JP2003515335A - 感染性クローン - Google Patents

感染性クローン

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ａ）ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の完全長コピーを含有しているＤＮＡ；または（ｂ）ＲＮＡウイルスのｇＲＮＡの１つまたはいくつかのフラグメントを含有しているＤＮＡであって、ここで、フラグメントはＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする；または（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有しているＤＮＡ；が、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化される工程を含むＤＮＡの調製方法に関する。加えて、コロナウイルスの天然の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に由来する配列を含むことを特徴とするＤＮＡであって、前記ＤＮＡのフラグメントがウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得るＤＮＡが提供される。さらに、ウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子を調製するためのこれらの核酸、またはこれらのＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ若しくはウイルス粒子を含む医薬調製物の使用が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する方法、この方法によって得ることの
できる核酸、およびワクチンとしておよび遺伝子治療のためのそれらの使用に関
する。
【０００２】
【従来の技術】
組換えＤＮＡ技術の進歩によって、生物間での遺伝子導入の開発における進歩
が導かれてきた。現時点において、多数の努力が、遺伝子導入技術の使用を通じ
た経済的および商業的な目的の、化学品、医薬品、および生物学的な産物の、産
生のために行われている。
【０００３】 原核生物細胞および真核生物細胞の両方の遺伝子操作における重要な因子の１
つが、ベクターおよび宿主ベクターシステムの開発である。一般的には、ベクタ
ーは、宿主細胞中で複製または発現し得る核酸分子である。ベクター−宿主シス
テムが、ベクターを保有している宿主細胞として定義され得、そしてこれによっ
てこれが含有している遺伝子情報が複製されそして発現されることを可能にする
。
【０００４】 ベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡゲノムの両方を用いて種々のウイルスから開
発されている。宿主細胞の核内で複製するＤＮＡウイルスに由来するウイルスベ
クターは、上記の細胞のゲノム中に組み込まれ得る欠点を有し、それによってこ
れらは、一般的には非常に安全ではない。対照的に、宿主細胞の細胞質中で複製
するＲＮＡウイルスに由来するウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスに基づくベ
クターよりも安全である。なぜなら、複製が核の外側でＲＮＡを通じて生じるか
らである。従って、これらのベクターは、宿主細胞のゲノム中にはほとんど組み
込まれないようである。
【０００５】 ｃＤＮＡクローンが、例えば、以下のような、正の極性を有する一本鎖のＲＮ
Ａウイルスから得られている：［ｓｓＲＮＡ（＋）］ピコルナウイルス（Ｒａｃ
ａｎｉｅｌｌｏ ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８１）；ブロモウイルス（Ａｈ
ｌｑｕｉｓｔら、１９８４）；アルファウイルス（シンドビスウイルスを含む属
）；セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖ
ＥＥ）（Ｒｉｃｅら、１９８７；ＬｉｌｋｅｓｔｏｅｍおよびＧａｒｏｆｆ、１
９９１；Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６；ＳｍｅｒｄｏｕおよびＬｉｌｋｅｓｔｏｍ
、１９９９）；フラビウイルスおよびペスチウイルス（ＲｉｃｅおよびＳｔｒａ
ｕｓｓ、１９８１；Ｌａｉら、１９９１；Ｒｉｃｅら、１９８９）；ならびにＡ
ｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルス（Ｇｅｉｇｅｎｍｕｌｌｅｒら、
１９９７）。同様に、異種遺伝子の発現のためのベクターが、例えば、以下のよ
うなｓｓＲＮＡ（＋）ウイルスのゲノムのＤＮＡ相補鎖のクローンから開発され
ている：アルファウイルス（シンドビスウイルスを含む属）；セムリキ森林ウイ
ルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）（Ｆｒｏｌｏｖ
ら、１９９６；Ｌｉｌｋｅｓｔｏｅｍ、１９９４；Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７）
。しかし、ＲＮＡウイルスから開始して組換えウイルスを調製するための全ての
方法がなお、ウイルスのほとんどが細菌について毒性である配列を含むという事
実によって、面倒である。従って、ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを調製し、そして
細菌中にｃＤＮＡをサブクローニングすることは、細菌宿主中のＤＮＡ配列の欠
失または再配置をしばしば導く。この目的のためには、ほとんどの一般的に使用
されるサブクローニングおよび発現ベクターは、組換えＲＮＡウイルスに由来す
る大きなＤＮＡ切片の調製のためには使用され得ない。しかし、より長い外来Ｄ
ＮＡ配列を保有し得るベクターを得ることが、医薬品（特に、ワクチン）の開発
の多数の局面について必要とされる。
【０００６】 コロナウイルスは、約２５から３１キロベース（ｋｂ）の間の長さを含む、Ｒ
ＮＡウイルスについての、最も大きな公知のゲノムを示すｓｓＲＮＡ（＋）ウイ
ルスである（Ｓｉｄｄｅｌｌ、１９９５；Ｌａｉ ＆ Ｃａｖａｎａｇｈ、１９
９７；Ｅｎｊｕａｎｅｓら、１９９８）。コロナウイルスによる感染の間に、ゲ
ノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は複製し、そして正および負の極性のサブゲノムＲＮＡ
（ｓｇＲＮＡ）のセットが合成される（Ｓｅｔｈｎａら、１９８９；Ｓａｗｉｃ
ｋｉおよびＳａｗｉｃｋｉ、１９９０；ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｏｓｔ ＆Ｓｐａａ
ｎ，１９９５）。ｓｇＲＮＡの合成は、感染した細胞の細胞質中で生じるＲＮＡ
依存性のプロセスであるが、その正確な機構はなお正確にはわかっていない。
【０００７】 いくつかのコロナウイルス（例えば、マウスの肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、感染
性の気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）（Ｃｈａｎｇ
ら、１９９４）、およびブタ胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）（スペイン特許出願番
号第Ｐ６００６２０号；Ｍｅｎｄｅｚら、１９９６；Ｉｚｅｔａら、１９９９；
Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）の欠損妨害（ＤＩ）ゲノム（それらの複製および
転写のために相補的なウイルスの存在を必要とする欠失変異体）が、記載されて
いる。しかし、コロナウイルスの完全なゲノムをコードするｃＤＮＡクローンの
構築が、コロナウイルスのゲノムの大きな大きさおよびその中の毒性の配列に起
因して、可能にはなっていない。
【０００８】 まとめると、宿主細胞中で異種核酸を複製しそして発現するための多数のウイ
ルスベクターが開発されているが、異種遺伝子の発現のための公知のベクターの
大部分は、ＲＮＡウイルスのサブクローニングには十分には適さない。さらに、
そのように得られたウイルスベクターには、種特異性の欠失、標的器官または組
織の限定、ならびにクローニングについてのそれらの限定された能力に起因する
欠点が存在する。これは、基本的な研究および応用研究の両方での使用の可能性
を制限する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、上記の問題を克服し得る異種遺伝子の発現のための新しいベクターを
開発するための方法が、必要とされている。詳細には、高いレベルの安全性およ
びクローニング能力を有している異種遺伝子の発現のための大きなベクターを有
することが、有利である。これは、それらの種特異性および向性が制御され得る
ように、設計され得る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、上記の問題点が、複数の工程を包含するＤＮＡの調製方法に
よって解決される。ここでは、 （ａ）ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の完全長のコピーを含有して
いるＤＮＡ；または （ｂ）ＲＮＡウイルスのｇＲＮＡの１つまたはいくつかのフラグメントを含有し
ているＤＮＡであって、ここで、フラグメントは、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメ
ラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする；また
は （ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有してい
るＤＮＡ； が、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化される。
【００１１】 驚くべきことに、本発明者らは、ウイルスのｇＲＮＡに由来する大きなＤＮＡ
配列をサブクローン化しそして発現するための先行技術の方法によって生じる問
題が、クローニングベクターとしてＢＡＣを使用することによって克服され得る
ことを見出した。ＢＡＣの使用は、これらのベクターが１個の細胞あたり１つま
たは２つのコピー数で細菌中に存在するという特定の利点を有する。これは、毒
性およびプラスミド間での組換えの可能性を相当制限する。
【００１２】 本発明はさらに、複数の工程を包含する、ウイルスのＲＮＡまたはウイルス粒
子を調製する方法を提供する。ここでは、ＤＮＡは、上記の方法の１つに従って
調製され、ＤＮＡが発現され、そしてウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子が単離
される。さらに、ＤＮＡを調製するために上記の方法の工程を含有している、医
薬品（特に、ワクチン）を調製する方法が、開示される。
【００１３】 本発明の別の局面によれば、コロナウイルスの天然の配列に対して少なくとも
６０％の相同性を有し、そしてＲＮＡ依存性ポリメラーゼおよび少なくとも１つ
の構造または非構造タンパク質をコードする、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（
ｇＲＮＡ）に由来する配列を含有しているＤＮＡが、提供される。ここでは、上
記のＤＮＡのフラグメントは、ＲＮＡに転写され得、そしてこのＲＮＡは、ウイ
ルス粒子に組み立てられ得る。本発明はまた、それぞれのＤＮＡを調製する方法
を含む。
【００１４】 本発明はさらに、ベクター（より詳細には、それぞれの核酸を含有している細
菌の人工染色体（ＢＡＣ））を提供する。さらなる実施態様に従うと、本発明は
、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡを含有している、宿主に対して、そして感染性の
、弱毒化されたか、または不活化されたウイルスに関する。
【００１５】 本発明はまた、本発明の核酸、ベクター、宿主細胞、またはウイルス粒子を含
有している、一価または多価のワクチンのような、医薬調製物を提供する。
【００１６】 最後に、本発明は、複数の工程を含有している、ウイルス粒子またはウイルス
ＲＮＡを産生するための方法を提供する。ここでは、本発明のＤＮＡが転写され
、そしてウイルス粒子またはウイルスが回収され、そしてこの方法によってウイ
ルスＲＮＡを得ることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、ＤＮＡの調製方法が提供される。この方法は、複数の工程を
包含する。ここでは、 （ａ）ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の全長のコピーを含有してい
るＤＮＡ；または （ｂ）ＲＮＡウイルスのｇＲＮＡの１つまたはいくつかのフラグメントを含有し
ているＤＮＡであって、ここで、フラグメントは、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメ
ラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする；また
は （ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有してい
るＤＮＡ； が、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化される。
【００１８】 本出願によれば、「細菌の人工染色体」はＦ因子の配列を含むＤＮＡ配列であ
る。この配列を含有しているプラスミド（いわゆる、Ｆプラスミド）は、少ない
コピー数（１個の細胞あたり１個または２個のコピー）で、３００ｋｂより長い
異種配列を安定に維持し得る。それぞれのＢＡＣが、当該分野で公知である（Ｓ
ｈｉｚｕｙａら、１９９２）。
【００１９】 本発明によると、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡは、ＲＮＡウイルスの天
然の配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは７５％、そしてより好ましく
は、８５％または９５％の相同性を有する。配列相同性は、好ましくは、Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）か
ら入手可能であるＣｌｕｓｔａｌコンピュータープログラムを使用して決定され
る。
【００２０】 本発明の方法によると、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡはさらに、１つの
ウイルスの構造または非構造タンパク質を除いて、いくつかまたは全てをコード
する配列を含み得る。
【００２１】 本発明の好ましい実施態様においては、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡは
さらに、１つまたはいくつかの異種遺伝子をコードする配列を含む。本出願によ
ると、遺伝子は、それがＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよび構造または非
構造タンパク質をコードする遺伝子についての供給源として使用されるウイルス
に由来しない場合には、「異種遺伝子」として特徴付けられる。従って、「異種
遺伝子」はまた、１つのタイプのウイルスに由来する遺伝子をいい、そして別の
タイプのウイルスに由来する配列を含有しているベクター中で発現される。目的
とするいかなる異種遺伝子も本発明の核酸に挿入することができる。哺乳動物の
免疫システムによって感染性病原体からの抗原として認識される、１つまたはい
くつかのペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子の挿入が、特に好ましい
。あるいは、本発明の方法は、感染性の病原体または感染性の病原体に対する防
御を提供する抗体の複製を妨害する、少なくとも１つの分子をコードする異種遺
伝子を使用して、行われ得る。異種配列は、免疫モジュレーター、サイトカイン
、免疫エンハンサー、および／または抗炎症性化合物をコードする特定の配列で
あり得る。
【００２２】 本発明の方法は、任意の大きさを有するＤＮＡを使用して、ＢＡＣ中へのクロ
ーニングが行われ得る。しかし、大きな配列を使用する場合には、ウイルスから
サブクローニングされたＤＮＡを調製するための公知の方法を上回る特異的な利
点が得られる。従って、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡは、少なくとも５ｋ
ｂの長さを含み、ここでは、少なくとも１５、２５、または３０ｋｂの大きさを
有するＤＮＡが、特に好ましい。
【００２３】 本発明の特定の好ましい実施態様によれば、ＢＡＣがＢＡＣ中にクローン化さ
れたＤＮＡの転写を制御する配列を含む、方法が提供される。これによって、ウ
イルスＲＮＡの転写を可能にし、そして従って、ウイルスの発現を可能にする。
当該分野で公知の転写を制御する任意の配列が、この目的のために使用される。
これには、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムに由来する遺伝子の発現を駆動する配列が
含まれる。サイトメガロウイルスの最初期（ＩＥ）プロモーターが好ましい。
【００２４】 ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡもまた、ポリ（Ａ）テイルによって３’末
端に隣接される。核酸は、終結配列および／またはウシの成長ホルモン（ＢＧＨ
）のポリアデニル化配列を含み得る。さらにまたはあるいは、核酸が、リボザイ
ム（例えば、δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）のリボザイム）をコードする配列を含み
得る。
【００２５】 さらなる利点は、ウイルスの少なくとも１つが、ヌクレオチドの置換、欠失、
または付加によって改変されている場合に、達成され得る。例えば、ウイルスの
向性を制御する遺伝子が、変更された向性を有するウイルスを得るために改変さ
れ得る。あるいは、ウイルスの向性を制御する遺伝子が、別のウイルスのそれぞ
れの遺伝子で置換されている。改変は、好ましくは、ウイルスのＳ、Ｍ、および
／またはＮ遺伝子中で行われる。
【００２６】 本発明の好ましい実施態様においては、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡが
、ウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得る方法が、提供される。
ウイルス粒子は、感染性の、弱毒化された、複製欠損、または不活化されたウイ
ルスであり得る。
【００２７】 任意のＲＮＡウイルスが、本発明の方法において使用され得る。ウイルスは、
例えば、ピコルナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、
トロウイルス、アルテリウイルス、カルシウイルス、ラブドウイルス、パラミク
ソウイルス、フィロウイルス、ボルナウイルス、オルトミクソウルス、ブンヤウ
イルス、アレナウイルス、またはレオウイルスであり得る。正方向の鎖のゲノム
を自然に有するウイルスの使用が好ましい。
【００２８】 さらに、本発明は、以下の工程を包含する、ウイルスＲＮＡまたはウイルス粒
子の調製方法を提供する。ここでは、ＤＮＡは、上記の方法の１つに従って調製
される。ＤＮＡは、適切な宿主細胞中で発現され、そしてウイルスＲＮＡまたは
ウイルス粒子が、宿主細胞から単離される。当該分野で公知の細胞培養物からウ
イルスを単離するための任意の方法が、使用され得る。あるいは、ウイルスＲＮ
Ａまたはウイルス粒子を調製する方法が、開示されている。ここでは、本発明の
ＤＮＡは、化学物質、生物学的試薬および／または細胞抽出物を使用して転写ま
たは翻訳され、そしてウイルスＲＮＡまたはウイルス粒子が続いて、単離される
。特定の実施態様については、ウイルスは、実質的に不活化されるか、または死
滅させられ得る。
【００２９】 本発明はまた、複数の工程を包含している医学組成物を調製するための方法を
提供する。ここでは、ＤＮＡ、ウイルスのＲＮＡ、またはウイルス粒子が、上記
の方法の１つに従って調製され、そして薬学的に受容可能なアジュバントおよび
／またはキャリアと混合される。多数のアジュバントおよびキャリアおよび希釈
剤が先行技術において公知であり、そして本発明に従って使用されえる。医薬品
は、好ましくは、感染性の疾患に対してヒトまたは動物を防御するためのワクチ
ンである。医薬品は、また、遺伝子治療のために使用され得る。
【００３０】 本発明はさらに、コロナウイルスの天然の配列に対して、少なくとも６０％の
相同性を有し、そしてＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１
つの構造または非構造タンパク質をコードする。ここでは、上記のＤＮＡは、ウ
イルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得る。
【００３１】 本発明によれば、用語「コロナウイルスに由来する配列」は、少なくとも６０
％、好ましくは７５％、そしてより好ましくは８５％または９５％の相同性を、
コロナウイルスの天然の配列に対して有する核酸をいうように使用される。配列
相同性は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ（ＥＢＩ）から入手可能であるＣｌｕｓｔａｌコンピューターを使用して決
定され得る。
【００３２】 用語「コロナウイルス」は、直鎖の、正方向のセンスの、２５から３３ｋｂの
ｓｓＲＮＡの単一の分子を有するウイルスのグループをいう。これらのウイルス
は、通常は、７個から１０個の構造遺伝子（すなわち、ウイルス構造を決定する
タンパク質をコードする遺伝子）を含む。これらの遺伝子は、代表的には、５’
−レプリカーゼ−（ヘマグルチニン−エステラーゼ）−スパイクエンベロープ−
膜−核タンパク質―３’の順に、ウイルスゲノム中に並べられる。さらに、ウイ
ルスゲノムは、多数の非構造遺伝子を含み得、これらは、共通の３’末端を有す
るｍＲＮＡのネストされたセットをコードし、そしてほとんどが必須ではない。
【００３３】 用語「ウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得る」は、ＤＮＡ配
列を特徴付けるために使用される。これは、適切な宿主細胞中に導入され、ＲＮ
Ａに転写され、そしてウイルス粒子を作成する。ウイルス粒子は、好ましくは、
感染性のウイルスであるが、上記のＲＮＡを含有している、不活化され得るか、
弱毒化され得るか、または複製欠損ウイルスであり得る。好ましくは、ウイルス
粒子の発現のために必要な情報の全てが、本発明のＤＮＡ配列によってコードさ
れる。
【００３４】 本発明の核酸はさらに、目的の１つまたはいくつかの異種遺伝子をコードする
配列を含み得る。本発明に従うと、遺伝子は、それがコロナウイルスに由来しな
い場合には、「異種遺伝子」として特徴付けられる。これらは、ＲＮＡ依存性の
ＲＮＡポリメラーゼ、および構造または非構造タンパク質をコードする遺伝子の
供給源として使用された。従って、「異種遺伝子」はまた、コロナウイルスの１
つのタイプに由来し、そして別のタイプのコロナウイルスに由来する配列を含有
しているベクター中で発現される遺伝子をいう。目的の任意の異種遺伝子が、本
発明の核酸中に挿入され得る。哺乳動物の免疫システムによって感染性の病原体
に由来する抗原として認識されるペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子
の挿入が、本質的に好ましい。従って、異種遺伝子は、感染性の病原体（感染性
の病原体の複製を妨害する少なくとも１つの分子、または感染性の病原体に対す
る防御を提供する抗体）に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１
つの抗原をコードする。あるいは、またはさらに、異種遺伝子は、免疫モジュレ
ーター、サイトカイン、免疫エンハンサー、および／または抗炎症性化合物をコ
ードし得る。
【００３５】 ＲＮＡに転写される本発明のＤＮＡのフラグメントは、好ましくは、少なくと
も２５ｋｂの大きさを有する。少なくとも３０ｋｂの大きさを有するフラグメン
トが、特に好ましい。
【００３６】 本発明の好ましい実施態様によれば、ＤＮＡはさらに、コロナウイルスの構造
または非構造タンパク質の１つを除くいくつかまたは全てをコードするコロナウ
イルスに由来する配列を含む。あるいは、本発明のＤＮＡは、さらにコロナウイ
ルスの構造または非構造タンパク質の全てをコードする配列を含む。
【００３７】 さらなる実施態様によれば、本発明の核酸は、コロナウイルスのｇＲＮＡに由
来する配列の転写を制御する配列を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムに由来する
遺伝子の発現を駆動する配列を含む、当該分野で公知の転写を制御する任意の配
列は、この目的のために使用され得る。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初
期（ＩＥ）プロモーターの使用が、好ましい。
【００３８】 本発明の核酸はまた、ポリ（Ａ）テイルによって３’末端で隣接され得る。核
酸はまた、ウシの成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結および／またはポリアデニル化
配列を含む。さらに、またはあるいは、核酸は、リボザイム（例えば、デルタ肝
炎ウイルス（ＨＤＶ）のリボザイム）をコードする配列を含み得る。
【００３９】 本発明の核酸は、任意のコロナウイルスに由来する（例えば、ブタの伝染性の
胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、マウスの肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、感染性の気管
支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、イヌコロナウイルス
（ＣＣｏＶ）、ネココロナウイルス（ＦｃｏＶ）、またはヒトコロナウイルスに
由来する）配列を含み得る。好ましい実施態様によれば、核酸は、感染性の胃腸
炎ウイルスに由来する。
【００４０】 本発明のさらなる実施態様によれば、本発明のＤＮＡは、プラスミドの一部、
好ましくは、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）の一部である。
【００４１】 本発明はさらに、それぞれの核酸またはワクチンを含有している宿主細胞を提
供する。宿主細胞は、真核生物または原核生物であり得る。あるいは、本発明は
、本発明の核酸を含有しているウイルス粒子を提供する。それぞれのウイルス粒
子は、例えば、本発明の核酸を用いてトランスフェクトされたかまたは感染させ
られた細胞培養物から単離され得る。
【００４２】 さらなる実施態様に従うと、本発明は、複数の工程を包含している、ウイルス
粒子またはウイルスＲＮＡを産生するための方法を提供する。ここでは、本発明
のＤＮＡは、宿主細胞中に導入され、ＤＮＡを含有している宿主細胞が、その発
現を可能にする条件下で培養され、そしてウイルス粒子またはウイルスのＲＮＡ
が回収される。さらに、ウイルス粒子またはウイルスのＲＮＡを産生するための
方法が、提供される。ここでは、本発明のＤＮＡがインビトロで化学物質、生物
学的な試薬、および／または細胞抽出物と、ＤＮＡの発現を可能にする条件下で
混合され、そしてウイルス粒子またはウイルスのＲＮＡが回収される。本発明は
また、上記の方法のいずれかによって得ることができる、ウイルス粒子およびウ
イルスのＲＮＡを含む。異種遺伝子を含有しているＲＮＡおよびウイルス粒子が
好ましい。そのように得られたウイルスは、感染性の、弱毒化された、複製欠損
、または不活化されたウイルスの形態を有し得る。
【００４３】 ウイルスは、改変された遺伝子（例えば、改変されたＳ、Ｎ、またはＭ遺伝子
）を含み得る。本発明の特異的な実施態様においては、Ｓ、Ｎ、またはＭ遺伝子
の改変は、弱毒化されたウイルスまたは変更された向性を有するウイルスを生じ
る。
【００４４】 さらなる実施態様によれば、本発明は、本発明の核酸、宿主細胞、またはウイ
ルスを含有している、医学調製物を提供する。好ましい実施態様に従うと、医薬
調製物は、感染性の病原体によって引き起こされる疾患に対して動物を防御し得
るワクチンである。ワクチンは、例えば、感染性の病原体に対する免疫応答を誘
導するために適切な少なくとも１つの抗原、または感染性の病原体に対する防御
を提供する抗体、または上記の感染性の病原体に対する防御を提供する抗体の配
列を含み得る。ワクチンは、感染性の病原体の複製を妨害する１つ上の分子を発
現するＤＮＡを含み得る。あるいは、ワクチンは、全身性の免疫応答および／ま
たは呼吸器、腸粘膜、または他の組織中で増殖する種々の感染性の病原体に対し
て粘膜における免疫応答を誘導し得る少なくとも１つの抗原を発現するベクター
を含み得る。ワクチンはまた、１つ以上の感染性の病原体によって引き起こされ
る感染に対して動物を防御し得る多価ワクチンであり得る。これは、本発明の１
つ以上の核酸を含み、そしてそれぞれが、上記の感染性の病原体、または感染性
の病原体のそれぞれの１つに対する防御を提供する抗体、または任意の感染性の
病原体の複製を妨害する他の分子に対して、免疫応答を誘導し得る抗原を発現す
る。
【００４５】 本発明のワクチンは、さらに、当該分野で公知の、任意の薬学的に受容可能な
キャリアまたは希釈剤を含み得る。
【００４６】 本発明はさらに、複数の工程を包含する、本発明のＤＮＡを調製するための方
法を提供する。ここでは、コロナウイルスに由来する妨害欠損ゲノムが、ＢＡＣ
ベクター中でプロモーターの発現下にクローン化され、そして欠損ゲノム内での
欠失が、再挿入される。この方法はさらに、複数の工程を包含し得る。ここでは
、ウイルスゲノム中の毒性配列が、残存しているゲノムＤＮＡ中への再挿入の前
に同定される。好ましくは、ウイルスゲノム中の毒性配列は、ゲノムが完成する
前に再挿入される最後の配列である。本発明によれば、この方法は、コロナウイ
ルスの感染性のクローンを得るために適切であり、これは、少なくとも80の世代
について最近中で安定であり、そして非常に効率的なクローニングベクターを提
供する。
【００４７】 本発明は、コロナウイルスに由来するｃＤＮＡの感染性のクローンの開発（Ａ
ｌｍａｚａｎら、２０００）、ならびに上記の感染性のクローンから構築される
ベクターの開発を提供する。これはまた、上記のクローン中に挿入される異種核
酸を含む。本発明によって提供される感染性のクローンおよびベクターは、基本
的および応用研究の両方において多数の適用、ならびに高いクローニング能力を
有する。そしてこれは、それらの種特異性および向性が容易に制御され得るその
ような方法に設計され得る。
【００４８】 本特許は、コロナウイルスの歴史においてはじめて、コロナウイルスのゲノム
をコードする全長の感染性のｃＤＮＡを得ることを可能にする方法の開発を記載
する。
【００４９】 コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする感染性のｃＤＮＡか
ら作成された、コロナウイルスに基づく異種核酸を発現させるための、新しいベ
クターまたはシステムが、開発されている。本発明の１つの特定の現実化におい
ては、コロナウイルスは、ブタの感染性の胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）である。
【００５０】 新しい発現システムが、基本的または応用研究において、例えば、目的（タン
パク質、酵素、抗体など）の産生を得るために、ワクチンのベクターとして、あ
るいは、ヒトおよび動物における遺伝子治療において、使用され得る。感染性の
ｃＤＮＡクローンから得られた感染性のコロナウイルスは、従来の遺伝子操作技
術によって操作され得、その結果、新しい遺伝子がコロナウイルスのゲノム中に
挿入され得、そしてその結果、これらの遺伝子は、免疫応答を誘導するためまた
は遺伝子治療のために、組織−および種−特異的様式で発現され得る。さらに、
発現は、新しい転写調節配列（ＴＲＳ）の選択によって最適化されており、これ
によって、数百倍以上に発現レベルを増大させることを可能にする。
【００５１】 コロナウイルス（特に、ＴＧＥＶ）に由来するベクターは、それらの中では複
製しない他の発現システムに関して、粘膜において免疫の誘導のためのいくつか
の利点を示す：（ｉ）ＴＧＥＶは、胃腸および呼吸器の粘膜に感染する（Ｅｎｊ
ｕａｎｅｓおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ、１９５５）、すなわち、分泌
性の免疫の誘導のための最適な部位；（ｉｉ）その向性が、Ｓ（スパイク）遺伝
子を改変することによって制御され得る（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、１９９７
）；（ｉｉｉ）相補性のウイルスに依存する発現のシステムの開発のための非病
原株が存在する（Ｓａｎｃｈｅｚら１９９２）；および（ｉｖ）コロナウイルス
が、中間体のＤＮＡ段階を通過することなく複製する細胞質性のＲＮＡであり（
ＬａｉおよびＣａｖａｎａｇｈ、１９９７）、これによって、その細胞性の染色
体への組込みを実際に不可能にする。
【００５２】 コロナウイルスのｇＲＮＡをコードするｃＤＮＡに由来する感染性のコロナウ
イルスを回収することを可能にした手順は、以下のストラテジーを含む： （ｉ）適切なプロモーターの制御下でのコロナウイルスのＲＮＡの発現； （ｉｉ）細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中へのコロナウイルスのＲＮＡのクローン
ニング； （ｉｉｉ）細菌に対して直接または間接的に毒性であるコロナウイルスのｃＤＮ
Ａの配列の同定； （ｉｖ）コロナウイルスの感染性のＲＮＡをコードするｃＤＮＡの成分（プロモ
ーター、転写終結配列、ポリアデニル化配列、リボザイムなど）の連結の正確な
順序の同定； （ｖ）一群の技術およびプロセスの同定（ＢＡＣの増殖、ＢＡＣ ＤＮＡの精製
プロセスに対する改変、形質転換技術などについての条件）、その組み合わせに
よって、ｃＤＮＡの感染性のコロナウイルスの効率的なレスキューを可能にする
。
【００５３】 プロモーターは、核内でのウイルスＲＮＡの発現を増大させることにおいて重
要な役割を果たす。ここで、これが合成され、その後、細胞質に輸送される。
【００５４】 ＢＡＣの使用は、本発明の手順の重要な点の１つを構成する。公知であるよう
に、細菌プラスミド中の真核生物配列のクローニングは、細菌について外因性で
ある配列の毒性に起因して、しばしば不可能である。これらの場合においては、
細菌は通常は、導入された配列を改変することによって毒性を排除する。それに
もかかわらず、この場合に続くストラテジーにおいては、これらのウイルス配列
の可能性のある毒性を回避するために、ＢＡＣ中のコロナウイルスの相補性ｃＤ
ＮＡを得るために、必須のクローニングが行われた。これらのプラスミドは、１
個の細胞あたり１個のみまたは最大２個のコピーで存在し、それらの毒性を相当
制限し、そしてプラスミド間での組換えの可能性を減少させる。
【００５５】 コロナウイルスの細菌毒性のｃＤＮＡの同定を通じて、コロナウイルスの完全
なゲノムをコードするｃＤＮＡの構築が、毒性の配列の排除を用いて完成させら
れ得る。これは、完全なゲノムの構築の最後の段階で、すなわち、それらの細菌
による改変を回避するために、真核生物中でのトランスフェクションの直前に、
付加される。
【００５６】 従って、本発明の１つの目的は、コロナウイルスのｇＲＮＡをコードする感染
性の２本鎖のｃＤＮＡクローン、ならびにそれを得るための手順から構成される
。
【００５７】 本発明のさらなる目的は、上記の感染性のクローンおよび上記の感染性のクロ
ーン中に挿入される異種核酸の配列を含む組換えウイルスベクターのセットから
構成される。
【００５８】 本発明のさらなる目的は、組換えコロナウイルスを産生するための方法から構
成される。この方法は、宿主細胞中へ上記の感染性のクローンを導入する工程、
感染性のクローンの複製を可能にする条件下で形質転換された細胞を培養する工
程、および組換えコロナウイルスを産生する工程、ならびに培養物から組換えコ
ロナウイルスを回収する工程を包含する。
【００５９】 本発明の別の目的は、改変された組換えコロナウイルスを産生するための方法
から構成される。この方法は、宿主細胞中に組換えウイルスベクターを導入する
工程、ウイルスベクターが複製することおよび産生された改変された組換えコロ
ナウイルスが産生されることを可能にする条件下でこれを培養する工程、ならび
に培養物から改変された組換えコロナウイルスを回収する工程を包含する。本発
明の別の目的は、異種ＤＮＡの配列の発現を可能にする条件下で、上記の組換え
ウイルスベクターを含有している宿主細胞を培養する工程を包含する、目的の産
物を産生するための方法から構成される。
【００６０】 上記の感染性のクローンまたは組換えウイルスベクターを含有している細胞は
、本発明の別の目的を構成する。
【００６１】 本発明の別の目的は、感染性の病原体によって引き起こされる感染に対して動
物を防御するワクチンのセットから構成される。これらのワクチンは、それぞれ
の感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗
原、または上記の感染性の病原体に対する防御を提供する少なくとも１つの抗体
を発現する感染性のベクターを、薬学的に受容可能な賦形剤とともに含む。ワク
チンは、ベクターが１つ以上の感染性の病原体に対する免疫応答を誘導し得る１
つ以上の抗原、あるいは、１つ以上の感染性の病原体に対する防御を提供する１
つ以上の抗体を発現するかどうかに依存して、一価または多価であり得る。
【００６２】 本発明によって提供される別の目的は、上記のワクチンの投与から構成される
、動物の免疫化の方法を含む。
【００６３】 本発明は、コロナウイルスの感染性のＲＮＡをコードするｃＤＮＡクローン（
従って、以下を含有している本発明の感染性のクローン）を提供する：（１）コ
ロナウイルスまたはウイルス自体の感染性のゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に対する
相補性ＤＮＡのコピー；および（２）最適化された転写促進配列を含む、さらな
る遺伝子についての発現モジュール。
【００６４】 本発明の１つの特定の実施態様においては、コロナウイルスは、クローンＣ１
１ ＴＧＥＶ単離物のＳ遺伝子、あるいはイヌまたはヒトのコロナウイルスのＳ
遺伝子による、このウイルスのＳ遺伝子の置換によって改変された、ＴＧＥＶ単
離物、特に、ＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物（Ｓａｎｃｈｅｚら１９９０）である。
【００６５】 転写を促進する配列（すなわち、プロモーター）は、それに対してウイルスの
ポリメラーゼＲＮＡが結合してメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を開始
する、コロナウイルスのそれぞれのメッセンジャーＲＮＡの５’−末端に配置さ
れたＲＮＡ配列である。特定のそして好ましい実施態様においては、ウイルスの
ゲノムは、ＣＭＶのＩＥプロモーターを使用してｃＤＮＡから発現される。これ
は、このプロモーターを使用して得られる発現の高いレベルに（Ｄｕｂｅｎｓｋ
ｙら、１９９６）、そしてＲＧＥＶコロナウイルスによって発現されるＲＮＡに
由来する大きな欠損ゲノム（９．７ｋｂおよび１５ｋｂ）が、それらが合成され
る核から細胞質へのそれらの輸送の間にスプライシングを受けないことを示す本
発明者らの研究室で得られた以前の結果に起因する。
【００６６】 本発明の欠損クローンはまた、ＢＧＨ遺伝子から来るような、転写終結配列お
よびポリアデニル化シグナルを含む。これらの終結配列は、ポリ（Ａ）テイルの
３’末端に配置された。１つの特定の実施態様においては、本発明の欠損クロー
ンは、２４個のＡ残基のポリ（Ａ）テイル、ならびにＨＤＶリボザイムの配列に
よるポリ（Ａ）テイルから分離されたＢＧＨの終結およびポリアデニル化配列を
含む。
【００６７】 ウイルスの感染性のｃＤＮＡがその中に挿入されているプラスミドは、複製起
点を保有しているＤＮＡ分子であり、そして従って、適切な細胞中で協力に複製
することが可能である。使用されるプラスミドは、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような適切な宿主細胞中で、本発明の感染性のクロー
ンを維持しそして増幅するためのレプリコンアダプターである。複製は、一般的
には、それを保有している細胞の選択を可能にする、抗生物質に対する耐性の遺
伝子を保有する（例えば、ｃａｔ）。
【００６８】 実施例１においては、ＣＭＶのＩＥプロモーターの制御下へのＴＧＥＶのクロ
ーンの構築が、記載される。ｃＤＮＡの３’末端に、２４ヌクレオチドのポリ（
Ａ）配列、ＨＤＶリボザイム、およびＢＧＨの転写終結配列が隣接させられるよ
うである。
【００６９】 本発明の感染性のクローンを得るための手順は、コロナウイルスのｇＲＮＡに
由来する全長のｃＤＮＡを構築する工程、および転写調節エレメントを連結する
工程を包含する。
【００７０】 コロナウイルスの感染性のｇＲＮＡをコードするｃＤＮＡは、ｃＤＮＡの安定
性を増大させる目的のために、ＢＡＣ中の適切なプロモーターの制御下にｃＤＮ
Ａとしてクローン化されたコロナウイルスに由来するＤＩゲノムから得られた。
ついで、細菌毒性の配列が同定され、そしてその毒性を排除する目的のために、
上記の毒性配列が除去され、そして完全なゲノムの構築の最後に、真核生物中で
のトランスフェクションの直前に、挿入された。ウイルスの子孫は、ウイルスの
複製をサポートする真核生物細胞中のコロナウイルスのゲノムを含む、ＢＡＣプ
ラスミドのトランスフェクションによって再構築され得る。
【００７１】 転写調節エレメントは、従来技術の手段によって連結される（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら、１９８９）。
【００７２】 本発明の感染性のクローンは、決定された活性をコードする異種核酸の少なく
とも１つの配列を、感染性のクローン中に存在しそして得られる発現ベクター中
に含まれる調節配列のプロモーターの制御化に挿入するために、従来の遺伝子操
作技術によって操作され得る。
【００７３】 本発明の感染性のクローンは、多数の適用を示す：例えば、これは、基礎的な
研究（例えば、コロナウイルスの複製および転写機構を研究するため）、および
応用的な研究（例えば、目的の産物（タンパク質、酵素、抗体など）の発現の効
率的なシステムの開発において）の両方において使用され得る。
【００７４】 適切な細胞が、本発明の感染性のｃＤＮＡクローンによって形質転換され、そ
してコロナウイルスの完全なゲノムを含有している得られたウイルス粒子が、回
収され得る。従って、本発明はさらに、組換えコロナウイルスを産生するための
方法を提供する。この方法は、宿主細胞中への本発明の感染性のｃＤＮＡの導入
、感染性のクローンの発現および複製を可能にする条件下での上記の細胞の培養
、ならびに、組換えコロナウイルス（これは、コロナウイルスの感染性のゲノム
を含む）から得られたウイルス粒子の回収を含む。本発明の感染性のクローンは
、種々の方法で（例えば、本発明の感染性のクローンからインビトロで転写され
たＲＮＡでの宿主細胞のトランスフェクションによって、または本発明の感染性
のｃＤＮＡクローンからインビトロで転写されたＲＮＡでの宿主細胞のトランス
フェクションによって）宿主細胞中に導入され得る。本発明の感染性クローンを
含む上記の宿主細胞は、本発明のさらなる目的を構成する。
【００７５】 本発明はまた、本発明の感染性のクローンに由来する組換えウイルスベクター
のセットを提供する。従って、本発明のウイルスベクターは、上記の異種核酸が
発現されることを可能にする条件下で、上記の感染性のクローン中に挿入された
異種核酸を含むように改変された、本発明の感染性のｃＤＮＡクローンを含む。
【００７６】 用語「核酸」は、それが本明細書中で使用される場合には、遺伝子または遺伝
子フラグメントを含み、そして一般的にはＤＮＡまたはＲＮＡの分子である。
【００７７】 本明細書中で使用される意味においては、核酸について適用される用語「異種
」は、宿主細胞中に異種核酸を導入するために使用される、ベクター中には通常
は存在しない核酸をいう。
【００７８】 本発明のウイルスベクターを含み得る異種核酸は、目的のタンパク質、ペプチ
ド、エピトープ、または任意の遺伝子産物（例えば、抗体、酵素など）をコード
する遺伝子またはフラグメントであり得る。異種核酸は、ｃＤＮＡの任意の適切
な領域中に（例えば、ＯＲＦ １ｂの後ろ、または遺伝子Ｎと７との間、開始コ
ドン（ＡＵＧ）の後ろ）、そして遺伝子を有するリーディングフレーム中に：ま
たは、あるいは、他のＯＲＦに対応している領域中に）従来の遺伝子操作技術の
手段によって、本発明の感染性のクローン中に挿入され得る。本発明のウイルス
ベクターの構築においては、異種核酸の挿入が、任意の基本的なウイルス機能を
妨害しないことが、不可欠である。
【００７９】 本発明のウイルスベクターは、１つ以上の活性を発現し得る。この後者の場合
においては、ウイルスベクターは、１つもしくは数個のプロモーターに先行して
、またはプロモーターもしくは種々のリボザイム認識部位（ＩＲＥＳ、内部リボ
ザイム進入部位）によって、または種々のプロモーターおよびリボザイム認識部
位によって、発現される活性のような、異種核酸の多くの配列として、含む。
【００８０】 従って、本発明は、目的の産物を産生するための方法を提供する。この方法は
、異種核酸が発現されることが可能である条件下で、本発明のウイルスベクター
を含む宿主細胞を培養する工程、および目的の産物の回収を包含する。本発明の
ウイルスベクターを含有している上記の宿主細胞は、本発明のさらなる目的を構
成する。
【００８１】 本発明のウイルスベクターは、その種特異性および向性が、容易に制御され得
るように設計され得る。これらの特徴に起因して、本発明のウイルスベクターの
非常に興味深い適用は、目的の遺伝子のベクターとしての、または種々の病原体
に対する免疫応答を誘導するためのワクチン用ベクターとしての、それらの使用
である。
【００８２】 本発明はさらに、以下を含有する、感染性の病原体によって引き起こされる感
染に対して、動物を防御し得るワクチンを提供する：（ｉ）上記の感染性の病原
体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくとも１つの抗原、または上記
の感染性の病原体に対する防御を提供する抗体を必要に応じて、以下とともに（
ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤。
【００８３】 本明細書中で使用される意味においては、「防御を誘導する」は、細胞性の応
答を強化する物質（インターロイキン、インターフェロンなど）、細胞性の壊死
因子、および感染性の病原体によって引き起こされる感染から動物を防御する同
様の物質によて誘導されるような適切な機構を通じて、本発明のウイルスベクタ
ーによって誘導される受容している生物体（免疫化された動物）の免疫応答とし
て、理解されるはずである。
【００８４】 用語「動物」には、任意の種の全ての動物（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物
）である。
【００８５】 「感染性の病原体」は、本明細書中で使用される意味においては、任意のウイ
ルス、真菌、寄生虫、または動物に感染し得そして病気を引き起こし得る他の感
染性因子を含む。
【００８６】 １つの特定の実施態様においては、本発明によって提供されるワクチンは、呼
吸器および胃腸粘膜において増殖する種々の感染性の病原体に対して、全身性の
免疫応答および／または粘膜中の免疫応答を誘導し得る、少なくとも１つの抗原
を発現する、１つ以上の本発明のウイルスベクターを含む。本発明のベクターは
、粘膜における免疫および乳腺刺激性の免疫を誘導するためにきわめて適切であ
り、これは、胃腸管の感染に対して新生児を防御することにおける特異的な目的
である。
【００８７】 別の特定の実施態様においては、本発明によって提供されるワクチンは、感染
性の病原体に対して防御する、任意のイソ型抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡなど
）の軽鎖および重鎖をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する、本発明の
少なくとも１つのウイルスベクターを含む。
【００８８】 種特異性は、ウイルスベクターが、対応している種の細胞性の応答によって認
識されるために適切である、所望される種（ヒト、イヌ、ネコ、ブタなど）に感
染するコロナウイルスのエンベロープのＳタンパク質を発現し得るように、制御
され得る。
【００８９】 本発明によって提供されるワクチンは、本発明のウイルスベクターが、１つ以
上の感染性の病原体に対して免疫応答を誘導し得る１つ以上の抗原、または１つ
以上の感染性の病原体に対して防御を提供する１つ以上の抗体を発現するかどう
かに依存して、一価または多価であり得る。
【００９０】 本発明の特定の実施態様においては、種々の感染性のヒト、ブタ、イヌ、およ
びネコの因子に対してヒト、ブタ、イヌ、およびネコを防御し得る、そして向性
が、所望される種特異性を有するコロナウイルスのＳ−糖タンパク質を発現する
ことによって制御される、一価のワクチンが提供される。
【００９１】 ブタの感染性の病原体に対する一価のワクチンは、以下のブタの病原体の抗原
から本質的に構成される群より選択される抗原：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉ
ｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、ブタパルボウイルス、Ｌｅｐ
ｔｏｓｐｉｒａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒ
ｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉ
ｄａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ ｈｙｄｉｏｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｉａｅ、ブタの表皮下痢ウイルス（ＰＥ
ＤＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス、ロタウイルス、または、以下を引き起こす
病原体に対する抗原：ブタの呼吸器および生殖系の症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒ
ｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ
）、Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ症候群（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）、ブタのインフ
ルエンザ、または伝染性の胃腸炎、および萎縮性の鼻炎の原因論的な因子、およ
び増殖性の回腸炎を発現するベクターを含み得る。イヌの感染性の病原体に対す
る一価のワクチンは、以下のイヌの病原体の抗原から本質的に構成される群から
選択される抗原を発現する、発現ベクターを含み得る：イヌのヘルペスウイルス
、１型および２型のイヌのアデノウイルス、１型および２型のイヌのパルボウイ
ルス、イヌのレオウイルス、イヌのロタウイルス、イヌのコロナウイルス、イヌ
のパラインフルエンザウイルス、イヌのインフルエンザウイルス、ジステンパー
ウイルス、狂犬病ウイルス、レトロウイルス、およびイヌのカルシウイルス。
【００９２】 ネコの感染性の病原体に対する一価のワクチンは、以下のネコの病原体の抗原
から本質的に構成される群から選択される抗原を発現する発現ベクターを含み得
る：ネコカルシウイルス、ネコの免疫不全ウイルス、ネコのヘルペスウイルス、
ネコの全白血球減少症ウイルス、ネコのレオウイルス、ネコのロタウイルス、ネ
コのコロナウイルス、ネコの感染性の腹膜炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコの
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、およびネコ白血病ウイルス。
【００９３】 ベクターは、感染性の病原体（例えば、上記に記載されているもののような、
ブタ、イヌ、またはネコの感染性の病原体）に対する防御を提供する抗体を発現
し得る。１つの特定の実施態様においては、ベクターは、６Ａ．Ｃ３として同定
された組換えのモノクローナル抗体を発現する。これは、ＴＧＥＶを中和し、Ｉ
ｇＧ１またはＩｇＡを用いて発現され、ここでは、イムノグロブリンの定常部分
は、ブタの起源、またはヒトおよびブタのロタウイルスについての中和抗体であ
る。
【００９４】 賦形剤として、生理食塩水または他の同様の生理的な溶液のような希釈剤が、
使用され得る。同様に、これらのワクチンはまた、水性のワクチン（例えば、水
酸化アルミニウム、ＱｕｉｌＡ、アルミナゲルなど）、ならびにミネラルオイル
、グリセリド、脂肪酸誘導体、およびそれらの混合物に基づく油性のワクチンの
、両方の処方物中で通常使用されるものに由来するアジュバントを含み得る。
【００９５】 本発明のワクチンはまた、細胞応答を増強する（ＣＲＰ）物質、すなわち、ヘ
ルパーＴ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）のサブ集団を強化する物質（例えば、イン
ターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−１２、γ−ＩＦＮ（γ−インターフェロン）、細胞性の壊死因子、およびワ
クチン接種された動物において細胞性の免疫を理論的に誘発し得る同様の物質を
もまた、含み得る。これらのＣＲＰ物質は、水性または油性のアジュバントを有
するワクチン処方物中で使用され得る。細胞性の応答を調節しそして免疫刺激す
る別のタイプのアジュバントもまた、使用され得る（例えば、ＭＤＰ（ムラミル
ジペプチド）、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、またはリポソーム）。
【００９６】 本発明は、種々の感染性の病原体によって引き起こされる感染から動物を予防
および防御し得る、多価のワクチンを提供する。これらの多価のワクチンは、対
応する抗原をコードする種々の配列が同じ組換えベクター中に挿入されている、
本発明のウイルスベクターから、あるいは、結合の接種のために後に混合される
依存性の組換えベクターを構築することによって、調製され得る。従って、これ
らの多価ワクチンは、１つ以上の抗原をコードする異種核酸、またはあるいは、
種々のウイルスベクター（それらのそれぞれが、少なくとも１つの異なる抗原を
発現する）を含むウイルスベクターを含む。
【００９７】 同様に、多価のベクターを含有している多価のワクチンは、抗原をコードする
配列の代わりに感染性の病原体に対して防御する抗体をコードする配列を使用し
て調製され得る。
【００９８】 本発明の１つの特定の実施態様においては、種々のブタ、イヌ、およびネコの
感染性病原体に対して、ヒト、ブタ、イヌ、およびネコを免疫化し得るワクチン
が、提供される。これについて、ワクチン中に含まれるウイルスベクターは、上
記のヒト、ブタ、イヌ、またはネコの病原体、あるいは他のものを発現しなけれ
ばならない。
【００９９】 本発明のワクチンは、液体または凍結乾燥させられた形態で存在し得、そして
賦形剤中で組換えシステムを懸濁することによって調製され得る。上記のシステ
ムが、凍結乾燥させられた形態である場合には、賦形剤自体は、再構成物質であ
り得る。
【０１００】 あるいは、本発明によって提供されるワクチンが、それらの形成部分、または
他の従来のもしくは組換えワクチンで希釈される希釈剤または凍結乾燥させられ
た画分としてのいずれかで、他の従来のワクチンと組み合わせて使用され得る。
【０１０１】 本発明によって提供されるワクチンは、動物に経口によって、鼻腔から、皮下
で、経皮的に、腹膜内で、粘膜内で、または吸入によって、投与され得る。
【０１０２】 本発明はまた、動物（特に、ブタ、イヌ、およびネコ）の１つ以上の感染性の
病原体に対して同時の免疫化のための方法を提供する。この方法は、本発明によ
って提供される組換えシステムの免疫学的に有効量を含むワクチンの、経口によ
る、鼻腔から、皮下での、皮内、腹膜内、筋肉内、または吸入による投与（また
はそれらの組み合わせ）を含む。
【０１０３】 さらに、本発明は、上記の動物を感染させる感染性の病原体に対する新生児の
動物を防御するための方法を提供する。この方法は、妊娠期間の前またはその間
での母体、あるいは、子孫に対する、本発明によって提供されるもののワクチン
の、経口による、鼻腔から、皮下での、皮内、腹膜内、筋肉内、または吸入によ
る投与（またはそれらの組み合わせ）から構成される。
【０１０４】
【実施例】
本発明は、以下の実施例によって説明される。これは、感染性のクローンを得
ることおよび本発明のウイルスベクターの構築を詳細に記載する。これらの実施
例は、本発明の範囲を限定するようには考えられないが、しかし、それらを説明
すると考えられる。上記の実施例においては、細菌の形質転換および増殖、ＤＮ
Ａ複製、配列分析、ならびにプラスミドの安定性を評価するためのアッセイは、
以下に記載される方法論に従って行われた。
【０１０５】 細菌の形質転換 全てのプラスミドが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中
にエレクトロポレーションされ、これによって以前に記載されたプロトコール（
Ｓｈｉｚｕｙａら、１９９２）に対してわずかな改変を導入する。それぞれの形
質転換のために、２μＬの連結物および５０μＬのコンピテント細胞を、０．２
ｃｍの皿（ＢｉｏＲａｄ）中で混合され、そして２００Ω、２．５ｋＶ、および
２５μＦでエレクトロポレーションされた。次いで、１ｍＬのＳＯＣ培地（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、１９８９）が、それぞれの形質転換体に添加され、細胞が３７
℃で４５分間インキュベートされ、そして最後に、組換えコロニーが、１２．５
μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有するＬＢ ＳＯＣ培地（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら、１９８９）上で検出された。
【０１０６】 細菌の増殖条件 もともともプラスミドを含有している細菌（その中のＴＧＥＶの不完全なゲノ
ムがクローン化された）が、３７℃で増殖させられ、これは、正常な増殖速度論
を示す。一方、完全なｃＤＮＡ含むＢＡＣは、可能な限り不安定性を最小にする
目的のために、３０℃で増殖させられた。なお、コロニーの大きさは、減少させ
られ、そして２４時間までのインキュベーション時間が、正常なコロニーの大き
さを達成するために必要であった。
【０１０７】 ＤＮＡの精製 Ｗｏｏ（Ｗｏｏら、１９９４）によって記載されているプロトコールは、わず
かな改変を有して、以下の通りであった。単一のコロニーから、４ＬのＬＢが、
クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍＬ）とともに接種された。１８℃で３
０時間のインキュベーション時間の後、細菌が、６，０００Ｇでの遠心分離によ
って回収され、そしてプラスミドが、製造業者の推奨に従って、Ｑｉａｇｅｎ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｕｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓキットを使用して精製され
た。この手順によって、得られたプラスミドＤＮＡが細菌のＤＮＡを混入してい
ることを観察した。混入している細菌のＤＮＡを排除するために、プラスミドＤ
ＮＡが、ＣｓＣｌ勾配上での１６時間の５５，０００ｒｐｍでの遠心分離の手段
によって精製された。得られた収量は、プラスミドの大きさに依存して、１５か
ら３０μｇ／Ｌの間であった。
【０１０８】 配列分析 ＤＮＡは、蛍光色素マークされたジデオキシヌクレオチドと、耐熱性ポリメラ
ーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動配列決定装置（３７３ Ｄ
ＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で配列
決定された。試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃｏｍｐａｎｙ
によるキット（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃ
ｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）の方法に
よって得られた。配列決定反応を行うために使用されたサーマルサイクラーは、
「ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ）であった。
【０１０９】 配列の連結およびＴＧＥＶのコンセンサス配列とのそれらの比較が、ＳｅｑＭ
ａｎ ＩＩ ａｎｄ Ａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡ）プログラムを使用して、それ
ぞれ行われた。コンセンサス配列中には差異は検出されなかった。
【０１１０】 プラスミドの安定性 もともとのグリセロレートから、組換えのｐＢｅｌｏＢＡＣ１７プラスミドを
含有している細菌が、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）を有する２
０ｍＬのＬＢ中で３０℃及び３７℃で１６時間増殖させられた。この材料は、継
代０と考えれらた。細菌は、１０６倍に希釈され、そして１６時間の間、３０℃
および３７℃で増殖させられた。連続的な継代が、連続する８日間の間に実現さ
れた（それぞれの継代が、約２０世代を示す）。プラスミドＤＮＡが、継代０お
よび８（１６０世代）でＭｉｎｉｐｒｅｐによって精製され、そして制限ヌクレ
オチドを用いて分析された。ＴＧＥＶのゲノムの一部を含む２つのプラスミドが
、高度に安定であり、それにもかかわらず、ＴＧＥＶの完全なゲノムを含むプラ
スミドは４０世代の後で、一定の不安定性を示した（この時点で、ＤＮＡの約８
０％が、正確な制限パターンを示した）。
【０１１１】 [実施例１] ＴＧＥＶに由来する感染性のｃＤＮＡのクローンに基づく組換えベ
クターの構築 １．１ ＴＧＥＶの感染性のｃＤＮＡの生成 完全なＴＧＥＶゲノムをコードするｃＤＮＡを得る目的のために、本発明者ら
は、最初に、欠損ＤＩ−ＣゲノムをコードするｃＤＮＡを用いて開始した（Ｍｅ
ｎｄｅｚら、１９９６）。ＴＧＥＶゲノムの約３分の１の長さを有するこのｃＤ
ＮＡを、低コピーのｐＡＣＮＲ１１８０プラスミド（Ｒｕｇｇｌｉら、１９９６
）中にクローン化し、そしてその配列を決定した。欠損ゲノムをコードするｃＤ
ＮＡが、相補性ウイルスの助けを用いて、効率的にレスキューされた（複製され
、そしてパッケージされた）（Ｍｅｎｄｅｚら、１９９６；Ｉｚｅｔａら、１９
９９）。
【０１１２】 ＤＩ−Ｃゲノムには、約１０、１、および８キロベース（ｋｂ）の３つの欠損
（Δ１、Δ２、およびΔ３）が、ＯＲＦ １ａ、１ｂ、そして遺伝子Ｓおよび７
の間にそれぞれ存在する（図１を参照のこと）。以下の感染性のＴＧＥＶゲノム
をコードするｃＤＮＡの配列を完成させるためのストラテジーは、段階的に、Ｄ
Ｉ−Ｃゲノム中の欠失させられた配列を段階的に取りこむこと、新しく作成され
た構築物の細菌毒性を分析することであった。この局面は非常に重要である。な
ぜなら、ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡを提示する組換えプラスミドが一般的にはあ
まり増殖せず、そして不安定であることが文献において広く記載されているから
である（ＢｏｙｅｒおよびＨａｅｎｎｉ、１９９４；Ｒｉｃｅら、１９８９；Ｍ
ａｎｄｌら、１９９７）。
【０１１３】 完成させられる第１の欠失は、ＯＲＦ １ｂの１ｋｂの欠失Δ２であり、これ
によって安定な組換えプラスミドを生じた。ＯＲＦ １ａを欠失している配列が
、ｃＤＮＡフラグメントＡ、Ｂ、Ｃ，およびＤ（図１）を、レプリカーゼの遺伝
子について必要とされる全ての情報が完成させられるそのような方法によって、
クローニングすることによって導入された（Ａｌｍａｚａｎら、２０００）。得
られた組換えプラスミドは、細菌中では不安定であり、これによって、フラグメ
ントＢ中に取りこまれた付加および欠失を有する新しいプラスミドを作成した（
Ａｌｍａｚａｎら、２０００）。興味深いことに、ヌクレオチド４，４１７から
９，６１５の間を含むゲノムの領域を含む５，１９８ｂｐのＣｌａＩ−ＣｌａＩ
制限酵素切断断片の排除（Ｐｅｎｚｅｓら、１９９９）によって、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ１０Ｂ株中で比較的安定なプラスミドを生じた。後者は、欠失Δ３の配列
が、ＴＧＥＶゲのゲノムの３’末端の構造または非構造タンパク質についての全
ての遺伝子情報をクローニングすることによって付加した（図１）。
【０１１４】 ＴＧＥＶ ｃＤＮＡの安定性を増大させる目的のためには、これがｐＢｅｌ−
ｐＢＡＣ１１プラスミド（Ｋｉｍら、１９９２）を使用してＢＡＣ中にサブクロ
ーン化されると決定した（図２を参照のこと）。ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１プラスミ
ドを、Ｈ．ＳｈｉｚｕｙａおよびＭ．ｓｉｍｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から懇意によって譲りうけた。
７，５０７ｂｐの大きさのプラスミドは、ｐａｒＢ、ｐａｒＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ（
ｏｒｉＳ）に由来するＦ因子の複製起点、および１個の細胞あたり単一のプラス
ミドコピーを維持するために必要な遺伝子（ｐａｒＡおよびｒｅｐＥ）を含む。
プラスミドはまた、選択マーカーとしてクロラムフェニコールに対する耐性の遺
伝子（ｃａｔ）を示す。ｃＤＮＡを、このプロモーターを使用して得られる高い
レベルの発現（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、１９９６）、そしてＲＧＥＶコロナウイル
スによって発現されるＲＮＡに由来する大きな欠損ゲノム（９．７ｋｂおよび１
５ｋｂ）が、それらが合成される核から細胞質へのそれらの輸送の間にスプライ
シングを受けないことを示す本発明者らの研究室で得られた以前の結果（Ｉｚｅ
ｔａら、１９９９；Ｐｅｎｚｅｓら、１９９９；Ａｌｍａｚａｎら、２０００）
に起因して、ＣＭＶのＩＥプロモーターの制御下にクローン化された。作成され
たＴＧＥＶ ｃＤＮＡ（ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩ）は、５，１９８ｂ
ｐのＣｌａＩフラグメントを除くレプリカーゼの遺伝子についての情報、および
構造および非構造タンパク質の全ての情報を含んだ。ｃＤＮＡの３’末端には、
２４ヌクレオチドのポリＡ配列、ＨＤＶのリボザイム、およびＢＧＨの転写終結
配列が隣接している（Ｉｚｅｔａら、１９９９）。一方、ＴＧＥＶの完全なゲノ
ムを作成するために必要なＣｌａＩフラグメントを、ＢＡＣ中にクローン化し、
それによってプラスミドｐＢＡＣ−Ｂ＋Ｃ＋Ｄ５’を作成した。これは、４，３
１０から９，７５８の間のＴＧＥＶゲノムの領域を含んだ（図３を参照のこと）
。両方のプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株中で増殖させ、そしてそれ
らの全体を配列決定した。得れらた配列は、ヌクレオチド６，７５２（Ａ→Ｇ、
サイレント）および１８，９９７（Ｔ→Ｃ、サイレント）の位置での２つの置換
、ならびに単離物Ｃ１１のＤ遺伝子によって置換されているＰＲＵ４６−ＭＡＤ
のＳ遺伝子中での変化を除いて、本明細書の最後に提供するＴＧＥＶのＰＲＵ４
６−ＭＡＤ単離物（配列番号１）のコンセント配列と同一であった（これらの変
化は、図４に示される）。
【０１１５】 さらに、感染性のＴＧＥＶをコードするｃＤＮＡを作成する目的のために、Ｐ
ＵＲ４６−ＭＡＤのＳ遺伝子（これは、呼吸管で高いレベル（＞１０６ＰＦＵ／
ｇ組織）で、そして胃腸管中で低いレベル（＜１０３ＰＦＵ／ｍＬ）で複製する
）を、ＴＧＥＶクローンＣ１１（従って、Ｃ１１）のＳ遺伝子によって完全に置
き換えた。これは、呼吸管（＞１０６ＰＦＵ／ｇ組織）および胃腸管（＜１０６ ＰＦＵ／ｍＬ）の両方で上昇した力価で複製する（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９
）。Ｃ１１のＳ遺伝子は、ＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物のＳｉｄｅｎｎｓｉとは異
なる１４個のヌクレオチドを示し、そしてＳ遺伝子の５’末端で６ｎｔの挿入を
示す（図４を参照のこと）（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）。本発明者らの研究
室での以前の結果（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）は、指向された組換えによっ
て作成された変異体（ＴＧＥＶのＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物のＳ遺伝子がＣ１１
腸内単離物のＳ遺伝子で置き換えられた）が、感染したブタの胃腸管中でわずか
に複製するかまたは全く複製しないＴＧＥＶの天然のＰＲＵ４６‐ＭＡＤ単離物
とは異なる、腸内向性および増大した感染性を獲得したことを示した。
【０１１６】 ｃＤＮＡを、完全なＴＧＥＶゲノムをコードするｃＤＮＡを含むｐＢＡＣ−Ｔ
ｃＤＮＡＦＬプラスミドを作成するために、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩ プラスミド中に、ｐＢＡＣ−Ｂ＋Ｃ＋Ｄ５’から得た５，１９８ｂｐのＣｌａＩ
−ＣｌａＩフラグメントのクローニングの手段によって、腸内単離物Ｃ１１のＳ
遺伝子を用いてＴＧＥＶのＰＵＲ４６‐ＭＡＤ単離物から構築した（図３）。
【０１１７】 感染性のｃＤＮＡ（ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩおよびｐＢＡＣ−Ｃｌ
ａＩＺ）、ならびに、完全なｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ ＦＬ ）のクローンの構築に使用したプラスミドの細菌中での安定性を、１６０の
世代についてＥ．ｃｏｌｉ中での増殖の後で分析した。安定性を、精製したＤＮ
Ａの制限酵素での消化の手段によって分析した。欠失または挿入は検出されなか
ったが、使用した分析技術によっては検出されない主要ではない変化の存在は、
ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡ−ΔＣｌａＩおよびｐＢＡＣ−Ｂ＋Ｃ＋Ｄ５’プラスミド
の場合においては除外することができなかた。ｐＢＡＣ‐ＴｃＤＮＡプラスミド
（これは、完全なＴＧＥＶのゲノムを含む）の場合においては、一定の不安定性
が、４０の世代の後で検出された（この時点で、ＤＮＡの約８０％が、正確な制
限パターンを示した）。しかし、このわずかな不安定性は、感染性のウイルスの
レスキューについての障害は示さない。なぜなら、２０世代（４Ｌの培養物）の
細菌の増殖が、ウイルスレスキューがされることを可能にするプラスミドＤＮＡ
の量を作成するためには充分であるからである。
【０１１８】 １．２ 完全なゲノムをコードするｃＤＮＡに由来する感染性のＴＧＥＶのレス
キュー ＳＴ細胞を、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドを用いてトランスフェクト
した。トランスフェクションの４８時間後に、培養物の上清を回収し、そして６
回、ＳＴ細胞に継代させた（図５を参照のこと）。継代２で開始して、感染の１
４時間で、細胞変性効果が現れ、これは感染後２０時間まで延長され、実際にこ
れらの細胞の全てが単層を形成するまで、延長された（図６を参照のこと）。一
方、レスキューされたウイルスの力価は、継代とともに迅速に増大し、継代３で
１０８ＰＦＵ／ｍＬの桁の値に到達する。実験を、５回繰り返し、そしてその全
ての場合において、同様の力価を有する感染性のウイルスを回収したが、それに
もかかわらず、トランスフェクトしていないＳＴ細胞または同様のプラスミド（
ここでは、ＣｌａＩ−ＣｌａＩフラグメントが反対の方向で見られた）でトラン
スフェクトしたＳＴ細胞の場合には、ウイルスは全く回収されなかった。
【０１１９】 得られたウイルスが混入の産物である可能性を排除する目的のために、６，７
５２および１８，９９７の位置での配列を、鋳型としてレスキューされたウイル
スのゲノムＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅したｃＤＮＡフラグメン
トの配列決定の手段によって、決定した。配列に分析によって、６，７５２およ
び１８，９９７の位置のヌクレオチドがｃＤＮＡ中に存在するものであることを
決定した。さらに、レスキューされたウイルスは、Ｃ１１のＳ遺伝子について予
想されるように、Ｓ遺伝子のｃＤＮＡ配列中に、２０，９９０の位置で制限部位
ＤｒａＩＩＩを示した（図８）。これらの３個のゲノムマーカーの存在によって
、単離したウイルスがｃＤＮＡから来たことを確認した。
【０１２０】 作成されたウイルスのさらに深い特徴付けにおいて、比較分析を、ｐＢＡＣ−
ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドでのトランスフェクションの後に回収したウイルス（
ＴｃＤＮＡ）で感染させた細胞、またはＴＧＥＶのＰＲＵ４６‐ＭＡＤ単離物で
感染させた細胞の免疫蛍光によって行った。これについては、Ｃ１１単離物およ
びＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物の両方を認識する特異的なポリクローナルおよびモ
ノクローナル抗体、または後者のみを（図６Ａ．Ｃ３を参照のこと）、そしてＴ
ｃＤＮＡおよびＰＵＲ４６−ＭＡＤの両方を認識するＭ（３Ｂ．Ｂ３）およびＮ
（３Ｂ．Ｄ８）タンパク質の特異的なモノクローナル抗体を、使用した。得られ
たデータは、作成したウイルスが、ＰＵＲ４６−ＭＡＤのＭおよびＮタンパク質
を提示し、そしてもともとのｃＤＮＡにおいて設計されたような、Ｃ１１単離物
のＳタンパク質を提示したことを示した。
【０１２１】 １．３ インビボでの感染性および伝染性 ＴｃＤＮＡウイルスのインビボでの感染性を分析する目的のために、５匹の新
生児のブタのグループに、継代６に由来するウイルスのクローンを接種し、そし
て死亡率を分析した。５匹の接種したブタは、接種後３から４日で死亡した。こ
のことは、ＴｃＤＮＡウイルスが感染性であることを示す。対照的に、ウイルス
の希釈液のみを接種しそして同じ条件下で維持した２匹のブタは、変化を受けな
いままであった。
【０１２２】 １．４ 転写調節配列の改変による発現のレベルの最適化 コロナウイルス中のＲＮＡ合成を、ＲＮＡ依存性のプロセスの手段によって行
った。ここでは、ｍＲＮＡを、負の極性を有する鋳型から転写した。ＴＧＥＶに
おいては、保存されたコンセンサス配列であるＣＵＡＡＡＣが見られる。これは
、遺伝子の大部分のすぐ前に配置される。これらの配列は、サブゲノムｍＲＮＡ
の転写のためのシグナルを示す。コロナウイルスにおいては、コロナウイルスの
タイプおよび宿主のタイプに依存して変更可能な長さを有する、６から８個の間
のｍＲＮＡが存在する。最大のものは、ゲノムＲＮＡに対応し、これは次いで、
ＯＲＦ １ａおよび１ｂのｍＲＮＡとして機能する。ｍＲＮＡの残りは、サブゲ
ノムｍＲＮＡに対応した。これらのＲＮＡを、大きさの増大に伴ってｍＲＮＡ１
から７と命名した。一方、最初に記載されたｍＲＮＡのセットが対応するｍＲＮ
Ａの名称とともに命名された後で発見されたいくつかのｍＲＮＡを、ダッシュお
よび数字を用いて、例えば、ｍＲＮＡ２−１と命名した。ｍＲＮＡは、ゲノムＲ
ＮＡの構造に関係する両辺共有の（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）構造を示す。最小の
ｍＲＮＡを除いて、残りは構造的にポリシストロニック（ｐｏｌｙｃｙｓｔｒｏ
ｎｉｃ）であるが、一般的には、５’にもっとも近く配置されたものだけが翻訳
される。
【０１２３】 マーカー遺伝子（ＧＵＳ）の発現の効率を、内部（ＩＧ）配列ＣＵＡＡＡＣ（
図１１）、ＩＧ配列の３’末端に隣接している種々の配列（図１２）、および種
々の挿入部位（図１３）の５’末端に隣接している種々の配列を使用して実験し
た。得られた結果（図１１から１３）は、最適な発現が、以下からなるＴＲＳを
用いて達成されたことを示した：（ｉ）ＴＧＥＶのＮ遺伝子のコンセント配列に
隣接している−８８ヌクレオチド；（ｉｉ）ＩＧ配列；および（ｉｉｉ）Ｓ遺伝
子のＩＧ配列の３’隣接配列。さらに、異種遺伝子の挿入の点との関係において
得られた結果と一致して、最大の発現レベルは、異種遺伝子がゲノムの３’末端
に配置された場合に達成された。記載されているようなＴＲＳは、ＧＵＳが１０ ６ 個の細胞あたり２から８μｇのレベルで発現されることを可能にする。
【０１２４】 １．５ 発現システムの組織特異性 多くの病原体は、粘膜を通じて宿主中に進入する。このタイプの感染を防ぐた
めには、高レベルの分泌免疫の誘導を可能にする発現システムを開発することが
重要である。これは、呼吸管および腸管に関係しているリンパ節中への抗原の投
与を通じて、基本的には達成され得る。この目的を達成するために、そして一般
的には、目的の組織で遺伝子の発現を指向するために、ＴＧＥＶの向性の分子基
準を実験した。これらの実験は、ＴＧＥＶの組織特異性が、所望される向性を有
するコロナウイルスのＳ遺伝子を含有している組換えウイルスの構築によって改
変され得る（Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、１９９７；Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９
９）。この情報によって、呼吸器または腸内向性を有するコロナウイルスのｃＤ
ＮＡゲノムに基づく発現システムを構築することを可能にする。
【０１２５】 １．６ 感染性のｃＤＮＡを使用するＰＲＲＳＶのＯＲＦ５によってコードされ
るウイルス抗原の発現 異種遺伝子の発現のレベルを最適化する目的のために、構築物を、ベクター中
にＴＲＳおよび異種遺伝子の交換を促進する配列をクローニングすることによっ
て隣接させられた、内部交換が可能なモジュールのベクターから作成した。ウイ
ルスのヌクレオカプシド（Ｎ）の遺伝子に隣接している−８８ヌクレオチドに先
行する最小のＩＧＳコンセンサス配列（ＣＵＡＡＣ）およびＫｏｚａｋ（ＡＣ）
ＧＡＣＣのものと同様の配列によって、５’末端で隣接されたＰＲＲＳＶ（ブタ
の呼吸器および生殖系の症候群ウイルス）は、最適な発現（約１０μｇ／１０６ 個の細胞）を生じた。原理的には、異種遺伝子のこれらの発現レベルは、免疫応
答を誘導するために充分であるものを上回る。異種遺伝子を、重要ではないウイ
ルスの遺伝子３ａおよび３ｂによって以前に占有されていた部位に挿入した。
【０１２６】 １．７ ｃＤＮＡに由来するウイルスベクターを用いて発現させた抗原に対する
、ブタ中での免疫応答の誘導 ｃＤＮＡおよび上記のＴＲＳに由来するウイルスベクターの同じタイプを使用
して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、高いレベル（ブタ
の睾丸（ＳＴ）細胞中の１００万個の細胞あたり２０μｇのタンパク質）で発現
させた。発現レベルは、細胞培養物中で２０未満の継代について安定であった。
さらに、ブタのセットを、生存しているウイルスベクターを用いて免疫した。こ
れを、経口、鼻腔内で、および胃腸管の経路によって投与した。そして強力な体
液性の免疫応答を、ウイルスベクターおよびＧＦＰの両方に対して検出した。興
味深いことに、副作用は、ウイルスベクターの３回の用量の投与の後には、接種
した動物中では観察されなかった。
【０１２７】 １．８ 感染性のウイルスの作成を導く外来遺伝子を発現する安全なウイルスベ
クターの構築 ヒトについてのベクターを設計するためには、生体安全性が最優先事項である
。この目的を達成するために、３つのタイプの安全性の保護がベクター中で操作
される。これらのうちの２つは、２つのウイルス成分の欠損に基づく。これらは
、ウイルスの複製のために不可欠であるウイルスゲノムの種々の位置にマップさ
れる。これらの成分はパッケージング細胞株によってトランスで提供される。こ
の細胞（ベビーハムスター腎臓、ＢＨＫ）は、ウイルスの必須の構造タンパク質
（エンベロープＥおよび膜Ｍタンパク質）をコードする欠失ＴＧＥＶ遺伝子を発
現する。第３の安全性の保護は、組換えによる感染性のウイルスの回収が妨げら
れ、それによって異種遺伝子の効率的に発現するが最も近い細胞に対してもなお
増殖することを不可能にする、自殺ベクターの生成を導く方法におけるような、
ウイルスゲノムのパッケージングシグナルの再配置である。
【０１２８】 ヒトでの使用のための新しいベクターの設計を用いて、本発明者らは、ヒト種
内で増殖させられ得る新しいウイルスを産生することはできない。なぜなら、こ
のベクターは、ヒトにおいて細胞から細胞には伝達され得ないからである。ベク
ターは、複製欠損ウイルスに基づく。これは、ウイルスの欠損を相補するパッケ
ージング細胞を使用することによってワクチン工場でのみ増殖し得る。これらの
安全性の保護は、コロナウイルスの操作における新規の手順を示す。新しい向性
を有する組換えウイルスは、ネコの細胞中で少なくとも複製能力がある。なぜな
ら、これらの細胞は、ブタ、イヌ、およびネコのコロナウイルスを複製するから
である。
【０１２９】 微生物の寄託 本発明の感染性のクローンを有するプラスミドを保有しているＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来する細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｐＢＡ
Ｃ−ＴｃＤＮＡＦＬと同定した）を、登録番号ＣＥＣＴ ５２５６のもとで、１
９９９年１１月２４日に、Ｓｐａｎｉｓｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＣＥＣＴ）、Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ）
に寄託した。
【０１３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＴＧＥＶの感染性のＲＮＡをコードするｃＤＮＡクローンの構築を示
す。図１Ａは、ＴＧＥＶのゲノム構造を示し、そして遺伝子の名称が、文字と数
字で示される（１ａ、１ｂ、Ｓ、３ａ、３ｂ、Ｅ，Ｍ、Ｎ、および７）。図１Ｂ
は、ｃＤＮＡクローニングストラテジーを示す。こでは、ＤＩ−Ｃゲノムを完成
させることからなる。欠失Δ１、Δ２、およびΔ３（これらは、ｃＤＮＡの全長
を再度構築するように完成されている）が、示される。ＤＩ−ｃゲノムの構造の
の下い配置された数字は、上記のＤＩ−Ｃ中のそれぞれの欠失が隣接しているヌ
クレオチドを示す。図１Ｃは、Δ１を完成させるために構築された４個のｃＤＮ
Ａフラグメント、および結合の間に使用された重要な制限部位の位置を示す。フ
ラグメントΔ１の挿入によって、ｃＤＮＡの毒性の増大を生じた。
【図２】 図２は、ＴＧＥＶの感染性のｃＤＮＡのクローニングに使用される、ｐＢｅｌ
ｏＢＡＣプラスミド（Ｗａｎｇら、１９９７）の構造を示す。ｐＢｅｌｏＢＡＣ
プラスミドは、Ｈ．ＳｈｉｚｕｙａおよびＭ．Ｓｉｍｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって提供され、そ
してＥ．ｃｏｌｉのＦ因子の複製起点（ｏｒｉＳ）を含む７，５０７塩基対を含
む。この遺伝子は、１個の細胞あたりのプラスミドの１つの単一のコピー（ｐａ
ｒＡ、ｐａｒＢ、ｐａｒＣ、およびｒｅｐＥ）、およびクロラムフェニコール耐
性遺伝子（ＣＭｒ）を維持することが不可欠である。Ｔ７およびＳＰ６プロモー
ター、ならびに特有の制限部位の位置が示される。ＣｏｓＮ：ｐＢＡＣプラスミ
ドの構築を容易にするためのラムダのｃｏｓＮ部位；ｌａｃＺ：β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子。プラスミドの作成の間に使用した配列ｌｏｘＰもまた、示される
。
【図３】 図３は、ＴＧＥＶ ｃＤＮＡの構築の間に使用された基本的なプラスミドの構
造を示す。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡΔＣｌａＩプラスミドは、５，１９８ｂｐの１
つのＣｌａＩ−ＣｌａＩを除く、全てのＴＧＥＶの情報を含む。ｃＤＮＡを、サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）の発現の即時初期（ＩＥ）プロモーター下にクロ
ーン化され、そして２４個のＡ残基、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）のリボザイ
ム、ならびにウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結およびポリアデニル化配列が隣
接している。ｐＢＡＣ−Ｂ＋ＣＤ５’プラスミドは、ｃＤＮＡが全長であるまで
のｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡΔＣｌａＩを完成させるために必要とされるＣｌａＩ−
ＣｌａＩフラグメントを含む。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドは、ＴＧＥ
Ｖの全長のｃＤＮＡを含む。ＳＡＰ：エビのアルカリホスファターゼ。
【図４】 図４は、ＴＧＥＶ ＲＵＲ４６−ＭＡＤ（ＭＡＤ）およびＣ１１のクローンの
Ｓ遺伝子のヌクレオチド配列中の差異を示す。数は、それぞれの遺伝子のヌクレ
オチド１である開始コドンのＡと考えられる、置換されたヌクレオチドの位置を
示す。棒の中の文字は、示される位置での対応しているヌクレオチドを示す。棒
の下の文字は、示される位置の周辺のヌクレオチドによってコードされるアミノ
酸（ａａ）置換を示す。Δ６ｎｔは、６ヌクレオチドの欠失を示す。矢印は、Ｓ
遺伝子の終結コドンの位置を示す。
【図５】 図５は、全長のＴＧＥＶ ｃＤＮＡに由来する感染性のＴＧＥＶのレスキュに
適用されるストラテジーを示す。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドがＳＴ細
胞（ブタの睾丸細胞）に対してトランスフェクトされ、そしてトランスフェクシ
ョンの４８時間後に、上清が、新しいＳＴ細胞を感染させるために使用された。
ウイルスが、示される時間に継代された。それぞれの継代で、上清のアリコート
および細胞性の単層が、ウイルスの滴定およびＲｔ−ＰＣＲアッセイのためのＲ
ＮＡの単離のために、それぞれ回収された。ｖｇＲＮＡ：全長のウイルスＲＮＡ
。
【図６】 図６は、トランスフェクトされたＳＴ細胞中のＴＧＥＶ ｃＤＮＡによって生
じる、細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。トランスフェクトされていない（コント
ロールの）ＳＴ細胞（図６Ａ）中にＣＰＥが存在しないこと、およびＳＴ細胞中
でｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬでのトランスフェクションの１４および２０時間後
に観察されたＣＰＥが、示される（それぞれ、図６Ｂおよび６Ｃ）
【図７】 図７は、継代によるウイルス力価の展開を示す。ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬで
のトランスフェクションの後の種々の継代での、細胞性の単層（１および２）の
２つのシリーズの上清中のウイルス力価が、示される。Ｍｏｃｋ１および２は、
トランスフェクトされていないＳＴ細胞をいう。ＴｃＤＮＡ１および２は、ｐＢ
ＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬでトランスフェクトされたＳＴ細胞をいう。
【図８】 図８は、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬでのＳＴ細胞のトランスフェクションの後
で回収されたウイルスの配列の分析結果を示す。ＴＧＥＶゲノムの構造が、図の
上部に示される。同様に、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬプラスミドならびにＴＧＥ
ＶクローンＣ８およびＣ１１から回収されたウイルスの間でのヌクレオチドの配
列における差異が、示される。ヌクレオチド間での差異の位置が、棒の上部に配
置された数字によって示される。ＴｃＤＮＡウイルスおよびクローンＣ１１のｃ
ＤＮＡ配列が、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応）によって得
られたフラグメントを配列決定することによって決定された。クローンＣ８の配
列は、公表されており（Ｐｅｎｚｅｓら、１９９９）、そしてこれは、本特許の
最後に含まれる。制限パターンが、ＴｃＤＮＡおよびＣ８ウイルスのヌクレオチ
ド１８，９９７および２０，９９０を含むＲＴ−ＰＣＲによって得られたフラグ
メントのＣｌａＩおよびＤｒａＩＩＩを用いて示される。制限パターンは、これ
らのウイルスのｃＤＮＡ中のＣｌａＩおよびＤｒａＩＩＩ部位の存在または非損
じ亜を示す。この分析の結果は、ＴｃＤＮＡウイルスが、Ｃ１１を単離すること
が期待されるＳ−遺伝子配列を有することを示す。ＭＷＭ：分子量マーカー。
【図９】 図９は、回収されたウイルスのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ウイルスＲＮ
Ａは、細胞性のポリメラーゼｐｏｌＩＩによって認識されるＣＭＶプロモーター
の制御下で発現された。原理は、このＲＮＡが細胞質へのその輸送の間にスプラ
イシングを受け得ることである。これが事実であるかどうかを実験するために、
スプライシングの高い可能性を有するＲＮＡの部位が、人のＤＮＡの配列中のス
プライシング部位を推定するためのプログラムを使用して、決定された（Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ ２．１．５．９４、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｓｏｌ
ｏｖｙｅｖら、１９９４）。切断の最大の可能性を有する可能性のあるスプライ
シング部位は、ヌクレオチド７，２４３にドナー部位を、そしてヌクレオチド７
，５７０でレシーバー部位を有した（図９Ａ）。このドメインがスプライシング
をうけたかどうかを実験するために、ｎｔ７，０７８およびｎｔ７，８０２によ
って隣接されるＲＴ−ＰＣＲフラグメント（図９Ｂ）が、トランスフェクトされ
ていない培養物の継代０および２のＲＮＡ（コントロール）から、あるいは逆方
向のまたは正確な方向の（ＴｃＤＮＡＦＬ）ＣｌａＩフラグメントを有するＴｃ
ＤＮＡでトランスフェクトされたＳＴ細胞から、調製された。得られる結果が、
図９Ｃ（継代０）および９Ｄ（継代２）に示される。
【図１０】 図１０は、ＴｃＤＮＡでトランスフェクトされたＳＴ細胞の培養物中で産生さ
れるウイルスの免疫蛍光分析の結果を示す。免疫蛍光のための染色が、ＴＧＥＶ
ＰＵＲ４６−ＭＡＤ単離物について特異的な抗体、ｐＢＡＣ−ＴｃＤＮＡＦＬ プラスミドでのトランスフェクションの後で回収されたウイルスについて特異的
な抗体を用いて、行われた。このために、両方の単離物に、またはＰＵＲ４６−
ＭＡＤにのみ結合する、ＴＧＥＶ特異的モノクローナル抗体が、使用された（Ｓ
ａｎｃｈｅｚら、１９９９）。結果によって、ＴｃＤＮＡウイルスが予想される
抗原性を有することを確認した。ＴＧＥＶについて特異的なポリクローナル抗血
清は、両方のウイルスに結合したが、感染していない培養物には結合せず、そし
てＴｃＤＮＡウイルス（Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９９）に結合したＳタンパク質
について特異的なモノクローナル抗体（ＩＤ．Ｂ１２および６Ａ．Ｃ３）、Ｍタ
ンパク質について特異的なモノクローナル抗体（３Ｂ．Ｂ３）、ならびにＮタン
パク質について特異的なモノクローナル抗体（３Ｂ．Ｄ８）にのみ結合した。
【図１１】 図１１は、インタージェニック（ＩＣ）配列の５’隣接領域が変化する、種々
の転写調節配列の下でのＧＵＳの発現を示す。ミニゲノムＭ３９が、ＣＭＶプロ
モーターの制御下にクローン化された。複数のクローニング配列（ＰＬ１、５’
−ＣＣＴＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＡＡＧＧ−３’；配列番号２）、および
選択された転写調節配列（ＴＲＳ）によって形成される転写ユニット、別の複数
のクローニング配列（ＰＬ２、５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＣ
ＣＴＧＴＣＧＡＣ−３’；配列番号３；またはＰＬ３、５’−ＧＴＣＧＡＣ−３
’；配列番号４）、Ｋｏｚａｋ（Ｋｚ）ドメインの構造を有する配列、β−グル
クロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ならびに別の複数のクローニング部位（ＰＬ４
、５’−ＧＣＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣ−３；配列番号５）が
、このミニゲノム中に挿入された。これらの配列は、ミニゲノムＭ３９の３’末
端、ＨＤＶリボザイム、ならびにＢＧＨの終結配列およびポリアデニル化配列に
よって３’末端で隣接された。ＴＲＳは、異なる数（０、−３、−８、および−
８８）のヌクレオチドをＩＧ配列（ＣＵＡＡＡＣ）注１の５’末端に有し、そし
て示されるように、Ｎ、Ｓ，またはＭ遺伝子に由来した。ＳＴ細胞が、種々のプ
ラスミドでトランスフェクトされ、相補的なウイルス（ＰＵＲ４６−ＭＡＤ）で
感染させられ、そして上清が、６回継代された。感染させられた細胞中でのＧＵ
Ｓ活性が、Ｉｚｅｔａ（Ｉｚｅｔａら、１９９９）によって記載されているプロ
トコールの手段によって決定された。継代された数に対するＧＵＳ活性の関係に
よって得られた結果が、図１１Ｂにまとめられる。 注１ 本特許の目的にとって、ＣＴＡＡＡＣとＣＵＡＡＡＣは同じ意味を有する
ことに注意すべきである。前者はＤＮＡの配列を示し、後者は対応するＲＮＡの
配列である。
【図１２】 図１２は、ＩＧ配列の３’−隣接領域において変化する、種々のＴＲＳ下での
ＧＵＳの発現を示す（図１１Ａを参照のこと）。ＴＧＥＶのＮ遺伝子の−８８ｎ
ｔに対応しているこの転写ユニットおよびＩＧ配列（ＣＵＡＡＡＣ）を使用して
、３’−隣接配列が改変された。これらの配列は、図１２Ａに示されるように、
種々のＴＧＥＶ遺伝子のもの（Ｓ、３ａ、３ｂ、Ｅ，Ｍ、Ｎ、および７）に対応
した。２つの場合においては、３’配列は、制限部位（ＳａｌＩ）および最適な
Ｋｏｚａｋ配列（Ｋｚ）を含む他のものによって、またはウイルスのゲノムのリ
ーダーに続いて配置された第１のＩＧ配列に続くものと同一の配列によって、置
き換えられた。感染させられた細胞中でのＧＵＳ活性が、上記のプロトコールの
手段によって決定された（Ｉｚｅｔａら、１９９９）。ｃＬ１２は、ＴＧＥＶゲ
ノムの「リーダー」配列の３’末端のものと同一である１２個のヌクレオチドの
配列を示す（最後に示されるウイルス配列を参照のこと）。継代された回数に対
するＧＵＳの発現の関係によって得られた結果が、図１２Ｂにまとめられる。
【図１３】 図１３は、ＧＵＳの発現のレベルを上回る、ミニ遺伝子の発現におけるモジュ
ールの挿入の部位の効果を示す。ＩＧ配列（ＣＵＡＡＣ）の５’末端に隣接して
いるＮ遺伝子の−８８ｎｔを含有している、ＧＵＳ転写ユニット、および３’末
端に隣接しているＫｚ配列（図１２Ａを参照のこと）が、全てのこれらの部位が
異種遺伝子の発現のために等しく許容性であるかどうかを決定するために、ミニ
ゲノムＭ３９中の４個の単一の制限部位に挿入された（図１３Ａを参照のこと）
。ＳＴ細胞が、これらのプラスミドでトランスフェクトされ、そして相補性ウイ
ルス（ＰＵＲ４６−ＭＡＤ）で感染させられた。感染させられた細胞中のＧＵＳ
活性が、上記に記載されるプロトコール（Ｉｚｅｔａら）に従って、継代０（Ｐ
０）で決定された。得られた結果が、図１３Ｂにまとめられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 11/00 11/00 29/00 29/00 31/00 31/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 CA11 DA06 HA17 4B065 AA26X AA95Y AB01 BA01 CA24 CA44 4C084 AA13 ZB011 ZB012 ZB111 ZB112 ZB311 ZB312 ZC611 ZC612 4C085 AA03 AA13 AA14 BB31 CC31 DD62 EE01 EE05 4C087 AA02 BC83 ZB01 ZB11 ZB21 ZB31 ZC61 【要約の続き】 しくはウイルス粒子を含む医薬調製物の使用が開示され る。

Claims (74)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の完全長コピーを含有して
    いるＤＮＡ；または （ｂ）ＲＮＡウイルスのｇＲＮＡの１つまたはいくつかのフラグメントを含有
    しているＤＮＡであって、ここで、フラグメントはＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメ
    ラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク質をコードする；また
    は （ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有して
    いるＤＮＡ； が、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化される工程を含むことを特徴と
    するＤＮＡの調製方法。
  2. 【請求項２】 ＢＡＣ中にクロー化されたＤＮＡが、１つのウイルスの構造または非構造タン
    パク質を除いて、いくつかまたは全てをコードする配列をさらに含む、請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ＢＡＣ中にクロー化されたＤＮＡが、１つまたはいくつかの異種遺伝子をコー
    ドする配列をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 異種遺伝子が、感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するのに適した少なく
    とも１つの抗原、感染性の病原体の複製を妨害する少なくとも１つの分子、感染
    性の病原体に対する防御を提供する抗体、免疫モジュレーター、サイトカイン、
    免疫エンハンサー、または抗炎症性化合物をコードする、請求項３に記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡが、少なくとも５ｋｂの大きさを有する請
    求項１〜４の一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡが、少なくとも１５ｋｂの大きさを有する
    請求項１〜５の一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡが、少なくとも２５ｋｂの大きさを有する
    請求項１〜６の一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ＢＡＣが、ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡの転写を制御する配列を含む、
    請求項１〜７の一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ウイルスの１つの遺伝子がヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって改
    変されている、請求項１〜８の一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ウイルスの向性を制御する遺伝子が改変されている請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ウイルスの向性を制御する遺伝子が、別のウイルスのそれぞれの遺伝子で置換
    されている、請求項１〜１０の一項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ＢＡＣ中にクローン化されたＤＮＡが、ウイルス粒子に組み立てられ得るＲＮ
    Ａに転写され得る、請求項１〜１１の一項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ウイルス粒子が、感染性の、弱毒化された、複製欠損の、または不活化された
    ウイルスである、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ウイルスが、自然に正方向の鎖のゲノムを有する請求項１〜１３の一項に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 ウイルスが、ピコルナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイ
    ルス、トロウイルス、アルテリウイルス、カルシウイルス、ラブドウイルス、パ
    ラミクソウイルス、フィロウイルス、ボルナウイルス、オルトミクソウイルス、
    ブンヤウイルス、アレナウイルス、またはレオウイルスである請求項１〜１４の
    一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＤＮＡが請求項１〜１５の一項に従って調製され、該ＤＮＡが適切な宿主細胞
    中で発現されるかまたは該ＤＮＡの転写を起こす条件下で化学物質、生物学的試
    薬および／または細胞抽出物と混合され、およびウイルスＲＮＡが単離される工
    程を含むことを特徴とするウイルスＲＮＡの調製方法。
  17. 【請求項１７】 ＤＮＡが請求項１〜１５の一項に従って調製され、該ＤＮＡが適切な宿主細胞
    中で発現されるかまたは該ＤＮＡの転写を起こす条件下で化学物質、生物学的試
    薬および／または細胞抽出物と混合され、およびウイルス粒子が単離される工程
    を含むことを特徴とするウイルス粒子の調製方法。
  18. 【請求項１８】 ウイルス粒子が引き続いて不活化されるか、または死滅させられる、請求項１
    ７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ＤＮＡが請求項１〜１５の一項に従って調製され、ウイルスＲＮＡが請求項１
    ６に従って調製されるかまたはウイルス粒子が請求項１７または１８に従って調
    製され、および引き続いて薬学的に受容可能なアジュバントまたはキャリアと混
    合されることを特徴とする医薬組成物の調製方法。
  20. 【請求項２０】 医薬品が、感染性の疾患に対してヒトまたは動物を防御するためのワクチンで
    ある請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 医薬品が、ヒトまたは動物の遺伝子治療のために使用される請求項１９に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 コロナウイルスの天然の配列に対して少なくとも６０％の相同性を有し、ＲＮ
    Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つの構造または非構造タンパク
    質をコードする、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に由来する配列を
    含むことを特徴とするＤＮＡであって、前記ＤＮＡのフラグメントがウイルス粒
    子に組み立てられ得るＲＮＡに転写され得るＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 異種遺伝子をコードする配列をさらに含む請求項２２に記載のＤＮＡ。
  24. 【請求項２４】 異種遺伝子が、感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するのに適した少なく
    とも１つの抗原、感染性の病原体の複製を妨害する少なくとも１つの分子、感染
    性の病原体に対する防御を提供する抗体、免疫モジュレーター、サイトカイン、
    免疫エンハンサー、または抗炎症性化合物をコードする、請求項２３に記載のＤ
    ＮＡ。
  25. 【請求項２５】 前記フラグメントが、少なくとも２５ｋｂの大きさを有する請求項２２または
    ２４に記載のＤＮＡ。
  26. 【請求項２６】 コロナウイルスの構造または非構造タンパク質の１つを除くいくつかまたは全
    てをコードするコロナウイルスに由来する配列をさらに含む、請求項２２〜２５
    の一項に記載のＤＮＡ。
  27. 【請求項２７】 コロナウイルスの構造または非構造タンパク質の全てをコードするコロナウイ
    ルスに由来する配列をさらに含む、請求項２２〜２６の一項に記載のＤＮＡ。
  28. 【請求項２８】 ウイルスｇＲＮＡの転写を制御する配列をさらに含む、請求項２２〜２７の一
    項に記載のＤＮＡ。
  29. 【請求項２９】 ウイルスｇＲＮＡの転写を制御する配列がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の
    最初期（ＩＥ）プロモーターである請求項２２〜２８の一項に記載のＤＮＡ。
  30. 【請求項３０】 配列が、ポリ（Ａ）テイル、肝炎ウイルスデルタ（ＨＤＶ）のリボザイム、ウ
    シ成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結およびポリアデニル化配列によって３’末端で
    隣接される、請求項２２〜２９の一項に記載のＤＮＡ。
  31. 【請求項３１】 ウイルスの配列が、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、マウス肝炎ウイ
    ルス（ＭＨＶ）、感染性の気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ウシコロナウイルス（
    ＢＣＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）
    ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）トロウイルス、またはアルテリウイルスの分離
    物に由来する請求項２２〜３０の一項に記載のＤＮＡ。
  32. 【請求項３２】 ウイルス粒子が、感染性の、非感染性の、または複製欠損のウイルスである、
    請求項２２〜３１の一項に記載のＤＮＡ。
  33. 【請求項３３】 コロナウイルスに由来する構造または非構造遺伝子の配列が、天然の遺伝子配
    列の１つまたはいくつかのヌクレオチドを置換し、欠失させ、または付加するこ
    とにより改変されている、請求項２２〜３２の一項に記載のＤＮＡ。
  34. 【請求項３４】 Ｓ、Ｎ、またはＭ遺伝子の配列が改変されている、請求項２２〜３３の一項に
    記載のＤＮＡ。
  35. 【請求項３５】 コロナウイルスに由来するＳ遺伝子の配列が、弱毒化されたウイルス粒子を得
    るように改変されている、請求項２２〜３４の一項に記載のＤＮＡ。
  36. 【請求項３６】 コロナウイルスに由来するＳ遺伝子の配列が、コロナウイルスの向性と異なる
    向性をもったウイルス粒子を得るように改変されている、請求項２２〜３５の一
    項に記載のＤＮＡ。
  37. 【請求項３７】 請求項２２〜３６の一項に記載の核酸を含むベクター。
  38. 【請求項３８】 ベクターが、プラスミドまたは細菌の人工染色体（ＢＡＣ）である請求項３７
    に記載のベクター。
  39. 【請求項３９】 請求項２２〜３８の一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
  40. 【請求項４０】 登録番号ＣＥＣＴ ５２６５のもとで、Ｓｐａｎｉｓｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
    ｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅに寄託された大腸菌。
  41. 【請求項４１】 請求項２２〜３８の一項に記載のＤＮＡが宿主細胞中に導入され、該ＤＮＡを
    含有する宿主細胞が該ＤＮＡの発現を可能にする条件下で培養され、および組換
    えウイルス粒子またはウイルスＲＮＡが回収される工程を含むことを特徴とする
    、組換えウイルス粒子またはウイルスＲＮＡの製造方法。
  42. 【請求項４２】 請求項２２〜３８の一項に記載のＤＮＡが該ＤＮＡの転写を可能にする条件下
    で化学物質、生物学的試薬および／または細胞抽出物と混合され、および組換え
    ウイルス粒子またはウイルスＲＮＡが回収される工程を含むことを特徴とする、
    組換えウイルス粒子または組換えウイルスＲＮＡの製造方法。
  43. 【請求項４３】 ＤＮＡが請求項２３〜３８の一項に記載のＤＮＡである請求項４１または４２
    に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 請求項４１〜４３の一項に記載の方法により得ることができるウイルス粒子。
  45. 【請求項４５】 ウイルス粒子が、感染性の、弱毒化された、複製欠損の、または不活化された
    ウイルスである、請求項４４に記載のウイルス粒子。
  46. 【請求項４６】 ウイルス粒子が、改変されたＳ、Ｍ、またはＮ遺伝子を含む請求項４４または
    ４５に記載のウイルス粒子。
  47. 【請求項４７】 Ｓ遺伝子の改変が弱毒化されたウイルスを生じさせる請求項４６に記載のウイ
    ルス粒子。
  48. 【請求項４８】 Ｓ遺伝子の改変が変更された向性をもったウイルスを生じさせる請求項４６に
    記載のウイルス粒子。
  49. 【請求項４９】 請求項４１〜４３の一項に記載の方法により得ることができるウイルスＲＮＡ
    。
  50. 【請求項５０】 請求項２２〜３８の一項に記載の核酸、請求項３９または４０に記載の宿主細
    胞、請求項４１〜４８の一項に記載のウイルス粒子、または請求項４９に記載の
    ウイルスＲＮＡを含むことを特徴とする医薬調製物。
  51. 【請求項５１】 請求項２２〜３８の一項に記載の核酸、請求項３９または４０に記載の宿主細
    胞、請求項４１〜４８の一項に記載のウイルス粒子、または請求項４９に記載の
    ウイルスＲＮＡを含むことを特徴とする、感染性の病原体によって引き起こされ
    る疾患に対して動物またはヒトを防御することのできるワクチン。
  52. 【請求項５２】 核酸が、感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するのに適した少なくとも１
    つの抗原、感染性の病原体の複製を妨害する少なくとも１つの遺伝子、または感
    染性の病原体に対する防御を提供する抗体をコードする配列を含む、請求項５１
    に記載のワクチン。
  53. 【請求項５３】 前記ウイルスベクターが、少なくとも１つの複製妨害分子、全身性の免疫応答
    および／または呼吸器、腸粘膜、または他の組織中で増殖する異なる感染性の病
    原体に対する粘膜における免疫応答を誘導し得る抗原を発現する、請求項５１ま
    たは５２に記載のワクチン。
  54. 【請求項５４】 請求項２２〜３８の一項に記載の１つ以上の核酸、請求項３９または４０に記
    載の宿主細胞、請求項４１〜４８の一項に記載のウイルス粒子、または請求項４
    ９に記載のウイルスＲＮＡを含み、ここでそれぞれが、前記感染性の病原体のそ
    れぞれに対する免疫応答を誘導するのに適した抗原、妨害分子、または前記感染
    性の病原体のそれぞれに対する防御を提供する抗体を発現する、１つ以上の感染
    性の病原体によって引き起こされる感染に対して動物またはヒトを防御し得る多
    価ワクチン。
  55. 【請求項５５】 薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤をさらに含む、請求項５１〜５４の
    一項に記載のワクチン。
  56. 【請求項５６】 コロナウイルスに由来する妨害欠損ゲノムがＢＡＣベクター中でプロモーター
    の発現下にクローン化され、そして欠損ゲノム内で欠失した配列が再挿入される
    、請求項２２〜３８の一項に記載のＤＮＡを調製する方法。
  57. 【請求項５７】 ウイルスゲノム中の毒性配列が、残存しているゲノムＤＮＡ中への再挿入の前
    に同定される、請求項５６に記載のＤＮＡの調製方法。
  58. 【請求項５８】 ウイルスゲノム中の毒性配列が、ゲノムが完成する前に再挿入される最後の配
    列である、請求項５６または５７に記載のＤＮＡの調製方法。
  59. 【請求項５９】 転写調節配列の下にクローン化された、コロナウイルスのゲノムＲＮＡ（ｇＲ
    ＮＡ）と相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の完全長のコピーを含む、コロナウイルス
    に由来する感染性クローン。
  60. 【請求項６０】 前記コロナウイルスが、ブタの感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）の単離物で
    ある請求項５９に記載の感染性クローン。
  61. 【請求項６１】 前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の発現の最初期（ＩＥ
    ）プロモーターである請求項５９または６０に記載の感染性クローン。
  62. 【請求項６２】 前記完全長ｃＤＮＡが、ポリ（Ａ）テイル、肝炎ウイルスデルタ（ＨＤＶ）の
    リボザイム、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）の終結およびポリアデニル化配列によ
    って３’末端で隣接される、請求項５９〜６１の一項に記載の感染性クローン。
  63. 【請求項６３】 前記感染性ｃＤＮＡが細菌の人工染色体（ＢＡＣ）中にクローン化されている
    請求項５９〜６２の一項に記載の感染性クローン。
  64. 【請求項６４】 コロナウイルスのｇＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを構築し、そして転写調節因子
    をアセンブルすることを特徴とする、請求項５９〜６３の何れかに記載の感染性
    クローンを取得する手順。
  65. 【請求項６５】 コロナウイルスｇＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの構築が、以下の工程を含む請求項
    ６４に記載の手順： （ｉ）前記コロナウイルスに由来する妨害欠損ゲノムが、ＢＡＣ中で発現プロ
    モーターの下でクローン化する工程、 （ｉｉ）前記妨害欠損ゲノムの欠失を完成し、感染性のｇＲＮＡについて欠失
    した配列を再生する工程、 （ｉｉｉ）細菌に対する毒性配列をクローン化される前に同定し、該毒性配列
    を除去し、前記毒性配列を、コロナウイルスのｇＲＮＡに対応するｃＤＮＡクロ
    ーンを得るために、真核細胞に形質転換する直前に挿入する工程。
  66. 【請求項６６】 請求項５９〜６３の何れかに記載された感染性クローンを含むか、または請求
    項５８または５９の何れかの手順により得ることができる組換えウイルスベクタ
    ーであって、異種核酸が発現されることを可能にする条件下で前記感染性クロー
    ンに挿入された前記異種核酸を含むように修飾された組換えウイルスベクター。
  67. 【請求項６７】 前記異種核酸が、目的の遺伝子産物をコードする遺伝子および遺伝子フラグメ
    ントから選択される請求項６０に記載のベクター。
  68. 【請求項６８】 異種核酸の発現を可能にする条件下で、請求項６０または６１の何れかに記載
    のウイルスベクターを含有する宿主細胞を培養し、目的産物を回収する工程を含
    む、目的産物の製造方法。
  69. 【請求項６９】 コロナウイルスのゲノムに対応するｃＤＮＡ配列中に異種核酸を含む修飾され
    た組換えコロナウイルスの製造方法であって、請求項６０または６１の何れかに
    記載されたウイルスベクターを宿主細胞導入する工程、前記ウイルスベクターの
    発現および複製を可能にする条件下で前記ウイルスベクターを含有する宿主細胞
    を培養する工程、および修飾された組換えコロナウイルスから得られたウイルス
    粒子を回収する工程を含む方法。
  70. 【請求項７０】 （ｉ）前記感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために適切な少なくと
    も１つの抗原、または前記感染性の病原体に対する防御を提供する抗体を発現す
    る請求項６０または６１に記載の少なくとも１つのウイルスベクターと、 （ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤を任意的に伴って含む、 感染性の病原体によって引き起こされる感染に対して動物を防御することがで
    きるワクチン。
  71. 【請求項７１】 前記ウイルスベクターが、全身性の免疫応答および／または呼吸器、腸粘膜、
    または他の組織中で増殖する異なる感染性の病原体に対する粘膜における免疫応
    答を誘導し得る少なくとも１つの抗原を発現する、請求項６４に記載のワクチン
    。
  72. 【請求項７２】 （ｉ）前記感染性の病原体に対する免疫応答を誘導するために十分な抗原、ま
    たは前記感染性の病原体に対する防御を提供する抗体を発現する請求項６０また
    は６１に記載のウイルスベクターと、 （ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤を任意的に伴って含む、１つ以上の感染性
    の病原体によって引き起こされる感染に対して動物を防御することができる多価
    ワクチン。
  73. 【請求項７３】 （ｉ）前記感染性の病原体のそれぞれ１つに対する免疫応答を誘導するために
    十分な抗原、または前記感染性の病原体のそれぞれ１つに対する防御を提供する
    抗体を発現する請求項６０または６１に記載の１つ以上のウイルスベクターと、 （ｉｉ）薬学的に受容可能な賦形剤を任意的に伴って含む、１つ以上の感染性
    の病原体によって引き起こされる感染に対して動物を防御することができる多価
    ワクチン。
  74. 【請求項７４】 請求項５９〜６３のいずれか記載の、または請求項６４または６５の何れかの
    手順によって得ることのできる感染性クローンを宿主細胞に導入し、感染性クロ
    ーンを含有する前記宿主細胞を、感染性クローンが発現および複製し得る条件下
    で培養し、コロナウイルスの完全なゲノムを含有する組換えコロナウイルスから
    得られるウイルス粒子を回収することを特徴とする組換えコロナウイルスの製造
    方法。
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