具体实施方式
由于本发明将α-溶血链球菌菌种搭载返回式太空飞行器(宇宙飞船或返回式卫星),利用太空中微(零)重力、宇宙射线、交变磁场、高真空、高热深冷等因素的综合作用,使菌株的DNA双链结构断裂,基因组发生重排,从而产生新的菌株。返回地面后,对经过太空搭载的菌株进行培养和筛选,通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容,优选出其中的正变异、遗传特性稳定的菌种,经培养发酵后得到治疗溃疡性结肠炎的药物。该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,编号为CGMCCNo.1082。
特别是所述的α-溶血链球菌D33菌株经太空搭载诱变,地面上的筛选、分离和纯化后,选育出发酵单位更高、所分泌的甘露聚糖肽含量更高的高产、优质菌株T33株。通过中国科学院微生物研究所对T33菌株及D33菌株的全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析和菌株的基因组DNA限制性酶切分析(RFLP/PFGE)比较,可以证明空间诱变及地面筛选出的T33菌株其基因有变异。该突变菌株在遗传上稳定,有较强的生产适应性,由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高,多肽含量比国家标准(80%)提高3至5倍,西安市药品检验所送样测定达到271.6%,发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上。该菌种经过神舟系列飞船航天搭载太空诱变,由北京中科院微生物所和西北大学生物系对菌种进一步筛选培养育种形成遗传性质稳定,变异特征明显的高产高效菌种。该菌种每发酵单位中α-太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽含量提高了几倍以上。(见附件材料1:陕西省科学技术厅陕西省科学技术成果鉴定证书材料
附件材料2:太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载公证书。
附件材料3:太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载返回地面筛选报告
附件材料4:中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的形态生理生化鉴定报告书
附件材料5:中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的SDS-PAGE及RFLP/PFGE分析鉴定报告书
附件材料6:陕西省药品检验所“神舟三号”太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽口服液检测报告
附件材料7:科技查新报告复印件
附件材料8:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种保藏受理通知书)
本发明菌种选育:在α-溶血链球菌生长规律的基础上,选定较合适生长时期的菌种,采用平皿生长的菌落、浸入其它物质中的菌悬液、带菌的砂土等方法,于2002年3月25日搭载“神舟三号”宇宙飞船。在太空轨道(近地点高度200公里、远地点高度350公里)进行了6天零18小时的在轨飞行。太空的特殊条件主要体现为微重力、高真空、高辐射、交变磁场等特殊环境。在外层空间飞行的菌种被置于一个与地球上的生态环境完全不同的环境中,主要包括来自磁场俘获的电子、质子及低能重粒子;来自银河系的宇宙射线如质子、粒子及更重的高能重粒子;来自太阳磁暴的质子及重粒子等。这些粒子作用于微生物细胞核中的DNA双链结构,可导致双链断裂。微重力、高真空环境可使DNA的碱基序列发生重组,即基因组的重组和变异。变异后产生的新菌株,其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、中试生产指标等均会发生不同程度的变化。在宇宙飞船返回地面后,经过进一步筛选,仅优选出其中0.2%的正变异且遗传特性稳定的菌株,经培育制成生产菌种。这种经航天搭载诱变后选育出的菌种已经在在2003年12月29日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,编号为CGMCCNo.1082。
实验及中试生产结果表明,经空间诱变后的新型太空菌种在遗传特性上稳定,有较强的生产适应性,由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高,多肽含量比国家标准(80%)提高3至5倍,西安市药品检验所送样测定达到271.6%,发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上,发酵周期大大缩短。
制备方法:
太空诱变菌种生产甘露聚糖肽的制备过程:
本发明所述的太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽是由以下方法制备:太空菌种制备---一级发酵---二级发酵-----发酵液提纯,最终生产出甘露聚糖肽。
太空菌种制备:
以经过空间诱变育种精心选育的α-溶血链球菌作为生产菌种。
A.斜面种子培养基:牛肉膏0.5%,酵母膏0.6%,蛋白胨0.5%,葡萄糖0.4%,氯化钠0.5%,琼脂3%,绵羊血8%;pH7.4。
斜面种子培养基灭菌温度121℃,时间30分钟,蒸汽压力0.12Mpa。
启封菌种冷冻管,用无菌肉汤培养基稀释,在无菌条件下接入血斜面,接种后置38℃恒温培养30小时。
B.肉汤种子培养基:牛肉膏0.5%,酵母膏0.6%,蛋白胨0.5%,葡萄糖0.4%,氯化钠0.5%;pH7.4。
肉汤种子培养基灭菌温度121℃,时间30分钟,蒸汽压力0.12Mpa。
将培养好的斜面菌种在无菌条件下按9%接种量,接入肉汤种子培养基内,38℃恒温培养30小时。
发酵过程:
发酵培养基:牛肉膏0.4%,酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%,葡萄糖0.4%,氯化钠0.5%。
发酵培养基灭菌温度121℃,时间30分钟,蒸汽压力0.12Mpa。
A.一级发酵罐:将优良的肉汤菌种在无菌条件下按10%接种量,接入一级种子罐,在29℃恒温培养30小时,罐压不超过0.02Mpa,通气量以能翻动培养液为宜,连续充分搅拌。
B.二级发酵罐:将一级发酵培养液在无菌条件下按20%接种量,接入发酵罐,在29℃恒温培养70小时,罐压不0.02Mpa,灭活放罐。灭活采用加温使发酵液温度达到100℃,保温60分钟,冷却静置。
提取过程:
a、发酵液进行浓缩,使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶20或酌情而定。
b、发酵液的浓缩液加入80-99%乙醇,体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后,离心去除上清液,沉淀用蒸馏水溶解,调pH5.0,得到溶解液并将溶解液静置。
c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液,准确量取清液体积,按上清液体积计算出所需乙醇量,调pH值,将乙醇缓慢加入到上清液中,并充分搅拌,静置后离心去除上清液得到沉淀物。
d、沉淀物再用蒸馏水溶解,调pH,离心,上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止,得到的沉淀物为太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时,即得到太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽产品。
上述方法得到的产品的检验:
[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末;无臭、无味。
本品在水中易溶,在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。
比旋度:取本品,精密称定,加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg的溶液,依法测定(中国药典2000年版二部附录vIE),比旋度为+70℃至+80℃。
[鉴别]1、取本品10mg,加水0.5ml使溶解,加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml,摇匀,沿管壁缓缓加硫酸0.5ml,数分钟后,界面呈紫红色。
2、取本品,加水制成每1ml中含1mg的溶液,取约10ul点于滤纸上,晾干,用无水乙醇固定,置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g,加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml,混匀即得。置暗处保存,可使用数月)中浸泡5分钟,取出,用70%乙醇溶液冲洗,置还原液(取碘化钾5g,硫代硫酸钠5g,加水100ml使溶解,再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml,随加随搅拌,临用时配)中浸泡5分钟,取出,用70%乙醇溶液冲洗,置品红业硫酸试液中浸泡约30分钟,取出,用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g,加盐酸1ml,加水溶解使成100ml,即得),冲洗,晾干,在滤纸片点样处应呈紫红色。
3、取供试品和对照品适量,分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液,按甘露聚糖肽免疫原性测定法试验,供试品和对照品管应均无溶血发生。
[检查]1、酸度:取本品,加水制成每1ml中含10mg的溶液,依法测定(中国药典2000年版二部附录VIH),pH值应为3.0-5.0。
2、吸收度:取本品,加水制成每1ml中含0.4mg的溶液,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA),在260nm的波长处,其吸收度不得大于0.25,在280nm的波长处,其吸收度不得大于0.20。
3、总氮量:取本品,照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VIID第二法)测定.按干燥品计算,含总氮量应为0.8-2.0%。
4、免疫原性:取供试品和对照品适量,分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液,再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液,依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法),供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。
5、干燥失重 取本品,在105℃干燥至恒重,减失重量不得过5.0%(中国药典2000年版二部附录VIIIL)。
6、重金属取本品,在1.0g,依法检查(中国药典2000年版VIIIH)含重金属不得过百万分之二十。
7、异常毒性取本品,加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液,依法检查(中国药典2000年版附录XIC).按静脉注射法给药,应符合规定(供注射用)。
[含量测定]
1.对照品溶液的制备
精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度.摇匀;精密量取5ml,置100ml的量瓶中,加水至刻度,摇匀.每1ml中含甘露糖50ug。
2.供试品溶液备
取本品适量,精密称定,加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。
3.标准曲线的制备
精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,分别置具塞试管中,各加水至1.0ml,再加3%苯酚溶液1.0ml,摇匀,冲入硫酸4.5ml,摇匀,放置于室温,以0管为空白.照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收度,计算回归方程。
4.测定法
精密量取供试品溶液1.0ml,照标准曲线制备项下自“再加3%苯酚溶液1.0ml”起,依法操作,测定吸收度,由回归方程计算甘露糖的含量。
甘露聚糖肽免疫原性测定法(补体结合法);
1、试液
A.酸盐缓冲液(pH7.2)
取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g,加水至1000ml使其溶解,加10%硫酸镁溶液1ml,摇匀。
B.1%羊红细胞悬液
羊血红细胞的制备:由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g,枸椽酸5.5g,加水至1000ml使溶解,100℃灭菌30分钟)的无菌容器中,4℃保存。
1%羊血红细胞悬液的制备:取上述羊血红细胞适量,用氯化钠注射液洗涤三次,每次离心5分钟(2000转/分),取压积羊血红细胞,用氯化钠注射液制成1%羊血红细胞悬液。取悬液,用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液,另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA),在541nm的波长处测定,其吸收度应为0.65-0.70,如超出限度应调节1%羊红细胞悬液的浓度。
C.溶血素及致敏羊血红细胞
溶血素的制备:取上述压积羊血红细胞,用氯化钠注射液制成25%羊血红细胞悬液.取家兔1只,静脉注射上述羊血红细胞悬液,每日一次,共七次,前三次3ml,后三次5ml,末次注射后七日采血。分离血清,56℃.30分钟灭活,分装,0℃以下保存。
溶血素单位的测定:取溶血素适量,加磷酸盐缓冲液分别制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀释液,各取0.1ml置试管中,加1%羊血细胞悬液0.1ml,摇匀,加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液0.2ml,摇匀,37℃保温30分钟,完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。
致敏羊血红细胞的制备: 临用前,将2%的羊血红细胞悬液与2单位溶血索等体积混合,37℃保温15分钟即得。
补体:取三只以上豚鼠,心脏采血,离心分离血清,0℃以下保存。
补体单位的测定: 取补体适量,加磷酸盐缓冲液,分别制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液,各取0.2ml置试管中,加0.2ml磷酸盐缓冲液,摇匀,37℃保温30分钟后,分别加致敏羊血红细胞0.2ml,摇匀,37℃再保温30分钟.完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。
抗体:取甘露聚糖肽对照品适量,加氯化钠注射液制成每1ml中含IOmg的对照品溶液免疫家兔,隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml,第二次至第五次各注射0.5ml,第六次至第十次各注射1.0ml,第十一次至第十五次各注射2.0ml,末次注射后三日采血,离心分离血清,56℃下30分钟灭活,分装,0℃以下保存(临用前,需56℃30分钟再次灭活)。
抗体单位的测定:取抗体适量,加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32.1∶64、1∶128的稀释液,各取0.1ml置试管中,加甘露聚糖肽对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2ml,摇匀,于4-8℃放置4小时以上,置37℃保温30分钟,不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体,以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原,以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原,抗体,以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管,以上三种对照管应全溶血;另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体,以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。
2、免疫原性测定法
取甘露骤糖肽对照品与供试品适量,照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液,各取0.1ml置试管中,加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml.摇匀,于4-8℃放置4小时以上,置37℃保温30分钟,加入致敏羊血红细胞0.2ml,摇匀,37℃再保温30分钟。观察各管的溶血情况,不溶血管的最低浓度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同时设抗原(不加抗体,以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原,以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管,以上三种对照管应全溶血:另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体,以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。
实施例1取蒲公英150g,金银花150g,蛇床子120g,猪胆120g,五倍子120g,黄芪150g,党参150g,苍术120g。
将以上中药煎煮两次→合并煎液→浓缩→过滤→加入上述α-甘露聚糖肽100g与药液混匀→保温灌模,共制栓剂每枚重5g→质检入库。
具体生产过程按中华人民共和国药典2000版一部栓剂的制备工艺(国家药典委员会编,化学工业出版社出版)
其它实施例与实施例1只是用中药成分不同,其它生产过程完全相同。
实施例2的药物1000g中含α-甘露聚糖肽300g、金银花30g、板蓝根50g、连翘30g、大青叶25g、清黛30g、黄连30g、黄芩30g、黄柏30g、黄藤25g、穿心莲30g、紫花地丁30g、蒲公英25g、败酱草30g、蚤休25g、龙胆草20g、山豆根30g、知母10g、厚朴30g、丹皮30g、白芍20g、夏枯草30g、瓜蒌30g、牛黄20g、大蒜30g、诃子30g。
实施例3的药物1000g中含α-甘露聚糖肽300g、金银花20g、板蓝根40g、连翘20g、大青叶15g、清黛20g、黄连20g、黄芩20g、黄柏20g、黄藤15g、穿心莲20g、紫花地丁20g、蒲公英15g、败酱草20g、蚤休15g、龙胆草10g、山豆根20g、知母10g、厚朴20g、丹皮20g、白芍10g、夏枯草20g、瓜蒌20g、牛黄10g、诃子20g、蛇床子20g、苦参20g、白头翁20g、苦楝根皮20g、仙鹤草芽20g、薄荷20g、大蒜40g、葱白20g、莱菔子20g、乳香20g、桃叶20g、皂角20g。
实施例4的药物1000g中含α-甘露聚糖肽300g、金银花20g、板蓝根20g、连翘10g、大青叶10g、清黛10g、黄连10g、黄芩15g、黄柏10g、黄藤10g、穿心莲10g、紫花地丁15g、蒲公英5g、败酱草10g、蚤休15g、龙胆草10g、山豆根15g、知母5g、厚朴10g、丹皮15g、白芍10g、夏枯草10g、瓜蒌15g、牛黄10g、诃子10g、蛇床子10g、苦参15g、白头翁10g、苦楝根皮15g、仙鹤草芽15g、薄荷10g、大蒜20g、葱白10g、莱菔子15g、乳香10g、桃叶10g、皂角10g、龙胆草10g、黄芩20g、白茅根20g、生地20g、生石膏20g、知母10g、六一散20g、大青叶20g、丹皮20g、赤芍20g、车前草10g、茯苓皮20g、生薏米20g、地肤子20g、白花蛇舌草20g。
实施例5的药物1000g中含α-甘露聚糖肽230g、金银花20g、板蓝根20g、连翘10g、大青叶10g、清黛10g、黄连10g、黄芩15g、黄柏10g、黄藤10g、穿心莲10g、紫花地丁15g、蒲公英5g、败酱草10g、蚤休15g、龙胆草10g、山豆根15g、知母5g、厚朴10g、丹皮15g、白芍10g、夏枯草10g、瓜蒌15g、牛黄10g、诃子10g、蛇床子10g、苦参15g、白头翁10g、苦楝根皮15g、仙鹤草芽15g、薄荷10g、大蒜20g、葱白10g、莱菔子15g、乳香10g、桃叶10g、皂角10g、龙胆草5g、黄芩10g、白茅根15g、生地10g、生石膏15g、知母5g、六一散10g、大青叶15g、丹皮10g、赤芍10g、车前草10g、茯苓皮15g、生薏米10g、地肤子10g、白花蛇舌草15g、苍术20g、白术20g、橘皮20g、半夏15g、茯苓25g、泽泻20g、猪苓20g、滑石15g、车前子20g。
实施例6的药物1000g中成分是α-甘露聚糖肽215g、金银花15g、板蓝根15g、连翘10g、大青叶10g、清黛10g、黄连5g、黄芩10g、黄柏5g、黄藤10g、穿心莲10g、紫花地丁10g、蒲公英5g、败酱草10g、蚤休5g、龙胆草10g、山豆根5g、知母5g、厚朴10g、丹皮10g、白芍10g、夏枯草10g、瓜蒌15g、牛黄10g、诃子10g、蛇床子10g、苦参5g、白头翁5g、苦楝根皮10g、仙鹤草芽5g、薄荷10g、大蒜10g、葱白10g、莱菔子15g、乳香10g、桃叶10g、皂角10g、龙胆草5g、黄芩10g、白茅根15g、生地10g、生石膏15g、知母5g、六一散10g、大青叶15g、丹皮10g、赤芍10g、车前草10g、茯苓皮15g、生薏米10g、地肤子10g、白花蛇舌草15g、苍术20g、白术20g、橘皮20g、半夏15g、茯苓25g、泽泻20g、猪苓20g、滑石15g、车前子20g、党参20g、淮山15g、黄芪10g、人参15g、甘草20g、当归10g、熟地20g。
本发明所述治疗慢性宫颈炎栓剂的毒理研究:①急性毒性试验:雌性家兔腹腔埋植50g,24小时后未见死亡及任何不良反应发生;②雌性家兔局部用药,每日三次,每次5g,连用2个月,检查肝肾功能、血象及各脏器组织均无异常变化;③豚鼠过敏试验为阴性;④致畸致死试验均为阴性。
动物药效学研究
实验一:本发明所述五种栓剂对宫颈炎大鼠天然免疫功能的影响
摘要:[目的]探讨本发明所述五种栓剂对宫颈炎实验大鼠的治疗作用。[方法]将大鼠分为造模组、本发明所述五种栓剂组、α-甘露聚糖肽组、宫颈宁栓剂组、正常对照组。全部实验动物进行病理学检查、红细胞免疫粘附功能、T淋巴细胞活化率和吞噬细胞吞噬功能的测定。[结果]病理学检查,造模组宫颈粘膜下可见大量炎细胞浸润,出现粘膜溃疡;本发明所述五种栓剂治疗组、正常对照组病理学改变不明显。红细胞免疫粘附功能、吞噬细胞吞噬功能,造模组明显低于正常对照组;本发明所述五种栓剂治疗组明显高于造模组,与正常对照组之间无明显差异。[结论]本发明所述五种栓剂均可提高宫颈炎实验大鼠红细胞免疫粘附功能及吞噬细胞吞噬功能,从而使相应的病理学改变得到改善。
宫颈炎是女性生殖器官炎症中最常见的疾患。此炎症除与创伤、各种细菌、病毒、衣原体等感染有关外,与机体的免疫功能也密切相关。机体的非特异免疫(又称天然免疫)在疾病的发生、病情的发展及预后过程中的作用越来越受到人们的普遍重视。免疫粘附是反应机体天然免疫的一个方面,其中红细胞免疫粘附功能显示重要作用。红细胞膜上的CR1具有粘附C3b、C4b的能力,其强弱的测定可作为分子红细胞免疫粘附功能强弱的指标之一。吞噬细胞吞噬功能在机体天然免疫中也起重要作用。本研究观察了宫颈炎大鼠红细胞免疫粘附功能、吞噬细胞吞噬功能、T淋巴细胞活化水平及本发明所述栓剂对其调节作用。
1材料与方法
1.1主要试剂、药物
液体苯酚:天津市化学试剂一厂,津Q/HG3524-91。
阿拉伯树胶:广东市化学玻璃仪器厂,UK进口分装,批号930118。
ConA(刀豆蛋白A):Sigma公司。
3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5二苯基溴化四唑(MTT):同上。
冻干酵母多糖试剂:西安交通大学医学院免疫教研室。
宫颈宁栓剂:江苏省中医院。
α-甘露聚糖肽栓剂:西安亨通光华制药有限公司。
本发明所述五种栓剂:西安亨通光华制药有限公司。
1.2动物与分组
选用健康、雌性、未孕wistar大白鼠117只,体重151-225g(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。将动物按体重随机分成9组,每组13只:正常对照组,模型组,本发明所述第一种栓剂组,所述第二种栓剂组,本发明所述第三种栓剂组,本发明所述第四种栓剂组,本发明所述第五种栓剂组,α-甘露聚糖肽组,宫颈宁栓剂组。
1.3造模方法及实验方法
除正常对照组外其余4组用25%苯酚胶浆制作宫颈炎模型,用锥形静脉切开针,进入阴道深部注入苯酚胶浆,每只1.5ml,3天1次,共3次。造模后第3天开始给药,α-甘露聚糖肽组用α-甘露聚糖肽粉10mg,阿拉伯树胶8g,蒸馏水15ml配成胶浆;宫颈宁栓剂组用宫颈宁栓5g,阿拉伯树胶8g,蒸馏水15ml配成胶浆;本发明所述五种栓剂组分别用本发明所述五种栓剂各5g,阿拉伯树胶8g,蒸馏水15ml配成胶浆;正常对照组、模型组于造模后第3天,用阿拉伯树胶,蒸馏水配成胶浆;各组均用锥形静脉切开针,分别进向阴道深部注入,每日1次,每次每只1.5ml,连续用10天。
1.4实验指标的测定方法
红细胞CR1分子免疫粘附功能的测定:将待测实验大鼠的抗凝血离心,配成1.25×10/mL红细胞悬液,将冻干酵母多糖试剂配成1×108/mL使用液,两者取出适量后混合,37℃温育30min,取样染色镜检。
T淋巴细胞活性测定:采用MTT检测法,将各组大鼠分别无菌取脾,研磨分离,制成单个核细胞悬液,调整细胞浓度为1×107/mL,分别加入终质量浓度为8mg/L的ConA,空白孔加入RPMI1640,5%CO2,37℃培养72h,终止培养前4h,1500r/min离心15min,弃上清,每孔加入盐酸异丙醇100μL溶解颗粒,于570nm测OD值。并计算其活化率。
中性粒细胞吞噬功能的检测:将待测实验大鼠的抗凝血,离心吸出白细胞层,适当稀释后取0.5mL,加入葡萄球菌菌液0.1mL(106CFU/mL),混匀后37℃温育45min,取样染色镜检。
2结果
动物造模后,造模组动物大多数(8只)阴道外口有浓稠略黄分泌物。本发明所述五种栓剂治疗后仅个别(1-2只)动物阴道外口有少量分泌物,其余均干燥、清洁。α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组均一半(6只)动物阴道外口有分泌物。治疗后处死各组动物,病理学检查,镜下见造模组动物阴道及宫颈粘膜可见大量炎细胞浸润,小血管扩张、充血、水肿,少数出现粘膜溃疡。α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组上述病理变化减轻,本发明所述五种栓剂组均明显减轻,接近正常组。
红细胞CR1分子免疫粘附功能的测定、T淋巴细胞活性测定、中性粒细胞吞噬功能的测定,结果见表1、2、3。统计学处理采用方差分析,q检验。
表1各组实验大鼠红细胞CR1分子免疫粘附功能的测定(%,X±s)
组别 动物数 红细胞CR1粘附率
对照组 13 16.46±2.06
模型组 13 9.09±2.38
本发明所述第一种栓剂组 13 15.69±2.47
本发明所述第二种栓剂组 13 15.93±2.01
本发明所述第三种栓剂组 13 16.25±2.34
本发明所述第四种栓剂组 13 16.40±2.58
本发明所述第五种栓剂组 13 16.51±1.87
α-甘露聚糖肽组 13 12.16±4.07
宫颈宁栓剂组 13 12.49±3.15
注:对照组与模型组比较**P<0.01,模型组与本发明所述栓剂组比较**P<0.01,模型组与α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组比较*P<0.05,对照组与本发明所述栓剂组比较P>0.05。
以上实验数据表明:宫颈炎大鼠红细胞CR1分子免疫粘附率较正常对照大鼠明显降低,统计学有显著性差异;应用本发明所述五种栓剂治疗后,红细胞CR1分子免疫粘附率均又恢复至正常水平,且随着配方的加强,疗效越来越肯定;经α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂治疗的大鼠,其红细胞CR1分子免疫粘附率升高,但未能恢复到正常水平。说明本发明所述五种栓剂对宫颈炎红细胞免疫粘附功能下降有较好的疗效,而α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂虽有一定的治疗效果,但疗效显著低于本发明所述五种栓剂。
表2各组实验大鼠中性粒细胞吞噬功能的测定(%,X±s)
组别 动物数 中性粒细胞吞噬率
对照组 13 74.06±2.17
模型组 13 60.09±2.08
本发明所述第一种栓剂组 13 72.75±2.47
本发明所述第二种栓剂组 13 73.06±2.13
本发明所述第三种栓剂组 13 73.38±2.42
本发明所述第四种栓剂组 13 73.91±2.34
本发明所述第五种栓剂组 13 74.10±2.78
α-甘露聚糖肽组 13 62.06±3.07
宫颈宁栓剂组 13 61.23±2.09
注:对照组与模型组比较**P<0.01,模型组与本发明所述栓剂组比较**P<0.01,模型组与α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组比较P>0.05,对照组与本发明所述栓剂组比较P>0.05。
以上实验数据表明:宫颈炎大鼠中性粒细胞的吞噬功能较正常大鼠明显降低,统计学有显著性差异;应用本发明所述五种栓剂治疗后,中性粒细胞的吞噬功能均恢复至正常水平,且随着配方的加强,疗效越来越肯定,与对照组无显著性差异;经α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂治疗的大鼠,其中性粒细胞的吞噬功能变化不大。说明本发明所述五种栓剂对宫颈炎中性粒细胞吞噬功能降低有较好的疗效,α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂则无明显的治疗作用。
表3各组实验大鼠T淋巴细胞活性的测定(%,X±s)
组别 动物数 T淋巴细胞活化率
对照组 13 65.08±6.64
模型组 13 55.09±6.09
本发明所述第一种栓剂组 13 64.25±5.37
本发明所述第二种栓剂组 13 64.47±6.31
本发明所述第三种栓剂组 13 64.83±6.21
本发明所述第四种栓剂组 13 65.05±6.14
本发明所述第五种栓剂组 13 65.21±6.43
α-甘露聚糖肽组 13 60.17±4.03
宫颈宁栓剂组 13 60.38±3.84
注:对照组与模型组比较**P<0.01,模型组与本发明所述栓剂组比较**P<0.01,模型组与α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组比较*P<0.05,对照组与本发明所述栓剂组比较P>0.05。
以上实验数据表明:宫颈炎大鼠T淋巴细胞活化率较正常大鼠明显降低,有显著性差异;应用本发明所述五种栓剂治疗后,T淋巴细胞活化率又显著升高,恢复到正常水平;经α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂治疗的大鼠,其T淋巴细胞活化率有所升高,但为恢复到正常水平。说明本发明所述五种栓剂对宫颈炎大鼠T淋巴细胞介导的细胞免疫功能具有较强的激活作用,α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂对T淋巴细胞有一定的激活作用,但疗效显著低于本发明所述五种栓剂。
3讨论
本发明所述五种栓剂具有清热燥湿,解毒消肿,祛腐生肌之功效。可明显改善宫颈炎实验大鼠病理学的改变。红细胞作为机体数量最多的血细胞,具有许多重要免疫相关功能,多层次地参与机体天然免疫。主要表现在红细胞CR1分子免疫粘附功能上。本发明所述五种栓剂可增强宫颈炎大鼠的红细胞免疫粘附功能,使其宫颈炎的症状及相应的病理学改变有明显改善。中性粒细胞吞噬功能在杀菌、溶菌和清除过程中起重要作用,是机体的天然免疫的组成部分。宫颈炎实验大鼠中性粒细胞吞噬功能降低,本发明所述五种栓剂可提高宫颈炎实验大鼠中性粒细胞的吞噬功能,对炎症的过度、持续反应具有抑制和治疗作用。T淋巴细胞介导的细胞免疫功能是天然免疫的组成部分,宫颈炎实验大鼠T淋巴细胞活化率明显下降,本发明所述五种栓剂可提高宫颈炎实验大鼠T淋巴细胞活化率,恢复机体的细胞免疫功能。
本研究从免疫学角度探讨了本发明所述五种栓剂通过改善宫颈炎实验大鼠红细胞免疫粘附功能,提高中性粒细胞吞噬功能,激活T淋巴细胞介导的细胞免疫功能,达到有效控制,终止炎症反应,使相应的病理学改变得到明显改善。
实验二:本发明所述五种栓剂对试验大鼠宫颈炎病理形态学的影响
摘要采用阴道深部注入苯酚胶浆,建立大白鼠宫颈炎症模型,并观察本发明所述五种栓剂对宫颈组织形态的影响。结果表明:本发明所述五种栓剂组动物宫颈局部鳞状上皮完好率明显高于α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂组;粘膜下及间质内炎细胞和水肿程度均明显轻于α-甘露聚糖肽和宫颈宁栓剂组。
1材料与方法
1.1主要试剂、药物
液体苯酚:天津市化学试剂一厂,津Q/HG3524-91。
阿拉伯树胶:广东市化学玻璃仪器厂,UK进口分装,批号930118。
宫颈宁栓剂:江苏省中医院。
α-甘露聚糖肽栓剂:西安亨通光华制药有限公司。
本发明所述五种栓剂:西安亨通光华制药有限公司。
1.2动物及分组
选用健康、雌性、未孕wistar大白鼠126只,体重150-200g(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。将动物按体重随机分成9组,每组14只:正常对照组,模型组,本发明所述第一种栓剂组,本发明所述第二种栓剂组,本发明所述第三种栓剂组,本发明所述第四种栓剂组,本发明所述第五种栓剂组,α-甘露聚糖肽组,宫颈宁栓剂组。
1.3造模方法及实验方法
除正常对照组外其余4组用25%苯酚胶浆制作宫颈炎模型,用锥形静脉切开针,进入阴道深部注入苯酚胶浆,每只1.5ml,3天1次,共3次。造模后第3天开始给药,α-甘露聚糖肽组用α-甘露聚糖肽粉10mg,阿拉伯树胶8g,蒸馏水15ml配成胶浆;宫颈宁栓剂组用宫颈宁栓5g,阿拉伯树胶8g,蒸馏水15ml配成胶浆;本发明所述五种栓剂组分别用本发明所述五种栓剂各5g,阿拉伯树胶8g,蒸馏水15ml配成胶浆;正常对照组、模型组于造模后第3天,用阿拉伯树胶,蒸馏水配成胶浆;各组均用锥形静脉切开针,分别进向阴道深部注入,每日1次,每次每只1.5ml,连续用10天。
1.4观察项目及方法
连续治疗10天后处死各组动物,解剖子宫后取出观察,并记录肉眼所见。取材阴道至子宫分角处组织,置20%中性福尔马林中固定,3天后将组织自中线纵行切开,做常规石蜡切片,HE染色,镜下观察阴道至子宫组织形态学变化及粘膜、粘膜下间质形态学的炎症改变程度,根据评定标准评定炎症程度。
粘膜:①鳞状上皮层次仅局部超过2-3层略有增厚为“+”,明显增厚为“++”,广泛增厚并使粘膜凹凸不平为“+++”;②有些处柱状上皮可见有增生而出现鳞化趋势为“+”,明显鳞化为“++”,鳞化区域广泛甚至达宫腔为“+++”;③仅见极少区域鳞状上皮出现糜烂,而被邻近柱状上皮增生替代为“+”,柱状上皮增生明显替代鳞状上皮为“++”,鳞状上皮大片脱落由柱状上皮替代为“+++”;④仅见极少区域糜烂突破基底膜为“+”,可见明显粘膜上皮变性坏死为“++”,粘膜溃疡伴有感染为“+++”。
炎细胞浸润:⑤仅见粘膜及粘膜下浅层有少量炎细胞浸润为“+”,粘膜及粘膜下间质内均有中等量炎细胞浸润为“++”,粘膜下及间质内深层均见大量广泛炎细胞浸润为“+++”;⑥间质成纤维细胞增生:间质内仅见成纤维细胞略较正常对照组增多为“+”,成纤维细胞增生明显并有少量胶原纤维束为“++”,成纤维细胞增生伴有大量胶原纤维束形成为“+++”。
综合阴道各部炎症改变程度,将阴道及宫颈总体炎症改变程度分为4级如下:正常:六项中仅见浅层少量炎细胞浸润;轻度:六项中两项以上“+”;中度:六项中两项以上“+”,两项有“++”;重度:六项中一项有“+++”,两项有“++”,三项有“+”;或三项有“+++”。
用普通光学显微镜观察粘膜下炎细胞浸润情况,并用目镜测微网于40×10倍镜下计数炎细胞浸润程度,并以每个目镜测微网为单位面积,均匀随机计数6个单位面积炎细胞数。取均值,将各组炎细胞数作统计学处理。
1.4统计学方法实验结果采用方差分析,Ridit检验等统计学方法处理。
2结果
2.1大体观察
造模后造模组动物大多数(9例)阴道外口可见有浓稠的分泌物、动物扎堆、少动、竖毛;本发明所述五种栓剂组仅个别(1-2例)阴道外口有少量分泌物外,其余均干燥,清洁且动物外观与正常对照组无明显区别;α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组近半数(各6例)阴外口有分泌物,外观略好于造模组。
2.2组织形态学观察
造模组阴道粘膜鳞状上皮层次增厚,宫颈鳞柱交界处可见有柱状上皮鳞状化生,有处可见上皮糜烂,并有糜烂部位柱状上皮替代鳞状上皮的趋势。少数病例可见有粘膜溃疡,粘膜下层毛细血管扩张充血,间质水肿。从粘膜至间质均可见大量炎细胞浸润,并可见间质纤维组织增生。本发明所述五种栓剂组与造模组相应部位比较,病变均明显轻微,其炎症改变程度也明显较其它组轻,其鳞状上皮形态与正常对照组相似,粘膜下炎细胞浸润较造模组明显减少、,组织结构与正常对照组无明显差异。α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组的炎症有所减轻,但依然重于本发明所述五种栓剂组。(见表1、2)
表1各组子宫炎症程度比较
组别 炎症程度分级 Ridit值 95%可信区
间
正常 轻度 中度 重度
对照组 12 2 0 0 0.201
0.03-0.37
模型组 0 3 7 4 0.756
0.60-0.91
本发明所述第一种栓剂组 4 8 2 0 0.416
0.26-0.57
本发明所述第二种栓剂组 4 9 1 0 0.405
0.25-0.56
本发明所述第三种栓剂组 5 7 2 0 0.395
0.24-0.55
本发明所述第四种栓剂组 5 8 1 0 0.385
0.23-0.54
本发明所述第五种栓剂组 5 9 0 0 0.365
0.21-0.52
α-甘露聚糖肽组 2 5 6 1 0.584 0.43-0.74
宫颈宁栓剂组 2 6 5 1 0.508
0.39-0.62
表2各组子宫颈粘膜炎细胞数比较
组别 n X±s
对照组 14 64.00±23.73
模型组 14 107.21±22.63**
本发明所述第一种栓剂组 14 65.03±20.14◇◇
本发明所述第二种栓剂组 14 64.93±20.17◇◇
本发明所述第三种栓剂组 14 64.75±19.04◇◇
本发明所述第四种栓剂组 14 64.23±19.25◇◇
本发明所述第五种栓剂组 14 64.03±21.01◇◇
α-甘露聚糖肽组 14 70.12±20.86◇◇
宫颈宁栓剂组 14 68.57±19.23◇◇
注:与正常组比**P<0.01;与造模组比:◇◇P<0.01
3讨论
本实验组织学检查证实本发明所述五种栓剂组的被覆上皮完好率均明显高于α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组,鳞柱交界处两种上皮移行部清晰,其形态结构,鳞状上皮层次均更接近于正常对照组。在鳞柱交界处,未见有明显高度鳞化征象,粘膜下腺体增生也较α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组轻微,粘膜下及间质内炎细胞浸润和水肿程度均明显轻于造模组,也略轻于α-甘露聚糖肽组和宫颈宁栓剂组。其总体炎症改变均较造模组轻微,而更接近于对照组。提示:本发明所述五种栓剂对实验动物所造成的宫颈粘膜的损伤和炎症均有理想的治疗作用。
本发明所述治疗慢性宫颈炎栓剂的临床疗效验证:张某,48岁,宫颈重度糜烂15年,曾用西药外用多次,阴道分泌物减少,但宫颈糜烂面无好转,常感疲乏无力,面色晦暗。采用本发明所述治疗慢性宫颈炎栓剂治疗7天后,自觉症状好转,精神状态佳,面色红润,阴道分泌物减少,无色无味,宫颈糜烂面从原来的超过2/3宫颈面积,缩小到现在的还不到1/3宫颈面积,糜烂程度变浅,表面已接近痊愈。继续用药一个月后复查,已痊愈,随访半年无复发。可见本发明所述栓剂对慢性宫颈炎确实有独特的疗效。
本发明所述治疗慢性宫颈炎栓剂的临床疗效统计:收集270例均符合《疾病临床诊断和疗效标准》中“慢性宫颈炎”诊断标准的病例,选入病例均为已婚妇女,其中20-30岁者87例,占32.2%;31-40岁者102例,占37.8%;41-50岁者62例,占23%;50岁以上者19例,站7%。宫颈单纯糜烂者197例,占72.9%;宫颈糜烂并肥大者51例,占18.9%;宫颈糜烂并息肉者15例,占5.6%;那巴氏囊泡7例,占2.6%;宫颈糜烂程度I度43例,占15.9%;II度168例,占62.2%;III度59例,占21.9%。疗效标准:痊愈:宫颈糜烂面完全愈合,表面光滑,活检无异常,原有自觉症状消失;显(有)效:子宫颈糜烂面缩小1/2以上,糜烂程度变浅,自觉症状减轻;无效:子宫颈糜烂面缩小未达到1/2或局部无变化,自觉症状未减轻。治疗结果:270例患者每日用药一次,每次5g,连用7天为一个疗程。一个疗程结束后,痊愈247例,占91.5%;显(有)效18例,占6.7%;无效5例,占1.8%。统计总有效率为98.1%。