨空腹采静脉血3ml,注入含有20ul肝素钠的试管中,轻轻遥匀以备用。
4.2PMN-cl的测定:取新鲜抗凝全血于测量管中100ul,加PBS溶液700ul和100ul鲁米诺,37℃保温20min后,测定本底发光强度6秒钟,再加调理的酵母多糖100ul,迅速遥匀,立刻测定刺激后的发光强度6秒钟,直到峰值出现(加酵母多糖后约30分钟)。
4.3Ly-cl的测定:用淋巴细胞分离液分离血中淋巴细胞,用D-Hanks液冲洗淋巴细胞几次,调细胞浓度为1×106个/ml。取淋巴细胞悬液100ul,并加D-Hanks液750ul于测量管中,加鲁米诺100ul,于37℃保温30min后,测定本底发光强度6秒钟,再加PHA 50ul,迅速摇匀后,立刻测定刺激后的发光强度6秒钟,直至峰值出现(加PHA后约10分钟)。
4.4SOD、GSH-Px、MDA的测定:按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书由专人来测定。采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用DTNB直接法测定谷胱甘酞过氧化物酶(GSH-Px)活性;采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)浓度。
4.5统计学处理:数据以“均数±标准差”表示,组间差异采用t检验作显著性比较。
5.维医异常黑胆质分型及治疗:根据《维吾尔医诊断学》对1081例患者进行了维医异常体液分型,结果其中胆液质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人154例,男60人,女94人,年龄在18-60岁,平均年龄:42.26±10.66;粘液质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人538例,男273人,女265人,年龄在20-60岁,平均年龄:42.23±10.51;黑胆质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人232例,男98人,女134人,年龄在18-60岁,平均年龄:46.03±10.91;血液质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人157例,男83人,女74人,年龄在21-56岁,平均年龄:41.16±12.32。(见表1)
表1 1081例患者维医异常黑胆质分型
异常黑胆质分型 | 例数 | 男 | 女 | 年龄(岁) | 平均年龄(岁) |
黑胆质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人胆液质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人粘液质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人血液质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人 | 232154538157 | 986027383 | 1349426574 | 18-6018-6020-6021-56 | 46.03±10.9142.26±10.6642.23±10.5141.16±12.32 |
由表1可见,异常黑胆质型疾病可由不同体液“燃烧”所致,其中由粘液质“燃烧”而产生的异常黑胆质型病人最多,共538例,占异常黑胆质型病人总数的49.77%。但异常黑胆质的分型与病人的年龄、性别无关系(P>0.05)。
根据患者异常黑胆质种类及其严重程度的不同,遵循维医“异病同治”及“同病异治”的治疗原则,对患者进行治疗。具体方法如下:
表2 异常黑胆质成熟剂和清除剂使用所需时间及疗程
异常黑胆质类型 | 成熟剂使用时间(天) | 清除剂使用时间(天) | 疗程(次) | 用量(ml/日/3次) |
黑胆质“燃烧”而产生的异常黑胆质胆液质“燃烧”而产生的异常黑胆质粘液质“燃烧”而产生的异常黑胆质血液质“燃烧”而产生的异常黑胆质 | 10-2015-2525-353-7 | 7-157-1510-203-5 | 1-61-41-31-3 | 120-150100-12080-12080-120 |
异常黑胆质成熟剂和清除剂在以下情况禁用:(1)年龄大于80岁(体强者例外)或小于12岁的患者;(2)严重心衰的病人;(3)月经期的妇女和孕妇;(4)异常血液质所产生的疾病(燃烧后产生黑胆质除外);(5)高烧病人。
6.结果:采用生物化学发光分析技术等方法分别检测了异常黑胆质型病人使用成熟剂和清除剂治疗前和治疗后(以异常黑胆质被成熟及清除的临床表现为依据)抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性、自由基损伤产物MDA含量及多形核白细胞(PMN)、淋巴细胞(Ly)自由基代谢变化情况等。结果见表3、4、5、6、7、8、9、10。
表3 黑胆质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
体抗氧化指标的变化情况(X±SD)
组别 | 例数SOD(Nu/ml) | GSH-Px(u) | MDA(nmol/ml) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36110.1±5.423280.2±6.3**23296.1±5.8***△ | 206.10±21.1121.42±18.7**197.10±17.2***△ | 3.96±0.196.73±0.4*4.68±0.18***△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05。与使用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
表4黑胆质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
体免疫细胞活性氧代谢的变化情况(X±SD)
组别 | 例数 | PMN-cl(cp6s) | Ly-cl(cp6s) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36232232 | 4778.00±1764.77532.02±2313.46**5022.98±614.74***△ | 325.02±143.27729.72±256.89**576.30±75.17△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05。与使用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
表5胆液质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
体抗氧化功能的变化情况(X±SD)
组别 | 例数 | SOD(Nu/ml) | GSH-Px(u) | MDA(nmol/ml) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36154154 | 110.1±5.492.26±19.92**109.98±25.93***△ | 206.10±21.1118.64±30.94**199.21±15.62***△ | 3.96±0.195.85±1.52*4.85±1.41***△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05。与使用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
表6胆液质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
机体免疫细胞活性氧代谢的变化情况(X±SD)
组别 | 例数 | PMN-cl(cp6s) | Ly-cl(cp6s) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36154154 | 4778.00±1764.77712.92±1320.18**4623.45±1249.45***△ | 325.02±143.27819.82±135.95**457.85±70.69△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05。与使用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
表7 粘液质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
体抗氧化功能的变化情况(X±SD)
组别 | 例数 | SOD(Nu/ml) | GSH-Px(u) | MDA(nmol/ml) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36538538 | 110.1±5.4114.37±29.80***109.98±29.76***△ | 206.10±21.1118.79±29.96**192.26±25.12***△ | 3.96±0.195.26±1.41*4.01±0.93**△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05。与使用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
表8 粘液质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
体免疫细胞活性氧代谢的变化情况(X±SD)
组别 | 例数 | PMN-cl(cp6s) | Ly-cl(cp6s) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36538538 | 4778.00±1764.77432.35±1875.71**5523.09±1328.05***△ | 325.02±143.27780.46±116.63**430.02±46.02***△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05。与便用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
表9血液质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
体抗氧化功能的变化情况(X±SD)
组别 | 例数 | SOD(Nu/ml) | GSH-Px(u) | MDA(nmol/ml) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36157157 | 110.1±5.485.74±32.68**108.18±29.36***△ | 206.10±21.1118.95±27.35*203.11±31.26***△ | 3.96±0.194.86±1.41**4.56±1.13***△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05。与使用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
表10 血液质“燃烧”而导致的异常黑胆质型病人使用异常黑胆质成熟剂和清除剂前后机
体免疫细胞活性氧代谢的变化情况(X±SD)
组别 | 例数 | PMN-cl(cp6s) | Ly-cl(cp6s) |
正常对照组治疗前治疗后 | 36157157 | 4778.00±1764.76012.90±1311.39**4635.17±239.61***△ | 325.02±143.27676.81±105.85*395.35±61.29△ |
与正常对照组比较*P<0.01,**P<0.05,***P>0.05,与使用成熟剂和清除剂前比较△P<0.05。
二、体外抗氧化作用
1.试剂:黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、酵母多糖A(Zymosan A)、鲁米诺(Luminol)等均为美国Sigma产品。其它试剂均为国产分析纯试剂。
2.仪器:SHG-1型生物化学发光仪:上海上立检测仪器厂;精密移液器:法国Gilson公司;低温冰箱:日本Sanyo公司;721-型分光光度计:上海第三分析仪器厂;PHS-25型PH计:上海雷磁仪器厂;TGL-16B型台式高速离心机:上海安亭科学仪器厂。
3.方法:
3.1对O2 -.的清除作用:向各测量管中分别注入梯度浓度的样品液100μl,空白对照管加100μl磷酸钾缓冲液,然后各管加入次黄嘌呤800μl,鲁米诺50μl,测本底发光强度10sec,最后注入黄嘌呤氧化酶50μl,启动发光反应,连续测定扩增的发光强度10sec至出现峰值。根据各样品的抑制率求出抑制发光强度50%的样品浓度,即IC50。
3.2对OH.的清除作用:向测量管中分别加入0.3mg/ml VitC 200μl,0.45mg/ml CuSO4400μl,酵母菌200μl(加时摇匀),然后分别加入梯度浓度的样品液600μl,空白对照管加600μl磷酸钠缓冲液。分别测定各管本底发光强度10sec,最后注入1%的H2O2600μl,摇匀,启动发光反应,连续测定发光强度10sec至出现峰值。求出抑制发光强度50%的样品浓度(IC50)。
3.3对H2O2的清除作用:向各测量管中加入双蒸水650μl,空白对照管加双蒸水700μl,再分别加入梯度浓度的样品溶液50μl,混匀,加鲁米诺100μl后,测定各管的本底发光强度10sec。最后加0.03%H2O2 100μl,启动发光反应,连续测定发光强度10sec至出现峰值。求出各样品的IC50值。
3.4对1O2的清除作用:向各测量管中加入PH8的5mmol/l NaOH 400μl(空白管加500μl),鲁米诺50μl,梯度浓度的样品液100μl,上机测本底发光后,加NaOCI 100μl,再立即加H2O2300μl快速混合,测出10sec发光强度,找出发光峰值,反应体系的总体积为950μl,PH8.0。求出各样品的IC50值。
3.5对多种活性氧的总和清除率:各管加入100μl全血,PBS 700μl,设梯度浓度的样品液五个浓度,各管分别加样品100μl及PBS 600μl,放置预恒温箱中37℃20min。恒温毕,每管加鲁米诺100μl,摇匀,上机,测本底发光6sec。每管加入酵母多糖A100μl,摇匀,用X程序连续测量各管的每6sec的发光值,直至测完预置的次数。根据各管的发光抑制率,求出各样品的IC50值。
4.结果:采用生物化学发光分析技术测定体外抗氧作用,结果表明它们对超氧阴离子自由基(O2 -.)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH.)、单线态氧(1O2)及多形核白细胞呼吸爆发(PMN-cl)均具有很强的抑制作用。即:
表11 异常黑胆质成熟剂和异常黑胆质清除剂对各种自由基的抑制作用IC50(抑制自
由基50%的药物浓度)
药名 | O2 -.(ug) | H2O2(mg) | OH.(mg) | 1O2(mg) | PMN-cl(mg) |
异常黑胆质成熟剂异常黑胆质清除剂 | 5.42±0.612.08±0.17 | 2.71±0.140.12±0.015 | 65.00±7.2874.74±11.4 | 7.22±0.811.25±0.10 | 6.91±0.741.87±0.09 |
三、保护线粒体的作用
1.材料:Wistar大鼠,♂,180-200g,由新疆维吾尔自治区医学实验动物中心提供;咪唑,蔗糖,NaCl,FeSO4,抗坏血酸均为国产分析纯试剂;SOD,MDA,Ca2+-Mg2+-ATPase和靠马斯亮兰蛋白定量试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。
2.仪器:低温超速离心机(Beckman产品),可见分光光度计(上海第三分析仪器厂),FA2104S型精密电子天平(上海天平仪器厂),600-电子显微镜(日本产),JY92-II型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)。
3.方法
3.1大鼠肝线粒体的制备
大鼠断头处死后,速取肝脏左叶和中叶置于预冷的生理盐水中,去大血管和结缔组织,用生理盐水洗去血污,用滤纸吸干。将肝脏放入预冷的分离介质中(蔗糖0.25mol/L,咪唑-盐酸0.01mol/L,pH7.4),匀浆,按差速离心法分离线粒体,用靠马斯亮兰蛋白定量,调蛋白浓度至1g/L。
3.2实验分组及羟自由基损伤
将分离的线粒体按下述7组分别置于孵育管内,0.7mL/管,终体积1mL。(I)正常对照组:线粒体无处理;(II)损伤对照组:线粒体+FeSO4(终浓度为0.1mmol/L)+抗坏血酸(终浓度为0.5mmol/L);(III-VII)保护组:线粒体+FeSO4(终浓度为0.1mmol/L)+抗坏血酸(终浓度为0.5mmol/L),还分别加入梯度浓度的异常黑胆质成熟剂或清除剂(0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1g/mL)。每组均为10例,均在37℃温育30min后,终止反应。
3.3对线粒体形态结构变化的影响
各组线粒体标本经2.5%的戊二醛固定以后,按常规制备电镜标本,观察各组线粒体结构的变化情况。
3.4对线粒体SOD活性、MDA浓度及Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响
各组线粒体标本用超声波发生仪以600W,5秒/次,间隙10秒,反复5次,破碎。然后各指标采用试剂盒严格按照说明书测定。
3.5统计学处理:所有数据均以x±s表示,采用t检验比较组间显著性差异。
4.结果:在分离鼠肝线粒体的基础上,采用FeSO4/抗坏血酸羟自由基发生系统直接损伤线粒体,电镜观察线粒体结构完整性,同时测定线粒体超氧化物歧化酶(SOD)活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的变化。
4.1对线粒体形态结构变化的影响:
图1为异常黑胆质的成熟剂和清除剂对线粒体膜结构的保护作用的电镜照片。
a.空白对照组;b.损伤对照组;c.0.00001g/ml异常黑胆质的成熟剂;d.0.0001g/ml异常黑胆质的成熟剂;e.0.001g/ml异常黑胆质的成熟剂;f.0.01g/ml异常黑胆质的成熟剂;g.0.1g/ml异常黑胆质的成熟剂;h.0.00001g/ml异常黑胆质的清除剂;i.0.0001g/ml异常黑胆质的清除剂;j.0.001g/ml异常黑胆质的清除剂;k.0.01g/ml异常黑胆质的清除剂;l.0.1g/ml异常黑胆质的清除剂。
从电镜照片上可以看到空白对照组中线粒体膜结构完整,内脊排列整齐。损伤对照组中线粒体结构受到一定程度的破坏,线粒体明显肿胀乃至破裂,内脊断裂。而不同浓度药物保护组中线粒体膜结构以浓度依赖性的逐渐恢复完整。可以推测,异常黑胆质成熟剂和异常黑胆质清除剂通过消除羟自由基对线粒体膜起到稳定和保护作用。
4.2线粒体SOD活性、MDA浓度及Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响:
FeSO4/抗坏血酸与线粒体在37℃共同温育30min后,造成线粒体脂质过氧化损伤,MDA浓度明显上升,SOD活性明显降低,并可降低线粒体Ca2+-Mg2+-ATPaseo活性,损伤对照组与空白对照组比较各指际均有显著性差异(P<0.01)。预先加入不同浓度的异常黑胆质成熟剂或异常黑胆质清除剂后,明显抑制线粒体MDA的生成,提高SOD活性,并能防止线粒体Ca2+-Mg2+-ATPase活性的降低。浓度越高时,这种变化趋势越明显。
表12 异常黑胆质成熟剂对线粒体MDA、SOD、Ca+2-Mg+2-ATPase的影响(x±s)
组别 | 浓度(g/mL) | SOD(NU/mgprot) | MDA(nmol/prot) | ATP酶(μmolPi/mgprot/hour) |
空白对照组损伤对照组异常黑胆质成熟剂异常黑胆质成熟剂异常黑胆质成熟剂异常黑胆质成熟剂异常黑胆质成熟剂 | --0.000010.00010.0010.010.1 | 94.71±5.2719.82±5.65*60.97±4.73*△65.19±6.71*△76.12±4.96*△82.06±3.36*△93.30±8.40△ | 3.51±0.5516.11±1.36*15.94±1.56*15.46±2.43*14.40±0.61*10.94±0.85*△3.54±0.86△ | 15.11±0.626.87±0.83*12.19±0.82*12.37±2.05*13.52±1.44△*13.33±1.25△*15.02±1.40△ |
与空白对照组比较有显著性差异*P<0.01,与损伤对照组比较有显著性差异△P<0.01。
表13 异常黑胆质清除剂对线粒体MDA、SOD、Ca+2-Mg+2-ATPase的影响(x±s)
组别 | 浓度(g/mL) | SOD(NU/mgprot) | MDA(nmol/prot) | ATP酶(μmolPi/mgprot/hour) |
空白对照组损伤对照组异常黑胆质清除剂异常黑胆质清除剂异常黑胆质清除剂异常黑胆质清除剂异常黑胆质清除剂 | --0.000010.00010.0010.010.1 | 96.21±4.1322.93±6.22*59.88±7.9567.30±7.68△73.10±6.41△86.79±7.11△96.59±5.76△ | 5.24±0.3816.63±0.24*15.19±0.20*14.92±0.47*△11.03±0.46*△9.08±0.35△4.94±0.15△ | 13.73±1.296.51±0.73*6.47±0.692*7.51±1.85*10.32±0.89△*10.33±0.84△*12.35±1.17△ |
与空白对照组比较有显著性差异*P<0.01,与损伤对照组比较有显著性差异△P<0.01。
结果表明,异常黑胆质成熟剂和清除剂通过消除羟自由基对线粒体膜起到稳定和保护作用。明显抑制线粒体MDA的生成,提高SOD活性,并能防止线粒体Ca2+-Mg2+-ATPase活性的降低。这种作用具有很明显的剂量依赖性,当浓度从0.00001g/ml逐渐提高到0.1g/ml时,各项指标逐渐恢复正常并最后接近于空白对照组(P>0.01),但与损伤对照组比较差异非常显著(P<0.01)。
四、保护DNA氧化损伤的作用
1.试剂:小牛胸腺DNA、PBR322质粒DNA、邻菲罗啉(Phen)、琼脂糖凝胶、溴酚兰、溴化乙锭(EB)、二甲苯青FF等均为美国Sigma产品;蔗糖、EDTA、Tris、VitC等试剂均为国产分析纯试剂。
2.仪器:SHG-1型生物化学发光仪:上海上立检测仪器厂;精密移液器:法国Gilson公司;低温冰箱:日本Sanyo公司;721-型分光光度计:上海第三分析仪器厂;PHS-25型PH计:上海雷磁仪器厂;TGL-16B型台式高速离心机:上海安亭科学仪器厂;DF-1海鸥照相机:上海照相器材厂;ZF-A1型紫外透射分析仪:上海长明光学电子仪器厂。
3.方法:
3.1对DNA化学发光的影响:根据要求设几个管、向各管中加入不同浓度的样品液50μl(空白对照组加入同等体积的蒸馏水),在加入2×10-3M的Phen 50μl,2×10-3M VitC 20μl,2×10-4M CuSO4 50μl,0.1M磷酸缓冲液(PH5.5)730μl,100μg/ml小牛胸腺DNA 50ul,测定本底发光强度6sec后,最后加入0.5%的H2O2 50μl启动反应(反应终体积为1ml),测量体系6sec的发光强度(cp6s),获取发光动力学曲线,以抑制发光50%的浓度为准,比较各样品对DNA的保护效果。
3.2FeSO4、H2O2引起DNA链断裂的影响:在Eppendorf管中,分别加入10μl PBR322质粒DNA和不同浓度的FeSO4、H2O2、样品液各5μl(H2O2最后加入,空白对照组中加双蒸水),充分混匀后于37℃温育60min(特殊要求时间另定)。0.8%琼脂糖凝胶(加入适量EB,终浓度为0.5μg/ml)电泳,电压为5v/cm,时间为2.5-3.0h。电泳结束后,紫外灯下观察电泳谱带并摄影。
4.结果
4.1对DNA化学发光强度的影响:
异常黑胆质成熟剂和清除剂对OH*.引起的DNA氧化损伤均有明显的抑制作用,表现在它们能使DNA的化学发光强度下降,并使DNA发光峰在很大程度上的延迟。
根据发光峰值计算出样品各浓度的抑制率,为求出抑制率与浓度之间的回归关系,先对各样品浓度做变量变换(X→lnX)后,以lnX作为横坐标,抑制率(Y%)作为纵坐标,进行回归解析,求出回归方程,再计算抑制DNA发光50%的样品浓度(IC50),结果见表14
表14 异常黑胆质成熟剂和清除剂浓度与发光抑制率之间的关系
浓度 | LnX(X,g/ml) | 抑制率(Y%) | |
成熟剂 | 清除剂 | ||
1×10-11×10-21×10-21×10-41×10-5 | -2.303-4.605-6.908-9.210-11.513 | 92.3492.1873.2670.9246.94 | 95.8892.3342.2316.852.01 |
异常黑胆质成熟剂浓度与DNA损伤抑制率之间的回归方程为:Y=108.75+4.8667lnX r=0.9461 P<0.05 IC50=5.723×10-6g/ml异常黑胆质清除剂浓度与DNA损伤抑制率之间的回归方程为:Y=128.83+11.432lnX r=0.9703 P<0.01 IC50=1.012×10-3g/ml
表明,异常黑胆质成熟剂和清除剂在保护OH*引起的DNA氧化损伤过程中起主要作用。
4.2对OH*引起的质粒DNA链断裂的保护作用:
异常黑胆质成熟剂、清除剂对OH-引起的质粒DNA链断裂均有明显的保护作用,并且保护效果与药物的浓度呈正相关。但它们的作用强度有所不同,当异常黑胆质成熟剂浓度稀释至0.01g/ml也表现出对DNA的保护作用,电泳图谱上出现3条带。异常黑胆质清除剂浓度在0.01g/ml时不表现保护作用,电泳图谱上表现2条带,浓度升高至0.02g/ml时才显示3条特。此结果表明,对OH-引起的DNA链断裂的保护作用以异常黑胆质成熟剂为最佳,异常黑胆质清除剂次之(见图2)。
图2为异常黑胆质成熟剂和清除剂对OH*引起的PBR322质粒DNA链断裂的保护作用的电泳图谱。(PBR322质粒DNA在37℃中与以下试剂温育60min:1-13,Fe2+1mmol/l,H2O20.1mmol/l;1-4,异常黑胆质清除剂0.1,0.05,0.02,0.01g/ml;5-8,异常黑胆质成熟剂0.1,0.05,0.02,0.01g/ml;9-12,阳性对照药0.1,0.05,0.02,0.01g/ml;13.Fe2+1mmol/l,H2O20.1mmol/l;14.空白对照组)
结果表明,异常黑胆质成熟剂、清除剂对OH*引起的质粒DNA链断裂均有明显的保护作用,并且保护效果与药物的浓度呈正相关,保护作用以异常黑胆质成熟剂为最佳,异常黑胆质清除剂次之。
五、诱导T淋巴瘤细胞凋亡的作用
1.细胞培养:Jurkat.Clone,E6-1T淋巴瘤细胞株由上海细胞生物学研究所细胞库购买。细胞培养于RPMI 1640(GIBRO公司)培养基中,含10%灭活小牛血清,100μg.ml-1青霉素,100μg.ml-1链霉素,37℃、5%CO2,每三天半换液传代。
2.药物处理:按照制备工艺准备异常黑胆质成熟剂和清除剂,并过滤除菌备用。对数生长期细胞,接种于培养瓶中,细胞浓度为5×104/ml,24孔细胞培养板中随机分组加药,加入100μg/ml的异常黑胆质成熟剂、清除剂处理细胞,并设含50μg/ml的Dex为对照,置37℃、5%CO2中培养。药物作用24小时,36小时后,离心收集细胞,PBS洗三次,提取细胞核DNA,其余细胞进行流式细胞仪分析。
3.DNA含量测定:
a.机前半小时,800g离心5min,异上清加2ml冷PBS缓冲液。800g,离心5分种,洗2次。
b.弃上清加200ul柠檬酸缓冲液,然后加360ul A缓冲液(胰蛋白酶)。放置10分种。
c.加B缓冲液(终止反应液)300ul放置10分种。
d.加PI染色液(200ug/ml,1.0%Tripton-x100,NaCl 0.9%)300ul,暗处放置30分种。
e.细胞染色液用小孔径沙网过滤。
f.样品上机测试,记录激光波长488处绝色荧光。结果打印并分析其结果。资料是通过LYSYStm11软件采集的,并通过List mode形式对数据进行存贮,用SFIT进行DNA含量直仿图分析及光散射图谱分析,打印出DNA含量分布组方图,自动拟合出细胞周期各时相比例,以下列公式计算增埴指数(Proliferation Index,PI)衡量细胞的分裂增值活动:
4.调亡细胞DNA断裂的分析:按文献方法提取各细胞DNA后,进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
5.结果
5.1细胞形态:细胞经光镜观察可见未经药物处理的对照细胞体积大,呈圆形或不规则椭圆形,核大而圆,胞奖少;经异常黑胆质的成熟剂与清除剂作用后,T淋巴瘤细胞胞浆内出现空泡,核质比较低,核形状不规则,出现肾形核、杆状核及少数分叶核,具有调亡细胞特征,台酚兰活体染色率达35%。
5.2异常黑胆质成熟剂与清除剂对细胞增殖的影响:经流式细胞仪分析,异常黑胆质的成熟剂和清除剂对T淋巴瘤细胞DNA含量变化的影响见图3,对T淋巴瘤细胞增值的影响见表15。
图3流式细胞仪鉴定异常黑胆质成熟剂和清除剂对T淋巴瘤细胞DNA含量变化影响的组方图。
结果表明,异常黑胆质的成熟剂与清除剂处理组细胞核DNA含量(FL2-A/FL2-Area)有明显的变化,出现凋亡细胞特征性的Ap峰(G1期细胞DNA含量减少)。
表15 异常黑胆质成熟剂与清除剂对T淋巴瘤细胞增值的影响
组别 | 细胞周期分布(%) | PI值(%) | |||
调亡细胞 | G0/G1 | S | G2+M | ||
对照异常黑胆质成熟剂异常黑胆质清除剂 | 1.65.0**8.0** | 59.463.562.3 | 22.923.030.0 | 17.714.6**7.5** | 40.636.537.6 |
**与对照组比较p<0.05。
结果表明,异常黑胆质成熟剂和清除剂能抑制T淋巴瘤细胞增殖,G2+M期细胞明显减少,细胞被阻止于S期,细胞增值指数(PI)降低,异常黑胆质的成熟剂与清除剂处理组部分细胞发生调亡(5.0%,8.0%和6.1%),出现亚二倍体峰。
5.3细胞调亡的DNA断裂分析:为了进一步鉴定异常黑胆质成熟剂与清除剂诱导T淋巴瘤细胞调亡,从细胞核提取DNA后,进行DNA琼脂糖凝胶电泳分析,结果没有明显的梯形DNA区带(DNAladder),表明,调亡的细胞很少,不够于用琼脂糖DNA核酸电泳定性方法检测。
上述结果表明,用100μg/ml的异常黑胆质成熟剂及清除剂处理T淋巴瘤细胞36小时后细胞发生凋亡,形态上观察到细胞调亡特征,表明异常黑胆质成熟剂及清除剂具有诱导T淋巴瘤细胞等体内诱变细胞凋亡的作用。
六、对人Hela细胞凋亡基因表达的影响
1.试剂:Hela细胞购于中科院上海细胞生物学研究所细胞库。将其培养于含100L/L灭活胎牛血清、100mg/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM(Gibco公司产品)培养基中,于37℃、50ml/L CO2`条件下,每3d换液传代1次。焦碳酸乙二脂(DEPC)、随机引物(Oligo[dT]15 Primer)、脱氧核糖核酸酶抑制剂(Rnasin)及脱氧核苷三磷酸(dNTP)均为Promega公司的产品。反转录酶(M-MuLV reverse transcriptase)为MBI Fermentas公司产品。Taq DNA聚合酶(5u)及PCR扩增缓冲液,为上海生工生物工程(Sangon)公司产品。
2.仪器:PCR热循环仪为Perkin-Elmer公司产品(Gene AmpPCR System 9700型)。紫外光度仪为Amersham pharmacia biotech公司产品(Gene QuantTM II RNA/DNACalculator型)。
3.方法:
3.1引物的设计与序列:按文献及Genebank库中p53基因的序列,设计了两条引物,p1:5′-GGTCGACTGACACGCTTCCCTGGATTGG-3′;p2:5′-GGATCCTGCTTCTGACGCACACCTATTG-3′(295bp fragment)。按有关文献设计了下列bcl-2及Fas基因序列。bcl-2为5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCC,3′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTG(348bp fragment);Fas为5′-GTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC,3’-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGC(342bpfragment)。
以上引物均由上海生工生物工程中心合成。
3.2药物处理:取对数生长期的细胞,接种于培养瓶中(250mL),细胞浓度为5×107/L。在24孔细胞培养板中随机分组加药,加入1g/L的异常黑胆质成熟、清除剂处理细胞,置37℃、50ml/L CO2培养。成熟剂与清除剂处理前(对照)及药物作用24h后,离心收集细胞。
3.3提取mRNA并反转录:按文献方法抽提细胞质总RNA。收集的细胞用PBS溶液洗两次,加200μL RNA提取缓冲液,离心、弃去由未裂解细胞和细胞核组成的沉淀,取上清,用50mg/L的蛋白酶K,37℃消化30min。然后,加1体积的水饱和酚和0.2体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)。离心后,用异丙醇沉淀RNA,并在-20℃至少放1h,离心、沉淀RNA,用700ml/L乙醇洗1遍,真空干燥并用DEPC水重溶RNA。向20μL反转录缓冲液中,加入2μL单链[dT]15引物,2.5μL dNTP(各10mmol/L)及0.5μL Rnasin(1×107u/L)。然后,于70℃加热5min,再置冰上冷却。简短离心后,加1.2μL Molory ML病毒反转录酶(Gibco公司产品),并37℃下保温1h,90℃变性5min,得到的cDNA样品保存于-70℃。
3.4PCR扩增:0.2mL的基因扩增体系中,含2.5μL cDNA,50mol/L KCI,10mol/LTris-Cl,2.0mol/L MgCl2,0.2mol/L dNTPs,0.5mol/L 5′→3′寡核苷酸引物及2.5uTaq酶(Sangon)。进行PCR反应共30个循环,并在94℃变性30S。在每个引物相应的退火温度上退火,并在72℃中延伸2min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。用去离子水作为阴性对照组。照象系统采用正/反665底片,用溴化乙锭染色后在紫外灯下显像DNA带。
4.结果
异常黑胆质成熟剂及清除剂对调亡基因表达的影响以Hela细胞为模型应用高度敏感的RT-PCR方法,研究凋亡基因表达的水平。结果显示,1g/L的异常黑胆质成熟剂与清除剂复方处理24h时有大量的p53基因表达,而Fas及bcl-2基因未见表达。同样,药物处理前上述三种基因均未见表达(见图4、5)。
图4为异黑成熟剂与清除剂处理24h对p53,Fas及bcl-2基因表达影响的电泳图谱。
1:异常黑胆质成熟剂+p53;2:异常黑胆质成熟剂+Fas;3:异常黑胆质成熟剂+bcl-2;
4:异常黑胆质清除剂+p53;5:异常黑胆质清除剂+Fas;6:异常黑胆质清除剂+bcl-2;
7:φ×174/Hinc IIDNA Marker;0:蒸馏水+p53。
图5异黑成熟剂与清除剂处理前p53,Fas及bcl-2基因表达的电泳图谱。
1:异常黑胆质成熟剂+p53;2:异常黑胆质成熟剂+Fas;3:异常黑胆质成熟剂+bcl-2;
4:异常黑胆质清除剂+p53;5:异常黑胆质清除剂+Fas;6:异常黑胆质清除剂+bcl-2;
7:λDNA/Hind IIIMarker;0:蒸馏水+p53。
本研究发现,异常黑胆质的成熟剂及清除剂作用于Hela细胞后与细胞凋亡密切相关的野生型p53基因的表达增加,而与细胞分化和增殖有关的Fas与Bcl-2基因的表达显著降低,说明异常黑胆质的成熟剂及清除剂可激活凋亡基因而使细胞发生凋亡。为此,我们认为,维医异常黑胆质成熟剂和清除剂诱导野生型p53基因的表达及下调bcl-2基因的表达,可能是其增强机体抗病功能的分子机制之一。
七、对免疫功能的影响
1.试剂:免疫球旦白G、M试剂:上海长征医学科学有限公司产品;RPMI-1640培养基干粉、青链霉素试剂盒、小牛血清、ConA、MTT等均为美国Sigma公司产品;Hank`s液、异丙醇为国产试剂。
2.仪器:BIO-RAD Model 550酶标仪,美国产品;二氧化碳培养箱,日本Sanyo产品;FA2104S-精密电子天平,上海天平仪器厂产品。
3.动物:昆明种,NIH小鼠,雌雄兼用,均由新疆维吾尔自治区医学实验动物中心提供,二级,合格证书:新疆医动字(94),16-001号。
4.方法与结果
4.1对正常小鼠免疫器官重量的影响:选取小鼠70只,雌雄兼用,体重14±0.5g。随机分为正常对照组、异常黑胆质成熟剂组(生药9.25g/kg.ig.qd×21d)、异常黑胆质成熟剂组(生药18.5g/kg.ig.qd×21d)、异常黑胆质成熟剂组(生药37g/kg.ig.qd×7d),第22天开始给清除剂((生药9g/kg.ig.qd×3d),第24天给药后2h,摘眼球放血处死,摘出胸腺及脾脏称重。以胸腺和脾脏重量(mg)与体重10g之比为胸腺指数和脾脏指数。
表16 异常黑胆质成熟剂及清除剂联合用药对正常小鼠免疫器官重量的影响(x±SD)
组别 | 动物数(n) | 剂量(g/kg) | 胸腺指数(mg/10g体重) | 脾脏指数(mg/10g体重) |
正常对照组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组 | 13111210 | -9.2518.537.0 | 18.40±6.6321.28±6.43*28.67±11.98***30.86±9.22*** | 52.55±11.5745.03±7.02*64.761±3.65***76.38±21.58*** |
注:与正常对照组比较*p>0.05,***P<0.01。
结果表明,异常黑胆质成熟剂和清除剂联合用药能提高胸腺和脾脏指数,提示该药可能有免疫增强作用。
4.2对正常小鼠血清免疫球蛋白含量的影响:选取小鼠70只,雌雄兼用,体重14±0.5g。随机分为正常对照组、异常黑胆质成熟剂组(生药9.25g/kg.ig.qd×21d)、异常黑胆质成熟剂组(生药18.5g/kg.ig.qd×21d)、异常黑胆质成熟剂组(生药37g/kg.ig.qd×7d),第22天开始给清除剂((生药9g/kg.ig.qd×3d),第24天给药后2h,眼静脉才血,分离血清,按试剂盒说明书测定IgG、IgM抗体水平。
表17 异常黑胆质成熟剂及清除剂联合用药对IgG、IgM抗体生成的影响(x±SD)
组别 | 动物数(n) | 剂量_(g/kg) | IgG(mg/ml) | IgM(mg/ml) |
正常对照组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组 | 13111210 | -9.2518.537.0 | 1.14±0.301.23±0.29*1.62±0.37***1.49±0.53*** | 0.30±0.130.39±0.13*0.92±0.23***0.86±0.26*** |
注:与正常对照组比较*p>0.05,***P<0.01。
结果表明,异常黑胆质成熟剂和清除剂联合用药中剂量和大剂量显著增加小鼠IgG、IgM抗体水平。
4.3对淋巴细胞增殖的影响:选取小鼠40只,雌雄兼用,体重14±0.5g。随机分为正常对照组、异常黑胆质成熟剂组(生药9.25g/kg.ig.qd×21d)、异常黑胆质成熟剂组(生药18.5g/kg.ig.qd×21d)、异常黑胆质成熟剂组(生药37g/kg.ig.qd×7d),第22天开始给清除剂((生药9g/kg.ig.qd×3d),第24天给药后2h,脱颈椎处死,无菌取脾脏,放入盛有冷Hank`s液平皿的尼龙网上,用针芯捻碎,将脾组织经尼龙网过滤,制成脾细胞悬液,1500rpm离心5min,用Hahk`s液洗涤3次,弃上清加Hank`s液2ml,再加Tris-NH4Cl 1500rpm离心5min,再用Hank`s液洗涤3次,加10%PBS-RPMI-1640液,计数并调细胞数为2×106个/ml,于96孔酶标板每孔加100ul,再加入5μg/ml ConA的RPMI-1640液100μl或5μg/ml PHA的RPMI-1640液100μl,5%CO2培养箱37℃培养48h,弃上清后加MTT(1mg/ml)100μl,震荡1min,5%CO2孵箱37℃培养4h,取出反应物,2000rpm离心5min,弃上清,每孔加酸化异丙醇100μl,震荡10min,在酶标仪490nm处读取OD值。
表18 异常黑胆质成熟剂及清除剂联合用药对淋巴细胞增殖的影响(x±SD)
组别 | 动物数(n) | 剂量(g/kg) | OD值(ConA刺激) | OD值(PHA刺激) |
正常对照组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组异常黑胆质成熟剂清除剂联合用药组 | 12111210 | -9.2518.537.0 | 0.392±0.0280.402±0.0260.509±0.040***0.662±0.055*** | 0.420±0.0370.423±0.032*0.509±0.027***0.667±0.048*** |
注:与正常对照组比较*p>0.05,***P<0.01。
结果表明,三个不同剂量的联合用药组对ConA和PHA诱导的脾淋巴细胞增殖反应有明显的促进作用。
综合上述结果表明:本发明的异常黑胆质的成熟剂和清除剂在临床上联合使用证明,具有提高机体抗氧化酶活性,抑制脂质过氧化损伤,清除自由基,提高线粒体ATP酶浓度,抑制线粒体膜脂质过氧化,保护DNA氧化损伤,诱导T淋巴瘤细胞凋亡,诱导野生型P53基因表达,下调FaS与bcl-2基因的表达,提高机体免疫功能等功能。通过本发明的两种制剂在临床上的联合使用,调节机体干寒性气质,使体内致病的异常黑胆质成熟和堆积,然后排出体外,使气质复原,体液平衡,为治疗人体体液性气质失调而产生的疑难疾病(如高血压、类风湿性关节炎、银屑病、白癜风、哮喘、肿瘤等)的治疗奠定基础。
实施例:能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物,由异常黑胆质成熟剂和异常黑胆质清除剂组成,异常黑胆质成熟剂和异常黑胆质清除剂分别由如下重量配比的原料制成:
异常黑胆质成熟剂:破布木果15份,红枣15份、牛舌草7份、蜜蜂花7份、甘草10份、薰衣草7份、铁线蕨7份、小茴香7份、地锦草7份、刺糖60份。
异常黑胆质清除剂:清泻山扁豆45份、刺糖45份、玫瑰花12份、菟丝草15份、诃子15份、西青果15份、欧亚水龙骨6份、甘草6份、小茴香6份、薰衣草10份、铁线蕨10份、地锦草10份、牛舌草10份、蜜蜂花10份、天山堇菜10份、睡莲花10份、葡萄干18份、破布木果30份、玫瑰花糖膏30份、巴旦仁10份、番泻叶21份。
能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物的制备方法,包括如下步骤:
异常黑胆质成熟剂的制备:以上十味药材除刺糖外其它药材剪碎,加1000ml水,加热煎煮10分钟后停止加热,浸泡,静置12小时,再用温火加热煎煮2小时。过滤,滤液趁热加刺糖搅拌溶解,再过滤,最终加蒸馏水稀释至500ml,即得。可制成口服液、汤剂、糖浆剂、颗粒剂、片剂、胶囊或丸剂。
异常黑胆质清除剂的制备:以上21种药材,除番泻叶、玫瑰花、菟丝草、熏衣草、天山堇菜、睡莲花、清泻山扁豆、刺糖、玫瑰花糖膏外其它药材剪碎,加2000ml水,加热煎煮10分钟后停止加热,浸泡,静置12小时。第二天,菟丝草装入布袋内浸泡于药液中,用温火加热煎煮1小时,加入薰衣草,再加热煎煮1小时。过滤前5分钟加入番泻叶、玫瑰花、天山堇菜、睡莲花炖煎5分钟,过滤,滤液趁热加刺糖和玫瑰花糖膏搅拌溶解,再过滤,得滤液。清泻山扁豆另外浸泡于80℃热水中,静置12小时,过滤,并与前述滤液合并,最终加蒸馏水稀释至1000ml,即得。可制成口服液、汤剂、糖浆剂、颗粒剂、片剂、胶囊或丸剂。
Claims (3)
1.能够使异常黑胆质型体液成熟和清除的药物,其特征在于它是由异常黑胆质成熟剂和异常黑胆质清除剂组成,异常黑胆质成熟剂和异常黑胆质清除剂分别由如下重量配比的原料制成:
异常黑胆质成熟剂
破布木果15份,红枣15份、牛舌草7份、蜜蜂花7份、甘草10份、薰衣草7份、铁线蕨7份、小茴香7份、地锦草7份、刺糖60份;
异常黑胆质清除剂
清泻山扁豆45份、刺糖45份、玫瑰花12份、菟丝草15份、诃子15份、西青果15份、欧亚水龙骨6份、甘草6份、小茴香6份、薰衣草10份、铁线蕨10份、地锦草10份、牛舌草10份、蜜蜂花10份、天山堇菜10份、睡莲花10份、葡萄干18份、破布木果30份、玫瑰花糖膏30份、巴旦仁10份、番泻叶21份。
2.制备权利要求1所述药物的方法,包括以下步骤:
(1)异常黑胆质成熟剂的制备:
将相应原料中除刺糖外其它药材剪碎,加3-15倍水,加热煎煮5-30分钟后停止加热,浸泡,静置12-24小时,再温火加热煎煮1-3小时,过滤,滤液趁热加刺糖搅拌溶解,再过滤,使最终加蒸馏水稀释至3-7倍;
(2)异常黑胆质清除剂的制备:
将相应原料中,除番泻叶、玫瑰花、菟丝草、薰衣草、天山堇菜、睡莲花、清泻山扁豆、刺糖、玫瑰花糖膏外药材剪碎,加3-15倍水,加热煎煮5-30分钟后停止加热,浸泡,静置12-24小时,第二天,菟丝草装入布袋内浸泡于药液中,用温火加热煎煮1-3小时,加入薰衣草,再加热煎煮1-2小时,过滤前5-15分钟加入番泻叶、玫瑰花、天山堇菜、睡莲花炖煎5-15分钟,过滤,滤液趁热加刺糖和玫瑰花糖膏搅拌溶解,再过滤,得滤液,清泻山扁豆另外浸泡于80℃热水中,静置12-24小时,过滤,并与前述滤液合并,最终加蒸馏水稀释至3-7倍。
3.根据权利要求1所述的药物,其特征在于所述的药剂是口服液、汤剂、糖浆剂、颗粒剂、片剂、胶囊和丸剂。
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