TWI498118B - 促進傷口癒合及血管新生的醫藥組合物與接骨木屬（蒴藋屬）（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）植物及菘藍屬（Ｉｓａｔｉｓ）植物之萃取物用於製備促進傷口癒合及血管新生之藥物的用途 - Google Patents

促進傷口癒合及血管新生的醫藥組合物與接骨木屬（蒴藋屬）（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）植物及菘藍屬（Ｉｓａｔｉｓ）植物之萃取物用於製備促進傷口癒合及血管新生之藥物的用途 Download PDF

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Description

促進傷口癒合及血管新生的醫藥組合物與接骨木屬(蒴藋屬)( Sambucus )植物及菘藍屬( Isatis )植物之萃取物用於製備促進傷口癒合及血管新生之藥物的用途
本發明係關於一種具有促進傷口癒合功效的醫藥組合物，且特別關於一種促進傷口癒合的醫藥組合物，其以冇骨消(Sambucus formosana )做為主要活性成分，且可更包括北板藍(Isatis indigotica )做為活性成分之一。
隨著全球高齡化社會發展，傷口感染與併發症的發生率提高使傷口型態日益複雜，並且經常發展成慢性傷口(chronic wound)而成為目前醫學照護與治療上的困難。慢性傷口產生原因例如，糖尿病/神經病變(Diabetic Ulcers/Neuropathic Ulcers)、壓瘡/褥瘡(Pressure/Decubitus Ulcers)、動/靜脈病變(Arterial/Venous Ulcers)…等。
以全球慢性傷口為主的糖尿病患為例，此類患者25%會產生足部潰瘍、傷口困難癒合、容易感染等問題，一旦產生上述症狀後截肢率高達10%以上。而慢性傷口的病患在癒合過程容易受到不易癒合與持續潰瘍的困擾，主要原因即是血管新生的不足。
冇骨消(Sambucus formosana )為台灣原生植物，與Sambucus chinensis 為同物異名，屬於忍冬科、茜草目、接骨木屬(蒴藋屬)，為多年生常綠或半冬枯草本植物，是台灣民間常用中草藥，內用於治療肺癰、風濕性關節炎、無名腫毒、腳氣浮腫、黃疸、咳嗽痰喘；外用可治跌打損傷及骨折等。藥用部位為根莖、全草或根。近年的研究顯 示其萃取物具有降低細胞激素(如IL-1α、IL-6、TNF-α…等)的分泌，明顯抑制蝕骨細胞成熟及生長，減緩骨質流失(碩士論文，侯淑貞，2003)。
北板藍的藥典藥用部位為十字花科植物菘藍(Isatis indigotica Fort.)的根(板藍根)，二年生草本。味苦、性寒。中醫理論認為具有清熱、解毒、凉血、利咽等功效，現代研究發現具抗菌、抗病毒、提高免疫功能、抗腫瘤作用、及增强動物的單核巨噬系統的吞噬能力(http：//baike.baidu.com/view/40502.htm)，果實則有關於抗病毒方面的研究被提出(中國中藥雜誌，2004，接骨木屬植物的化學成分和藥理活性研究進展)。
目前並沒有冇骨消與北板藍等中草藥在血管新生的應用上的相關文獻發表。先前技術揭露一種促進創傷癒合的醫藥組合物，其可含有板藍根(北板藍)與冇骨消，然板藍根(北板藍)與冇骨消並非此促進創傷癒合的醫藥組合物的主要活性成分，且於此專利申請案中明確指出板藍根(北板藍)與冇骨消屬於清熱解毒類。
而中醫所述「清熱解毒」，目前一般視為代表「抗發炎」(可參考「漢方臨床應用全集(上)」，培琳出版社，1997年5月修訂版，p.123-p.124)。又根據目前一些已發表文獻清楚可知，許多藥物或中藥材同時具有「抗發炎」與「抑制血管新生」的功效(http：//tcam.ccmp.gov.tw/infomation/95/CCMP94-RD-016.pdf；http：//ir.ym.edu.tw/ir/handle/987654321/4458； http：//ir.lib.csmu.edu.tw：8080/ir/handle/310902500/726)，然而先前技術所揭露內容，並無從推知北板藍與冇骨消與促進血管新生之關連性。
本發明提供一種促進傷口癒合的醫藥組合物，包括：一有效量之接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物為促進傷口癒合的活性成分；以及一藥學上可接受之載體或媒劑。
本發明也提供一種接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物用於製備促進傷口癒合之藥物的用途。
本發明還提供另一種促進傷口癒合的醫藥組合物，包括：一有效量之菘藍屬(Isatis )植物為促進傷口癒合的活性成分；以及一藥學上可接受之載體或媒劑。
本發明更提供一種菘藍屬(Isatis )植物用於製備促進傷口癒合之藥物的用途。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
在本發明一第一態樣中，本發明提供一種以接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物為主要活性成分之促進傷口癒合的醫藥組合物，其具有促進細胞增生與血管新生之功效，並可促進傷口癒合。
上述本發明之促進傷口癒合的醫藥組合物，可包括， 但不限於一有效量之接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物與一藥學上可接受之載體或媒劑，其中接骨木屬植物為促進傷口癒合的活性成分。又，上述接骨木屬植物具有促進細胞增生與血管新生之功效。
接骨木屬植物的例子可包括，冇骨消(Sambucus formosana Nakai)、野鴉椿(Sambucus japonica Thunb.)、西洋接骨木(Sambucus nigra L.)、金葉接骨木(Sambucus williamsii Hance)與毛接骨木(Sambucus williamsii Hance var.miquelii (Nakai)Y.C.Tang)等，但不限於此。
上述接骨木屬植物可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述接骨木屬植物的利用部位可包括接骨木屬植物全株、接骨木屬植物的根、接骨木屬植物的莖、接骨木屬植物的葉、接骨木屬植物的花及/或接骨木屬植物的果實，或者，上述接骨木屬植物可經過一萃取程序成為一接骨木屬植物的萃取物。於此實施例中，上述接骨木屬植物的利用部位可包括接骨木屬植物全株、接骨木屬植物的根、接骨木屬植物的莖、接骨木屬植物的葉、接骨木屬植物的花及/或接骨木屬植物的果實。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視所使用之植物特性與當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
上述接骨木屬植物可為冇骨消(Sambucus formosana Nakai)，而由一般傳統植物分類學或基因分類所確認之冇骨消，皆可為本發明中所使用之冇骨消。在一實施例中，上述冇骨消，可為其核醣體基因DNA內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)的序列與序列辨識號：1具有60%、70%、80%或90%以上同源性的冇骨消。在一特定實施例中，上述冇骨消可為一冇骨消，其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列為序列辨識號：1，或與序列辨識號：1具有序列相似度80%以上之序列。在另一實施例中，上述冇骨消，可為其葉綠體基因間非編碼區(intergenic non-coding region)trnH-psbA 的序列與序列辨識號：5具有60%、70%、80%或90%以上同源性的冇骨消。在一特定實施例中，上述冇骨消可為一冇骨消，其葉綠體基因間非編碼區trnH-psbA 的序列為序列辨識號：5，或與序列辨識號：5具有序列相似度80%以上之序列。
在一實施例中，上述冇骨消可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述冇骨消的利用部位可包括冇骨消全株、冇骨消的根、冇骨消的莖、冇骨消的葉、冇骨消的花及/或冇骨消的果實，而在一特定實施例中，上述冇骨消的利用部位可為冇骨消全株。
在另一實施例中，上述冇骨消可經過一萃取程序成為一冇骨消的萃取物。於此實施例中，上述冇骨消的利用部位可包括冇骨消全株、冇骨消的根、冇骨消的莖、冇骨消的葉、冇骨消的花及/或冇骨消的果實，而在一特定實施例中，上述冇骨消的利用部位可為冇骨消全株。在一實施例 中，上述萃取程序並無特別限制，可視當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
在另一實施例中，上述本發明促進傷口癒合的醫藥組合物可更包括一菘藍屬(Isatis )植物。於此實施例中，在上述本發明促進傷口癒合的醫藥組合物包括一接骨木屬植物與一菘藍屬植物的情況下，接骨木屬植物與菘藍屬植物的重量比可為約1-7：3-5，較佳為約1-5：3-5，但不限於此。又，菘藍屬植物的例子可包括，但不限於，菘藍(Isatis indigotica Fort.)、長圓果菘藍(Isatis oblongata DC..)、寬翅菘藍(Isatis violascens )、毛果菘藍(Isatis tinctoria L.var.praecox (Kit.)Koch)、三肋菘藍(Isatis costata )、小果菘藍(Isatis minima Bunge)與歐洲菘藍(Isatis tinctoria L.)等。
上述菘藍屬植物可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍屬植物的利用部位可包括菘藍屬植物全株、菘藍屬植物的根、菘藍屬植物的莖、菘藍屬植物的葉、菘藍屬植物的花及/或菘藍屬植物的果實。
或者，上述菘藍屬植物可經過一萃取程序成為一菘藍屬植物的萃取物。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視所使用之植物特性與當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程 序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
上述菘藍屬植物可為菘藍(Isatis indigotica Fort.)，而由一般傳統植物分類學或基因分類所確認之菘藍，皆可為本發明中所使用之菘藍。在一實施例中，上述菘藍，可為其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列與序列辨識號：2具有60%、70%、80%或90%以上同源性的菘藍。在一特定實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列為序列辨識號：2，或與序列辨識號：2具有序列相似度80%以上之序列。在另一實施例中，上述菘藍，可為其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列與序列辨識號：6具有60%、70%、80%或90%以上同源性的菘藍。在一特定實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列為序列辨識號：6，或與序列辨識號：6具有序列相似度80%以上之序列。
在一實施例中，上述菘藍可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部位可為菘藍的根(北板藍)。
在另一實施例中，上述菘藍可經過一萃取程序成為一菘藍的萃取物。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部 位可為菘藍的根(北板藍)。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
於一實施例中，上述本發明促進傷口癒合的醫藥組合物可包括一接骨木屬植物與一菘藍屬植物，其中接骨木屬植物為冇骨消，而菘藍屬植物為菘藍，又冇骨消與菘藍的重量比可為約1-7：3-5，較佳為約1-5：3-5。
本發明促進傷口癒合的醫藥組合物，由於具有促進細胞增生與血管新生的功效，而可促進傷口癒合，而藉由使用本發明促進傷口癒合的醫藥組合物而可促進其增生之細胞，可包括人類臍帶血管內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)，但不限於此。又，上述本發明促進傷口癒合的醫藥組合物，由於具有促進細胞增生與血管新生的功效，因而可應用於下列症狀或疾病之治療，症狀或疾病可包括皮膚病症、冠心病、動脈粥樣硬化病、腦動脈阻塞、缺血性心臟病等，但不限於此。又，上述皮膚病症可包括，但不限於一般外傷、褥瘡或糖尿病患者之傷口。此外，本發明促進傷口癒合的醫藥組合物還可應用於醫療美容。
在本發明一第二態樣中，本發明也提供一種接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物用於製備促進傷口癒合之藥物 的用途。
上述接骨木屬植物可為任何接骨木屬植物，並無特別限制，例如，冇骨消、野鴉椿、西洋接骨木、金葉接骨木或毛接骨木等。
上述接骨木屬植物可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述接骨木屬植物的利用部位可包括接骨木屬植物全株、接骨木屬植物的根、接骨木屬植物的莖、接骨木屬植物的葉、接骨木屬植物的花及/或接骨木屬植物的果實。
或者，上述接骨木屬植物可經過一萃取程序成為一接骨木屬植物的萃取物。於此實施例中，上述接骨木屬植物的利用部位可包括接骨木屬植物全株、接骨木屬植物的根、接骨木屬植物的莖、接骨木屬植物的葉、接骨木屬植物的花及/或接骨木屬植物的果實。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視所使用之植物特性與當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
上述接骨木屬植物可為冇骨消(Sambucus formosana Nakai)。於本發明中，冇骨消定義為由一般傳統植物分類學或基因分類所確認之冇骨消。在一實施例中，上述冇骨消，可為其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列與序列辨識號：1具有60%、70%、80%或90%以上同源性的冇骨消。 在一特定實施例中，上述冇骨消可為一冇骨消，其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列為序列辨識號：1，或與序列辨識號：1具有序列相似度80%以上之序列。在另一實施例中，上述冇骨消，可為其葉綠體基因間非編碼區trnH-psbA 的序列與序列辨識號：5具有60%、70%、80%或90%以上同源性的冇骨消。在一特定實施例中，上述冇骨消可為一冇骨消，其葉綠體基因間非編碼區trnH-psbA 的序列為序列辨識號：5，或與序列辨識號：5具有序列相似度80%以上之序列。
在一實施例中，上述冇骨消可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述冇骨消的利用部位可包括冇骨消全株、冇骨消的根、冇骨消的莖、冇骨消的葉、冇骨消的花及/或冇骨消的果實，而在一特定實施例中，上述冇骨消的利用部位可為冇骨消全株。
在另一實施例中，上述冇骨消可經過一萃取程序成為一冇骨消的萃取物。於此實施例中，上述冇骨消的利用部位可包括冇骨消全株、冇骨消的根、冇骨消的莖、冇骨消的葉、冇骨消的花及/或冇骨消的果實，而在一特定實施例中，上述冇骨消的利用部位可為冇骨消全株。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
在另一實施例中，於本發明接骨木屬植物用於製備促進傷口癒合之藥物的用途中，接骨木屬植物更可與菘藍屬(Isatis )植物一起使用。於此實施例中，在一接骨木屬植物與一菘藍屬植物一起使用的情況下，接骨木屬植物與菘藍屬植物的重量比可為約1-7：3-5，較佳為約1-5：3-5，但不限於此。
又，菘藍屬植物可為任何菘藍屬植物，並無特別限制，例如，菘藍、長圓果菘藍、寬翅菘藍、毛果菘藍、三肋菘藍、小果菘藍或歐洲菘藍等。
上述菘藍屬植物可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍屬植物的利用部位可包括菘藍屬植物全株、菘藍屬植物的根、菘藍屬植物的莖、菘藍屬植物的葉、菘藍屬植物的花及/或菘藍屬植物的果實。
或者，上述菘藍屬植物可經過一萃取程序成為一菘藍屬植物的萃取物。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視所使用之植物特性與當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
上述菘藍屬植物可為菘藍(Isatis indigotica Fort.)。於本發明中，菘藍定義為由一般傳統植物分類學或基因分類所確認之菘藍。在一實施例中，上述菘藍，可為其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列與序列辨識號：2。在一特定 實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列為序列辨識號：2，或與序列辨識號：2具有序列相似度80%以上之序列。在另一實施例中，上述菘藍，可為其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列與序列辨識號：6具有60%、70%、80%或90%以上同源性的菘藍。在一特定實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列為序列辨識號：6，或與序列辨識號：6具有序列相似度80%以上之序列。
在一實施例中，上述菘藍可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部位可為菘藍的根(北板藍)。
在另一實施例中，上述菘藍可經過一萃取程序成為一菘藍的萃取物。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部位可為菘藍的根(北板藍)。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
於一實施例中，於本發明接骨木屬植物用於製備促進 傷口癒合之藥物的用途中，一接骨木屬植物與一菘藍屬植物一起被使用，其中接骨木屬植物為冇骨消，而菘藍屬植物為菘藍，又冇骨消與菘藍的重量比可為約1-7：3-5，較佳為約1-5：3-5。
在本發明一第三態樣中，本發明提供一種以菘藍屬植物為主要活性成分之促進傷口癒合的醫藥組合物，其具有促進細胞增生與血管新生之功效，並可促進傷口癒合。
上述本發明之促進傷口癒合的醫藥組合物，可包括，但不限於一有效量之菘藍屬植物與一藥學上可接受之載體或媒劑，其中菘藍屬植物為促進傷口癒合的活性成分。又，上述菘藍屬植物具有促進細胞增生與血管新生之功效。
菘藍屬植物的例子可包括，菘藍、長圓果菘藍、寬翅菘藍、毛果菘藍、三肋菘藍、小果菘藍與歐洲菘藍等，但不限於此。
上述菘藍屬植物可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍屬植物的利用部位可包括菘藍屬植物全株、菘藍屬植物的根、菘藍屬植物的莖、菘藍屬植物的葉、菘藍屬植物的花及/或菘藍屬植物的果實。
或者，上述菘藍屬植物可經過一萃取程序成為一菘藍屬植物的萃取物。於此實施例中，上述菘藍屬植物的利用部位可包括菘藍屬植物全株、菘藍屬植物的根、菘藍屬植物的莖、菘藍屬植物的葉、菘藍屬植物的花及/或菘藍屬植物的果實。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視所使用之植物特性與當時環境進行適當調整。上述萃 取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
上述菘藍屬植物可為菘藍，而由一般傳統植物分類學或基因分類所確認之菘藍，皆可為本發明中所使用之菘藍。在一實施例中，上述菘藍，可為其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列與序列辨識號：2具有60%、70%、80%或90%以上同源性的菘藍。在一特定實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列為序列辨識號：2，或與序列辨識號：2具有序列相似度80%以上之序列。在另一實施例中，上述菘藍，可為其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列與序列辨識號：6具有60%、70%、80%或90%以上同源性的菘藍。在一特定實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列為序列辨識號：6，或與序列辨識號：6具有序列相似度80%以上之序列。
在一實施例中，上述菘藍可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部位可為菘藍的根(北板藍)。
在另一實施例中，上述菘藍可經過一萃取程序成為一菘藍的萃取物。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包 括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部位可為菘藍的根(北板藍)。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
本發明促進傷口癒合的醫藥組合物，由於具有促進細胞增生與血管新生的功效，而可促進傷口癒合，而藉由使用本發明促進傷口癒合的醫藥組合物而可促進其增生之細胞，可包括人類臍帶血管內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)，但不限於此。又，上述本發明促進傷口癒合的醫藥組合物，由於具有促進細胞增生與血管新生的功效，因而可應用於下列症狀或疾病之治療，症狀或疾病可包括皮膚病症、冠心病、動脈粥樣硬化病、腦動脈阻塞、缺血性心臟病等，但不限於此。又，上述皮膚病症可包括，但不限於一般外傷、褥瘡或糖尿病患者之傷口。此外，本發明促進傷口癒合的醫藥組合物還可應用於醫療美容。
在本發明一第四態樣中，本發明也提供一種菘藍屬植物用於製備促進傷口癒合之藥物的用途。
上述菘藍屬植物菘藍植物可為任何菘藍植物，並無特別限制，例如菘藍、長圓果菘藍、寬翅菘藍、毛果菘藍、 三肋菘藍、小果菘藍或歐洲菘藍等。
上述菘藍屬植物可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍屬植物的利用部位可包括菘藍屬植物全株、菘藍屬植物的根、菘藍屬植物的莖、菘藍屬植物的葉、菘藍屬植物的花及/或菘藍屬植物的果實。
或者，上述菘藍屬植物可經過一萃取程序成為一菘藍屬植物的萃取物。於此實施例中，上述菘藍屬植物的利用部位可包括菘藍屬植物全株、菘藍屬植物的根、菘藍屬植物的莖、菘藍屬植物的葉、菘藍屬植物的花及/或菘藍屬植物的果實。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視所使用之植物特性與當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
上述菘藍屬植物可為菘藍。於本發明中，菘藍定義為由一般傳統植物分類學或基因分類所確認之菘藍。在一實施例中，上述菘藍，可為其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列與序列辨識號：2具有60%、70%、80%或90%以上同源性的菘藍。在一特定實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其核醣體基因DNA內轉錄間隔區的序列為序列辨識號：2，或與序列辨識號：2具有序列相似度80%以上之序列。在另一實施例中，上述菘藍，可為其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列與序列辨識號：6具有60%、70%、80% 或90%以上同源性的菘藍。在一特定實施例中，上述菘藍可為一菘藍，其葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 的序列為序列辨識號：6，或與序列辨識號：6具有序列相似度80%以上之序列。
在一實施例中，上述菘藍可僅經清洗、切片或磨碎等物理性處理。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部位可為菘藍的根(北板藍)。
在另一實施例中，上述菘藍可經過一萃取程序成為一菘藍的萃取物。於此實施例中，上述菘藍的利用部位可包括菘藍全株、菘藍的根(北板藍)、菘藍的莖及/或菘藍的葉(大青葉)，而在一特定實施例中，上述菘藍的利用部位可為菘藍的根(北板藍)。在一實施例中，上述萃取程序並無特別限制，可視當時環境進行適當調整。上述萃取程序可為以單一溶劑所進行之單一萃取步驟，或可包括許多不同之萃取步驟。在一實施例中，上述萃取程序所使用之溶劑可包括水、酒精、甲醇及/或其它極性及非極性溶劑等，但不限於此。
又，於上述本發明促進傷口癒合的醫藥組合物中，上述藥學上可接受之載體可包括，但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥 學組合物配置成劑型(dosage form)。例如，口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。
另外，在皮膚外用之情況下，藥學上可接受之媒劑可做為活性成分之稀釋劑、分散劑或載體。藥學上可接受之媒劑可包括常在皮膚護理產品中使用的材料，如水、液體或固體軟化劑、矽酮油、乳化劑、溶劑、濕潤劑、增稠劑、粉末、噴射劑與類似物。媒劑可以在沒有其它佐劑的存在下構成組合物的其餘部份。
而，上述本發明促進傷口癒合的醫藥組合物之給藥可以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)、藉由植入貯存器(implanted reservoir)，或皮膚外用的方式。
非口服可包括(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intraleaional)注射以及灌注技術。
皮膚外用方式則可包括直接將本發明醫藥組合物直接塗覆於皮膚上欲處理或治療之部位。
此外，前述之所有組合物於一實施例中皆可製作成一皮膚塗劑型式包括，但不限於，乳劑、膏劑、凝膠、噴劑、化妝水、洗髮水或幕斯等。一般來說，皮膚噴劑可由噴霧狀共聚物所組成，例如，聚乙烯吡咯烷酮、醋酸乙烯及其 類似物，且其可具有化妝水之功能。皮膚凝膠的製備方法與噴劑類似，但其為凝膠狀且無乙醇的存在，可附著於皮膚上。皮膚幕斯為利用壓力釋放泡沫。皮膚乳劑為一疏水性或親水性乳劑、膏劑、凝膠、潤膚劑、噴劑、塗劑、皮膚調理水、洗髮水或幕斯。另外，更可添加適合的成份至皮膚乳劑，此額外添加的成份包括凡士林、蠟、羊毛脂、矽、微脂體、蔬菜、礦物油、增塑劑、香料、防腐劑、促滲透劑、pH值調整劑或其他適合用於局部皮膚的成份。此額外的成份可濕潤皮膚，穩定活性化合物，增加前述組合物-皮膚的接觸，局部區域的濃度，控制組合物的釋放。
又，前述組合物也可更包括其它特殊的皮膚受益活化物，如防曬劑及皮膚淡化劑。媒劑也可以進一步包括如抗氧化劑、香料、遮光劑、防腐劑、著色劑及緩衝液之類的佐劑。
【實施例】 實施例1：植物萃取物製備 1.藥材乙醇萃取
將200 g之冇骨消全株的粉末、200 g之冇骨消之根的粉末、200 g之冇骨消之莖的粉末與200 g之菘藍之根(北板藍)的粉末分別加入5倍體積95%乙醇，並以120 rpm震盪萃取。於7天後，將所獲得之萃取液抽氣過濾。接著，將濾液減壓濃縮至體約30 mL，並分裝至冷凍乾燥瓶進行冷凍乾燥，且將所得萃取物秤重紀錄。冷凍乾燥的萃取物 貯存在4℃或-20℃。
實施例2：植物基原鑑定 1. DNA萃取
分別將冇骨消與菘藍進行DNA萃取以獲得其個別之DNA。DNA之萃取步驟如下所示：
(1)將適量植物樣本置於研缽中，加入液態氮研磨成粉末。
(2)將適量粉末樣本倒入含5-10 ml DNA萃取緩衝液的離心管中(樣本量及緩衝液體基隨需求做調整)，混合均勻後，置於65℃水浴槽30-60分鐘，期間取出搖晃均勻2-3次。
(3)取出後加入與萃取緩衝液等體積之三氯甲烷(chloroform)/異戊醇(isoamyl alcohol)(24：1(v/v))溶液，混合均勻後，以8,000 rpm在4℃下離心5分鐘。
(4)取出上清液分置於新的微量離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇(isopropanol)，之後將其置於-20℃冰箱中沉澱過夜。
(5)由-20℃冰箱中取出微量離心管，以12,000 rpm在4℃下離心20分鐘。
(6)移除上清液，加入1 mL之-20℃已預冷的75%酒精，以12,000 rpm在4℃下離心5分鐘。之後，移除去上清液，並將微量離心管置於室溫或37℃烘箱中，待酒精烘乾。
(7)每管加入50-100 μL TE緩衝液。或延續步驟(3)。
(8)取出上清液至新的高速離心管中，加入2-2.5倍體積的沉澱緩衝液，並混合均勻。接著於4℃靜置1-2小時，再以12,000 rpm在4℃下離心20分鐘。
(9)倒掉上清液，加入2.5 ml含RNase之1.2 M NaCl溶液，於37℃中搖晃溶解後置30-60分鐘。
(10)取出後再加入2.5 ml之三氯甲烷/異戊醇(24：1(v/v))，混合均勻後，以8,000 rpm在4℃下離心10分鐘。
(11)取出上清液分置於新的微量離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇於-20℃冰箱中沉澱過夜。
(12)由-20℃冰箱中取出微量離心管，以12,000 rpm在4℃下離心20分鐘。
(13)倒出上清液，加入1 mL之-20℃已預冷之75%酒精，以12,000 rpm在4℃下離心5分鐘，倒去上清液，並將微量離心管置於室溫或37℃烘箱中，待酒精烘乾。
(14)每管加入50-100 μL TE緩衝液。
2. DNA聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)
將由上述萃取步驟所獲得之冇骨消DNA樣本與菘藍DNA樣本，分別進行聚合酵素連鎖反應(PCR)以擴增其基因組中(internal transcribed spacer,ITS)片段及葉綠體基因間非編碼區(intergenic non-coding region)trnH-psbA 或trnF-trnL 。
聚合酵素連鎖反應之反應物成分如表1所示。
適用擴增冇骨消之部分核醣體基因DNA內轉錄間隔區與菘藍之部分核醣體基因DNA內轉錄間隔區的引子對序列，如表2所示。
適用擴增冇骨消之部分葉綠體基因間非編碼區與菘藍之部分葉綠體基因間非編碼區的引子對序列，如表3所示。
將上述之反應液置於PCR反應管中，加入無菌水使最終體積為50 μL，充分混合後，置於PCR反應器中反應。PCR反應程式設為：步驟1：94℃，10分鐘；步驟2；94℃，30秒；步驟3：52℃，30秒；步驟4：72℃，1分鐘；步驟5：步驟2~4進行35次循環反應；步驟6：72℃，5分鐘；步驟7：25℃。
結束後PCR產物進行電泳分析。將PCR產物取10 μl以1.5%瓊脂膠(agarose gel)、電壓100 V進行電泳，使用DNA ladder作為指標。電泳完成後以溴化乙錠(ethidium bromide)對膠體進行染色，並在高解析度冷卻影像處理系統及ULTRA-LUM光源下觀察並照相。
3.定序
分別將上述所擴增之冇骨消之部分核醣體基因DNA 內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)片段以及菘藍之部分核醣體基因DNA內轉錄間隔區片段進行定序。確認冇骨消之部分核醣體基因DNA內轉錄間隔區序列為序列辨識號：1，菘藍之部分核醣體基因DNA內轉錄間隔區為序列辨識號：2。
又，分別將上述所擴增之冇骨消之葉綠體基因間非編碼區(intergenic non-coding region)trnH-psbA 片段以及菘藍之葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 片段進行定序。確認冇骨消之葉綠體基因間非編碼區trnH-psbA 序列為序列辨識號：5，菘藍之葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 為序列辨識號：6。
實施例3：植物萃取物促進人類臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)細胞增生-MTT分析
促進臍靜脈內皮細胞之細胞生長萃取物的篩選，利用人類血管內皮細胞，以生長因子VEGF或三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)等中草藥萃取物作為對照組，作為促進血管內皮細胞生長活性之藥物篩選與活性評估平台。實施方法為將約5x103 細胞/孔的HUVEC接種於明膠(gelatin)塗覆的96孔盤中，以M199完全培養基(complete medium)於含5% CO2 的37℃培養箱中隔夜培養；隔天更換為含待測之定量濃度的中草藥萃取物與新鮮不含ECGS之5%血清培養基中，再將96孔盤置於培養箱培養48小時後，以細 胞存活檢測法(MTT assay)分析並量化內皮細胞活性，而獲得最佳之促進HUVEC增生的植物萃取物種、部位及萃取方法的相關資訊。
將冇骨消全株萃取物(中草藥1)與菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)從初篩時的有效濃度100 μg/mL往下稀釋十倍至0.1 μg/mL來測試藥效的範圍與劑量反應。單一萃取物的活性分析結果顯示於第1A圖與表4，植物組合物活性比較分析於第1B圖與表5，植物部位活性分析則於第1C圖與表6中。此兩種中草藥萃取物之濃度達100 μg/mL具有顯著的促進血管內皮細胞生長的作用，可達到與VEGF相當的促進作用。
將冇骨消全株萃取物(中草藥1)與菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)以1：1之比例進行混合以形成一混合物(內含50 μg/mL中草藥1與50 μg/mL中草藥2)，並測定其對血管內皮細胞之增生的影響，結果參見第1B圖與表5。如第1B圖與表5所示，正對照組20 ng/mL VEGF162 達275±35%細胞生長率時，於處理濃度分別為30 μg/mL與100 μg/mL的情況下，冇骨消全株萃取物(中草藥1)處理組則達219±2%與359±21%細胞生長率，菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)處理組則達118±11%與152±8%細胞生長率，而1：1比例之混合物處理組則能達192±1%與351±2%細胞生長率。由上述結果可知，顯示減半使用中草藥1與中草藥2時，能達到與中草藥1單獨使用時的促進內皮細胞生長效果。
表5、單一中草藥萃取物與混合中草藥萃取物對血管內皮細胞增生的影響
測定特定部位植物萃取物對血管內皮細胞之增生的影響，結果參見第1C圖與表5。結果顯示，源自中草藥1之根或莖的萃取物皆有促進HUVEC生長的效果。正對照組20 ng/mL VEGF162 達245%(標準差=14%)細胞生長率時，30 μg/mL冇骨消的根萃取物處理組達179%(標準差=21%)細胞生長率，10 μg/mL與30 μg/mL冇骨消的莖萃取物處理組則分別達178±23%與244±18%細胞生長率。由上述結果可知，顯示中草藥1的根與莖部位萃取物皆有促進細胞增生的效果。
實施例4：植物萃取物促進HUVEC細胞增生-細胞計數分析(Cell counting assay) 人類血管內皮細胞生長數量的計數(Cell counting)
依照實施例3所述實驗方法處理細胞至培養48小時後，將培養液洗去，以70%酒精固定細胞30分鐘，去除固定液並加入含0.5 μg/mL Hoechst 33258染色，避光靜置15分鐘後將染劑洗去，以EVOS螢光顯微鏡系統擷取影像並在放大40倍之視野下計數螢光染色的細胞核數目，以估計經藥物作用後的細胞數目。
藉由螢光顯微鏡系統來擷取以不同之單一中草藥萃取物在不同濃度下處理之細胞的影像，而所擷取之顯示於第2A圖。第2B圖與表7為第2A圖細胞數目量化的數據。參見第2B圖與表7，負對照DMSO處理組之細胞數為160±7，正對照組20 ng/mL VEGF162 處理組之細胞數為390±32。在此分析方式下，相較於負對照組DMSO處理組，正對照組20 ng/mL VEGF162 處理組顯示顯著差異。而相較於負對照組DMSO處理組，冇骨消全株萃取物(中草藥1)達10 μg/mL以上能呈現顯著差異，又冇骨消全株萃取物(中 草藥1)3、10、30與100 μg/mL處理組之細胞數分別為157±5、211±15、380±28與422±5，表現出劑量反應。另外，菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)3、10、30與100 μg/mL處理組之細胞數分別為150±16、160±16、197±11與380±5，又相較於負對照組DMSO處理組，菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)達30 μg/mL以上能呈現顯著差異。
將冇骨消全株萃取物(中草藥1)與菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)以1：1之比例進行混合以形成一混合物(內含50 μg/mL中草藥1與50 μg/mL中草藥2)，並評估其對血管內皮細胞之增生的影響。
藉由螢光顯微鏡系統來擷取以冇骨消全株萃取物(中 草藥1)與菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)之1：1混合物處理之細胞與以不同之單一中草藥萃取物在不同濃度下處理之細胞的影像，而所擷取之顯示於第2C圖。第2D圖與表8則為2C圖的細胞計數結果。參見第2D圖與表8，負對照組DMSO處理組之細胞數為163±23，正對照組20 ng/mL VEGF162 處理組之細胞數為604±35。30 μg/mL與100 μg/mL冇骨消全株萃取物(中草藥1)處理組之細胞數分別為503±49與673±28，而30 μg/mL與100 μg/mL菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)處理組之細胞數則分別為為172±26與390±50。此外，冇骨消全株萃取物(中草藥1)與菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)之1：1混合物處理組之則能達456±37與608±29細胞生長率，而上述細胞計數結果可驗證第1B圖之結果。
實施例5：植物萃取物促進HUVEC的管柱形成-metrigel based tube formation assay(in vitro 血管新生) 血管內皮細胞脈管形成分析法(Tube formation assay)
將Metrigel(或GFR-Metrigel(無生長因子))置於4℃冰箱解凍，在冰上將其與M199培養基作1：1混合稀釋後以100 μL/cm2 加入48孔盤並放於37℃培養箱待凝結成膠體；將血管內皮細胞(HUVEC)懸浮於M199培養基並調整成2x105 細胞/mL，混合已定量濃度的中草藥萃取物後，分別取0.3 mL細胞液加入Metrigel-coated 48孔盤中，置於37℃培養箱培養3小時後，以EVOS顯微鏡系統抓取影並以ImageJ軟體計算固定視野下脈管的總長度，而獲得脈管形成的資訊。
在GFR-Metrigel(無生長因子)上測試脈管的形成，結果如第3A圖所示，第3B圖與表9為將第3A圖所示之脈管形成進行量化之結果。根據第3B圖與表9可知，正負對照組間的差距得以拉開，以負對照組DMSO為100±11%下，正對照組20 ng/mL VEGF162 則達294±5%，30 μg/mL與100 μg/mL冇骨消全株萃取物(中草藥1)脈管生成率達163±2%與271±29%，相同作用濃度下菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)脈管生成率則達138±13%與241±9%，兩項中草藥萃取物皆對脈管形成有促進效果，且呈現劑量反應。
表9、單一中草藥萃取物與混合中草藥萃取物對血管內
實施例6：植物萃取物促進血管內皮細胞的遷移(Cell migration)
以血管內皮細胞的細胞遷移分析法(Cell migration assay)分析中草藥萃取物對血管內皮細胞的遷移的效果。
將2x104 細胞/孔的HUVEC種於The OrisTM Cell Migration Assay Collagen I plate，並培養隔夜至細胞貼於培養盤底部。將細胞改以含有2%血清之M199培養液培養6小時後，以OrisTM Stopper Tool移除OrisTM Stoppers並分別加入定量濃度的中草藥萃取物與對照物。經過18小時作用後，以Calcein AM螢光染劑染色，以OrisTM Detection Mask標示細胞遷移區域並以EVOS顯微鏡系統擷取影像。最後將細胞以10%甲醛(formaldehyde)固定15分鐘，於去除固定液後加入0.5 μg/mL Hoechst33258染細胞核，再利用Image J軟體計算固定視野下之細胞數目。
以The OrisTM Cell Migration Assay試驗細胞遷移的結果，影像如第4A圖所示，而第4B圖與表10為將第4A圖 所示之細胞遷移數目之量化結果。遷移的細胞數在負對照組DMSO為71±10下，正對照組20 ng/mL VEGF162 則達251±6，30 μg/mL、100 μg/mL與300 μg/mL冇骨消全株萃取物(中草藥1)處理組之細胞遷移數分別為60±13、159±9與307±3，而30 μg/mL、100 μg/mL與300 μg/mL菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)處理組之細胞遷移數則為22±0、148±28與234±72。此外，30 μg/mL、100 μg/mL與300 μg/mL冇骨消全株萃取物(中草藥1)與菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)之1：1混合物處理組之細胞遷移數分別達93±0、242±37與296±29。結果顯示，兩項中草藥萃取物與萃取物之1：1混合物對細胞遷移皆有促進效果，且呈現劑量反應。
實施例7：植物萃取物促進血管內皮細胞的侵襲作用(Cell invasion)
以血管內皮細胞的細胞侵襲分析法(Cell invasion assay)分析中草藥萃取物對血管內皮細胞侵襲作用的影響。
將含5×104 細胞的500 μl培養液分別混和定量濃度的中草藥萃取物與對照物並種於BioCoatTM MatrigelTM Growth factor reduced(GFR)invasion chamber。作用18小時後，停留在內嵌透膜(inserts)上層的細胞以棉花棒擦除，將內嵌透膜以PBS潤洗並以calcein AM螢光染劑染侵襲至下層的細胞，利用EVOS顯微鏡系統擷取螢光影像後，以10%甲醛固定15分鐘，去除固定液後加入0.5 μg/mL Hoechst 33258將細胞核染色，再利用Image J軟體計算固定視野下之細胞數目。
利用BioCoatTM MatrigelTM Growth factor reduced(GFR)invasion chamber分析促進血管細胞侵襲作用的影像結果如第5A圖所示，而第5B圖與表11為將第5A圖之細胞侵襲數目以百分率量化。以負對照組DMSO的細胞侵襲百分率為100±17%，正對照組20 ng/mL VEGF162則有310±36%。30 μg/mL與100 μg/mL冇骨消全株萃取物(中草藥1)處理組之細胞侵襲率分別達149±23%與313±4%。30 μg/mL與100 μg/mL菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)處理組之細胞侵襲率則分別達118±2%與176±5%。此外，30 μg/mL與100 μg/mL冇骨消全株萃取物(中草藥1)與菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)之1：1混合物處理 組之細胞侵襲率則分別達186±6%與313±15%。結果顯示，兩項中草藥萃取物與萃取物之1：1混合物對細胞侵襲作用也有促進效果，且呈現劑量反應。
實施例8：植物萃取物促進血管新生動物實驗 8.1血管新生活體動物實驗方法：
Matrigel由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(sarcoma)純化出來，含有豐富的ECM(Extracellular matrix)蛋白，更含有生長所需的因子，在室溫及37℃的狀態下，能聚合成具有活性膠狀物質，可模擬內皮細胞的生長環境。以前述之植物萃取物，對於活體動物體內之血管新生(angiogenesis)的活性試驗。將人類臍帶內皮細胞(HUVECs)1.5x106 細胞與250 uL的Matrigel混合，分別在與不同的植物萃取物均勻混合後植入SCID免疫缺陷小鼠的皮下，經14天後犧牲小鼠，將皮下之Matrigel plugs取出，進行 H&E細胞型態色與新生血管的免疫組織染色分析。取下小鼠皮下之Matrigel plugs，透過4%福馬林固定24小時後，進行石蠟包埋並製作切片，接著進行細胞型態染色(Hemotoxylin & Eosin stain,H&E)與血管表皮細胞表現分子CD31之免疫組織染色。細胞增生方面，則以H&E染色為觀察結果，每個染色組織切片以顯微鏡200倍率觀察，隨機挑選2個觀察區域並進行細胞計數。血管新生方面則以CD31免疫組織染色為主要觀察結果，藉以觀察植物萃取物是否能夠促進Matrigel plugs的HUVEC細胞增生與血管新生作用。
8.2血管新生活體動物實驗結果：
由小鼠皮下取下之Matrigel，透過H&E染色後，以顯微鏡200倍率觀察，結果如第6A圖所示。由第6A圖可看出加入冇骨消全株萃取物(中草藥1)之matrigel其HUVEC細胞有比控制組增多的趨勢。各組的染色樣品在顯微鏡200倍率視野下隨機挑選2個區域(區域=0.03 mm2 )所進行細胞計數之結果如第6B圖所示。第6B圖顯示控制組HUVEC細胞數為67.63±8.14細胞/區域，加入冇骨消全株萃取物(中草藥1)的HUVEC細胞數為99.00±18.63細胞/區域，加入菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)的HUVEC細胞數為73.25±10.51細胞/區域。各組細胞密度與控制組相比較後，顯示冇骨消全株萃取物(中草藥1)具有促進HUVEC細胞增生的效果。透過血管內皮細胞標記CD31 免疫組織染色可比較出，加入菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)之matrigel其表現CD31之血管內皮細胞接比控制組明顯，如第6C圖所示，顯示北板藍皆具有促進血管新生的效果。
實施例9：植物萃取物促進糖尿病慢性傷口癒合動物實驗 9.1糖尿病慢性傷口癒合動物實驗方法：
糖尿病小鼠為國家實驗動物中心提供的BKS.Cg-Dock7 m +/+Lepr db /JNarl 基因轉殖第二型糖尿病肥胖小鼠(以下簡稱db/db 小鼠)，以前述之植物萃取物進行糖尿病慢性傷口癒合實驗。
將麻醉後的db/db 小鼠背部皮膚切除(包含表皮、真皮、皮下組織，直至肌肉層)，切除傷口大小為直徑1公分的圓形面積。之後將防水透氣薄膜(3M tegarderm)覆蓋於傷口處，將0.1 mg冇骨消全株萃取物(中草藥1)與0.1 mg菘藍之根(北板藍)萃取物(中草藥2)均勻混合，注射於薄膜與傷口之間，投藥方式為每天投藥一次，一周投藥五天至傷口完全癒合為止。實驗期間定期拍照記錄，以ImageJ分析傷口面積，統計方法以student t test分析。
9.2糖尿病慢性傷口癒合動物實驗結果：
上述實驗結果如第7A圖與7B圖所示。比較第0天(皮膚切除手術當天)、第12天、第21天、第30天時傷口照片(第7A圖)，可明顯發現，投藥組在第12天相較於控 制組傷口癒合較快。又，在第21天投藥組傷口已完全癒合，但控制組仍尚未完全癒合，控制組要到第三十天才能完全癒合。以第0天傷口面積為100%，在第12天投藥組傷口面積為53.84±2.04%，控制組傷口面積為79.66±5.03%；p值<0.05：＊(第7B圖)。由此動物實驗結果顯示，冇骨消與北板藍混合物能夠明顯促進糖尿病慢性傷口癒合，使第二型糖尿病肥胖db/db 小鼠的傷口癒合加快，縮小傷口面積，完全癒合的時間提前。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1A圖顯示，經不同之單一植物萃取物處理之人類血管內皮細胞增生的MTT分析結果。p值<0.001：＊ ＊ ＊；p值<0.01：＊ ＊；p值<0.05：＊。
第1B圖顯示，經不同之單一植物萃取物處理與經混合之植物萃取物處理之人類血管內皮細胞增生的MTT分析結果。p值<0.001：＊ ＊ ＊；p值<0.01：＊ ＊；p值<0.05：＊。
第1C圖顯示，經不同部位植物萃取物處理之人類血管內皮細胞的MTT分析結果。p值<0.01：＊ ＊；p值<0.05：＊。
第2A圖顯示，經不同之單一植物萃取物植物萃取物處理之人類血管內皮細胞的細胞核螢光染色照片。
第2B圖顯示，經不同之單一植物萃取物植物萃取物處理之人類血管內皮細胞的細胞計數結果。p值<0.001：＊ ＊ ＊；p值<0.01：＊ ＊。
第2C圖顯示，經不同之單一植物萃取物處理與經混合之植物萃取物處理之人類血管內皮細胞的細胞核螢光染色照片。
第2D圖顯示，經不同之單一植物萃取物處理與經混合之植物萃取物處理之人類血管內皮細胞的細胞計數結果p值<0.01：＊ ＊；p值<0.05：＊。
第3A圖為經不同萃取物在不同濃度處理之人類血管內皮細胞(HUVEC)在GFR-Metrigel上形成之脈管的螢光顯微鏡照片。
第3B圖顯示將第3A圖所示之脈管形成進行量化的結 果。p值<0.001：＊ ＊ ＊；p值<0.05：＊。
第4A圖顯示，經不同之單一植物萃取物植物萃取物處理之人類血管內皮細胞之細胞遷移分析的螢光染色分析結果。
第4B圖顯示，經不同之單一植物萃取物植物萃取物處理之細胞遷移的螢光定量分析結果。p值<0.001：＊ ＊ ＊；p值<0.01：＊ ＊；p值<0.05：＊。
第5A圖顯示，經不同之單一植物萃取物植物萃取物處理之人類血管內皮細胞之細胞侵襲的螢光染色分析。
第5B圖顯示，經不同之單一植物萃取物植物萃取物處理之細胞侵襲的螢光定量分析結果。p值<0.001：＊ ＊ ＊；p值<0.01：＊ ＊；p值<0.05：＊。
第6A圖顯示，從以不同植物萃取物處理之小鼠皮下所取下的Matrigel，透過H&E染色後的顯微鏡照片。
第6B圖顯示，從以不同植物萃取物處理之小鼠皮下所取下的Matrigel，透過H&E染色的細胞計數數據。p值<0.01：＊ ＊。
第6C圖顯示，從以不同植物萃取物處理之小鼠皮下所取下的Matrigel，透過CD31免疫組織染色後的顯微鏡照片。
第7A圖顯示糖尿病慢性傷口癒合動物實驗照片。 Veh：未給藥之控制組；TCM：冇骨消與北板藍等比例混合物之處理組。
第7B圖顯示糖尿病慢性傷口癒合動物實驗癒合面積百分比(%)與時間關係圖。Veh：未給藥之控制組；TCM： 冇骨消與北板藍等比例混合物組。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 促進傷口癒合的醫藥組合物與接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物或菘藍屬(Isatis )用於製備促進傷口癒合之藥物的用途
<130> 0965-A24043CIP-TW
<160> 10
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 622
<212> DNA
<213> 冇骨消
<400> 1
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> 菘藍
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 4
<210> 5
<211> 460
<212> DNA
<213> 冇骨消
<400> 5
<210> 6
<211> 790
<212> DNA
<213> 菘藍
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 7
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 10

Claims (20)

  1. 一種促進傷口癒合的醫藥組合物，包括：以一有效量之接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物及菘藍屬(Isatis )植物之萃取物作為促進傷口癒合的活性成分；以及一藥學上可接受之載體或媒劑，其中該接骨木屬植物與該菘藍屬植物之重量比為1-7：3-5，且該接骨木屬植物為冇骨消，而該菘藍屬植物為菘藍。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該冇骨消的利用部位包括該冇骨消全株、該冇骨消的根、該冇骨消的莖、該冇骨消的葉、該冇骨消的花及/或該冇骨消的果實。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該萃取物所使用之萃取溶劑包括水、酒精及/或甲醇。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該冇骨消之核醣體基因DNA內轉錄間隔區之序列為序列辨識號：1，或與該序列辨識號：1具有序列相似度80%以上之序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該冇骨消之葉綠體基因間非編碼區(intergenic non-coding region)trnH-psbA 之序列為序列辨識號：5，或與該序列辨識號：5具有序列相似度80%以上之序列。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥 組合物，其中該菘藍的利用部位包括該菘藍全株、該菘藍的根、該菘藍的莖、該菘藍的葉、該菘藍的花及/或該菘藍的果實。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該菘藍的利用部位包括該菘藍全株、該菘藍的根(北板藍)、該菘藍的莖及/或該菘藍的葉(大青葉)。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該菘藍的利用部位包括該菘藍全株、該菘藍的根(北板藍)及/或該菘藍的莖。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該菘藍之核醣體基因DNA內轉錄間隔區之序列為序列辨識號：2，或與該序列辨識號：2具有序列相似度80%以上之序列。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之促進傷口癒合的醫藥組合物，其中該菘藍之葉綠體基因間非編碼區trnF-trnL 之序列為序列辨識號：6，或與該序列辨識號：6具有序列相似度80%以上之序列。
  11. 一種接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物及菘藍屬(Isatis )植物之萃取物用於製備促進傷口癒合之藥物的用途，其中該接骨木屬植物與該菘藍屬植物之重量比為1-7：3-5，且該接骨木屬植物為冇骨消，而該菘藍屬植物為菘藍。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之接骨木屬植物及菘藍屬植物之萃取物用於製備促進傷口癒合之藥物的用途，其中該冇骨消的利用部位包括該冇骨消全株、該冇骨消的根、該冇骨消的莖、該冇骨消的葉、該冇骨消的花及/或該 冇骨消的果實。
  13. 一種促進血管新生的醫藥組合物，包括：以一有效量之接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物及菘藍屬(Isatis )植物之萃取物作為促進血管新生的活性成分，其中該接骨木屬植物與該菘藍屬植物之重量比為1-7：3-5，且該接骨木屬植物為冇骨消，而該菘藍屬植物為菘藍；以及一藥學上可接受之載體或媒劑。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之促進血管新生的醫藥組合物，其中該冇骨消的利用部位包括該冇骨消全株、該冇骨消的根、該冇骨消的莖、該冇骨消的葉、該冇骨消的花及/或該冇骨消的果實。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之促進血管新生的醫藥組合物，其中該萃取物所使用之萃取溶劑包括水、酒精及/或甲醇。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之促進血管新生的醫藥組合物，其中該菘藍的利用部位包括該菘藍全株、該菘藍的根、該菘藍的莖、該菘藍的葉、該菘藍的花及/或該菘藍的果實。
  17. 如申請專利範圍第13項所述之促進血管新生的醫藥組合物，其中該菘藍的利用部位包括該菘藍全株、該菘藍的根(北板藍)、該菘藍的莖及/或該菘藍的葉(大青葉)。
  18. 如申請專利範圍第13項所述之促進血管新生的醫藥組合物，其中該菘藍的利用部位包括該菘藍全株、該菘藍的根(北板藍)及/或該菘藍的莖。
  19. 一種接骨木屬(蒴藋屬)(Sambucus )植物及菘藍屬(Isatis )植物之萃取物用於製備促進血管新生之藥物的用途，其中該接骨木屬植物與該菘藍屬植物之重量比為1-7：3-5，且該接骨木屬植物為冇骨消，而該菘藍屬植物為菘藍。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之接骨木屬植物及菘藍屬植物之萃取物用於製備促進血管新生之藥物的用途，其中該冇骨消的利用部位包括該冇骨消全株、該冇骨消的根、該冇骨消的莖、該冇骨消的葉、該冇骨消的花及/或該冇骨消的果實。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946731B (zh) * 2014-03-28 2019-12-20 中国中医科学院中药研究所 快速检测金银花的pcr试剂盒及检测方法
CN105942431A (zh) * 2016-05-03 2016-09-21 王胜 一种含海盐和大青叶提取物的植物盐及采用纳米纤维膜除重金属离子工艺制备植物盐的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008142619A1 (en) * 2007-05-17 2008-11-27 Izun Pharmaceuticals Corporation Use of herbal compositions in the protection and enhancement of extracellular matrix components
CN101797286A (zh) * 2009-07-15 2010-08-11 袁力克 一种用于减轻外科术后伤口感染及缝线反应的中药组合物及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837257A (en) * 1996-07-09 1998-11-17 Sage R&D Use of plant extracts for treatment of HIV, HCV and HBV infections
TW200621276A (en) * 2004-12-30 2006-07-01 jing-lin Wang Medical combination for promoting wound healing
CN100531748C (zh) * 2005-06-16 2009-08-26 上海中创医药科技有限公司 陆英提取物及其制备方法
CN101524411B (zh) * 2009-03-05 2011-12-21 常熟雷允上制药有限公司 大容量苦黄注射液及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008142619A1 (en) * 2007-05-17 2008-11-27 Izun Pharmaceuticals Corporation Use of herbal compositions in the protection and enhancement of extracellular matrix components
CN101797286A (zh) * 2009-07-15 2010-08-11 袁力克 一种用于减轻外科术后伤口感染及缝线反应的中药组合物及其制备方法

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