MXPA03010427A - Particulas del tipo del virus corona que comprenden genomas funcionalmente eliminados. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al campo de coronavirus y diagnostico, uso terapeutico y vacunas derivadas de los mismos. La invencion proporciona coronavirus replicados y particulas tipo virus replicadas (VLP) de las cuales partes grandes de su genoma se (al menos funcionalmente) eliminan sin abolir sus capacidades replicativas. Tal eliminacion resulta preferiblemente en al menos una eliminacion funcional en la cual el gen correspondiente no esta, o solo parcialmente, expresado por lo cual el producto de gen resultante es disfuncional o al menos funcionalmente distinto de un correspondiente producto de gen de tipo silvestre. Un resultado sorprendente se observa con VLP proporcionados con eliminaciones como se proporciona en la presente, en el cual el VLP eliminado, si bien es capaz de la replicacion in vitro e in vivo, generalmente esta bien atenuado, en que estos no causan enfermedades en el hospedador objetivo, haciendolo muy apropiado para uso terapeutico, tal como un vehiculo de administracion para genes y otras cargas (por lo cual la direccion especifica puede proporcionarse cuando se desee), y para usarse como un vacuna, siendo atenuada mientras porta determinantes inmunogenicos importantes que ayudan a la eleccion de una respuesta inmune.

Description

PARTÍCULAS DEL TIPO DEL VIRUS CORONA QUE COMPRENDEN GENOMAS FUNCIONALMENTE ELIMINADOS Campo de la Invención La invención se refiere al campo de los coronavirus y al diagnóstico, uso terapéutico y vacunas derivadas de los mismos .

Antecedentes de la Invención Los viriones corona tienen una estructura bastante simple. Consisten de una nucleocápsida rodeada por una membrana de lípidos. La nucleocápsida en forma de hélice está compuesta del genoma de ARN empacado para un tipo de proteína, la proteína nucleocápsida M. La envoltura viral contiene generalmente 3 proteínas de membrana: la proteína de espícula (S) , la proteína de membrana ( ) y la proteína de envoltura (E) . Algunos coronavirus tienen una cuarta proteína en su membrana, la proteína de hemaglutinina-esterasa (HE) . Como todos los virus de coronavirus, codifican una amplia variedad de productos de genes diferentes y proteínas. Más importante entre estos son obviamente las proteínas de funciones relacionadas con la replicación viral y la estructura del virión. Pero además de estas funciones elementales, los virus generalmente especifican una colección diversa de proteínas la función de las cuales todavía es Reft 151851 desconocida pero que se conoce o se sabe que es de alguna manera benéfica para el virus. Estas proteínas pueden ser esenciales - definidas operativamente por requerirse para la replicación del virus en células de cultivo - o dispensables . Los coronavirus constituyen una familia de virus de AR de sentido positivo grandes, que provocan usualmente infecciones respiratorias e intestinales en muchas especies diferentes. Con base en los criterios de proteína estructural y genética, antigénicos se han dividido en 3 grupos diferentes: grupo I, II y III. Actualmente, en vista de las grandes diferencias entre los grupos, su clasificación entre los 3 géneros diferentes se discute actualmente por el grupo de estudio ICTV responsable. Las características que todos los virus tienen en común, son un conjunto característico de genes esenciales que codifica funciones de replicación y estructurales. Entrelazados y flanqueando estos genes, se presentan secuencias que difieren profundamente entre los grupos y que son más o menos especificas de cada grupo. De los genes elementales, los más predominantes ocupan alrededor de tres tercios del genoma . Localizado en el extremo 5', este gen denominado de polimerasa que codifica dos precursores grandes, los muchos productos de desdoblamiento funcionales del cual se mantienen colectivamente como responsables de la replicación y transcripción del ARN. Los otros genes elementales especifican las proteínas estructurales básicas , M, E, y S. La proteína nucleocápaida (N) empaca el AR viral que forma el núcleo del virión. Esta estructura RNP esta rodeada por una envoltura de lípidos en la cual la proteína de membrana (M) se presenta abundantemente lo que constituye una matriz densa. Asociada con la proteína M está la proteína de envoltura pequeña (E) y la proteína de espícula (S) ( la última forma los peplómeros virales que se involucran en la fusión virus-célula y célula-célula. Los genes para estas proteínas estructurales suceden invariablemente en el genoma viral en el orden 5 ' -S-E-M-N- 13.

En las células infectadas, las nucleocápsidas de coronavirus se ensamblan en el citoplasma. Las nucleocápsidas interactúan con las proteínas de envoltura viral que después de su síntesis en el retículo endoplásmico se acumulan en el compartimiento intermediario, un sistema de membrana localizado entre el retículo endoplásmico (ER) y el complejo Golgi . Este sistema de membrana actúa como el compartimiento que injerta la interacción de las nucleocápsidas con las proteínas de envoltura viral, conduce a la punción de los viriones que luego se liberan de la célula por exocitosis. Se ha demostrado recientemente que el ensamble de las partículas corona virales no requiere el involucramiento de las nucleocápsidas. Las partículas desprovistas de una nucleocápsida se ensamblan en células cuando se co-expresan los genes de la proteína de la envoltura viral. Los requerimientos mínimos para la formación de partículas de tipo virus (VLP) son la proteína M y E; la proteína S es dispensable pero se incorpora si está presente a través de sus interacciones con la proteína M. El análisis microscópico de electrones y bioquímico revela que los VLP son de tamaño homogéneo y tienen dimensiones similares como los viriones auténticos de corona. Claramente, la proteína M y E tiene la capacidad de asociarse en el plano de las membranas celulares e inducir la curvatura que conduce al injerto de vesículas especificas que se secretan posteriormente de las células. Ha aparecido un artículo que describe estos resultados en EMBO Journal (Vol . 15, p . 2020-2028, 1996). Todavía en otro artículo, las partículas de tipo coronavirus se muestran que no están desprovistas de una nucleocápsida, el ensamble aquí no tuvo lugar independientemente de una nucleócápsida (Bos et al., Virology 218, 52-60, 1996) . Adicionalmente , el empaque del AR no fue muy eficiente. Adicionalmente, ninguna de estas dos publicaciones proporciona características suficientes de direccionamiento y administración que harían a los VLP adecuados como un portador terapéutico, por ejemplo equipado con información de direccionamiento específica y/o con un mensaje genético o no genético. Sin embargo, los coronavirus tienen diferentes ventajas teóricas distintas para su uso como vectores sobre otros sistemas de expresión viral (ver también W098/49195) ; (i) los coronavirus son virus de AR de hebra sencilla que se replican dentro del citoplasma sin un intermediario de ADN, haciendo improbable la integración del genoma de virus dentro del cromosoma de la célula hospedadora; (ii) estos virus tienen el genoma de ARN más grande conocido que tiene en principio espacio para la inserción de genes externos grandes; (iii) ya que los coronavirus en general infectan las superficies de la mucosa, tanto respiratoria como entérica, se pueden usar para inducir una respuesta inmune secretora fuerte; (iv) el tropismo de los coronavirus se puede modificar por la manipulación de la proteína de espícula (S) permitiendo la ingeniería del tropismo y la virulencia del vector; y (v) las cepas de coronavirus no patogénicas que infectan a la mayoría de las especies de interés, están disponibles para desarrollar sistemas de expresión. Se han desarrollado dos tipos de vectores de expresión con base en los genomas del coronavirus . Uno requiere de dos componentes (dependiente de la ayuda) y el otro un genoma sencillo que se modifica por la recombinación dirigida o por la ingeniería de un ADNc que codifica un ARN infeccioso. Los sistemas de expresión dependientes de la ayuda, también denominado minigenomas, se han desarrollado usando miembros de los 3 grupos de coronavirus . Los minigenomas derivados del coronavirus tienen una capacidad de clonación teórica cercana a 25 kb, ya que el AR del minigenoma de alrededor de 3 kb se amplifica eficientemente y se empaca por el virus de ayuda y el genoma del virus tiene alrededor de 30 kb . Esto es en principio, la capacidad de clonación más grande para un vector basado en los genomas del virus de ARN . La genética inversa ha sido posible por la recombinación dirigida entre un virus de ayuda y un corona virus replicante o no replicante derivado de ARN (9) . La recombinación dirigida ha estado mediada por 1 o 2 cruces . Los cambios se introdujeron dentro del gen S que modificó la patogenicidad del MHV. El gen que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) se insertó en el MHV entre los genes S y E por recombinación dirigida resultando en la creación de un vector con el genoma viral de ARN más grande conocido (Id) . También se han creado mutaciones por la mutagénesis dirigida dentro de los genes E y M, que muestra un rol crucial de estos genes en el ensamble. La construcción de un clon de ADNc genómico de longitud completa, puede mejorar considerablemente la manipulación genética de los coronavirus. La construcción de un clon infeccioso de ADNc TGEV se ha hecho posible recientemente (le) . Para obtener un ADNc infeccioso, se han combinado 3 estrategias (i) la construcción del ADNc de longitud completa se comenzó a partir de un DI que se replica estable y eficientemente por el virus de ayuda. Al usar este DI el genoma de longitud completa se determina y verifica el desempeño del genoma aumentado después de cada etapa. Este método permite la identificación de un fragmento de ADNc que fue tóxico al hospedador bacteriano. Este hallazgo se usa tomar ventaja al reintroducir el fragmento tóxico dentro del ADNc viral en la última etapa de clonación (ii) con objeto de expresar el genoma del coronavirus largo, y agregar la terminación 5' , se usó un sistema de amplificación de 2 etapas que acopla la transcripción en el núcleo desde el promotor CMV, con una segunda amplificación en el citoplasma, impulsada por la replicasa viral y (iii) para incrementar la estabilidad del ADNc viral dentro de las bacterias, se clonó el ADNc como un cromosoma artificial bacteriano (BAC por sus siglas en inglés) , que produce solamente una o dos copias de plásmido por célula. El ADNc de longitud completa se divide en 2 plásmidos debido a su fusión en un reducido de la estabilidad del ADNc. Un plásmido contiene todas las secuencias de virus excepto para un fragmento Cía I a Cía I de alrededor de 5 kb, que se incluye dentro de un segundo BAC. Un clon de ADNc infeccioso completamente funcional, que conduce a un virus virulento capaz de infectar los tractos entéricos y respiratorios, se preparó por ingeniería al insertar el fragmento Cali dentro del resto de la secuencia de ADNc TGEV. Como se dice, ambos sistemas de expresión dependientes de la ayuda, con base en dos componentes y en genomas sencillos construidos por la recombinación dirigida o por el uso de un ADNc infeccioso se han desarrollado. Las secuencias que regulan la transcripción han sido caracterizadas. Se ha logrado la expresión de altas cantidades de antígenos heterólogos (1 a T µg/lOs células) , y los niveles de expresión se han mantenido por alrededor de 10 pasos. Estos niveles de expresión deben ser suficientes para obtener respuestas inmunes protectoras. Los vectores de coronavirus de genoma sencillo, se han construido eficientemente expresando un gen externo tal como GFP. Así, se ha abierto una nueva avenida para los coronavirua que tienen propiedades únicas tal como un tamaño de genoma largo y tropismo entérico, que los hace de alto interés como vectores de expresión, ya sea para el desarrollo de vacunas y terapia de genes también como para otras condiciones que se necesitan reunir, notablemente la virulencia del hospedador de los constructos del vector, y la viabilidad de constructos del vector en cultivos de células necesarios para estar dentro de limitaciones diferentes. Por un lado, el vector puede no permanecer demasiado virulento, pero debe tener al menos algunas propiedades atenuadas que lo hagan útil para la replicación in vivo como un vehículo de administración de genes o vacuna para el hospedador o sujeto que se somete a la terapia. Por otro lado, el vector se debe replicar bien en el cultivo celular, al menos cuando se desea el uso comercial. La invención proporciona coronavirus replicantes y partículas del tipo coronavirus replicantes (VLP por sus siglas en inglés) a partir de las cuales se eliminan y/o reconfiguran partes grandes de su genoma (al menos funcionalmente) sin eliminar sus capacidades replicantes. Dicha eliminación, resulta preferiblemente en al menos una eliminación funcional en que el gen correspondiente no está o se expresa solamente parcialmente con lo cual el producto gen resultante está ausente, es disfuncional o al menos funcionalmente diferente de un producto de gen de tipo silvestre correspondiente. Un resultado sorprendente que se observa con los VLP proporcionados con las eliminaciones y/o reconfiguraciones como se proporcionan en la presente, es que el VLP eliminado o reconfigurado , a pesar de que pueda replicarse in vitro o in vivo, esté en general bien atenuado, y que no provoca enfermedad (o lo hace mucho menos) , en el hospedador objetivo, haciéndolo muy adecuado para uso terapéutico, como un vehículo de administración para genes y/o otras cargas (por lo cual se puede suministrar un direccionamiento específico también cuando se desee) o para su uso como una vacuna, que está atenuada mientras lleva determinantes inmunogénicos importantes, que ayudan a obtener una respuesta inmune. Tales determinantes se puede determinar de un coronavirus (homólogo o heterólogo) pero también se pueden derivar de otros patógenoe . En otras palabras la invención proporciona el uso del VLP replicante con un genoma reconfigurado y/o parcialmente eliminado como un vector. Dentro del vector se puede introducir una secuencia externa de ácido nucleico. Esta secuencia de genes externa codifica (parte de) una proteína, es esta proteína o parte de ella, codifica por la secuencia insertada, que puede servir como un inmunogen o un medio de direccionamiento (ligando capas de enlazarse a un receptor) . En una modalidad preferida, el VLP como se proporciona en la presente, se modifica además en una de diversas formas, genómica o en su composición de proteína, con lo cual expone en su superficie diversas moléculas biológicas u objetivo y/o se lleva dentro de las moléculas, partículas con actividad biológica que necesitan protegerse o cubrirse y/o que contiene genomas dentro de los cuales se han incorporado genes o secuencias externas. Una de las principales necesidades en la medicina actual son los sistemas para la administración dirigida de agentes terapéuticos en el cuerpo. En consecuencia, el desarrollo de portadores que pueden dirigir la carga a grupos específicos de células e introducir esta carga dentro de la células tal que pueda ejercer su actividad biológica, es un desafío importante en la investigación biomédica. Se han consumido ya esfuerzos importante en el desarrollo y prueba de sistemas basados en lipoaomas, microesferas , anticuerpos, etc, para la administración de fármacos, genes, péptidos, y proteínas. Aunque muchos de estos métodos son prometedores, los éxitos actuales ahora están limitados. El genoma de un VLP como se suministra en la presente ha sido eliminado y/o reconf igurado a tal grado sin eliminar la replicación, que sirve muy bien como un vehículo de administración para la carga. Al suministrar el VLP con la carga o usar el VLP como un vector se hace por ejemplo, al insertar una secuencia de un gen externo que codifica una molécula deseada tal como un ligando o molécula de enlace, ya sea que es un inmunógeno o molécula de enlace receptor o cualquier otra proteína o péptido. En una modalidad preferida, la carga comprende un ácido nucleico dentro del cual se han incorporado los genes o secuencias externas de interés. Los genes externos se pueden expresar por un VLP por inserción adicional de tal gen en su genoma, o al usar un espacio genético creado por la eliminación de genes no esenciales. Para incrementar además la seguridad de la terapia de administración de genes con virus del tipo corona, tal como el VLP como se proporciona en la presente, la invención también proporciona un método para inhibir o bloquear la infección por coronavirus en general, y con una partícula del tipo del coronavirus en particular, que comprende el tratamiento de un organismo o de células en riesgo de infección o de infectarse con tal coronavirus o VLP con un péptido de repetición denominado en grupos de siete como se suministra en la presente. Se ha encontrado por la presente que todos los coronavirus contienen una o dos regiones de repetición en grupos de siete características en su proteína S, que es instrumental en la entrada del coronavirus en la célula. Los péptidos derivados de la región de repetición en grupos de siete próxima a la membrana (HR2 por ejemplo, la cepa MHV A59 el péptido compuesto de los aminoácidos 1216-1254 de la proteína S, ver también la figura 20) son particularmente potentes en inhibir la infección, así como la fusión de células infectadas con las circundantes, como se determina en la descripción detallada, que ilustra las ventajas proporcionadas. Por supuesto, la terapia de péptidos no es restringida a situaciones de terapia de genes o de terapia de vehículos de administración como se proporciona aquí, sino también se puede usar en la prevención o tratamiento de infecciones coronavirales en general. En una modalidad adicional, la invención proporciona un VLP replicante de conformidad con la invención que también se modifica en el ectodominio y/o el endodominio de una proteína viral. Por ejemplo, al modificar el ectodominio de la proteína de espícula, el VLP se suministra con moléculas biológicas modificadas como medios objetivo que sirven para direccionar el VLP para interactuar con moléculas biológicas diferentes que se asemejan o que pueden interactuar con los medios objetivo tal como las proteínas receptoras sobre células, sean receptores de hormonas, inmunoglobuli s específicas en células B, moléculas asociadas con MHC y MHC presentes en las células T y otras células, proteínas de transferencia u otras moléculas del receptor conocidas por la persona experta en el campo de los receptores de las superficies celulares. Los medios objetivo también se pueden suministrar por interactuar con sitios de enlace conocidos de enzimas seleccionadas en proteínas o de otras moléculas que sirven como un substrato para la enzima seleccionada. En una modalidad adicional de la invención, los VLP replicantes se suministran al exponer un determinante inmunogénico tal como una toxina bacteriana o una proteína bacteriana viral heteróloga que comprende un determinante antigénico relevante específico para un patógeno. Este es un ejemplo por el cual los VLP sirven como un inmunógeno o vacuna, dirigidos aquí por ejemplo contra la toxina bacteriana. Los linfocitos B que llevan la inmunoglobulina correspondiente en su superficie, son en este caso las células objetivo para los VLP reconocidos una vez por el linfocito B, estas células se multiplicaran y producirán el anticuerpo adecuado. Se puede lograr la preparación de los VLP o coronavirus con espículaa modificadas genéticamente por modificación del genoma viral tal que exprese la proteína S modificada en células infectadas. Aquí también se suministra la preparación de los coronavirus que contienen picos alterados en una forma diferente al expresar los genes ? modificados en células que están además infectadas en el coronavirus. La coincorporación de la espícula mutante proporciona al virus con nuevos medios de direccionamiento . En una modalidad, la invención proporciona una partícula viral de tipo corona (VLP) que comprende un genoma a partir del cual al menos un fragmento de uno o diversos genes o grupos de genes que no pertenecen a los genes que especifican las funciones de polimerasa (ORFla/lb) o las proteínas estructurales N, M, E, y S, se eliminan sin resultar en una pérdida total de capacidades replicantes, con lo cual se proporcionan estos VLP con propiedades ventajosas para uso terapéutico, por ejemplo, como un vector para propósitos de administración de genes o para su uso como una vacuna que administra un antígeno o epítopo adecuado para obtener una repuesta inmune en el hospedador de interés. En otras palabras, los genes no esenciales de los coronavirus, no son cruciales para el crecimiento in vitro sino que determinan la virulencia viral. La atenuación adquirida por su eliminación, proporciona así vacunas virales excelentes y vectores terapéuticos. La administración o vacunación con un coronavirus, se puede lograr ahora con el conocimiento asegurado de que las partículas del tipo virus que administran el gen o antígeno de interés, están lo suficientemente atenuada para no provocar una enfermedad coronaviral específica. Por supuesto, además de un VLP que solamente se elimina en alguno o varios de los genes no esenciales antes mencionados, la invención también proporciona un VLP proporcionado con uno, preferiblemente funcional en que un péptido substancial en fragmento de al menos 4 de los aminoácidos originales, preferiblemente de al menos 40 no se expresa, eliminación en alguno o los genes que codifican proteínas estructurales, en particular, tal eliminación en una proteína estructural conduce a un VLP con una proteína de espícula modificada (S) en la cual parte del ácido nucleico que codifica la espícula se elimina y se reemplaza opcionalmente por una secuencia de gen objetivo, así por ejemplo proporciona a la espícula con otro diferente al ectodominio natural (o endodominio) de la proteína de espícula del virus original corona. Los virus del grupo I, con el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) probablemente como el miembro más complejo, tiene sus genes típicos localizados entre los genes S y E y en dirección a descendente del gen N, estos es entre el gen N y 3'U R (región no traducida). Los virus del grupo II al cual pertenecen los virus de la hepatitis de ratón ( HV) tienen los genes particulares entre la polimerasa y los genes S y entre los genes para las proteínas S y E. Una de las proteínas codificadas característica para este grupo es la proteína de hemaglutinina esterasa (HE) , que se incorpora en los viriones y de la cual se han demostrado las actividades de heraaglutinación y esterasa. Las actividades HE no son esenciales y su importancia permanece por determinarse. Finalmente, también los virus del grupo III con el virus de bronquitis infecciosa del coronavirus del prototipo (IBV) como representativo, tienen secuencias entre los genes S y E pero también entre los genes M y N. Aunque para algunos de los genes específicos del grupo no se pueden detectar productos de expresión en células infectadas mientras que para otros (por ejemplo el gen HE en MHV) se han observado los mutantes virales que se presentan naturalmente que llevan eliminaciones en estos genes, existe la posibilidad de que para alguno de estos genes, no los productos de proteínas sino otros productos de genes tales como las secuencias de nucleótidos (ADN o ARN) per se, sean importantes o esenciales. Considerando esto con base en su organización del genoma, se pueden distinguir 3 grupos de coronavirus, la invención proporciona el grupo I (FcoV) o el VLP recombinante a partir del cual preferiblemente un fragmento (que resulta preferiblemente en al menos una eliminación funcional en aquella del gen correspondiente no está o solamente se expresa parcialmente con lo cual está ausente el producto del gen resultante, disfuncional o al menos f ncionalmente diferente de un gen de tipo silvestre correspondientes) a partir del gen 3a, 3b, 3c, 7a o 7b, o el gen como un todo ha sido eliminado. Tal VLP eliminado, aunque puede replicarse in vitro e in vivo está bien atenuado en que no provoca esencialmente enfermedad en el hospedador objetivo, haciéndolo muy adecuado para uso terapéutico, por ejemplo como un vehículo de administración para genes y otros cargos (con lo cual se puede suministrar el direccionamiento especifico así cuando se desea) para su uso como una vacuna, que se atenúa mientras lleva determinante inmunogénicos importantes que ayudan a obtener una repuesta inmune. Tal virus I del grupo eliminado, especialmente un corona virus felino tal como FIPV, a partir del cual se elimina un fragmento correspondiente al gen 3c, y/o 7b es en particular inmediatamente útil como una vacuna que expresa determinantes antigénicos e inmunogénicos relevantes a través de sus proteínas estructurales (a. o. espícula) y se elimina f ncionalmente en una forma tal que se logra la atenuación, conduciendo a una vacuna segura y eficaz. Estos virus vivos atenuados todavía inducen el espectro más completo de las respuestas inmunes, celulares e humorales requeridas para proteger contra infección o enfermedad. Adicionalmente, tal VLP eliminado para la prevención de la enfermedad en felinos se puede proporcionar con proteínas heterólogas (o fragmentos funcionales de las mismas) , tal como glicoproteínas del virus de leucemia de felinos, calicivirus felino, virus del herpes de felino, permitiendo la producción de una vacuna bivalente o aun multivalente . Cuando se desea, otros polipéptidos inmunológicos o terapéuticamente importantes tales como citocinas se incorporan en su lugar o también. Adicionalmente , la invención proporciona para el grupo II (MHV) , un VLP recombinante a partir del cual preferiblemente un fragmento (que resulta preferiblemente en al menos una eliminación funcional) del gen 2a, HE, 4a, 4b, o 5a, o el gen como un todo ha sido eliminado. Tal virus del grupo II eliminado, especialmente un MHV, se suministra con propiedades ventajosas para uso terapéutico. Por ejemplo, especialmente como un vector para propósitos de administración. Tal VLP eliminado, aunque puede replicarse in vitro e in vivo, está bien atenuado, y no provoca esencialmente enfermedad en el hospedador objetivo, haciéndolo muy adecuado para uso terapéutico, como un vehículo de administración para genes y otras cargas (con lo cual se puede suministrar el direccionamiento específico también cuando se desee) y para su uso como una vacuna, que se atenúa mientras se llevan atenuantes inmunogénicos importantes que ayudan a obtener una respuesta inmune. Para el grupo III (IBV) , se proporciona un VLP proporcionado recombinante a partir del cual preferiblemente un fragmento (que resulta preferiblemente en al menos una eliminación funcional) del gen 3a, 5b, 5a o5b, del gen como un todo se ha eliminado. En otra modalidad, para los grupos I, II o III, la invención proporciona una partícula de tipo virus capaz de replicación, la partícula derivada de un coronavirus en donde los genes para las proteínas estructurales no suceden en el orden 5' -S-E-M-N-3 ' . Tal VLP replicativo con el orden de gen reconfigurado tienen dos características importantes. Una es la seguridad, y resulta del hecho de que la recombinacion homóloga del genoma VLP con aquella de un virus de campo accidental es improbable que genere nueva progenie viable. El otro es la atenuación debido al mezclado de los genes. Tal VLP replicante con un orden de genes reconfigurado proporciona un VLP bien atenuado para uso en administración de genes vacunas, y se proporciona en la presente para soportar las eliminaciones también de los genes no esenciales. Se muestra en la presente que los cambios en el denominado orden invariable de los genes que especifican las funciones de polimerasa (ORFla/lb) y las proteínas estructurales S, E, M, y N en el genoma coronaviral , es sorprendentemente bien tolerado, por ejemplo los VLP con el orden de genes S, M, E, N, o E, S, , N se obtienen fácilmente. También aquí los genes externos se pueden insertar en posiciones diferentes en el genoma viral, ya sea como un gen adicional o reemplazando los genes eliminados no esenciales; estos genes se expresan y se mantienen establemente durante el paso del virus. En otra modalidad, la invención proporciona un VLP recombinante en donde el ácido nucleico que codifica la proteína S ha sido modificada o al menos parcialmente eliminada. La proteína S de estos virus es responsable de enlazarse al receptor de células y para la fusión posterior de la membrana viral y celular durante la entrada. Estas dos funciones suceden en regiones separadas de la molécula: el enlace del receptor en la terminal amino y la fusión en la parte terminal carboxi . Por lo tanto, al reemplazar (parte de) el dominio de enlace del receptor por la molécula biológicas con especificidades de direccionamiento diferentes, se pueden dirigir los coronavirus para interactuar con una amplia variedad de moléculas objetivo que se expresan por ejemplo en las superficies de las células. Al hacerlo así sin afectar la función de fusión de la proteína S los VLP de conformidad con la invención se pueden fusionar o penetrar en la célula que no se infecta normalmente por el virus original. Se proporcionan por la invención partículas de tipo virus (VLP) derivadas de los coronavirus, en las cuales una o más copias de las proteínas de membrana viral se han modificado para contener porciones de proteína externa de origen viral (corona viral o no corona viral) o no viral, cuyas porciones son partes que reemplazan las proteínas de membrana VLP o se incorporan dentro de estas proteínas de membrana con lo cual constituyen una parte integral de las mismas. Mediante esto, el VLP se proporciona con propiedades biológicas novedosas tales como nuevos medios de direccionamiento o información inmunológica o proteínas con actividad biológica específica contenida dentro de la partícula del tipo de virus, cuyas propiedades biológicas están asociadas con el VLP después o en lugar de la proteína de tipo natural del corona virus original. En una modalidad de la invención, los VLP recombinantes con un genoma eliminado y/o reconfigurado se suministran en los cuales una parte del ectodominio (esto es la parte expuesta al exterior de la partícula viral) de la proteína de espícula se ha reemplazado por el dominio correspondiente (o parte del mismo) de la proteína de espícula de otro coronavirus. Por ello el VLP ha adquirido otra especificidad del substrato de células con lo cual el VLP puede entrar a las células que no son de otra manera accesibles o susceptibles al coronavirus original. En una modalidad adicional de la invención, los VLP se suministran que están compuestos del coronavirus de la hepatitis de ratón (MHV) , proteínas M y E y que contienen moléculas de espícula quiméricas que consisten del dominio terminal carboxi + transmembrana de los MHV S, pero el ectodominio de la proteína de espícula del coronavirus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) . Estos VLP pueden ahora entrar a las células de felino y suministrar partículas del tipo MHV. Las partículas con estas espículas quiméricas se producen al hacer constructos del gen MHV S en el virus corona en el cual la región que codifica el dominio de la termina viral amino, se reemplaza por el dominio correspondiente de FIPV. Estos constructos se insertan en los plásmidos detrás de un promotor de la polimerasa T7 de bacteriófagos. Los constructos luego se co-transfectan con plásmidos que llevan los genes MHV M y E, ambos también del promotor T7 en las células OST-7 que han sido infectadas con un virus de vacuna recombinante que expresa la polimerasa T7. Los VLP resultantes contienen la proteína quimérica MHV/FIPV S. En otra modalidad de la invención se suministra el VLP por los métodos usados como anteriormente con los ectodominios de la proteína espícula del coronavirus de la bronquitis infecciosa (IBV) , o el ectodominio (o parte del mismo) de una proteína de envoltura de cualquier virus envuelto que no pertenece a los coronavirus. Por ejemplo, los VLP basados en MHV se suministran por la invención que llevan en su superficie el ectodominio glicoproteína gD del virus de la pseudorabia (PV por sus siglas en inglés) en lugar del ectodominio del tipo MHV o el dominio luminal (esto es, terminal amino) (o parte del mismo) de cualquier proteína de membrana de tipo I no viral. De esta manera los VLP se suministran que tenga una especificidad de células para células de pollo o células de cerdo o células reactivas con la proteína de membrana de tipo I . Todavía en otra modalidad de la invención, se producen los VLP replicantes con modificaciones que están contenidas dentro de las partículas. Esto se logra por la incorporación de constructos modificados de cualquiera de las proteínas virales de corona S, M, E y HE . En las partículas del virus corona estas proteínas tienen su dominio en la terminal carboxi encerrada dentro del interior de la envoltura viral. Así, las secuencias de proteína externa incorporadas dentro, anexas o que reemplazan el dominio de la terminal carboxi se adjuntan también. De esta manera, se pueden proporcionar VLP que contengan porciones de proteína o fragmentos de las mismas, de otro virus o proteínas no virales tales como hormonas tal como la eritropoyetina . Esto permite la producción de VLP que contienen una proteína activa biológica o fragmentos de la misma, que están por la envoltura viral que pueden liberarse y/o recuperarse después, cuando se degrade o fusione la membrana viral con otra membrana. Esto permite la producción in vitro en células, o la producción in vivo en glándulas secretoras tales como glándulas de la leche de substancias biológicamente activas que de otra manera son perjudiciales o tóxicas a las células productoras o que por otras razones necesitan producirse en una forma cubierta. Como otra modalidad, los VLP basados en MHV se suministran que llevan en su superficie o dentro una molécula enzimáticamente activa como la furina o una citocina o un receptor de hormona u otro polipéptido viral o no viral con actividad biológica. En estos ejemplos, se proporcionan los VLP con medios objetivo (adicionales) que sirven para dirigir los VLP a la célula que no son accesibles de otra manera al virus corona original . La invención proporciona VLP replicantes obtenidos recombinantemente que además se modifican en el ectodominio y/o el entodominio de cualquiera de las proteínas virales. Al modificar el ectodominio de la proteína de espícula, se suministran los VLP con moléculas biológicas modificadas como medios de direccionamiento que sirven para dirigir loa VLP para interactuar con otras moléculas biológicas que se asemejan o que pueden interactuar con los medios objetivo tales como las proteínas del receptor en las células, que sean receptores de hormonas inmunoglobuli as específicas y células B, MHC y moléculas asociadas con MHC presentes en las células T y otras célulae, proteínas de transferencia u otras moléculas de receptor conocidos por la persona experta en el campo de receptores de superficie celular. También se pueden suministrar los medios de direccionamiento para interactuar con sitios de enlace conocidos de las enzimas seleccionadas, sobre proteínas u otras moléculas que sirven como substrato para la enzima seleccionada . La preparación de los VLP o coronavirus con espículas modificadas se puede lograr genéticamente por la modificación del genoma viral tal que exprese la proteína S modificada en células infectadas. Aquí también se proporciona la preparación de los virus corona que contienen espículas alteradas en una forma diferente por la expresión de genes modificados S en células que están además infectadas en el coronavirus. La co- incorporación de la espicula mutante proporciona al virus con nuevos medios de direccionamiento . Como un ejemplo, se demuestra la producción de partículas MHV que contienen la proteína quimérica MHV/FIPV ?. El constructo del gen quimérico S se expresa en las células L que se infectan posteriormente con la cepa A59 (MHV-A59) MHV de tipo silvestre o un mutante del mismo. El virus de progenie liberado por las células contiene la proteína S modificada. Para demostrar el direccionamiento alterado se usó el virus para infectar células felinas que naturalmente no son susceptibles al MHV. Las células se infectan ahora como se muestran por inmunofluorescencia y producen MHV norm l. Como otro ejemplo se demuestra la producción de proteínas S quiméricas que contienen MHV, en cuya parte del ectodominio S ha sido reemplazado por la parte correspondiente (esto es, el dominio luminal o amino terminal) de la molécula humana CD4 como un ejemplo de una proteína no viral. Estos coronavirus modificados han adquirido la propiedad de infectar células infectadas con VIH y células que expresan la glucoproteína de la de envoltura VIH a través del reconocimiento específico del CD4 y complejo HIV gpl20. Como resultado, las células infectadas con VIH se someterán a una infección lítica reduciendo efectivamente el número de células infectadas con VIH en el cuerpo con lo cual se reduce la severidad de la enfermedad o aun se termina la infección. Como otro ejemplo, se demuestra la producción de un VLP de conformidad con la invención, que contiene moléculas de espícula de las cuales la parte de la terminal amino se ha reemplazado por un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla que reconoce una proteína de superficie celular específica que se expresa en células que no pueden estar normalmente infectadas con el coronavirus que se encuentra en el base del VLP. El virus modificado puede infectar estas células de otra manera refractarias. Este ejemplo ilustra el principio de que de esta manera, esto es, al insertar información de direccionamiento específica en la espícula viral, se pueden dirigir los virus corona para seleccionar células o tejidos. El fragmento de anticuerpo de cadena sencilla puede por ejemplo, seleccionarse en sistemas de despliegue de fagos o en otros sistemas de selección clonal de fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla que se conocen en el campo.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de VLP replicantes o coronavirus como vehículos de suministro de genes. Esto se puede lograr en formas diferentes. Una forma es al incorporar genes externos o secuencias dentro del genoma viral tal que con la entrada del virus en las células se expresan estos genes o que las secuencias insertadas se conviertan de otra forma en biológicamente activas (como es el caso con la ribozima o los ARN antisentido generados por el virus dentro de la célula) . La otra forma utiliza VLP para empacar ARN externo en partículas, al hacer uso de la señal de empaque coronavirales . Al incorporar las secuencias externas en el genoma coronaviral se puede lograr por manipulación genética usando un clon de ADNc infeccioso, una copia de ADN de tamaño completo del genoma viral . También se puede lograr por recombinación de ARN en cuyo caso la parte que representa el ARN del genoma viral y que contienen las secuencias externas se introducen células infectadas permitiendo que se incorporen las secuencias externas a través de recombinación homologa. Debido a que los coronavirus exterminarán usualmente las células que infectan, es importante para la mayoría de los propósitos atenuarlas de manera que no exterminarán las células con la cual interactúan. La atenuación se logra aquí al alterar genómicamente el virus a través de supresión o reconfiguración.

Como un ejemplo de la atenuación de la invención, se proporciona por la preparación de un mutante MHV a partir del cual ha sido eliminado por recombinación un gen esencial. Se suministra una línea celular de ratón en la cual el gen MHV E se ha integrado cromosomalmente permitiendo que se produzca la proteína E por la expresión de gen. El MHV que carece de un gen E ha sido producido en células normales de ratón por recombinación usando una ARN sintético que contiene una copia perfecta de la terminación 3' genómica del MHV excepto por la carencia de un E intacto. El virus E defectuoso puede crecer fácilmente en las células que complementan el defecto. El virus producido está atenuado de manera tal que puede infectar a otras células de ratón, pero no productivamente: la carencia de una proteína E evita el ensamble de la progenie. Como un ejemplo del principio de incorporación de secuencias genéticas externas dentro de VLP atenuados o no atenuados, o coronavirus y de su expresión, está lo siguiente proporcionado por la invención. Un VLP derivado de MHV se suministra dentro del cual un gen reportero tal como LacZ o la proteína verde fluorescente se ha recombinado, y uno en el cual el gen quimérico MHV/FIPV S se ha incorporado. La expresión de los genes se muestra por la tinción fluorescente azul o verde de células infectadas con VLP y por la capacidad adquirida para infectar células felinas respectivamente. La otra forma de obtener vehículos de suministro basados en coronavirus utiliza VLP que comprende secuencias de ARN externas. La incorporación de las secuencias de ARN externas dentro de estas partículas, requiere su empaque en nucleocápsidas . El empaque del ARN viral por las moléculas de la proteína (N) de nucleocápsida sucede por el reconocimiento de secuencias específicas, señales de empaque por la proteína N. En el MHV la señal de empaque incluye una región de 69 nucleótidos de largo en el gen IB. Los ARN externos (que no son coronavirales) contienen las señales de empaque del coronavirus, o genomaa coronavirales defectuosos en los cuales se han retenido estas señales pero dentro de los cuales se han incorporado las secuencias externas, se ensamblan en VLP cuando se introducen en células que expresan los genes N, y E(±S) . Los VLP pueden introducir en la célula objetivo un ARN definido que puede tener una de varias funciones. Un ejemplo proporcionado por la invención es un ARN que actúa como un ARNm y la especificación de una proteína particular tal como una toxina de un inductor de la apoptosis o un fragmento de anticuerpos. Otro ejemplo es una ARN antisentido o un ARN con actividad de ribozimas. Para la mayoría de los propósitos es esencial adquirir copias múltiples del ARN en cada célula para obtener el efecto deseado. Esto puede no ser factible con los VLP que solamente llevarán uno de o unos cuantos pseudo-NC. La invención así proporciona los ARN con señales de amplificación tales que se multiplicarán en la célula objetivo. Para lograr esta meta, las secuencias de replicación del virus Semliki Forest (SFV) se usan como la base del constructo de ADN. El AR m derivado por SFV que comprende además las secuencias de encapsidación de los coronavirus y que especifica una proteína reportera se ensambla en VLP . La amplificación activada por SFV permite la síntesis de la proteína reportera en la célula, en animales la aparición de anticuerpos para la proteína reportera testifica el suministro productivo del contenido del VLP. La invención también proporciona un VLP que es un antígeno o un vehículo de suministro de epítopos que significa para la inducción de las respuestas inmunes específicas, celulares y/o humorales, sistémicas y/o locales incluyendo la inducción y producción de anticuerpos específicos contra las proteínas, para lograr la protección contra la infección por patógenos de origen viral y no viral. Como un ejemplo, la invención proporciona la inducción de anticuerpos contra la proteína reportera derivada del ARNm derivado de SFV, que comprende además las secuencias de encapsidación del coronavirus y la especificación de una proteína reportera como se describe arriba. Como otro ejemplo, se demuestra la inducción de anticuerpos a la espicula FIPV y a PRV gD por la inmunización con los VLP también descritos arriba. Así, las respuestas inmunes se puede obtener contra las proteínas que son codificadas por el genoma alterado del VLP y/o contra las proteínas que han sido incorporadas como medios de direccionamiento en el VLP, con lo cual se reemplaza parcial o completamente la proteína original de espícula. Los ejemplos ilustran la aplicabilidad del método a la inducción de respuestas inmunes contra proteínas tan diversas como por ejemplo de orígenes virales bacterianos, parásitos, celulares y hormonales . La invención también proporciona VLP que tienen completamente conservada la proteína de espícula original pero que se alteran genómicamente para atenuar el VLP y/o codificar las secuencias de nucleótidos que necesitan administrarse a las células a las cuales se dirigió el coronavirus original. Por ejemplo de esta manera, las células epiteliales intestinales o células epiteliales respiratorias que se infectan normalmente por TGEV, o PRCV, respectivamente, pueden ahora interactuar con VLP derivados de TGEV o PRCV, u otros coronavirus específicos de células si se necesita, para expresar proteínas que no se expresan normalmente por los virus. De esta manera, las células epiteliales respiratorias de pacientes con fibrosis quística pueden por ejemplo inducirse para expresar moléculas de tensoactivo de pulmón que se codifican por el genoma alterado del VLP. Para demostrar además la invención se proporcionan diversos ejemplos en la descripción detallada que no es limitante de la invención.

Descripción de las Figuras Figura 1A. La parte superior muestra el principio de la tecnología de recombinación de ARN. Se infectan células de felino con fMHV (el derivado MHV que lleva una proteína S quimérica con un ectodominio de la proteína FIPV S que permite que el virus crezca en las células de felinos) y se trangfecta con un ARN donador sintético que lleva entre otros el gen intacto MHV S. La recombinación adecuada de ARN conduce a los virus que han recuperado su capacidad de crecer células murinas por la adquisición de las espículas similares. La parte inferior muestra en la izquierda, representación esquemática de las partes relevantes de los constructos de plásmido a partir de los cuales se generan los ARN del donador. Se detallan a la derecha la organización genómica de los virus recombinantes generados con estos ARN donadores . Figura IB. Se muestran las secuencias de nucleótidos de las nuevas uniones creadas en los constructos de plásmido (y los virus resultantes) , las posiciones y números de los cuales se indican en la parte A (lado izquierdo) .

Figura 2 Análisis RT-PCR de virus recombinantes con supresiones genéticas. El ARN genómico se aisla del virus clonado, el ADNc se prepara ???- RT con cebadores adecuados (1092 y 1127) y la PCR se hace con los cebadores 1261 + 990 o con los cebadores 1173 + 1260 para analizar la región de loa genes 4a/b/5a o de los genes 2a + HE, respectivamente. El detalle de los análisis se muestra a la derecha, los resultados de los análisis con gel de agarosa de los productos PCR se muestran a la izquierda. Los virus analizados se muestran arriba del gel . En el marcador de la pista derecha se corrieron los ADN.

Figura 3 Los ARN virales sintetizados en las células infectadas por los diferentes mutantes de eliminación MHV se analizaron por extracción de ARN citoplásmico total, se etiquetaron metabólicamente con [33P] ortofosfato en presencia de actinomicina D, seguida por la electroforesis en gel de agarosa al 1%. La reposición genética de los virus de eliminación se muestra en la parte superior mientras que las especies de ARN subgenómico se designan a la derecha también de acuerdo con la composición genética.

Figura 4 Curvas de crecimiento de una etapa del virus eliminación recombinante . Después de una infección elevada m.o.i. de células LR7 con virus de eliminación y HV-WT se tomaron muestras de cada medio de cultivo en tiempos diferentes y se analizó por titulación la infectividad de estas muestras.

Figura 5 Como en la figura 1, la construcción de los virus con un orden de genes reconfigurados se detalla. A la izquierda las partes relevantes de los constructos de plásmidos : la organización del genoma de sus secuencias de ADNc MHV y las designaciones de los plásmidos. A la derecha, los virus respectivos con su estructura de genoma y sus nombres.

Figura 6 Curvas de crecimiento de una etapa de los virus recombinantes con genoma reconfigurado . Después de la infección alta m.o.i. de células LR7 con los virus MHV-Á2aHE (DELTA2aHE) , HV-lbMS, MHV-MSm o HV-WT se tomaron muestras en cada medio de cultivo en tiempos diferentes y se analizó por titulación la infectividad en estas muestras.

Figura 7A Como en la figura 1 la construcción de virus con inserciones de genes externos se detalla. A la izquierda los diversos constructos de plásmidos (vector) con sus nombres se detallan. A la derecha, el repuesto genético de los virus obtenido con estos plásmidos por recombinación de ARN en célulaa felinas se muestra junto con sus nombres. Abajo: las secuencias del cebador (y los números) usado para la introducción de una secuencia de un promotor intergénico (IGS) , enfrente del gen de lucíferaza de la renilla (RL) y de la luciérnaga (FL) . Figura 7B. El análisis RT-PCR de virus recombinante que lleva el gen RL . El ADNc se prepara usando el cebador 1412 por RT en el ARN viral; para cada virus, dos virus derivados independientemente (designados por las extensiones AlA y B1A; A2 y Bl; A7A y B3D) se analizaron en paralelo. Posteriormente, se efectúo el PCR en el ADNc resultante así como en los plásmidos usados para generar los virus (ver Fig. 7A) . Con los pares cebadores indicados al fondo de la figura.

Para cada conjunto también se incluyó una muestra de control negativo (H20) . El análisis del gel de aragosa de los fragmentos PCR junto con los marcadores de ADN (pistas de flanqueo) se muestra y se indican los tamaños de los productos a la derecha.

Figuras 8A-8B Curvas de crecimiento de una etapa del virus recombinante que lleva genes externos. Después de una infección de alto m.o.i. de las células LR7 con un virus, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en tiempos diferentes y se analizó la efectividad en estas muestras por titulación.

Figura 8A. Curvas de crecimiento de virus diferentes que tienen el gen de renilla de luciferasa en comparación con MHV-WT. Figura 8B. El crecimiento de dos clones independientemente obtenidos del virus MHV-EF L que lleva el gen de la luciérnaga de luciferasa se muestra en comparación con MHV-WT.

Figuras 9A-9B La expresión de luciferasa por virus recombinante . Se infectaron células LR7 con virus que expresan la luciferasa de renilla figura 9A o de luciérnaga figura 9B y con MHV-WT, y se observó la actividad de luciferasa generada en las células en el tiempo. En B, los dos clones obtenidos independientemente del virus MHV-EFML (ver figura 8B) se comparan con MHV-WT.

Figura 10 Estabilidad de los virus que llevan genes externos. Los virus recombinantes MHV-ERLM y MHV-EFLM (dos clones obtenidos independientemente en cada caso) se pasaron 8 veces sobre la célula LR7 a un bajo m.o.i. Después de cada paso, se determinó la infectividad viral (TCID50) en el medio de cultivo cosechado. La colección de virus así obtenida se inoculó en paralelo en las células LR7 a m.o.i. de 5 y la expresión de luciferasa en las células se cuantificó 8 hr después de la infección. Se graficaron los resultados como una función del número de pasos.

Figura 11 Inhibición de la infección MHV por el péptido HR2. Se inocularon células LR7 con el virus MHV-EPLM en presencia de concentraciones diferentes del péptido HR2 o como control, el péptido que corresponde a los aminoácidos 1003-1048 de la proteína viral S. Después de una hora de inoculación, se lavaron las células y se incubaron además en ausencia del péptido. Para evaluar el éxito de la célula de infección se analizaron a 4h p.i. para la expresión de luciferasa. En la figura se gráfica la actividad de luciferasa contra las diferentes concentraciones de péptidos usadas.

Figura 12 Inhibición de la fusión células-células por el péptido HR2. Después de la inoculación de cultivos en paralelo con las células LR7 con células MHV-A59, se sobrepusieron con medio de agar que contiene concentraciones diferentes del péptido HR2 y se contaron las placas al día siguiente.

Figura 13 La estructura genética del vector plásmido primario pBRDIl en comparación con aquella del virus parental a partir del cual se deriva. La parte superior muestra la organización del genoma de la cepa FIPV 79-1146. Las partes punteadas (esto es, las 702 bases más hacia la dirección 5' y las 9,262 bases derivadas de la dirección 3') se ensamblan en el conatructo de ADNc de pBRDIl; en este plásmido el ADNc viral está precedido por una secuencia promotora del fago T7 y el inserto está flanqueado por sitios de restricción Xhol (5') y Notl (3 ' ) ¦ B. El plásmido pBRDI2 es un derivado de pBRDIl en el cual el gen FIPV S ha sido reemplazado por el gen quimérico S (designado mS) que codifica el ectodominio MHV-A59 S mientras ha retenido las secuencias para la transmembrana de proteína FIPV S y el endodominio. El plásmido pBRDI2 se obtuvo al substituir en pBRDIl el segmento SacI-AflII por el fragmento correspondiente de pTMFSl. El último plásmido es un derivado del plásmido pTMFS (12) que contiene la secuencia del gen quimérico y dentro del cual se clonó un fragmento Sacl-Stul para extender la secuencia MHV S en su terminación 5' con secuencias que corresponden a la terminación FIPV pollB 3'.

Figura 14 Detalles de secuencia de los constructos pBRDI . A. La secuencia de nucleótidos de pBRDIl y pBRDI2 alrededor del extremo más en la dirección 5' de la secuencia de genoma FIPV: el sitio Xhol y la secuencia de fagos T7 están seguidas por un triplete G y posteriormente por la secuencia FIPV. B . La secuencia de la unión pollA/pollB. C. La secuencia de nucleótidos en la terminación más 3' del constructo de ADNc . La región no traducida 3' (3'UTR) está seguida por una extensión de nucleótidos de adenina y una secuencia Notl. D. Secuencia de nucleótidos en la transición FIPV pollB-MHV S en pTMFSl y pBRDI2.

Figura 15 Diagrama esquemático de la generación de mFIPV por la recombinación de ARN genómico FIPV y ARN sintético derivado de pBRDI2 en células de felino. La organización genética en cada ARN se indica así como la selección para el virus recombinante (esto es mS quiméricos que contienen) por el crecimiento en células murinas .

Figura 16 Análisis de las proteínas estructurales mFIPV. Se infectaron células murinas LR7 con mFIPV y para comparación, con MHV-A59 ; se infectaron células de felino FCWF con la cepa FIPV 79-1146. Se etiquetaron las células infectadas con aminoácidos 35S desde 5-7 h p.i., se prepararon lisados de células y se efectuaron las imnunoprecipitaciones con anticuerpos diferentes: anticuerpos policlonales contra FIPV (pistas 1, 6 y 10) y MHV (pistas 3, 4, 8 y 12) y anticuerpos monoclonales contra la proteína S (Sf; pistas 2, 7 y 11) y la proteína murina S (Sn,,- pistas 5, 9 y 13) . Se analizaron las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-12%. La posición en el gel de las proteínas MHV y FIPV se indica en el lado izquierdo y derecho respectivamente. La proteína mFIPV S se precipita por los sueros específicos MHV S, no por aquellos que precipitan la proteína FIPV S, y su migración en el gel es similar con aquella de la proteína MHV S .

Figura 17 Curvas de crecimiento de una etapa de mFIPV en comparación con MHV, después de una infección de alto m.o.i. de células LR7 con dos virus, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en tiempos diferentes y se analizó por titulación la infectividad en estas muestras.

Figura 18 Generación de mutantes de eliminación FIPV. En la parte superior el principio del método se muestra: recombinación del mFIPV ARN con pBRDI sintético de un ARN donador derivado, que lleva el gen intacto FIPV S. Debajo de esto se detalla el repuesto genético de los plásmidos construidos pB DTl (izquierda) y de los virus generados (derecha) . Las flechas indican la posición (y número) de los cebadores usados, los triángulos abiertos indican eliminaciones. A la derecha los números de pares base (pb) indican los tamaños de los fragmentos PCR predichos para ser obtenidos con los pares cebadores indicados.

Figuras 19A-19B Análisis genéticos de los virus de eliminación FIPV recombinante. Se aisló el ARN genómico de los virus de eliminación así como del FIPV de tipo silvestre recombinante. Las reacciones RT y PCR se efectuaron usando loa cebadores 1 y 9 para el análisis de la región de genes 3ABC (figura 19A) y los cebadores 10 y 11 para los genes 7AB (figura 19B) . Las posiciones de los fragmentos de ADN en los geles de agarosa se indican a lo largo del gel junto con su tamaño predicho (c.f Fig. 18, derecha). Los ARN virales analizados en las pistas diferentes se indican a la derecha.

Figura 20 Regiones de repetición en grupos de siete (HR) y sus secuencias de aminoácidos en proteínas de espícula de coronavirus . A. Representación esquemática de la estructura de espícula MHV-A59 del coronavirus . La glucoproteína de espícula (S) contiene una secuencia de señal en la terminal N (SS) y un dominio de transmembrana (TM) cercano a su terminación C. S se desdobla proteolíticamente (flecha) en una subunidad SI y ?2, que no se liga covalentemente . S2 contiene dos regiones de repetición en grupos de siete conservadas HR1 y HR2 como se indica. B. Alineación de secuencia de los dominios HR1 y HR2 de MHV-A59 , HCV-OC43 (cepa del coronavirus humano 0C43) , HCV-229E (cepa de coronavirus humano 229E) , FIPV y IBV (cepa del virus de la bronquitis infecciosa Beaudette) . La alineación muestra una inserción notable de exactamente 2 repeticiones en grupos de siete (14 aa) en HR1 y HR2 de HCV-229E y FIPV, que está presente en las proteínas S de todos los grupos de virus 1. La repetición en grupos de siete hidrofóbica predicha, residuos a y d son indicados arriba de las secuencias. El giro de la estructura de las repeticiones en grupos de siete predichas en HR1 está provocado por un interruptor ("stutter"). Los asteriscos denotan residuos conservados. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos HRl, HRla, HRlb , HRlc y HR2 usadas en este estudio se presentan en letras itálicas a continuación de las alineaciones. Los residuos en la terminal N derivados del sitio de desdoblamiento proteolítico de la proteína de fusión GST está entre corchetes.

Figura 21 = Tabla 1 Se muestran las secuencias de uniones que se generan en los plásmidos detallados en la figura 5 y en los virus obtenidos con estos plásmidos. Los números corresponden a la numeración de las uniones como se indica por las flechas en los plásmidos (figura 5, izquierda) .

Figura 22 = Tabla 2 Los cebadores usados para empalmar la extensión de traslape (SOE) -PCR y para RT-PCR en la construcción y análisis de los FIPV recombinantes . Para su posición en el genoma FIPV ver la figura 18, en la cual sus números y sentidos se indican por flecha. La numeración de los cebadores se refiere a aquella en la secuencia pBRDIl.

Figura 23 = Agregado 1 La secuencia de nucleótido del plásmido pBRDIl. La secuencia comienza con el sitio Xhol (ctcgag) seguido por una secuencia de un promotor de polimerasa T7 de fagos y la secuencia triple G, después de los cual avanza en la secuencia 5' FIPV ADNc . gura 24 = Agregado 2 La secuencia de nucleótidos del plásmido pBRDI2. secuencia comienza con el sitio Xhol (ctcgag) seguido por la secuencia del promotor de polimerasa T7 del fago y la secuencia triple G, después de lo cual avanza con la secuencia 5'FIPV ADNc .

Figura 25 Supervivencia de los ratones C57B1/6 infectados con los recombinantes MHV. Se inocularon intracranealmente ratones de 4 semanas de edad con diversas diluciones de virus de tipo silvestre recombinantes y de eliminación (n=5 por virus) y se observó la supervivencia. Se muestran los datos para los ratones infectados con 2.5x 105 PFU. Aunque los animales infectados con MHV-WT todos habían sucumbido por la infección posterior al día 7, todos los ratones inoculados con el virus mutante de eliminación sobrevivieron hasta 21 días después de la infección.

Figura 26A: Se etiquetaron metabólicamente células infectadas 17C11 con [33P] ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se describe (4, 10) . Las muestras del ARN citoplásmico total purificado usando reactivo Ultraspec (Biotecx) se desnaturalizaron con formaldehído y formamida, se separaron por electroforesis a través de agarosa al 1% que contiene formaldehído y se visualizaron por fluorografía. Las diferentes especies de ARN se indican por números que corresponden con la tabla 4 (^Figura 42) .

Figura 26B Ratones inoculados intraperitonealmente con lxlOeTCID50 de cada MHV recombinantes se les aplicó la eutanasia en el día 4 posterior a la infección y se determinó la replicación actual en el hígado por ensayos cuantitativos de placas.

Figura 27 El análisis RT-PCR de los virus recombinantes MHV-EFML y MHV-minFL, Se preparó el ADNc usando el cebador 1475 por RT en ARN viral, para cada virus, dos virus independientemente derivados (designados por las extensiones A1A y B1A, A6F y B4A) se analizaron en paralelo. Posteriormente, se efectuó la PCR en el ADNc resultante así como en los plásmidos usados para generar los virus (ver figura 7A) con el par cebador 935 y 1474. El análisis del gel de aragosa de los fragmentos PCR junto con un marcador de ADN se muestra.

Figura 28 El análisis RT-PCR de los virus recombinantes MHV-EFML y MHV-minFL. Se preparó el ADNc usando el cebador 1412 por RT en ARN viral, para cada virus 2 virus independientemente derivados (designados por las extensiones A2E y B4D) se analizaron en paralelo. Posteriormente, se efectuó la PCR en el ADNc resultante así como en los plásmidos usados para generar los virus (ver figura 7A) con los pares cebadores al final de la figura. El análisis del gel de aragosa de los fragmento PCR junto con un marcador de ADN se muestra.

Figuras 29-31 Síntesis de ARN por MHV recombinante . Los genomas de los virus recombinantes se detallan en la parte superior, sus patrones de expresión de ARN observados se muestran a continuación. Las células infectadas 17C11 se etiquetaron metabólicamente con [33P] ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se describe (4, 10) . Las muestras del ARN citoplásmico total, se purificaron usando reactivo Ultraspec (Biotecx) , naturalizado con formaldehído y formamida, se separaron por electroforesis a través de agarosa al 1% que contiene formaldehído y se visualizaron por fluorografía. Observar que las especies de ARN subgenómico en esta figura se designan por su composición más que como RNA2 a RNA7 , ya que las designaciones numéricas serían ambiguas para los mutantes.

Figura 29: MHV- T, MHV-ERLM y MHV-EFLM.

Figura 30: MHV-EFLM y MHV-minFl .

Figura 31: MHV-MRLN, MHV-ERLM, MHV-2aRLS, MHV-MSmNRL, y MHV-MSmN.

Figura 32 Replicación in vitro de los virus recombinantes que llevan virus externos. Después de una infección de alto m.o.i. de células LR7 con virus (superior: MHV-MRLN, MHV-ERLM, MHV-2aRLS medio: MHV-EFLM, MHV-minFL; inferior: MHV-ERLM, MHV-MSmNRL) , se tomaron muestras de cada medio de cultivo 9 horas después de la infección y se analizó por titulación la infectividad en estas muestras.

Figura 33 Expresión de luciferasa por virus recombinante . La expresión intracelular de la luciferasa de renilla y de luciérnaga de diversos virus recomb nantes se determinó de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (Promega) 9 horas después de la infección. Superior: MHV-EFLM y MHV-minFL; inferior: MHV-ERLM y MHV-MSmNRL.

Figura 34 Expresión de la luciferasa de la luciérnaga in vivo. Ratones hembra negativos MHV de 8 semanas de edad BALB/c se usaron en el experimento. Se inocularon los ratones intranasalmente con MHV-EFL . Se usaron 4 animales por doais (10eTCIDso) se sacrificaron los ratones y se separaron los hígados y cerebros al día 4 después de la infección. Los órganos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se homogeneizaron en un reactivo de Lisis de cultivo de células suministrado con el sistema de ensayo de luciferasa (Promega) . Se midió la actividad FL de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500) .

Figura 35 Tasas de supervivencia que siguen a la inoculación de gatos con diversos mutantes de eliminación: FIPW 79-1146; r-wtFIPV; FIPVA3abc; y FIPVA7a; y FIPVA3abc+7ab (100 pfu) .

Figura 36 Concentraciones de anticuerpos neutral i zadores FIPV formuladas en diferentes puntos de tiempo después de la infección de gatos con variantes de eliminación FIPV.

Figura 37 Tasas de supervivencia después de la prueba inmunogénica de gatos con FIPV 79-1146 (100 pfu) . Gatos (N=4) no vacunados previamente (?) ; gatos (N=5) vacunados previamente con FIPVA3abc ( ? ) ; gatos (N=5) vacunados previamente con FiPVA7ab (?) ; y gatos (N=5) vacunados previamente con FIPVA3abc+7ab (?) .

Figura 38 Curvas de crecimiento en una etapa de los virus recombinantes FIPV que llevan genes externos. Después de la infección de alto m.o.i. de las células FCWF con virus, se tomaron muestras de cada medio de cultivo en tiempos diferentes y se analizó la infección en estas muestras por titulación. Recombinante nr. 1(D) y nr. 9( ) .

Figura 39 Expresión de luciferasa por virus recombinantes. Se infectaron células FCWF con virus que expresan la luciferasa de renilla (nr. 1 ?; y nr. 9 ?) y con wt-rFIPV (?) , y la actividad de luciferasa generada en las células de monitoreo durante el tiempo.

Figura 40 Curvas de crecimiento en una etapa del virus recombinante FIPV con eliminaciones de los genes no esenciales. Después de una infección alta m.o.i. de células FCWF con virus se tomaron muestras con cada medio de cultivo en tiempos diferentes y se analizó por titulación la infectividad en estas muestras.

Figura 41 Cuantificaciones de la síntesis de ARN por MHV recombinante que lleva eliminaciones de genes no esenciales.

Figura 42 Cuantificaciones de la síntesis de ARN por MHV recombinantes con genomas reconfigurados MHV.

Figura 43 Tabla de calificación para los signos clínicos que siguen a la vacunación y la aplicación de la prueba inmunogénica.

Figura 44 Registro clínico total que estudia la vacuna inicial con mutantes diferentes de FIPV79-1146.

Figura 45 Registro clínico tal que sigue a la prueba inmunogénica con FIVP 79-1146.

Figura 46A Replicación del virus recombinante que lleva 2 genes externos. Después de una infección alta m.o.i. de las células LR7 con virus (MHV-RLFL, MHV- 2aRLS , ? MHV-EFLM) se tomaron muestras de cada medio de cultivo 9 horas después de la infección, y se analizó por titulación la infectividad en estas muestras .

Figura 46B Expresión de luciferasa por virus recombinantes . La expresión intracelular de luciferasa de luciérnaga y de renilla de virus recombinantes diversos se determinó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega) en infección posterior de 9 horas (MHV-RLFL, MHV-2aRLS, y MHV-EFLM) .

Descripción Detallada de la Invención Los datos experimentales relacionados con la patente: I. Virus de hepatitis de ratón (MHV) , cepa A59 (MHV-A59) 1. Generación de los virus vivos atenuados. a. Construcción de los genes que carecen de MHV recombinante . b. Confirmación de los genotipos recombinantes. c. Síntesis de ARN por mutantes de eliminación MHV. d. Fenotipo de crecimiento de cultivo de tejido. e. Virulencia de los virus recombinantes en ratones. 2. Generación de los virus recombinantes con un orden de genes reconfigurado . a. Construcción de los virus recombinantes con orden de genes reconfigurado . b. Síntesis de ARN por mutantes MHV con un orden de genes reconfigurado . c. Fenotipo de crecimiento de cultivo de tejido. d. Replicación de los virus recombinantes en ratones. 3. Generación de los virus recombinantes que expresan los genes externos . a. Construcción de virus recombinantes que llevan genes reporteros . b. Síntesis de ARN por virus recombinantes. c. Replicación de virus que expresan luciferasa de la renilla o la luciérnaga. d. Expresión de luciferasa de la renilla y de luciérnaga en cultivo de células. e. Mantenimiento de los genes externos durante el paso viral . f. Expresión de la luciferasa de luciérnaga en ratones. g. Generación de MHV que expresa dos genes externos de un genoma. h. Generación de MHV que expresa un gen quimérico espícula-GFP . . Inhibición de la infección y de la fusión celular por un péptido derivado de una proteína de espícula.

II. Virus de peritonitis infecciosa de felinos (PIPV) , cepa 79-1146. 1. Generación de mFIPV, un coronavirus de felino que crece en células murinas . a. Construcción de un vector de transcripción sintético de ARN. b. Generación de mFIPV por recombinación de ARN. c. Análisis de proteína mFIPV. d. Características de crecimiento con mFIPV. 2. Generación de la vacuna FIPV viva atenuada por eliminaciones de genes. a. Construcción de los vectores de transcripción de ARN sintético . b. Generaciones de genes que carecen de FIPV recombinante . c. Análisis genético de genes que carecen de FIPV recombinante . d. Características de crecimiento de los genes que carecen de FIPV. e. Virulencia de los virus recombinantea en gatos. f. Respuesta inmune inducida por virus recombinante. g. Virus de eliminación de FIPV que sirven como vacunas vivas atenuadas. 3. Inserción y expresión de genes externos. a. Construcción de virus recombinantes que llevan genes reporteros . b. Crecimiento en una etapa virus. c. Expresión de la luciferasa de renilla. 4. Generación de las vacunas basadas en FIPV multivalentes . a. Construcción de la vacuna del virus de leucemia felina multivalente (FeLV) con base en el vector FIPV. b. Construcción de una vacuna de virus de inmunodeficiencia felina multivalente (FIV) con base en un vector FIPV. c. Construcción de una vacuna de calicivirus felino multivalente (FCV) con base en un vector FIPV. d. Construcción de una vacuna del virus de panleucopenia felina multivalente (FPV) con base en un vector FIPV. e. Construcción de una vacuna del virus del herpes felina (FHV) con base en un vector FIPV. f. Construcción de una vacuna del serotipo FIPV de I y II multivalente con base en el vector FIPV del serotipo II. 5. Generación de virus recombinantes con un orden de genes reconfigurados . 6. Generación de vacunas basadas en FIPV contra patógenos caninos . a. Generación de una vacuna basada en FIPV contra el moquillo canino. b. Generación de una vacuna basada en FIPV contra la enfermedad parvo canina. c. Generación de una vacuna basada en FIPV contra hepatitis infecciosa canina. d. Generación de una vacuna basada en FIPV contra la enfermedad hemorrágica de los cachorros.

III. Virus de gastroenteritis transmisible (TGEV) 1. Generación de una vacuna viva atenuada contra TGEV 2. Generación de vacunas basadas en TGEV multivalentes . a. Construcción de una vacuna de Parvovirus Porcino multivalente (PPV) basada en un vector TGEV b. Construcción de una vacuna del virus de la influenza de los cerdos multivalente basada en un vector TGEV c. Construcción de una vacuna del virus de la fiebre de los cerdos africanos multivalente con base en un vector TGEV d. Construcción de una vacuna de tipo 2 del circovirus porcino multivalente basado en un vector TGEV e. Construcción de una vacuna del virus del síndrome reproductivo y respiratorio Porcino multivalente basado en un vector TGEV 3. Generación de virus recombinantes con un orden de genes reconfigurado .

IV. Virus de Bronquitis Infecciosa de las Aves (IBV) 1. Generación de una vacuna viva basada en un IBV atenuado 2. Generación de vacunas basadas en IBV multivalentes al. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra más de un serotipo IBV. all. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra la Enfermedad de Newcastle. b. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra la influenza de las aves. c. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra la Enfermedad del Virus de la Anemia de los Pollos (CAV) . d. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra la enfermedad del reovirus de las aves. e. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra la enfermedad Bursal infecciosa . f. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra la enfermedad de Marek. g. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra la laringotraqueitis infecciosa . 3. Generación de virus recombinantes con un orden de genes reconfigurado .

V. Coronavirus humano (HCoV) cepa 229E (HCoV-229E) 1. Generación de una vacuna viva basada en un HCoV-229E atenuado 2. Generación de una vacuna atenuada viva contra HCoV cepa 0C43. 3. Generación de vacunas basadas en HCoV multivalentes. a. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector HCoV que protege contra el Virus Sincitial Respiratorio (RSV) b. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector HCoV que protege contra el rotavirus c. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector HCoV que protege contra el virus del tipo Norwalk d. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector HCoV que protege contra el virus de la influenza 4. Generación de virus recombinantes con un orden de genes reconfigurado .

I. Virus de Hepatitis de Ratón (MHV) , cepa A59 (MHV-A59) 1.1. Generación de los virus atenuados Objetivo General: Establecer si la eliminación del genoma coronaviral (MHV-A59) de los genes o grupos de genes que no pertenecen a los genes que especifican las funciones de polimerasa (ORFla(/lb) o las proteínas estructurales N, , E, y S, se tolera y produce virus viable aún si estas secuencias de genes se separan todas juntas; establecer si talea eliminaciones tienen un efecto atenuante en el virus cuando se inoculan en los ratones .

I.l.a. Construcción de los genes que carecen de MHV recombinantea Objetivo Especifico: Generar mutantes de eliminación MHV-A59 que carecen de los genes 2a + HE (MHV-DA2aHE) , genes 4a + 4b + 5a (MHV-DA45a) , y genes 2a + HE + 4a + 4b + 5a (MHV-min) . Método : Recombinación dirigida de ADN (3, 9, 10) usando fMHV, las células de felino que se infectan derivadas de MHV-A59 (FCWF) no las células murinas (LR7) (7) , y los ARN de donador sintético que llevan las eliminaciones pretendidas (Figura 1A superior) . Procedimiento : Se construyeron vectores de transcripción para la producción de ARN de un donador sintético a partir del plásmido pMH54 (7) , que codifica un transcrito de partida que consiste de la terminación 5' del genoma MHV-A59 (467 nt) fusionado al codón 28 del gen HE y que corre a la terminación 3' del genoma (Figura 1) . Se usó el plásmido pMH54 para reconstruir el WT-MHV recombinante , un derivado fMHV que nuevamente infecta las células murinas. El vector de transcripción pXHDA45a carece de los ORF 4a, 4b( y 5a. Para la construcción de este plásmido se obtuvo un producto por PC del plásmido pB59 (2) mediante el uso del cebador 1089 (5 ' -ACCTGCAGGACTAATCTAAACTTTATTCTTTTTAGGGCCACGC- 3 ' ) , que codifica un sitio de restricción pSTi (Sse8387I , una secuencia intergénica (IGS) y que es complementaria a la secuencia justo en la dirección ascendente del gen E o 5b y el cebador 1092 (5' -CCTTAAGGAATTGAACTGC-3 ' ) que es complementario a la terminación 5' de la región codificadora de la proteína M. El producto por PCR se clonó en pGE -T Easy (Promega) según las instrucciones del f bricante produciendo pXH0803. El producto PCR se extirpó posteriormente con PstI y EcoRV y se clonó dentro de pMH54 tratado con Sse8387I y EcoRV, resultando en pXHDA45a. El vector de transcripción pXHDA2aHE carece de ORFs 2a y HE y contiene aproximadamente 1200 pares base de la terminación 3' del gen de polimerasa fusionado al gen S. Para construir este plásmido un producto PCR se obtuvo al empalmar la extensión de traslape PCR. Un producto PCR se obtuvo del plásmido p96 (1) usando el cebador 1128 (5'-ACGGTCCGACTGCGCGCTTGAACACGTTG- 3 ' ) , que codifica un sitio de restricción RsrII y es complementario a la región de 1200 pares base en la dirección ascendente del codón de detención ORFlb, y el cebador 1130 (5 ' -CATGCAAGCTTTATTTGACATTTACTAGGCT-3'), que es complement rio a la terminación 3' de la región codificadora de polimerasa y la región IGS en dirección ascendente del gen S . El otro producto PCR se obtuvo de pMH54 usando el cebador 1129 (5'-GTCAAATAAAGCTTGCATGAGGCATAATCTAAAC-3' ) , que es complementario al cebador 1130 y el cebador 1127 (5 ' -CCAGTAAGCAATAATGTGG-3')/ ue es complementario a la terminación 5' del gen S. Los productos por PC se purificaron y mezclaron y luego se amplificaron con los cebadores 1128 y 1127. El producto por PCR obtenido en la segunda ronda de PCR se clonó en pGEM-T Easy, produciendo pXH1802. El producto por PCR se extirpó con RsrII y Avrll y ae clonó dentro de pMH54 tratado con las misma enzimas resultando en pXHAD2aHE. El vector de transcripción pXHmin tiene la terminación 3' de ORFlb fusionada al gen S y la eliminación de ORF4a, 4B y 5a. Este vector se construyó al clonar el fragmento extirpado con PstI y EcoRV a partir de pXH0803 en pXHÜ2aHE tratado con Sse8387I y EcoRV. La composición de todos los segmentos generados por PCR se confirmó por formación de secuencias de ADN. Para generar los virus imitantes de eliminación, se transcribieron los ARN del donador de plásmidos derivados de pMH54 (linealizados con Pací) y se transfectaron por electroporación dentro de las células felinas FCWF que habían estado infectadas con fMHV. Estas células infectadas y transfectadas luego se colocaron en placas sobre una monocapa de células de ratón LR7 (7) . Después de 24 horas de incubación a 37°C, se cosecharon los virus de progenie al tomar el sobrenadante del cultivo de células y se seleccionaron los recombinantes candidato por dos rondas de purificación de placas en células LR7. Resultado : Con cada uno de los A N del donador sintético usado, se obtuvieron placas transparentes. Conclusión : Se habían obtenido los virus recombinantes que habían recuperado la capacidad de crecer en células murinas .

I.l.b. Confirmación de los genotipos recombinantes Ob etivo : Confirmar por RT-PCR la reposición genética de los virus recombinantes obtenidos. Procedimiento y Resultados : Los virus recombinantes clonados uno de cada experimento de recombinación, se produjeron en células LR7 , se aisló el ARN viral y RT-PCR se hizo usando métodos estándar sobre ARN genómico como se muestra en la Figura 2. Para confirmar la eliminación de los ORFs 4 y 5a, la etapa RT se efectúo con el cebador 1092 (5 ' -CCTTAAGGAATTGAACTGC-3 ' ) , que es complementaria a la terminación 5' del gen M, mientras que la PCR se efectuó con el cebador 1261 (5 ' -GCTGCTTACTCCTATCATAC- 3 ' ) y el cebador 990 (5 ' -CCTGATTTATCTCTCGATTTC-3 ' ) , que son complementarios con la terminación 5' del gen E y S respectivamente. En el caso del MHV-WT recombinante , un producto RT-PCR que corresponde en tamaño con el de 1328 pares base esperado se observa (Figura 2, arriba) . Como se espera, un producto PCR de la misma longitud se observo para HV-AÜ2aHE. En contraste, ambos MHV-DA45a y MHV-min productos mucho más pequeños por RT-PCR se detectaron. El tamaño más pequeño de los productos RT-PCR corresponde con la eliminación de 736 pares base. La eliminación de ORFs 2a y HE se analiza de una forma similar. La etapa RT se efectuó con el cebador 1127 (5 ' -CCAGTAAGCAATAATGTGG-3 ' ) , que es complementario con la terminación 5' del gen S. El PCR se efectuó con el cebador 1173 (5'-GACTTAGTCCTCTCCTTGA- 3 ' ) y el cebador 1260 (5'-CTTCAACGTCTCAGTGC- 3 ' ) , que es complementario a la terminación 3' del gen IB y la terminación 5' del gen S respectivamente. Ambos productos por PCR MHV-WT y MHV-?A45a se detectaron, que fueron mucho más grandes que los productos PCR detectados para MHV-A2aHE y MHV-min (Figura 2, inferior) . La diferencia en tamaño corresponde con la eliminación de 2164 pares base. Finalmente, las uniones recientemente generadas presentes en los genomas del virus mutante de eliminación (Figura 1A [triángulos] y IB [secuencias] ) , se analizaron al formar secuencias de los productos RT-PCR. Hasta este punto, se clonaron loa productos por PCR en el vector pGEM-T (Promega) . Las secuencias obtenidas estuvieron en acuerdo perfecto con las predicciones. Conclusión : Los mutantes virales construidos tuvieron las eliminaciones genéticas pretendidas. 3 I.l.c. Síntesis de ARN por mutantes de eliminación HMV Obj e i o : Confirmar los patrones de los ARN sintetizados en células infectadas por los virus mutantes. Procedimiento : Las células infectadas 17C11 se etiquetaron metabólicamente con ortofosfato [33PJ en presencia de actinomicina D esencialmente como ae describe (4, 10) . Las muestras del ARN citoplásmico total, purificadas uaando el reactivo Ultraspec (Biotecx) , se desnaturalizaron con formaldehldo y formamida, se separaron por electroforesis a través de agarosa al 1% que contiene formaldehído y se visualizaron por fluorografía (Figura 3; observar que la especie de ARN subgenómica en esta figura se designa por su composición más que como ARN2 hasta AR1SJ7 , ya que las designaciones numéricas serían ambiguas para los mutantes de eliminación) . Resultado : Para el MHV-WT recombinante, el patrón de ARN y las cantidades molares relativas de las seis especies de ARN subgenómicas (sg) y el ARN genómico (g) fueron muy similares con aquellas previamente reportadas para MHV (10) (4) (5) (8), con una excepción notable. El ARNsg 4-5a/E-M-N que usualmente ae denota como ARN4, fue por mucho más abundante que previamente observado par estas especies en el MHV de tipo silvestre (10) (4) (5) (8) . Esto se debe presumiblemente a los tres cambios de nucleótidos en las posiciones 13, 15, y 18 en la dirección ascendente de la señal reguladora de la transcripción de consenso (5'-AAUCUAAAC3 ' ) que precede al gen 4 (Figura 1), que se introdujo en el vector de transcripción pMH54 para crear el sitio Sse8387I en la dirección descendente del gen S (7) . Para los mutantes de eliminación, todas las variantes de A sg tuvieron movilidades que correspondieron con sus tamaños predichos (Figura 3 y Tabla 3) , y no ae observaron especies adicionales prominentes. Las cantidades molares relativas de las especies mutantes ARNsg fueron bastantes similares con aquellas de las contra partes del tipo silvestre que se originan de las señales reguladoras de la transcripción correspondiente. Conclusión : Los resultados confirman los genotipos de los virus recombinantes y demuestran sus fenotipos esperados al nivel de ARN.

I.l.d. Fenotipo de crecimiento de Cultivo de Tejidos Obj etivo : Comparar los fenotipos de crecimiento in vi tro . Procedimiento Y Resultados: Las monocapas de células LR7 confluentes crecieron en capas de 35-mm se infectaron con cada virus recombinante (8 PFU/célula) y la infectividad viral en los medios de cultivo a tiempos diferentes posteriores a la infección (p.i.) se determinó por titulación en células LR7. TCID50 en valores (dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50%) se calcularon y graficaron (Figura 4) . Los virus recombinantes no difirieron apreciablemente con respecto a la inducción de los efectos citopáticos de la sincitio extensiva o en su tamaño de placas. Sin embargo, MHV-GA45a y MHV-min difieren de MHV-WT y MHV-DA2aHE en su cinética de crecimiento en una etapa (Figura 4) . Los dos virus despliegan aproximadamente concentraciones 10 veces inferiores en todos los puntos de tiempo. Conclusión : Todos los virus de eliminación se multiplican bien in vitro aunque la eliminación de los genes 4 y 5a tuvo un efecto ligeramente negativo.

I.l.e. Virulencia de los virus recombinantes en ratones Obj etivo : Establecer si las eliminaciones genéticas afectan la virulencia viral . Procedimiento y Resultados: Los virus recombinantes se caracterizaron en su hospedador natural el ratón. Como primera etapa, se determinó la virulencia de los virus recombinantes. Un ensayo LD50 (50% de dosis letal) se efectuó al inocular MHV negativo, ratones C57B1/6 intracranealmente con cuatro diluciones en serie de 10 tantos (5x10s - 5xl02) de virus recombinante . Se diluyeron los virus usando PBS que contiene 0.75% de albúmina de suero de bovino. Se usó un volumen de 25 µ? para inyección dentro del hemisferio cerebral izquierdo. Se analizaron cinco animales por dilución por virus. Los valores LDS0 se calcularon por el método Reed-Muench basado en la muerte por 21 días posteriores a la infección. Claramente, los virus mutantes de eliminación se atenuaron cuando se comparan con el MHV-WT recombinante . Aunque el virus MHV-WT tuvo un LD50 de 1.8xl04, no se pudo derivar ningún LD50 para los mutantes de eliminación. Aunque los animales inoculados con las dosis superiores muestran algunos signos de enfermedad, ninguno de los animales infectados con alguno de los virus mutantes con eliminación murió hasta la entrada de 50,000 PFU/ratón. Esto implica que el LD50 para estos virus excede un valor de 50,000 y puede estar bien arriba de 100,000. La Figura 25 ilustra la cinética de la mortalidad de ratones infectados con la dosis de inoculación superior, 2.5xl05unidades formadoras de placa (PFU) o virus WT de eliminación. Aunque todos los animales inoculados con el virus de tipo silvestre habían muerto siete días posterior a la infección, los virus de eliminación estuvieron altamente atenuados, desplegando ninguna muerte y menos síntomas clínicos severos. A pesar de la observación de ninguna mortalidad, todos los ratones infectados con los virus Ü45a y D2aHE mostraron signos clínicos de postura encorvada, apariencia desaliñada y andar anadeado durante la primera semana después de la infección; estos síntomas fueron menos severos y se observaron en menos ratones infectados con MHV-min.

Conclusión : Los virus con eliminaciones de la secuencias que especifican los genes 2a + HE o los genes 4a + 4b + 5a o de la combinación de todos estos genes, muestran un fenotipo significativamente atenuado en ratones. En otras palabras, los genes no esenciales de los coronavirus no son cruciales para el crecimiento in vitro sino que determinan la virulencia viral. La atenuación adquirida por su eliminación proporciona asi vacunas virales excelentes y vectores terapéuticos . 1.2. Generación de virus recombinantes con un orden de genes reconfigurado Objetivo General: Establecer si el orden invariable de los genes que especifican las funciones de polimerasa (ORPla/lb) y las proteínas estructurales S, E, M, y N en el genoma corona viral es esencial para la viabilidad de estos virus o si se tolera la reconfiguración de este orden. 1.2. a. Construcción de virus recombinante con un orden de genes recon igurado Objetivo Especifico: Generar mutantes MHV-A59 en los cuales las posiciones relativas de los genes de proteínas estructurales en el genoma HV-A59 se cambian al mover el gen M y/o E. Método ; Recombinación dirigida de ARN usando fHMV y ARN de donadores sintéticos llevando las reconfiguracionea pretendidas (Figura 5, superior). Procedimiento : Vectores de transcripción para la producción del AR donador para la recombinación dirigida se construyeron de los plásmidos pMH54 y pXHD2aHE (descritos arriba) . Con objeto de generar el vector de transmisión pXHSM45N (Figura 5, parte inferior izquierda), se generó un producto de PCR al empalmar la extensión de traslape (SOE) -PCR que contenía la terminación 3 ' del gen M y la terminación 5' del gen N y en el cual se introdujo un sitio de restricción EcoRV entre el gen M y IGS justo en la dirección ascendente del gen N. Para generar este fragmento PCR, el cebador exterior 1C (5 '' GTGTATAGATATGAAAGGTACCGTG-3 ') , que corresponde a la región del gen M que contiene el sitio único pnl, y el cebador exterior 1097 (5 ' -CGAACCAGATCGGCTAGCAG-3'), que corresponde a la región del gen N que contiene el sitio único Nhel, se usaron. El cebador 1095 (5'-AGATTAGATATCGGCTAGCAG- 3 ' ) y el cebador 1096 (5'-GAACCTAAGATATCTAATCTAAACTTTAAGGATG-3 ' ) se usaron como cebadores interiores. Corresponden a la secuencia entre el gen M y el gen N e introducen el sitio de restricción EcoRV. El producto PCR resultante se clonó en un pGEM-T easy (Promega) produciendo el vector pXH0302. Como paso siguiente en la construcción de pXHSM45N, se trató el pMH54 con las enzimas de restricción Sse8387I y EcoRV y el fragmento 9 resultante se clonó en el sitio EcoRV de pXH0302 después de truncarse por el tratamiento con polimerasa de ADN T4 , produciendo el vector pXH0902. Después de extirpar el fragmento Sse83877I-EcoRV de pMH54, también se truncó el vector restante con el tratamiento con polimerasa de ADN T4, y se volvió a ligar resultando en el plásmido pXH1401. Finalmente, se trató el plásmido pXH0902 con enzimas de restricción Nhel y BssHII y el fragmento resultante se clonó en pXH1401 tratado con las misma enzimas, produciendo pXHSM45N. Para la construcción de pXHMSmN, primero se retiraron los ORFs 4, 5 y M de pMH54 por restricción de este vector con enzimas Sse8387I y BssHII, seguido por el tratamiento con polimerasa de ADN T4 y la religación del vector restante, que produjo pXHG45M5' . Después, el fragmento resultante del tratamiento de pXH0302 con las enzimas Nhel y BssHII se clonó en pMH54 tratado con las mismas enzimas resultando en pXHMeN. Posteriormente, el fragmento obtenido después de la restricción de pXHMeN con EcoRV se clonó en pXH1802 (arriba descrito) , que se digirió con HindIII y se trató con el fragmento Klenow de la polimerasa I del ADN producido pXH0305B. El fragmento obtenido por la restricción de pMH54 con las enzimas MluI y EcoRV se clonó en pB59 (2) tratado con las misma enzimas lo cual resultó en el vector pXH2801. Después el fragmento resultante del tratamiento de pXH2801 con las enzimas de restricción Kpnl y PstI se trató con polimerasa de ADN T4 y se clonó en pXH1802 tratado con la enzima de restricción HindIII y el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN produciendo pXH0806. Posteriormente, el fragmento obtenido por digestión de pXH0305B con Spel y AflII se clonó en pXH0806 tratado con las mismas enzimas resultando en pXH1506. Finalmente, se obtuvo pXHSmN al clonar el fragmento que resulta de la restricción de pXH1506 con RsrII y Avrll en pXHD45M5' tratado con las mismas enzimas. Para la construcción del vector de transcripción pXHlb S, se restringió el vector pXHMeN con EcoRV. El fragmento resultante se separó y el vector se volvió a ligar produciendo pXHDM. A continuación, el fragmento obtenido por la digestión de pXH0305B con RsrII y Avrll se clonó en pXHPM tratado con las mismas enzimas produciendo pXHlbMS . Todos los constructor se confirmaron por análisis de restricción y/o secuencia. Se detallan esquemáticamente en la Figura 5 (izquierda) . Todas las nuevas uniones generadas incluyendo la introducción del sitio Sse8387I del sitio descendente del gen S en pMH54 (7) , se indican con flechas, mientras que su secuencia se muestra en la Tabla 1. Se generaron los virus recombinantes por recombinación de ARN-ARN entre los transcriptos de corrida del vector de transcripción y el genoma fMHV como se describe arriba. Después de 2 rondas de purificación de placas en las células LR7 , se analizaron los virus por PCR de y transcriptasa reversa sobre ARN genómico y se encontró que contiene los genomas con la organización esperada. Conclusión : El orden estricto de genes de los coronavirus no es un prerrequisito esencial para la viabilidad .

I.2.b. Síntesis de ARN por mutantes MHV con un orden de genes reconfigurado Obj etivo : Confirmar los patrones de los ARN sintetizados en células infectadas por los virus mutantes. Procedimiento : Las células 17C11 infectadas se etiquetaron metabólicamente con [ 3P] ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se describe (4, 10). Se desnaturalizaron muestras del ARN citoplásmico total purificado usando el reactivo Ultraspec (Biotecx) , con formaldehído y formamida, separado por electroforesis a través de agarosa al 1% que contiene formaldehído y visualizado por fluorografía (Figura 26A) . Resultado : Los coronavirus expresan su genoma por medio de la generación de un conjunto alojado en la co-terminal 3' de los ARN sg . Los virus recombinantes con una organización reconfigurada de genoma por lo tanto se predice que sintetizan los patrones del ARN viral que son distintamente diferentes de aquel del virus precursor. Para el virus de tipo silvestre reconstruido (MHV-WT) y para MHV-D2aHE, los patrones del ARN y las cantidades de las especies genómicas (g) y del ARN sg parecían ser similares con aquellas previamente observadas (Figura 3). Observar que MHV-D2aHE así como sus derivados MHV-MSmN y MHV-lbMS, no sintetizan la especie de ARN sg que codifica la proteína 2a. para los mutantes MHV con los genomas reconfigurados, todos los ARN sg variantes tuvieron modalidades que correspondieron con sus tamaños predichos (Figura 26A y Tabla 4) , y no se observaron especies adicionales obvias. MHV-SM45N creció muy pobremente y por lo tanto se etiquetó solamente de manera débil . Todos los ARN sg se pueden detectar excepto aquel a partir del cual se debe traducir la proteína M. La baja abundancia de este ARN sg, la razón del cual es desconocida, es probable que sea la causa del crecimiento afectado de este virus . En general , los patrones de los ARN virales sintetizados por las células infectadas por los virus recombinante, satisfactoriamente reflejan los cambios hechos a la organización del genoma del coronavirus . Conclusión : Los resultados confirman los genotipos de los virus recombinantes y demuestran sus fenotipos esperados al nivel del ARN.

X.2. C . Fenotipo de Crecimiento de Cultivo de Tejidos Obj etivo : Comparar los fenotipos de crecimiento in vi tro de los virus imitantes. Procedimiento y Resultados: Las monocapas de células LR7 confluentes que crecieron en placas 35-mm se infectaron con cada virus recom inante (8 PFU/célula) y se determinó la infectividad viral en medios de cultivos en tiempos diferentes posteriores a la infección por titulación en células LR7. Los valores TCID50 se calcularon y se graficaron (Figura 6) . Todos los virus excepto el mutante MHV-SM45N se analizaron de esta manera. La concentración infecciosa de este último virus fue demasiado baja (aproximadamente 1000 veces más baja que el WT recombinante MHV) para efectuar una curva de crecimiento de una etapa. Aunque los MHV-lbMs parecían inducir los sincitios de alguna manera más lenta que el WT recombinante, todos los virus replicaron aproximadamente al mismo grado en una curva de crecimiento de una etapa. Conclusión : Excepto por el virus mutante MHV-SM45N, la reconfiguración de genes no tuvo un efecto dramático en sus características de crecimiento in vi tro.

I.2.d. Replicación de los virus recomblnantes en ratones Obj etivo : Establecer si los virus con un orden de genes reconfigurado pudieron replicarse en ratones. Procedimiento y Resultados: Ratones BALB/c hembra negativos al MHV de ocho semanas de edad se usaron en este experimento. Se diluyeron los virus en PBS y un volumen total de 100 µ? (106 TCID50) se usó para la inyección en la cavidad peritoneal . Se inocularon cuatro animales por virus. Se sacrificaron loa ratones y se separaron los hígados del día 4 después de la infección. Los hígados se colocaron en 1.5 mi DMEM, se pesaron y luego se congelaron a -80DC hasta que se concentraron para el virus. Las concentraciones de virus se determinaron por ensayo de placas en monocapas de células LR7 siguiendo la homogeneización de los órganos. Se estudió la replicación de HV-WT, MHV-D2aHE y MHV-WT en su hospedador natural el ratón. Aunque la dosis letal al 50% de MHV-WT en ratones se determinó previamente a 2.7xl04PFU, el MHV-Q aHE no fue lo suficientemente virulento para una determinación de un valor de dosis letal del 50% (sección I.l.e). Por lo tanto, se decidió analizar la replicación in vivo de los virus recombinantes . Los ratones inoculados intraperitonealmente con lxl0eTCID se les aplicó la eutanasia el día 4 posterior a la infección y se determinó la replicación viral en el hígado. Los resultados se muestran en Figura 26B. MHV-D2aHE y MHV-MSmN se replicaron en el hígado hasta un grado similar aunque mucho más lento que MHV-WT. La eliminación de ORFs 2a y HE generó un virus recombinante (MHV-D2aHE) que se atenuó en el hospedador natural como se muestra en la sección I.l.e aunque la reconfiguración adicional del orden de genes del coronavirus (MHV-MSmN) no resultó en un fenotipo más atenuado en este ensayo. Conclusión : Los virus con un orden de genes reconfigurado, que carecen de la organización típica del genoma del coronavirus y los virus que carecen de ORFs 2a y HE pueden replicarse en su hospedador natural el ratón. 1.3. Generación de virus recombinantes que expresan genes externos Obj etivo : Establecer si se pueden insertar los genes externos en posiciones diferentes en el genoma viral, ya sea como un gen adicional o reemplazando los genes no esenciales eliminados o en combinación con un orden de genes reconfigurados , establecer si estos genes se expresan y si se mantiene establemente y durante el paso in vi tro del virus. 1.3. a. Construcción de los virus recombinantes que llevan genes reporteros Objetivo : Generar virus MHV-A59 con inserciones de genes externos . Procedimiento : Se construyeron diversos virus que contienen un gen reportero externo en su genoma en posiciones diferentes (ver Figura 7A) . Se usaron dos genes reporteros, que codifican la luciferasa de renilla (RL) y la luciferasa de la luciérnaga (FL) . Para ambos genes se construyó un plásmido en el cual se antecede el gen por la secuencia intergénica MHV (IGS) . A partir de este constructo el cásete de expresión (gene más IGS) luego se puede transferir en vectores de transcripción diferentes. Como una primera etapa, el MHV el IGS se clonó enfrente del gen RL. Hasta este punto el cebador 1286 ( 5 ' -GGATACTAATCTAAACTTTAG- 3 ' ) y 1287 (5'-CTAGCTAAAGTTTAGATTAGATATGGTGCA-3 ' ) se combinó en sus pares base uno con el otro y se clonó en pRL-null (Promega) tratado con Nhel y PstI, resultando en pXH1909. Para la construcción del vector de transcripción que contiene el gen RL entre los genes 2a y S (pXH22aRLS) se tomaron las siguientes etapas. Se restringió el vector p96 (1) con HindIII y MluI y el fragmento resultante se clonó en pXH1802 (antes descrito) tratado con HindII y BssHII, produciendo pXH2103. Después, se separó el cásete de expresión RL de pXH1909 por la restricción con EcoRV y Xbal, tratado con el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN y se clonó en pXH2103 digerido con HindIII y tratado con el fragmento Klenow resultando en pXH2509A. Finalmente, pXH22aRLS se construyó por la clonación del fragmento que resulta de la digestión de pXH2509A con Rsrll y Avrll en pMH54 tratado con las mismas enzimas. Para la construcción de pXH2ERLM el mismo cásete de expresión se usó para hacer pXH2509A se clonó en pMH54 digerido con EcoRV. Se clonó también el mismo cásete de expresión pXHMeN (antes descrito) tratado con EcoRV produciendo pXH2ERLN. Posteriormente se construyó pXH2MRL por la clonación del fragmento que resulta de la restricción de pXHMeN con EcoRV en pXH2ERLN tratado con la misma enzima. PXHMSmNRL se construyó por la clonación del cásete de expresión de renilla en pXHMSmN (anters descrito) tratado con EcoRV. Para la construcción de pXHEFLM, el gen FL se clonó primero detrás del mismo IGS como se usó para el cásete de expresión RL. Hasta este punto, se separó el gen de luciferaga de pSP-Luc+ (Promega) por la restricción con Avrll y Xbal y se clonó dentro de pXH1909 tratado con Nhel y Xbal, produciendo pXH2711. Posteriormente el cásete de expresión FL se cortó de pXH2711 por restricción con EcoRV y Xbal, tratado con el fragmento Klenow de la poli erasa I de ADN y se clonó en pMH54 restringido por EcoRV resultando en pXHEFLM. Se construyó el plásmido pXHminFL al clonar el cásete de expresión FL dentro de pXHmin (antes descrito) diferido con EcoRV. Este plásmido carece de ORFs 2a/HE/4a/4b/5a y contiene el gen FL entre los genes E y M. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y de secuencias, se generaron los virus recombinantes por recombinación de AR -ARN entre los transcritos de corrida del vector de transcripción y el genoma fMHV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirmaron genéticamente por el análisis RT-PCR. Los resultados de los virus recombinantes que contienen el gen RL se muestran en Figura 7B y 27. Para confirmar la inserción de este gen se efectuó una etapa RT en el AR genómico con el cebador 1412 (5 ' -CTGCGGACCAGTTATCATC-3 ' ) , que es complementario para la terminación 5' del gen RL. Posteriormente, se efectuó un PCR con el cebador 1091 (5'-GTTACAAACCTGAATCTCATCTTAATTCTGGTCG-3 ' ) y el cebador 1413 (5'-CATCCGTTTCCTTTGTTCTGG-3 ' ) para MHV-ERLM y MHV-MRLN o con el cebador 1173 (5 ' -GACTTAGTCCTCTCCTTGATTG3 ' ) y el cebador 1413 para MHV-2aRLS. El cebador 1091 y el cebador 1173 corresponden a la terminación 3' del gen ab y el gen Ib respectivamente mientras que el cebador 1413 corresponde con la terminación 5' del gen RL. Como con los controles positivos, se tomaron los vectores de transcripción adecuados. En todos los casos, se obtuvieron fragmentos PCR del mismo tamaño que los controles positivos mientras que el control de agua fue negativo. Los tamaños de fragmentos observados (y predichos) fueron de aproximadamente 1,000 pares base para MHV-2aRLS, aproximadamente 670 pares base para MHV-ERLM, y aproximadamente 1,300 pares base para MHV-MRLN (7B) . Para MHV-MSmNRL se efectuó un PCR con el cebador 1091 y el cebador 1413 y con el cebador 1173 y el cebador 1413. Como controles positivos, se tomó el vector de transcripción adecuado. En todos los casos los fragmentos PCR se obtuvieron del mismo tamaño que los controles positivos. Los tamaños de fragmento observados (y predichos) fueron de aproximadamen e 670 pares base para la reacción PCR con los cebadores 1091 y 1413, y aproximadamente 1,200 pares base para la reacción PCR con los cebadores 1173 y 1413 (7B) (observar que en la Figura 7B y 27 para cada tipo de virus 2 independientemente obtenido se analizaron e incluyeron los clones virales) . Loa resultados confirman la inserción del gen RL dentro del genoma MHV en la posición correcta. Los resultados de los virus recombinantes que contienen el gen FL se muestran en la Figura 28. Para confirmar la inserción de este gen en la etapa RT se efectúa en el ARN genómico con el cebador 1475 (5 ' -GCCTAATGCAGTTGCTCTCC-3 ' ) , que es complementario a la terminación 5' del gen FL. Posteriormente se efectuó un PCR con el cebador 935 (5'-GTTTTAGCACAGGGTGTGGCTCATG-3' ) , que corresponde con la terminación 3' del gen S y el cebador 1474 (5'-CCATCTTCCAGCGGATAG-3 ' ) , que corresponde con la terminación 5' del gen FL. Como controles positivos, se tomaron los vectores de transcripción adecuados. En todos los casos, se obtuvieron fragmentos por PCR del mismo tamaño que los controles positivos, mientras que el control de agua fue negativo. Los tamaños de fragmentos observados (y predichos) fueron de aproximadamente 1,200 pares base para MHV-EFLM y aproximadamente 500 pares base para MHV-minFL (observar que en la Figura 28 para cada tipo de clones virales obtenidos independientemente del virus 2 se analizaron e incluyeron) .

Conclusión : Inserción de módulos genéticos dentro del genoma coronaviral es tolerada en todas las posiciones probadas, todos los virus pretendidos fueron viables.

I.3.b Síntesis de ARN por virus recombinantes Obj etivo : Confirmar los patrones de los ARN sintetizados en células infectadas por los virus mutantes . Procedimiento : Las células infectadas 17C11 se etiquetaron metabólicamente con [33P] ortofosfato en presencia de actinomicina D esencialmente como se describe (4, 10) . Las muestras del ARN citoplásmico total purificada usando el reactivo Ultraspec (Biotecx) , se desnaturalizaron con formaldehído y formamida, se separaron por electroforesis a través de agarosa al 1% conteniendo formaldehído y se visualizaron por fluorografía (Figura 29-31; observar que las especies de ARN subgenómicas en esta figura se designan por su composición más que como ARN2 hasta ARN7, ya que las designaciones numéricas serían ambiguas para los mutantes) . Resultado : Para todos los mutantes MHV con los genes de luciferasa, todos los ARN sg variantes tuvieron movilidades que correspondieron con sus tamaños predichos (Figura 29-31) . Para los virus que contienen el gen de luciferasa de renilla no se observaron especies adicionales obvias. Para los virus que contienen el gen de la luciferasa de la luciérnaga, se observaron dos especies adicionales de ARN que corresponden en tamaño con la transcripción de sgRNA de las secuencias del gen de la luciferasa de la luciérnaga que son similares a MHV IGS. En general, los patrones de los ARN virales sintetizados por las células infectadas con los virus de recom inantes , reflejan satisfactoriamente la inserción de los caaetes de expresión dentro del genoma del coronavirus. Conclusión : Los resultados confirman los genotipos de los virus recombinantes y demuestran sus fenotipos esperados al nivel del ARN.

I.3.C. Replicación de los virus que expresan la luciferasa de la luciérnaga o de ranilla. Ob etivo : Comparar las características de crecimiento de los virus con el virus de tipo silvestre y uno con el otro. Procedimiento y resultados : Después de 2 rondas de reservas del virus de purificación de placas se prepararon, se titularon y se usaron para infección alta m.o.i. (m.o.i de 8) de células LR7 después de lo cual se observaron las infectividades virales en los medios de cultivo. Los resultados se representan por las curvas de crecimiento que se muestran en la figura 8A y 8B, y por los resultados que se muestran en la figura 32. Del MHV-EFML , se analizaron dos clones virales, obtenidos independientemente del experimento de recombinación descrito bajo 1.3. a. En la figura 32 los valores TCID50 obtenidos 8-9 horas después de la infección se muestran. Obviamente las características de crecimiento de los virus recombinantes que se muestran en la figura 8A y 8B son esencialmente indistinguibles, todos loa virus crecieron hasta concentraciones que fueron comparables con aquellas del virus recombinante de tipo silvestre. MHV-MSmN L alcanzó concentraciones de alguna forma inferiores (figura 32). Conclusión : Los casetes de expresión insertados difícilmente afectan las características de crecimiento in vitro de los virus recombinantes.

I.3.d. Expresión de la luciferasa de luciérnaga y de ranilla en el cultivo de células Obj etivo : Establecer si fueron funcionales los caaetes de expresión insertados. Procedimiento y resultados: Los cultivos de monocapa confluentes de las células LR7 se infectaron a un m. o. i. de 8 y la producción de la actividad de luciferasa en la célula se observó con el tiempo. La expresión LR en las células se midió al usar el sistema de ensayo reportero dual de luciferasa (Promega) según las instrucciones del fabricante. Similarmente, se midió la expresión FL al usar el sistema de ensayo de luciferasa (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la actividad RL y FL en unidades relativas de luz (RLU) usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500 o Turner Designs Modelo TD-20/20) .

Los resultados se muestran gráficamente en la figura 9A, 9B y 33. Todos los virus recombinantes excepto por el virus de tipo silvestre recombinante expresaron altos niveles de luciferasa, indicando que los casetes del gen de luciferasa de la luciérnaga y de la renilla fueron funcionales en cada posición genómica probada. Para la mayoría de los virus, se alcanzó el nivel más elevado de expresión 9 horas después de la infección. El nivel de expresión de la luciferasa de la luciérnaga en este punto de tiempo se determinó como 1.6 ug/lOe células. MHV-minFL expresaron niveles de la actividad de luciferasa que fueron comparables con aquellos producidos por los otros virus recombinantes que contienen el gen FL, mientras que la expresión del gen de luciferasa de renilla en células infectadas con MHV-MSmNRL fue aproximadamente 10 veces inferior que en las células infectadas con MHV-ERLM. Esta diferencia corresponde con la diferencia encontrada en la replicación entre MHV-MSmNRL y MHV-ERML. Conclusión : Los genes externos se pueden expresar por los corona virus por la inserción adicional de tal gen al usar un espacio genético creado por la eliminación de genes no esenciales, o en combinación con una organización de genoma reconfigurada .

I.3.e. Mantenimiento de genes externos durante el paso viral Obj etivo : Evaluar la estabilidad de los genes de luciferasa insertados durante el paso viral . Procedimiento y resultados: Los virus recombinantes MHV-ERLM y MHV-EFLM se pasaron 8 veces sobre células LR7 a un bajo m.o.i (<0.05) . Después de cada paso, la infectividad viral (TCID50) en el medio de cultivo se determinó 9 horas después la infección. Posteriormente, la actividad de la luciferasa de renilla y de luciérnaga se determinó en un experimento de expresión en paralelo (m.o.i-5) 8 horas después de la infección (fig. 10) . Ambos MHV-ERML y MHV-EFML, 2 clones obtenidos independientemente A y B se analizaron. Aunque la expresión de la luciferasa de renilla fue consistentemente estable por al menos 8 pasos, aquella de la luciferasa de luciérnaga fue estable solamente por 5 pasos. Después del paso 5 de MHV-EFLM, disminuyó ampliamente el nivel de expresión para ambos clones independientes. Después de 8 pasos se aislaron 10 clones virales por ensayo de placas, ambos de MHV-ERLM y de MHV-EFML y se probaron para la expresión de luciferasa. Aunque para MHV-ERLM todos los 10 clones fueron positivos, 9 de los clones MHV-EFML ya no mostraron una expresión de luciferasa claramente detectable. Conclusión : Un gen externo se puede mantener establemente en el genoma coronaviral por al menos 8 pasos in vitro .

I.3.f. Expresión de la luciferasa de la luciérnaga en ratones Objetivo: Establecer si el gen insertado de luciferasa ae expresa en el hoapedador natural del ratón. Procedimiento y resultados: Ratones BALB/c hembra negativos, al MHV de 8 semanas de edad, se usaron en el experimento. Se inocularon intranasalmente los ratones con 106TCID50MHV-EFLM. Se usaron 4 animales por virus. Se sacrificaron los ratones y se separaron los hígados y cerebros en el cuarto día después de la infección. Se congelaron rápidamente los órganos en nitrógeno líquido y se homogeneizaron en un reactivo de lisis de cultivo de células suministrado con el sistema de ensayo de luciferasa (Promega) . Se midió del actividad FL de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500) . Claramente como se usa en la figura 34, se pueden detectar la actividad luciferasa en el hígado y el cerebro. Como una forma alternativa para evaluar si el gen externo también se expresan in vivo, esto es, en animales, se inoculo un ratón intraperitonealmente con 106TCID5CMHV-EFLM . Cuatros días después se sedó el ratón y se administró subcutáneamente la luciferina. Se evaluó la expresión de luciferasa 5 minutos después en tiempo real grabando la emisión de luz del cuerpo del ratón cesado usando una pantalla sensible acoplada a una cámara CCD. La luz que salía del área del hígado del ratón se observó claramente.

Conclusión : Se puede expresar un gen externo por el coronavirus en su hospedador natural .

I.3.g. Generación de MHV que expresa dos genes externos de una genoma Obj etivo : Establecer si dos genes externos se pueden expresar a partir de una genoma sencillo. Procedimiento y resultados: pXH2aRLSEFLM se generó por clonación del cásete de expresión FL en pXH2aRLs digerido con EcoRV. Después de la confirmación del constructo por una análisis de restricción y secuencia, se generaron los virus recombinantes por la recombinación ARN-ARN entre los transcritos de corrida del vector de transcripción y el genoma fMHV como se describe arriba. El virus resultante HV-RLFL, se confirma genéticamente por análisis RT-PCR. La actividad de la luciferasa de renilla y la actividad de la luciferasa de luciérnaga se pueden detectar en placas individuales. Después de la generación de una reserva de alta concentración, los cultivos de monocapa confluentes de células LR7 se infectaron a una m.o.i. de 8 y se observó la producción de la actividad de luciferasa en las células por el tiempo. La expresión RL en las células se midió al usar el sistema de ensayo de renilla (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Símilarmente, se midió la expresión FL al usar el sistema de ensayo de luciferasa (Promega) según las instrucciones del fabricante 8 horas después de la infección. Se midió la actividad RL y FL en unidades de luz relativas (RLU) usando un luminómetro (Luraac Biocounter M2500) . Los resultados muestran que MHV-RLFL se replica al mismo grado como MHV-2aRLS y MHVEFLM (Fig. 46A) . MHV-RLFL expresó la luciferaaa de renilla y la luciferasa de luciérnaga. MHV-2aRLS expresó solamente la luciferasa de renilla mientras que MHV-EFLM expresó solamente la luciferasa de luciérnaga (Fig. 46B) . Conclusión: Se pueden expresar dos genes externos a partir de un genoma sencillo de corona virus.

I.3.h. Generación de MHV que expresa un gen GFP de pico quimérico Obj etivo : Establecer si el MHV recombinante se puede generar que exprese o incorpore proteínas GFP de espícula quimérica . Procedimiento y resultados : El gen GFP se clonó en la estructura con el gen S en pMH54. Después de la confirmación del constructo por un análisis de restricción de secuencias, se generaron los virus recombinantes por recombinación de A N-ARN entre los transcriptos de la corrida del vector de transcripción y el genoma fMHV como se describe arriba. El virus resultante MHV-SGFP, se confirmó genéticamente por una análisis RT-PCR. Se analizaron microscópicamente las placas y se mostró que expresan GFP como es evidente de la fluorescencia verde. El análisis de inmunoprecipitación indica que las proteínas híbridas se generaron que se pueden precipitar con anticuerpos específicos para MHV-S y GFP. Conclusión : Se puede generar el MHV que exprese un gen quimérico S-GFP en lugar de un gen S de tipo silvestre. El virus mutante es viable y se puede propagar en cultivo celular indicando que estas proteínas híbridas se incorporan en la partícula viral. 1.4. Inhibición de la infección y de la fusión celular por un péptido derivado de proteína de eapícula Objetivo general: Inhibir la infección coronaviral y la distribución de una infección que comienza al interferir con la fusión de la membrana usando péptidos. Objetivo especifico: Producir un péptido que constituye una secuencia derivada de la región de repetición en grupos de siete próxima de membrana (HR2) de la proteína MHV-A59 S y demostrar su efecto inhibidor en la entrada de MHV-A59 en las células LR7 y sobre la fusión célula-célula en un cultivo infectado de esta célula. Procedimientos : a. Construcciones de plásmidos: Un fragmento PCR de un plásmido de plantilla pTUMS (13) que contiene el gen de espícula MHV-A59 se obtuvo, que corresponde a los residuos de aminoácidos 1216-1254 (HR2) de la proteína S (Fig. 20) el cebador delantero usado fue: 5'-GCGGATCCATCGAAGGTCGTGATTTATCTCTCGATTTC 3 ' . Este cebador introdujo un sitio en la dirección ascendente BamHI y una secuencia que codifica un sitio de desdoblamiento del factor Xa inmediatamente en la dirección descendente del sitio BamHI dentro del fragmento amplificado. El cebador inverso (5' CGAATTCATTCCTTAGGTTGATGTAG 3') contiene una sitio EcoRI en la dirección descendente así como un codón de detención que precede al sitio EcoRI . Se clonó el fragmento con PCR dentro del sitio BamHi-EcoRI del vector de expresión bacteriana pGEX-2T. b. Expresión y purificación de la proteína bacteriana: Células BL21 recientemente transformadas (NOVAGEN) se hicieron crecer en un medio 2YT hasta la fase log (OD600 de 1.0) y se indujo la expresión posteriormente al agregar IPTG (GibcoBRL) hasta una concentración final de 0.4 mM. Dos horas después del comienzo de la inducción se peletizaron las células, se volvieron a suspender en 1/25 de volumen de cultivo 10 mM Tris pH (8.0), 10 mM EDTA, 1 mM PMSF y se sonicaron sobre hielo (5 veces por 2 minutos con intervalos de 1 minuto). Se centrifugaron los lisados de célula a 20,000 x 60 minutos a 4°C. Luego se agregaron 2 mi de glutatión-sefarosa 4B (50% p/p en PBS) por 50 m de sobrenadante y se incubó la suspensión durante la noche (O/M) a 4°C bajo rotación. Se lavaron 3 veces las perlas con 50 mi PBS y se volvieron a suspender en un volumen final de 1 mi PBS. Se desdoblaron los péptidos de la porción GST sobre las perlas usando 20U de trombina por incubación por 4 horas a temperatura ambiente (RT) . Los péptidos en el sobrenadante se purificaron por CLAR Bobre una columna de fenilo con un gradiente lineal de acetonitrilo que contiene ácido trifluoroacético al 0.1%. Las fracciones que contiene péptido se secaron al vacío O/N y se disolvieron en agua. Se determinó la concentración del péptido al medir la absorbanc a a A280 nm o por análisis de proteína BCA (Micro BCA™ Assay Kit, PIERCE) . c. Ensayos de inhibición de fusión célula-célula y entrada célula-virus : La potencia del péptido HR2 en la inhibición de la infección viral se determinó usando el MHV-EFLM recombinante que expresa la luciferasa de luciérnaga. Las monocapas confluentes de las células LR7 en placas de 96 pozos se inocularon a 37°C en DMEM a una multiplicidad de 5 por 1 hora en presencia de concentraciones variables de péptidos que van desde 0.4 - 50 µ?. Después de 1 hora, se lavaron las células con DMEM y se reemplazó el medio por DMEM libre de péptido. 5 horas después de la infección, se lisaron las células por 15 minutos a temperatura ambiente en 50 µ? de solución amortiguadora de lisis según el protocolo del fabricante (Sistema de ensayo de luciferasa, Progema) . Al mezclar 10 µ? de liaado de células y 40 µ? de substrato, se midió inmediatamente la actividad de luciferasa usando un betaluminómetro Wallac. La concentración inhibidora efectiva 50% (ECS0 valor) se calculó al ajustar los datos de inhibición a una ecuación de enlace de equilibrio: % de actividad luciferasa = 100/ (1+ (C/EC50) . La capacidad del péptido HR2 para inhibir la fusión célula-célula mediada por la espicula se determinó usando un ensayo de placas . Las monoplacas de las células LR7 en 6 placas de pozos se inocularon contra 50 PFU de MHV-A59 en DMEM a 37°C. Después de 1 hora de lavaron las células con DMEM y se agregó a una sobrecapa de agar que contiene el péptido HR2 a concentraciones de 50, 10, 2, 0.4 y 0.08 µ?. Se contaron las placas a 48 h p.i., después de teñir y fijar con formaldehído al 0.9%/violeta de cristal 0.75%. Resultados : La potencia del péptido HR2 para inhibir la entrada de virus se probó usando un virus que expresa un gen reportero de luciferasa ya que esto permite una detección extremadamente sensible de la infección. Se efectuaron las inoculaciones de las células con el virus en presencia de concentraciones diferentes del péptido HR2. Después de 1 hora de inoculación, se lavaron e incubaron las células además del medio de cultivo en ausencia del péptido. A 4 horas p.i., antes de la formación del aincitio que tiene lugar normalmente, se lisaron y probaron las células para la actividad de la luciferasa (Fig. 11) . En esta figura, la actividad normalizada de luciferasa que representa el éxito de la infección, se graficó contra la concentración de péptido presente durante la inoculación. El péptido HR2 bloqueó la entrada viral muy eficientemente, la infección se inhibió virtualmente por completo a una concentración de 50µ?. La concentración efectiva (EC50) a la cual el 50% de la infección viral se inhibió fue 0.15µ . Se examinó la capacidad del péptido H 2 para inhibir la fusión célula-célula mediada por la proteína de espícula al usar un ensayo de placa. Después de la inoculación de (cultivos paralelos) células en ausencia de un péptido, se aplicó una sobrecapa que contiene concentraciones diferentes del péptido HR2. La formación de placas parece estar completamente eliminada en presencia de concentraciones de péptidos 2 de hasta 0.4µ? (Figura 12). A 0.08uM del péptido HR2 solamente se pudieron observar en placas tenues . Se demostró la especificidad de la inhibición en todos estos ensayos al probar en paralelo el efecto de otros péptidos preparados idénticamente y usados en las mismas concentraciones incluyendo por ejemplo el péptido que corresponde a los aminoácidos 1003-1048 de la proteína HV-A59 (que se muestra como "péptido de control" en la Figura 11). Solamente fue efectivo el péptido HR2.

Conclusión : El péptido HR2 es un inhibidor potente de la entrada de virus en la célula y de la fusión célula-célula mediada por la espícula MHV-A59.

II. Virus de peritonitis infecciosa de felinos (PIPV) cepa 79-1146 II.1. Generación de mFIPV, un coronavirue felino que crece en células de murina Objetivo general: Establecer un sistema de recombinación de ARN dirigido para el coronavirus felino FIPV 79-1146 similar a aquel antes descrito para la manipulación genética del coronavirus murino MHV-A59. Objetivo Especifico: Generar mFIPV un derivado FIPV en el cual el ectodominio de la proteína de espícula se ha reemplazado genéticamente por aquel de la proteína MHV-A59 con lo cual se cambia el tropismo de virua quimérico a murina en lugar de células felinas.

I.l.a. Construcción de un vector de transcripción de ARN sintético Obj etivo : Preparar un constructo de plásmido a partir del cual un ARN y un donador sintético se pueda transcribir para dirigir la recombinación de ARN y que consiste de secuencias derivadas de la terminación 5 'del genoma FIPV fusionado a las secuencias derivadas de la parte 3' del genoma viral, esto es todas las secuencias en la dirección descendente de (y que incluye) el extremo terminal 3' de 0 F1B. También: preparar un derivado de este plásmido en el cual la secuencia que codifica el ectodominio de espícula ha sido reemplazada por aquella que codifica el dominio correspondiente de la proteína de espícula MHV-A59. Procedimiento y resultados: Usando las técnicas de clonación de ADN estándar, el vector pBRDIl se construyó que contiene una copia de ADNc de las 702 bases más hacia 5' ligadas a las 9.262 bases más a 3' del genoma FIPV 79-1146 (Figura 13A) . Se hizo la ligación en una forma tal que el fragmento del gen O F 1A (pol 1A) se fusionó en la estructura en su terminación 3' y en la terminación 5' del fragmento del gen ORF IB (pol IB) (Figura 14B) . Adicionalmente , en este punto se introdujo un sitio de restricción SacI (Figura 14B) . La secuencia del coronavirus felino se colocó bajo el control de una secuencia del promotor de polimerasa T7 del bacteriófago seguido por un triple G (Figura 14A) para impulsar una transcripción de ARN eficiente in vítro usando la polimerasa T7. En la terminación 3' se finalizó la secuencia por un extremo polyA de 15 A's seguido por un sitio de restricción único iVotl (Figura 14C) para facilitar la transcripción de corrida. La secuencia del promotor T7 está precedida por un sitio de restricción único Xhol (Figura 14A) tal que el ADNc del coronavirua felino se puede clonar como un fragmento de restricción Xhol-Notl de 10.015 dentro del vector del respaldo pBRXN (11) resultando en pBRDIl (Figura 13A) . El plásmido pBRDIl se usó posteriormente para preparar pBRDI2 en el cual se reemplazó el gen FIPV S por un gen de espícula quimérico (mS) compuesto de una parte que codifica el ectodominio de la proteína de espícula MHV y una parte que codifica la transmembrana y el endodominio de la proteína de espícula FIPV. Para introducir este gen híbrido en pBRDIl, primero se fusionó la terminación 3' del gen felino pollB a la terminación 5' del gen de espícula murino (ver Figura 14D para la secuencia en las uniones) . Este producto de fusión se clono en pTMFS (12) como un fragmento Sacl-Stul resultando en pTMFSl (Figura 13B) . El gen híbrido luego se aisló de pTMFSl como un fragmento SacI-AlflI y se usó para reemplazar el gen de espícula FIPV de pBRDIl resultando en pBRDI2 (Figura 13B) . Las secuencias de pBRDIl y pBRDI2 se muestran en el agregado 1 y agregado 2 respectivamente.

Il.l.b. Generación del mFIPV por recombinación de ARN Obj etivo : Generar mFIPV, un derivado de FIPV dirigido a células murinas . Procedimiento y Resultados; Los transcritos de ARN del donador de corrida cerrados se sintetizaron del Notl linealizado, usando un kit de polimerasa de ARN T7 (Ambion) según las instrucciones del fabricante. Los transcriptos se introdujeron en células felinas FCWF (80 cm2 de matraz de cultivo) que 3e habían infectado antes con FIPV 79-1146 (m.o.i. de 1), por electroporación (aparato de electroporación pulsador de genes, Biorad 2 , pulsos consecutivos; 0.3 kV/960 microF) . Las células electroporadas se cocultivaron en un matraz de 25 cm2 con células murinas LR7 (50% de confluencia) para permitir la recombinación del ARN genómico y sintético (Fig. 15) . Después ed 24 h de incubación a 37°C, se pueden observar los sincitios masivos de las células murinas LR7 y de las células felinas FCWF. Los recombinantes candidato mFIPV se seleccionaron al descontar el sobrenadante de cultivo y pasar el virus por tres diluciones de punto final consecutivas en células LR7. El virus resultante no pudo infectar y provocar un efecto citopático en las células FCWF. Conclusión: Se obtuvo un virus con el tropismo ed célula murina pretendido. II.l.c. Análisis de proteínas mFIPV Objetivo: Confirmar la identidad de mFIPV al nivel de la síntesis de la proteína viral .· Procedimiento y Resultados: Las células murinas LR7 se infectaron con mFIPV y las proteínas se etiquetaron con aminoácidos 35S- etiquetados por 2h comenzando a 5h p.i. Como controles, se infectaron células LR7 y FCWF con MHV y FIPV respectivamente, y se etiquetaron similarmente de 5-7h p.i. Después del etiquetado, se prepararon lisados celulares y se efectuaron inmunoprecipitaciones en presencia de un detergente como se describe (12) . Se utilizaron los siguientes anticuerpos (para referencias, ver 12) : G73 (aFIPV) , un fluido de ascitos obtenido de un gato infectado con FIPV (proporcionado por H. Vennema) ; K134 ( MHV) , un suero de conejo formulado contra el MHV-A59 purificado; WA3.10 (aSm) , un Mab contra un epítopo presente en el ectodominio MHV-A59S; 23F4.5 (ocSf) , un Mab contra un epítopo en el ectodominio FIPV S. Las proteínas inmunoprecipitadas se tomaron en una solución amortiguadora de muestra de electroforeáis y se calentaron por 2 min a 95°C, excepto para una muestra de proteína (pista 4 en la fig. 16) , que se mantuvo a temperatura ambiente para evitar la agregación de la proteína MHV M. Se analizaron las proteínas por electroforesis en un gel de poliacrilamida SDS-12.5%. Los patronea electroforáticos se muestran en la Fig. 16. Como se esperaba, los anticuerpos anti-FIPV precipitaron las proteínas FIPV S, M y N del lisado de las células infectadas con FIPV (pista 10) , pero ninguna de las proteínas MHV del lisado de las células infectadas con MHV (pista 1). El 23F4.5 Mab precipitó el felino S de FIPV (pista 11) pero no el murino S de MHV (pista 2) , como se esperaba. También el suero anti-MHV precipitó las proteínas MHV S, N y M (pista 3 y 4) pero no las proteínas FIPV (pista 12), y el A3.10 Mab precipitó la proteína MHV S (pista 5) pero no la proteína FIPV S (pista 13) . Cuando se observan las proteínas precipitadas de los lieados de células infectadas con mFIPV, está claro que el suero anti-FIPV G73 precipita las proteínas M y N, pero no la proteína S (pista 6) . La proteína S tampoco se precipitó por el 23F4.5 Mab (pista 7) . La proteína mFIPV S se precipitó sin embargo por el suero anti-MHV (pista 8) así como por el Mab WA3.10 (pista 9) . Conclusión: Las células infectadas por mFIPV, expresan las proteínas virales predichas, particularmente la proteína S híbrida con el ectodominio derivado de MHV.

Il.l.d. Características de crecimiento de mFIPV Obj etivo : Comparar las concentraciones para mFIPV con aquellas para FIPV y MHV-A59. Procedimiento y Resultados: Los experimentos de titulación e infección revelaron que el virus recombinante mFIPV ya no pudo infectar las células FCWF felinas , pero creció eficientemente en las células murinas LR7, mostrando características de crecimiento similares como MHV-A59. Esto se demuestra por ejemplo, por una comparación de sus curvas de crecimiento en una etapa en estas células mostradas en la Fig. 17. En este experimento, las células se infectaron con mFIPV y MHV-A59 (m.o.i de 5 cada una) después de lo cual se tomaron muestras del fluido de cultivo en diversos puntos de tiempo y se concentraron en células LR7 por dilución de punto final. También, loe mFIPV indujeron sincitios amplias y efectos citopáticos con la infección de estas células. Las reservas de mFIPV recombinante que crecieron en células LR7 alcanzaron concentraciones del mismo orden de magnitud que lo hizo FIPV en células FCWF (5.107 PFU/ml). Esto fue sin embargo, un orden de magnitud inferior al que se observó para MHV-A59 en células LR7. Conclusión : El reemplazo del ectodominio de la proteína de espícula resulta en un mFIPV recombinante que replica en sus células hospedadoras "nuevas" y aparentemente no pierde mucho de su aptitud biológica.

II.2. Generación de vacuna FIPV reducida viva por eliminaciones de genes Objetivo general: Eliminar secuencias de gen del genoma FIPV que no son esenciales para la replicación viral in vitro para obtener virus de eliminación que se reducen en animales felinos y por lo tanto son candidatos para vacunas (vector) virales .

II.2. a. Construcción de vectores de transcripción de ARN sintéticos Obj etivo : Construir los plásmidos para la síntesis de los transcritos de ARN donadores que carecen de loa genes 3ABC y/o 7AB para la recombinación dirigida con ARN mFIPV (Figura 18, parte superior). Procedimiento y Resultados: Las eliminaciones de los genes 3ABC y 7AB se introducen en el plásmido pBRDIl usando SOE-PCR. Para los cebadores usados, ver la Tabla 2 y la Figura 18, lado izquierdo. Para eliminar el grupo 3ABC, las combinaciones de los cebadores I y 4 y de 2 y 3 se usan para generar fragmentos de 375 bp (A) y 1012 bp (B) , respectivamente (Figura 18, lado izquierdo) . Los fragmentos A y B se fusionan usando el traslape entre ambos fragmentos a través de los cebadores 3 y 4 , y se amplifican usando los cebadores 1 y 2, lo que resulta en un fragmento de 1366 bp (C) . El fragmento C se digiere con AflII y SnaBI y se clona en pBRDIl digerido en AflII y SnaBI, lo que resulta en pBRDHA3ABC (Figura 18) . Para eliminar los genes 7AB, las combinaciones de los cebadores 5 y 8 y de los cebadores 6 y 7, se usan para generar fragmentos de 1215 bp (D) y de 324 bp (E) , respectivamente (Figura 18) . Los fragmentos D y E se fusionan usando el traslape entre ambos fragmentos a través de los cebadores 7 y 8, y se amplifican usando los cebadores 5 y 6 que resultan en un fragmento de 1524 bp (F) . El fragmento F se digiere con MluI y Notl y se clona en pBRDIl digerido con MluI y Notl, lo que resulta en pBRDHA7AB (Figura 18) . Lo incorrecto de las secuencias de los fragmentos C y F se confirma por secuenciado de ADN. Al constructo pBRDI 1?3??0+?7??( el fragmento Mlul/Notl del pBRDIlA7AB se introduce en el pBRDIlA3ABC digerido en Mlul/Notl (Figura 18) . Conclusión : Los constructos de ARN donadores derivados de pBRDIl, que carecen de los grupos de gen 3ABC y/o 7AB se obtienen .

II.2.b. Generaciones de genes que carecen de FIPVs recombinantea Objetivo: Generar los FIPVs recombinantes que carecen de las secuencias para los genes 3ABC, para los genes 7AB, y para ambos de estos grupos de genes. Procedimiento y Resultados: Se sintetizan transcritos donadores de escape, recubiertos, de los pBRDIl, pBRDIlASABC, pBRDIlA7AB y pBRDI1?3??0+?7?? , respectivamente, usando un kit de polimerasa de ARN T7 (Ambion) como se especifica por el fabricante. Los transcritos donadores se introducen en las células LR7 murinas (matraz de 80 era2) , que se ha infectado antes con mFIPV (m.o.i. de 0.4), por electroporación (aparato de electroporación de pulso de gen, Biorad, 2 pulsos consecutivos; 0.85 kV/50 microF) . Las células electroporadas se cocultivaron en un matraz de cultivo de 25cm2 con células FCWF de felino (50% de confluencia) . Después de 24 horas de incubación a 37 °C, podrá detectarse el sincitio masivo en las células LR7 murinas y las células FCWF de felino. Los virus de eliminación candidatos liberados en el sobrenadante de cultivo celular mezclado, se purificaron por dos rondas de purificación en placas en células FCWF. Conclusión : Los virus que han adquirido la capacidad de crecer en células FCWF de felino se obtienen del experimento de recombinación con mFIPV.

II.2. c. Análisis genético de genes que carecen de FIPVa recombinantes Obj etivo : Confirmar la reposición genética de los virus de eliminación supuestos. Procedimiento y Resultados: para evaluar cual de las eliminaciones pretendidos verdaderamente se presentan en los diferentes mutantes de eliminación FIPV, el RT-PCR en los ARN virales genómicos se realiza al enfocarse en la región 3ABC y 7AB. Los cebadores usados y los tamaños del ADN esperados, se indican en la Tabla 2 y la Figura 18 (lado derecho) . Los resultados de los análisis RT-PCT se muestran en la Figura 19. La Figura 19a revela que loa virus de tipo silvestre recombinantes (r-wtFIPV) y FIPVA7AB cada uno portan la región 3ABC aunque esta región es escasa en los virus FIPVA7AB y FIPVA3ABC+A7AB, como se juzga por los tamaños de los fragmentos amplificados. La Figura 19B demuestra que el r-wt-FIPV y FIPVA3ABC todavía portan la región 7AB, aunque los virus FIPVA7AB y FIPVA3ABC+A7AB carecen de esta región. Los fragmentos de 397 bp y 646 bp, que indican la eliminación de 3ABC y 7AB, respectivamente, se clonan y se procesan en secuencia lo que confirma las secuencias de ADN esperadas. Conclusión : Los virus de eliminación tienen precisamente las eliminaciones genómicas pretendidos.

II.2. d. Características de crecimiento de loa genes que carecen de FIPVs Obj etivo : Observar el tropismo de célula de los virus de eliminación y evaluar su crecimiento in vitro. Resultados : Todos los 4 virus recombinantes se inocularon en células LR7 de ratón, pero fallan para producir cualesquiera de los efectos citopáticos. Estas pueden, sin embargo, crecer eficientemente en células FCWF de felino, como se espera. Los virus r-wt-FIPV, FIPVYA3ABC y FIPVA7AB alcanzan concentraciones que son similares a aquellas obtenidas con la cepa FIPV familiar 79-1146 en estas células. Las concentraciones están todas en el orden de 5.107 PFU/ml (Figura 40) . Sin embargo, el mutante doble FIPVA3ABC+A7AB creció menos eficiente; las concentraciones obtenidas con este virus generalmente fueron 1 hasta 2 unidades log menores (Figura 40) .

Conclusión: Las secuencias que comprenden los grupos de genes 3ABC y 7AB no son esenciales para la viabilidad de FIPV. Aparentemente, ni las secuencias de nucleótido ni las proteínas codificadas por los genes son esenciales para la replicación del virus. 11.2.a. Virulencia de los virus recomblnantes en gatos Objetivo : Establecer cuales eliminaciones genéticas afectan la virulencia. Procedimiento y Resultados: Los virus de eliminación recomblnantes se caracterizan en su hospedador natural, el gato. Para este propósito, se colocan 24 gatos SPF (5 meses de edad) en 5 grupos y se inoculan oronasalmente (100 pfu) con cepa FIPV 79-1146 (n=4), r-wtFIPV (n=5) , FIPVA3ABC (n=5) , FIPVA7AB (n-5) y FIPVA3ABC+A7AB (n=5) , respectivamente, y se continúa durante (al menos) 3 meses. Se registran las señales de enfermedad clínica como se muestra en la Tabla 5. La inoculación de los gatos con las variantes de eliminación no inducen señales clínicas de enfermedad. Preferiblemente, todos los gatos se mantienen totalmente saludables durante el experimento (Tabla 6 y Figura 35) . En contraste, la infección con los controles FIPV79-1146 y r-wtFIPV de tipo silvestre inducen el inicio rápido de la enfermedad clínica caracterizado por depresión, anorexia, ictericia, pérdida de peso y leucopenia (Tabla 6) . Tres de cuatro y cinco de cinco gatos inoculados con FIPV 79-1146 y r-wtFIPV, respectivamente, se les hace la eutanasia debido a los síntomas avanzados de FIP entre el día 14 y 42 después de la infección (Figura 35) . Conclusiones : 1) El FIPV 79-1146 y su r-wtFIPV equivalente recombinante de tipo silvestre son igualmente virulentos; y 2) los virus con eliminaciones de las secuencias especifican los genes 3abc y 7ab o la combinación de algunos o todos estos genes que exhiben un fenotipo significativamente atenuado en gatos.

II.2. f. Respuesta inmune inducida por virus recombinantes Ob etivo: Determinar la actividad de neutralización FIPV en sueros de gato . Procedimiento y Resultados: Las respuestas al anticuerpo específicas de FIPV de los gatos inoculados con los virus de eliminación se caracterizan. Para este propósito, se obtienen muestras de sangre los días 0, 21 y 90 después de la infección, y se preparan y se incuban en suero inactivado por calor con FIPV79-1146 (10.000 PFU) después de lo cual se determina la actividad que neutraliza el FIPV usando células FCWF en un ensayo de microplaca de 96 pozos. Las concentraciones se expresan como el recíproco de la dilución más baja que no inhibe mayormente los efectos citopáticos virales. Como se espera, el día 0 ninguno del suero de gato muestra una actividad neutralizante de FIPV importante. El día 21, todos los gatos están seroconvertidos y muestras altas concentraciones de anticuerpos neutralizantes. Las concentraciones observadas en gatos inoculados con FIPV 79-1146, r-wtFIPV, FIPVA3ABC y FIPVA7AB son comparables mientras que las concentraciones observadas en gatos infectados FIVPA3ABC+A7AB fueron aproximadamente 50 veces menor (Figura 36). En general, las concentraciones se mantienen altas durante al menos 90 días (fin del experimento) . Conclusión: A pesar de la ausencia de señales de enfermedad clínica, se observan altas concentraciones de anticuerpos neutralizantes en gatos que se han inoculado con variantes de eliminación FIPV. Esto sugiere fuertemente que los virus de eliminación son viables y replican en el gato conduciendo a una respuesta inmune fuerte en la forma de una respuesta de anticuerpo.

II.2. g. Virus de eliminación FIPV que sirven como vacunas vivas, atenuadas Ob etivo : Para estudiar si la inoculación previa con las variantes de eliminación atenuadas protege a los gatos contra la prueba inmunogénica a FIPV 79-1146. Procedimiento y Resultados; Los gatos previamente inoculados con las variantes de eliminación atenuadas se les aplica la prueba inmunogénica oronasalmente con FIPV 79-1146 (100 pfu) al día 90. Como un grupo de control, 4 gatos sin tratar de edad similar se les aplicó la prueba inmunogénica . El grupo de control muestra un inicio rápido de la enfermedad clínica caracterizada por la depresión, anorexia, ictericia, pérdida de peso y leucopenia (día 7) . Se observa un inicio rápido similar de los síntomaB con 3 de 5 gatos previamente inoculados con FIPVA3ABC+Á7AB, mientras que todos los gatos previamente infectados con FIPVA3ABC o FIPVA7AB permanecen generalmente saludables y sin síntomas de FIP típicos durante el experimento (Tabla 7) , aunque 2 de 5 gatos previamente inoculados con FIPA3ABC muestran pérdida de peso temporal . Debido a los síntomas avanzados de FIP, aun gato del grupo de control se le aplicó la eutanasia el día 32, mientras que los otros gatos en el grupo de control se recuperan de sus síntomas de FIP iniciales. Un registro letal del 25% es menor que el observado en los experimentos previo. Esto se supone debido a la edad avanzada de los gatos que se conoce que conduce a una susceptibilidad reducida para FIPV. Los tres gatos vacunados FIPVÁ3ABC+A7AB con síntomas iniciales mantienen la enfermedad y se les aplica la eutanasia entre los días 11 y 56 (Figuras 37) . Aparentemente, la eliminación combinada de los dos grupos de genes 3ABC y 7AB que se encuentran para reducir la aptitud de FIPVA3ABC+Á7AB, como se juzga por su crecimiento in vitro atenuado, también afecta la relación de replicación del virus en los gatos, como se testifica por los niveles inferiores de anticuerpos neutralizantes inducidos. De esta manera, el virus se sobre-atenúa y sólo es capaz de proteger parcialmente contra una prueba inmunogénica a FIPV. La protección completa deberá requerir una dosis mayor o repetida . Conclusión: Antes de la vacunación con FIPVA3ABC o FIPVA7AB, se protegen los gatos contra la enfermedad causada por la prueba inmunogénica a FIPV.

II.3. Inserción y expresión de los genes externos Ob etivo : Establecer si los genes externos pueden insertarse a posiciones diferentes en el genoma viral, ya sea como un gen adicional o reemplazando los genes no esenciales eliminados; y establecer si estos genes se expresan y si se mantienen establemente durante el paso in vitro del virus.

II.3. a. Construcción de virus recombinantes que portan los genes reporteros Ob etivo: Generar virus FIPV 79-1146 con inserciones del gen externo. Procedimiento : Se construye un virus que contiene un gen reportero externo en su genoma en la posición de los genes 3abc. El gen reportero, luciferasa de renilla (RL) se coloca bajo el control transcripcional del gen 3a precedente IGS .

Para eliminar el grupo 3abc e introducir el gen RL en el plásmido pBRDIl, se usan las combinaciones de los cebadores 1244 ( 5 ' -GCCATTCTCATTGATAAC- 3 ' ) y de 1514 (5'- CTGAGTCTAGAGTAGCTAGCTAATGACTAATAAGTTTAG-3 ' ) y de 1245 (5'-GCTTCTGTTGAGTAATCACC-3') y 1513 (5 ' - GCTAGCTACTCTAQACTCAGGCGGTTCTAAAC-3 ' ) para generar fragmentos de 336 bp (A) y 1068 bp (B) por medio de PCR, respectivamente. En el cebador 1513 y 1514, las secuencias subrayadas y en negrita representan un sitio de restricción Nhel y Xbal, respectivamente. Los fragmentos A y B se fusionan usando el traslape entre ambos fragmentos a través de los cebadores 1514 y 1513 y se amplifican usando los cebadores 1244 y 1245, usando SOE-PCR, lo que resulta en un fragmento de 1384 bp (C) . El fragmento C se clona en el vector pGEM Easy (Promega) , lo que resulta en pGEM-C. el gen RL derivado de pRL-null (Promega) se introduce como un fragmento Nhel/Xbal en el pGEM-C digerido por Nhel y Xbal, lo que rsulta en pGEM-C+luc. El fragmento C+luc se introduce como un fragmento AflII/SnaBI en el pBRDIl digerido en AflII y SnaBI, lo que resulta en pBRDIlA3ABC+luc . Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de expresión y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. Conclusión : La luciferasa de renilla del gen reportero externo puede colocarse en el genoma del FIPV de coronavirus tipo I. Son viables los virus recombinantes pretendidos.

II.3. b. Crecimiento de una etapa de los virus Objetivo : Comparar las características de crecimiento de los virus con el virus de tipo silvestre. Procedimiento y Resultados : Después de dos rondas de purificación en placas, se prepararon existencias de virus de 2 recombinantes obtenidos independientemente bajo el II.3. a, se concentraron y se usaron para una infección m.o.i. alta (m.o.i. de 8) de células FCWF después de lo cual se observan los infectados virales en el medio de cultivo. Los resultados se representan por las curvas de crecimiento mostradas en la Figura 38. Ambos recombinantes independientemente obtenidos crecen a una concentración log 1 hasta 2 más baja en comparación con el del virus de tipo silvestre recombinante . Conclusión : Los virus recombinantes con cásete de expresión insertado crecen normalmente in vitro, pero se afectan sus rendimientos .

II.3. c. Expresión de luciferasa de renilla Obje ivo: Establecer si el cásete de expresión insertado fue funcional.

Procedimiento y Resultados: Se infectan cultivos monocapa confluentes de células PC F a una m.o.i. de T y la producción de actividad de luciferasa en las células se observa durante el tiempo. La expresión RL en células se mide al usar el Sistema de Ensayo Reportero Luciferasa Dual (Promega) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El RL se mide con relación a unidades de luz (RLU) usando un luminómetro (Lumac Biocounter M2500 o Turner Designs Modelo TD-20/20) . Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 39.

En contraste al virus de tipo silvestre recombinante , los dos genes de luciferasa recombinantes que contienen virus que expresan altos niveles de actividad de luciferasa, indican que el gen de luciferasa de renilla es funcional. La expresión inicia tan pronto como 2 horas después de la infección. El nivel de expresión más alto se alcanza a 9 horas después de la infección. Conclusión: Los genes externos pueden expresarse por coronavirus al usar el espacio genético creado por la eliminación de los genes no esenciales.

II.4. Generación de vacunas con base en FIPV multivalentes Objetivo : Desarrollo de vacunas multivalentes con base en la cepa FIPV reducida viva como el vector. Enfoque : Se seleccionaron genes (o fragmentos del gen) de otros patógenos de felino y canino que codifican antígenos conocidos para inducir la inmunidad protectora contra estos patógenos. Los casetes de expresión de estos genes se introducen en el genoma de FIPV en combinación con eliminaciones atenuadas de genes no esenciales. Los casetes de expresión contienen el FIPV TRS al frente del (partes de) gen a expresarse .

II. . a. Construcción de la vacuna del virus de leucemia felina multivalente (FeLV) con base en el vector FIPV Obj etivo : Desarrollo de la vacuna FeLV con base en una cepa FIPV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) los genes gag y env FeLV relacionados con la protección se colocaron en casetes de expresión y posteriormente se introducen en pBRDIlA3ABC y pBRDHA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de los genes gag y env FeLV se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión : (Partes de) los genes gag y env FeLV relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse por una cepa FIPV reducida viva. Estos recombinantes pueden, por lo tanto, funcionar como una vacuna multivalente contra el virus de leucemia felina y la infección FIPV.

II.4. b. Construcción de una vacuna del virus de inmunodeficiencia felino (FIV) multivalente con base en un vector FIPV Objetivo : Desarrollo de vacuna FIV con base en la cepa FIPV reducida viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) los genes gag y env FIV relacionados con la protección se colocan en casetes de expresión y posteriormente se introducen en pBRDIlA3ABC y pBRDHA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación AR -ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de los genes gag y env FIV se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión: (Partes de) los genes gag y env FIV relacionados con la protección, pueden introducirse en y expresarse por una cepa FIPV reducida viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el virus de inmunodeficiencia felina y la infección FIPV.

II.4. c. Construcción de una vacuna de calicivirua felino (FCV) multivalente con base en el vector FIPV Obj etivo : Desarrollo de una vacuna FCV con base en una cepa FIPV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) el gen de cápsida FCV relacionado con la protección se coloca en un cásete de expresión y posteriormente se introduce en pBRDI lA3ABC y pBRDIlAVAB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen de cápsida FCV se confirma por análisis de inmunoprecipitación . Conclusión : (Partes de) el gen de cápsida FCV relacionado con la protección puede introducirse en y expresarse por una cepa FIPV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el calcivirus felino e infección FIPV.

II.4, d. Construcción de una vacuna del virus de panleucopenla felino (PPV) multivalente con basa en el vector FIPV Ob etivo: Desarrollo de vacuna FPV con base en la cepa FIPV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) el gen R3 relacionado con la protección, que codifica las proteínas de cápsida VP1 y VP2 se coloca en un cásete de expresión y posteriormente se introduce en pBRDHA3ABC y pBRDIlA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de (partes de) el gen R3 se confirma por análisis de inmunoprecipitación . Conclusión : (Partes de) el gen R3 relacionado con la protección, puede introducirse en y expresarse por una cepa FIPV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el virus de panleucopenia felino e infección FIPV.

II. . e. Construcción de la vacuna del virus de herpes felino (FHV) multivalente con base en el vector FIPV Objetivo: Desarrollo de vacuna para FHV con base en la cepa FIPV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) los genes del virus del herpes felino gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, gM, ICPO, ICP1 e ICP4 relacionados con la protección, ae colocan en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en pBRDHA3ABC y pBRDIlA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de los genes FHP insertados se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión : (Partes de) los genes del virus del herpes felino gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, ICPO, ICP1 e ICP4 relacionados con la protección pueden introducirse y expresarse en una cepa FIPV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el virus del herpes felino y FIPV.

II.4. f. Construcción de vacuna para el serotipo I y II de FIPV multivalente con base en el vector del eerotipo II FIPV Objetivo : Desarrollo de vacuna que proteja contra el serotipo I y contra el coronavirus de felino II, con base en la cepa del serotipo II de FIPV atenuada viva como el vector . Procedimiento : (Partes de) el gen de espicula relacionado con la protección de un coronavirus de felino del serotipo I del cual la región que codifica la secuencia de señal se retira, se coloca en un cásete de expresión y posteriormente se introduce en pBRDIlA3ABC y pBRDHA7AB, respectivamente. Por ejemplo: en un caso se usa un constructo del gen de espicula del cual se le ha retirado la región que codifica la secuencia de señal; en otro caso, se usa un gen de espicula truncado, del cual se le ha retirado la región que codifica el dominio + endodominio de transmembrana. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación AR -AR entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del constructo de gen de espicula del serotipo I insertado se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión ; (Partes de) el gen de espicula relacionado con la protección del serotipo I de coronavirus de felino, puede introducirse y expresarse en una cepa del serotipo II de FIPV atenuada viva, y por lo tanto, pueden funcionar como una vacuna muítivalente contra el coronavirus de felino del serotipo tanto I como II.

II.5. Generación de virus recombinantes con orden de gen reconfigurado Obj etivo : Desarrollo de una vacuna FIPV en la cual la eliminación de genes no esenciales se combina con un orden de gen reconfigurado al mover el gen N en dirección ascendente del gen S en el genoma del FIPV. Procedimiento y Resultado: Se sintetizaron transcritos donadores de escape, cubiertos, de los vectores pBRDHA3ABC, pBRDI 1?7?? y pBRDI 1?3??0+?7?? linearizado por Notl en los cuales el gen N, junto con sus TRS, se inserta en una posición en dirección ascendente del S. Los transcritos donadores se introducen en las células LR7 murinas (matraz de 80 cm2) , que se ha infectado antes con mFIPV (m.o.i. de 0.4), por electroporación (aparato de electroporación de pulso de gen, Biorad, 2 pulsos consecutivos; 0.85 kV/50 microF) . Las células electroporadas se cocultivaron en un matraz de cultivo de 25cm2 con células FCWF de felino (50% de confluencia) . Después de 24 horas de incubación a 37°C, podrá detectarse el sincitio masivo en los cultivos celulares. Los virus mutantes de eliminación con los genomas reconfigurados liberados en el sobrenadante de cultivo celular mezclado, se purificaron por dos rondas de purificación en placas en células FCWF.

Conclusión : Podrán generarse FlPVs imitantes de eliminación con el orden de gen reconfigurado . Estos virus pueden funcionar como vacunas FIPV atenuadas vivas. En virtud de su orden de gen reconfigurado , estos virus representan vacunas seguras debido a su capacidad atenuada para generar progenie viable por recombinación con los virus que circulan en el campo.

II.6. Qeneraclón de vacunas con base en FIPV contra patógenos caninos Objetivo general: Desarrollo de vacunas con base en la cepa del serotipo II FIPV atenuada viva cottio el vector contra patógenos caninos . Enfoque : Ya que los coronavirus de felino del tipo II expresan las proteínas de espícula tipo coronavirus canino (2a) , tales vectores de coronavirus felino pueden usarse como vacunas en caninos. Por lo tanto, la vacuna FIPV atenuada viva que se ha desarrollado, también puede usarse para la vacunación de caninos contra el coronavirus de canino (CCV) . Adicionalmente, pueden generarse vacunas multivalentes al introducir casetes de expresión de genes relacionados con la protección de otros patógenos caninos en el genoma de FIPV en combinación con eliminaciones atenuados de genes no esenciales y con recolocaciones del genoma. Los casetes de expresión contienen el FIPV TRS al frente de (partes de) el gen a expresarse . 11.6.a. Generación de vacuna basada en FIPV contra el moquillo canino Obj etivo : Desarrollo de una vacuna contra el moquillo canino con base en una cepa FIPV atenuada viva como el vector . Procedimiento : (Partes de) los genes H y F relacionados con la protección se colocan en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en pBRDIlA3ABC y pBRDHA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de (partes de) los genes H y F se confirma por análisis de intnunoprecipitación. Conclusión : (Partes de) los genes H y F relacionados con la protección del virus del moquillo canino, pueden introducirse en y expresarse por la cepa FIPV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna contra el virus del moquillo canino e infección por CCV.

II.6. b. Generación de una vacuna con base en FIPV contra la enfermedad del parvo canino Objetivo: Desarrollo de la vacuna del parvovirus canino con base en una cepa FIPV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) el gen R3 relacionado con la protección, que codifica las proteínas de cápsida VP1 y VP2 , se coloca en un cásete de expresión y posteriormente se introduce en pBRDHA3ABC y pBRDHA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de (partes de) el gen R3 se confirma por el análisis de inmunoprecipitación . Conclusión: (Partes de) el gen R3 relacionado con la protección del parvovirus canino, puede introducirse en y expresarse por la cepa FIPV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna contra la enfermedades del parvovirus canino e infección CCV.

II.6. c. Generación de la vacuna con base en FIPV contra hepatitis canina infecciosa Objetivo: Desarrollo de una vacuna de adenovirus 1 canino con base en la cepa FIPV atenuada viva como el vector.

Procedimiento : (Partes de) los genes de la proteína estructural relacionados con la protección del adenovirus 1 canino, se colocan en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en pBRDIlA3ABC y pBRDIlA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación de ARN-ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de (partes de) los genes de la proteína estructural relacionada con la protección del adenovirus 1 canino, se confirma por análisis de inmunoprecipitación . Conclusión : (Partes de) los genes de la proteína estructural relacionados con la protección del adenovirus 1 canino, pueden introducirse en y expresarse por una cepa FIPV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna contra la hepatitis canina infecciosa e infección por CCV.

II.6. d. Generación de vacuna con base en FIPV contra la enfermedad hemorrágica de cachorros Objetivo: desarrollo de la vacuna del virus del herpes 1 canino con base en una cepa FIPV atenuada viva como el vector . Procedimiento : (Partes de) los genes del virus del herpes canino gB, gC, gD, gE, gH, gl , gK, gL, gM, gM, ICPO, ICP1 e ICP4 relacionados con la protección, se colocan en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en pBRDHA3ABC y pBRDIlA7AB, respectivamente. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por recombinación AR -ARN entre los transcritos de escape del vector de transcripción y el genoma mFIPV como se describe arriba. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de los genes insertados se confirma por análisis de inmunoprecipitación . Conclusió : (Partes de) los genes del virus del herpes canino gB, gC, gD, gE, gH, gl , gK, gL, gM, ICPO, ICP1 e ICP4 relacionados con la protección pueden introducirse y expresarse en una cepa FIPV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el virus del herpes 1 canino y CCV.

III. Virus de gaatro-enteritis transmisible (TGEV) III.1. Generación de una vacuna atenuada viva contra el TGEV Obj etivo : Desarrollo de una vacuna atenuada viva contra el TGEV. Enfoque : A estos virus utantes de eliminación TGEV recombinantes objetivo, se generaron de manera que carecen de los genes 3ab y/o 7 no eaencialea . Procedimiento : Se generan virus recom inantes como se describe por Almazan et al. (2000). Del BAC- GVEFL, un clon de ADNc TGEV infeccioso se coloca detrás de un promotor CMV en pBeloBACll, y los genes 3ab y 7 se retiran por medio de técnicas de clonación estándar, permaneciendo intactas las estructuras de lectura abierta circundantes y las secuencias reguladoras de transcripción. Se transfectan células de testículos de cerdo epitelial (ST) con este derivado pBAC-TGEVFL que carece de los genes 3ab y 7 (pBAC-TGVEFL) . Los virus TGEV recombinantes se colocan en placas purificadas y se caracterizan por RT-PCR para la ausencia de los genes 3ab y/o 7. Se generan grandes cantidades de los virus de eliminación TGEV recombinantes por las células ST infectadas.

Conclusión: Se genera el TGEV recombinante que carece de loa genes 3ab y 7. Estos virus pueden funcionar como una vacuna atenuada viva contra TGEV.

III.2 Generación de las vacunas con base en TGEV multivalentes Obj etivo : Desarrollar vacunas multivalentes con base en un TGEV atenuado vivo como un vector. Enfoque : Los casetes de expresión de los genes relacionados con la protección de patógenos porciones, se 1 5 introducen en el genoma TGEV en combinación con eliminaciones atenuados de genes no esenciales y recolocaciones de genoma. Los casetes de expresión contienen el TGEV TRS al frente del (partes de) gen a expresarse.

III.2. . Construcción de una Vacuna de Parvovirus Porcino Multivalente (PPV) con Base en el Vector TGEV Objetivo : Desarrollo de una vacuna con base en una cepa TGEV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) el gen R3 relacionado con la protección, que codifica las proteínas de cápsida VP1 y VP2 , se coloca en un cásete de expresión y posteriormente se introduce en un derivado pBAC-TGEVFL que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan por células ST transfectadas con su derivado de eliminación pBAC-TGEVFL que contiene (partes de) el gen R3 relacionado con la protección. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen R3 insertado se conforma por análisis de inmunopreci itació . Conclusión-. (Partes de) el gen R3 relacionado con la protección puede introducirse en y expresarse por una cepa TGEV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra una 6 infección TGEV y el Parvovirus de Porcino.

III.2. b. Construcción de una vacuna del virus de influenza de cerdo multivalente con base en el vector TGEV Qbj etivo : Desarrollo de una vacuna del virus de influenza de cerdo con base en una cepa TGEV atenuada viva como el vector . Procedimiento : (Partes de) los genes de neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) relacionados con la protección, se colocan en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en el derivado pBAC-TGEVFL que carece de loe genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todos los conatructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan al transfectar células ST con su derivado de eliminación pBAC-TGEVFL que contiene (partes de) los genes de neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) . Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis T-PCR. La expresión de los genes de neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) insertados se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión : (Partes de) los genes de neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse por una cepa TGEV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el virus de influencia del cerdo y la infección TGEV.

III.2. c Construcción de una vacuna del virus de fiebre de cerdo africano multivalente basada en el vector TGEV Obj etivo : Desarrollo de una vacuna del virus de la fiebre del cerdo africano con base en un cepa TGEV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (partes de) los genes que codifican la proteína estructural relacionada con la protección se colocaron en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en un derivado pBAC-TGEVFL que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes por células ST transíectadas con este derivado de eliminación RT-PCR, que contiene (partes de) los genes que codifican la proteína estructural relacionada con la protección. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión de los genes que codifican la proteína estructural se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión: (Partes de) los genes que codifican la proteína estructural relacionada con la protección pueden introducirse en y expresarse por la cepa TGEV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra un virus de la fiebre del cerdo Africano y la infección TGEV.

III.2. d. Construcción de la vacuna de circovirus de tipo 2 porcino multlvalente con base en el vector TGEV Obj etivo : Desarrollo de una vacuna de circovirus de tipo 2 porcino con base en una cepa TGEV atenuada viva como el vecto . Procedimiento : (Partea de) los genes Cl, C2 , VI y V2 relacionados con la protección del circovirus del tipo 2 porcino se colocaron en un c sete de expresión y posteriormente se introducen en un derivado pBAC-TGEVFL que carece de los genes 3ab t 7. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan al transfectar células ST con este derivado de eliminación pBAC-TGEVFL que contiene (partes de) los genes Cl, C2 , VI y V2 relacionados con la protección del circovirus del tipo 2 porcino. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PC . La expresión de los genes Cl, C2 , VI y V2 del circovirus del tipo 2 porcino se confirma por análisis de inmunoprecipitació . Conclusión: (Partes de) los genes Cl, C2 , VI y V2 relacionados con la protección del circovirus del tipo 2 porcino pueden introducirse en y expresarse por una cepa TGEV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el circovirus del tipo 2 porcino, y la infección TGEV.

III.2. a. Construcción de una vacuna del virus dal síndrome reproductivo y respiratorio porcino multivalente con base en el vector TGEV Ob e ivo: Desarrollo de una vacuna del virus del síndrome reproductivo y respiratorio del porcino con base en una cepa TGEV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) el ORF2 hasta 0RF7 relacionado con la protección del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino se colocaron en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en un derivado pBAC-TGEVFL que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes generados por células ST transfectadas con este derivado de eliminación pBAC-TGEVFL que contiene (partes de) el 0RF2 hasta 0RF7 relacionado con la protección del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del ORF2 hasta 0RF7 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino se confirma por análisis de inmunoprecipitación . Conclusión: (Partes de) el ORF2 hasta ORF7 relacionado con la protección del virus del síndrome reproductivo respiratorio porcino puede introducirse y expresarse por una cepa TGEV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el virus del síndrome reproductivo respiratorio porcino y una infección TGEV.

III.2. e. Construcción de una vacuna del virúa de la enfermedad de los pies y la boca multlvalente con base en el vector TGEV Obj etivo : Desarrollo de una vacuna del virus de la enfermedad de la boca y la pata con base en una cepa TGEV atenuada viva como el vector. Procedimiento : (Partes de) las secuencias relacionadas con la protección que codifican VPl hasta VP4 del virus de la enfermedad de la pata y la boca se colocan en un cásete de expresión y posteriormente se introducen en un derivado pBAC-TGEVFL que carece de los genes 3ab y 7. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan por células ST transíectadas con este derivado de eliminación pBAC-TGEVFL que contiene (partes de) las secuencias relacionadas con la protección que codifican VPl hasta VP4 del virus de la enfermedad de los pies y boca. Los virus resultantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR.

La expresión de las secuencias que codifican VP1 hasta VP4 del virus de la enfermedad de los pies y la boca se confirman por análisis de inmunoprecipitación . Conclusión: (Partes de) las secuencias relacionadas con la protección que codifica VP1 hasta VP4 del virus de la enfermedad de los pies y la boca pueden introducirse en y expresarse por una cepa TGEV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente contra el virus de la enfermedad de los pies y la boca y la infección TGEV.

III . 3. Generación de virus recombinantes con orden de gen reconfigurado Obje ivo : Desarrollo de una vacuna TGEV en la cual la eliminación de genes no esenciales se combinan con un orden de gen reconfigurado al mover el gen N en dirección ascendente del gen S en el genoma TGEV. Procedimiento y Resultados: Los virus recombinantes se generan como se describe por Almazan et al. (2000) . Del pBAC-TGEVFL, un clon de ADNc TGEV infeccioso colocado atrás del promotor CMV en pBeloBACll, los genes 3ab y 7 se retiran por medio de técnicas de clonación estándar, dejando las estructuras de lectura abiertas circundantes y las secuencias reguladoras de transcripción intactas. Además, el gen N se clona a una posición en el genoma en dirección ascendente del 1 gen S. Se tranafectan células (ST) de testículo de cerdo epitelial con este derivado pBAC-TGEVFL que carece de los genes 3ab y 7 y tiene un genoma reconfigurado . Loa virus TGEV recombinantea se colocan en placas purificadas y se caracterizan por RT-PCR para la ausencia de los genes 3ab y/o 7. Se generan grandes cantidades de recombinantes de eliminación TGEV por las células ST infectadas. Conclusión: El TGEV recorabinante se genera que carece de los genes 3ab y 7, y el cual tiene un orden de gen reconfigurado. Eatos virus funcionan como una vacuna atenuada viva contra TGEV, así, contra otro patógenos de porcino cuando los genes que codifican antígenos relevantes se incorporan apropiadamente .

IV. Virus de la Bronquitis Infecciosa de las Aves (IBV) IV.1. Generación de una vacuna atenuada viva contra IBV Obj tivo : Desarrollo de una vacuna atenuada viva contra IBV. Enfoque : Se generan virus imitantes de eliminaciones IBV recombinantes que carecen de los genes no esenciales 3a/b y/o 5a/b. Con objeto de adquirir virus de vacuna que protejan contra múltiples serotipos IBV, se incorporan constructos de gen de punta derivados de tales virus diferentes. Procedimiento : Se generan virus recombinantes como se describen por Casáis et al. (2001). Se ensamblan clones de ADNc IBV infecciosos en el genoma del virus de la vacuna al usar ligación in vitro secuencial de fragmentos de ADNc de plásmidos derivados de pFRAGl, pFRAG2 , y pFRAG3 , seguido por clonación directa en el genoma del virus de la vacuna vNotl/tk como se describe (la) . Se remueven los genes 3a/b y 5a/b del pFRGA3 por mutagénesis PCR dejando intacto las estructuras de lectura abierta circundantes y las secuencias reguladoras de la transcripción, lo que resulta en pFRAG3A. El gen S en pFRAG3A podrá reemplazarse por genes S derivados de diferentes serotipos IBV usando RT-PCR. Los virus de vacuna recombinantes se generan por recombinación entre el virus de viruela HP1.441 y la mezcla de ligado in vitro vNotl/tk-IBV. Los virus recombinantes se colocan en placas purificadas y se caracterizan por PCR y análisis de manchado Southern. Finalmente, los genes que carecen de IBV infecciosos 3a/b y/o 5a/b se generan como sigue: se infectan células (CK) de riñón de pollo con el virus de la viruela recombinante que expresa la polimerasa ARN T7. Posteriormente las células se transfectan con ADN aislado del virus de vacuna recombinante que contiene los genes que carecen del clon de ADNc IBV 3a/b y 5a/b. A los tres días después de la infección, el medio de cultivo se colecta y se usa para infectar células CK para generar grandes cantidades de células recombinantes IBV. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR.

Conclusión : Se genera el IBV recorabinante que carece de los genes 3a/b y/o 5a/b. Estos virus pueden funcionar como una vacuna atenuada viva contra IBV. Al reemplazar el gen S, los IBV recombinantes podrán obtenerse de tal manera que funcione como vacunas atenuadas vivas contra diferentes serotipos IBV.

IV.2, Generación de vacunas con base en IBV muíti elantes Objetivo: Desarrollo de una vacuna multivalente con base en la cepa IBV atenuada viva como el vector. Enfoque : Se introducen caaetes de expresión de los genes relacionados con la protección de patógenos de pollo en el genoma IBV en combinación con la eliminación atenuado de genes no esenciales. Los casetes de expresión que contienen el IBV TRS (CTTAACAA) al frente de (partes de) el gen a expresarse.

IV.2. al. Construcción de una vacuna multivalente con base en el vactor IBV que protege contra más de un serotipo IBV Objetivo : Desarrollo de una vacuna IBV con base en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales y protege contra más de un serotipo. Procedimiento : (Partes de) el gen IBV S relacionado con la protección de un serotipo IBV diferente se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en pFRAG3A. El constructo más largo contiene una copia extra completa del gen ? excepto por la secuencia que codifica el péptido de señal; otro constructo tiene un gen S truncado en la terminal carboxi que carece del código para el dominio de transmembrana y endodominio. Después de la confirmación de todos los constructos pos análisis de restricción y secuencia, se generan virus recombinantes como se describe arriba. Los virus recombinantes se confirman gené icamente por análisis RT-PCR. La expresión apropiada de los constructos del gen S heterólogo se verifica por análisis de inmunoprecipitación con un antisuero de tipo específico usando lisados de células infectados con virus recombinantes radioetiquetados . Conclusión: (Partes de) el gen IBV S relacionado con la protección de un serotipo IBV diferente puede introducirse en y expresarse de una cepa IBV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como vacunas multivalentes para proteger contra la infección por más de un serotipo IBV.

IV.2.aII. Construcción de una vacuna multivalente con base en el vector IBV que protege contra la enfermedad de Newcastle Objetivo: Desarrollo de una vacuna del virus de la enfermedad Newcastle (paramixovirua de la ave tipo I; APMV-1) con base en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales . Procedimiento : (Partes de) Los genes HN y P APMV-1 relacionados con la expresión se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en pFRAG3A. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes como se describen arriba. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación . Conclusión: (Partes de) los genes HN y F APMV-1 relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse de una cepa OBV atenuada viva . Los virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra APMV- e infecciones IBV.

IV.2.b. Construcción de una vacuna multivalente con base en un vector IBV que protege contra la Influenza de Ave Obj etivo : Desarrollo de una vacuna de virus de la Influenza del Ave en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales. Procedimiento : (Partes de) los genes H y N de la Influenza de la Ave relacionados con la protección se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en pFRAG3A. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan como se describe arriba. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión : (Partes de) los genes H y N de la Influenza del Ave relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse de una cepa IBV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra la Influenza del Ave e infecciones IBV.

IV.2. c. Construcción de una vacuna multivalente con base en un vector IBV que protege contra la enfermedad del virus de la Anemia del Pollo (CAV) . Objetivo ; Desarrollo de una vacuna CAV con base en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales. Procedimiento : (Partes de) los genes VI, V2 , y V3 CAV relacionados con la protección se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en pFRAG3A. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan como se describe arriba. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión: (Partes de) los genes VI, V2 , y V3 CAV relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse de una cepa IBV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra CAV e infecciones IBV.

IV.2. d Construcción de una vacuna multivalente con base en un vector IBV que protege contra la enfermedad de reovirua de ave . Objetivo: Desarrollo de una vacuna de reovirus de ave con base en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales . Procedimiento : (Partes de) los genes f?, f2 , y 83 de reovirus de ave relacionados con la protección se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en pFRAG3A. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes como se describe arriba. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación . Conclusión: (Partes de) los genes f?, f2 , y 83 de reovirus de ave relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse de una cepa IBV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra el reovirus del ave e infecciones IBV.

IV.2. e. Construcción de una vacuna multivalente con base en un vector IBV que protege contra la Enfermedad Bursal Infecciosa. Objetivo: Desarrollo de una vacuna contra el Virus de Enfermedad Bursal Infecciosa (IBDV) con base en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales. Procedimiento : (Partes de) el gen VP2 IBDV relacionados con la protección se colocan en casetea de expresión, posteriormente se introducen en pFRAG3A. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantea se generan como se describe arriba. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión: (Partes de) el gen VP2 IBDV relacionado con la protección puede introducirse en y expresarse de una cepa IBV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra el IBDV de infecciones IBV.

IV.2. f. Construcción de una vacuna multivalente con base en un vector IBV que protege contra la Enfermedad de Marek. Obj etivo : Desarrollo de una vacuna del virus del herpes 2 Gallid (virus de la enfermedad de arek) con base en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales. Procedimiento : (partes de) el gen Gallid del virus del herpes 2 gB relacionado con la protección se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en pFRAG3A. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan como se describe arriba. Los virus recombinantes de confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusió : (Partes de) el gen Gallid del virus del herpes 2 gB relacionado con la protección puede introducirse en y expresarse de una cepa IBV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra el virus del herpes 2 Gallid e infecciones IBV.

IV.2. g. Construcción de una vacuna multivalente basada en un vector IBV que protege contra laringotraqueitis infecciosa Obj etivo : Desarrollo de una vacuna del virus del herpes 1 Gallid (virus de la laringotraqueitis infecciosa) con base en una cepa IBV atenuada viva que carece de genes no esenciales . Procedimiento : (Partes de) los genes del virus del herpes 1 Gallid gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL y gM relacionados con la protección, se colocan en casetes de expresión y posteriormente se introducen en pFRAG3 ?. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan los virus recombinantes como se describe anteriormente. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación.

Conclusión : (Partes de) los genes del virus del herpes 1 Gallid relacionados con la protección pueden introducirse en, y expresarse de, una cepa IBV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra invenciones del virus del herpes 1 Gallid e infecciones por IBV.

IV.3. Generación de virus recombinantes con orden de gen reconfigurado Objetivo : Desarrollar una vacuna IBV en la cual la eliminación de los genes no esenciales se combina con un orden de gen reconfigurado al mover el gen N en dirección ascendente del gen S en el genoma IBV. Procedimiento : Se generan virus recombinantes como se describe por Casáis et al. (2001). Se ensamblan clones de ADNc IBV infecciosos en el genoma del virus de la vacuna al usar el ligado in vitro secuencial de fragmentos de ADNc derivados de plásmidos derivados de pFRAGl, pFRAG2 , y pFRAG3 , seguido por clonado directo en el genoma del virus de la vacuna vNotl/tk como se describe (la) . Los genes 3a/b y 5a/b se removieron del pFRAG3 por mutagénesis PCR quedando intactas las estructuras de lectura abierta circundantes y las secuencias reguladoras de transcripción. Además, el gen N junto con su TRS se mueve a una posición en dirección ascendente del gen S lo que resulta en una recolocación de pFRAG3A. Se generan virus de vacuna recombinante por recombinación entre el virus de viruela de las aves HP1.441 y la mezcla del ligado in vitro vNotl/tk- IBV. Los virus recombinantes se colocan en placas purificadas y se caracterizan por PCR y análisis de manchado Southern. Finalmente, los genes 3a/b, 5a/b que carecen de IBV infeccioso y con un orden de gen reconfigurado, se generan como sigue: células de riñón de pollo (CK) se infectan con el virus de viruela de las aves recombinante que expresa la polimerasa de ARN T7. Posteriormente, las células se transfectan con ADN aislado del virus de vacuna recombinante que contiene el clon de ADNc IBV que carece de los genes 3a/b y 5a/b en combinación con el orden del gen reconfigurado . A los 3 días después de la infección, el medio de cultivo se colecta y se usa para infectar células CK para generar grandes cantidades de IBV recombinante. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR.

Conclusión : Se generó el IBV recombinante que carece de los genes 3a/b y 5a/b en combinación con el orden del gen reconfigurado . Estos virus funcionan como una vacuna atenuada viva contra IBV. Cuando se combinan con los conatructos del gen S de otros conatructos de gen y/o serotipos IBV de otros patógenos de aves adicionales, pueden generarse vacunas multivalentes .

V. Cepa 229E del corona virus humano (HCoV) (HCoV-229E) V.l. Generación de una vacuna viva con base en HCoV-229E atenuado Obj etivo : Desarrollo de una vacuna atenuada viva contra HCOV-229E. En oque : Se generan virus imitantes de eliminación HCoV recombinantes que carecen de los genes 4a/b no esenciales. Procedimiento : Se generan virus recombinantes esencialmente como se describe por Thiel et al. (2001) . Se ensamblan clones de ADNc HCoV infecciosos en el genoma del virus de la vacuna. El virus de vacuna vHCoV-vec-1 contiene un fragmento de ADNc de 22.5 kbp que codifica el extremo 5' del genoma HCoV. Este fragmento se remueve del genoma de la vacuna por digestión con Bspl20I, digestión con luI y ligado al fragmento de ADNc del ???? que se obtiene por digestión con Mlul/Eagl. El ???? contiene un fragmento de ADNc que codifica el extremo 3' del genoma HCoV, pero carece del gen 4a/b, sin interferir con los otros genes o secuencias reguladoras de transcripción. El ???? se deriva de pME al usar métodos de mutagénesis PCR convencionales . Los productos de ligación se ligan al ADN del virus de vacuna rvNotl/tk. Los virus de vacuna recombinantes se generan como se describe anteriormente. Los virus recombinantes se colocan en placas purificadas y se caracterizan por PCR y análisis de manchado Southern. Finalmente, se generan genes 4a/b que carecen de HCoV infeccioso como siguen: células de riñon de pollo (CK) se infectan con el virus de viruela de las aves recombinante que expresa la polimerasa de ARN T7. Posteriormente, las células se transfectan con ADN aislado del virus de vacuna recombinante que contiene los genes que carecen del clon de ADNc HCoV 4a/b. A 3 días después de la infección, el medio de cultivo se colecta y se usa para infectar células de fibroblasto largas humanas (MRC-5) para generar grandes cantidades de HCoV recombinante. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. Conclusión : Se genera HCoV recombinante que carece de los genes 4a/b. Estos virus pueden funcionar como una vacuna atenuada viva contra HCoV-229E.

V.2. Generación de una vacuna atenuada viva contra la cepa HCoV OC43 Ob etivo: Desarrollo de una vacuna atenuada viva contra HCOV-OC43. Enfoque: Se generan virus mutantes de eliminación HCoV recombinantes que carecen de los genes 4a/b no esenciales, y que contienen un gen de proteína S híbrido, que codifica el ectodominio de HCoV-0C43. Procedimiento : Se generan virus recombinantes esencialmente como se describe por Thiel et al. (2001). Se ensamblan clones de ADNc HCoV infecciosos en el genoma del virus de la vacuna. El virus de vacuna v-HCoV-vec-1 contiene un fragmento de ADNc de 22.5 kbp que codifica el extremo 5' del genoma HCoV. Este fragmento se remueven del genoma de la vacuna por digestión con Bspl20I, digestión con MluI y ligado a un fragmento de ADNc de pMEA-£0C43 que se obtiene por la digestión con Mlul/Eagl. El pMEA-SOC43 contiene un fragmento de ADNc que codifica el extremo 3' del genoma HCoV, carece del gen 4a/b, y contiene un gen de proteína S híbrido, sin interferir con los otros genes o secuencias reguladoras de transcripción, el gen de proteína S híbrido contiene la región del gen S de HCoV-OC43 que codifica el ectodominio de proteína S, mientras que el resto del gen se deriva del gen HCoV-229E. El p EA-SOC43 de deriva de ???? al usar métodos de mutagénesis (RT-) PCR convencionales. Los productos de ligado se ligan al ADN del virus de la vacuna vNotl/tk. Se generan virus de vacuna recombinante como se describe arriba. Los virus recombinantes se colocan en placas purificadas y se caracterizan por PCR y análisis de manchado Southern. Finalmente, los genes 4a/b que carecen de HCoV infeccioso se generan como sigue: se infectan células de riñón de pollo (CK) con el virus de viruela de las aves recombinante que expresa la polimerasa de ARN T7. Posteriormente, las células se transfectan con ADN aislado del virus de vacuna recombinante que contiene los genes 4a/b del clon de ADNc HCoV. Tres días después de la infección, el medio de cultivo se colecta y se usa para infectar células de fibroblasto largas humanas (MRC-5) para generar grandes cantidades de HCoV recombinantes . Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. Conclusión : Se generan HCoV recombinante que carece de los genes 4a/b. Estos virus contienen el ectodominio de la proteína S de HCoV-OC43 y por lo tanto funcionan como una vacuna atenuada viva contra HCoV-OC43.

V.3. Generación de vacuna con base en HCoV multivalente Obj etivo : Desarrollo de vacuna multivalente con base en una cepa HCoV atenuada viva como un vector. Enfoque : Se introducen casetes de expresión de los genes relacionados con la protección de patógenos humanos en el genoma HCoV en combinación con la eliminación atenuado de genes no esenciales. Los casetes de expresión contienen el HCoV TRS (TCTCAACT) al frente de (partes de) el gen a expresarse .

V.3.a. Construcción de una vacuna multivalente con base en un vector HCoV que protege contra el virus sincitial respiratorio (RSV) Obj etivo : Desarrollo de una vacuna RVS con base en una cepa HCoV atenuada viva que carece de genes no esenciales. Procedimiento : (Partes de) los genes HN y F RSV relacionados con la protección se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en ????. Después de confirmar todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, los virus recombinantes se generan como se describe anteriormente. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión: (Partes de) los genes HN y F RSV relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse de una cepa HCoV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra infecciones RSV y HCoV.

V.3.b. Construcción de una vacuna multivalente con base en un vector HCoV que protege contra el rotavirus Obj etivo : Desarrollar una vacuna de rotavirus con base en una cepa HCoV atenuada viva que carece de genes no esenciales . Procedimiento : (Partea de) los genes VP4 , VP6 y VP7 del rotavirus relacionados con la protección se colocan en casetes de protección y posteriormente se introducen en ????. Después de confirmar todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan virus recom inantes como se describe arriba. Loa virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. Las expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusión : (Partes de) los genes VP4 , VP6 y VP7 del rotavirus relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse de, una cepa HCoV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden funcionar como una vacuna recombinante para proteger contra infecciones de rotavirus y HCoV.

V.3.c. Construcción de una vacuna multlvalente con base en un vector HCoV que protege contra el virus tipo Norwalk Qbj etivo : Desarrollo de una vacuna del virus tipo Norwalk con base en una cepa HCoV atenuada que carece de genes no esenciales. Procedimiento : (Partes de) el gen de cápsida del virus tipo Norwalk relacionado con la protección, se coloca en casetes de expresión, y posteriormente se introduce en ????. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan virus recombinantes como se describe arriba. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación. Conclusiones : (Partes de) el gen de cápsida del virus tipo Norwalk relacionado con la protección puede introducirse en y expresarse de una cepa HCoV atenuada viva . Este virus recombinante puede por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra el virus tipo Norwalk e infecciones HCoV.

V.3.d. Construcción do una vacuna multivalente con base en un vector HCoV que protege contra el virus de influenza Objetivo: Desarrollo de una vacuna del virus de influenza con base en una cepa HCoV atenuada viva que carece de genes no esenciales. Procedimiento : (Partes de) los genes H y N del virus de la influenza relacionados con la protección se colocan en casetes de expresión, y posteriormente se introducen en ????. Después de la confirmación de todos los constructos por análisis de restricción y secuencia, se generan virus recombinantes como se describe arriba. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. La expresión del gen externo se confirma por análisis de inmunoprecipitación.

Conclusión : (Partes de) los genes H y N del virus de la influenza relacionados con la protección pueden introducirse en y expresarse de una cepa HCoV atenuada viva. Estos virus recombinantes pueden por lo tanto funcionar como una vacuna multivalente para proteger contra el virus de influenza e infecciones HCoV.

V.4. Generación de virus recombinantes con orden de gen reconfigurado Objetivo: Desarrollo de una vacuna HCoV en la cual la eliminación de genes no esenciales se combina con un orden de gen reconfigurado al mover el N en dirección ascendente del gen S en el genoma HCoV. Procedimiento : Se generan virus recombinantes esencialmente como se describe por Thiel et al. (2001). Se ensamblan clones de ADNc HCoV infecciosos en el genoma del virus de vacuna. El virus de vacuna vHCoV-vec-1 contiene un fragmento de ADNc de 22.5 kbp codificado en el extremo 5' del genoma HCoV. Este fragmento se remueve del genoma del virus de vacuna por digestión con Bsp 1201, digestión con luI y ligado a un fragmento de ADNc de la recolocación ???? que se obtiene por la digestión con Mlul/Eagl. La recolocación ???? contiene un fragmento de ADNc que codifica el extremo 3' del genoma HCoV, pero carece del gen 4a/b, sin interferir con loa otros genes o secuencias reguladoras de transcripción, y en el cual el gen N, junto con su TRS, se coloca en dirección ascendente del gen S. La recolocación ???? se deriva de pME al usar métodos de mutagénesis PCR convencional. Los productos de ligados se ligan a ADN del virus de vacuna vNotl/tk. Se generan los virus de vacuna recombinantes como se describe arriba. Los virus recombinantes se colocan en una placa purificada y se caracterizan por PCR y análisis de manchado Southern. Finalmente, los genes HCoV que carecen de 4a/b infeccioso se generan como sigue: se infectan células de riñón de pollo (CK) con virus de viruela de las aves recombinante que expresa la polimerasa de ARN T7. Posteriormente las células se transfectan con ADN aislado del virus de vacuna recombinante que contiene los genes HCoV que carecen del clon de ADNc 4a/b, en combinación con el orden de gen reconfigurado . Tres días después de la infección, el medio de cultivo se colecta y se usa para infectar células de fibroblasto largas humanas (MRC-5) para generar grandes cantidades de HCoV recombinantes. Los virus recombinantes se confirman genéticamente por análisis RT-PCR. Conclusión : Se genera HCoV recombinante que carece de los genes 4a/b en combinación con un orden de gen colocado. Estos virus pueden funcionar como una vacuna atenuada viva contra HCoV-229E. Cuando se combinan con los constructos del gen S de HcoV-OC43 y/o los constructos del gen de otros patógenos humanos adicionales, pueden generarse vacunas multivalentes .

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Nucleocapsid- independent assembly of coronavirus-like partióles by coexpression of viral envelope proteins. EMBO J. 15:2020-2028. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una partícula tipo virus aislada o recombinante capaz de la replicación, caracterizada porque la partícula se deriva de un coronavirus del cual al menos un fragmento funcional de un ácido nucleico codifica un producto de gen viral diferente a la polimerasa, o se elimina una proteína estructural N, M, E o S . 2. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se deriva del grupo I de coronavirus en donde el ácido nucleico codifica un producto de gen 3a, 3b, 3c, 7a o 7b. 3. Una partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se deriva del grupo II de coronavirus en donde el ácido nucleico codifica un producto de gen 2a, HE, 4a, 4b, o 5a. 4. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se deriva de un grupo III de coronavirus en donde el ácido nucleico codifica el producto de gen 3a, 3b, 5a o 5b. 5. Una partícula tipo virus aislada o recombinante capaz de la replicación, caracterizada porque la partícula se deriva del coronavirus en donde los genes de la proteínas estructurales no se presentan en el orden 5 ' -S-E-M-N-3 ' . 6. La partícula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque al menos un fragmento funcional de un ácido nucleico codifica un producto de gen viral diferente a la polimerasa, o se retira una proteína estructural N, M, E, o S. 7. La partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizada porque se proporciona con al menos una proteína biológicamente activa o fragmento de la misma asociada con la superficie de la partícula tipo virus diferente al ectodominio natural de cualesquiera de las proteínas del coronavirus original . 8. La partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizada porque se proporciona con al menos una proteína biológicamente activa o fragmento de la misma asociada con el lado interno de la partícula tipo virus diferente al endodominio natural de cualesquiera de las proteínas del coronavirus original . 9. La partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizada porque se proporciona con al menos un medio de direccionamiento funcional asociado con la superficie de la partícula tipo virus diferente a la proteína espícula natural del coronavirus original . 10. La partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizada porque la partícula se proporciona con un genoma del coronavirus en donde el gen externo o partes del mismo se han insertado. 11. La partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizada porque está atenuada . 12. La partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizada porque es un vehículo de administración de genes. 13. La partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizada porque es un vehículo de administración de antígenos o epítopos. 14. Una composición caracterizada porque comprende una partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13 para uso terapéutico. 15. Una composición caracterizada porque comprende una partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, y un portador f rmacéuticamente aceptable para usarse como un inmunógeno o vacuna. 16. Una composición caracterizada porque comprende una partícula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, para su uso en diagnóstico. 17. Un método para inhibir o bloquear una infección con un coronavirus o partícula tipo coronavirus (VLP) , caracterizado porque comprende el tratamiento de un organismo con un péptido de repetición en grupo de siete o fragmento funcional del mismo como se muestra en la figura 20. Reeximen de la Invención La invención se refiere al campo de coronavirus y diagnóstico, uso terapéutico y vacunas derivadas de los mismos. La invención proporciona coronavirus replicados y partículas tipo virus replicadas (VLP) de las cuales partes grandes de su genoma se (al menos funcionalmente) eliminan sin abolir sus capacidades replicativas . Tal eliminación resulta preferiblemente en al menos una eliminación funcional en la cual el gen correspondiente no está, o solo parcialmente, expresado por lo cual el producto de gen resultante es disfuncional o al menos funcionalmente distinto de un correspondiente producto de gen de tipo silvestre. Un resultado sorprendente se observa con VLP proporcionados con eliminaciones como se proporciona en la presente, en el cual el VLP eliminado, si bien es capaz de la replicación in vitro e in vivo, generalmente está bien atenuado, en que estos no causan enfermedades en el hoapedador objetivo, haciéndolo muy apropiado para uso terapéutico, tal como un vehículo de administración para genes y otras cargas (por lo cual la dirección especifica puede proporcionarse cuando se desee) , y para usarse como un vacuna, siendo atenuada mientras porta determinantes inmunogénicos importantes que ayudan a la elección de una respuesta inmune.