CN112972466B - 5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在抑制外周炎症及中枢神经系统炎症方面的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及5‑羟基吲哚‑3‑羧酸酯类化合物在抑制外周及中枢神经系统炎症方面的新用途。主要涉及应用盐酸艾咪朵尔来防治外周和中枢神经系统炎症所引起的相关疾病，以及对神经细胞的保护效应。

Description

5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在抑制外周炎症及中枢神经 系统炎症方面的用途

技术领域

本发明属于药物新用途领域，具体涉及5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在抑制外周炎症及中枢神经系统炎症、以及保护神经细胞方面的新用途。特别地，涉及应用盐酸艾咪朵尔来防治外周炎症和中枢神经系统炎症所引起的相关疾病，以及对神经细胞的保护效应。

背景技术

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子发生的防御反应。这些反应主要包括细胞、血管、间质、神经-体液等方面的变化。炎症的发生和发展是由机体因素及致炎因素共同决定的。正常情况下，致炎介质与抗炎介质二者产生的量，处于稳态平衡状态；当病原体以及其他致炎因子侵入时，则诱发大量的致炎介质产生，从而导致平衡失调即诱发炎症。引起炎症的致炎因素是多方面的，如物理性因素、化学性因素及内源性毒物、机械性因素、生物性因素、及免疫因素。炎症过程中涉及到多种细胞及多种因子的参与，其中，以白细胞渗出和局部组织损伤为主。介导炎症的细胞主要有四类：中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞。炎症在临床上的主要表现有：红、肿、热、痛。临床上常用的抗炎药主要有甾体类抗炎药和非甾体类抗炎药两类。甾体类抗炎药作用强，但不良反应较多，其应用范围受限。传统的非甾体抗炎药主要指作用于环氧合酶的一类药物，然而其选择性差，长期服用仍可造成较多不良反应。因此，开发抗炎效果更广泛且安全性更好的新型的抗炎药对防治各类外周炎症具有重要的临床意义。

随着人们的炎症研究的深入和神经免疫学的发展，发现在脑缺血、脑肿瘤、脑外伤、感染、轴索损伤、神经系统的自身免疫和神经退行性病变等多种神经病变中，均有免疫学病理改变。其中中枢神经系统的炎症致病学说被越来越多的基础和临床观察结果证实。神经炎症介导的病变主要由小胶质细胞的活化继而导致一些小分子如一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的过量释放，引起神经元细胞的损伤或死亡。因此，寻找能够有效抑制小胶质细胞活化的药物，对于防治多种神经系统相关疾病具有重要的社会意义和市场价值。

盐酸艾咪朵尔(Imidol Hydrochloride,Imidol)属于5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物，由沈阳药科大学药物化学教研室首次合成，该化合物体内外抗病毒药效强、毒性低，对乙肝病毒具有显著的抑制作用，其主要通过抑制乙肝病毒进行DNA复制和抑制产生HBsAg、HBeAg的能力来抗乙肝病毒。

而目前对于盐酸艾咪朵尔抗炎的药理活性未见报道，更未见有盐酸艾咪朵尔抑制外周炎症、中枢神经系统炎症，以及具有神经细胞保护作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在抑制外周炎症及中枢神经系统炎症、神经保护方面的新用途，特别是涉及盐酸艾咪朵尔(Imidol)在这些方面的新用途，从而为拓展盐酸艾咪朵尔的临床应用奠定基础。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在制备抑制外周炎症和/或中枢神经系统炎症的药物中的应用。

所述外周炎症包括非特异性炎症、自身免疫性炎症、感染性炎症。

所述感染性炎症包括急性肺损伤。

所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物用于抑制脂多糖诱导的巨噬细胞的激活。

所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物用于抑制脂多糖诱导的小胶质细胞的激活。

所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物具有神经保护作用。

所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物包括盐酸艾咪朵尔。

所述盐酸艾咪朵儿的剂量为25-216mg/kg，优选的剂量为25mg/kg、36mg/kg、50mg/kg、72mg/kg、100mg/kg、144mg/kg或216mg/kg。所述盐酸艾咪朵儿的剂量是指相对于每千克动物体重一天内服的盐酸艾咪朵儿的质量。

所述盐酸艾咪朵儿在液体制剂中的浓度为3-30μM，优选浓度为3μM、10μM或30μM。

本发明的技术效果

本发明提供的5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物，特别是盐酸艾咪朵尔具有抑制外周炎症及中枢神经系统炎症、以及神经保护的作用。更具体而言，在外周炎症方面，具有抑制非特异性炎症、自身免疫性炎症、感染性炎症的作用；在中枢神经系统炎症方面，具有抑制由小胶质细胞活化引起的中枢神经系统炎症；在神经细胞保护方面，具有抑制神经元损伤的作用。

附图说明

图1为Imidol治疗(7天)抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响。

图2为Imidol治疗(7天)抑制醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高。

图3为Imidol治疗(7天)抑制角叉菜胶所致大鼠足肿胀。

图4为Imidol治疗(7天)抑制棉球所致大鼠棉球肉芽组织增生的形成。

图5为Imidol治疗(7天)抑制佐剂性关节炎大鼠原发性足肿胀的时效和量效关系。

图6为Imidol治疗(7天)抑制佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀的时效和量效关系。

图7A-7E为Imidol治疗(7天)改善对LPS诱导的小鼠急性肺损伤。

图7A为LPS诱导急性肺损伤小鼠模型示意图。

图7B为肺湿重/干重(W/D)比值。

图7C为支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量。

图7D为BALF中细胞总数。

图7E为病理组织形态观察。

图8A-8C为Imidol降低LPS诱导RAW264.7巨噬细胞活化模型中NO释放。

图8A为单独给予Imidol对细胞存活率的检测。

图8B为在LPS刺激下Imidol对细胞存活率的检测。

图8C为Imidol单独或与LPS联用对细胞NO释放的检测。

图9A-9B为Imidol抑制对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞形态学和超微病理学改变。

图9A为相差显微镜下细胞的形态学观察。

图9B为透射电镜下细胞的超微结构形态观察。

图10A-10B为Imidol抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路中p65蛋白的核转位。

图10A中红色荧光代表p65蛋白，蓝色代表细胞核。

图10B为p65蛋白与细胞核共定位比统计图。

图11A-11D为Imidol抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞MAPKs/NF-κB信号通路中IKB-α蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化。

图11A中红色荧光代表磷酸化IKB-α蛋白，蓝色代表细胞核。

图11B中红色荧光代表磷酸化ERK1/2蛋白，蓝色代表细胞核。

图11C为磷酸化IKB-α蛋白荧光强度统计图。

图11D为磷酸化ERK1/2蛋白荧光强度统计图。

图12A-12C为Imidol抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞内ROS释放增加。

图12A为DPPH·自由基的清除检测。

图12B为ROS释放量检测统计图。

图12C为流式细胞术检测ROS释放量检测。

图13A-13D为Imidol抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NADPH氧化酶活性增强及作用靶点预测。

图13A为NADPH氧化酶活性。

图13B为计算机分析Imidol与NADPH氧化酶结合能力。

图13C为Imidol结合靶点三维图。

图13D为Imidol抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的机制示意图。

图14为Imidol降低LPS活化的N9小胶质细胞NO释放的时效和量效关系。

图15为Imidol降低LPS活化的原代大鼠小胶质细胞NO释放。

图16A-16B为Imidol抑制LPS活化的N9小胶质细胞内iNOS mRNA表达。

图17为Imidol降低LPS活化的N9小胶质细胞内iROS水平。

图18A-18B为Imidol抑制LPS活化的N9小胶质细胞内IL-1βmRNA表达。

图19A-19B为Imidol抑制LPS活化的N9小胶质细胞内COX-2mRNA表达。

图20为Imidol改善N9小胶质细胞活化导致的原代大鼠皮质神经元损伤。

图21为Imidol改善N9小胶质细胞活化导致的原代大鼠海马神经元损伤。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

<5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物>

以往5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物是作为新型抗流感病毒药物进行研究的。Grinev A.H.，et al.Khim-Farm Zh，1987，21(1)，52；Parisheva E.K.et al.Khim FarmZh，1988，22(5)，565；Mezentseva M.V.et al.Khim Farm Zh，1990，24(10)，52；OtovaS.A.，et al.KhimFarm Zh，1992，26(1)，52；Zotova S.A.et al.Khim Farm Zh，1995，29(1)，51等文献报道了一些5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物的合成及其药理活性研究，实验表明其中一些化合物具有抗流感病毒活性，并且具有诱导干扰素产生，增强人体免疫力的药理作用。

本发明涉及5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物中的盐酸艾咪朵儿，其化学名为1-甲基-4-(1-咪唑基)甲基-2-(苯基亚磺酰甲基)-5-羟基-6-溴-1H-吲哚-3-羧酸乙酯盐酸盐，英文名为1-methyl-4-(1-imidazole)methyl-2-(phenyl-sulfinylmethyl)-5-hydroxy-6-bromo-1H-indole-3-carboxylic acid ethyl ester hydrochloride，简称ImidolHydrochloride，或简称Imidol，其结构如下式(Ⅰ)：

该药物主要以口服的方式给药。

有效成分Imidol的剂量为25-216mg/kg，优选的剂量例如：25mg/kg、36mg/kg、50mg/kg、72mg/kg、100mg/kg、144mg/kg或216mg/kg。

有效成分Imidol的浓度为3-30μM，优选浓度例如：3μM、10μM或30μM。

<外周炎症>

本发明涉及的外周炎症包括非特异性炎症、自身免疫性炎症、感染性炎症等。

<非特异性炎症>

炎症发生发展一般经历三个时期：以毛细血管扩张和通透性亢进、渗出、水肿为主要特征的急性期，也称之为血管反应期；以白细胞游走、浸润、趋化为特点的亚急期，也称之为细胞反应期；以纤维组织增生、肉芽屏障形成为主要特质的慢性期，也称之为组织反应期。因此，阻断炎症反应过程的任何一个阶段，药物都可发挥抗炎作用。通常药理学研究中所采用的炎症模型就是根据炎症发生、发展过程中不同时相的性质而设计的，所以，炎症模型可归纳为三种类型：渗出和肿胀模型；白细胞游走模型；肉芽肿增生模型。

本发明通过Imidol对二甲苯所致小鼠耳肿胀、对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、对大鼠棉球肉芽肿形成、以及对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响，来考察Imidol对非特异性炎症的抗炎活性(图1-4)。

<自身免疫性炎症>

抗原进入机体使T细胞致敏，当再次接触佐剂后，致敏T细胞分化增殖，释放出各种淋巴因子并直接杀伤靶细胞，引起单核细胞的浸润，同时由抗原抗体形成的免疫复合体激活补体，导致白细胞趋化激活，释放一系列致炎因子，从而产生局部和全身性炎症反应。

本发明通过Imidol对大鼠佐剂性关节炎、对AA大鼠原发性炎症、以及对AA大鼠继发性炎症的影响来考察Imidol对自身免疫性炎症的抗炎活性(图5-6)。

<感染性炎症>

由致病微生物(细菌、病毒等)引起的炎症称为感染性炎症。脂多糖是G-细菌胞壁外膜的主要成分，由亲水性的核心多糖和疏水性的类脂组成，其中类脂A是LPS的主要活性成分。LPS可以直接或间接损伤肺泡上皮和肺血管内皮细胞，导致毛细血管通透性升高、中性粒细胞浸润和炎症介质的释放失控，从而诱发一系列病理生理改变。

本发明选用LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型，来评价Imidol对感染性炎症的影响(图7A-13D)。该小鼠急性肺损伤模型的病理特点与临床急性肺损伤(ALI)相似且成模率高。

<中枢神经系统炎症>

本发明涉及的中枢神经系统炎症主要由小胶质细胞的活化继而导致一些小分子如一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的过量释放，引起神经元细胞的损伤或死亡(图14-19B)。

<神经保护>

应用Imidol能够对活化的N9小胶质细胞条件培养液造成的原代大鼠皮质及海马神经元损伤均具有保护作用(图20-21)。因此，该治疗方案能够通过抑制小胶质细胞活化发挥神经保护作用。

实施例

以下结合图1-21，通过具体实施详细说明本发明的内容。

1、实验材料：

昆明种小鼠，18-22g，雄性，由沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(辽)2010-0001。Wistar大鼠，180-220g，雄性，由沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(辽)2010-0001。Imidol：纯度＞98％，白色粉末，由沈阳药科大学药物化学教研室合成和提供。

对于动物实验，该Imidol用DMSO和5％葡萄糖溶液配制使用，现用现配。DMSO的终浓度≤0.2％。对于细胞实验，Imidol用DMSO配制100mM储备液，避光保存于-20℃。临用时用完全培养基稀释到相应浓度进行实验。DMSO的终浓度为≤1‰。

2、实验方法：

2.1实验分组及给药

2.1.1二甲苯所致小鼠耳肿胀实验

雄性昆明种小鼠60只，随机分成6组，每组10只，即，模型对照组、阳性药Aspirin组(120mg/kg)、Imidol给药组(18mg/kg、36mg/kg、72mg/kg、144mg/kg)。Imidol组及Aspirin组每天灌胃给予相应剂量的药物，1次/天，连续给药7天，给药体积为0.2ml/10g，模型对照组每天灌胃给予相同体积的5％葡萄糖溶液。

2.1.2醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高实验

小鼠分组给药方法同2.2.1。

2.1.3大鼠棉球肉芽肿形成实验

雄性Wistar大鼠48只，体重180-220g，随机分为6组，每组8只，即模型对照组，阳性药Aspirin组(84mg/kg)，Imidol组(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)。各组大鼠在手术次日开始给药，Aspirin组和Imidol组给予相应体积的药物，模型对照组每天灌胃给予相同体积的5％葡萄糖溶液，1次/天，连续给药7天，给药体积为2ml/100g。

2.1.4角叉菜胶致大鼠足肿胀实验

雄性Wistar大鼠66只，体重18-220g，随机分成6组，每组11只，即，模型对照组、阳性药Aspirin组(84mg/kg)、Imidol给药组(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)。Imidol组、Aspirin组灌胃给予相应剂量的药物，1天/次，连续给药7天，给药体积为2ml/100g，模型对照组每天灌胃给予相应体积的5％葡萄糖溶液。

2.1.5大鼠佐剂性关节炎实验

雄性Wistar大鼠70只，体重160-180g，随机分为7组，每组10只，即空白组、模型组、Imidol(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)组、阳性药Aspirin(84mg/kg)组。Imidol组及阳性药Aspirin组于造模第15天开始灌胃给予相应剂量的药物，给药体积为2ml/100g，1次/天，连续给药7天，空白组和模型组给予相同体积的5％葡萄糖溶液。

2.1.6小鼠急性肺损伤实验

雄性KM小鼠105只，随机分为7组，即空白组、模型组、假手术组、Imidol(24mg/kg、72mg/kg、216mg/kg)组及阳性药Dex 1mg/kg组，每组15只。Imidol组灌胃给予相应剂量的药物，1天/次，连续给药7天，给药体积为0.2ml/10g，空白组、模型组、假手术组每天灌胃给予相同体积的5％葡萄糖溶液。Dex尾静脉注射方式给药，1次/天，连续给药7天，给药体积为0.1ml/10g。

2.1.7细胞实验

受试药物Imidol浓度设置为0.3，1，3，10，30，100(μM)单独或与LPS(1μg/ml或500ng/ml)共同作用组。同时设空白对照组和阳性药组，其中阳性药组为吲哚美辛组(10μM)或米诺环素(20μM)。每个浓度设3个平行孔。

2.2模型的制备

2.2.1二甲苯所致小鼠耳肿胀模型

于末次给药后1小时后，取二甲苯20μl均匀涂布于小鼠右耳正反两面致炎。致炎30分钟后脱颈处死，用7mm直径打孔器分别在左右两耳同一部位打下圆耳片，立即称重，以左右耳片重量差作为肿胀度，并计算右耳肿胀率及肿胀抑制率。

2.2.2醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型

末次给药1h后，于小鼠尾静脉注射0.5％伊文思兰0.1ml/10g后立即腹腔注射0.6％冰醋酸0.1ml/10g，30min后脱颈处死小鼠，腹腔注射生理盐水5ml/只，分3次冲洗，轻揉小鼠腹部，抽取腹腔液于3000rpm离心10分钟，于590nm处测定吸光度A值，用A值衡量动物腹腔渗出液的伊文思蓝染料的含量，作为检测毛细血管通透性的指标。

2.2.3大鼠棉球肉芽肿模型

各组大鼠用3.5％水合氯醛麻醉后，无菌状态下于大鼠腋窝部皮下切开小口，将高温高压灭菌棉球(20mg/个)分别植入大鼠腋窝部皮下，随即缝合皮肤，并在切口上洒适量的青霉素以防止伤口感染，之后用手术针缝合大鼠皮肤。各组大鼠在手术次日开始给药，末次给药后1h，脱颈处死大鼠，用剪刀和镊子打开原切口，将棉球连同周围组织一起取出，剔除多余脂肪，放入烘箱中60℃烘干24h，称取肉芽肿棉球的重量(mg)。

2.2.4角叉菜胶致大鼠足肿胀模型

末次给药1h后于大鼠右侧足趾皮下注射1％角叉菜胶0.1ml/只致炎，测定致炎前及致炎后1、1.5、2、3、4、5h肿胀足体积，并计算肿胀度(ml)及肿胀率(％)。

(1)足肿胀度＝致炎后足体积－致炎前足体积

(2)足肿胀率％＝足肿胀度/致炎前足体积×100％

2.2.5大鼠佐剂性关节炎模型

各组大鼠经3.5％水合氯醛轻微麻醉后，于大鼠左后足趾皮内注射0.1ml弗式完全佐剂(CFA)致炎，正常组大鼠注射同体积的生理盐水。原发性及继发性关节炎检测分别于造模第0、14、17、19、21d测量各组大鼠左足体积(原发肿胀)和右足体积(继发肿胀)。并通过下列公式计算足肿胀率：足肿胀率(％)＝(第n天足体积-第0天足体积)×100％/第0天足体积。

2.2.6 LPS诱导的感染性炎症模型

2.2.6.1小鼠急性肺损伤模型建立

末次给药1h后手术造模，各组小鼠于手术前禁食12h，小鼠经腹腔注射4％水合氯醛麻醉，而后仰卧位固定小鼠，采用暴露式气管滴注法，于颈部正中处切开并分离气管后，使用微量注射器穿刺气管，经气管滴注LPS(5mg/kg)生理盐水溶液(30μl/20g)，而后使小鼠直立，垂直旋转，使得药物在肺内均匀地分布，以建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型。假手术组采用同样的手术处理方式；生理盐水组暴露分离气管后，经气管滴注等量的生理盐水溶液，各组均于造模后6h收集标本。

2.3支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集

每组取8只小鼠脱颈处死后，仰卧位固定于操作台上，颈部正中处切开暴露气管后，使用一次性静脉留置针外套管(5号)进行气管插管，丝线结扎使其固定，然后用6ml冰生理盐水溶液经气管套管注入冲洗双侧支气管肺泡，反复注入、回吸3次后，回收肺泡灌洗液，置于冰上，防止细胞粘附，4℃，1200rpm离心10min，取上清保存于-80℃冰箱内，备测生化指标。

2.4肺湿重/干重比值测定

每组取6只小鼠脱颈处死后，仰卧位固定于操作台，暴露气管后，打开胸腔观察肺大体形态学改变。剪断气管后取右侧肺叶，称湿重，然后将肺置于60℃恒温箱中干燥，72h后取出，称干重，最后计算肺湿/干重的比值(W/D)。

2.5支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量测定

考马斯亮蓝法进行BALF中蛋白含量的测定，严格按说明书要求进行操作，设置标准管、空白管和测定管，按顺序加入试剂并混匀，静置约10min，紫外分光光度计1cm光径，波595nm处，将空白管调零，测定各管吸光度(OD)值。按照如下公式计算得出BALF中蛋白含量：蛋白含量(mg/mL)＝(测定管OD-空白管OD)/(标准管OD-空白OD)×标准管的浓度(mg/mL)。

2.6支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数

BALF细胞计数，用于评价小气道和肺泡腔内炎性细胞浸润的数量。支气管肺泡灌洗液离心去上清后的细胞团用200μl PBS重悬，采用细胞计数板进行细胞计数，算出每毫升的细胞总数。

2.7肺组织病理形态学观察

每组取6只小鼠脱颈处死后，仰卧位固定于操作台上，暴露气管后，打开胸腔，剪断气管后取左侧肺叶，于10％多聚甲醛中固定24h，各级乙醇脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片(厚度为5μm)，HE染色。光镜下观察肺组织炎性细胞浸润、水肿以及损伤情况。

2.7.1石蜡包埋步骤

1)组织脱水：标本经70％乙醇脱水过夜，80％乙醇脱水2h，90％乙醇脱水2h，95％乙醇Ⅰ脱水1.5h，95％乙醇Ⅱ脱水1.5h，100％乙醇Ⅰ脱水1.5h，100％乙醇Ⅱ脱水1.5h；

2)组织透明：二甲苯：乙醇(1:1)透明1h，二甲苯Ⅰ透明45min，二甲苯Ⅱ透明45min；

3)组织浸蜡与包埋：石蜡：二甲苯(1:1)浸蜡1h，石蜡Ⅰ浸蜡1h，石蜡Ⅱ浸蜡1h，石蜡包埋。

2.7.2 HE染色步骤

1)脱蜡：二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min；

2)水化：100％乙醇Ⅰ3min，100％乙醇Ⅱ3min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，水洗3min×3次；

3)苏木精染色：苏木精3min，水洗1min；

4)分化：1％盐酸乙醇10s；

5)返蓝：自来水冲洗10min；

6)伊红染色：伊红30s，水洗1min；

7)脱水：75％乙醇30s，85％乙醇30s，95％乙醇Ⅰ2min，95％乙醇Ⅱ2min，100％乙醇Ⅰ3min，100％乙醇Ⅱ3min，

8)透明：二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ2min，

9)封片：中性树胶：二甲苯＝1:1封片。

2.8细胞培养

2.8.1小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7及小胶质细胞系N9培养

细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMEM培养基作为基础配制成内含10％小牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的细胞培养液。细胞以约1×106cells/ml的浓度在5％CO₂，37℃培养皿中传代培养，至第2天贴壁细胞约占培养瓶底面积70-80％，以胰酶消化细胞，传代至另一培养皿。以液氮冻存复苏后的细胞作为第一代，选择第3-8代细胞进行实验。

2.8.2原代小胶质细胞分离、纯化和培养

(1)用75％的酒精对新生大鼠(24h以内)进行消毒，然后在无菌条件下断头取脑，置于冰浴的Hank’s液中，小心剔除软脑膜、血管和大脑内部组织及核团，剥离大脑皮层。用Hank’s液清洗一遍，剪碎；

(2)用0.25％胰酶消化10-15min，以IMDM培养液(含5％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素及50μM 2-巯基乙醇)止消化，巴氏吸管吹打，1300转/分钟离心5分钟，弃去上清，加DMEM培养液重悬，过200目筛网，制备混合细胞悬液；

(3)调整细胞密度为5×10⁵cells/ml，按每瓶7ml种植于100ml细胞培养瓶中；静置培养于CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中，48h后用等量培养液换液去除死亡细胞碎片；以后间隔3-4d换液一次，培养至10-15d，收集细胞；

(4)将瓶口拧紧，摇振10min，在无菌条件下收集上清液。将收集到的细胞悬液重新种植于100ml细胞培养瓶内，CO₂培养箱静置培养约30min后，室温下轻摇培养瓶以去除贴壁未牢的成分(主要为少突胶质细胞和星形胶质细胞)，弃去后加入新鲜培养液；此时所得到的细胞绝大部分为小胶质细胞，根据需要可以在重悬后调整细胞密度进行种植培养。

2.9细胞存活率的测定：MTT分析法

取生长状态良好的RAW264.7细胞、原代小胶质细胞或N9小胶质细胞，以1.2×10⁵cells/ml接种于96孔扳内，100μl/well，细胞贴壁培养24h后换无血清新鲜培养液，加药处理。细胞加药后继续培养24h后，向细胞培养液中加入MTT溶液(5mg/ml)10μl/well，于37℃下共同孵育4h，弃去培养液，加100μl/well的DMSO震荡10min，570-630nm处测定其吸光度值。计算细胞存活率。

细胞成活率％＝样品组OD值/对照组OD值的平均值×100％

2.10亚硝酸盐含量的测定：Griess分析法

生长状态良好的RAW264.7细胞、原代小胶质细胞或N9小胶质细胞，以1.2×10⁵cells/ml接种于96孔扳内，100μl/well，细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，加药处理。受试药物细胞加药后继续培养24h后，取上清培养液50μl，转移到96孔细胞培养板，使用一氧化氮检测试剂盒按50μl/孔分别加入室温Griess试剂，540nm处测定其吸光度值，根据试剂盒中标准品制备的标准曲线计算上清液中NO^2-含量。

2.11细胞形态观察

用倒置显微镜观察细胞培养板中RAW264.7巨噬细胞生长状况和形态特征变化。

2.12透射电镜检测

将RAW264.7细胞(4×10⁴/cm²)铺在100mm培养皿中，并用Imidol(30μM)和IND(10μM)，空白组加入生理盐水，单独或与500ng/mL LPS联用孵育24小时。离心后，收集细胞置于预冷的2.5％戊二醛溶液中后固定。而后，使用磷酸缓冲液漂洗后经1％锇酸溶液再固定80min，经超纯水漂洗，梯度丙酮脱水，环氧树脂渗透包埋制成组织块。使用超薄切片机制备70nm厚的超薄切片后将之捞至铜网，并使用3％醋酸双氧铀及柠檬酸铅进行组织染色。切片最后经超纯水冲洗后使用透射电镜进行采片。

2.13 DPPH·自由基的清除作用的测定

实验时，配制浓度为1×10^-4mol/L的DPPH·乙醇溶液，闭光置于摇床上轻轻摇动10min。将受试样品Imidol配成10倍终浓度的PBS溶液，吸取各浓度药液100μl，分别加入1×10^-4mol/L的DPPH-乙醇溶液900μl。摇匀后室温避光放置30min，酶标仪检测517nm处的吸光度值。

2.14细胞内活性氧(ROS)水平的变化

生长状态良好的RAW264.7细胞、原代小胶质细胞或N9小胶质细胞接种于6孔扳内。以100％纯甲醇溶解DCFH-DA配制成10mM的DCFH-DA母液，再用PBS溶液稀释500倍至终浓度20μM。细胞加药后继续培养0.5-6h后，吸取上清液，以该DCFH-DA溶液37度孵育1h，用PBS洗三次以去除未进入细胞内的DCFH-DA。采用流式细胞仪检测细胞的荧光强度或采用多功能酶标仪检测激发光波长485nm，发射光波长528nm处的荧光强度。

2.15免疫荧光测定

将RAW264.7细胞(1×10⁴/孔)置于对数生长期，并接种于带有细胞爬片的24孔板中。稳定24小时后，向细胞中加入Imidol(3、10、30μM)单独或与500ng/ml LPS联合使用，空白组加入相同溶剂。孵育1小时后除去培养基，用4％多聚甲醛固定20分钟，然后在室温下加入0.1％Triton X-100透化10分钟。室温下用5％正常山羊血清封闭1小时后，将细胞分别与一抗(靶向p65，磷酸化IκBα和磷酸化ERK1/2蛋白)孵育4℃过夜。用PBS三次洗涤后，将细胞与Cy3标记的二抗在室温下进一步孵育1小时。最后，将细胞与DAPI孵育10分钟。使用尼康C2Plus的共焦显微镜以20倍物镜采集图像。通过Image J软件分析共定位百分比和荧光强度。

2.16 NADPH氧化酶活性测定

取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，以1×10⁴cells/ml接种于24孔培养板中，贴壁培养24h后换成无血清培养液，加药处理。Imidol(3、10、30μM)与LPS(500ng/ml)共同作用12h，药物处理结束时弃去上清，加入含有0.1％NBT的培养液，37℃孵育3h，甲醇固定并拍照。细胞内的NBT颗粒用KOH和DMSO混合后溶解，室温震荡10min后，用酶标仪检测630nm处的吸光度。

2.17 Imidol与NADPH氧化酶的NOX2/gp91^phox相互作用预测

(1)受体数据收集：从蛋白质结构数据库RCSB PDB中得到受体分子的晶体结构。配体数据收集：使用ChemDraw画出活性小分子的结构。

(2)蛋白优化：去掉X-射线衍射解析得到的NOX2/Gp91^phox晶体结构中的水分子，并进行能量最小化。配体优化：LigPrep预处理配体小分子，生成两种构象。

(3)生成格点文件：蛋白晶体无共结晶，无法定义活性位点，将全部蛋白作为活性位点生成格点

(4)配体-受体分子对接：使用Glide，将配体的两个构象分别与优化后的受体分子盲对接。

(5)评价和打分：根据docking score和glide gscore评分越低越好；2D作用方式图分析配体与受体的成键方式以及作用氨基酸。

2.18 RT-PCR法考察小胶质细胞iNOS、IL-1β和COX-2 mRNA表达变化

取生长良好的N9小胶质细胞，以5×10⁵cells/ml接种于100ml培养瓶中，7ml/瓶，细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，加药处理。Imidol浓度设置为3，10，30μM与LPS(1μg/ml)共同作用组，同时设空白对照和米诺环素(20μM)和DPI(1μM)组。胞加药后继续培养12h后，收集细胞用于RT-PCR分析。

2.18.1 RNA抽提、纯度分析及鉴定RNA的完整性

(1)RNA抽提：按Trizol％说明，一步法提取细胞总RNA

1)细胞用新鲜培养液吹打下来，计数5×10⁶个，1000转/min离心5min，PBS洗一遍，

2)每管加Trizol 1ml，枪头反复抽吸均匀，移入1.5ml离心管中。

3)室温放置5min，加氯仿0.2ml，小心盖好，剧烈振摇15s，室温放置2-3min，4℃12000g离心15min。

4)仔细吸取上层水相(约500μl)，移至另一1.5ml EP管中，加0.5ml异丙醇，室温放置10min，4℃12000g离心10min。

5)小心移去上清，加0.01％DEPC处理过水配制的75％乙醇1ml轻柔上下颠倒洗洗涤，以免RNA离散，4℃7500g离心5min，尽可能吸走上清液。

6)室温下挥干(5-10min)不能完全干燥，加0.01％DEPC水50μl，吹打溶解，56℃水浴助溶10min。-70℃保存。

(2)紫外吸收测定法分析RNA浓度、纯度：用DEPC-H₂O稀释RNA(稀释度1:100)，即吸取10μl RNA，加入DEPC-H₂O 990μl，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值(以DEPC-H₂O调零)。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml，根据RNA浓度测定的结果将总RNA配置成1μg/μl。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。

2.18.2逆转录(RT)合成cDNA第一链(按照试剂盒操作说明进行)

1)将1μg总RNA加入微量离心管中并于70℃温育10min。短暂离心后置于冰上。

2)依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20μl的反应体系。

3)将反应体系于室温温育10min，然后于42℃温育15min。

4)将样品于95℃加热5min，然后于冰上冷却5min。存放于-20℃备用。

2.18.3 PCR反应及检测

(1)PCR扩增反应体系25μl：(按照顺序加入PCR管中)

1st strand cDNA 1μl

10×PCR Buffer 2.5μl

dNTP mix 2μl(2.5mM×2μl)

引物(含目的基因及GAPDH上、下游引物10pmol)1μl

Taq DNA polymerase 1.25units

三蒸水补足至25μl

(2)PCR扩增条件：

iNOS:94℃预变性5min

28cycles 94℃变性45s

57.6℃退火45s

72℃延伸1min

72℃终末延伸7min

IL-1β:94℃预变性5min

28cycles 94℃变性30s

55℃退火30s

72℃延伸45s

72℃终末延伸7min

COX-2:94℃预变性5min

28cycles 94℃变性45s

65℃退火30s

72℃延伸1min

72℃终末延伸7min

GAPDH:94℃预变性5min

28cycles 94℃变性45s

58℃退火45s

72℃延伸1min

72℃终末延伸7min

(3)琼脂糖凝胶电泳及半定量分析

取PCR扩增产物5μl，加入溴酚蓝1μl，于含0.5μg/ml溴化乙啶(EB)的1.2％琼脂糖凝胶中电泳，扩增条带与标准DNA分子量条带比较。Quantity One software分析、读取目的基因和GAPDH条带的光密度值，通过计算IOD(目的基因)/IOD(GAPDH)的比值，从而得到目的基因的相对表达丰度。

(4)各基因引物序列见下表

2.19原代大鼠皮质和海马神经元的培养

(1)无菌条件下取新生大鼠(1d)大脑皮质和海马，置于冰浴的Hank’s液中，剥除脑膜及血管，剪碎；

(2)0.25％胰酶消化5-10min，以IMDM培养液(内含5％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素及50μM 2-巯基乙醇)终止消化，巴氏吸管吹打，1000转/min离心5min，弃上清，加培养液重悬，200目筛网机械过滤，制备混合细胞悬液；

(3)计数，将细胞密度调整为1×10⁶cells/ml，接种于经0.01％多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)预处理的96孔板上，每孔100μl；

(4)置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。24h后换液并加入10μM阿糖胞苷(Ara-C)抑制非神经细胞的生长；

(5)之后隔天换液半液，于培养后第7～8天进行实验。

2.20条件培养液的制备

根据实验室前期工作结果，选定工具药LPS的作用时间、作用浓度分别为48h、1μg/ml。无血清IMDM孵育N9小胶质细胞48h后收集上层培养液为空白条件培养液(controlconditioned medium，CON-CM)；LPS(1μg/ml)刺激N9小胶质细胞48h后收集上层培养液为模型条件培养液(LPS conditioned medium，LPS-CM)；各浓度的Imidol与LPS(1μg/ml)共同作用于小胶质细胞48h后收集的条件培养液为Imidol条件培养液(Imidol-conditionedmedium，Imidol+LPS-CM)；米诺环素(20μM)和LPS(1μg/ml)共同作用于N9小胶质细胞48h后收集上层培养液为Minocyclin-条件培养液(Minocyclin-conditioned medium，MINO+LPS-CM)。收集后随即使用或于-70℃冷冻保存。应用Griess法分别检测各组中NO^2-的含量，以考察小胶质细胞条件培养液制备的成功与否。

2.21条件培养液的导致神经元损伤的模型的确立

实验分为3组。第1组为空白组，即CON-CM作用于原代大鼠皮层或海马神经元24h；第2组为模型组，即LPS(1μg/ml)-CM作用于原代大鼠皮层或海马神经元24h；第3组为CON-CM+LPS组，即CON-CM中加入LPS(1μg/ml)后作用于原代大鼠皮层或海马神经元24h，以考察LPS有无神经毒性。MTT法检测，所得OD值以对照组为100％计算神经元存活率进行统计学分析。

2.22条件培养液对成熟原代大鼠皮质及海马神经元的处理

把收集到的各组小胶质细胞条件培养液转移到培养7-8天的原代大鼠皮质及海马神经元,作用神经元的时间是24h。MTT法检测，所得OD值以空白条件培养液组为100％计算神经元存活率进行统计学分析。

2.23统计学方法

所有样本数据资料使用SPSS 21.0统计软件包进行处理分析，用GrahPad Prism8.0作图。结果采用Mean±S.E.M.表示，先用软件对整体样本数据进行正态分布检验符合正态分布，然后采用One-Way ANOVA评价整体方差差异，并结合LSDt-test、Tukey’s test或Dunnett’s test进行多组间数据比较。

3、实验结果

3.1 Imidol对非特异性炎症的抑制作用

实验结果如图1-4所示，在二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验中，Imidol36mg/kg、72mg/kg和144mg/kg能显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀度(抑制率分别为40％、51％和52％)；醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的急性炎症模型中，Imidol 72mg/kg和144mg/kg能显著拮抗醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高(抑制率分别为29％和34％)；角叉菜胶主要模拟炎症发生时的肿胀症状，实验结果表明，Imidol 25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg可显著抑制角叉菜胶所致大鼠足肿胀度；大鼠棉球肉芽肿实验结果显示，Imidol 100mg/kg能显著抑制大鼠棉球肉芽肿形成(抑制率为14％)。提示IImidol能够显著抑制炎症急性期引起的渗出和水肿，以及慢性期纤维肉芽组织的增生，表明Imidol非特异性炎症有抑制作用。

3.2 Imidol对自身免疫炎症的抑制作用

实验结果如图5-6，结果表明在造模第14天，模型组大鼠继发性足肿胀率与空白组相比，有显著性差异，说明大鼠佐剂性关节炎模型建立成功。Imidol 25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg能显著抑制AA大鼠原发性足肿胀度；Imidol 100mg/kg对AA大鼠继发性足肿胀度有显著的抑制作用。提示Imidol对自身免疫性炎症有抑制作用。

3.3 Imidol改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤

实验结果如图7A-7E，结果表明：Imidol 72mg/kg、216mg/kg可显著降低肺干湿重比值及支气管肺泡灌洗液中蛋白含量；Imidol216mg/kg可显著降低支气管肺泡灌洗液中细胞数。本实验中采用HE染色观察肺组织病理学改变，结果表明：LPS刺激下，肺组织出现明显的肺泡间隔增宽，肺泡融合，大量的炎性细胞浸润，弥漫性的肺出血以及肺水肿；Imidol72mg/kg、216mg/kg可减轻急性肺损伤小鼠肺结构的损伤，肺水肿、出血、肺泡融合等症状有所缓解。提示Imidol对感染性炎症有抑制作用。

3.4 Imidol抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

实验结果如图8A-9B，结果表明：Imidol(0.3-30μM)和吲哚美辛(10μM)单独使用或与LPS(500ng/ml)联合作用24h对RAW264.7巨噬细胞的存活率无明显影响。之后用Griess试剂检测培养基中NO的浓度。LPS(500ng/ml)刺激24h的RAW264.7细胞显着增加NO的产生，Imidol(0.3-30μM)浓度依赖性地抑制NO释放增加，而单独使用Imidol(0.3-30μM)则不诱导NO的产生。

通过相差显微镜观察RAW 264.7细胞，发现与空白组细胞相比，LPS刺激24h诱导了细胞的活化。Imidol(0.3-30μM)和吲哚美辛(10μM)在24小时内以浓度依赖的方式抑制了LPS诱导的形态变化另外，通过透射电镜观察到RAW 264.7细胞的超微结构变化。结果表明，RAW264.7细胞的表面具有形态规则的微绒毛，线粒体和内质网等细胞器，且核周空间清晰可见。LPS刺激24小时后，RAW264.7细胞出现大量液泡，线粒体空泡，内质网扩张和细胞内溶酶体粒细胞增多。Imidol(30μM)和吲哚美辛(10μM)可以减轻LPS诱导的细胞超微结构损伤。

3.5 Imidol抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的炎症反应机制探究

实验结果如图10A-13D，图10A-10B中使用免疫荧光法检测了NF-κB的转运和相关上游蛋白的磷酸化。与空白组细胞相比，LPS刺激后，NF-κB p65的细胞核水平显着升高，细胞质水平降低。Imidol(3-30μM)以浓度依赖性的方式降低了核转移。同时图11A-11D结果表明，LPS刺激后IκBα蛋白和MAPKs通路中的ERK1/2蛋白磷酸化水平显着增加，而Imidol(3-30μM)可以明显减轻IκBα和ERK1/2蛋白磷酸化水平。表明，Imidol可以抑制LPS诱导的NF-κB/MAPKs信号通路的活化。Imidol的抗氧化作用如图12A-12C所示，Imidol(1-30μM)没有清除DPPH自由基的作用。用Imidol(1-30μM)处理显著降低LPS诱导的RAW 264.7细胞中的ROS产生。结果表明，Imidol的抗炎作用可能与其抗氧化活性有关。由于ROS在巨噬细胞中主要由NADPH氧化酶介导，因此我们使用NBT法测定了Imidol对LPS刺激的RAW 264.7细胞中NADPH氧化酶活化的保护作用。结果如图13A-13D，表明LPS刺激12h后，NBT阳性细胞数量显着增加，这表明LPS处理显著上调了NADPH氧化酶的活性，Imidol(0.3-30μM)抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞中NADPH氧化酶活性的过度增加。为了研究Imidol与NADPH氧化酶的作用方式，我们对NADPH氧化酶中Imidol和NOX2/gp91^phox亚基之间的相互作用进行了预测分析。在分子对接模拟实验中，Imidol与Glu135形成一个盐桥相互作用，与NOX2/gp91^phox亚基的Gln142，Lys124和Thr138形成三个氢键(H键)相互作用。另外，药物的疏水区和Lys54彼此匹配以促进结合。因此，Imidol可以与NOX2/gp91^phox紧密结合，可能是通过该方式抑制NADPH氧化酶的活性。

3.6 Imidol对LPS活化的N9小胶质细胞和原代大鼠小胶质细胞NO释放的影响

实验结果如图14-15，采用Griess法考察了Imidol在3-100μM浓度下与LPS(1μg/ml)联合作用N9小胶质细胞12h、24h、48h和72h对N9小胶质细胞NO释放的影响。结果显示，Imidol(3-100μM)作用于小胶质细胞24h时药效较12h、48h和72h时强。Imidol(3-100μM)作用于N9小胶质细胞24h时，各浓度均有明显NO抑制作用，且Imidol在30μM时药效最强。此时计算得到的IC50值为34μM。Imidol(0.1-100μM)作用于原代大鼠小胶质细胞48h时，Imidol(10-100μM)有明显的NO抑制作用，且具有浓度依赖性。计算得到的IC50值为10μM。

3.7 Imidol对LPS活化的小胶质细胞内iNOS mRNA表达的影响

RT-PCR检测结果如图16A-16B，小胶质细胞经LPS刺激后，与空白组相比，iNOSmRNA的诱导表达水平明显升高。Imidol(3,10,30μM)，Minocycline 20μM，DPI1μM均能明显降低iNOS mRNA的诱导表达水平，说明Imidol可以抑制LPS活化的小胶质细胞内iNOS的基因转录。

3.8 Imidol对LPS活化的N9小胶质细胞内活性氧生成的影响

实验结果如图17，小胶质细胞经LPS处理30min后，与空白组相比较，荧光强度显著增强，说明小胶质细胞内ROS水平显著增高。Imidol(1-30μM)及NAC(10mM)处理后的小胶质细胞内荧光强度显著下降，表明Imidol具有下调活化的小胶质细胞内ROS水平的作用。

3.9 Imidol对N9小胶质细胞炎性相关因子或酶类mRNA表达的影响

3.9.1 Imidol对LPS活化的小胶质细胞内IL-1βmRNA表达的影响

RT-PCR检测结果如图18A-18B，小胶质细胞经LPS刺激后，与空白组相比，IL-1βmRNA的诱导表达水平明显升高。Imidol(3,10,30μM)，Minocycline 20μM和DPI 1μM均能明显降低IL-1βmRNA的诱导表达水平，说明Imidol可以抑制LPS活化的小胶质细胞内IL-1β的基因转录。

3.9.2 Imidol对LPS活化N9小胶质细胞内COX-2mRNA表达的影响

RT-PCR检测结果如图19A-19B，小胶质细胞经LPS刺激后，与空白组相比，COX-2mRNA的诱导表达水平明显升高。Imidol(3,10,30μM)、Minocycline 20μM和DPI 1μM均能明显降低COX-2mRNA的诱导表达水平，说明Imidol可以抑制LPS活化的小胶质细胞内COX-2的基因转录。

3.10 Imidol条件培养液对原代大鼠皮质神经元损伤的影响

实验结果如图20，与对照组CON-CM相比，LPS(1μg/ml)-CM作用于原代大鼠皮质神经元24h造成原代大鼠皮质神经元存活率显著降低；与模型组LPS(1μg/ml)-CM相比，Imidol(10μM,30μM)-CM能够显著抑制N9小胶质细胞活化导致的原代大鼠皮质神经元损伤。

3.11 Imidol条件培养液对原代大鼠海马神经元损伤的影响

实验结果如图21，与对照组CON-CM相比，LPS(1μg/ml)-CM作用于原代大鼠海马神经元24h造成原代大鼠海马神经元存活率显著降低；与模型组LPS(1μg/ml)-CM相比，Imidol(3μM,10μM,30μM)-CM均能够显著抑制N9小胶质细胞活化导致的原代

大鼠海马神经元损伤。

通过上述实施例可知，Imidol一方面能够改善各类外周炎症，主要包括非特异性炎症、自身免疫性炎症和感染性炎症。对Imidol抑制感染性炎症的深入研究发现，Imidol也能够在体外改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应，同时其抗炎机制可能与靶向NADPH氧化酶的NOX2/gp91^phox亚基进而调控ROS相关NF-κB/MAPKs信号通路。另一方面Imidol能够抑制LPS诱导的N9小胶质细胞和原代大鼠小胶质细胞NO的释放，该抑制作用可能与Imidol降低LPS激活的N9小胶质细胞内一氧化氮合酶的mRNA表达有关。同时，Imidol能够抑制LPS诱导的N9小胶质细胞内活性氧水平的升高及细胞内炎性细胞因子IL-1β炎症相关酶COX-2的mRNA表达。另外，Imidol能够对活化的N9小胶质细胞条件培养液造成的原代大鼠皮质及海马神经元损伤均具有保护作用。

产业上的可利用性

本发明提供了5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在抑制外周炎症及中枢神经系统炎症、神经保护方面的新用途，特别是涉及盐酸艾咪朵尔(Imidol)在这些方面的新用途，从而为拓展盐酸艾咪朵尔的临床应用奠定基础。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> 5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在抑制外周炎症及中枢神经系统炎症方面的用途

<130> 6660-191498I-2

<150> 201911294739.7

<151> 2019-12-16

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcagctgg ccaatgag 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccccatagga aaagactgca 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatggctta ttacagtggc aatg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtagtggtgg tcggagattc g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccagatgcta tctttgggga gac 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttgcattga tggtggctg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtgctgagt atgtcatgga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcagctctg ggatgacctt 20

Claims (10)

1.一种5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物在制备抑制外周炎症和/或中枢神经系统炎症的药物中的应用；

所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物包括盐酸艾咪朵尔，其结构如下式(Ⅰ)：

2.根据权利要求1所述的应用，所述外周炎症包括非特异性炎症、自身免疫性炎症、感染性炎症。

3.根据权利要求2所述的应用，所述感染性炎症包括急性肺损伤。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物用于抑制脂多糖诱导的巨噬细胞的激活。

5.根据权利要求1所述的应用，所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物用于抑制脂多糖诱导的小胶质细胞的激活。

6.根据权利要求1或5所述的应用，所述5-羟基吲哚-3-羧酸酯类化合物具有神经保护作用。

7.根据权利要求1所述的应用，所述盐酸艾咪朵儿的剂量为25-216mg/kg。

8.根据权利要求7所述的应用，所述盐酸艾咪朵儿的剂量为25mg/kg、36mg/kg、50mg/kg、72mg/kg、100mg/kg、144mg/kg或216mg/kg。

9.根据权利要求1、7或8所述的应用，所述盐酸艾咪朵儿在液体制剂中的浓度为3-30μM。

10.根据权利要求9所述的应用，所述盐酸艾咪朵儿在液体制剂中的浓度为3μM、10μM或30μM。

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