PL207933B1 - Wyizolowana lub zrekombinowana replikatywna cząsteczka podobna do koronawirusa, kompozycja zawierająca tą cząsteczkę do zastosowania terapeutycznego, do zastosowania jako immunogen lub szczepionka i do zastosowania diagnostycznego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana lub zrekombinowana replikatywna cząsteczka podobna do koronawirusa, kompozycja zawierająca tą cząsteczkę do zastosowania terapeutycznego, do zastosowania jako immunogen lub szczepionka i do zastosowania diagnostycznego.

Koronawirusy mają raczej prostą budowę. Posiadają nukleokapsyd otoczony błoną lipidową. Helikalny nukleokapsyd składa się z genomowego RNA otoczonego jednym typem białka, nukleokapsydowym białkiem N. Otoczka wirusowa ogólnie zawiera trzy białka błonowe: białko kolca (S), białko błonowe (M) i białko otoczki (E). Niektóre koronawirusy mają w swojej błonie czwarte białko, białko esterazy hemaglutyniny (HE). Jak wszystkie wirusy koronawirusy kodują ogromną różnorodność produktów genowych i białkowych. Najważniejszymi z nich są oczywiście białka odpowiedzialne za funkcje związane z replikacją wirusa i strukturą wirionu. Poza tymi funkcjami wirusy ogólnie określają różnorodne zbiory białek, których funkcja jest nadal nieznana, a o których wiadomo lub przypuszcza się, że w jakiś sposób są korzystne dla wirusa. Białka te mogą być zarówno funkcjonalnie zasadniczymi dla replikacji wirusa w hodowli komórkowej lub mogą być niepotrzebne. Koronawirusy stanowią rodzinę dużych RNA wirusów o nici plus, które zazwyczaj powodują zakażenia układu oddechowego i jelitowe u wielu róż nych gatunków. Opierają c się na antygenowym, genetycznym i strukturalnym kryterium białka mogą być one podzielone na trzy różne grupy: grupa I, II i III. Obecnie, z uwagi na znaczne różnice pomiędzy grupami klasyfikacja do trzech, różnych rodzajów jest dyskutowana przez znaną grupę badawczą ICTV. Właściwościami posiadanymi przez wszystkie te wirusy jest specyficzny zespół genów warunkujących replikację i funkcje strukturalne. Sekwencje występujące pomiędzy i otaczające te geny różnią się znacznie pomiędzy grupami i są bardziej lub mniej specyficzne dla każdej grupy. Podstawowe geny zajmują około dwóch trzecich genomu. Umiejscowiony po jego 5' stronie tzw. gen polimerazy koduje dwa duże prekursory dające liczne funkcjonalne produkty cięcia, które są wspólnie odpowiedzialne za replikację i transkrypcję RNA. Inne, podstawowe geny określają białka strukturalne N, M, E i S. Białko nukleokapsydu (N) upakowuje wirusowy RNA tworząc rdzeń wirionu. Ta struktura (RNP) jest otoczona przez otoczkę lipidową, w której białko błony (M) występuje powszechnie tworząc gęstą macierz. Z białkiem M związane jest małe białko otoczki (E) i biał ko kolca (S), to ostatnie tworzy peplomery wirusa związane z fuzją wirus-komórka i komórka-komórka. Geny dla tych białek strukturalnych niezmiennie występują w genomie wirusa w porządku 5'-S-E-M-N-3'.

W zakaż onych komórkach nukleokapsydy koronawirusa są składane w cytoplazmie. Nukleokapsydy oddziałują z białkami otoczki wirusa, które po ich syntezie w retikulum endoplazmatycznym gromadzą się w kompartmencie pośrednim, systemie błonowym umiejscowionym pomiędzy retikulum endoplazmatycznym (ER) i kompleksem Golgiego. Ten system błon działa jako kompartment pączkowania: oddziaływanie nukleokapsydów z białkami otoczki wirusa prowadzi do oddzielenia wirionów, które są następnie uwalniane z komórki przez egzocytozę.

Obecnie pokazano, że składanie cząsteczek koronawirusa nie wymaga udziału nukleokapsydów. Cząsteczki pozbawione nukleokapsydu są składane w komórce, gdzie współekspresji ulegają geny białka otoczki wirusa. Minimalnymi wymaganiami dla tworzenia wiruso-podobnych cząsteczek wirusa (ang. virus-like particles) (VLP) są: białko M i E; białko S jest zbędne, lecz jest włączane jeśli występuje dzięki swojemu oddziaływaniu z białkiem M. Analizy biochemiczne i elektronomikroskopowe pokazały, że VLP są homogenne pod względem wielkości i mają podobne wymiary jak prawdziwe koronawirusy. Jasnym jest, że białka M i E mają zdolność do wiązania się ze sobą w płaszczyźnie błon komórkowych i wywoływania krzywizny prowadzącej do wypączkowania specyficznych „nośników, które są następnie wydzielone z komórek. Artykuł opisujący te wyniki ukazał się w EMBO Journal (tom 15, str. 2020-2028, 1996).

W kolejnym artykule pokazano cząsteczki typu koronawirusa, które nie posiadały nukleokapsydu, tutaj składanie nie miało miejsca niezależnie od nukleokapsydu (Bos i wsp., Virology, 218, 52-60, 1995). Ponadto, pakowanie RNA nie było bardzo wydajne. Ponadto, żadna z tych dwóch publikacji nie dostarcza dostatecznych właściwości adresowania i dostarczenia, które uczyniłyby VLP użytecznymi jako terapeutyczny nośnik, przykładowo wyposażonymi w specyficzną informację pozwalającą na adresowanie i/lub informację genetyczną i nie genetyczną.

Jednakże, koronawirusy posiadają szereg znaczących korzyści teoretycznych co do ich zastosowania jako wektorów w stosunku do innych wirusowych systemów ekspresji (patrz również WO 98/49195): (i) koronawirusy są jednoniciowymi wirusami RNA, które replikują się w cytoplazmie bez

PL 207 933 B1 pośredniczącego DNA, czyniąc mało prawdopodobnym integrowanie wirusowego genomu do chromosomu komórki gospodarza; (ii) wirusy te mają największe znane genomy RNA mające dostatecznie dużo miejsca dla wprowadzenia dużych, obcych genów; (iii) ponieważ koronawirusy ogólnie zarażają powierzchnię śluzówki układu oddechowego jak i śluzówki jelitowej, mogą być użyte dla indukcji silnej, wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej; (iv) tropizm koronawirusów może być zmodyfikowany przez manipulowanie białkiem kolca (S) pozwalającym na przebudowę tropizmu i wirulentności wektora; i (v) nie patogenne szczepy koronawirusów zarażające większość interesujących gatunków są dostępne dla opracowania systemów ekspresji.

Opracowano dwa typy wektorów ekspresyjnych opartych na genomach koronawirusów. Jeden wymaga dwóch składników (zależny od wirusa pomocniczego) a drugi genomu pojedynczego, który jest zmodyfikowany zarówno przez rekombinację nacelowywaną lub poprzez przebudowanie cDNA kodującego zakaźny RNA. Zależne od wirusa pomocniczego systemy ekspresji, nazwane również mini genomami zostały opracowane przy pomocy przedstawicieli tych trzech grup koronawirusów. Minigenomy pochodzące od koronawirusa posiadają teoretyczną pojemność klonowania zbliżoną do 25 kb, podczas gdy minigenomy RNA o około 3 kb są wydajnie powielane i pakowane przez wirus pomocniczy i ten genom wirusa ma około 30 kb. Jest to zasadniczo największa pojemność klonowania dla wektora opartego na wirusowych genomach RNA.

Odwrotna genetyka była możliwa przez ukierunkowaną rekombinację pomiędzy wirusem pomocniczym a niezdolnym do replikacji lub replikującym, pochodzącym z koronawirusa RNA (9). Ukierunkowana rekombinacja realizowana jest przez jeden lub dwa crossing-over. Zmiany wprowadzono w genie S, które zmodyfikował y patogenność MHV. Do MHV wprowadzono gen kodują cy zielone biał ko fluorescencyjne (GFP) pomiędzy genami S i E przez ukierunkowaną rekombinację tworzącą wektor, który jest największym znanym RNA genomem wirusowym (1d). Mutacje uzyskano również przez ukierunkowaną mutagenezę w obrębie genów dla E i M pokazując kluczowe znaczenie tych genów dla składania.

Konstrukcja pełnej długości klonu genomowego cDNA może znacząco usprawnić manipulacje genetyczną koronawirusem. Obecnie możliwą stała się konstrukcja zakaźnego klonu TGEV cDNA (1c). Dla uzyskania zakaźnych cDNA połączono trzy strategie: (i) konstrukcje pełnej długości cDNA rozpoczęto od DI, który był stabilnie i wydajnie zastąpiony przez wirus pomocniczy. Przy pomocy tego DI pełnej długości genom został skompletowany i powiększenie genomu sprawdzono po każdym etapie. Podejście to pozwoliło na zidentyfikowanie fragmentu cDNA, który był toksyczny dla bakteryjnego gospodarza. Spostrzeżenie to wykorzystano dla uzyskania korzyści przez ponowne wprowadzenie toksycznego fragmentu do wirusowego cDNA w ostatnim etapie klonowania; (ii) w celu uzyskania ekspresji długiego genomu koronawirusa i w celu dodania użyto 5' cap dwuetapowego systemu amplifikacji, który umożliwia transkrypcje w jądrze komórkowym z promotora CMV z drugą amplifikacją w cytoplazmie, prowadzoną przez wirusową replikazę; i (iii) w celu zwiększenia stabilności wirusowego cDNA w bakterii, cDNA sklonowane jako sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) wytwarzający jedynie jedną lub dwie kopie plazmidu na komórkę. Pełnej długości cDNA podzielono na dwa plazmidy ponieważ jego włączenie do jednego zmniejszało stabilność cDNA. Jeden plazmid zawiera wszystkie sekwencje wirusowe z wyjątkiem fragmentu Clal do Clal o długości około 5 kb, który był włączony do drugiego BAC. W pełni funkcjonalny zakaźny klon cDNA, prowadzący do wirulentnego wirusa zdolnego do zarażenia zarówno układu pokarmowego jak i oddechowego zbudowano przez wbudowanie fragmentu Clal do pozostałości sekwencji cDNA TGEV.

Jak wspomniano, skonstruowano systemy ekspresji zależne od wektora pomocniczego, oparte na dwóch składnikach i pojedynczych genomach skonstruowanych przez ukierunkowaną rekombinację lub przy użyciu infektywnego cDNA. Scharakteryzowano sekwencje, które regulują transkrypcję.

Uzyskano ekspresję dużych ilości heterologicznych antygenów (1 do 8 μg/10⁶ komórek) i utrzymywano ekspresję przez około 10 szczepień. Te poziomy ekspresji powinny być dostateczne dla wywołania ochronnych odpowiedzi immunologicznych.

Pojedynczy genom wektorów koronawirusowych został skonstruowany w celu osiągnięcia wydajnej ekspresji obcego genu takiego jak GFP. W ten sposób utworzony został nowy kierunek dla koronawirusów, które mają unikalne właściwości takie jak duży genom oraz tropizm jelitowy, co czyni je bardzo interesującymi jako wektory ekspresyjne, przy czym zarówno dla opracowania szczepionki jak i dla terapii genowej spełnione muszą być również i inne warunki, to znaczy w granicach wymagań musi mieścić się zarówno znacząca wirulencja konstruktów wektora dla gospodarza jak i żywotność konstruktów wektora w hodowli komórkowej. Z drugiej strony, wektor może nie pozostawać zbyt wiru4

PL 207 933 B1 lentnym, lecz powinien posiadać przynajmniej kilka atenuowanych właściwości czyniąc go użytecznym dla replikacji in vivo jako nośnika dostarczającego gen lub szczepionkę gospodarzowi lub podmiotowi podlegającemu leczeniu. Z drugiej strony wektor powinien dobrze replikować się w hodowli komórkowej, przynajmniej gdy pożądane jest jego komercyjne użycie.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana lub zrekombinowana replikatywna cząsteczka podobna do koronawirusa, w której naturalny porządek genów dla białek strukturalnych 5'-S-E-M-N-3' jest zmieniony przez reanranżację genów.

W cząsteczce według wynalazku korzystnie usunięty jest co najmniej funkcjonalny fragment z kwasu nukleinowego kodującego produkt genu wirusowego innego niż polimeraza lub białko strukturalne N, M, E lub S.

Cząsteczka według wynalazku jest dostarczona z co najmniej jednym białkiem związanym z powierzchnią wspomnianej cząsteczki podobnej do korona wirusa, który to fragment jest wybrany z grupy składającej się z ektodomeny białka kolca lub jego części innego koraonawirusa, ektodomeny białka otoczki lub jego części wirusa nie należącego do koronawirusów, enzymatycznie aktywnej cząsteczki i domeny aminokońcowej lub jej części jakiegokolwiek błonowego nie-wirusowego białka typu I.

W nastę pnym korzystnym wykonaniu, czą steczka według wynalazku dostarczona jest z co najmniej jednym biologicznie aktywnym białkiem lub jego fragmentem związanym z wnętrzem wspomnianej cząsteczki podobnej do koronawirusa, innej niż naturalna endodomena któregokolwiek białka oryginalnego koronawirusa.

Również korzystnie, cząsteczka dostarczona jest z co najmniej jednym funkcjonalnym środkiem adresowania związanym z powierzchnią wspomnianej cząsteczki podobnej do koronawirusa, innej niż naturalne białko kolca koronawirusa.

W kolejnym korzystnym wykonaniu, cząsteczka według wynalazku jest dostarczona z genomem koronawirusa, do którego został wbudowany obcy gen lub jego część.

Ponadto, cząsteczka według wynalazku korzystnie jest cząsteczką atenuowaną.

Cząsteczka według wynalazku jest korzystnie nośnikiem dostarczającym gen.

Cząsteczka według wynalazku, korzystnie jest antygenem lub epitopem dostarczającego nośnika.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca wyizolowaną lub zrekombinowaną replikatywną cząsteczkę podobną do koronawirusa, w której naturalny porządek genów dla białek strukturalnych 5'-S-E-M-N-3' jest zmieniony przez reanranżację genów dla zastosowania terapeutycznego.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca cząsteczkę jak zdefiniowano powyżej i farmaceutycznie akceptowalny nośnik dla zastosowania jako immunogen lub szczepionka.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca szczepionkę jak zdefiniowano powyżej dla zastosowania diagnostycznego.

Ogólnie w wynalazku opisano replikującego się koronawirusa i replikujące się cząsteczki typu korona (VLP), w których usunięto duże części ich genomu (przynajmniej funkcjonalnie) i/lub przebudowano nie znosząc ich zdolności do replikacji. Wspomniana delecja jest korzystnie uzyskana jako przynajmniej delecja funkcjonalna pod tym względem, że gen koronawirusa nie ulega wcale lub ulega jedynie częściowej ekspresji, w konsekwencji czego brak jest produktu genu, gen jest pozbawiony swojej funkcji lub przynajmniej funkcjonalnie odmienny od odpowiadającego mu genowego produktu typu dzikiego. Pewien zaskakujący wynik obserwowany dla VLP dostarczonych z delecjami i/lub przebudowaniami jakie tu opisano jest taki, że wspomniane delecje lub rearanżacje VLP zachowują zdolność do replikacji in vitro i in vivo i ogólnie są dobrze attenuowane pod tym względem, że nie powodują choroby (lub wywołują ją w znacznie mniejszym stopniu) u docelowego gospodarza, czyniąc go bardzo użytecznym dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo jako nośnik dostarczania genu lub innej transportowanej substancji (co za tym idzie zapewnione może być specyficzne adresowanie, gdy jest to pożądane) lub dla użycia jako szczepionka, będąc attenuowanymi gdy przenoszą ważną determinantę immunogenową pozwalającą na wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Takie determinanty (homologiczne lub heterologiczne) koronawirusów mogą także pochodzić z innych patogenów. Innymi słowy wynalazek pozwala na zastosowanie replikującej się VLP z częściowo usuniętym i/lub przebudowanym genomem jako wektora. Do wektora tego może być wprowadzona sekwencja obcego kwasu nukleinowego. Ta sekwencja obcego genu koduje (część) białko. To białko lub jego część, kodowane przez wbudowaną sekwencję, może służyć jako immunogen lub „element adresujący (ligand zdolny do wiązania się z receptorem).

PL 207 933 B1

W korzystnej postaci, wspomniane VLP jakie tu dostarczono są dalej modyfikowane na jeden lub wiele sposobów, genomicznie lub w ich białkowym składzie, przez co eksponują na swojej powierzchni różne biologiczne lub docelowe cząsteczki i/lub przenoszą w tych cząstkach cząsteczki z aktywnoś cią biologiczną , która powinna być zabezpieczona lub osł abiana i/lub zawierają genomy do których włączono obce geny lub sekwencje. Jednymi z głównych potrzeb współczesnej medycyny są systemy dla ukierunkowanego dostarczenia do ciała czynników terapeutycznych. W konsekwencji, opracowanie nośników, które mogą skierować zawartość do specyficznych grup komórek i wprowadzić tą zawartość do tych komórek tak, że może ona ujawnić swoją aktywność biologiczną, jest głównym celem w badaniach biomedycznych. W opracowanie i testowania systemów opartych na liposomach, mikrosferach, przeciwciałach itp. dla dostarczenia leków, genów, peptydów i białek już został włożony wielki wysiłek. Choć wiele tych podejść jest obiecujących to do chwili obecnej sukces w tym względzie jest ograniczony. Genom VLP jaki tu dostarczono posiada delecję i/lub uległ rearanżacji w takim zakresie, że nie zniesiona jest jego zdolność do replikacji i służy on bardzo dobrze jako adresujący nośnik dla wspomnianej zawartości. Dostarczając wspomniane VLP z zawartością lub użycie VLP jako wektora jest np. dokonane przez wbudowanie sekwencji obcego genu kodującej pożądaną cząsteczką taką jak ligand lub cząsteczka wiążąca, czy jest immunogenem czy cząsteczką wiążącą receptor lub jakimkolwiek innym białkiem lub peptydem. W korzystnej postaci wspomniany ładunek obejmuje kwas nukleinowy, do którego włączono obce geny lub sekwencje. Obce geny mogą być wyrażone przez VLP zarówno poprzez dodatkowe wbudowanie takiego genu do genomu lub przez zastosowanie przestrzeni genetycznej stworzonej przez usunięcie nieistotnych genów. Dla dalszego zwiększenia bezpieczeństwa leczenia dostarczeniem genu przy pomocy wirusów typu korona, takiego jak dostarczony tu VLP, wynalazek pozwala na rozwinięcie metody hamowania lub ogólnie blokowania zakażenia koronawirusami i cząsteczkami typu koronawirusów w szczególności, obejmującego leczenie organizmu lub komórek zagrożonych zakażeniem lub zakażonych takimi koronawirusami lub VLP z tzw. hepta powtórzonymi peptydami jak tu opisano. W przypadku wszystkich koronawirusów stwierdzono, że posiadają jeden lub dwa charakterystyczne hepta powtórzone obszary w ich białku S, które są narzędziem podczas wnikania koronawirusa do komórki. Peptydy pochodzące z proksymalnego błonowego obszaru hepta powtórzeń (HR2; np. dla szczepu MHV peptyd A59 składa się z aminokwasów 1216-1254 białka S, patrz również Fig. 20) i są szczególnie silnymi inhibitorami zakażenia jak również fuzji zakażonych komórek otaczającymi je cząsteczkami, jak określono w szczegółowym opisie ilustrującym dostarczone korzyści. Oczywiście leczenie peptydem nie jest ograniczone do przypadku terapii genowej lub terapii dostarczenia nośnika jaki tu przedstawiono, lecz może być również użyta w zapobieganiu lub ogólnie leczeniu zarażeń koronawirusowych.

Wynalazek dostarcza replikatywnych VLP, które są również zmodyfikowane w ektodomenie i/lub endodomenie białka wirusowego. Przykładowo, modyfikując ektodomenę białka kolca, dostarczony jest VLP ze zmodyfikowanymi cząsteczkami biologicznymi w sensie adresowania, które służą do kierowania VLP do oddziaływania z innymi cząsteczkami biologicznymi, które odzwierciedlają lub mogą oddziaływać z celem takim jak receptory białkowe na komórkach, być receptorami hormonu, specyficznymi immunoglobulinami na komórkach B, MHC i cząsteczkami towarzyszącymi MHC obecnymi na komórkach T i innymi komórkami przenoszącymi białka lub innymi cząsteczkami receptora znanymi fachowcom w dziedzinie powierzchniowych receptorów komórkowych. Adresowanie może również być zapewnione dla oddziaływania ze znanymi miejscami wiązania wybranych enzymów z białkami lub innymi cząsteczkami służącymi jako substraty dla wybranego enzymu.

Replikujące się VLP według wynalazku są dostarczone w postaci prezentującej determinantę immunogeniczną, taką jak toksyna bakteryjna lub heterologiczne białko wirusowe lub bakteryjne zawierające odpowiednią determinantę antygenową specyficzną dla patogenności. Jest to przykład, w którym VLP służy jako immunogen lub szczepionka, przykładowo tu skierowana przeciwko toksynie bakteryjnej. Limfocyty B niosące odpowiednią immunoglobulinę na swojej powierzchni są przypadkiem adresowania komórek do VLP rozpoznanych przez limfocyt B, ta komórka(i) będzie powielała się wytwarzając odpowiednie przeciwciała.

Przygotowanie koronawirusów lub VLP ze zmodyfikowanymi kolcami może być osiągnięte genetycznie przez modyfikowanie genomu wirusowego tak, że wyraża on w zarażonych komórkach zmodyfikowane białko S. Dostarczone są również tu preparaty koronawirusów o zmienionych kolcach, na różne sposoby, przez ekspresję zmodyfikowanych genów S w komórkach, które są ponadto zarażone koronawirusami. Współwbudowanie zmienionych w wyniku mutacji kolców dostarcza wirusów o nowych wł a ś ciwoś ciach adresują cych. W jednej postaci wynalazek dostarcza czą steczkę typu koro6

PL 207 933 B1 nawirusa (VLP) zawierający genom z przynajmniej fragmentem szeregu genów lub grup genów nie należących do genów związanych z funkcjami polimerazy (ORF1a/1b) lub strukturalne białka N, M, E i S usunięte bez całkowitej utraty zdolności do replikacji, co za tym idzie dostarczając te VLP o korzystnych właściwościach dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo jako wektora celem dostarczenia genu lub dla zastosowania jako szczepionki dostarczającej dogodny antygen lub epitop dla wywołania odpowiedzi immunologicznej w interesującym gospodarzu. Innymi słowy, nie istotne geny koronawirusów nie są kluczowe dla wzrostu in vivo lecz określają wirulentność wirusa. Attenuacja spowodowana ich delecją dostarcza, co za tym idzie, doskonałych szczepionek wirusowych i leczniczych wektorów. Dostarczenie genu lub szczepienie koronawirusami może obecnie być osiągnięte dzięki wiedzy dającej pewność, że cząsteczki typu wirusowego dostarczające gen lub interesujący antygen są dostatecznie attenuowane, aby nie powodować specyficznej choroby wywołanej koronawirusem. Oczywiście, wśród VLP, którym usunięto jakikolwiek lub szereg z wyżej wspomnianych nieistotnych genów, wynalazek dostarcza również VLP dostarczonych z korzystnie funkcjonalnymi pod względem istotnego fragmentu peptydu z przynajmniej 4 oryginalnych aminokwasów, korzystnie przynajmniej 40, i nie jest wyrażany, usunięty żaden lub geny kodujące białka struktury, w szczególności taka delecja białka struktury prowadzi do VLP o zmodyfikowanym kolcu, o innej niż naturalna ektodomenie (lub endodomenie) białka kolca oryginalnego koronawirusa.

Wirusy z grupy I, włącznie z wirusem powodującym zapalenie jelit kotów (VIPV) prawdopodobnie jako najbardziej złożonym przedstawicielem, posiadają swoje typowe geny umiejscowione pomiędzy genami S i E i poniżej genu N, tj. pomiędzy genem N i 3' UTR (obszar nie podlegający translacji). Wirusy grupy II, do których należą wirusy mysiej żółtaczki (MHV), posiadają swoje szczególne geny pomiędzy genem kodującym polimerazę i genami S i genami dla białek S i E. Jedno z kodowanych białek charakterystycznych dla tej grupy to białko esterazy hemaglutyniny (HE), które jest wbudowane do wirionów i którego aktywności hemaglutynizujące i esterazy zostały wykazane. Aktywności HE nie są istotne i ich znaczenie wymaga oceny. Ostatecznie, również wirusy grupy III, których prototypem jest wirus zarażający oskrzela (IBV), posiadają sekwencje pomiędzy genami S i E, lecz również pomiędzy genami M i N. Podczas gdy dla pewnych genów grupowo specyficznych nie można wykryć produktów ekspresji w zarażonych komórkach, dla innych (np. gen HE w MHV) naturalnie występujące mutanty wirusa, które zaobserwowano posiadają delecje w tych genach, istniej możliwość, że w przypadku pewnych z tych genów istotne lub kluczowe są nie produkty białkowe lecz inne produkty ekspresji genów, takie jak sekwencje nukleotydowe (DNA lub RNA).

Rozważając, że w oparciu o organizacje genomu, rozróżnione mogą być trzy grupy koronawirusów, wynalazek dostarcza dla grupy I (FCoV) zrekombinowanego VLP, z którego korzystnie fragment (korzystnie dający przynajmniej funkcjonalną delecję odpowiedniego genu, który nie jest lub jedynie częściowo ulega ekspresji w konsekwencji czego brak jest produktu genu, pozbawiony funkcji lub przynajmniej funkcjonalnie inny od odpowiadającego mu produktu genu typu dzikiego) z genu 3a, 3b, 3c, 7a lub 7b lub wspomniany gen jako całość został usunięty. Takie VLP z delecją pozostają zdolne do replikacji in vitro i in vivo i są dobrze attenuowane i co jest kluczowe, nie powodują choroby u docelowego gospodarza, co czyni je bardzo dogodnymi dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo jako dostarczające nośników dla genów i innych ładunków (gdy specyficzne adresowanie może być dostarczone, gdy jest to pożądane) i dla użycia jako szczepionka, będąc attenuowanymi i jednocześnie niosąc ważne determinanty immunogeniczne pozwalające na wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Takie wirusy grupy I z delecją, szczególnie kocie koronawirusy, takie jak FIPV, z których fragment odpowiadający genowi 3c i/lub 7b został usunięty, jest szczególnie bezpośrednio użyteczny jako szczepionka, bowiem wyraża odpowiednie determinanty antygenowe i immunogeniczne przez swoje strukturalne (przykładowo kolec) białka i ma funkcjonalną delecję tak, że uzyskana jest attenuacja prowadząca do bezpiecznej i skutecznej szczepionki. Takie żywe, attenuowane wirusy nadal wywołują najpełniejsze spektrum humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej wymaganej dla ochrony przed zarażeniem i/lub chorobą. Ponadto, tak jak usunięte VLP dla zapobiegania chorobie kotów mogą być dostarczone heterologiczne białka (lub ich funkcjonalne fragmenty), takie jak (gliko)proteiny wirusa białaczki kota, kociego kalicywirusa, kociego wirusa opryszczki, pozwalające na wytworzenie szczepionki biwalentnej lub nawet multiwalentnej. Gdy jest to pożądane inne immunologicznie lub terapeutycznie ważne białka, takie jak cytokiny, są włączone zamiast lub równocześnie. Ponadto, wynalazek dostarcza dla grupy II (MHV) zrekombinowanego VLP, z którego korzystnie fragment (korzystnie dający przynajmniej funkcjonalną delecję) z genu 2a HE, 4a, 4b lub 5a wspomnianego genu jak również cały zostały usunięte. Wirusy grupy II z takimi delecjami, szczególnie MHV, są

PL 207 933 B1 dostarczone z korzystnymi właściwościami dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo szczególnie jako wektor dla dostarczania. Takie VLP z delecją pozostają zdolne do replikacji in vitro i in vivo jak również attenuowane tak, że zasadniczo nie powodują choroby u docelowego gospodarza tworząc go bardzo dogodnym dla zastosowania terapeutycznego, jako nośniki dla genów i innego ładunku (gdy dostarczone może być specyficzne adresowanie, jeśli jest to pożądane) i dla użycia jako szczepionka, będąc attenuowanymi, niosąc jednocześnie ważne determinanty immunogenowe pomagające w wywoł aniu odpowiedzi immunologicznej.

Dla grupy III (IBV) dostarczony jest zrekombinowany VLP, z którego korzystnie fragment (korzystnie powodujący przynajmniej funkcjonalną delecję) z genu 3a, 3b, 5a lub 5b lub cały wspomniany gen, zostały usunięte. W innej postaci dla grup I, II lub III wynalazek dostarcza cząsteczkę typu wirusa zdolną do replikacji, wspomniana cząsteczka pochodzi w koronawirusa, w którym geny dla białek struktury nie występują w kolejności 5'-S-E-M-N-3'. Takie replikatywne VLP o przebudowanej kolejności genu mają dwie ważne właściwości. Jedną jest bezpieczeństwo wynikające z faktu, że homologiczna rekombinacja genomu VLP z przypadkowym wirusem o naturalnym pochodzeniu jest nieprawdopodobna jako wytwarzająca żywotne, nowe potomstwo. Inną, jest attenuowanie wynikające z przetasowania tych genów. Takie, replikatywne VLP o zmienionej kolejno ś ci genów dostarczają dobrze attenuowanych VLP dla szczepienia lub zastosowania dla dostarczenia genu i jest dostarczony tu z delecjami również nieistotnych genów. Pokazano tu, że zmiany w tzw. niezmiennym porządku genów wpływają na funkcje polimerazy (ORF1a/1b) i białek struktury S, E, M i N w genomie koronawirusa jest, co zaskakujące dobrze tolerowane, przykładowo, VLP o porządku genów S, M, E, N lub E, S, M, N są proste do uzyskania. Również w różnych miejscach genomu wirusa mogą być wbudowane obce geny, zarówno jako gen dodatkowy lub zastępując usunięte nieistotne geny; geny te ulegają ekspresji i są stabilnie utrzymywane podczas pasażowania wirusa.

W kolejnej postaci, wynalazek dostarcza zrekombinowanego VLP, w którym kwas nukleinowy kodujący białko S został zmodyfikowany przynajmniej przez częściową delecję. Białko S tych wirusów jest odpowiedzialne za wiązanie z receptorem komórkowym i następnie za fuzje błony wirusa i komórkowej podczas wnikania. Te dwie funkcje te zachodzą w oddzielnych obszarach cząsteczkowych: wiązanie receptora w części amino-końcowej i fuzja w części karboksy-końcowej. Dlatego, przez zastąpienie domeny wiążącej receptora (części) przez cząsteczki biologiczne o innej specyficzności adresowania koronawirus może być skierowany na oddziaływanie z różnymi cząsteczkami docelowymi, które są przykładowo wyrażone na powierzchni komórek. Czyniąc tak bez wpływania na funkcję fuzji białka S, VLP według wynalazku może ulec fuzji z lub wniknąć do komórek normalnie nie zarażanych przez oryginalny wirus.

Wynalazek dostarcza cząsteczki wiruso-podobne (VLP) pochodzące z koronawirusów, w których jedną lub więcej kopii wirusowych białek błonowych zmodyfikowano tak, aby zawierały cząsteczki obcego białka wirusowego (zarówno koronawirusa lub nie koronawirusa) lub nie pochodzące od wirusa, które to cząsteczki są albo zastępują części białek błony VLP lub są wbudowane do tych białek błonowych, przez co stanowiąc ich integralną część. W związku z tym, VLP są zaopatrywane w nowe właściwości biologiczne takie jak nowe sposoby adresowania lub informacje immunologiczne lub białka o specyficznej aktywności biologicznej zawarte w cząsteczce wiruso-podobnej, której właściwości biologiczne są związane z VLP za lub w miejscu naturalnego białka kolca oryginalnego koronawirusa.

W pewnej postaci wynalazku, jest dostarczony zrekombinowany VLP z usunię tym i/lub przebudowanym genomem tak, że (część) ektodomeny (tj. część eksponowana na zewnątrz cząsteczki wirusa) białka kolca została zastąpiona przez odpowiadającą jej domenę (lub jej część) białka kolca innego koronawirusa. W ten sposób, VLP nabył innej komórkowej, specyficzności substratowej, przez co VLP jest zdolny do wniknięcia do innych komórek niedostępnych lub wrażliwych na oryginalny koronawirus. W dalszej postaci wynalazku dostarczone są VLP złożone z białek M i E mysiego koronawirusa żółtaczki (MHC) białek i które zawierają cząsteczki chimerowego kolca obejmujące transbłonowe lub końcową karbosylową domenę MHV S, lecz endodomenę białka kolca koronawirusa powodującego zapalenie jelit u kota (FIPV). Te VLP mogą teraz wnikać do komórek kota i dostarczać cząsteczki typu MHV. Cząsteczki o takich chimerowych kolcach są wytwarzane przez sporządzenie konstruktów genu S koronawirusów MHV, w których obszar kodujący amino-końcową domenę jest zastąpiony przez odpowiednią domenę FIPV. Konstrukty te są wbudowane do plazmidów za promotorem polimerazy bakteriofaga T7. Konstrukty są następnie współtransfekowane z plazmidami niosącymi geny MHV M i E, oba również pod promotorem T7 w komórkach OST-7, które zarażono zrekombinowaną

PL 207 933 B1 szczepionką wirusa wyrażającą polimerazę T7. Otrzymane VLP zawierają chimerowe białko MHV/FIPV. W innej postaci wynalazku, dostarczony jest VLP sposobami użytymi jak wyżej z ektodomenami białka kolca zakaźnego koronawirusa zapalenia oskrzeli (IBV) lub ektodomeny (lub jej części) białka otoczki z jakiejkolwiek otoczki wirusowej nie należącej do koronawirusów. Przykładowo, oparte na MHV VLP są dostarczone przez wynalazek tak, że przenoszą na swojej powierzchni ektodemenę glikoproteiny gD wirusa choroby Aujeszkyego (pseudorabies virus) (PRV) zamiast ektodomeny kolca MHV lub zewnętrznej (amino-końcowej) domeny (lub jej części) jakiegokolwiek nie błonowego białka typu 1 nie pochodzącego z wirusa. W ten sposób dostarczony jest VLP specyficzny dla komórek kurczaka lub komórek świni lub komórek reaktywnych względem błonowego białka typu 1.

W kolejnej postaci wynalazku, replikujące się VLP są wytworzone z modyfikacjami zawartymi w cząsteczkach. Jest to osią gnię te przez włączenie zmodyfikowanych konstruktów któregokolwiek z białek koronawirusa S, M, E i HE. W cząsteczkach koronawirusa białka te mają karboksy-końcową domenę wbudowaną do wewnętrznej otoczki wirusowej. Zatem są tam również zawarte włączone do niej sekwencje obcego białka, które są dodane lub zastępujące karboksy-końcową domenę. W ten sposób dostarczony może być VLP zawierający cząsteczki białka lub jego fragmenty z innego wirusa lub nie wirusowe białka, takie jak hormony, takie jak erytropoetyna. Pozwala to na wytworzenie VLP zawierającego biologicznie aktywne białko lub jego fragment, które jest/są osłonięte przez otoczkę wirusa i mogą być uwolnione i/lub odzyskane później, gdy błona wirusa ulega degradacji lub jest połączona przez fuzję z inną błoną. Pozwala to na wytwarzanie in vitro w komórkach, lub wytwarzanie in vivo w gruczołach wydzielniczych takich jak gruczoły mlekowe, substancji aktywnej biologicznie, która w innym wypadku jest szkodliwa lub toksyczna dla wytwarzających ją komórek lub które z innych powodów powinne być wytworzone w zabezpieczonej postaci.

W kolejnej postaci dostarczone są VLP oparte na MHV niosące na swojej powierzchni lub wewnątrz, cząsteczki aktywne enzymatycznie takie jak furyna lub cytokina, lub receptor hormonów, lub inny wirusowy, lub nie wirusowy peptyd o aktywności biologicznej. W tych przykładach, VLP są dostarczane z (dodatkowym) środkiem adresowania służącym kierowaniu VLP do komórek, w innym wypadku, niedostępnych dla oryginalnego koronawirusa. Wynalazek dostarcza otrzymane rekombinacyjnie, replikatywne VLP, które są ponadto modyfikowane w ektodomenie i/lub ektodomenie któregokolwiek z białek wirusa. Przez modyfikację ektodomeny białka kolca, VLP są dostarczone ze zmodyfikowanymi cząsteczkami biologicznymi jako środkiem adresowania służącym kierowaniu VLP do oddziaływania z innymi cząsteczkami biologicznymi będącymi partnerem lub mogącymi oddziaływać z celem takim jak biał ka receptora na komórkach, być ich receptorami hormonu, specyficznymi immunoglobulinami na komórkach B, MHC i towarzyszącymi MHC cząsteczkami obecnymi na komórkach T i innych komórkach, lub innymi cząsteczkami znanymi osobie biegłej w dziedzinie receptorów powierzchniowych komórki. Środki adresowania mogą być również dostarczone dla oddziaływania ze znanymi miejscami wiązania wybranych enzymów na białkach lub innych cząsteczkach służących jako substrat dla wybranego enzymu.

Przygotowanie VLP lub koronawirusów ze zmodyfikowanymi kolcami może być osiągnięte genetycznie przez modyfikowanie genomu wirusa tak, ze wyraża on zmodyfikowane białko S w zarażonych komórkach. Dostarczono tu również preparatu koronawirusów zawierającego zmienione kolce w różny sposób wyrażających zmodyfikowane geny S w komórkach, które są dodatkowo zarażone koronawirusem. Współwłączenie, zmienionego w wyniku mutacji kolca dostarcza wirusowi nowego środka adresowania. Przykładowo, pokazano wytwarzanie cząsteczek MHV zwierających chimerowe białko S z MHV/FIPV. Konstrukt chimerowego genu S jest wyrażony w komórkach L, które są następnie zarażone dzikiego typu szczepem MHV A59 (MHV-A59) lub jego mutantem. Potomstwo wirusa uwalniane przez komórki zawiera zmodyfikowane białko S. Dla pokazania zmienionego adresowania użyto wirus zarażając nim komórki kocie, które normalnie są niewrażliwe na MHV. Komórki są następnie zarażone co pokazano przez immunofluorescencję i wytwarzają normalny MHV. W następnym przykładzie pokazano, że wytwarzanie MHV zawierającego chimerowe białka S, w których część ektodomeny S zastąpiono przez odpowiadającą jej część (tj. prezentowaną na zewnątrz lub aminokońcową domenę) ludzkiej cząsteczki CD4 jako przykładu nie wirusowego białka. Tak zmodyfikowane koronawirusy zachowały zdolność do zarażenia komórek zarażonych HIV i komórek prezentujących glikoproteinę otoczki HIV przez specyficzne rozpoznawanie kompleksu CD4 i gp120 z HIV. W wyniku tego, zarażone komórki HIV podlegają litycznemu zarażeniu co skutecznie ogranicza liczbę komórek zarażonych HIV w ciele i co za tym idzie zmniejsza ostrość przebiegu choroby i ewentualnie powoduje koniec infekcji.

PL 207 933 B1

Jako kolejny przykład pokazano wytwarzanie VLP według wynalazku zawierających cząsteczki kolca, w których amino-końcową część zastąpiono jednołańcuchowym fragmentem przeciwciała rozpoznającym białko powierzchniowe komórki, które jest prezentowane na komórkach, które normalnie mogą nie być zarażone koronawirusem stanowiącym podstawę dla wspomnianego VLP. Zmodyfikowany wirus jest zdolny do zarażenia tych, w innym wypadku odpornych, komórek. Przykład ilustruje zasadę, że w ten sposób, tj. przez wbudowanie bardzo specyficznej informacji o adresowaniu do kloca wirusa, koronawirus może być skierowany do wybranych komórek lub tkanek. Jednoniciowy fragment przeciwciała może przykładowo być wybrany systemami prezentacji faga lub w innych systemach selekcji klonalnej jednołańcuchowych fragmentów przeciwciała znanych nauce.

Kolejny aspekt tego wynalazku dotyczy zastosowania wspomnianych, zdolnych do replikacji VLP lub koronawirusów jako nośników dostarczających gen. Można to osiągnąć różnymi sposobami. Jednym sposobem jest włączenie obcych genów lub sekwencji do genomu wirusa tak, że po wprowadzeniu wirusa do komórek geny te ulegają ekspresji lub wbudowane sekwencje stają się aktywne biologicznie w inny sposób (jak w przypadku rybozymów lub anty-sensownego RNA wytworzonego przez wirusy w komórkach). Inny sposób wykorzystuje VLP do pakowania obcego RNA do cząsteczek przez użycie sygnału(ów) koronawirusowych dla pakowania wirusa. Wbudowanie obcych sekwencji do genomu koronawirusa może być osiągnięte przez manipulacje genetyczną przy pomocy infektywnego klonu (c-)DNA, pełnej wielkości kopii DNA genomu wirusa. Może to osiągnąć również przez rekombinację RNA, w którym to przypadku, RNA stanowiący część genomu wirusa i zawierający obce sekwencje, jest wprowadzona do zarażonych komórek pozwalając obcym sekwencjom na ich wbudowanie przez rekombinację homologiczną. Ponieważ koronawirusy będą zazwyczaj zabijały zarażone nimi komórki, jest ważnym dla większości celów aby je attenuować tak, żeby nie zabijały komórek, z którymi oddziałują. Attenuacja jest osiągnięta tu przez zmianę genomu wirusa przez delecję lub rearanżację.

W wynalazku attenuację przykł adowo wykonuje się przez przygotowanie zmutowanej postaci MHV, z której istotny gen został usunięty przez rekombinację. Dostarczona jest mysia linia komórkowa, w której gen E z MHV został wbudowany do chromosomu, pozwalając białku E na jego wytwarzanie przez ekspresję genu. MHV pozbawiony genu E został wytworzony w normalnych komórkach mysich przez rekombinowanie przy pomocy syntetycznego RNA zawierającego doskonałą kopię 3'-końca genomu MHV z wyjątkiem braku niezmienionego genu E. Wirus defektywny pod względem E jest zdolny do wzrostu jedynie w komórkach uzupełniających tą wadę. Wytwarzany wirus jest attenuowany tak, że może zarażać inne mysie komórki, lecz nie produktywnie: utrata białka E zapobiega składaniu potomstwa. Jako przykład zasad wbudowywania obcych genetycznie sekwencji do attenuowanego lub nie attenuowanego VLP lub koronawirusów i jego ekspresja jest w dalszej kolejności zapewniona przez wynalazek. VLP pochodzący od MHV jest dostarczony w taki sposób by gen reporterowy taki jak LacZ lub zielonego białka fluorescencyjnego został zrekombinowany tak, że jest do niego wbudowany chimerowy gen MHV/FIPV S. Ekspresja genów jest uwidoczniona przez niebieskie lub zielone zabarwienie fluorescencyjne komórek zarażonych VLP i przez nabyte zdolności do zarażenia komórek kocich. Inny sposób uzyskania transportujących nośników opartych na koronawirusie wykorzystują YLP zawierające obce sekwencje RNA. Włączenie obcych sekwencji RNA do tych cząsteczek wymaga ich zapakowania do nukleokapsydów. Wirusowe RNA zapakowane przez cząsteczki białka nukleokapsydu (N) zachodzi przez rozpoznanie specyficznych sekwencji, sygnału(ów) pakowania przez białko N. W MHV sygnał pakowania obejmuje obszar 69 nukleotydów długości genu 1b. Obcy (nie pochodzący od koronawirusa) RNA zwierający sekwencję(e) pakujące koronawirusa lub defektywne genomy koronawirusa, w których ten sygnał(y) zostały zachowane, lecz do których obce sekwencje zostały wbudowane, są składane w VLP i wprowadzone do komórek wyrażających geny N, M i E (±S). VLP może wprowadzić do docelowej komórki określony RNA, który może posiadać jedną z szeregu funkcji. Przykładem dostarczony przez wynalazek jest RNA działający jak mRNA i określający szczególne białka takie jak toksyna lub czynnik indukujący apoptozę lub fragment przeciwciała. Kolejnym przykładem jest anty-sensowny RNA lub RNA o aktywności rybozymu. Dla większości celów kluczowym jest uzyskanie wielu kopii RNA w każdej komórce, dla uzyskania pożądanego efektu. Może to nie być łatwe w przypadku VLP, które będą przenosiły jeden lub kilka pseudo-NC. Tym samym wynalazek dostarcza RNA z sygnałami dla amplifikacji tak, że mogą być one namnażane w docelowej komórce. Dla osiągnięcia tego celu użyte są sekwencje odpowiedzialne za replikację z wirusa Semliki Forest (SFV) stanowiąc podstawę konstruktu RNA. Pochodzący z SFV mRNA zawiera ponadto sekwencję odpowiedzialną za zamkniecie w kapsydzie z koronawirusa i wytwarzający specyficzne białko reporte10

PL 207 933 B1 rowe złożony w VLP. Amplifikacją prowadzona przez SFV pozwala na syntezę w komórce białka reporterowego; u zwierząt pojawienie się przeciwciał przeciwko białku reporterowemu testowanemu świadczy o skutecznym dostarczenia zawartości VLP.

Wynalazek dostarcza również VLP, który jest nośnikiem dostarczającym antygen lub epitop pomyślanym dla wywołania specyficznej odpowiedzi immunologicznej, komórkowej i/lub humoralnej, ogólnej i/lub miejscowej obejmujących wywoływanie i wytworzenie specyficznych przeciwciał przeciw białkom dla uzyskania ochrony przed zarażeniem przez patogeny o wirusowym i nie wirusowym pochodzeniu. Przykładowo, wynalazek opisuje indukcję przeciwciał przeciwko białku reporterowemu pochodzącemu z mRNA SFV, które zawiera ponadto sekwencje koronawirusa odpowiedzialne za zamknięcie w kapsydzie i określa repertuar białka opisanego powyżej. Jako kolejny przykład przedstawia się indukcję przeciwciał u myszy przeciwko kolcom FIPV i przeciw gD PRV przez immunizację VLP opisaną również powyżej. Co za tym idzie, odpowiedzi immunologiczne mogą być wywołane zarówno przeciw białkom, które mogą być kodowane przez zmieniony genom VLP i/lub przeciw białkom, które zostały wbudowane jako środki adresowania do VLP, przez co, częściowo lub w całości zastępują oryginalne białko kolca. Przykłady ilustrujące możliwość zastosowania podejścia dla indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw białkom tak zróżnicowanym jak przykładowo pochodzące od wirusów, bakterii, pasożyta, komórki i hormonalnych.

Wynalazek ponadto dostarcza VLP, które w pełni zachowały oryginalne białko kolca, lecz które zostały zmienione genomicznie dla attenuowania VLP i/lub dla kodowania sekwencji nukleotydowej, która powinna być dostarczona do komórek, do których adresowany był oryginalny koronawirus. Przykładowo, w ten sposób komórki nabłonka jelita lub komórki nabłonka oddechowego, które normalnie są zarażane odpowiednio TGEV lub PRCV mogą obecnie oddziaływać z VLP pochodzącymi z TGEV lub PRCV lub innymi komórkami specyficznymi dla koronawirusów, jeśli jest taka potrzeba, dla ekspresji białek normalnie nie wyrażanych przez wspomniane wirusy. W ten sposób, komórki nabłonka oddechowego pacjentów z mukowiscydozą mogą być indukowane przez ekspresję cząsteczek powierzchniowych kodowanych przez zmieniony genom VLP. Dla dalszego zademonstrowania wynalazku dostarczone są różne przykłady w szczegółowym opisie, które nie ograniczają wynalazku.

Fig. 1:

A. Część górna przedstawia zasady technologii rekombinowania RNA. Komórki kota są zarażone fMHV (pochodna MHV niosąca chimerowe białko S z okta-domeną z białka FIPV S pozwalającego wirusowi na wzrost na komórkach kota) i stransfekowane syntetycznym donorowym RNA niosącym, m.in. niezmieniony gen MHV S. Odpowiednie rekombinowanie RNA prowadzi do wirusów, które odzyskały zdolność do wzrostu na mysich komórkach przez dostarczenie niezmienionego kolca. Dolna część przedstawia po lewej schematyczne przedstawienie odpowiednich części plazmidu, z których wytworzono RNA dawcy. Po prawej przedstawiono organizację genomowego DNA zrekombinowanych wirusów wytworzonych z tym donorowym RNA.

B. Sekwencje nukleotydowe przedstawiają nowe połączenia utworzone w konstruktach plazmidowych (i otrzymanych wirusach), pozycje i numery których podano w części A (lewa strona).

Fig. 2:

Analiza RT-PCR zrekombinowanych wirusów z delecjami genetycznymi. RNA wyizolowano ze sklonowango wirusa, cDNA przygotowano przez RT przy pomocy odpowiednich starterów (1092 i 1127) i PCR przeprowadzono przy pomocy starterów 1261 + 990 lub starterów 1173 + 1260 dla analizy rejonów genów 4a/b/5a lub genów 2a+HE, odpowiednio. Zakres analiz przedstawiono po prawej stronie, wyniki analizy w żelu agarozowym produktów PCR przedstawiono po stronie lewej. Zbadane wirusy przedstawiono powyżej na żelu. Na ścieżce po prawej stronie rozdzielono znacznik DNA.

Fig. 3:

Wirusowy RNA zsyntetyzowany w zarażonych komórkach przez różne mutanty delecyjne MHV zbadano przez ekstrakcje całkowitego cytoplazmatycznego RNA wyznakowanego metabolicznie [³³P]ortofosforan w obecności aktynomycyny D, a następnie elektroforezę w 1% żelu agarozowym. Genetyczne przysposobienie wirusów z delecją przedstawiono na górze podczas gdy subgenomowe rodzaje RNA oznaczono po prawej stronie również zgodnie z ich kompozycją genetyczną.

Fig. 4:

Jednoetapowe krzywe wzrostu zrekombinowanych wirusów z delecją. Po zarażeniu wysokim mianem wirusa (m.o.i.) komórek LR7 wirusami z delecją i MHV-WT z każdej pożywki hodowlanej pobrano próbki MHV-WT po różnym czasie i przez miareczkowanie zbadano infektywność tych próbek.

PL 207 933 B1

Fig. 5:

Tak jak na Fig. 1 przedstawiono konstrukcję wirusów z przebudowaną kolejnością genów. Po lewej, odpowiednie części konstruktów plazmidowych: organizacja genomu ich sekwencji cDNA dla MHV i oznaczenia plazmidów. Po prawej, odpowiednie wirusy z ich strukturą genomu i ich nazwami.

Fig. 6:

Jednoetapowa krzywa wzrostu dla zrekombinowanych wirusów z przebudowanym genomem.

Po zarażeniu przy wysokim m.o.i. komórek LR7 wirusami MHV-A2aHE (DELTA2aHE), MHV-1bMS, MHV-MSmN lub MTV-WT próbki pobrano z każdej pożywki hodowlanej po różnym czasie i przez miareczkowanie zbadano infektywność tych próbek.

Fig. 7:

A. Jak na Fig. 1 przedstawiono stężenie wirusów ze wstawionym obcym genem. Po lewej stronie, różne konstrukty plazmidowe (wektor) przedstawiono wraz z ich nazwami. Po prawej, genetyczny make-up otrzymanych z tych plazmidów przez rekombinowanie RNA w komórkach kota jak przedstawiono razem wraz z ich nazwami. Poniżej: sekwencje startera (i liczby) użyto dla wprowadzenia sekwencji wewnątrzgenowego promotora (IGS) przed genem renilla (RL) i genem dla lucyferazy świetlika (FL).

B. Analiza RT-PCR zrekombinowanych wirusów niosących gen RL. cDNA przygotowano przy pomocy startera 1412 przez RT na wirusowym RNA; dla każdego wirusa zbadano równolegle dwie niezależne jego pochodne (oznaczone kolejno A1A i B1A; A2 i B1; A7A i B2D). Następnie przeprowadzono PCR na uzyskanym cDNA jak również na plazmidach użytych dla wytworzenia wirusów (patrz Fig. 7A) przy pomocy pary starterów wskazanych poniżej na Fig.. Dla każdego zestawu uwzględniono również próbkę kontroli negatywnej (H2O). Analizę w żelu agarozowym fragmentów pCR przeprowadzono wraz ze znacznikami DNA (otaczające linie) co przedstawiono i wielkość produktów podano po prawej stronie.

Fig. 8:

Jednoetapowe krzywe wzrostu zrekombinowanych wirusów niosących obce geny. Po zarażeniu wysokim m.o.i. komórek LR7 wirusami próbki pobrano z każdej pożywki hodowlanej po różnym czasie i infektywność tych próbek zbadano przez miareczkowanie.

A. krzywe wzrostu różnych wirusów posiadających gen lucyferazy renilla jak to porównano z MHV-WT.

B. Wzrost trzech niezależnie uzyskanych klonów wirusa MHV-EFLM niosącego gen lucyferazy świetlika przedstawiono w porównaniu z MHC-WT.

Fig. 9:

Ekspresja lucyferazy przez zrekombinowane wirusy. Komórki RL7 zarażono wirusem wyrażającym renilla (A) lub świetlikową (B) lucyferazę z MHV-WT i wytworzoną w komórkach aktywność lucyferazy śledzono przez cały czas. W B dwa niezależnie uzyskane klony wirusa MHV-EFLM (patrz Fig. 8B) porównano z MHV-WT.

Fig. 10:

Stabilność wirusów niosących obce geny. Zrekombinowane wirusy MHV-ERLM i MHV-EFLM (dwa niezależnie otrzymane klony w każdym przypadku) przesiano ośmiokrotnie przez komórki RL7 przy niskim m.o.i.. Po każdym przesianiu określono infektywność wirusa (TCID50) w zebranej pożywce hodowlanej. Tak zebranymi wirusami zaszczepiono równolegle komórki RL7 przy m.o.i.5 i oznaczono ilościowo ekspresję lucyferazy w komórkach po 8 godz. po zarażeniu. Wyniki odłożono jako funkcje liczby pasaży.

Fig. 11:

Hamowanie infekcji MHV przez peptyd HR2. Komórki LR2 zarażono wirusem MHV-EFLM w obecności różnych stężeń peptydu HR2 lub jako kontrolę, peptyd odpowiada aminokwasom 1003-1048 wirusowego białka S. Po godzinie inkubacji komórki wypłukano i dalej zaszczepiono przy braku peptydu. Szacunek powodzenia zarażenia komórek badano po 4 godz. po zarażeniu dla ekspresji lucyferazy. Na Fig. aktywność lucyferazy jest odłożona względem różnych, użytych stężeń peptydu.

Fig. 12:

Hamowanie fuzji komórka-komórka przez peptyd HR2. Po zaszczepieniu równoległych hodowli komórek RL7, komórki MHV-A59 zalano pożywką z agarem zawierającą różne stężenia peptydu HR2 i następnego dnia policzono łysinki.

PL 207 933 B1

Fig. 13:

A. Struktura genetyczna wyjściowego wektora plazmidowego pBRDI1 w porównaniu z wyjściowym wirusem, z którego go wyprowadzono. Górna część przedstawia genomową organizację FIPV szczepu 79-1146. Kropkowane części (tj. 5' końcowe 702 zasady i pochodzące 3' 9262 zasady) złożono w konstrukt cDNA pBRDI1; w plazmidzie wirusowy cDNA ulega ekspresji dzięki sekwencji fagowego promotora T7 i wstawka jest otoczona przez miejsca restrykcyjne XhoI (5') i Notl (3').

B. Plazmid pBRDI2 jest pochodną pBRDI1, w której gen S FIPV został zastąpiony przez chimerowy gen S (oznaczony mS) kodujący ektodomenę MHV-A59 S zachowując sekwencję dla białka FIPV S transbłonowego i endodomenę. Plazmid pBRDI2 został uzyskany przez podstawienie w pBRDI1 fragmentu Sacl-Aflll przez odpowiadają cy mu fragment pTMFS1. Ten ostatni plazmid jest pochodną plazmidu pPMFS (12) zawierającego sekwencję chimerowego genu i do którego wklonowano fragment Sacl-Stul dla rozszerzenia sekwencji MHV S na 5' końcu sekwencjami odpowiadającymi końcowi 3' FIPV pol1B.

Fig. 14:

Szczegółowa sekwencja konstruktów pBRDI.

A. Sekwencja nukleotydowa pBRDI1 i pBRDl2 w pobliżu samego 5' końca sekwencji genomu FIPV: miejsce XhoI i sekwencja faga T7 następują po trójce G i następnie przed sekwencją FIPV.

B. Sekwencja złącza pol1A/pol1B.

C. Sekwencja nukleotydowa samego 3' końca konstruktu cDNA. Po 3' nie ulegającym translacji obszarze (3' UTR) następuje ciąg adenin i sekwencja Notl.

D. Sekwencja nukleotydowa na złączu FIPVY pol1B-MHV w pTMFS1 i pBRDI2.

Fig. 15:

Schematyczne przedstawienie wytwarzania mFIPV przez genomowe rekombinowanie RNA FIPV i pochodzącego z pBRDI2 syntetycznego RNA w komórkach kota. Organizacja genetyczna w każ dym RNA jest podana jak również selekcja dla rekombinacji (tj. zawierają cy chimerowy mS) wirusa przez wzrost w komórkach ssaka.

Fig. 16:

Analiza mFIPV białek strukturalnych. Mysie komórki RL7 zarażono mFIPV i, dla porównania, MHV-A59; kocie komórki FCWF zarażono FIPV szczepu 79-1146. Zarażone komórki wyznakowane [³⁵S]aminokwasami z lizatów komórkowych 5-7 godz. po zarażeniu przygotowano i immunoprecypitację przeprowadzono przy pomocy różnych przeciwciał: poliklonalnych przeciwciał przeciw FIPV (ścieżki 1, 6 i 10) i MHY (ścieżki 3, 4, 8, i 12) i przeciwciałami monoklonalnymi przeciw kociemu białku S (Si, ścieżki 2, 7 i 11) i mysie białko S (Sm; ścieżki 5, 9 i 13). Białka zbadano przez elektroforezę w SDS-12% żelu poliakryloamidowym. Miejsce na żelu zajmowane przez białka MHV i FIPV odpowiednio po lewej i prawej stronie. Białko mFIPV S jest wytrącone dzięki czynnikowi surowicy MHV-S, nie przez ich precypitację białka FIPV S i integracje w żelu w podobnych warunkach co dla białka MHV S.

Fig. 17:

Jednoetapowa krzywa mFIPV w porównaniu z MHV. Po zarażeniu przy wysokim m.o.i. komórek LR7 dwoma wirusami pobrano próbki z każdej pożywki hodowlanej po różnym czasie infektywność tych próbek zbadano przez miareczkowanie.

Fig. 18:

Wytworzenie mutantów delecyjnych FIPV. Na górze podano zasady sposobu: rekombinacja mFIPV RNA z syntetycznym pochodzącym z pBRDI dawcą RNA niosącym niezmieniony gen FIPOV S. Poniżej przedstawiono genetyczny make-up skonstruowanych plazmidów pBRDI1 (po lewej stronie) i wytworzonych wirusów (po prawej). Strza ł ki wskazują miejsce (i liczbę ) uż ytych starterów, otwarte trójkąty delecję. Po prawej stronie liczbę par zasad (bp) wskazującą wielkość fragmentów PCR, których wytworzenie przewidziano przy zastosowaniu par starterów.

Fig. 19:

Analiza genetyczna zrekombinowanych wirusów z delecją FIPV. Genomowy RNA wyizolowano z wirusów z delecjami jak również ze zrekombinowanych FIPV typu dzikiego. Reakcje RT i PCR przeprowadzono stosując startery 1 i 9 dla analizy genów obszaru 3ABC (panel A) i starterów 10 i 11 dla genów 7AB (panel B). Miejsca fragmentów DNA w żelach agarozowych wykazano wzdłuż żelu wraz z przewidywaną ich wielkością (patrz Fig. 18, po prawej). Wirusowy RNA zbadano w różnych ścieżkach jak podano po prawej stronie.

PL 207 933 B1

Fig. 20:

Hepta powtórzone obszary (HR) i ich sekwencje aminokwasowe w białkach kolca koronawirusa.

A. Schematyczne przedstawienie struktury kolca koronawirusa MHV-A59. Glikoproteina kolca (S) zawiera N-końcową sekwencję sygnałową (SS) i domenę transbłonową (TF) blisko do jej C-końca. S jest przecięty proteolitycznie (strzałka) w podjednostce S1 i S2, które są połączone nie kowalencyjnie. Białka S2 zawierają dwa zakonserwowane obszary powtórzenia hepta, jak zaznaczono HR1 i HR2.

B. Przyrównanie sekwencji domen HR1 i HR2 z MHV-A59, HCV-OC43 (ludzki szczep koron wirusa OC43), HCV-229E (ludzki szczep koronawirusa 229E), FIPV i IBV (infektywny szczep wirusa zapalenia oskrzeli Beaudette). Przyrównanie pokazuje znaczącą wstawkę dwóch hepta powtórzeń (14aa) w obu HR1 i HR2 z HCV-229E i FIPV występujących w białkach S wszystkich wirusów grupy I. Wydedukowane reszty hydrofobowych hepta powtórzeń a i d są podane powyżej sekwencji. Przesunięcie ramki odczytu hepta powtórzeń w HR1 jest spowodowane przez ślizganie się. Gwiazdki oznaczają reszty zakonserwowane. Sekwencje aminokwasowe peptydów HR1, HR1a, HR1b, HR1c i HR2 użytych w tych badaniach są przedstawione wersalikami poniżej przyrównań. N-końcowe reszty pochodzące z miejsca cięcia proteolitycznego fuzji białkowej GST podano poniżej w nawiasach.

Fig. 21 = Tabela 1:

Sekwencje pokazują połączenia, które są wytworzone w plazmidach przedstawionych na Fig. 5 i wirusach otrzymanych z tych plazmidów. Liczby odpowiadają numeracji połączeń co wykazano strzałkami w plazmidach (Fig. 6, po lewej).

Fig. 22 = Tabela 2:

Startery użyte dla wydłużenia zakładki składającej (SOE)-PCR i dla RT-PCR przy konstrukcji i analeasye zrekombinowanego FIPV. Dla ich umiejscowienia w genomie FIPV: patrz Fig. 18, gdzie ich liczbę i orientację podano strzałkami. Numeracja starterów odnosi się do tej z sekwencji pBRDI1.

Fig. 23 = załącznik 1:

Sekwencja nukleotydowa plazmidu pBRDI1. Początki sekwencji w miejscu XhoI (ctcgag), po czym następuje sekwencja promotora dla polimerazy z bakteriofaga T7 i sekwencja trzech G, po czym następuje sekwencja cDNA 5' FIPV.

Fig. 24 = załącznik 2:

Sekwencja nukleotydowa plazmidu pBRDI2. Początki sekwencji w miejscu XhoI (ctcgag), po czym następuje sekwencja promotora dla polimerazy z bakteriofaga T7 i sekwencja trzech G, po czym następuje sekwencja cDNA 5' FIPV.

Fig. 25:

Przeżycie myszy C57Bl/6 zarażonych zrekombinowanymi MHC. Myszy w wieku 4 tygodni zaszczepiono doczaszkowo różnym rozcieńczeniem zrekombinowanych typu dzikiego i wirusów z delecjami (n=5 na wirus) i śledzono przeżywalność. Przedstawiono dane dla myszy zarażonych 2,5 x 10⁵ PFU. Podczas gdy zwierzęta zarażone MHV-WT wszystkie padły w 7 dni po zarażeniu, wszystkie myszy zarażone wirusami z delecją przeżyły do 21 dni po zarażeniu.

Fig. 26A:

Zarażone komórki 17Cl1 wyznakowano metabolicznie [³³P]ortofosforanem w obecności aktynomycyny D zasadniczo tak jak to opisano (4,10). Próbki całkowitego, cytoplazmatycznego RNA oczyszczono przy pomocy odczynnika Ultraspec (Biotecx), zdenaturowano formaldehydem i formaliną, rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym zawierającym formaldehyd i uwidoczniono przez fluorografię. Różne rodzaje RNA podano liczbami odpowiadającymi tym z Tabeli 4 (= Fig. 42).

Fig. 26:

Myszy zaszczepione dootrzewnowo 1 x 10⁶ TCID⁵⁰ każdym rekombinantem MHV usypiano w czwartym dniu po zaraż eniu i określono replikację wirusa w wą trobie przez iloś ciowe oznaczenia łysinkowe.

Fig. 27:

Analiza RT-PCR zrekombinowanych wirusów MHV-EFLM i MHV-minFL. cDNA przygotowano przy pomocy startera 1475 przez RT na wirusowym RNA; dla każdego wirusa analizowano równolegle dwa niezależnie uzyskane wirusy (oznaczone symbolami A1A i B1A, A6F i B4A). Następnie przeprowadzono PCR na otrzymanym cDNA jak również na plazmidach użytych dla wytworzenia wirusów (patrz Fig. 7A) przy pomocy pary starterów 935 i 1474. Przedstawiono analizę na żelu agarozowym fragmentów PCR wraz ze znacznikiem DNA.

PL 207 933 B1

Fig. 28:

Analiza RT-PCR zrekombinowanych wirusów MHV-EFLM i MHVminFL. cDNA przygotowano przy pomocy startera 1412 przez RT na wirusowym RNA; dla każdego wirusa analizowano równolegle dwa niezależnie uzyskane wirusy (oznaczone symbolami A2E i B4D). Następnie przeprowadzono PCR na otrzymanym cDNA jak również na plazmidach użytych dla wytworzenia wirusów (patrz Fig. 7A) przy pomocy pary starterów podanej poniżej Fig.. Przedstawiono analizę na żelu agarozowym fragmentów PCR wraz ze znacznikiem DNA.

Fig. 29-31:

Synteza RNA przez zrekombinowane MHV. Genomy zrekombinowanych wirusów przedstawiono powyżej, ich obserwowane wzory ekspresji RNA przedstawiono poniżej. Zarażone komórki 17Cl1 wyznakowano metabolicznie [³³P]ortofosforanem w obecności aktynomycyny D zasadniczo tak, jak to opisano (4,10). Próbki całkowitego cytoplazmatycznego RNA oczyszczono przy pomocy odczynnika Ultraspec (Biotecx) zdenaturowano formaldehydem i formaliną, rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym zawierającym formaldehyd i uwidoczniono przez fluorografię. Zauważ, że subgenomowe rodzaje RNA na tej Fig. są oznaczone raczej przez ich kompozycję niż jako RNA2 do RNA7, bowiem oznaczenia numeryczne mogą być mylące w przypadku mutantów.

Fig. 29:

MHV-WT, MHV-ERLM i MHV-EFLM.

Fig. 30:

MHV-EFLM i MHV-minFL

Fig. 31:

MHV-MRLN, MHV-ERLM, MHV-2aRLS, MHV-MSmNRL i MHV-MSmN.

Fig. 32:

Replikacja in vitro wirusów niosących obce geny. Po zarażeniu wysokim m.o.i. wirusów komórek RL7 (u góry: MHV-MRLN, MHV-ERLM, MHV-2aRLS; po środku MHV-EFLM, MHV-minFL; na dole MHV-ERLM, MHV-MSmNRL), próbki pobrano z każdej pożywki hodowlanej w 10 godz. po zarażeniu i zakaź ność badano przez miareczkowanie.

Fig. 33:

Ekspresja lucyferazy przez zrekombinowane wirusy. Wewnątrzkomórkowa ekspresja lucyferazy ze świetlika i renilla szeregu zrekombinowanych wirusów określono zgodnie z zaleceniami producentów (Promega) w 9 godz. po zarażeniu. Góra: MHV-EFLM i MHV-minFL; na dole: MHV-ERLM i MHV-MSmNRL.

Fig. 34:

Ekspresja lucyferazy ze świetlika in vivo. W doświadczeniu użyto ośmiotygodniowych, MHV ujemnych samic myszy BALB/c. Myszy zaszczepiono donosowo MHV-EFLM. Użyto czterech zwierząt na dawkę (10⁶ TCID⁵⁰). Myszy uśpiono i pobrano wątroby i mózgi w 4 dni po zarażeniu. Organy szybko zamrożono w ciekłym azocie i homogenizowano w Cell Culture Lysis Reagent dostarczonym wraz z Luciferase Assay System (Promega). Aktywność FL zmierzono zgodnie z zaleceniami producenta stosując luminometr (Lumac Biocounter M2500).

Fig. 35:

Poziom przeżywalności po zarażeniu kotów różnymi mutantami z delecjami: FIPV79-1146;

r-wtFIPV; FIPVΔ3abc; FIPVΔ7a i FIPVΔ3abc+7ab (10pfu).

Fig. 36:

Miana przeciwciał zobojętniających FIPV rozwiniętych po różnym czasie po zarażeniu kotów wariantami delecyjnymi FIPV.

Fig. 37:

Poziom przeżywalności po podaniu kotom FIPV 79-1146 (100 pfu). Koty (N=4), które wcześniej nie szczepiono (□); koty (N=5) wcześniej zaszczepione FIPVΔ3abc (♦); koty (N=5) wcześniej zaszczepione FIPVΔ7ab (□) i koty (N=5) wcześniej zaszczepione FIPVΔ3abc+7ab (□).

Fig. 38:

Jednoetapowe krzywe wzrostu zrekombinowanych wirusów FIPV niosących obce geny. Po zarażeniu wysokim m.o.i. komórek FCWF wirusami, pobrano próbki z każdej pożywki hodowlanej po różnym czasie i przez miareczkowanie zbadano ich infektywność. Rekombinant nr 1 (□) i nr 9 (♦).

PL 207 933 B1

Fig. 39:

Ekspresja lucyferazy przez zrekombinowane wirusy. Komórki FCWF zarażono wirusami wyrażającymi lucyferazę renilla (nr 1 □ i nr 9 ♦) i wt-rFIPV (□) i wytworzoną w komórkach aktywność lucyferazy śledzono w czasie.

Fig. 40:

Jednoetapowe krzywe wzrostu zrekombinowanych wirusów FIPV z delecją nieistotnych genów. Po zarażeniu wirusami przy wysokim m.o.i. komórek FCWF pobrano próbki z każdej pożywki hodowlanej po różnym czasie i przez miareczkowanie zbadano ich infektywność.

Fig. 41 = Tabela 3:

Ilościowe oznaczenie syntezy RNA przez zrekombinowane MHV z delecjami nieistotnych genów.

Fig. 42 = Tabela 4:

Ilościowe oznaczenie syntezy RNA przez zrekombinowane MHV o przebudowanych genomach.

Fig. 43 = Tabela 5:

Ocena Tabeli na podstawie objawów klinicznych po szczepieniu i zarażeniu.

Fig. 44 = Tabela 6:

Łączna kliniczna ocena po pierwotnym szczepieniu różnymi mutantami FIPV 79-1146.

Fig. 45 = Tabela 7:

Łączna kliniczna ocena po zarażeniu FIPV 79-1146.

Fig. 46A:

Replikacja zrekombinowanych wirusów niosących 2 obce geny. Po zarażeniu komórek LR7 wysokim m.o.i. wirusów (MHV-RLFL, MHV-2aRLS i MHV-EFLM) pobrano próbki każdej pożywki hodowlanej w 9 godz. po zarażeniu i przez miareczkowanie zbadano infektywność tych próbek.

Fig. 46B:

Ekspresja lucyferazy przez zrekombinowane wirusy. Wewnątrzkomórkową ekspresję lucyferazy ze świetlika i renilla szeregu zrekombinowanych wirusów określono zgodnie z zaleceniami producenta (Promega) w 9 godz. po zarażeniu (MHV-RLFL, MHV-2aRLS i MHV-EFLM).

Dane doświadczalne związane z patentem:

I. Wirus mysiej żółtaczki (MHV) szczep A59 (MHV-A59)

1. Wytworzenie żywych, attenuowanych wirusów

a. Konstrukcja zrekombinowanego MHV pozbawionego genów.

b. Potwierdzenie zrekombinowanych genotypów.

c. Synteza RNA przez delecyjne mutanty MHV.

d. Fenotyp wzrostowy hodowli tkankowej.

e. Wirulentność zrekombinowanych wirusów u myszy.

2. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

a. Konstrukcja zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

b. Synteza RNA przez mutanty MHV o zmienionej kolejności genów.

c. Fenotyp wzrostowy hodowli tkankowej.

d. Replikacja zrekombinowanych wirusów w myszy.

3. Wytwarzanie zrekombinowanych wirusów wyrażających obce geny.

a. Konstrukcja zrekombinowanych wirusów niosących geny reporterowe.

b. Synteza RNA przez zrekombinowane wirusy.

c. Replikacja wirusów wyrażających lucyferazę renilla lub świetlika.

d. Ekspresja lucyferazy renilla i świetlika w hodowli tkankowej.

e. Zachowanie obcych genów podczas przeszczepiania wirusa.

f. Ekspresja lucyferazy świetlika w myszy.

g. Wytwarzanie MHV wyrażających dwa obce geny z jednego genomu.

h. Wytwarzanie MHV wyrażających chimerowy gen kolec-GFP.

4. Hamowanie infekcji i fuzji komórek przez peptyd pochodzący od białka kolca.

II. Wirus kociego, zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIPV), szczep 79-1146.

1. Wytwarzanie mFIPV kociego koronawirusa rosnącego na komórkach myszy.

a. Konstrukcja syntetycznego wektora transkrypcyjnego RNA.

b. Wytworzenie mFIPV przez rekombinowanie RNA.

c. Analiza białka mFIPV.

d. Cechy wzrostu mFIPV.

PL 207 933 B1

2. Wytworzenie żywej, attenuowanej szczepionki FIPV przez delecję genów.

a. Konstrukcja syntetycznych wektorów transkrypcyjnych RNA.

b. Wytworzenie zrekombinowanych FIPV pozbawionych genów.

c. Analiza genetyczna zrekombinowanych FIPV pozbawionych genów.

d. Właściwości wzrostowe FIPV pozbawionych genów.

e. Wirulentność zrekombinowanych wirusów u kotów.

f. Odpowiedź immunologiczna indukowana przez zrekombinowane wirusy.

g. Wirusy FIPV z delecją służą jako attenuowane żywe szczepionki.

3. Wbudowanie i ekspresja obcych genów.

a. Konstrukcja zrekombinowanych wirusów niosących geny reporterowe.

b. Jednoetapowy wzrost wirusów.

c. Ekspresja lucyferazy z renilla.

4. Wytworzenie multiwalentnych szczepionek opartych na FIPV.

a. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw wirusowi kociej białaczki (FeLV) opartej na wektorze FIPV.

b. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw wirusowi kociego niedoboru odporności (FIV) opartej na wektorze FIPV.

c. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw kociemu kaliciwirusowi (FCV) opartej na wektorze FIPV.

d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw kociej panleukopenii (FPV) opartej na wektorze FIPV.

e. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw kociemu wirusowi opryszczki (FHV) opartej na wektorze FIPV.

f. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw FIPV serotyp I i II opartej na wektorze FIPV serotyp II.

5. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

6. Wytwarzanie szczepionek opartych na FIPV przeciw psim patogenom.

a. Wytwarzanie szczepionki opartej na FIPV przeciw psiej nosówce.

b. Wytwarzanie szczepionki opartej na FIPV przeciw psiej parwowirozie.

c. Wytwarzanie szczepionki opartej na FIPV przeciw psiej zakaźnej żółtaczce.

d. Wytwarzanie szczepionki opartej na FIPV przeciw chorobie krwotocznej szczeniąt.

III. Przenoszony wirus żołądkowo-jelitowy (TGEV).

1. Wytworzenie żywej attenuowanej szczepionki przeciw TGEV.

2. Wytworzenie multiwalentnych szczepionek opartych na TGEV.

a. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw świńskiemu parwowirusowi (PPV) opartej na wektorze TGEV.

b. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw świńskiemu wirusowi grypy opartej na wektorze TGEV.

c. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw afrykańskiemu świńskiemu wirusowi gorączki opartej na wektorze TGEV.

d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw świńskiemu cirkowirusowi typu 2 opartej na wektorze TGEV.

e. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw świńskiemu wirusowi powodującemu zespół zaburzenia oddechowego i rozrodczego opartej na wektorze TGEV.

3. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

lV. Ptasi zakaźny wirus zapalenia oskrzeli (IBV).

1. Wytworzenie żywej szczepionki opartej na attenuowanym IBV.

2. Wytworzenie multiwalentnych szczepionek opartych na IBV.

aI. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed więcej niż jednym serotypem IBV.

all. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą Newcastle.

b. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed ptasią grypą.

c. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą spowodowaną wirusem anemii kurczaka (CAV).

PL 207 933 B1

d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą wywołaną ptasim reowirusem.

e. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej zakaźną chorobą kaletki.

f. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą Marek'a.

g. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed zakaźnym zapaleniem gardła i krtani.

3. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

V. Ludzki koronawirus (HCoV) szczep 229E (HCoV-229E).

1. Wytworzenie żywej szczepionki opartej na attenuowanym HCoV-229E.

2. Wytworzenie żywej attenuowanej szczepionki przeciw HCoV szczep OC43.

3. Wytworzenie multiwalentnych szczepionek opartych na HCoV.

a. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed syncytialnym wirusem układu oddechowego (RSV).

b. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed rotawirusem.

c. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed wirusem typu Norwalk.

d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed wirusem grypy.

4. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

I. Mysi wirus żółtaczki (MHV) szczep A59 (MHV-A59).

II. Wytworzenie żywych attenuowanych wirusów.

Cel ogólny: Określenie czy delecja z genomu koronawirusa (np. MHV-A59) genów lub grup genów nie należących do genów określających funkcje polimerazy (ORF1a/1b)lub białek strukturalnych N, M, E i S jest tolerowana i daje żywotne wirusy nawet jeśli sekwencje genów są usunięte łącznie; ustalenie czy takie delecje mają działanie attenuujące na wirus gdy są wszczepione do myszy.

I.1.a. Konstrukcja zrekombinowanego MHV pozbawionego genów.

Określenie celu: Wytworzenie mutanta delecyjnego MHV-A59 pozbawionego genów 2a+HE (MHV- A2aHE), genów 4a+4b+5a (MHV- A45a) i genów 2a+HE+4a+4b+5a (HVE-min).

Sposób realizacji: Ukierunkowana rekombinacja RNA (3, 9, 10) przy pomocy fMHV, MHV-A59 pochodnej zarażającej komórki kota (FCWF), a nie komórki mysie (LR7) (7) i syntetyczny dawca RNA niosący zamierzone delecje (Fig. 1b, góra).

Procedura: Wektory transkrypcyjne dla wytwarzania syntetycznego donorowego RNA skonstruowano z plazmidu pMH54 (7) kodującego ciągły transkrypt zawierający 5' koniec genomu MHV-A59 (467 nukleotydów) przyłączone do kodonu 28 genu HE i zachodzącą do 3' końca genomu (Fig. 1). Plazmid pMH54 użyto dla rekonstrukcji rekombinanta WT-MHV i fMHV pochodnej ponownie zarażając komórki myszy. Wektor transkrypcyjny pXH Δ45 pozbawiony jest ORFów 4a, 4b i 5a. Dla konstrukcji tego plazmidu otrzymano produkt PCR z plazmidu PB59 (2) przy pomocy startera 1089 (5'-ACCTGCAGGACTAATCTAAACTTTATTCTTTTTAGGGCCACGC-3') kodującego miejsce restrykcyjne PstI/Sse8387I, sekwencję wewnątrzgenową (IGS) i który jest komplementarny do sekwencji położonej bezpośrednio powyżej genu E lub 5b i starter 1092 (5'-CCTTAAGGAATTGAACTGC-3'), który jest komplementarny do 5' końca obszaru kodującego białko M. Produkt PCR sklonowano w pGEM-T Easy (Promega) zgodnie z instrukcją producenta co dało pXH0803. Produkt PCR następnie wycięto Pstl i EcoRV i sklonowano w pMH54 poddanym działaniu Sse8387I i EcoRV otrzymując pXH A45a. Wektor transkrypcyjny pXH A2aHE jest pozbawiony ORF2a i HE i zawiera około 1200 bp 3' końca genu polimerazy połączone z genem S. Dla skonstruowania plazmidu uzyskano produkt PCR przez składające wydłużenie zakładki przez PCR. Jeden produkt PCR otrzymano z plazmidu p96 (1) stosując starter 1128 (5'-ACGGTCCGACTGCGCGCTTGAACACGTTG-3'), kodujący miejsce restrykcyjne Rsrll i komplementarny do obszaru 1200 bp powyżej kodonu stop ORF1b i starter 1130 (5'-CATGCAAGCTTTATTTGACATTTACTAGGCT-3'), który jest komplementarny do 3' końca obszaru kodującego polimerazę i obszaru IGS genu S. Po otrzymaniu produktu PCR z pMH54 przy pomocy startera 1129 (5'-GTCAAATAAAGCTTGCATGAGGCATAATCTAAAC-3'), który jest komplementarny do startera 1130 i starter 1127 (5'-CCAGTAAGCAAT7U\TGTGG-3'), który jest komplementarny do 5' końca genu S. Produkty PCR oczyszczono i zmieszano i następnie namnożono starterami 1128

PL 207 933 B1 i 1127. Produkt PCR uzyskany w drugiej rundzie PCR sklonowano w pGEM-T Easy, otrzymuj ą c pXH1802. Produkt PCR został wycięty Rsrll i AvrII i sklonowany w pMH54 poddanym działaniu tych samych enzymów, co dało pXH ,-\2aHE. Wektor dla transkrypcji pXHmin zawiera 3' koniec orflb przyłączony do genu S z delecją orf4a, 4b i 5a. Wektor skonstruowano przez klonowanie fragmentu wyciętego Pstl i EcoRV z pXH0803 do pXHn2aHE poddanego działaniu Sse8387I i EcoRV. Kompozycję wszystkich fragmentów wytworzonych przez PCR potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA.

Dla wytworzenia mutantów wirusów z delecją, donorowy RNA stranskrybowano z (zlinearyzowany PacI) plazmdiów pochodnych pMH54 i wprowadzono przez transfekcję stosując elektroporację do kocich komórek FCWF, które zarażono fMHV. Te zarażone i stransfekowane komórki wysiano następnie na pojedynczą warstwę mysich komórek RL7 (7). Po 24 godz. inkubacji w 37°C zebrano potomstwo wirusów przez pobranie nadsączu z hodowli komórek i wyselekcjonowano kandydatów na rekombinanty przez dwie rundy oczyszczania łysinek na komórkach RL7.

Wynik: Dla każdego użytego syntetycznego donora RNA otrzymano klarowne łysinki.

Wniosek: Otrzymano zrekombinowane wirusy, które odzyskały zdolność do wzrostu na komórkach myszy.

1.1. b. Potwierdzenie genotypów rekombinanta.

Cel: Potwierdzenie przez RT-PCR postaci genetycznej otrzymanych zrekombinowanych wirusów.

Postępowanie i wyniki: Sklonowane, zrekombinowane wirusy, jeden z każdego doświadczenia z rekombinacją, namnożono na komórkach RL7, wyizolowano wirusowy RNA i przeprowadzono PCR przy pomocy typowych sposobów na genomowym RNA co przedstawiono na Fig. 2. Dla potwierdzenia delecji ORF4 i 5a przeprowadzono etap RT ze starterem 1092 (5'-CCTTAAGGAATTGAACTGC-3), który jest komplementarny do 5' końca genu M, podczas gdy PCR przeprowadzony przy pomocy startera 1261 (5'-GCTGCTTACTCCTATCATAC-3') i startera 99 (5'-CCTGATTTATCTCTCGATTTC-3'), które są komplementarne do 3' i E i S, odpowiednio. W przypadku zrekombinowanego MHV-WT i obserwowano produkt RT-PCR odpowiadający wielkości, którą oczekiwano 1328 par zasad (Fig. 2, góra). Jak oczekiwano, produkt PCR o tej samej długości zaobserwowano dla MHV-.-\ 2aHE. Przeciwnie, zarówno MHV- ,-\45a i MHV-min wykryto jako znacznie mniejsze produkty RT-PCR. Mniejsza wielkość produktów RT-PCR odpowiada delecji 736 bp. Delecję Orf 2a i He zbadano w ten sam sposób. Etap RT przeprowadzono przy pomocy startera 1127 (5'-CCAGTAAGCAATAATGTGG-3'), który jest komplementarny do 5' końca genu S. PCR przeprowadzono przy pomocy startera 1173 (5'-GACTTAGTCCTCTCCTTGA-3') i startera 1260 (5'-CTTCAACGGTCTCAGTGC-3'), które są komplementarne do 3' końca genu 1b i 5' końca genu S, odpowiednio. Wykryto zarówno produkty PCR dla MHV-WT i MHV- A45a, które były znacznie większe niż produkty wykryte dla MHV-.-\2aHe i MHV-min (Fig. 2, dół). Różnica wielkości odpowiada delecji 2164 bp. Ostatecznie nowo wytworzone połączenia występujące w genomach zmutowanych wirusów z delecją (Fig. 1A [trójkąty] i 1B [sekwencja]) zbadano przez sekwencjonowanie produktów RT-PCR. Ostatecznie produkty PCR sklonowano w wektorze pGEM-Teasy (Promega). Otrzymane sekwencje były w całkowitej zgodzie z przewidywanymi.

Wnioski: Skonstruowane mutanty wirusa posiadały zamierzone delecje genetyczne.

1.1. c. Synteza RNA przez mutanty delecyjne MHV.

Cel: Potwierdzenie wzorów RNA zsyntetyzowanego w komórkach zarażonych przez zmutowane wirusy.

Procedura: Zarażone komórki 17Cl1 wyznakowano metabolicznie [³³P]ortofosforanem w obecności aktynomycyny D zasadniczo jak to opisano (4, 10). Próbki całkowitego cytoplazmatycznego RNA oczyszczono przy pomocy odczynnika Ultraspec (Biotecx) zdenaturowano formaldehydem i formaliną, rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym zawierającym formaldehyd i uwidoczniono przez fluorografię (Fig. 3; zauważ, że subgenomowe rodzaje RNA na tej Fig. są oznaczone przez ich kompozycję raczej niż jako RNA2 do RNA7, bowiem oznaczenia numeryczne mogą być mylące dla mutantów delecyjnych).

Wynik: Dla rekombinanta MHV-WT wzór RNA i względne ilości molarne sześciu subgenomowych (sg) rodzajów RNA i genomowych (g) RNA były bardzo podobne do tych, które wcześniej zaobserwowano dla MHV (10) (4) (5) (8) z jednym istotnym wyjątkiem. 4-5a/E-M-N sg RNA, który jest zazwyczaj oznaczony RNA 4 był znacznie powszechniejszy niż wcześniej zaobserwowany dla tych rodzajów MHV typu dzikiego (10) (4) (5) (8). Było to związane z trzema nukleotydowymi zmianami w pozycjach 13, 15 i 18 powyżej konsensusowego sygnału regulującego transkrypcję (5'-AAUCUAAAC-3'), który poprzedzał gen 4 (Fig. 1), który wprowadzono do wektora transkrypcyjnego

PL 207 933 B1 pMH54 dla wytworzenia miejsca Sse8387I poniżej genu S (7). Dla mutantów delecyjnych wszystkie warianty sgRNA miały ruchliwość odpowiadającą ich przewidzianym wielkościom (Fig. 3 i Tabela 3) i nie zaobserwowano dodatkowych dominują cych rodzajów. Wzglę dne molarne iloś ci rodzajów sgRNA zmienione w wyniku mutacji były całkiem podobne do tych, z ich odpowiedników typu dzikiego pochodzących z odpowiednich sygnałów regulatorowych odpowiedzialnych za transkrypcję.

Wnioski: Wyniki potwierdziły genotypy zrekombinowanych wirusów i pokazały ich oczekiwane fenotypy na poziomie RNA.

I.1.d. Fenotyp wzrostowy hodowli tkankowej.

Cel: Porównanie fenotypów wzrostowych in vitro

Procedura i wyniki: Konfluentną, jednowarstwową hodowlę komórek RL7 hodowaną na 35 mm szalkach, zarażono każdą zrekombinowanym wirusem (8 PFU na komórkę) i infektywność wirusa w poż ywce hodowlanej okreś lono w róż nym czasie po zaraż eniu (p.i.) przez miareczkowanie na komórkach RL7. TCID⁵⁰ (50% dawka zarażająca hodowlę tkankową) wartości obliczono i wykreślono (Fig. 4). Zrekombinowane wirusy nie różnią się znacząco pod względem wywoływania wydajnego wytwarzania syncytium lub efektów cytopatycznych lub wielkości wytwarzanych łysinek. Jednakowoż,

MHV- A45a i MHV-min różnią się od MHV-WT i MHV-.-\ 2aHE pod względem kinetyki jednoetapowego wzrostu (Fig. 4). Dwa wirusy ujawniają około dziesięciokrotnie niższe miana we wszystkich punktach czasowych.

Wniosek: Wszystkie wirusy z delecją namnażały się dobrze in vitro, choć delecja genów 4 i 5a dawała nieznacznie ujemny efekt.

1.1. e. Wirulentność zrekombinowanych wirusów u myszy.

Cel: Określenie czy delecje genetyczne wpływają na wirulentność wirusa.

Procedury i wyniki: Zrekombinowane wirusy scharakteryzowano w ich naturalnym gospodarzu, myszy. W pierwszym etapie określono wirulentność zrekombinowanych wirusów. LD⁵⁰ (50% dawki letalnej) oznaczenie przeprowadzono przez zaszczepienie MHV-ujemnej myszy C57B1/6 doczaszkowo dziesięciokrotnymi seriami rozcieńczeń (5 x 10⁵ - 5 x 10²) zrekombinowanych wirusów. Wirusy rozpuszczono przy pomocy PBS zawierającego 0,75% albuminy z surowicy bydlęcej. Objętość 25 μΐ użyto do wstrzyknięcia do lewej półkuli mózgowej. Badano 5 zwierząt na rozcieńczenie na wirus. Wartości LD50 obliczono sposobem Reed-Muench opartej na śmierci w ciągu 21 dni po zarażeniu. W sposób oczywisty zmutowane wirusy z delecją były attenuowane w porównaniu ze zrekombinowanymi MHV-WT. Podczas gdy wirus MHV-WT miał LD50 1,8 x 10⁴ to nie można było uzyskać LD50 dla mutantów delecyjnych. Choć zwierzęta zaszczepione wyższymi dawkami ujawniły pewne cechy choroby, żadne z zarażonych zwierząt którymkolwiek ze zmutowanych wirusów z delecją zmarło po podaniu 50 tys. PFU/mysz. Konsekwencją tego jest, że LD50 dla tych wirusów przekracza wartość 50 tys. i równie dobrze może być około 100 tys. Fig. 25 obrazuje kinetykę śmiertelności myszy zarażonych najwyższymi dawkami, 2,5 x 10⁵ jednostek tworzących łysinki (PFU), WT i wirusów z delecją. Podczas gdy wszystkie zwierzęta zaszczepione wirusem typu dzikiego zmarły w ciągu 7 dni po zarażeniu, wirusy z delecją były w wysokim stopniu attenuowane nie powodowały śmierci i pojawienia się ostrych objawów klinicznych. Poza tym, że nie zaobserwowano śmiertelności, wszystkie myszy zarażone wirusami D45a i D2aHE ujawniły objawy kliniczne przygarbienia, zmierzwienia i kaczego chodu w ciągu pierwszego tygodnia po zarażeniu; objawy te były mniej ostre i zaobserwowano je u niewielu myszy zarażonych MHV-min.

Wniosek: Wirusy z delecjami sekwencji obejmującymi geny 2a + HE lub geny 4a + 4b + 5a lub kombinacje wszystkich tych genów ujawniają u myszy znacząco attenuowany fenotyp. Innymi słowy, nieistotne geny koronawirusów nie są kluczowe dla wzrostu in vitro lecz określają wirulentność wirusa. Attenuacja nabyta jest przez ich delecje i co za tym idzie dostarcza znakomitych szczepionek wirusowych i wektorów terapeutycznych.

1.2. Wytwarzanie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

Cel ogólny: Określenie czy niezmienna kolejność genów określa funkcje polimerazy (ORF1a/1b) i białek strukturalnych S, E, M i N w genomie koronawirusa jest istotne dla żywotności tych wirusów lub czy zmiana tego uporządkowania jest tolerowana.

1.2. a. Konstrukcja zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

Określenie celu: Wytworzenie mutantów MHV-A59, w których względne miejsca genów struktury w genomie MHV-A59 są zmienione przez przesunięcie genów M i/lub E.

Podejście: ukierunkowana rekombinacja RNA przy pomocy fMHV i syntetycznego donorowego RNA niosącego geny przestawione w zamierzony sposób (Fig. 5, góra).

PL 207 933 B1

Procedura: Wektory transkrypcyjne dla wytworzenia donorowego RNA dla ukierunkowanej rekombinacji skonstruowano z plazmidów pMH54 i pXHD2aHE (opisane powyżej). Celem wytworzenia wektora transkrypcyjnego pXHSM45N (Fig. 5, dolna prawa część), produkt PCR wytworzono przez składanie zachodzących na siebie wydłużonych sekwencji (SOE)-PCR zawierających 3'-koniec genu M i 5'-koniec genu N i w którym miejsce restrykcyjne EcoRV wprowadzonych pomiędzy genem M i IGS bezpośrednio powyżej genu N. Dla wytworzenia fragmentu PCR użyto zewnętrznego startera 1C (5'-GTGTATAGATATGAAAGGTACCGTG-3') odpowiadający obszarowi genu M zawierającemu unikalne miejsce KpnI i zewnętrzny starter 1097 (5'-CGAACCAGATCGGCTAGCAG-3') odpowiadający obszarowi genu N zawierającemu unikalne miejsce Nhel. Starter 1095 (5'-25 AGATTAGATATCTTAGGTTCTCAACAATGCGG-3') i starter 1096 (5'-GAACCTAAGATATCT7y\TCTAAACTTTAAGGATG-3') użyto jako starterów wewnętrznych. Odpowiadają one sekwencji pomiędzy genem M i N i wprowadza miejsce EcoRV. Uzyskany produkt PCR został sklonowany w pGEM-Teasy (Promega) co daje wektor pXH0302. Jako kolejny etap w konstrukcji pXHSM45M, pMH54 poddane działaniu enzymów restrykcyjnych Sse8387l i EcoRV i otrzymany fragment sklonowane w miejscu EcoRV pXH0302 po stępieniu przez działanie polimerazą DNA z bakteriofaga T4, co dało wektor pXH0902. Po wycięciu fragmentu Sse8387l-EcoRV z pMH54, pozostałą część wektora przez działanie polimerazą DNA z bakteriofaga T4 i po ponownej ligacji otrzymano plazmid pXH1401. Ostatecznie, plazmid pXH0902 poddano działaniu enzymów restrykcyjnych Nhel i BseHII i otrzymany fragment sklonowano w pXH1401 poddanym działaniu tych samych enzymów co dało pXHSM45M.

Dla konstrukcji pXHMSmN najpierw usunięte ORFy 4, 5 i M z pMH54 przez trawienie restrykcyjne tego wektora enzymami Sse8387I i BssHII, a następnie działanie polimerazą DNA z bakteriofaga T4 i religowanie pozostałej części wektora, co dało pXHD45M5'. Następnie fragment otrzymany przez trawienie pXH0302 enzymami Nhel i BssHII sklonowano w pMH54 poddanym działaniu tymi samymi enzymami, co dało pXHMeN. Następnie fragment otrzymany po trawieniu enzymem restrykcyjnym EcoRV pXHMeN sklonowano w pXH1802 (opisany powyżej), który został strawiony Hindlll i poddany działaniu fragmentu Klenov polimerazy I DNA, dając pXH0305B. Fragment otrzymany przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Mlul i EcoRV pMH54 sklonowano w pB59(2) poddanego działaniu tych samych enzymów co dało wektor pXH2801. Następnie fragment otrzymany przez działanie na pXH2801 enzymami restrykcyjnymi KpnI i Pstl i poddano działaniu polimerazy DNA z bakteriofaga T4 i sklonowano w pXH1802 poddanego działaniu enzymu restrykcyjnego Hindlll i fragmentem Klenev'a polimerazy I DNA, co daje pXH0806. Następnie, fragment otrzymany przez trawienie pXH0305B przez Spel i Aflll sklonowano w pXH0806 poddanym działaniu tych samych enzymów, co daje pXH1506. Ostatecznie, pXHSmN otrzymano przez klonowanie fragmentu uzyskanego przez trawienie pXH1506 enzymami restrykcyjnymi Rsrll i AvrII do pXHD45M5' poddanych działaniu tych samych enzymów.

Dla konstrukcji wektora transkrypcyjnego pXH1bMS, wektor pXHMeN strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRV. Otrzymany fragment usunięto i ponownie ligowano otrzymując pXHDM. Następnie fragment otrzymany przez trawienie pXH0305B strawiono enzymami Rsrll i AvrII i sklonowano w pXHDM poddanym działaniu tych samych enzymów otrzymując pXH1bMS.

Wszystkie konstrukty potwierdzono przez analizę restrykcyjną i/lub analizę sekwencji. Przedstawiono to schematycznie na Fig. 5 (lewa). Wszystkie nowo wytworzone połączenia włącznie z wprowadzeniem miejsca Sse8387I poniżej genu S w pMH54 (7) są wskazane strzałkami podczas gdy ich sekwencje w Tabeli 1. Zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy wektorem transkrypcyjnym prowadzącym ciągłą transkrypcję genomu fMHV, jak to opisano powyżej. Po dwóch rundach oczyszczania łysinki na komórkach RL7 wirusy zbadano przez RT-PCR na genomowym RNA i stwierdzono, że zawierają genomy o oczekiwanej orientacji.

Wniosek: Określona kolejność genów nie jest zasadniczo wymagana wstępnie dla żywotności.

I.2.b. Synteza RNA przez mutanty MHV o zmienionej kolejności genów.

Cel: Potwierdzenie wzorów RNA zsyntetyzowanych w komórkach zarażonych zmutowanymi wirusami.

Procedura: Zarażone komórki 17Cl1 wyznakowano metabolicznie [³³P]ortofosforanem w obecności aktynomycyny D zasadniczo tak jak to opisano (4, 10). Próbki całkowitego cytoplazmatycznego RNA oczyszczone przy pomocy odczynnika Ultraspec (Biotecx), zdenaturowano formaldehydem i formamidem, rozdzielono przez elektroferezę w 1% żelu agarozowym zawierającym formaldehyd i uwidoczniono przez fluorografię (Fig. 26A).

Wyniki: Koronawirusy wyrażają swoje genomy przez wytwarzanie zestawu zagnieżdżonych sg RNA o wspólnych 3'-końcach. Zrekombinowane wirusy o zmienionej organizacji genomu są co za tym

PL 207 933 B1 idzie, podejrzane o zsyntetyzowanie wzorów wirusowych RNA, które są znacząco odmienne od tych, dla wirusów rodzicielskich. Dla zrekonstruowanych wirusów typu dzikiego (MHV-WT) i dla MHV-D2aHE, wzory RNA i ilość genomowych (g) i sg RNA wydają się być podobne do tych, które zaobserwowano wcześniej (Fig. 3). Zauważ, że MHV-.-\2aHE- jak również jego pochodne MHV-MS-mN i MHV-1bMS nie syntetyzują rodzajów sg RNA kodujących białko 2a. Dla mutantów MHV o przebudowanych genomach wszystkie warianty sg RNA miały ruchliwość odpowiadającą ich przewidywanym wielkościom (Fig. 26A i Tabela 4) i nie zaobserwowano wyraźnych dodatkowych ich rodzajów. MHV-SM45N rosły bardzo słabo i co za tym idzie były jedynie słabo wyznakowane. Można było wykryć wszystkie rodzaje sg RNA z wyjątkiem jednego, z którego powinna zachodzić translacja białka M. Unikalność tego sg RNA, czego przyczyna jest nieznana jest prawdopodobnie przyczyną zaburzonego wzrostu tego wirusa. Ogólnie, wzory wirusowego RNA zsyntetyzowanego przez komórki zarażone zrekombinowanymi wirusami wyraźnie odzwierciedlają zmiany dokonane w organizacji genomu koronawirusa.

Wniosek: Wyniki potwierdzają genotypy zrekombinowanych wirusów i uwidaczniają ich oczekiwane genotypy na poziomie RNA.

1.2. C. Fenotyp wzrostowy hodowli tkankowej.

Cel: Potwierdzenie fenotypów wzrostowych zmutowanych wirusów in vitro.

Procedura i wyniki: Konfluentne rosnące jako pojedyncza warstwa na 35 mm szlakach komórki RL7 zarażono każdym ze zrekombinowanych wirusów (8 PFU/komórkę) i infektywność wirusów w pożywce hodowlanej określono w różnym czasie po zarażeniu przez miareczkowanie na komórkach RL7. Wartości TCID⁵⁰ obliczono i wykreślono (Fig. 6). W ten sposób zbadano wszystkie wirusy z wyjątkiem zmutowanego MHV-SM45N. Miano zarażenia tego ostatniego wirusa było zbyt niskie (około 1000x niższe WT rekombinanta MHV) dla wyznaczenia jednoetapowej krzywej wzrostu. Choć MHV-1bMs wydaje się indukować trochę wolniej tworzenie syncytiów niż rekombinant WT, wszystkie wirusy namnażają się w przybliżeniu w takim samym zakresie, co widać na krzywej wzrostu.

Wniosek: Z wyjątkiem zmutowanego wirusa MHV-SM45N, przebudowa genu nie ma dramatycznego wpływu na jego charakterystyki wzrostu in vitro.

1.2. d. Replikacja zrekombinowanych wirusów w myszy.

Cel: Określenie czy wirusy o zmienionej kolejności genu są replikatywne w myszy.

Procedura i wyniki: Ośmiotygodniowe MHV-ujemne samice myszy BALB/c były użyte w doświadczeniu. Wirusy rozcieńczono w PBS i całkowitą objętość 100 μl (10⁶ TCID⁵⁰) użyto dla wstrzyknięcia do jamy otrzewnowej. Każdym wirusem nastrzyknięto cztery zwierzęta. Myszy uśpiono i pobrano wątroby w 4 dniu po zarażeniu. Wątroby umieszczono w 1,5 ml DMEM, zważono i następnie zamrożono w -80°C, aż do oznaczenia miana wirusa. Miana wirusa określono oznaczeniem łysinkowym na jednowarstwowej hodowli komórek RL7, a następnie homogenizację narządów. Replikację MHV-WT, MHV-D2aHE i MHV-MSmN badano w ich naturalnym gospodarzu, myszy. Podczas gdy 50% śmiertelną dawkę MHV-WT w myszy określono wcześniej na 2,7x10⁴ PFU, MHV-D2aHE nie był dostatecznie wirulentny dla określenia wartości 50% dawki letalnej (rozdział I.1.e.). Co za tym idzie, zdecydowaliśmy się zbadać replikację in vivo zrekombinowanych wirusów. Mysz zaszczepioną dootrzewnowo 1x10⁶ TCID⁵⁰ uśmiercone w 4 dni po zarażeniu i określono replikację wirusa w wątrobie. Wyniki są przedstawione na Fig. 26B. Replikację MHV-D2aHE i MHV-MSmN w wątrobie do podobnego zakresu była znacznie mniejsza niż MHV-WT. Delecja ORF 2a i HE dała zrekombinowany wirus (MHV-D2aHE) attenuowany w naturalnym gospodarzu, co pokazano w rozdziale podczas gdy dodatkowa przebudowa kolejności genów koronawirusa (MHV-MSmN) nie dała w tym oznaczeniu bardziej attenuowanego w fenotypie.

Wniosek: Wirusy o zmienionej kolejności genów, które utraciły typową organizację genomu koronawirusa i wirusy, które utraciły ORF 2a i HE są replikatywne w ich naturalnym gospodarzu, myszy.

1.3. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów wyrażających obce geny.

Cel: Określenie czy obce geny mogą być wbudowane w różnych miejscach do genomu wirusa, zarówno jako dodatkowy gen lub zastępując usunięte, nieistotne geny lub w połączeniu ze zmienioną kolejnością genów, określają czy geny są wyrażone i czy są one stabilnie utrzymywane w czasie przeszczepiania wirusa in vitro.

1.3. a. Konstrukcja zrekombinowanych wirusów niosących geny reporterowe.

Cel: Wytworzenie wirusów MHV-A59 ze wstawionymi obcymi genami.

Procedura: Skonstruowano szereg wirusów zawierających obcy gen reporterowy w ich genomie w różnych miejscach (patrz Fig.7A). Użyto dwóch genów reporterowych kodujących lucyferazę renilla (RL) i lucyferazę świetlika (FL). Dla obu genów skonstruowano plazmidy, w których gen poprzedzała

PL 207 933 B1 międzygenowa sekwencja MHV (IGS). Z tych konstruktów kasetka (gen + IGS) może być następnie przeniesiona do różnych wektorów transkrypcyjnych. W pierwszym etapie MHV IGS sklonowane przed genem RL. W tym celu starter 1286 (5'-GGATACTAATCTAAACTTTAG-3') i 1287 (5'-CTAGCTAAAGTTTAGATTAGATATCCTGCA-3') przyłączono do każdego ze sklonowanych w pRL-null (Promega) poddanych działaniu Nhel i Pstl otrzymując pXH1909. Dla konstrukcji wektora transkrypcyjnego zawierający gen pomiędzy genami 2a i S (pXH22aRLS) przeprowadzono następujące etapy. Wektor p96 (1) strawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Nlul i otrzymany fragment sklonowano w pXH1802 (opisany powyżej) poddany działaniu Hindlll i BssHII, co daje pXH2103. Następnie kasetka ekspresyjna RL została usunięta z pXH1909 przez trawienie restrykcyjne EcoRV i Xbal, działanie fragmentem Klenov'a polimerazy I DNA i klonowanie w pXH2103 strawionym Hindlll i poddanym działaniu fragmentu Klenev'a otrzymując pXH2509A. Ostatecznie, pXH22aRLS skonstruowano przez klonowanie fragmentu otrzymanego przez trawienie pXH2509A enzymem Rsrll i AvrII w pMH54 poddanym działaniu tych samych enzymów.

Dla konstrukcji pXH2ERLM kasetkę ekspresyjną, którą użyto dla sporządzenia pXH2509A, sklonowano w pMH54 strawionym EcoRV.

Tą samą kasetkę ekspresyjną sklonowano również w pXHMeN (opisana powyżej) poddanym działaniu EcoRV, otrzymując pXH2ERLM. Następnie pXH2MRLN skonstruowano klonując fragment otrzymany z trawienia restrykcyjnego pXHMEN EcoRV w pXH2ERLN poddanym działaniu tego samego enzymu. pXHMSmNRL skonstruowano przez klonowanie kasetki ekspresyjnej renilla w pXHMSmN (opisane powyżej) poddane działaniu EcoRV.

Dla konstrukcji pXHEFLM gen FL był najpierw sklonowany pomiędzy tym samym IGS jaki użyto dla kasetki ekspresyjnej RL. W tym celu gen lucyferazy usunięto z pSP-Luc+ (Promega) przez trawienie restrykcyjne AvrII i Xbal i sklonowano w pXH1909 poddanych działaniu Nhel i Xbal co daje pXH2711. Następnie, kasetka ekspresyjna FL została wycięta z pXH2711 przez trawienie EcoRV i Xbal, działanie fragmentem Klenov polimerazy I DNA i sklonowanie w pPMH54 strawionym EcoRV, co daje pXHEFLM.

Plazmid pXHminFL skonstruowano przez klonowanie kasetki ekspresyjnej FL w pXHmin (opisany powyżej) strawionym EcoRV. Plazmid ten utracił ORF 2a/HE/4a/4b/5a i zawiera gen FL pomiędzy genami E i M. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i analizę sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinację RNA-RNA pomiędzy wektorem transkrypcyjnym i genomem fMHV jak to opisano powyżej. Otrzymane wirusy potwierdzono genetycznie przez analizę RT-PCR.

Wyniki zrekombinowanych wirusów zawierających gen RL przedstawiono na Fig. 7b i 27. Dla potwierdzenia insercji tych genów przeprowadzono etap RT na genomowym RNA starterem 1412 (5'CTGCGGACCAGTTATCATC-3'), który jest komplementarny do 5' końca genu RL. Następnie, przeprowadzono PCR starterem 1091 (5'-CATCCGTTTCCTTTGTTCTGG-3') dla MHV-ERLM i MHV-MRLN lub starterem 1173 (5'-GACTTAGTCCTCTCCTTGATTG-3') i startera 1413 dla MHV-2aRLS. Starter 1091 i starter 1173 odpowiadające 3' końcowi genu 4b i genu 1b, odpowiednio, podczas gdy starter 1413 odpowiada 5'-końcowi genu RL. Jako pozytywne kontrole użyto same, odpowiednie wektory transkrypcyjne. We wszystkich przypadkach otrzymano fragmenty PCR o tej samej wielkości jako kontrole pozytywne, podczas gdy woda była w kontroli negatywnej. Zaobserwowano (i przewidziano) fragmenty o wielkości około 1000 par zasad dla MHV-2aRLS, około 670 par zasad dla MHV-ERLM i około 1300 par zasad dla MHV-MRLN (7b). Dla MHV-MSmNRL przeprowadzono PCR ze starterem 1091 i starterem 1413 i ze starterem 1173 i starterem 1413. Jako kontrolę pozytywną użyto samych, odpowiednich wektorów transkrypcyjnych. We wszystkich przypadkach otrzymano fragmenty PCR o tej samej wielkości co kontrola pozytywna. Zaobserwowane (wydedukowane) wielkości fragmentów były odpowiednio 670 par zasad dla reakcji PCR ze starterami 1091 i 1413 i około 1200 par zasad dla reakcji PCR ze starterami 1173 i 1413 (7B) (zobacz na Fig. 7B i 27, dla każdego typu wirusa 2 niezależnie otrzymano klony wirusowe, które zbadano i uwzględniono). Wyniki potwierdziły wbudowanie genu RL do genomu MHV w prawidłowym miejscu.

Wyniki dla zrekombinowanych wirusów zawierających gen FL przedstawiono na Fig. 28. Dla potwierdzenia wbudowania tego genu przeprowadzono etap RT na genomowym RNA ze starterem 1475 (5'-GCCTAATGCAGTTGCTCTCC-3'), który jest komplementarny do 5' końca genu FL. Następnie, przeprowadzono PCR ze starterem 935 (5'-GTTTTAGCACAGGGTGTGGCTCATG-3') odpowiadającym 3' końcowi genu S i starterem 1474 (5'-CCATCTTCCAGCGGATAG-3'), który odpowiada 5' końcowi genu FL. Jako kontrolę pozytywną użyto samych wektorów transkrypcyjnych. We wszystkich

PL 207 933 B1 przypadkach, otrzymano fragmenty PCR o takiej samej wielkości co kontrola pozytywna, podczas gdy woda była kontrolą negatywną. Zaobserwowana (i wydedukowana) wielkość fragmentów była około 1200 par zasad dla MHV-EFLM i około 500 par zasad dla MHV-minFL zauważ, że na Fig. 28 dla każdego rodzaju wirusa 2 zbadano i uwzględniono niezależnie otrzymane klony wirusa.

Wniosek: Wbudowanie modułów genetycznych do genomu koronawirusa jest tolerowane we wszystkich zbadanych miejscach; wszystkie zamierzone wirusy były żywotne.

I.3.b. Synteza RNA przez zrekombinowane wirusy.

Cel: Potwierdzenie wzorów RNA zsyntetyzowanego w komórkach zarażonych przez zmutowane wirusy.

Procedura: Zarażone komórki 17Cl1 wyznakowano metabolicznie przy pomocy [³³P]ortofosforanu w obecności aktynomycyny D zasadniczo jak opisano (4,10). Próbki całkowitego cytoplazmatycznego RNA oczyszczone przy pomocy odczynnika Ultraspec (Biotecx), zdenaturowano formaldehydem i formamidem, rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym zawierającym formaldehyd i uwidoczniono przez fluorografię (Fig. 29-31; zauważ, że subgenomowe rodzaje RNA na tej Fig. są oznaczone przez ich kompozycję, raczej niż jako RNA2 do RNA7, bowiem oznaczenie numeryczne będzie mylące w przypadku mutantów).

Wynik: Dla wszystkich mutantów MHV z genami lucyferazy, wszystkie warianty sg RNA miały ruchliwość odpowiadającą ich przewidywanej wielkości (Fig. 29-31). Dla wirusów zawierających gen lucyferazy renilla nie zaobserwowano wyraźnych, dodatkowych rodzajów. Dla wirusów zawierających gen lucyferazy ze świetlika zaobserwowano dwa dodatkowe rodzaje RNA, odpowiadające pod względem wielkości transkrypcji sg RNA z sekwencji genu lucyferazy świetlika, które są podobne do MHV IGS. Ogólnie, wzory wirusowego RNA zsyntetyzowanego przez zarażone komórki ze zrekombinowanymi wirusami wyraźnie odpowiadają insercji kasetek ekspresyjnych lucyferazy do genomu koronawirusa.

Wniosek: Wyniki potwierdzają genotypy zrekombinowanych wirusów i pokazują ich oczekiwane fenotypy na poziomie RNA.

I.3.c. Replikacja wirusów wyrażających lucyferazę świetlika.

Cel: Porównanie charakterystyk wzrostu wirusów z wirusami typu dzikiego i między sobą.

Procedura i wyniki: Po dwóch rundach oczyszczania łysinki przygotowano roztwory wyjściowe wirusa, zmiareczkowane i użyte dla zarażenia przy wysokim m.o.i. (m.o.i. wynosi 8) komórek RL7, po czym śledzono infekcje wirusowe w pożywce hodowlanej. Wyniki są przedstawione jako krzywe wzrostu pokazane na Fig. 8A i 8B i jako wyniki pokazane na Fig. 32. MHV-EFLM dwóch klonów wirusowych otrzymano niezależnie w doświadczeniach z rekombinowaniem opisanych w I.3.a. na Fig. 32 pokazano wartości TCID50 otrzymane po 8-9 godz. po zarażeniu. Oczywiście, charakterystyki wzrostowe zrekombinowanych wirusów przedstawione na Fig. 8A i 8B są zasadniczo nie rozróżnialne; wszystkie wirusy rosną do miana, które było porównywalne do miana zrekombinowanego wirusa typu dzikiego. MHV-MSmNRL osiągał trochę niższe miano (Fig. 32).

Wniosek: Wbudowanie kasetki ekspresyjnej w poważnym stopniu wpływa na charakterystykę wzrostu in vitro zrekombinowanych wirusów.

I.3.d. Ekspresja lucyferazy renilla i świetlika w hodowli komórkowej.

Cel: Określenie czy była funkcjonalna wbudowana kasetka ekspresyjna.

Procedura i wyniki: Konfluentne jednowarstwowe hodowle komórek RL7 zarażono przy m.o.i. 8 i wytworzoną aktywność lucyferazy ś ledzono w komórkach przez okreś lony czas. Ekspresję RL w komórkach zmierzono przy pomocy Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta. Aktywność RL i FL zmierzono w jednostkach względnych (RLU) stosując luminometr (Lumac Biocounter M2500 lub Turner Designs Model TD-20/20).

Wyniki przedstawiono graficznie na Fig. 9A, 9B i 33. Wszystkie zrekombinowane wirusy z wyjątkiem rekombinowanych wirusów typu dzikiego wyrażają lucyferazę na wysokim poziomie wykazując, że zarówno kasetki genu lucyferazy renilla i świetlika były funkcjonalne w każdym zbadanym miejscu genomu. W przypadku większości wirusów najwyższy poziom ekspresji był osiągnięty po 9 godz.

po zarażeniu. Poziom ekspresji lucyferazy świetlika w tym momencie został określony na 1,6 μg/10⁶ komórek. Poziom ekspresji aktywności lucyferazy z MHV-minFL, który porównano do tych produktów uzyskanych z różnych zrekombinowanych wirusów zawierających gen FL, podczas gdy ekspresja genu lucyferazy renilla w komórkach zarażonych MHV-MSmNRL była około 10-razy niższa niż w komórkach zarażonych MHV-ERLM. Różnica ta odpowiada różnicy występującej pomiędzy replikacja MHV-MSmNRL i MHV-ERLM.

PL 207 933 B1

Wniosek: Obce geny mogą być wyrażone przez koronawirusy zarówno jako dodatkowa wstawka takiego genu, przy pomocy przestrzeni genetycznej wytworzonej przez delecję nieistotnych genów lub w połączeniu ze zmianą organizacji genomu.

1.3. e. Utrzymanie obcych genów podczas pasażowania wirusa.

Cel: Ocena stabilności wbudowanych genów lucyferazy podczas przeszczepiania wirusa.

Procedura i wyniki: Zrekombinowane wirusy MHV-ERLM i MHV-EFLM przeszczepiono 8 razy na komórki RL7 przy niskim m.o.i. (mniej niż 0,05). Po każdym przeszczepieniu określono infektywność wirusa (TCID50) w pożywce hodowlanej w 9 godz. po zarażeniu. Następnie, aktywność lucyferazy świetlika i renilla określono w równoległym doświadczeniu z ekspresją (m.o.i. = 5) w 8 godz. po zarażeniu (Fig. 10). Zarówno MHV-ERLM i MHV-EFLM zbadano dwa niezależnie uzyskane klony A i B. Podczas gdy ekspresja lucyferazy renilla była jednorodnie stabilna przez przynajmniej osiem pasaży, lucyferaza ze świetlika była stabilna jedynie przez pięć pasaży. Po pasażu 5 poziom ekspresji MHV-EFLM wyraźnie spadał w przypadku obu niezależnych klonów. Po ośmiu pasażach wyizolowano 10 klonów wirusowych przez oznaczenie łysinkowe zarówno MHV-ERLM i MHV-EFLM i zbadano je z uwagi na ekspresję lucyferazy. Podczas gdy w przypadku MHV-ERLM wszystkie 10 klonów było pozytywnych, 9 z klonów MHV-EFLM nie ujawniało dłużej wyraźnie wykrywalnej ekspresji lucyferazy.

Wniosek: Obcy gen może być stabilnie utrzymany w genomie koronawirusa in vitro przez przynajmniej 8 pasaży.

1.3. f. Ekspresja lucyferazy świetlika w myszy.

Cel: Określenie czy wbudowany gen lucyferazy jest wyrażany w naturalnym gospodarzu, myszy.

Procedura i wyniki: Ośmiotygodniowe, MHV negatywne samice myszy BALB/c użyto w doświadczeniu. Myszy zaszczepiono donosowo 10⁶ TCID⁵⁰ MHV-EFLM. Użyto czterech zwierząt na wirus. Myszy zabito i usunięto wątroby i mózgi w 4 dni po infekcji. Narządy szybko zamrożono w ciekłym azocie zhomogenizowano dostarczonym Cell Culture Lysis Reagent z Luciferase Assay System (Promega). Aktywność FL zmierzono zgodnie z instrukcjami producenta przy pomocy luminometru (Lumac Biocounter N2500). Jednoznacznie, jak pokazano na Fig. 34, aktywność lucyferazy może być wykryta zarówno w wątrobie jak i mózgu. Jako alternatywny sposób dal oceny czy obcy gen uległ również ekspresji in vivo tj. w zwierzętach, myszy zaszczepiono dootrzewnowo 10⁶ TCID⁵⁰ MHV-EFLM. Cztery dni później myszy uśpiono i podano podskórnie lucyferynę. Ekspresję lucyferazy oceniono 5 minut później przez rejestrowanie w czasie rzeczywistym emisji światła przez ciało martwej myszy, stosując wrażliwy ekran połączony z kamerą CCD. Wyraźnie zaobserwowano emisje światła z obszaru wątroby myszy.

Wniosek: Obcy gen może być wyrażony przez koronawirusy w ich naturalnym gospodarzu.

1.3. g. Wytworzenie MHV wyrażającego dwa obce geny z jednego genomu.

Cel: Określenie czy dwa obce geny mogą ulegać ekspresji z jednego genomu.

Procedura i wyniki: pXH2aRLSEFLM wytworzono przez klonowanie kasetki ekspresyjnej FL w pXH2aRLS strawionym EcoRV. Po potwierdzeniu konstruktu przez analizę restrykcyjną i sekwencji zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem fMHV jak to opisano. Otrzymany wirus, MHV-RLFL, został potwierdzony genetycznie przez analizę RT-PCR. Zarówno aktywność lucyferazy renilla i lucyferazy świetlika można było wykryć w pojedynczych łysinkach. Po wytworzeniu zapasu wirusa o wysokim mianie zarażono konfluentne, jednowarstwowe hodowle komórek RL7 przy m.o.i. 8 i śledzono w czasie wytwarzanie aktywności lucyferazy w komórkach. Ekspresję RL w komórkach zmierzono przy pomocy Renilla Assay System (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta. Podobnie, ekspresja FL została zmierzona przy pomocy Luciferase Assay System (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta w 8 godz. po zarażeniu. Aktywność RL i FL zmierzono we względnych jednostkach światła (RLU) stosując luminometr (Lumac Biocounter M2500). Wyniki pokazały, że MHV-RLFL replikuje się z taką samą wydajnością jak MHV-2aRLS i MHVEFLM (Fig. 4 6A). MHV-RLFL wyraża zarówno lucyferazę renilla i lucyferazę świetlika, MHV-2aRLS wyraża jedynie lucyferazę renilla, podczas gdy MHV-EFLM wyraża jedynie lucyferazę świetlika (Fig. 46B).

Wniosek: Dwa obce geny mogą ulegać ekspresji z jednego genomu koronawirusa.

1.3. h. Wytworzenie MHV eksprymującego chimerowy gen kolec-GFP.

Cel: Ustalenie czy zrekombinowany MHV może być wytworzony tak, że zachodzi ekspresja wbudowanego, chimerowego białka kolec-GFP.

Procedura i wyniki: Gen GFP został sklonowany w ramce z genem S w pMH54. Po potwierdzeniu konstruktu przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rePL 207 933 B1 kombinowanie RNA-RNA pomiędzy transkryptami ciągłymi z wektora transkrypcyjnego i genomem fMHV jak to opisano powyżej. Otrzymany wirus MHV-SGFP potwierdzono genetycznie przez analizę RT-PCR. Łysinki zbadano mikroskopowo i pokazano ekspresję GFP jako zieloną fluorescencję. Analiza immunoprecypitacji wykazała, że zostały wytworzone białka hybrydowe, które mogą być wytrącone specyficznymi przeciwciałami przeciw MHV-S i GFP.

Wniosek: MHV może być wytworzony tak, że wyraża chimerowy gen S-GFP zamiast dzikiego typu genu S. Ten zmutowany wirus jest żywotny i może być namnożony w hodowli komórkowej dowodząc, że te białka hybrydowe są wbudowane do cząsteczki wirusa.

I.4. Hamowanie infekcji i fuzji komórki przez białko będące pochodną białka kolce.

Cel ogólny: Hamowanie infekcji koronawirusa i rozprzestrzenianie zachodzącej infekcji przez wpływanie przy pomocy peptydów na fuzję błony.

Cel specyficzny: Wytworzenie peptydu tworzącego sekwencję pochodzącą z błonowego - proksymalnego hepta powtórzonego obszaru (HR2) z białka S MHV-A59 i pokazanie jego efektu inhibitorowego na wniknięcie MHV-A59 do komórek LR7 i fuzje komórka-komórka w zarażonej hodowli tych komórek.

Procedury:

a. Konstrukcje plazmidu:

Otrzymano gen kolca jako fragment PCR z matrycy plazmidu pTUMS (13) zawierającej MHV-A59 gen kolca, odpowiadający 1216-1254 (HR2) białka S (Fig. 20). Użyto startera do przodu: 5'GCGGATCCATCGAAGGTCGTGATTTATCTCTCGATTTC3'. Starter ten wprowadzał powyżej miejsce BamHI i sekwencję kodującą miejsce cięcia dla czynnika Xa bezpośrednio poniżej miejsca BamHI, do namnożonego fragmentu. Starter odwrotny (5'CGAATTCATTCCTTGAGGTTGATGTAG3') zawierał poniżej miejsce EcoRI jak również kodon stop poprzedzający miejsce EcoRI. Fragment PCR sklonowane w miejsce BamHI-EcoRI bakteryjnego wektora dla ekspresji pGEX-2T.

b. Ekspresja białka bakteryjnego i oczyszczanie:

Świeżo stransformowane komórki BL21 (NOVAGEN) hodowano w pożywce 2YT do fazy logarytmicznej (OD600 = 1,0) i następnie indukowano ekspresję dodając IPTG (Gibco BRL) do końcowego stężenia 0,4 mM. Dwie godziny po rozpoczęciu indukcji komórki osadzono i zawieszono w 1,25 objętości hodowli 10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA i 1 mM PMSF i rozbijano ultradźwiękami na lodzie (5 razy po 2 min. z 1 min. przerwami). Lizaty komórkowe wirowano przy 20 tys, x g przez 60 min. w 4°C. Następnie dodano 2 ml glutation-sefarozy 4B (50% obj./obj. W PBS) do 50 ml nadsączu i nadsącz inkubowano przez noc (O/N) w 4°C obracając. Ziarna wypłukano trzykrotnie 50 ml PBS i zawieszono w końcowej objętości 1 ml PBS. Peptydy odcięto od cząsteczek GST na ziarnach przy pomocy 20 U trombiny inkubując przez 4 godz. w temperaturze pokojowej (RT). Peptydy w nadsączu oczyszczono HPLC na kolumnie Phenyl liniowym gradientem acetonitrylu zawierającym 0,1% kwasu trójchlorooctowego. Peptydy zawierające frakcje wysuszono pod próżnią O/N i rozpuszczono w wodzie. Stężenie peptydu określono przez pomiar absorbancji przy A280 nm lub analizę białka BCA (Micro BCA™ Assay Kit, Pierce).

c. Wniknięcie wirusa do komórki i oznaczenia zahamowania fuzji komórka-komórka:

Zdolność peptydu HR2 do zahamowania infekcji wirusowej określono przy pomocy rekombinacyjnej ekspresji MHV-EFLM lucyferazy świetlika. Konfluentne jednowarstwowe hodowle komórek RL7 na 96-studzienkowych płytkach inkubowano w 37°C w DMEM przy wielokrotności infekcji 5 przez 1 godz. w obecności różnych stężeń peptydu mieszczących się w granicach 0,4-50 μM. Po 1 godz. komórki wypłukano DMEM i pożywkę zastąpiono przez pozbawioną peptydu DMEM. Pięć godz. po infekcji komórki zlizowano przez 15 minut w RT w buforze dla lizy, zgodnie z zaleceniami producenta (Luciferase Assay System, Promega). Po zmieszaniu 10 μl lizatu komórkowego z 40 μl substratu aktywność lucyferazy zmierzono niezwłocznie stosując Wallac Betaluminometer. Obliczono stężenie dające 50% skuteczności inhibitora (wartość EC50) przez dopasowanie danych o hamowaniu do równania równowagi wiązania: procent aktywności lucyferazy = 100 (1 + (C/EC50). Zdolność peptydu HR2 do hamowania zależnej od kolca fuzji komórka-komórka określono przy pomocy oznaczenia łysinkowego. Jednowarstwowe hodowle komórek RL7 w 6-studzienkowych płytkach zaszczepiono 50 PFU MHV-A59 w DMEM w 37°C. Po 1 godzinie komórki wypłukano DMEM i zalano agarem zawierającym peptyd HR2 w stężeniach 50, 10, 2, 0,4 i 0,08 μM. Łysinki policzono po 48 godz. od zarażenia i utrwalono 0,9% formaldehydem/0,75% fiolet krystaliczny.

Wyniki: Zdolność peptydu HR2 do hamowania wnikania wirusa badano stosując wirus wyrażający reporterowy gen lucyferazy, ponieważ pozwala to na wybitnie czułe wykrycie zarażenia. Zakaże26

PL 207 933 B1 nie komórek wirusem przeprowadzono w obecności różnych stężeń peptydu HR2. Po 1 godz. od zaszczepienia komórki wypłukano i inkubowano dalej w pożywce hodowlanej przy braku peptydu. Po 4 godz. od zarażenia, zanim normalnie utworzy się syncytium, komórki zlizowano i zbadano z uwagi na aktywność lucyferazy (Fig. 11). Na tym obrazku znormalizowana aktywność lucyferazy przedstawiająca powodzenie zarażenia została odłożona względem stężenia peptydu obecnego podczas zaszczepienia. Peptyd HR2 zablokował bardzo wydajnie wniknięcie wirusa, infekcja była zahamowana zasadniczo całkowicie przy stężeniu 50 μM. Skuteczne stężenie (EC₅₀), przy którym 50% zarażenia wirusowego było zahamowane wynosiła 0,15 μM. Zdolność peptydu HR2 do zahamowania fuzji komórkakomórka za pośrednictwem białka kolca zbadano stosując oznaczenie łysinkowe. Po zaszczepieniu (równoległych hodowli) komórek przy braku peptydu zalano je warstwą zawierającą różne stężenie peptydu HR2. Tworzenie łysinek wydawało się być całkowicie zahamowane w obecności peptydu HR2 o stężeniach do 0,4 μM (Fig. 12). Przy stężeniu 0,08 μM peptydu HR2 zaobserwować można jedynie niewielkie łysinki.

Specyficzność inhibitora przedstawiono we wszystkich tych oznaczeniach przez równoległe badanie efektów innych peptydów (Fig. 20) przygotowanych identycznie i użytych w tych samych stężeniach, przykładowo włącznie z peptydem odpowiadającym aminokwasom 1003-1048 białka S z MHV-A59 (przedstawione jako „peptyd kontrolny na Fig. 11). Skuteczny był jedynie peptyd HR2.

Wniosek: Peptyd HR2 jest silnym inhibitorem zarówno wnikania wirusa do komórek jak i fuzji komórka-komórka przy udziale kolca MHV-A59.

II. Koci, zakaźny wirus zapalenia otrzewnej (FIPV) szczep 79-1146.

II. 1. Wytworzenie mFIPV, kociego koronawirusa rosnącego na komórkach myszy.

Cel ogólny: Ustalenie adresowanego systemu rekombinowania RNA dla kociego koronawirusa FIPV 79-1146, podobnego do opisanego powyżej dla manipulacji genetycznej mysim koronawirusem MHV-A59.

Cel specyficzny: Wytworzenie mFIPV, pochodnej FIPV, w której białko ektodomeny kolca zostało zastąpione genetycznie przez białko S z MHV-A59, co za tym idzie zmianę tropizmu chimerowego wirusa na komórki myszy zamiast kocich.

1.1. a. Konstrukcja syntetycznego wektora transkrypcyjnego RNA.

Cel: Przygotowanie konstruktu plazmidowego, z którego transkrybowany może być syntetyczny, donorowy RNA dla ukierunkowanej rekombinacji RNA i który zawiera sekwencje pochodzące z 5' końca genomu FIPV przyłączone do sekwencji pochodzących z 3' części genomu wirusa, tj. wszystkie sekwencje poniżej (włącznie z) 3' końcem ORF1B. Również: przygotowanie pochodnej plazmidu, w której sekwencje kodujące ektodomenę kolca zostały zastąpione przez kodującą odpowiednią domenę białka kolca MHV-A59.

Procedura i wyniki: Stosując standardowe techniki klonowania DNA skonstruowano wektor pBRDI1 zawierający kopię cDNA 5' końcowych 702 zasad przyłączonych przez ligację do 3' końcowych 9262 zasad genomu FIPV 79-1146 (Fig. 13A). Ligację przeprowadzono w taki sposób, że fragment genu ORF 1A (pol 1A) połączono w ramce na jego 3' końcu z 5' końcem fragmentu genu ORF 1B (pol 1B) (Fig. 14B). Ponadto, w miejsce to wprowadzono unikalną sekwencję restrykcyjną dla SacI (Fig. 14B). Sekwencje kociego koronawirusa umieszczono pod kontrolą sekwencji promotora bakteryjnej polimerazy T7, po której następują 3G (Fig. 14A) powodując wydajną transkrypcję RNA in vitro przy pomocy T7 polimerazy. Na 3' końcu sekwencja kończyła się poliA ogonem o 15 A poprzedzonym unikalnym miejscem restrykcyjnym Notl (Fig. 14C) dla zapewnienia ciągłej transkrypcji. Sekwencja promotora T7 jest poprzedzona przez unikalne miejsce restrykcyjne dla XhoI (Fig. 14A) tak, że DNA kociego koronawirusa może być sklonowane jako fragment restrykcyjny XhoI-NotI o długości 10 015 wektora pBRXN (11) otrzymując pBRDI1(Fig. 13A).

Następnie plazmid pBRDI1użyto dla przygotowania pBRDl2, w którym FIPV S gen zastąpiono przez gen chimerowego kolca (mS) skomponowany z części kodującej ektodomenę białka kolca MHV i część kodującą transbłonową i ektodomenę białka kolca FIPV. Dla wprowadzenia hybrydowego genu do pBRDI1 najpierw 3' koniec kociego genu pol 1B połączono z 5' końcem mysiego genu kolca (patrz Fig. 14D dla sekwencji w łącznikach). To białko fuzyjne sklonowano w pTMFS (12) jako fragment Sacl-Stul otrzymując pTMFS1 (Fig. 13B). Hybrydowy gen wyizolowano pTMFS1 jako fragment Sacl-Alfll i użyto dla zastąpienia genu kolca FIPV z pBRDI1 otrzymując pBRDl2 (Fig. 13B). Sekwencje pBRDI1 i pBRDl2 przedstawiono odpowiednio w załączniku 1 i 2.

11.1. b. Wytworzenie mFIPV przez rekombinowanie RNA.

Cel: Wytworzenie mFIPV, pochodnej FIPV adresowanej do komórek myszy.

PL 207 933 B1

Procedura i wyniki: Posiadające czapeczkę RNA dla transkrypcji ciągłej zsyntetyzowano ze zlinearyzowanego Notl pBRDI2 przy pomocy zestawu polimerazy RNA T7 (Ambion) zgodnie z zaleceniami producenta. Transkrypty wprowadzono do kocich komórek FCWF (80 cm² kolba hodowlana), które wcześniej zarażono FIPV 79-1146 (m.o.i. 1) przez elektroporację (aparat dla elektroporacji Gene pulser, Biorad, dwa kolejne pulsy; 0,3 kV/960 mikroF). Komórki po elektroporacji hodowano w 25 cm² kolbach z mysimi komórkami LR7 (50% konfluencji) pozwalając na rekombinowanie syntetycznego i genomowego RNA (Fig. 15). Po 24 godz. inkubacji w 37°C można było zaobserwować ogromne syncytia zarówno mysich komórek LR7 i komórek kocich FCWF. Kandydatów na rekombinantów mFIPV wyselekcjonowano pobierając nadsącz i pasażując wirus przez trzy kolejne, końcowe rozcieńczenia komórek LR7. Otrzymany wirus był niezdolny do zrażenia i powodował cytopatyczny efekt komórek FCWF.

Wniosek: Otrzymano wirus z zamierzonym tropizmem do komórki mysiej.

11.1. c. Analiza białka mFIPV.

Cel: Potwierdzenie identyczności mFIPV na poziomie syntezy białka wirusowego.

Procedura i wyniki: Mysie komórki LR7 zarażono mFIPV i białka wyznakowano ³⁵S-wyznakowanymi aminokwasami przez 2 godz. poczynając od piątej godz. po zarażeniu. Jako kontrolę zarażono komórki LR7 i FCWF odpowiednio MHV i FIPV i wyznakowano je podobnie 5, 6 godz. po zarażeniu. Po wyznakowaniu przygotowano lizaty komórkowe i przeprowadzono immunoprecypitację w obecności detergentu, jak to opisano (12). Użyto następujących przeciwciał (dla literatury patrz 12): G73 (aFIPV), płyn wysiękowy otrzymano od kota zarażonego FIPV (dostarczony przez H. Venneman); K134 (aMHV), surowica królicza rozwinięta przeciw oczyszczonemu MHVA59; WA3.10 (aS_m) i Mab przeciw epitopowi obecnemu w ektodomenie MHV-A59 S; 23F4.5 (aS_m), Mab przeciw epitopowi FIPV S ektodomeny. Immunoprecypitowane białka zawieszono w buforze dla próbek do elektroforezy i ogrzano przez 2 min. w 95°C, z wyjątkiem jednej próbki białka (ścieżka 4 na Fig. 16), którą trzymano w temperaturze pokojowej dla zapobieżenia agregowaniu białka MHV M. Białka zbadano przez elektroforezę w 12,5% SDS-żelu poliakryloamidowym. Wzory elektroforezy pokazano na Fig. 16. Jak oczekiwano, przeciwciała anty-FIPV precypitowały białka FIPV S, M i N z lizatu komórek zarażonych FIPV (ścieżka 10), lecz nie białka MHV z lizatu komórek zrażonych MHV (ścieżka 1). 23F4.5 Mab precypitowało kocie S z FIPV (ścieżka 11), lecz nie mysie S z MHV (ścieżka 2), jak oczekiwano. Również surowica przeciw MHV wytrącała białka MHV S, N i M (ścieżka 3 i 4), lecz nie białka FIPV (ścieżka 12) i Mab WA3.10 wytrącało białko MHV S (ścieżka 5), lecz nie białko FIPV S (ścieżka 13). Patrząc na białka wytrącone z lizatów komórek zarażonych mFIPV jest jasnym, że surowica G73 przeciw FIPV wytrąca białka M i N, lecz nie białko S (ścieżka 6). Białko S również nie było wytrącane przez 23F4.5 Mab (ścieżka 7). Jednakowoż, białko mFIPV S było precypitowane przez surowicę anty MHV (ścieżka 8) jak również Mab WA3.10 (ścieżka 9).

Wniosek: Komórki zarażone przez mFIPV wyrażały wydedukowane białka wirusowe, w szczególności hybrydowe białko S z domeną pochodzącą z MHV.

11.1. d. Charakterystyka wzrostu mFIPV.

Cel: Porównanie mian otrzymanych dla mFIPV z tymi dla FIPV i MHV-A59.

Procedura i wyniki: Doświadczenia z zarażeniem i miareczkowaniem ujawniły, że zrekombinowany wirus mFIPV nie był dalej zdolny do zarażenia kocich komórek FCWF, lecz rósł skutecznie na mysich komórkach LR7 ujawniając podobne cechy wzrostu jak MHV-A59. Pokazano to, przykładowo przez porównanie jego jednoetapowych krzywych wzrostu w tych komórkach co przedstawiono na Fig. 17. W doświadczeniu tym komórki zarażono mFIPV i MHV-A59 (m.o.i. 5 dla każdej), po czym pobrano próbki płynu z hodowli w różnych momentach i zmiareczkowano komórki LR7 stosując szereg rozcieńczeń. Również mFIPV wywoływał znaczne efekty na tworzenie syncytiów i cytopatyczne po zarażeniu tych komórek. Roztwory wyjściowe zrekombinowanych mFIPV hodowanych na komórkach LR7 osiągały miana tego samego rzędu co FIPV na komórkach FCWF (5, 10⁷ PFU/ml). Były one jednak niższe niż zaobserwowane dla komórek MHV-A59 na komórkach LR7.

Wniosek: Zastąpienie ektodomeny białka kolca osiągnięte w rekombinancie mFIPV, który replikował się dobrze w komórkach swojego „nowego gospodarza nie spowodowało widocznej utraty dostosowania biologicznego.

PL 207 933 B1

11.2. Wytworzenie żywej attenuowanej szczepionki FIPV przez delecję genu.

Cel ogólny: Delecja sekwencji genu z genomu FIPV, które nie są istotne dla replikacji wirusa in vitro dla otrzymania wirusów z delecją, które są attenuowane w kotach i co za tym idzie kandydatów na wirusową (wektor) szczepionkę.

11.2. a. Konstrukcja syntetycznych wektorów dla transkrypcji RNA.

Cel: Konstrukcja plazmidów dla syntezy donorowych transkryptów RNA pozbawionych genów ABC i/lub 7AB dla ukierunkowanej rekombinacji z RNA mFIPV (Fig. 18, część górna).

Procedura i wyniki: Delecję genów 3ABC i 7AB wprowadzono do plazmidu pBRDI1 stosując SOE-PCR. Dla użytych starterów patrz Tabela 2 i Fig. 18, lewa strona.

Dla usunięcia rejonu 3ABC użyto kombinacji starterów 1 i 4 i, 2 i 3 dla wytworzenia fragmentów 375 bp (A) i 1012 bp (B), odpowiednio (Fig. 18, lewa strona). Fragmenty A i B połączono stosując zakładkę pomiędzy obydwoma fragmentami za pośrednictwem starterów 3 i 4 i powielono przy pomocy starterów 1 i 2 otrzymując fragment 1366 bp (C). Fragment C strawiono Aflll i SnaBI i sklonowano strawionym Aflll i SnaBI pBRDI1 otrzymując pBRDI1.-\3ABC (Fig. 18).

Dla usunięcia genów 7AB użyto kombinacji starterów 5 i 8 i starterów 6 i 7 dla wytworzenia fragmentów 1215 bp (D) i 324 bp (E), odpowiednio (Fig. 18). Fragmenty D i E połączono przy pomocy zakładki pomiędzy obydwoma fragmentami przez startery 7 i 8 i powielono stosując startery 5 i 6, otrzymując fragment 1524 bp (F). Fragment F strawiono Nlul i Notl i sklonowano w Nlul i Notl strawionym pBRDI1 otrzymując pBRDI1.-\7AB (Fig. 18). Poprawność sekwencji fragmentów C i F potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Dla konstrukcji pBRDI1.-\3ABC + Δ7AB, fragment Nlul/Notl pBRDI-1A7AB o długości 1527 bp wprowadzono do strawionego NluI/Notl pBRDI1.-\3ABC (Fig. 18).

Wniosek: Otrzymano pBRDI1 pochodne konstrukty donorowe RNA pozbawione bloku genów 3ABC i/lub 7AB.

11.2. b. Wytworzenie zrekombinowanego FIPV pozbawionego genów.

Cel: Wytworzenie zrekombinowanego FIPV, który utracił sekwencje dla genów 3ABC, genów 7AB i oba bloki genów.

Procedura i wyniki: Posiadające czapeczkę transkrypty ciągłe zsyntetyzowano ze zlinearyzowanych Notl pBRDI1, pBRDI1.-\3ABC, pBRDlA7AB i pBRDI1Δ3ABC+Δ7AB odpowiednio, stosując zestaw polimerazy RNA z bakteriofaga T7 (Ambion) jak to określił producent. Donorowe transkrypty wprowadzono do mysich komórek LR7 (kolba 80 cm²), które zarażono wcześniej mFIPV (m.o.i. 0,4) przez elektroporację (aparat do elektroporacji Gene pulser, Biorad, dwa kolejne pulsy; 0,85 kV/50 mikroF). Komórki po elektroporacji hodowano w kolbach hodowlanych 25 cm² z kocimi komórkami PCWF (50% konfluencji). Po 24 godz. inkubacji w 37°C można było wykryć duże syncytia zarówno mysich komórek LR7 i kocich komórek FCWF. Kandydujące delecyjne wirusy uwolnione do nadsączu z mieszanej hodowli komórkowej oczyszczono przez dwie rundy oczyszczania przez łysinki na komórkach FCWF.

Wniosek: Wirusy, które nabyły zdolności do wzrostu na kocich komórkach FCWF otrzymano w doświadczeniu z rekombinowaniem z mFIPV.

11.2. c. Analiza genetyczna pozbawionych genów rekombinantów FIPV.

Cel: Potwierdzenie postaci genetycznej potencjalnych wirusów z delecją.

Procedura i wyniki: Dla oceny czy otrzymano zamierzone delecję w wirusach FIPV, przeprowadzono RT-PCR na genomowym RNA wirusa koncentrując się na obszarze 3ABC i 7AB. Użyte startery i oczekiwane wielkości DNA podano w Tabeli 2 i na Fig. 18 (prawa strona). Wyniki analizy RT-PCR przedstawiono na Fig. 19. Fig. 19A ujawnia, że rekombinanty wirusa typu dzikiego (r-wtFIPV) i FIPVΔ7AB każdy przenosi obszar 3ABC, podczas gdy rejonu tego brak w wirusach FIPVΔ3ABC i FIPVΔ3ABC+Δ7AB, co oceniono po wielkości powielonych fragmentów. Fig. 19B pokazuje, że r-wtFIPV i FIPVΔ3ABC nadal przenoszą rejon 7AB, podczas gdy wirusy FIPVΔ7AB i FIPVΔ3ABC+Δ7AB nie zawierają tego rejonu. Fragmenty 397 bp i 646 bp wskazujące odpowiednio na delecję 3ABC i 7AB zostały sklonowane i ustalono ich sekwencję co potwierdziło oczekiwane sekwencje DNA.

Wniosek: Wirusy z delecją miały dokładnie zamierzone delecję genomu.

11.2. d. Charakterystyki wzrostowe genów pozbawionych FIPV.

Cel: Sprawdzenie tropizmu wirusów z delecją i ocena ich wzrostu in vitro.

Wyniki: wszystkie cztery zrekombinowane wirusy wyszczepiono na mysie komórki LR7, lecz nie spowodowały one jakichkolwiek efektów cytopatycznych. Jednakowoż, rosły one skutecznie, jak oczekiwano, na kocich komórkach FCWF. Wirusy r-wtFIPV, FIPVΔ3ABC i FIPVΔ7AB osiągnęły miana, które były podobne do uzyskiwanych przez wyjściowy szczep FIPV 79-1146 na tych komórkach.

PL 207 933 B1

Wszystkie miana były w zakresie 5x10⁷ PFU/ml (Fig. 40). Jednakowoż, podwójny mutant FIPVΔ3ABC+Δ7AB rósł mniej wydajnie; miana uzyskane dla tego wirusa były ogólnie 1 do 2 jednostek log niższe (Fig. 40).

Wniosek: Sekwencje zawierające bloków genów 7ABC i 7AB nie jest istotne dla żywotności FIPV. Najwyraźniej, ani sekwencje nukleotydowe, ani kodowane przez geny białka nie są istotne dla replikacji wirusa.

11.2. e. Wirulentność zrekombinowanych wirusów u kotów.

Cel: Ustalenie czy delecję genetyczne wpływają na wirulentność.

Procedura i wyniki: Zrekombinowane wirusy z delecją scharakteryzowano w ich naturalnym gospodarzu, kocie. Dla tego celu koty 24 SPF (w wieku 5 miesięcy) podzielono na 5 grup i zarażono donosowo, doustnie (100 PFU) FIPV szczepu 79-1146 (n=4), r-wtFIPV (n=5), FIPVΔ3ABC (n=5), FIPVΔ7AB (n=5) i FIPVΔ3ABC+A7ΔB (n=5), odpowiednio, i powtórzono po (przynajmniej) 3 miesiącach. Kliniczne objawy choroby oceniono jak pokazano w Tabeli 5. Zarażenie kotów wariantami delecyjnymi nie wywołało klinicznych objawów choroby. Raczej wszystkie koty pozostały w pełni zdrowe przez czas trwania doświadczenia (Tabela 6 i Fig. 35). Przeciwnie, zarażenie kontrolą typu dzikiego FIPV 79-1146 i r-wtFIPV powodowało gwałtowne kliniczne objawy choroby charakteryzujące się depresją, anoreksją, żółtaczką, utratą wagi i leukopenią (Tabela 6). Trzy z czterech i pięć spośród pięciu kotów zaszczepionych odpowiednio FIPV 79-1146 i r-wtFIPV musiało zostać uśpionych z uwagi na zaawansowane objawy FIP pomiędzy 14 i 42 dnia po zarażeniu (Fig. 45).

Wnioski: 1) FIPV 79-1146 i odpowiadający mu rekombinant typu dzikiego r-wtFIPV są w równym stopniu wirulentne i 2) wirusy z delecjami sekwencji określają geny 3ABC lub 7AB lub kombinacje pewnych, lub wszystkich tych genów ujawniając znacząco attenuowane fenotypy u kotów.

11.2. f. Odpowiedź immunologiczna wywołana przez zrekombinowane wirusy.

Cel: Określenie aktywności zobojętniającej FIPV w surowicy kota.

Procedura i wyniki: FIPV specyficzne odpowiedzi przeciwciałem kotów zrażonych wirusami z delecją zostały scharakteryzowane. Dla tego celu próbki krwi pobrano w dniach 0, 21 i 90 po zarażeniu i przygotowano inaktywowaną termicznie surowicę i inkubowano z FIPV 79-1146 (10 tys. PFU), po czym aktywność neutralizującą FIPV określono przy pomocy komórek FCWF w 96-studzienkowym oznaczeniu na mikropłytce. Miana wyrażono jako odwrotność największego rozcieńczenia, które już nie hamowało cytopatycznych efektów wirusa. Jak oczekiwano w dniu 0 żadna z kocich surowic nie ujawniała znaczącej aktywności neutralizującej FIPV. W dniu 21, wszystkie koty były pozytywne serologicznie i ujawniały wysokie miana neutralizujących przeciwciał. Miana zaobserwowane u kotów zaszczepionych FIPV 79-1146, r-wtFIPV, FIPVΔ3ABC i FIPVΔ7AB były porównywalne, podczas gdy miana zaobserwowane u kotów zarażonych FIPVΔ3ABC+Δ7AB były około 50 razy niższe (Fig. 36). Ogólnie, miana pozostały wysokie przez przynajmniej 90 dni (koniec doświadczenia).

Wnioski: Pomimo braku klinicznych objawów choroby, wysokie miana zobojętniających przeciwciał są obserwowane u kotów, które były zaszczepione wariantami FIPV z delecją. Sugeruje to silnie, że wirusy z delecją są żywotne i replikują się w kotach prowadząc do silnej odpowiedzi immunologicznej w postaci odpowiedzi przeciwciałem.

11.2. g. Wirusy FIPV z delecją służą jako attenuowane żywe szczepionki.

Cel: Badanie czy wstępne zaszczepienie attenuowanymi wariantami delecyjnymi chroni koty przed zarażeniem FIPV 79-1146.

Procedura i wyniki: Koty wcześniej zaszczepione attenuowanymi delecyjnymi wariantami były zarażone donosowo i doustnie FIPV 79-1146 (100 PFU) w dniu 90. Jako grupy kontrolnej użyto czterech nie traktowanych kotów w podobnym wieku zarażone w identyczny sposób. Grupa kontrolna ujawnia gwałtowne objawy kliniczne charakteryzujące się depresją, anoreksją, żółtaczką, utratą wagi i leukopemią (dzień 7). Podobnie, gwałtowny zespół objawów obserwowano u trzech z 5 kotów wcześniej zarażonych FIPVΔ3ABC+Δ7AB, podczas gdy wszystkie koty zarażone wcześniej FIPVΔ3ABC lub FIPVΔ7AB pozostały ogólnie zdrowe, bez typowych objawów FIP w czasie eksperymentu (Tabela 7), choć dwa z pięciu kotów, które wcześniej zaszczepiono FIPVΔ3ABC ujawniło czasową utratę wagi.

Z uwagi na zaawansowane objawy FIP jeden kot z grupy kontrolnej został uśpiony w dniu 32, podczas gdy inne koty w grupie kontrolnej wyzdrowiały. Śmiertelność oceniona na 25% jest niższa niż zaobserwowana we wcześniejszych doświadczeniach. Jest to przypuszczalnie związane z zaawansowanym wiekiem kotów, o czy wiadomo, że powoduje zmniejszenie wrażliwości na FIPV. Trzy koty zaszczepione FIPVΔ3ABC+Δ7AB z początkowymi objawami pozostały chore i zostały uśpione pomię30

PL 207 933 B1 dzy dniami 11 i 56 (Fig. 37). Najwyraźniej, połączona delecja bloku dwóch genów 3ABC i 7AB, która jak stwierdzono zmniejsza dostosowanie FIPVΔ3ABC+Δ7AB co oceniono przez ich zmniejszony wzrost in vitro - wpływa również na replikację wirusa w kotach, co oceniono przez niższy poziom zaindukowanych zobojętniających przeciwciał. Tak więc wirus jest nadattenuowany i jedynie zdolny do szczególnej ochrony przed zarażeniem FIPV. Pełna ochrona będzie wymagała wyższej lub powtórzonej dawki.

Wniosek: Wstępne szczepienie FIPVΔ3ABC lub FIPVΔ7AB chroni koty przed chorobą spowodowaną zarażeniem FIPV.

11.3. Wbudowanie i ekspresja obcych genów.

Cel: Ustalenie czy obce geny mogą być wbudowane w różnych miejscach do genomu wirusa, zarówno jako dodatkowe geny lub zastępując usunięte nieistotne geny; i ustalenie czy geny te są wyrażone i czy są one stabilnie utrzymywane w czasie pasażowania in vitro wirusa.

11.3. a. Konstrukcja zrekombinowanych wirusów niosących geny reporterowe.

Cel: Wytworzenie wirusów FIPV 79-1146 ze wstawionym obcym genem.

Procedura: Skonstruowany został wirus zawierający obcy gen reporterowy w swoim genomie w miejscu genów 3ABC. Gen reporterowy lucyferazy renilla (RL) został umieszczony pod kontrolą transkrypcyjną IGS kontrolującego gen 3a. Dla usunięcia bloku 3abc i wprowadzenia genu RL do plazmidu pBRDI1 użyto kombinacji starterów 1244 (5'-GCCATTCTCATTGATAAC-3') i 1514 (5'-CTGAGTCTAGAGTAGCTAGCTAATGACTAATAAGTTTAG-3') i 1245 (5'-GCTTCTGTTGAGTAATCACC-3') i 1513 (5'-GCTAGCTACTCTAGACTCAGGCGGTTCTAAAC-3') dla wytworzenia odpowiednio fragmentów 336 bp (A) i 1068 bp (B) przez PCR. W starterze 1513 i 1514 podkreślono i podano jako pogrubione odpowiednio miejsca restrykcyjne Nhel i Xbal. Fragmenty A i B połączono przy pomocy zakładek pomiędzy obydwoma fragmentami przy pomocy starterów 1514 i 1513 i powielono przy pomocy starterów 1244 i 1245, stosując SOE-PCR dający fragment 1384 bp (C). Fragment C sklonowane w wektorze pGEM-T Easy (Promega) otrzymując pGEM-C. Gen RL pochodzący z pRL-null (Promega) został wprowadzony jako fragment Nhel/Xbal do strawionego Nhel i Xbal pGEM-C dając pGEM-C+luc. Fragment C+luc został wprowadzony jako fragment Aflll/SnaBI do pBRDI1 strawionego Aflll i SnaBI dając pBRDI1 A3ABC+luc.

Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak to opisano powyżej. Otrzymane wirusy potwierdzono genetycznie przez analizę RT-PCR.

Wniosek: Obcy gen reporterowy lucyferazy renilla może być umieszczony w genomie koronawirusa FIPV typu I. Zamierzone, zrekombinowane wirusy są żywotne.

11.3. d. Jednoetapowy wzrost wirusów.

Cel: Porównanie charakterystyki wzrostu wirusów z wirusem typu dzikiego.

Procedura i wyniki: Po dwóch rundach oczyszczania przez łysinki przygotowano roztwory wyjściowe 2 niezależnie otrzymanych w II.3.2 rekombinantów, które zmiareczkowano i użyto dla zarażenia przy wysokim m.o.i. (m.o.i. 8) komórek FCWF, po czym śledzono infektywność wirusa w pożywce hodowlanej. Wyniki są przedstawione przez krzywą wzrostu pokazaną na Fig. 38. Oba niezależnie otrzymane rekombinanty rosły 1 do 2 jednostek log miana wolniej w porównaniu z rekombinowanym wirusem typu dzikiego.

Wniosek: Zrekombinowane wirusy z wbudowaną kasetką ekspresyjną rosły normalnie in vitro, lecz zaburzone było ich namnażanie.

11.3. c. Ekspresja lucyferazy renilla.

Cel: Określenie czy wbudowana kasetka funkcjonalna była funkcjonalna.

Procedura i wyniki: Konfluentne jednowarstwowe hodowle komórek FCWF zarażono przy m.o.i. 8 i wytwarzanie aktywności lucyferazy w komórkach śledzono w czasie. Ekspresję RL w komórkach zmierzono stosując Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta. RL zmierzono we względnych jednostkach jasności (RLU) stosując luminometr (Lumac Biocounter M2500 lub Turner Designs Model TD-20/20).

Wyniki są przedstawione graficznie na Fig. 39. W przeciwieństwie do rekombinanta wirusa typu dzikiego, dwa zrekombinowane geny lucyferazy zawarte w wirusach wyrażających aktywność lucyferazy na wysokim poziomie wykazując, że gen lucyferazy renilla jest funkcjonalny. Ekspresja rozpoczyna się tak wcześnie jak 2 godz. po zarażeniu. Wysoki poziom ekspresji został osiągnięty w 9 godz. po zarażeniu.

PL 207 933 B1

Wniosek: Obce geny mogą być wyrażone przez koronawirusy dzięki przestrzeni genetycznej stworzonej przez delecję nie mających kluczowego znaczenia genów.

11.4. Wytworzenie wielowalentnych szczepionek opartych na FIPV.

Cel: Opracowanie wielowalentnych szczepionek opartych na żywych attenuowanych szczepach FIPV jako wektorach.

Podejście: Wyselekcjonowano geny (lub fragmenty genów) z innych patogenów kocich i psich kodujących antygeny znane z indukcji ochronnej immunogenności przeciw tym patogenom. Kasetki ekspresyjne tych genów wprowadzono do genomu FIPV w połączeniu z attenuującymi delecjami genów nie będących kluczowymi. Kasetki ekspresyjne zawierające FIPV TRS przed genem, który będzie ulegał ekspresji.

11.4. a. Konstrukcja wielowalentnej szczepionki przeciw wirusowi białaczki kociej (FeLV) opartemu na wektorze FIPV.

Cel: Opracowanie szczepionki FeLV opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

Procedura: (fragmenty) geny gag i env związane z ochroną FeLV umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pBRDI1A3ABC i pBRDI1.-\7AB, odpowiednio. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami wektora i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy potwierdzono genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję genów gag i env FeLV potwierdzono przez badanie immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragment) genów gag i env związanych z ochroną FeLV może być wprowadzony i wyrażony przez żywy attenuowany szczep FIPV. Rekombinanty te mogą ponadto funkcjonować jako multiwalentna szczepionka przeciw wirusowi kociej białaczki i zarażeniu FIPV.

11.4. b. Konstrukcja wielowalentnej szczepionki na kociego wirusa niedoboru odporności (FIV) opartej na wektorze FIPV.

Cel: Opracowanie szczepionki FIV opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) geny gag i env związane z ochroną FIV umiejscowioną w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pBRDI1A3ABC i pBRDI1.-\7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję genów gag i env FIV potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów gag i env związane z ochroną FIV wprowadzono do i wyrażono przez żywy attenuowany szczep FIPV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka przeciw kociemu wirusowi niedoboru odporności i infekcji FIPV.

11.4. c. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki dla kociego kaliciwirusa (FCV) opartej na wektorze FIPV.

Cel: Opracowanie szczepionki FCV opartej na żywym attenuowanym szczepie FPV jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) genu kapsydu związane z ochroną FCV umiejscowiono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1A3ABC i pBRDI1.-\7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję genu kapsydu FCV potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genu kapsydu FCV związane z ochroną mogą być wprowadzone do i wyrażone przez żywe attenuowane szczepy FIPV. Takie zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, funkcjonować jako multiwalentna szczepionka przeciw kociemu kaliciwirusowi i zarażeniu FIPV.

11.4. d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki dla kociego wirusa panleukopenii (FPV) opartej na wektorze FIPV.

Cel: Opracowanie szczepionki FPV opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) gen R3 związany z ochroną, kodujący białka kapsydu VP1 i VP2 umiejscowiono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1.-\3ABC i pBRDI1A7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone

PL 207 933 B1 genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję (fragmentów) genu R3 potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genu R3 związane z ochroną mogą być wprowadzone do i wyrażone przez żywy attenuowany szczep FIPV. Takie zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, funkcjonować jako multiwalentna szczepionka przeciw kociemu wirusowi panleukopenii i zarażeniu FIPV.

11.4. e. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw kociemu wirusowi opryszczki (FHV) opartej na wektorze FIPV.

Cel: Opracowanie szczepionki dla FHV opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) genów kociego wirusa opryszczki gB, gC, gD, gE, gH, gI, gK, gL, gM, gM, ICP0, ICP1 i ICP4 związane z ochroną umiejscowiono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1A3ABC i pBRDI1.-\7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję wbudowanych genów FHP potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów kociego wirusa opryszczki gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, ICP0, ICP1 i ICP4 związane z ochroną mogą być wprowadzone do i wyrażone przez żywe attenuowane szczepy FIPV. Takie zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, funkcjonować jako multiwalentna szczepionka przeciw kociemu wirusowi opryszczki i zarażeniu FIPV.

11.4. f. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki dla FIPV serotypu I i II opartej na wektorze FIPV o serotypie II.

Cel: Opracowanie szczepionki chroniącej zarówno przeciw serotypowi I i serotypowi II kocich koronawirusów opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV o serotypie II jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) genu kolca związane z ochroną przeciw kociemu koronawirusowi o serotypie I, z którego usunięto obszar kodujący sekwencję sygnałową umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1A3ABC i pBRDI1.-\7AB. Przykładowo, w jednym przypadku był użyty taki konstrukt genu kolca, z którego usunięto region kodujący sekwencję sygnałową; w innym przypadku użyto skróconego genu kolca, z którego usunięto obszar kodujący transbłonową domenę plus endodomenę. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję wbudowanego konstruktu genu kolca o serotypie I potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genu kolca związany z ochroną przeciw kociemu koronawirusowi serotypu I może być wprowadzony i wyrażony przez żywy attenuowany szczep FIPV o serotypie II, i co za tym idzie, funkcjonować jako multiwalentna szczepionka przeciw obu serotypom I i II kocich koronawirusów.

II. 5. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

Cel: Opracowanie szczepionki FIPV, w której usunięcie genów nie będących kluczowymi jest połączone ze zmianą kolejności genu przez przesunięcie genu N przed gen S w genomie FIPV.

Procedura i wyniki: Posiadające czapeczkę ciągłe transkrypty donorowe zsyntetyzowano ze zlinearyzowanego Notl wektorów pBRDI1A3ABC, pBRDIMAB i pBRDI1Δ3Abc+Δ7AB, w których gen N, wraz z TRS wbudowano w miejscu powyżej S. Donorowe transkrypty wprowadzono do mysich komórek LR7 (kolby 80 cm²) i zarażono je wcześniej mFIPV (m.o.i. 0,4) przez elektroporację (aparat do elektroporacji Gene Pulser, Biorad, dwa kolejne pulsy; 0,85 kV/50 mikroF). Komórki dla elektroporacji współhodowano w kolbach hodowlanych 25 cm² z kocimi komórkami FCWF (50% konfluencji). Po 24 godz. inkubacji w 37°C można było wykryć ogromne syncytia w hodowlach komórkowych. Mutanty wirusa z delecją z przebudowanymi genomami uwolnione do nadsączu mieszanej hodowli komórek oczyszczono przez dwie rundy oczyszczania przez łysinki na komórkach FCWF.

Wniosek: Może być wytworzony delecyjny mutant FIPV o zmienionej kolejności genu. Wirusy te mogą funkcjonować jako żywe attenuowane szczepionki FIPV. Z uwagi na zaletę związaną ze zmianą kolejności ich genów wirusy te stanowią bezpieczniejsze szczepionki z uwagi na ich ograniczoną zdolność do wytworzenia żywotnego potomstwa przez rekombinowanie z wirusami krążącymi w środowisku.

PL 207 933 B1

II. 6. Wytworzenie szczepionek opartych na FIPV przeciw psim patogenom.

Cel ogólny: Opracowanie szczepionek opartych na żywych attenuowanych szczepach FIPV serotypu II jako wektorze przeciw psim patogenom.

Podejście: Ponieważ kocie koronawirusy typu II wyrażają białka kolca typu psiego koronawirusa (2a), takie wektory kociego koronawirusa mogą być użyte jako szczepionki u psów. Co za tym idzie, żywa attenuowana szczepionka FIPV, którą opracowano może być również użyta dla szczepienia psów przeciw psiemu koronawirusowi (CCV). Ponadto, multiwalentne szczepionki mogą być wytworzone przez wprowadzenie kasetek ekspresyjnych genów związanych z ochroną przed innymi psimi patogenami do genomu FIPV w połączeniu z attenuującymi delecjami genów nie będących kluczowymi i przebudową genomu. Kasetki ekspresyjne zawierają FIPV TRS przed (fragmentami) genów, które będą wyrażone.

11.6. a. Wytworzenie opartej na FIPV szczepionki przeciw psiej nosówce.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw psiej nosówce opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) genów H i F związanych z ochroną umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1A3ABC i pBRDI1.-\7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję (fragmentów) genów H i F potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów H i F związanych z ochroną przeciw wirusowi psiej nosówki mogą być wprowadzone i wyrażone przez żywy attenuowany szczep FIPV. Te, zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, służyć jako szczepionka przeciw wirusowi psiej nosówki i zarażeniu CCV.

11.6. b. Wytworzenie opartej na FIPV szczepionki przeciw psiej chorobie wywołanej parwowirusem.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw psiemu parwowirusowi opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) genu R3 związanego z ochroną, kodującego białka kapsydu VP1 i VP2 umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1.-\3ABC i pBRDI1.-\7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję (fragmentów) genu R3 potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) gen R3 związany z ochroną przeciw psiemu parwowirusowi może być wprowadzony do i wyrażonemu przez żywy attenuowany szczep FIPV. Te, zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, służyć jako szczepionka przeciw psiej chorobie wywołanej parwowirusem i zarażeniu CCV.

11.6. c. Wytworzenie opartej na FIPV szczepionki przeciw zakaźnej psiej żółtaczce.

Cel: Opracowanie szczepionki psiemu adenowirusowi i opartej na żywym, attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

Procedura: (Fragmenty) genów białek struktury psiego adenowirusa I związane z ochroną umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1.-\3ABC i pBRDI1.-\7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję (fragmentów) genów białek struktury psiego adenowirusa I potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów białek struktury psiego adenowirusa I związanych z ochroną mogą być wprowadzone i wyrażone przez żywy attenuowany szczep FIPV. Te, zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, służyć jako szczepionka przeciw zakaźnej psiej żółtaczce i zarażeniu CCV.

11.6. d. Wytworzenie opartej na FIPV szczepionki przeciw krwotocznej chorobie szczeniąt.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw psiemu herpes wirusowi 1 opartej na żywym attenuowanym szczepie FIPV jako wektorze.

PL 207 933 B1

Procedura: (Fragmenty) genów psiego wirusa herpes gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, gM, ICP0, ICP1 i ICP4 związanych z ochroną umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono odpowiednio do pBRDI1A3ABC i pBRDI1.-\7AB. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencji, zrekombinowane wirusy wytworzono przez rekombinowanie RNA-RNA pomiędzy ciągłymi transkryptami z wektora transkrypcyjnego i genomem mFIPV jak opisano powyżej. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresję wbudowanych genów potwierdzono przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów psiego herpes wirusa gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL, gM, ICP0, ICP1 i ICP4 związanych z ochroną mogą być wprowadzone i wyrażone przez żywy attenuowany szczep FIPV. Te, zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, służyć jako szczepionka przeciw psiemu herpes wirusowi 1 i CCV.

III. Przenoszone wirusy żołądkowo-jelitowe (TGEV).

111.1. Wytworzenie żywej attenuowanej szczepionki przeciw TGEV.

Cel: Opracowanie żywej attenuowanej szczepionki przeciw TGEV.

Podejście: Dla tego celu wytworzono zrekombinowane wirusy TGEV z mutacją delecyjną, które utraciły geny 3ab i/lub 7, które nie są dla nich kluczowe.

Procedura: Zrekombinowane wirusy wytworzono jak to opisali Almazan i wsp. (2000). Z pBAC-TGEV^FL infekcyjny klon cDNA TGEV umieszczono za promotorem CMV w pBeloBAC11, geny 3ab i 7 usunięto typowymi technikami klonowania pozostawiając otaczające je ramki odczytu i sekwencje regulujące transkrypcje niezmienionymi. Komórki nabłonkowe jąder świni (ST) stransfekowano pochodną pBAC-TGEV^FL, która utraciła geny 3ab i 7 (pBAC-TGEV^FL). Zrekombinowane wirusy TGEV oczyszczono przez łysinki i scharakteryzowano przez RT-PCR z uwagi na brak genów 3ab i/lub 7. Duże ilości zrekombinowanych wirusów TGEV z delecją wytworzono przez zarażenie komórek ST.

Wniosek: Wytworzono zrekombinowane TGEV pozbawione genów 3ab i 7. Wirusy te mogą działać jako żywe attenuowane szczepionki przeciw TGEV.

III. 2. Wytworzenie multiwalentnych szczepionek opartych na TGEV.

Cel: Opracowanie multiwalentnych szczepionek opartych na żywym, attenuowanym TGEV jako wektorze.

Podejście: Kasetkę ekspresyjną z genami związanymi z ochroną przeciw świńskim patogenom wprowadzono do genomu TGEV wraz z attenuującymi delecjami nie będących kluczowymi genów i przebudową genomu. Kasetki ekspresyjne zawierają TGEV TRS przed (fragmentem) genu, który ma ulec ekspresji.

III. 2.a. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw świńskiemu parwowirusowi (PPV) opartej na wektorze TGEV.

Cel: Opracowanie szczepionki opartej na żywym attenuowanym szczepie TGEV jako wektorze.

Procedura: (Fragment) genu R3 związanego z ochroną, kodującego białka otoczki VP1 i VP2 umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pBAC-TGEV^FL pozbawionej genów 3ab i 7. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjna i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono przez transfekcje komórek ST pochodną pBAC-TGEV^FL zawierającą (fragment) genu R3 związanego z ochroną. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja wbudowanego genu R3 była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragment) genu R3 związanego z ochroną może być wprowadzony do i wyrażony przez żywy attenuowany szczep TGEV. Te zrekombinowane wirusy mogą co za tym idzie działać jako multiwalentna szczepionka przeciw świńskiemu parwowirusowi i zakażeniu TGEV.

111.2. b. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw świńskiemu wirusowi grypy opartej na wektorze TGEV.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko świńskiemu wirusowi grypy opartej na żywym attenuowanym szczepie TGEV jako wektorze.

Procedura: (Fragment) genów hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) związanych z ochroną, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pBAC-TGEV^FL pozbawionej genów 3ab i 7. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono przez transfekcje komórek ST pochodną pBAC-TGEV^FL z delecją, która zawierała (fragment) genów hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) związanych z ochroną. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja wbuPL 207 933 B1 dowanych genów hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragment) genów hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) związanych z ochroną można wprowadzić do i wyrazić w żywym attenuowanym szczepie TGEV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka przeciw świńskiemu wirusowi grypy i zakażeniu TGEV.

111.2. C. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw afrykańskiej gorączce świń, opartej na wektorze TGEV.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw afrykańskiej gorączce świń opartej na żywym attenuowanym szczepie TGEV jako wektorze.

Procedura: (Fragment) genów kodujących białko struktury związanych z ochroną, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pBAC-TGEV^FL pozbawionej genów 3ab i 7. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono przez transfekcję komórek ST pochodną pBAC-TGEV^FL zawierającą delecję zawierającą (fragment) genów kodujących białko struktury związane z ochroną. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja genów kodujących białko struktury była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragment) genów kodujących białko struktury związanych z ochroną może być wprowadzony do i wyrażony przez żywy attenuowany szczep TGEV. Te zrekombinowane wirusy mogą co za tym idzie działać jako multiwalentna szczepionka przeciw wirusowi afrykańskiej gorączki świń i zakażeniu TGEV.

111.2. d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw świńskiemu cirkowirusowi typu 2 opartej na wektorze TGEV.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw świńskiemu cirkowirusowi typu 2 opartej na żywym attenuowanym szczepie TGEV jako wektorze.

Procedura: (Fragment) genów C1, C2, V1 i V2 świńskiego cirkowirusa typu 2 związanego z ochroną, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pBAC-TGEV^FL pozbawionej genów 3ab i 7. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono przez transfekcję komórek ST pochodną pBAC-TGEV^FL z delecją zawierającą (fragment) genów C1, C2, V1 i V2 świńskiego wirusa typu 2 związanych z ochroną. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja genów C1, C2, V1 i V2 świńskiego cirkowirusa typu 2 była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragment) genów C1, C2, V1 i V2 świńskiego cirkowirusa typu 2 związanych z ochroną może być wprowadzony do i wyrażony przez żywy attenuowany szczep TGEV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka przeciw świńskiemu cirkowirusowi typu 2 i zakażeniu TGEV.

111.2. e. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw wirusowemu i zespołowi oddechowemu i rozrodczemu świni opartej na wektorze TGEV.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko wirusowi świńskiego zespołu oddechowego i rozrodczego opartej na żywym, attenuowanym szczepie TGEV jako wektorze.

Procedura: (Fragment) ORF2 do ORF7 wirusa świńskiego zespołu oddechowego i rozrodczego związanych z ochroną, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pBAC-TGEV^FL pozbawionej genów 3ab i 7. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono przez transfekcję komórek ST pochodną pBAC-TGEV^FL z delecją zawierającą (fragment) ORF2 do ORF7 z wirusa świńskiego zespołu oddechowego i rozrodczego związanego z ochroną. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja ORF2 do ORF7 wirusa świńskiego zespołu oddechowego i rozrodczego była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragment) ORF2 do ORF7 wirusa świńskiego zespołu oddechowego i rozrodczego związanego z ochroną może być wprowadzony do i wyrażony przez żywy attenuowany szczep TGEV. Te zrekombinowane wirusy mogą co za tym idzie działać jako multiwalentna szczepionka przeciw wirusowi świńskiego zespołu oddechowego i rozrodczego i zakażeniu TGEV.

III.2.e. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki przeciw wirusowi choroby stóp i ust opartej na wektorze TGEV.

PL 207 933 B1

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw wirusowi choroby stóp i ust opartej na żywym attenuowanym szczepie TGEV jako wektorze.

Procedura: (Fragment) sekwencja kodująca VP1 do VP4 wirusa choroby stóp i ust związana z ochroną, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pBAC-TGEV^FL pozbawionej genów 3ab i 7. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono przez transfekcję komórek ST pochodną pBAC-TGEV^FL z delecją zawierającą (fragment) sekwencje kodujące VP1 do VP4 wirusa choroby stóp i ust związanej z ochroną. Otrzymane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja sekwencji kodujących VP1 do VP4 wirusa choroby ust i stóp była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragment) sekwencja kodująca VP1 do VP4 wirusa choroby stóp i ust związana z ochroną może być wprowadzona do i wyrażona przez żywy attenuowany szczep TGEV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka przeciw wirusowi choroby stóp i ust i zakażeniu TGEV.

III. 3. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

Cel: Opracowanie szczepionki TGEV, w której delecja genów nie będących kluczowymi jest połączona ze zmianą kolejności genów przez przesunięcie genu N przed gen S w genomie TGEV.

Procedura i wyniki: Zrekombinowane wirusy wytworzono jak to opisali Almazan i wsp. (2000). Z pBAC-TGEV^FL, zakaźny klon TGEV cDNA umieszczony pomiędzy promotorem CMV i pBeloBAC11, usunięto geny 3ab i 7 przy pomocy typowych technik klonowania, pozostawiając nienaruszone otaczające otwarte ramki i sekwencje regulujące transkrypcję. Ponadto, gen N sklonowano w miejscu genomu powyżej genu S. Komórki nabłonkowe jąder świni (ST) stransfekowano pochodną pBAC-TGEV^FL, która utraciła geny 3ab i 7 i ma przebudowany genom. Zrekombinowane wirusy TGEV oczyszczono przez łysinki i scharakteryzowano przez RT-PCR z uwagi na brak genów 3ab i/lub 7. Duże ilości rekombinantów TGEV z delecją wytworzono przez zarażenie komórek ST.

Wniosek: Zrekombinowane TGEV wytworzono tak, że utraciły geny 3ab i 7 i mają zmienioną kolejność genów. Wirusy te funkcjonują jako żywa, attenuowana szczepionka przeciw TGEV jak również przeciw innym patogenom świńskim, gdzie geny kodujące odpowiednie antygeny były odpowiednio wbudowane.

IV. Zakaźny wirus zapalenia oskrzeli ptaków (IBV).

lV.1. Wytworzenie żywej attenuowanej szczepionki przeciw IBV.

Cel: Opracowanie żywej attenuowanej szczepionki przeciw IBV.

Podejście: Wytworzono zrekombinowanego delecyjnego mutanta IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi 3a/b i/lub 5a/b. Celem uzyskania szczepionek wirusowych chroniących przed licznymi serotypami IBV, wbudowano otrzymane konstrukty genu kolca z takich, różnych wirusów.

Procedura: Zrekombinowane wirusy wytworzono jak to opisali Casais i wsp. (2001). Zakaźne klony IBV cDNA złożono w genomie szczepionki wirusowej przy pomocy kolejnych ligacji in vitro fragmentów cDNA pochodzących z pFRAG1, pFRAG2 i pFRAG3 pochodnych plazmidów, następnie sklonowane je bezpośrednio do genomu wirusowej szczepionki vNot/tk jak to opisano (1a). Geny 3a/b i 5a/b usunięto z pFRAG3 przez mutagenezę PCR pozostawiając otwarte ramki odczytu i sygnały regulatorowe transkrypcji nienaruszone, otrzymując pFRAG3Δ. Gen S w pFRAG3Δ może być zastąpiony przez geny S pochodzące z różnych serotypów IBV przy pomocy RT-PCR. Zrekombinowane szczepionki wirusowe wytworzono przez rekombinację pomiędzy wirusem ospy drobiu i vNotI/tk-IBV przez ligację in vitro mieszaniny. Zrekombinowane wirusy oczyszczono przez łysinki i scharakteryzowano przez analizę PCR i Southern-blot. Ostatecznie, wytworzono zakaźne IBV pozbawione genów 3a/b i/lub 5a/b jak następuje: komórki nerki kurczaka (CK) zarażono zrekombinowanym wirusem ospy drobiu wyrażającym polimerazę RNA z bakteriofaga T7. Następnie komórki stransfekowano DNA wyizolowanym ze zrekombinowanej szczepionki wirusowej zawierającej klon IBV cDNA pozbawiony genów 3a/b i 5a/b. W trzy dni po zarażeniu pożywkę hodowlaną zebrano i użyto do zarażenia komórek CK dla wytworzenia dużych ilości zrekombinowanego IBV. Zrekombinowane wirusy potwierdzono genetycznie przez analizę RT-PCR.

Wniosek: Zrekombinowane IBV wytworzono tak, że utracił geny 3a/b i/lub 5a/b. Wirus ten może działać jako żywa attenuowana szczepionka przeciw IBV. Przez zastąpienie genu S otrzymany może być zrekombinowany IBV funkcjonujący jako żywe attenuowane szczepionki przeciw różnym serotypom IBV.

PL 207 933 B1

IV.2.2 Wytworzenie multiwalentnych szczepionek opartych na IBV.

Cel: Opracowanie multiwalentnej szczepionki opartej na żywym attenuowanym szczepie IBV jako wektorze.

Podejście: Kasetki ekspresyjne genów związanych z ochroną przeciw patogenom kurczaka wprowadzono do genomu IBV w kombinacji z attenuującą delecją genów nie będących kluczowymi. Kasetki ekspresyjne zawierają IBV TRS (CTTAACAA) przed (fragmentami) genu, który będzie wyrażany.

IV.2.al. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przeciw więcej niż jednemu serotypowi IBV.

Cel: Opracowanie szczepionki IBV opartej na żywym attenuowanym szczepie IBV pozbawionym genów nie będących kluczowymi i chroniącej przed więcej niż jednym serotypem.

Procedura: (Fragmenty) genu S z IBV o różnych serotypach związane z ochroną przez IBV, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pFRAG3Δ. Największy konstrukt zawierał pełną dodatkową kopię genu S z wyjątkiem sekwencji kodującej peptyd sygnałowy; kolejny konstrukt posiadał gen S skrócony na końcu karboksylowym pozbawiony sekwencji kodującej domenę transbłonową i endodomenę. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Odpowiednia ekspresja homologicznych konstruktów genu S była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji z surowicą odpornościową specyficzną dla typu stosując radioaktywnie wyznakowany zrekombinowany wirus, który zaraził lizaty komórkowe.

Wniosek: (Fragmenty) genu S z IBV o różnych serotypach związane z ochroną przed IBV mogą być wprowadzone i wyrażone przez żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przeciw zarażeniu przez IBV o więcej niż jednym serotypie.

IV.2.aII. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą Newcastle.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko wirusowi choroby Newcastle (ptasi paramyxowirus typu I: APMV-1) opartej na żywym attenuowanym szczepie IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genów HN i F związanych z ochroną przed APMV-1, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pFRAG3Δ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów HN i F związane z ochroną przed APMV-1 mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed zarażeniami APMV-1 i IBV.

IV.2.b. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed ptasią grypą.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko wirusowi ptasiej grypy opartej na żywym, attenuowanym szczepie IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genów H i N związanych z ochroną przed ptasią grypą, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pochodnej pFRAG3Δ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów H i N związanych z ochroną przed ptasią grypą mogą być wprowadzone i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed zarażeniami ptasią grypą i IBV.

IV.2.c. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą wywołaną przez wirus anemii kurcząt (CAV).

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko CAV opartej na żywym attenuowanym szczepie IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genów V1, V2 i V3 związanych z ochroną przed CAV, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pFRAG3Δ. Po potwierdzeniu wszystkich kon38

PL 207 933 B1 struktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów V1, V2 i V3 związanych z ochroną przed CAV mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed zarażeniami CAV i IBV.

IV.2.d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą wywołaną przez ptasi reowirus.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko ptasiemu reowirusowi opartej na żywym, attenuowanym szczepie IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genów Φ1, Φ2 i 83 związanych z ochroną przed ptasim reowirusem, umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pFRAG3Δ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów Φ1, Φ2 i 83 związanych z ochroną przed ptasim reowirusem mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed zarażeniami ptasim reowirusem i IBV.

IV.2.e. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed zakaźną chorobą kaletki.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko wirusowi zakaźnej choroby kaletki (IBDV) opartej na żywym attenuowanym szczepie IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genu VP2 związanego z ochroną przed IBDV, umieszczono w kasetce ekspresyjnej i następnie wprowadzono do pFRAGΔ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genu VP2 związanego z ochroną przed IBDV mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed zarażeniami ptasim IBDV i IBV.

IV.2.f. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed chorobą Marek'a.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko kurzemu wirusowi herpes 2 (wirus choroby Marek'a) opartej na żywym attenuowanym szczepie IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genu gB związanego z ochroną przed kurzym wirusem herpes 2, umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pFRAG3Δ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genu gB związane z ochroną przed kurzym wirusem herpes 2 mogą być wprowadzone do i wyrażone przez żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed zarażeniami kurzym wirusem herpes 2 i IBV.

IV.2.g. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze IBV chroniącej przed zakażeniem noso-gardzieli.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciwko kurzemu wirusowi herpes 1 (wirus zakaźny noso-gardzieli) opartej na żywym attenuowanym szczepie IBV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genów gB, gC, gD, gE, gH, gl, gK, gL i gM związanych z ochroną przed kurzym wirusem herpes 1, umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pFRAG3Δ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów związanych z ochroną przed kurzym wirusem herpes 1 mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep IBV. Te zrekombinowane wirusy mogą,

PL 207 933 B1 co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed zarażeniem kurzym wirusem herpes 1 i IBV.

IV. 3. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

Cel: Opracowanie szczepionki IBV, w którym usunięcie genów nie będących kluczowymi jest połączone ze zmienioną kolejnością genów przez przesunięcie genu N przed gen S w genomie IBV.

Procedura: Zrekombinowane wirusy wytworzono jak to opisali Casais i wsp. (2001). Zakaźne klony IBV cDNA złożono w szczepionce genomu wirusa przez kolejne ligacje in vitro fragmentów cDNA pochodzących z pFRAG1, pFRAG2 i pFRAG3 pochodnych plazmidów, a następnie bezpośrednie klonowanie do genomu szczepionki wirusowej vNotI/tk jak to opisano (1a). Geny 3a/b i 5a/b usunięto z pFRAG3 przez mutagenezę PCR pozostawiając niezmienionymi otaczające ramki odczytu i sekwencje regulatorowe transkrypcji. Dodatkowo gen N wraz z jego TRS przesunięto do miejsca powyżej genu S, otrzymując pFRAG3Δrearranged. Zrekombinowane szczepionki wirusowe wytworzono przez rekombinację pomiędzy wirusem kurzej ospy HP1.441 i vNotI/tk-IBV in vitro w mieszaninie ligacyjnej. Zrekombinowane wirusy oczyszczono przez łysinki i scharakteryzowano przez PCR i analizę Southern-blot. Ostatecznie, zakaźne IBV pozbawione genów 3a/b i 5a/b o zmienionej kolejności genów wytworzono jak następuje: komórki nerki kurczaka (CK) zrażono zrekombinowanym wirusem ospy drobiu wyrażającym polimerazę RNA z bakteriofaga T7. Następnie komórki stransfekowano DNA wyizolowanym ze zrekombinowanej szczepionki wirusowej zawierającej klon IBV cDNA pozbawiony genów 3a/b i 5a/b w kombinacji ze zmienioną kolejnością genów. W trzy dni po zarażeniu zebrano pożywkę hodowlaną i użyto jej dala zarażenia komórek CK dla wytworzenia dużych ilości zrekombinowanego IBV. Zrekombinowane wirusy potwierdzono genetycznie przez analizę RT-PCR.

Wniosek: Wytworzono zrekombinowany IBV pozbawiony genów 3a/b i 5a/b w połączeniu ze zmienioną kolejnością genów. Wirusy te działają jako żywa, attenuowana szczepionka przeciw IBV. Połączone z konstruktami genu S z innych serotypów IBV i/lub konstruktów genów z innych, ptasich patogenów, dodatkowo mogą być wytworzone multiwalentne szczepionki.

V. Ludzki koronawirus (HcoV) szczep 229E (HcoV-229E).

V.1. Wytworzenie żywej szczepionki opartej na attenuowanym HCoV-22 9E.

Cel: Opracowanie żywej, attenuowanej szczepionki opartej na attenuowanym HcoV-229E.

Podejście: Wytworzono zrekombinowane wirusy będące mutantem delecyjnym HCoV, które utraciły geny 4a/b nie będące kluczowymi.

Procedura: Zrekombinowane wirusy wytworzono zasadniczo jak to opisali Thjel i wsp. (2001). Zakaźne klony HCoV cDNA zostały złożone w genomie szczepionki wirusowej. Szczepionka wirusowa vHCoV-vec-1 zawiera fragment 22,5 tys. par zasad cDNA kodujący 5'-koniec genomu HCoV. Fragment ten został usunięty z genomu szczepionki przez trawienie Bsp120I, strawiony Mlul i połączony przez ligację z fragmentem cDNA z pMEΔ, który otrzymano przez trawienie Mlul/Eagl. pMEΔ zawiera fragment cDNA kodujący 3' koniec genomu VcoV, lecz pozbawiony genu 4a/b bez zmiany innych genów lub sekwencji regulujących transkrypcję. pMEΔ otrzymano z pME przy pomocy tradycyjnych sposobów mutagenezy przez PCR. Produkty ligacji wbudowano do DNA szczepionki wirusowej vNotI/tk. Zrekombinowane wirusy szczepionki wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy oczyszczono przez łysinki scharakteryzowano przez PCR i analizę Southern-blot. Ostatecznie, zakaźne HCoV pozbawione genów 4a/b wytworzono jak następuje: komórki nerki kurczaka (CK) zarażono zrekombinowanym wirusem ospy drobiu wyrażającym polimerazę RNA z bakteriofaga T7. Następnie komórki stransfekowano DNA wyizolowanym ze zrekombinowanej szczepionki wirusowej zawierającej klon HCoV cDNA pozbawiony genów 4a/b. W trzy dni po zarażeniu zebrano pożywkę hodowlaną i użyto jej dla zarażenia ludzkich, długich komórek fibroblastów (MRC-5) dla wytworzenia dużej ilości zrekombinowanych HCoV. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR.

Wniosek: Zrekombinowane HCoV wytworzono tak, że pozbawione jest genów 4a/b. Wirusy te mogą funkcjonować jako żywa attenuowana szczepionka przeciw HCoV-229E.

V.2. Wytworzenie żywej attenuowanej szczepionki przeciw HCoV szczepu OC43.

Cel: Opracowanie żywej, attenuowanej szczepionki przeciwko HCoV-OC43.

Podejście: Zrekombinowane wirusy będące mutantem delecyjnym HCoV wytworzono tak, że pozbawione są nie będących kluczowymi genów 4a/b i zawierają hybrydowy gen białka S kodujący ektodomenę HCoV-OC43.

Procedura: Zrekombinowane wirusy wytworzono zasadniczo jak to opisali Thjel i wsp. (2001). Zakaźne klony HCoV cDNA zostały złożone w genomie szczepionki wirusowej. Szczepionka wirusowa

PL 207 933 B1 vHCoV-vec-1 zawiera fragment 22,5 tys. par zasad cDNA kodujący 5'-koniec genomu HCoV. Fragment ten został usunięty z genomu szczepionki przez trawienie Bsp120I, strawiony Mlul i połączony przez ligację z fragmentem cDNA z pMEA-SOC43, który otrzymano przez trawienie Mlul/Eagl. pMEΔ-SOC43 zawiera fragment cDNA kodujący 3' koniec genomu HCoV, lecz pozbawiony genu 4a/b i zawierający gen hybrydowego białka S, bez zmiany innych genów lub sekwencji regulujących transkrypcję. Gen dla hybrydowego białka S zawiera rejon genu S z HCoV-OC43 kodujący ektodomenę białka S, podczas gdy pozostałość genu pochodzi z genu HCoV-229E. pMEΔ-SOC43 otrzymano z pMEΔ przy pomocy tradycyjnych sposobów mutagenezy (RT-PCR). Produkty ligacji wbudowano do DNA szczepionki wirusowej vNotI/tk. Zrekombinowane wirusy szczepionki wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy oczyszczono przez łysinki scharakteryzowano przez PCR i analizę Southern-blot. Ostatecznie, zakaźne HCoV pozbawione genów 4a/b wytworzono jak następuje: komórki nerki kurczaka (CK) zarażono zrekombinowanym wirusem ospy drobiu wyrażającym polimerazę RNA z bakteriofaga T7. Następnie komórki stransfekowano DNA wyizolowanym ze zrekombinowanej szczepionki wirusowej zawierającej klon HCoV cDNA pozbawiony genów 4a/b. W trzy dni po zarażeniu zebrano pożywkę hodowlaną i użyto jej dla zarażenia ludzkich, długich komórek fibroblastów (MRC-5) dla wytworzenia dużej ilości zrekombinowanych HCoV. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR.

Wniosek: Zrekombinowane HCoV wytworzono tak, że pozbawione jest genów 4a/b. Wirusy te zawierają ektodomenę białka S HCoV-OC43 i co za tym idzie mogą funkcjonować jako żywa attenuowana szczepionka przeciw HCoV-OC43.

V.3. Wytworzenie multiwalentnych szczepionek opartych na HCoV.

Cel: Opracowanie multiwalentnej szczepionki opartej na żywym attenuowanym szczepie HCoV jako wektorze.

Podejście: Kasetki ekspresyjne genów związanych z ochroną przed ludzkimi patogenami wprowadzono do genomu HCoV w kombinacji z attenuującą delecją genów nie będących kluczowymi. Kasetki ekspresyjne zawierają HCoV TRS (TCTCAACT) przed (fragmentami) genów, które będą wyrażone.

V.3.a. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed syncytialnym wirusem oddechowym (RSV).

Cel: Opracowanie szczepionki RSV opartej na żywym attenuowanym szczepie HCoV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genów HN i F związanych z ochroną przed RSV, umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pMEΔ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów HN i F związanych z ochroną przed RSV mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep HCoV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed RSV i zarażeniami HCoV.

V.3.b. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed rotawirusem.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw rotawirusowi opartej na żywym attenuowanym szczepie HCoV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) genów VP4, VP6 i VP7 związanych z ochroną przed rotawirusem, umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pMEΔ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genów VP4, VP6 i VP7 związanych z ochroną przed rotawirusem mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep HCoV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed rotawirusem i zarażeniami HCoV.

V.3.c. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed wirusami typu Norwalk.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw wirusowi typu Norwalk opartej na żywym attenuowanym szczepie HCoV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

PL 207 933 B1

Procedura: (Fragmenty) genu kapsydu związane z ochroną przed wirusem typu Norwalk, umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pMEΔ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) genu kapsydu związanego z ochroną przed wirusem typu Norwalk mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep HCoV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed wirusem typu Norwalk i zarażeniami HCoV.

V.3.d. Konstrukcja multiwalentnej szczepionki opartej na wektorze HCoV chroniącej przed wirusem grypy.

Cel: Opracowanie szczepionki przeciw wirusowi grypy opartej na żywym attenuowanym szczepie HCoV, który utracił geny nie będące kluczowymi.

Procedura: (Fragmenty) geny H i N związane z ochroną przed wirusem grypy, umieszczono w kasetkach ekspresyjnych i następnie wprowadzono do pMEΔ. Po potwierdzeniu wszystkich konstruktów przez analizę restrykcyjną i sekwencję, zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR. Ekspresja obcego genu była potwierdzona przez analizę immunoprecypitacji.

Wniosek: (Fragmenty) geny H i N związane z ochroną przed wirusem grypy mogą być wprowadzone do i wyrażone przez, żywy attenuowany szczep HCoV. Te zrekombinowane wirusy mogą, co za tym idzie, działać jako multiwalentna szczepionka dla ochrony przed wirusem grypy i zarażeniami HCoV.

V.4. Wytworzenie zrekombinowanych wirusów o zmienionej kolejności genów.

Cel: Opracowanie szczepionki HcoV, w której usunięto geny nie będące kluczowymi i jednocześnie przebudowano uporządkowanie genów przez przesunięcie genu N powyżej genu S w genomie HCoV.

Procedura: Zrekombinowane wirusy wytworzono zasadniczo jak to opisali Thjel i wsp. (2001). Zakaźne klony HCoV cDNA zostały złożone w genomie szczepionki wirusowej. Szczepionka wirusowa vHCoV-vec-1 zawiera fragment cDNA 22,5 tys. par zasad kodujący 5'-koniec genomu HCoV. Fragment ten został usunięty z genomu szczepionki przez trawienie Bsp120l, strawiony Mlul i połączony przez ligację z fragmentem cDNA z pMEΔrearranged, który otrzymano przez trawienie Mlul/Eagl. pMEΔrearranged zawiera fragment cDNA kodujący 3' koniec genomu HCoV, lecz pozbawiony genu 4a/b i bez zmiany innych genów lub sekwencji regulujących transkrypcję i w którym gen N, wraz z TRS zostały umiejscowione powyżej genu S. pMEΔrearranged otrzymano z pME przy pomocy tradycyjnych sposobów mutagenezy PCR. Produkty ligacji wbudowano do DNA szczepionki wirusowej vNotI/tk. Zrekombinowane wirusy szczepionki wytworzono jak opisano powyżej. Zrekombinowane wirusy oczyszczono przez łysinki scharakteryzowano przez PCR i analizę Southern-blot. Ostatecznie, zakaźne HCoV pozbawione genów 4a/b wytworzono jak następuje: komórki nerki kurczaka (CK) zarażono zrekombinowanym wirusem ospy drobiu wyrażającym polimerazę RNA z bakteriofaga T7. Następnie komórki stransfekowano DNA wyizolowanym ze zrekombinowanej szczepionki wirusowej zawierającej klon HCoV cDNA pozbawiony genów 4a/b w kombinacji ze zmianą kolejności genów. W trzy dni po zarażeniu zebrano pożywkę hodowlaną i użyto jej dla zarażenia ludzkich, długich komórek fibroblastów (MRC-5) dla wytworzenia dużej ilości zrekombinowanych HCoV. Zrekombinowane wirusy były potwierdzone genetycznie przez analizę RT-PCR.

Wniosek: Zrekombinowane HCoV wytworzono tak, że pozbawione jest genów 4a/b w kombinacji ze zmienioną kolejnością genów. Wirusy te mogą funkcjonować jako żywa attenuowana szczepionka przeciw HcoV229E. Gdy dodatkowo połączono z genem S konstrukty z HCoV-OC43 i/lub konstrukty z innych ludzkich patogenów, wytworzona może być multiwalentna szczepionka.

PL 207 933 B1

Literatura:

1. Bredenbeek, P. J., C. J. Pachuk, A. F. Noten, J. Charite, W. Luytjes, S. R. Weiss, i W. J. Spaan. 1990. The primary structure and expression of the second open reading frame of the polymerase gene of the coronavirus MHV-A59; a highly conserved polymerase is expressed by an efficient ribosomal frameshifting mechanism. Nucleic Acids Res. 18:1825-32.

1a. Casais, R., V. Thiel, S.G. Siddell, D, Cavanagh, i P. Britton. 2001. Reverse genetics system for the avian coronavirus infectious bronchitis virus. J. Virol. 75:12359-12369.

lc. Ahmazan, F., J.M. Gonzalez, Z. Penzes, A. Izeta, E. Calvo, J. Plana-Duran, i L. Enjuanes. 2000. Engineering the largest RNA virus genomeas an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5516-5521.

ld. Fischer, F. , C.F. Stegen, CA. Koetzner, i P. S. Masters. 1997. Analysis of a recombinant Mouse Hepatitis Virus Expressing a foreign gene reveals a novels aspect of coronavirus transcription. J. Virol. 71:5148-5 160.

2. Fischer, F., D. Peng, S. T. Hingley, S. R. Weiss, i P. S. Masters. 1997. The internal open reading frame within the nucleocapsid gene of mouse hepatitis virus encodes a structural protein that is not essential for viral replication. J. Virol. 71:996-1003.

2a. Herrewegh, A.A., I. Smeenk, M.C. Horzinek, P.J.M. Rottier, i R.J. de Groot. 1998. Feline coronavirus type II strains 79-1683 and 79-1146 originate from a double recombination between feline coronavirus type I and canine coronavirus. J. Virol. 72:4508-45 14.

3. Hsue, B., T. Hartshorne, i P. Masters. 2000. Characterization of an essential RNA secondary structure in the 3' untranslated region of the murine coronavirus genome. J. Virol. 74:6911-6921.

4. Hsue, B., i P. S. Masters. 1999. Insertion of a new transcriptional unit into the genome of mouse hepatitis virus. J. Virol. 73:6128-6135.

5. Jacobs, L., W. Spaan, M. Horzinek, i B. van der Zeijst. 1981. Synthesis of subgenomic mRNA's'of mouse hepatitis virus is initiated independently: evidence from UV' transcription mapping. J. Virol. 39:401-406.

6. Jendrach, M., V. Thiel, i S. Siddell. 1999. Characterization of an internal ribosome entry site within mRNA 5 of murine hepatitis virus. Arch. Viral. 144:921-933.

7. Kuo, L., G. Godeke, M. Raamsman, P. Masters, i P. Rottier. 2000. Retargeting of coronavirus by substitution of the spike glycoprotein ectodomain: crossing the host cell species barrier. J. Viral. 74:1393-1406.

8. Leibowitz, J., K. Wiihelmsen i C. Bond. 1981. The virus-specific intracellular RNA species of two murine coronaviruses: MHV-a59 and MLIV-JHM. Virology. 114:39-51.

9. Masters, P. S. 1999. Reverse genetics of the largest RNA viruses. 53:245-264,. Adv. Virus Res. 53:245-264.

10. Masters, P. S., C. A. Koetzner, C. A. Kerr, i Y. Heo. 1994. Optimization of targeted RNA reconibination and mapping of a novel nucleocapsid gene mutation in the coronavirus mouse hepatitis virus. J. Viral. 68:328-37.

10a. Thiel, V., J. Herold, B. Schelle, and S. Siddell. 2001. Infectious RNA transcribed in vivo from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J. Gen. Viral. 82, 1273-1281.

11. de Vries, A.A.F, A.L.Glaser, M.J.B.Raamsman, C.A.M.de Haan, S.Sarnataro, G.-J.Godeke i P.J.M.Rottier. 2000. Genetic manipulation of equine arteritis virus using full-length eDNA clones: separation of overlapping genes and expression of a foreign epitope. Virology 270:84-97.

12. Godeke, G.-J., C.A.M.de Haan, J.W.A.Rossen, H.Vennema, i P.J.M.Rottier. 2000, Assembly of spikes into coronavirus particles is mediated by the carboxy-terminal domain of the spike (5) protein. J.Virol. 74:1566-1571.

13. Vennema, H., G.-J.Godeke, J.W.A.Rossen, W.F.Voorhout, M.G.Horzinek, D.-J.E.Opstelten, i P.J.M.Rottier. 1996. Nucleocapsid-independent assembly of coronavirus-like particles by coexpression of viral envelope proteins. EMBO J. 15:2020-2028.

Claims (12)

1. Wyizolowana lub zrekombinowana replikatywna cząsteczka podobna do koronawirusa, znamienna tym, że naturalny porządek genów dla białek strukturalnych 5'-S-E-M-N-3' jest zmieniony przez reanranżację genów.

2. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że ma usunięty co najmniej funkcjonalny fragment z kwasu nukleinowego kodującego produkt genu wirusowego innego niż polimeraza lub białko strukturalne N, M, E lub S.

3. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jest dostarczona z co najmniej jednym białkiem związanym z powierzchnią wspomnianej cząsteczki podobnej do koronawirusa wybranym z grupy składającej się z ektodomeny białka kolca lub jego części innego koronawirusa, ektodomeny białka otoczki lub jego części wirusa nie należącego do koronawirusów, enzymatycznie aktywnej cząsteczki i domeny aminokońcowej lub jej części jakiegokolwiek błonowego nie-wirusowego białka typu I.

4. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że dostarczona jest z co najmniej jednym biologicznie aktywnym białkiem lub jego fragmentem związanym z wnętrzem wspomnianej cząsteczki podobnej do koronawirusa, innej niż naturalna endodomena któregokolwiek białka oryginalnego koronawirusa.

5. Cząsteczka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że dostarczona jest z co najmniej jednym funkcjonalnym środkiem adresowania związanym z powierzchnią wspomnianej cząsteczki podobnej do koronawirusa, innej niż naturalne białko kolca koronawirusa.

6. Cząsteczka według zastrz. 1 do 5, znamienna tym, że jest dostarczona z genomem koronawirusa, do którego został wbudowany obcy gen lub jego część.

7. Cząsteczka według zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że jest attenuowana.

8. Cząsteczka według zastrz. 1 do 7, znamienna tym, że jest nośnikiem dostarczającym gen.

9. Cząsteczka według zastrz. 1 do 11, znamienna tym, że jest antygenem lub epitopem dostarczającego nośnika.

10. Kompozycja zawierająca cząsteczkę jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 9 dla zastosowania terapeutycznego.

11. Kompozycja zawierająca cząsteczkę jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 9 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik dla zastosowania jako immunogen lub szczepionka.

12. Kompozycja zawierająca szczepionkę jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 9 dla zastosowania diagnostycznego.