HU228205B1 - Infectious clones - Google Patents
Infectious clones Download PDFInfo
- Publication number
- HU228205B1 HU228205B1 HU0203305A HUP0203305A HU228205B1 HU 228205 B1 HU228205 B1 HU 228205B1 HU 0203305 A HU0203305 A HU 0203305A HU P0203305 A HUP0203305 A HU P0203305A HU 228205 B1 HU228205 B1 HU 228205B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- infectious
- rna
- dna
- sequences
- virus
- Prior art date
Links
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 92
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims description 79
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 72
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 43
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 40
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 claims description 36
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 34
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims 1
- 244000000001 Virome Species 0.000 claims 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000007408 cone-beam computed tomography Methods 0.000 claims 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 76
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 abstract description 8
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 abstract description 5
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 43
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 16
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 9
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000711466 Murine hepatitis virus Species 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000004929 transmission Raman spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 3
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001474033 Acar Species 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 102100030917 Zinc finger protein SNAI1 Human genes 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940037201 oris Drugs 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 101150034434 repE gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- IVRGXOYCDSZACZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-5-(octyldisulfanyl)benzoic acid Chemical compound CCCCCCCCSSC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 IVRGXOYCDSZACZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 241000117281 Aora Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000680578 Canid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 1
- 241001493036 Canine rotavirus Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001507946 Cotoneaster Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- NTSBMKIZRSBFTA-AIDOXSFESA-N Digoxigenin bisdigitoxoside Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@]([C@@H]4[C@H]([C@]5(CC[C@@H]([C@@]5(C)[C@H](O)C4)C=4COC(=O)C=4)O)CC3)(C)CC2)C[C@@H]1O NTSBMKIZRSBFTA-AIDOXSFESA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- OJIYIVCMRYCWSE-UHFFFAOYSA-M Domiphen bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCOC1=CC=CC=C1 OJIYIVCMRYCWSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001105160 Eleodes Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 101150068770 Gcna gene Proteins 0.000 description 1
- 206010019133 Hangover Diseases 0.000 description 1
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 101000595467 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032965 Myomesin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 241000287462 Phalacrocorax carbo Species 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 101100029566 Rattus norvegicus Rabggta gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101150027674 S1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047486 Virilism Diseases 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 229940053200 antiepileptics fatty acid derivative Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000006253 efflorescence Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000003958 fumigation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 208000016339 iris pattern Diseases 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 235000020131 mattha Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005649 metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- HRRDCWDFRIJIQZ-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,8-dicarboxylic acid Chemical compound C1=CC(C(O)=O)=C2C(C(=O)O)=CC=CC2=C1 HRRDCWDFRIJIQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N uranium(0) Chemical compound [U] JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
- A61K39/225—Porcine transmissible gastroenteritis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/20062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
- C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány tárgyát eljárások képezik koronavírus genomiális RNS-éböl (gRNS) származó szekvenciákat tartalmazó DNS előállítására, amely szekvenciák legalább 60%-ban homológok a vírus natív szekvenciájával, és RNS-függő RNS-polimerázt és legalább egy szerkezeti vagy nem szerkezeti fehérjét kódolnak, ahol a DNS egy fragmense átírható RNS-sé és virionná állítható össze, azzal jellemezve, hogy koronavírusból származó interferáló defektív genomot klónozunk promóter szabályozása alatt bakteriális mesterséges kromoszómába (BAC), és a defektív genomból deletált szekvenciákat visszainzertáljuk a genomba. Ezenkívül a találmány tárgyát képezi ezen nukleinsavak alkalmazása virális RNS vagy virionok előállítására, valamint az ezeket a DNS-eket, virális RNS-eket vagy virionokat tartalmazó oltóanyagok.
Fertőző klánok
A találmány tárgyát eljárások képezik DNS vagy RNS eimillítására, és ezen eijártlssal előállítható a»kleinsa vak: és oltóanyagként történd tdkalmazások.
A netortbináns DNS-techsológia fejlődése az organizmusok közölt; génátvitei előmbaiadáshoz vessetett. Jelenleg számos próbálkozás történik. gazdasási és koreskedeluti jelentőségű kémiai, gyógyászati és biológiai termékek előállítására génaiviíe'h mődszetvií alkalmazásával
Misa prokariőta, máid eukarióra sejtek genetikai mtnhpaláelőjáoak egyik kulcskérdése vektoruk: és vektor-gazda módszerek kifejlesztése. Általában .a vektor gszdasejther történő replikáeióra és expressziőra képes .««kkónsav-ísoSeköla, Vektor-gazda rendszert olyan gazdasepként definiálhatják, antely vektort hordoz, és tehetővé teszi az általa tartalmazott genetikai infennáeio repiíkációját és expresszíóiás.
Vektorokat kifejlesztenek mind DNS, mind RNS genostta vírusokból. A gazdasejtek sejtmagjában repiskálödö DNS-v busókból származó- vlrnsvektoroknak az a kátránya, hogy képesek islegfelödtti a sejt genomjóba, ezáltal általában nem nagyon biztonságosak. Ezzel ellentétben a g&záásejt cirapiazmájában replikálodo RNS-vírusokbdl származó vírasvektorok biztonságosabbak a DNR-vfnrsoko» alapulóknál, mivel a replikámé RNS-en keresztül történik a sejtmagon kívül. Ezen vektorok ezáltal nem valószínű, hogy íntegrákxlnife a gazdasejt genomjába.
A WO99/43Ő42 tsetnzetközl közzétételi irat ismerted mesterséges kromoszómák alkalmazását, különösen olyan bakteriális mesterséges kromoszómák (DAC) alkalmazását, amelyekbe Herpes síssples víráiis DNSszekveneiák leitek beklónozva rekombinásts virasrészeeskék ia vivő és In vsito előállítására.
eDNS-klőookat eiőállűotlak pozitív polaritásn egyláseó RNS-vírosokböi ixs.RNS{v)], példán! pikoroavirosboi (Raeísnielfe és Baltimore, lödig brotnovírashől (Ahlquist és tntsal. 1984); aiiavlrsssból, amely neatzetség tartalmazza & Síndbls.vírust; Sémiik) Dürert vírust (SFVi és a venezuelai ió-eneefehissz vfeastíVEE) (Rice és mtsai., 1937; Liíjeström és Garoíí, 1991; Frolov és misah, 1996; Ssnerdou és Liljeslröm, 1999); Ikmivloisokböl és pesnvírtssokfeói (Riee és Slranss, 1:981; i,at és mtsak, 1.991; Riee és mtsai,, 1939); és az rtsöYJVírófee család virtisaibő; {Getgentanller és mtsai, 19971, Hasonlóképpen, heíerolog gének expresszáltatásáza alkalmas vektorokat kifejlesztettek ssfeNSfe-) vírus genootjával. komplementer DNS klánjaiból, példáéi alfavírosokbói, köziék Síndbis vírusból. Sémiik) korost vírusból (SFV) és venezuelai ló-eueelálitisz vírusból ÍVRE) Entíov és mtsai., 1996; Liíjeström, 1994; Pasbko és onsak, 1997). Azonban az összes RNSvímsböl kiinduló eljárás, rekombtnáns vírusok el&tllítására még adudig bonyolult amiatt, hogy a legtöbb vírus tartalmaz baktériumok szántára toxikus szekvenciákat. A víráiis RNS eDNS-ének előállítása és a eDNS szubklónozása baktériumokban tehát gyakran vezet a baktériomgazdában a DNS-szskveueíák deiéeiőjához vagy áttondezödéséhez. Ebből a célból a leggyakrabban alkalmazott szubklónozó és expresszié» vektorok nem alkalmazhatók rekombioáns RNS-vhnss>kból száonaző nagy DNS-tészlotek előállítására. Azonban szükséges olyast vektorok előállítása, asuelyek nagy islegen ÖNS-szekvene iákat képesek hordozni, gyógyászat; anyagok, különösen oltóanyagok kífejlcsziésének számos vonatkozásában.
A kotonttvirtssok olyan ssRNSÍv) virosok, amelyeknek a. legnagyobls ismert RNS-víras genotttjs van, amelyttek a hossza körülbelül 25 és 31 kdobázis (kb) közölt van (Síddel!, 1995; tol és Cavanagh, 1997; Enjnanes és mtsai, 1998). A köí-onavirassai történő fertőzés során a geoomíálix RNS (gRNS) repbkáiődik, és
Akmszámunk; 90695-29ίΜ,Τ »4 *» ♦* «Φ
Φ Φ
-3- »♦·♦ »«· »♦♦»· »’ pozitív és negatív polarltásá szttbgenomiábs FNS-ek (sgRNS) készlete szkttetízálódik (Seíhna és mtsai., 1.9W; Sawfcki és Sawiekí, 1990; vas dér Most és Spaan, Í99S). Az sgRNS· szintézise RNS-fúggő folyamat, amely a fertőzött sejt eifoplazmájában megy végbe, habár a pontos meetetzmusa még sem teljesen ismert.
Feltárták olyan cDNS-ek előállításút, amelyek deféfctiv interferáló (Dl) ^nomot .kodéinak fdcléclós matáns, amely kompismentúlő vhxrs jelenlété; Igényli a replikámójshoz és tmoszkripciőjához) bizonyos taxa· vímsok esetében, mint például egér hepatitisz vínts- (MHV>, fertőző bronchitriz vfess (lüV), szarvasmarba kor©navlras (13CV)(Chang és mts&i., 1994), és sertés gsszíroenterítisz vírus (TGEVXP9óöÖ629. számú spanyol szabadalmi bejelentés; Ménhez és mtsak, 199& Izein és misal., 1999; Saocbez és mtsaí, 1999). Azonban olyan eöN'S-kión előállítása, amely kotonavíros teljes genomjáí kódolja, nem vök lehetséges, talán a koronavöns genomjának nagy mérete és toxikus szekvenciái miatt.
Összefoglalva, habár nagy számú virnsvektort fejlesztettek ki beíemióg nukíeinsavak replikálásárs és expreszsziójára gazdasejtekben, a heíerológ gének, expresszálfetására alkalmas ismert vektorok többsége nem nagyon alkalmas fefeS-vírusok szöbklónezásárs. Ezenkívül sz így kapott vrresvektoroksak vannak bátránysl, a fejspecídiás hiánya és a célzott szerv és szövet korlátozottsága miatt, és azok korlátozott klónozást kapacitása miatt, ami .szőkíts az. alkalmazás lehetőségéi miatt alap, mind alkalmazott kutatásban.
Ily módon szükség van eljárásokra új. beterológ gének exprcsszaltatására alkalmas vektorok kifejlesztésére, amelyek megoldást biztosítanak a fenti problémákra. Különösen előnyös lenne beterológ gének expresszáitaiásra alkalmas nagy vektorok biztosítása, amelyek nagy biztonságúnk és klónozás! kapacitásúak, és amelyeket ágy lehetne tervezni, hogy a íajspcclriíásuk és íropizutusak szabályozható legyen.
A festi problémákat megoldja a találmány szerinti eljárás korotsavirns genondáiss RNS~éböl (gfoNS) származó szekvenciákat tarlohnazó DHS előállítására, amely szerint a szekvenciák legalább 69%-bsrs homológoké vírus nadv szekvenciájával, és ENS-lnggő RHS-polimerázt és legalább egy szerkezeti vagy nem szerkezed fehérjét kódolnak, ahol a DNS egy fragmense átírható RblS-xé és virireaná állítható össze, azzal jellemezve, hogy kmonavimsbél származó ioterforálö detektív genotnot kionozcnk pronröíer szabályozása alatt bakteriális mesterséges kromoszómába (SAC), és a detektív gettómból deietált szekvenciákat visszamzettáljttk a genomba.
Meglepő módon azt: találtak, hogy a technika állása szerinti, vkáks gRMS-bőI származó nagy mérető Obi S-szek véne iák szobkiörsozására és exprexszálístására alkalmas eljárások sósán fennálló problémák áthidalhatók SAC klónozó vektorként történő alkalmazásával. A SAC aíkaknazástt kölőnösen előnyös sunyiban, hogy·' ezen vektorok sejtenként. egy vagy két példányban vannak jelen a baktériumokban, ami számottevően korlátozza a toxlátást, és csökkenti a plsztnidok közötti rekombináció lehetőségei.
A találmány tárgyát képezi továbbá fertőző klón, welv koronavírrss genomkílis RNS-éttek (gRNS) teljes hosszúsági· kompieinenter DbiS-ét fcDNS) tartalmazza, Irmsszkripciö-szabályoze szekvencia szabályozása alatt, amelyben a fertőző cDNS bakteriális mesterséges kromoszómába (SÁG) van klónozva. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya rekotnhíxtáns virasvektor, amely fertőző kiónt tartalmaz, és amely módosítva van heterolőg nuk.leinssvval a fertőz© kiónba inzertálva, olyan körüintények között, amelyek lehetővé teszik a heterolőg mzktemsav expresszsóját A íalálmatty tárgyát képezik. továbbá állas: fertőző ágens által okozott fertőzésével szembeni védetem? képes oltóanyag, amely tartalmaz χ « » » « * » ♦ ♦ » * X « X X * * Φ
Φ»Χ * « **
Μ»Φ* X* ** (1) legalább egy 12. igésyprart szerbsti rekombiaáns virasvektorb amely vagy legalább egy, a fertőző ágens elleni imanínváfesz indokálására alkalmas mtigéaí, vagy a fertőző ágens elles védelmet nyújtó ellenanyagot express.zái, adott esetben együtt (ő) gyógyászatilag el.tógadbaté kötőanyaggal.
Ez az oltóanyag muttivaíeos oltóanyag lebeg amely egynél több fertőző ágens által okozott fertőzéssel szembeni védelemre képes. Az· alábbiakban röviden Ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat:
Az 1, ábrán TGEV fertőző RNS-ét kódoló cDNE-klőrt konstruálását matatjuk be. Az l.A ábrán a. TGEV genetikai stterkezefét mutatjuk be, a gének. nevét bellikkel és ezámokktű felölve (la, 1b, S, 3a, 3b, E, Μ, N, és 7i. Az 1 ,.B ábrán a eDNS-klónozáss stratégiát nratatjok be, amely a DlA~-ge«om kiegészítést tartalmazza. .felezzük a teljes hosszúságú cDNS visszaállításához kiegészített A?., Δ2 és A3 delédőknl. A öl-C-gertotn szerkezete alatt elhelyezkedő szántok jelzik a Dl-C-genom delédéját szegélyező nokleotidokat. Az I.C ábrán a Al fejfedő kiegészítésére konstruált négy eDNS-iragmenst matatlak be, és a kapcsolás során alkalmazott tó restrikciós helyek elhelyezkedését. A A1 íragtoens hsxertáfesa a cDNS tó.ddsásán&k a növekedését okozta.
A 2, ábrást a TGEV fertőző cDNS-éaek klónozásában alkalmazott pBeloBAC plantid (Waag és rntsafe 1997) szerkezetét matatjuk be. A pBeloBAC pkszmldot El. Shfeuya és M. Srnsors (Cairiömta Institate of Technology) biztosította. A pbmid ?5Ö? bázispárttól (bpj áll, amelyek tartalmazzák az £ cort F-tnktoránák replikáciős origóját f oriS), a sejtenként egyetlen példány megtartásához szükséges gétseket (párA, parik parC és repE) és a klorrnnfernkol-reztszfencia gént tCM’k A T? és SFö promólerek helyét és az egyedi restrikciós helyeket jelezzük. CosN: lambda cosfe-bely a pBA€~ptezmí.d előállításának elősegítésére; Inc Z: p-galaktózidúz gés. A plazmái létrehozása sorért alkídmazort ioxP-szekvendát szintén jelezzük.
A 3. ábrán a TGEV «DNS konstruálására alkalmazott alapvető ptosídok szerkezetét mutatjuk be. A pBAC-TcDNAMU“ plaztuid tartalmazza a TGEV RNS összes iítíőrmádőját, kivéve egyetlen 5,148 bp hosszúságú Clal-Cíaí fiogíseasí. A oöN:S-t a dtóme.gafovi'rus (CMV) közvetlen: korai (1E) promderének expressziős szabályozása alatt klónoztuk, es a .3’ véges 24 A-ből áló polKAj-lárokkak a hepatitisz delta vírus (EIDV) rtlxtztütjávsi, és a szarvasmarha növekedési hormon C BGIi) teratisrúdős és pohademláeiós szekvenciáival szegélyezték. A p.8AC-B-K>D5' plazmái tartalmazza a pB:AC-TcE>NAA<í'5í plazmid kompiementálásához szükséges Cl&l-Ciaí íragmenst. A pBAC-TcDN.A*1 plazmid tartalmazza a teljes hosszúságú TGEV cÖNS-t SAP: garnélarák alisallkus íoszfátáz.
A 4. ábrán, a PUR4Ó-M.AD (MAD) és Cl. 1 TGEV klóitok S-génje uokleotidszekvenciájának. az eltéréseit mutatjuk be. A számok a szohsxtifeált nokleotidok helyéi jelzik, az egyes gének első smkfeotidjakénf véve az inldádős kodon A-ját A téglalapokon belüli betűk jelzik a megfelelő tmkieotidot a jelzett helyen, A téglalapok .alattt belük jelzik a jelzett pozíció körül; nukleoSídok által kódolt andnostv-szubsztítúelökat. A Aőrá: egy ő onkfeotlány i fejfedőt jdez. A nyíl az S-gért íermlnádős kodomának a helyét jelzik.
Az 5. ábrán a fertőző TGEV-nek a télies hosszúságú TGEV cDNS-bői történő kimentésére követett stratégiát mutatjuk be. A pBAC-TcDNzV4· piazmidot ST-sejtek.be (sertés heresejtek) transzfektáhuk, és 48 órával a traoszfeirtálás után a felülúszót alkalmaztak új ST-sejtek transxfektálásárm A vírust a jelzett időpontnál passzáltak. Mindet! egyes passzázskor a ieiülúszö és az egyseltes sejtréteg alikvotjait összegyűjtöttük vírus bírálására és RNS RT-1R7R elemzés céljára történő izolálására. vgfeNA: teljes hosszúságú vitális RNS..
V*
,. «* 9 9
A 6. ábrás a TGBV eDNS által SX-sejtóheR okozott cltopátiás hatást (EPE) matatjuk he,. CPE bíát-yáf nens. tmnszfekiált (kessbrol.!) ST-sejtekben (6-.A ábra), és a pBAC~Ts£>NA! piazmiödat történd traaszfektálás után 14 és 20 órával ST-sejtekben megfigyelt.-CPE-t (sorrendben 6,B és 6.C ábra) mutatjuk be.
A ábrás a virustster változását mutaíjnk be a passzáíássah Két egysejtes réteg (1 és 2) pBACTeDNA1' plazmáddal történő transztektálása utáni különböző passztílások íciülúszőjában iévö viroxtiterí ábrázoló grafikont múmiánk be. Misek 1 és 2 jelenti a nem trsnszfektált ST-sejteket, TcDNA 1 és 2 jelenti a pBACTcöNA plazmáddal tramz-fektáh ST-sejteto.
A 8. ábrán ST-sejtek pBAC—XcDMA1-’' plazmíddál történő iranszíéktálása irtás izolált vírus szekveueiaelenizíbiének eredményét mutatják: he. A TGEV-genom szerkezetét az ábra felső részé» jelezzek. Hasonlóképpen jelezzük a nnkfetüldök szekvenciájában lévő eltérésekéi (genetikai markerek} a pBAC-TcONA1'1' (TcDNA) piaz.íniddal és & C8 es Cl 1 TCtéiV-klóitokkal kapott vírusok közöd.A nnkteoíidok közötti eltérések pozícióját a téglalap feletti számok jelzik. A TcDNA-vlm és a Cl 1-klón cDNS-szakvenciájál RT-PCR-rel (reverz transzkripció és polímeráz-lánereakeió) kapott fragmensek szekvenálásávul határoztok meg, A C8-klön szekvenciáiét elküldtük publikálásra (Pénzes és mísai, 19941, és mellékeljük ezen szabadak»» végén. Az RTPCR-rel kapott iragmensek - amelyek tartalmazzák a 18997 és 2Ö99Ö nukleotldokat a Te-DNA. és CS vírusokból - Clai és Dralil restrikciós mintázatát matatjuk be. A restrikciós mintázat mutatja a Clal és Draíll helyek jelenlétét vagy biáttyái ezen vírusok cDHS-éhen, Ezen elemzés eredménye jelezte, hogy a kapott TcDN A-vírttsnak a C 1 i-izolátorn esetén vári S-gén szekvenciája volt. MWM: molekuiatöíneg-markemk,
A 9, ábrán a kapott vírus RT-PCR-etemzéséttck az eredményét .matatja h«· A vitális RNS-t a sejt pol11 poliíueráza által felismert CMV-promöter szabályozása alatt expreszszálísttuk, Elvileg ezen RblS-en végbemehet ’splicing’ a cüoplazmáhs történő transzportja során. Annak ínnnlusányozására, hogy ez-e a helyzet, az SMS nagy feplieiug' valószínűségű helyest meghatároztuk hantán DNS ’sphcing'' helyeit megiósotö program •(Version 2.1.5,94, Department of Célt Öíology, Sayior College oí bfedieine) (Soíovyev és mtsal., 1994) alkalmazásával. A maximális hasítási valószínűségű: potenciális ’splicing’ helyek a 72.43. donor és a 7570. fogadó helyek voltak (9.Á ábra). Annak tanulmányozására, hogy ezen a doménen véghegy-e a 'splielngk az 7078.. és 7802. uukieotidokkai szegélyezeti RT-BCR íragíoenst (9.8 ábra} állítottuk elő nem fcraaszíektált tenyészetek (kontroll). Ö. és 2. passzálásásak RNS-ébÖl, vagy a Cisi-íragmeost ibrdímü irányítottságban ί'ΓοΟΝΑ'·'^ ^·”^) vagy helyes irányítottságban (TcDöíA!'!'} tartalmazó TcDNA-val tésuszáektált ST-sejtekból, és az RT-ECR-ből kapott termékeket agarózgélen elemeztük. A kapott eredményeket a 9.C ábrán (ö. passzálás) és a 9.D ábrán (2. pssszálás) mutatják be.
A 10. ábrán TeDhíA-val donszíéktált Sí-sejtek íenyészeteilx-as előállított vírus ímmmrfhroreszeencíás elemzésének eredményét mutatjuk be. Az imnmnfiuoníszcens festést TGEV PVR46-MAD Izoiáhunra és a pBAC-TcDNA^' plazmáddal történő ínanszfekíálás után kapott vínssta- specifikus elienmtyagokkal ísnjtottok végre. Ebből a eéíböl olyan ’íGEV-speeifisus ínonókfonálls ellenanyagokat alkalmaztunk, amelyek kötődnek minőkéi Íz,dátumhoz, vagy csak a íRiR4ó-MAD-boz (Sánoaez és znísaí, 1990). Az eredmények Igazolták azt, hegy a Te DN A-vírusnak a várt andgeniíása van. A TGEV-re Kpeesdkus políklonáiis aníiszémm kötődött ioindkér vírushoz, de a nem fertőzött tenyészetekhez nem, és csak az S-tehérje esetén (1D.1512 és ÓA.C3), M-íéhérje esetén (38. 83} és N-íéhérje esetén (3B.B3) várt monoklonálís ellenanyag kötődöd a ícDNA -virusboz. (Sáschez és mtsai, 1999).
φ««« φ*φ« φ X φ φ φ φ
♦.♦·« * ♦ φ*
X * Φ Φ φ * φ φ-χ« Λ* ΦΦΦΧ X*
Α Η. ábrán GöS expresszsőjátmutatjtsk. be kofebőző teussztkripciös szabályozó szekvenciák (TRS) szabályozása alatt, amelyek az intergéo (IG) szekvenciát 5’ irányban szegélyező régióban térnek el. Az M39 arinigeaotnot klőstozmk CMV-promóter szabályozása alatt. Ebbe a tnim$>:enomba ínzertáiftmk egy többszörös klónozó helyet (RLE 5’<CTAGGATTI'AAATCCTÁAGG-3b 2. azonosítószámú szekvencia), és a kiválaszkíö Irsmszkrlpeió-szabályoző szekvenciák által alkotott transzkripciós egységet (TRS),. egy másik többszörös klónozó helyei (PL2, S’-GCGGCCGCGCCGGGGAGGCC'fG'f'CGACG! 3, azortositőszámÍJ szekvencia; vagy Ri,3, S’-öTCGAC-3‘; 4. azonosítószámú szekvencia), Rozak-domém tartalmazó szekvenciákat, a b-ghíkuronidáz (GGS) gént, és egy másik többszörös kfőnoző helyet <Ft< 5‘-GClAGCCCAG«CGCOC<5ÖTACX-3’; 5. azonosítószámú szekvencia! fezen szekvenciákat) előnyös 3' végen az M39 atitrigenem 3’ végével a I-IDVribözimmat és a BGíI termináeiős és poiiadeniláeiöx szekvenciáival szegélyeztük.. A TRS-ekusk különböző számú fö, -3, -& és -Sih mzkleotldja. volt az IG-szekvencia 5’ végén (CIJAAAC), és az N-, S- vagy M-gésekböl jött, amint jelezzük, A különböző piszmídokkai ínmszfekíáií ST-sejíeket fertőztünk a köjnplementáló vírussal (FGR46-MAD), és a felöiűszőfcat 6-szor passzákak. A fertőzött sejtek GGS-aktivkását Izem és mtsaí , (1999) által leírt protokollal határoztak meg. A kapott GGS-aktívítás eredményeket a passzálások szánéinak függvényében a 11.B ábrán gyűjtöttük össze.
A 12. ábrán, GUS expresszióját amtatjak be küiönijőzö TRS-ek alatt, amelyek eltérnek az 1Gszekvencia 3’ szegélyező régiójában (lásd a 1 LA ábrát). A TGEV N-génjének -kő. nukleotldjának' megfelelő 5' szegélyező régiót plusz, az. IG-szekvenelát {CIJAAAC)· tartalmaző transzkripciós egység alkalmazásával módosítottuk ad' szegélyező szekvenciákat. Ezen szekvenciák, ategfeleifek a különböző TGEV-gésteknek (S, Ja, 3b, E, Μ, N, és ?), amint a 1.2„A ábrán jelezzük. Két esetben a 3’ szekvenciákat heiyettesltcdak másokkal, amelyek restrikciós helyei (Sáli) és optimalizált Kozak-szckveneiáf (Kz) tartalmaztak, vagy olyan szekvenciává! amely azonos a vírusgéné® vezetöszekvenoiáját követő első iG-szekvencsa utánival. A GUS aktivitását a fertőzött sejtekben. a fenti protokoll alkalmazásával határoztuk meg (Izeta és totsal, 1999), cL 12 jelöli a TGEV-genssm vezeíoszekvene iájának 3' végén lévő 12 nukieofiddial azonos szekvenciát (lásd a végén jelzett virasszekvenciát). A kapott GüS-expresszió eredményeket a passzázsok szántának függvényében a I2.B ábran gyűjtöttük össze;
A 13. ábrán az «xpressziös tnodni mmígsnemba történő ínzertáláss helyének a hatását mutatjok be a GUS-expresszíó szintiére. Az IG-szék vétse la (CUAAAC) S' végét szegélyező, N-gén ~§S. nukfeobdot és a .3’ véget szegélyező Kz-szekvenclákat tartalmazó GUS transzkripciós egységet (lásd a 12,A. ábrát) mzertálínk be srz M39 mmígenom négy egyszeres restrikciós helyére (I3.Á ábra) aanak meghatározására, hogy ezen helyek egytbrtnán psnmsszivok-e a heferológ gén expressxáltaíáss szempontjából ST-sejteket transzfektálnmk ezen plazmidokka! és ferlöztősk. a kosoplemeutáió vírussal (PGRAé-MAD). A fertőzött sejtek GGS-sktívhásás meghatároztuk a Öt passzálásban (Fö) a fenti protokoll alkalmazásával (Izeta és nhsai., 1999). A kapott' eredményeket a 13.B ábrán gyűjtöttük össze.
A leírás szerinti értelemben „.bakteriális mesterséges kromoszóma” alatt olyan DNS-szekvenehú értünk, amely az F-iáktor szekvoísofejáí tartalmazza. Az ezen szekveoeiákaí tartalmaző plazmidök, az úgynevezett Fpktzmidok képesek 3ÖÖ Rb-nál hosszabb heterolog szekvenciák: stabil fersnisrtására alacsony köpiaszám mellett (egy vagy két példány sejtenként). Megfelelő BAC-ok ismertek a szakterületen (Shizttya ás nnsai., 1992).
’ Megjegyezzük, hogy a leírás szerinti értelemben: A Cl'AAAC és CUAAAC szekvenciáknak azonos a jelentése. Az. első jelenti a DNS szekvenciáját, és a második a megfelelő RNS szekvenciáját φ««φ ΦΦ«Φ ΦΦ φ. φ φ ♦.·♦.*
Φ φ *Φ φ * * φ φ φ φ«« *χ ΧΦΦΦ Φ*
A feláin-iáRy szerinti, BAC-ba klónozott DNS legalább 60%-fess, előnyösen 75%-ban, és előnyösében 85 vagy 95%-b;m bontolög RNS-viros rasíoészefes szekvenciájával. A szekvenciahoirsológlát előnyösen a f festő/ számítógépi program alkalmazásával határozzak -meg, mely az ’Europesa Irioioformaties insriíme’feíái (£81) .szerezhető-be.
A leírás szerinti értelemben a „komutvírssböl származó szekvencia” kifejezés alatt olyan nnkfe insavszekvenciát értünk, amely legalább 60%-bas, előnyőse» 75%-ban, ós előnyösebbe» 85 vagy 95%-fean homológ koconzvíras természetes szekvenciájával.. A .szekveneiéotnoiőgiát a Cfertu/ számítógépi program alkalmazásával határozhatjuk meg, mely az „Enropean Bistmharmatics htsttate”~sál (ESI) szerezbelö be.,
A Jcöfoaavtras' kitiíjezés alatt a leírás szerinti értelemben vírusok olyan csoportját értjük, amelyeknek egyetlen, 25-33 Kb mérető lineáris, pozitív szálú ssRNS-e van. Ezen vírusok általába.» 7~iö szerkezeti, azaz a vírus szerkezetét meghatározó fehérjét kódoló gént tartsimazoak. A gének tipikusan az alábbi sorrendben helyezkednek el a víntsgsaontiba»: 5’ - replíkáz - (feemagglaíimn-észteráz) -’spike’ - borok - membrán oakleoproietn - 3:. Ezcstfelol a virssgeoom tartalmazhat számos nem szerkezeti gént is, amelyek mSNS-ek egymásba ágyazott készletét kódolják közős 3’ véggel, és felnyomó részben nem lényegesek;
A „átírható RNS-sé, amely vlrionsst állítható össze” kifejezés alatt olyan DN'S-szekveociát értünk, amely ~ ha egyszer be lett juttatva alkalmas gazdasejtbe - átírható RNS-sé és virionok&t hozhat létre. A virionók előnyösen fertőző vírusok, de lehetnek az RNS-t tartalmazó felaktivált, legyengített vagy replikáöő-defekífe vírusok. Előnyösen a vlrlon expressziójához szükséges összes információt kódolja a találmány szerinti DNSszekvencia.
A találmány szerinti nuklettssavak továbbá tartalmazhatnak egy vagy több jelentőséggel bíró feeterológ gént kódoló szekvenciái. A. leírás szerinti értelemben, egy gén ..heferolög gén”, ha az ««$n abból a koronavltnsből származik, amelyet az RhíS-íüggo RNS-polimstazt es a szerkezeti vagy nem szerkezeti fehérjét kódoló gének forrásaként alkaimaztönk. „feterológ gén” alatt ezáltal: olyan géneket is értőnk, amelyek egyfajta korosavírnslfol származnak, és egv másik í&jta koronavirnsból származó szekvenciákat tartalmazó vektorban vannak expresszáltafva. Bárrnilyem jelentőséggel bíró heíerolőg; gém rezeriáiliamttk a találmány szerinti nokleinsavakba. Emlős immunrendszere által, fertőző ágens antigénjeként felismert pepiidet vagy fehérjét: kódoló gén mzeríáiása különösen előnyős, A heferolög gén ezáltal kódolhat legalább egy, fertőző ágens elleni, immunválasz -indukálására alkalmas antigént, legalább egy, fertőző ágens tepiíkáeiójáf zavaró molekulát, vagy fertőző ágens elleni védelmet syójtő ellenanyagot. Más megoldásként vagy ezenfelül, a heterológ gén ímmunmodulátort, eltekint, smnntnenhaneert vagy gyolladáselienes vegyületet kódolhat.
A találmány széttöri, RNS-sé átírt DNS-bagmens mérete előnyösen legttlább 25 Kb. Legalább 30 Kb mérető írag;mensek. különösen előnyösek,
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint szerinti a DNS tartalmazza továbbá kotonavirus számos vagy egy kivételével az összes szerkezeti vagy mm szerkezeti fehérjéjét kódoló szekvenciát Más megoldásként a Saláhnány szerinti DNS továbbá tartalmazza koronavlrtss összes szerkezeti vagy nem szerkezeti fehérjéjét kódoló szekvenciát.
Egy további megvalósítási: -mód szerint a találmány szerinti onkteinsavak koronaviros gRNő-ébői származó szekvencia ttatiszkripciójáf szabályozó szekvenciát tartalmaznak. A szakterületen transzkripció szabályozására ismert bármilyen szekvenciát alkalmazhatunk erre a célra, beleértve DNS- vagy RNS-genosnokböí szár».«»·. *«· * β φ X * Φ » * «φ« * « φ*
X Φ * Φ » Φ Λ „ ♦·*· ♦··» ·*·♦**· « » ssazo gének expresszíőját irányító szekveuckte. A eúontegalovirtss (CMV) közvsűea korai OE) pnasnőserésék alkalmazása előnyős.
A találmány szerinti noklesnsavat: a 3' végen polí(.A)-fárokkal szegélyezhetjük. A. nukleinsav tartalmazhatja a szarvasabba növekedési termen (BGH) tonuáciés és/vagy pmistdenllácsós szekvenciáit. Ezenkívül vagy más megoldásként: a snkleinsav tortalsnnzhaí riboximot, például a hepaöítez-δ vírus (HDV) riboxímjáí: kódoló szék véne sókat .
A találmány szériád nukleiosavak báirstilyen koronavítusből származó szekvenciát tartalmazhatnak', példán! a sertés átadható gas^roeníerhhsz vírus fí'GEV), egér hepatitisz vírus (MHV)> fertőző bronehifisz vírus (ΪΒV), szarvasmarha körmstvtrus (BöCV), kutya koronaviras iCCoV}, macska korosavíuss (FcoV)· vagy teaiá» koronavírtis ízolátornáből származói. Egy előnyős megvalósítási mód szerint a nnkleinsav átadható gaszteeemeriósz vírusból származik.
A találmány tárgyát képezik, tovább eljárások találmány szerinti DNS előállítására, amelyek szerte fcoronaváusből származó detektív sníerferál© genomoí klónozunk promóier szabályozása alatt BAC-vefctorisa, é.s a detektív genom, deléeióil visszahszertátjuk. Az eljárás továbbá tartalmazhatja a. vírusgénem toxikus szekvenciáinak azonosítását a gesomiábs ÖNS-be történő visszainzesfeiása előtt Előnyösen a virnsgenoor toxikus szekvenciái az utolsó vissz&inzeríált szekvenciák a genom teljessé tétele előtt. A találmány szerint ez az eljárás alkalmas koronavíres fertőző kiőojainaik előállítására, amelyek legalább 80 generáción, kérészül!: stabilak baktériumokban, és ezáltal nagyon hatékony klónozó vektort biztosítanak.
A találmány tárgya koronavlrosből {Aímazan és mtsai., 20ÖÖ) származó fertőző kiónok kifeliesztése, valaroksi a fertőző klőnokbő! kouriruáit vektorok, melyek ixefetoiőg nukleinsav-szokveneiákíst is tsrtaltnaztsak a klónokba ínzertálva. A taláínrány szerinti fertőző klánoknak és vektoroknak számos alkalmazása van mind a!&p~, mind alkalmazott kutatásban, valamint nagy klónozás! kapacitása, és oly módon tervezhetők, hogy a laispeeifirásuk és troplzmusnk könnyen szabályozható,
A találmány tárgya olyan eljárás kifejlesztése, amely a koronavírusok történetében első alkalommal teszi lehetővé teljes hosszúságú, a. koronavúus ge&omjál kódoló fertőző cöNS-kiőn előállítását (Aimazan és mtsai.. .2000).
l-feterelőg nukiemsavak expressztőjára alkalmas új vektort vagy rendszert is kifejlesztettünk, koronavírjs genomiáiís RbtS~ét (gRNS) kódoló fertőző eDNS-kiőnbói létrehozott: koronavints sktpjázs. A találmány egy előnyös megvalósítási mód szerint a korona vírus a sertés átadható gasrtroenteriíisz vírus (TGE V).
Az áj expresszié© rendszert alkalmazhatjuk alap- vagy· alkalmazott .kaíatáistea, például jelentőséggel bitó termékek (fehérjék, enzimek, ellenanyagok, stb.) előállítására, oltóanyag-vektorként, vagy génterápiában, rnind emberekben, mind állatokban, A fertőző eDNS-klőnből előállított fertőző koronavirust manipulálhatjuk hagyományos genetikai mérnökség útjárt, ily módon új géneket építhetünk be a korottavínis geoemjába, és ezen gének expresszákathatő.k szövet- és feispeciíikns ínódon immunválasz isdukáiására vagy génterápiára. Ezenfelül az expressziót optiroalizáltuk új transzkripció-szabályozó szekvenciák (TRS) kíszelektálásávsl, amelyek lehetővé teszik az expresszi© több mint százszoros növelését.
A korooavírusbőí származó vektorok, különösen a TGEV-ből származók, számos előnnyel, járnak Immunitás indukáláxában nyáikabártya-membrteokbam olyan expresszsős rendszerekhez viszonyítva, mnelye.k nem replíkálödnak azokban: (í) a TG EV megfertőzi a. bélrendszert és légúti nyálkahártyákat (Bnjoaoes és Van dér ♦ S** ♦:*·*· « Λί 0 < 0 0 ♦ « » 0 β '♦·♦ * <· * * * « ~ Q »»» ** »··»* *>
Zejjst, 1995), -azaz a legjobb helyeket szekretórikns iísmnniíás mdaháíására: (si)-a tpopimim szabályozható az S y spike’) gén módosításával (Ballesteros és mísai., 1997); fiií) vannak nem kórokozó törzsek az expmszlós rendszer kifej íesztéssre, amelyek komplementálö virostől laggenek (Sünéhez és mtsai., 1992); és (tv) a koronavftasok citoplazmatikus RNS-vírusck, amelyek köztes DNS-áilapot ttélksl teplíkálödnak (Lat és Cavanagb, i 997), gyakorlatilag lebetefienné téve azok tmegrálődásjh a sejt kromoszómájába.
Az az eljárás, amely lehetővé telte fertőző koronavíms kinyeréséi olyas eDNS-bök amely korona viros gRNS-ét kódolja, az alábbi stratégiát foglalja magába;
íiij a korömtvíms genomjának klónozása bakteriális musleméges kromoszómába (BAC);
fin.) a koronavírns azon szekvenciáinak azonosid&a, amelyek közvetlenül vagy közvetve tovifatsak a baktériumok számára;
(ív) a koronavirns fertőző SNS-éí kódoló cDNS tenposensek. kapcsolási sorrendjeitek pontos meghatározása (promőterek, transzkripció-termHiációs szekvenciák, pol iádéul láciős szekvenciák, rtboztmok, stb,); és (v) módszerek és eljárások (BAC tenyésztési körülményei, BAC DNS oAzfhási eljárásának módosításai, transzformációs eljárások, stb.) azonosítása, amelyek együttesen lehetővé teszik fertőző korostsvfms kimentéséi cDNS-böh
A promóter feníos szerepet játszik a vitális RNS expresszié jának sejtmagban történő· növelésében, ahol az szimetizáiódik és később transzportálődik a citoplazmába.
A BAC alkalmazása a találmány szerinti eljárás egyik knicsponíjáf képezi. Amint ismeretes, enkarlöta szekvenciák klónozása bakteriális plssttnidokban gyakran lehetetlen az exogén szekvenciák bskférkasökm gyakorolt toxfcSása miatt. Eltekben az esetekben a baktériumok általában eiimínáiják a toxicitást a hejedatofi szekvenciák módosítása ólján. Mindazonáltal a jelen esetben követed stratégia szerint a virális szekvenciák foxíciffe sástak elkerülése véged, végrehajtottuk a szükséges klónozásokat a koronavírus teljes cDNS-éoek előállhástioa BAC-ban. Ezen plaztnidok esek egy példányban, vagy maximon! keltőben varrnak: jelen sejtenként, jelentősen korlátozva a toxidlásükai, és csökkentve a plazmsdok közöd! rekombináció lehetőségét.
A koronavíms baktórinmofea toxikos szekvenciáinak azonosítása révén elvégezhettük a koronavíros teljes genomját kódoló «DNS előállítását, a toxikus szekvenciák kivételével, amelyeket a teljes genom összeállításának utolsó lépésében adunk, azaz éppen az enkaríóta sejtekbe történő rtattszfeklálás előd, elkerülve a baktériumok általi módosítását
A találmány egyik célja tehát fertőző kétszálá «DNS, amely köronavíms gRNS-éf kódolja, valamint eljárás annak előállítására.
A találmány további célja rekotnbnráns virális vektorok készlete, amelyek tartalmazzák a fertőző klóm és a fertőző klóttba inzertéit hsterolög nökleinsavat.
A találmány további célja eljárás rekombináns koronavíms előállítására, amely szerint a fertőző klóm bejtidafjnk gazdasejíhe, a transzformált sejteket tenyésztjük: a fertőző klóit repl ikáé lóját és a rekombináns koronavlras előállítását: lehetővé tevő körühnények között, és & rekombináns korona vírust kinyerjük a tenyészetből.
A találmány egy másik célja eljárás módosított rekamhínáns koronavíros előállítására, amely szerint a. rekombináns virális vektort bejutatjuk gnzdasejíbe, azt tenyésztjük olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a virális vektor replikáeióját és a módosított: rekombináns koronavíms termelési, és a rekombináns korona«ί* *
fc # ·*
Sf «
Λ »
Ο*·- » vírust kinyerjek a- fenyészetbőt A találmány egy másik célja eljárás jelentőséggel bíró termék. előállítására, amely szerint a rekombináns virális vektort tartalmazó- gazdasejteket tenyésztjük a heterológ DNS szekvenciájának expresszióját lehetővé tevő köritlméayek között.
A lest említett fertőző klönokat vagy jekomblnáos· vírusvektorek tartalmazó- sejtek a találmány másik célját képezik, .A tákihnifey egy marik célját oltóanyagok képezik, amelyek állatokat védenek fesíóző ágensek' által okozott fertőzésekkel szemben. Ezen oltóanyagok fertőző- vektorokat tartalmaznak, amelyek legalább egy megfelelő antigént expreszxzátak a fertőző ágensek elleni immunválasz mdnkáíására, vagy legalább egy ellenanyagot tartalmaznak, amely védelmei nyájé a fertőző ágenssel szemben, gyógyászatilag elfogadható kötőanyaggal együtt. Az oltóanyagok lehetnek mono- vagy mferivulensek, attól íöggően, begy a vektorok egy vagy több olyan antigént expresszáfeak, amely képes jntmunválasz indokolására egy vagy több fertőző ágenssel szemben, vagy más megoldásként egy vagy több ellenanyagot, amely védelmet nyüjt egy vagy több fertőző ágenssel .szemben,
A találmány egy -másik célja eljárás állat immunizálására, amely szerint az oltóanyagot beadjak.
A találmány tárgya eDfeS-klón, amely komnavints fertőző RNS-él kódolja, sasit ezentöl a találmány szerion fertőző klönnak nevezőnk, amely tartalmaz: (Íj koronavírus fertőző genomiáíís RNS-e (gRNS) kompiémester DNS-másolstát (cONS), vagy magát a vitális RNS-t; és (2) egy további gén expressziős modulját, amely optimalizált transzkripciót elősegítő szekvenciákat tartalmaz,
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a koron&vfms TGEV-lzolátom, különöse® a P0K4Ő-MAD izolálom (Sánchoz és mis®., I99ő), amely módosítva van a vitás S-génjénete helyettesítése utján a Cl 1 -klón TGEV-ízoíátnm S-g-énjével, vagy kutya vagy humán teouavírus Sínjével.
A transzkripciót elősegítő szekvencia, vagy ptatnöter egy SNS-szekvenaia a korooavfeas bhvs.vő RNSének (m8NS) 5’ végén, amelyhez a vitális RNS-polimeráz- kötődik a hírvivő RNS (mRNS) transzkripciójának megkezdésére. Különös és előnyös nmg valósítási mód szerint a vitális genom cDNS-től expresszáiódik a CMV ÍE-promóterének alkalmazásával, müvei magas szintű expresszié éthetó el ezzel a premötertet (Dnbensky és mtsai., 1996), és a laboratóriumunkban kapott korábbi eredmények azt jelzik, hogy nagy··, TGEY kotonavlrusből származó detektív genonmk (9,7 kh és 15 kb) olyan RNS-etó expresszáltak, amelyeken nem megy végbe ’sphcing’ a sejísnagix?! - ahol sxmíeíizálóőnák - a chopíazmába való transzportjuk során.
A találmány szerinti fertőző klón- tartalmaz ttanszfaípeiő-tertnns^lós szekvenciát és polladeníláctós szignált is, mint például a Böbl-génből származót. Ezen. termmációs- szekvenciák®, a poli(Akíarok 3 végére kell helyezni. Egy előnyős megvalósítási mód szerint a taláhnány szerinti fertőző klón 34 Bukleoridnyí po.lí(A)~ farkat tartalmaz, és a BGH terntioáclős és poiiadenliáciös szekvenciáit, a HDV-riboóm szekvenciájával elválasztva a pofii A)-feíokí6i.
A plazroid, amelybe a vírus fertőző eDNS-ét Iszertálfnk olyan DNS-moíefcula, amelynek van replikációs origója, és ezáltal potenciálisan képes alkalmas- sejtbe» ttbténő repíifc&cíóra. Az alkalmazott plazmid a találmány szerinti fertőző klón megfelelő gazdastjthen, mint példán! baktériumba®, példáid SreAerrctóf coliban történő ftamtartására és repitkáclójána megfelelő topókon. A repitkon általában aaöbto&kumrezlsrtoBdagént hordoz, ami lehetővé teszi az azt hordozó sejtek szelekcióját (példán! cat).
- π « « ♦ > X «
Az I. példában TCBV fertőző klőnjátstk előállítását mutatjuk he, s CMV lE-promóíenmek szabályozása alatt, .A cDNS 3’ végén; egy 24 nnkfeotldnys polílAj-szekvencía, a ϊ-lDV-ribozim, és a BO.H transzkripciótednináclös szekvenciája talállsaíő.
A. íaláii5tány szerinti fertőző klön előállítására szolgáló eljárás szerint korontívirus gRNS-éből teljes hosszúságú cöNS-t állítunk elő, és azt ttsatópciá-szsbalyeeó elemekhez kapcsoljak.
A korosavtrus fertőző gkhlS~ét kódoló cDNS-t cSMS-ként klónozott, koronavxrasből szfemaaő Dlgenonüíől állítottuk elő, megfelelő promöter .szabályozása alatt BAC-haa, a cDNS stabilitósának aövelése érdekében. Azután a bakferiantokra toxikus szekvenciákat nzonositotfok, és & toxioitás eliminálása érdekében a toxikus szekvenciáké elwolitottnk és heinaettáfok a teljes: genom létrehozásának a végén, éppen csak az eokariöts sejtekbe történő tnmszféktálás előtt, a vitális utódokat rekonstniáihatjuk a BAC-plazond rtaoszfekcíója útján, amelyek tartalmazzák a horouavirus gestomot a vitális replikádét támogató eukariőta sejtekben-.
A tdurtzktipció-szabályoző elemeket hagyományos módszerekkel kapcsoljuk (Matnotis és mtsai.,
IWk
A találmány szerinti fertőző klóm mantpulálbaíjrtk hagyományos: genetikai mérnökség útján, hogy legalább egy heterológ rmkleinsav-szekvomeláí inzertáijuok he, amely meghatározod aktivitást kódol, olyan promöter szabályozása alatt, amely jelen vas a fertőző klónbas, és a kapod expressziét vektor .szabályozó szekvenciáiban,
A találmány szerinti fertőző kiónnak számos alkalmazása van; Például alkalmazható mind alapkutatásban, például koronavlrosök rsplikáejós és transzkripciós mcefedúzduisának teölmányozásábm, mind alkalmazott kutatásban, például hatékony rendmrerek kifejfeszteaében jelentőséggel bitó termékek expresszákatssára (fehérjék, enzimek, ellenanyagok, sfb.y
Megfelelő sejteket oumszfermálhaínnk a találmány szerinti fertőző cDNS-klőnnal, és .kinyerhetjük a ko~ rouavtrus teljes genomját tartalmazó vsdonokat. Tékát a találmány tárgya továbbá eljárás rekomblnáns komnavs:rtis előállítására, amely szerint találmány szerinti fertőző c'D'NS-t juttatnak be gazáosejtbe, a sejtet tenyésztjük olyas körülmények között, amelyek lehetővé teszik a fertőző klón expressziojái és replikáeióját, és a rekomblnáns kmonavtrnsfeól kapod vtrsonokzt kinyerjük, amelyek tartalmazzák a korona vírus fertőző genomját. A találmány szerinti fertőző klóst különféle aíakon juttathatjuk be a gazdasejtbe, például a gazdaseji danszfektáláa útján találmány szerinti fertőző kiönről fe v&ro átírt RNS-sei, vagy a. gazdasejt megfertőzése útján találmány szerinti fertőző eÖbiS-klőnaal. A találmány szerinti fertőző klánt, tartalmazó gazdasejtek a találmány további célját képezik.
A találmány tárgyát képezik, rekomblnáns virtisvektorok ís, amelyek taláhnány szerinti fertőző kiónból származnak, amelyeket ezentúl a találmány szerinti virosvektotoknak nevezünk. A találmány szerinti virasvektorok találmány szerinti fertőző cDNS-klöní tartalmaznak, amely ógy van módosítva, hogy' beteroíóg smkfeinsavat tartalmaz a fertőző kiónba inzertálva olyan: körülmények között, amelyek leheiővc teszik a beferolőg tntkleinsav expressziőját.
A „nakiemsav” kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben géneket és génfeagmenseket értőnk, valamint általában bármilyen D:NS- vagy RNIS-molekulak
12A leifíísi szerinti értelemben- a Jteíeroiőg” kifejezés alatt -nskleínsavsk vtmaiközásábaa olyan nokfetasavakat estünk, melyek normálisan .nincsenek jelen sí heterölog nafcfernsavnák a gazdasejtbe történő bejuttatására alkalmazott vektorban.
A ís’iíítew.y szerinti vinrsvektotbaa levő hetero.tőg tódeinsav lehet fehérjét, pept-ídet, epitőpot, vagy bármilyen jetefeséggsl hlrö géntemxékeí. (mint például ellenanyagokat, enzimeket, stb.) kódoló gén vagy géahragmeos.. /1 beterolőg nuklemsavat hagyomifeyos genetikai mérnöki módszerekkel maortálhatjuk be a találmány szertó fertőző kiónba a eDNS- bármely megfelelő régiójába, például az N és 7 jeiá gének, közötti ib ÖRF után, az imeiásiós ködöst (AUG) kővetően, és olvasási fázisban sassal a gtóek vagy más megoldásként más ORE-oknak megfelelő .zónákba. A találmány szertó vfensvekíor konstruálása seáán lényeges, hogy a heterolög mdcfeinsav beinzertálása ne zavarja az alapvető vitális femkelók egyikéi sem.
A találmány szerinti viresvektor egy vagy több aktivitást expresszálhaf. Ez «többi esetben a vlrasvektor annyi betérőkig nakleinsav-szekvenciát tartalmazhat, amennyi aktivást kell expresszábri, melyeket egy vagy több premófer előz meg, vagy egy prométer és különböző rtbosztóa-feiismerő helyek (ÍRES, ’ internál ribosome entry stó), vagy különböző prmnóíerek és egy rib<(szóma~fehsmetŐ hely.
Tehát a találmány tárgya eljárás jelentőséggel bíró termék elöálbíásárs, amely szeritó találmány szerinti vírusvekfert tartalmazó: gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények közök, -amelyek lehetővé teszik: a betérőkig ííökteiBSítv expresszáissút és a jelentőséggel bitó terméket kmyerjM. A hdátóiny szerinti vírus-vektort tartalmazó .gazdasejtek a találmány további céllal képezik.
A taláimány szerinti vírus-vektort égy tervezhetjük meg, begy .a fejspeci irtásai és tropizmusát könnyen szafeilyozbassuk, Ezen jellemzők következtében a találmány szerinti vimvek;ssr<ik nagyim érdekes alkalmazása: azok alkalmazása génterápiáim jelentőséggel bírt? gén vektoraként, vagy ebőanyag-véktorként különböző kórokozók -elleni tómmválnsz indnká-iásám.
A ratónány tárgyát képezik továbbá állat fertőző ágess által okozod fertőzésével szembeni védelemre képes oltóanyagok, amelyek tartalmaznak él) legalább egy találmány szertó vlnrsvektort, mely legalább egy, a fertőző ágess elleni inmumválasz iednkálásáta alkalmas antigént, vagy a fertőző ágens ellen védelmet nyújtó ellenanyagot expressz»!, adott esetben együtt Ili) gyögyásztóilag elfogadható kötőanyaggal.
A leírás szerinti értelemben „védelem isdakáiása’5 alatt a fogadó organizmus (tóntózálandó állati találmány szerinti virtrsvekíort&i -indukált. inmnxnválasza értendő, alkalmas mechanizmuson keresztül, mint példás! olyan anyagokkal indukálva, amelyek potcuciáíják a sejtes választ (interietónek, interferonok, stb,), sejtes sekrőzis fektorök, és hasonló asyagsík, amelyek védik az állatof fertőző ágeosek által okozott fertőzésekkel szemben.
Az „állat kifejezés alatt bármely fej összes állatát értjük, előnyösen emlősöket, köztük az embert.
A „fertőző ágens” kifejezés alatt a leírás szerinti éríelemben bármilyen vitális, bakteriális, gombás, parazita, vagy egyéb fertőző ágenst értőnk, amely megfertőzhet egy állaim, és betegséget okozhat.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti oltóanyag legalább egy találmány szerinti v-ínrsvektert tartalmaz, amely legalább egy, szisztémás- hmnonváfesz ésfeagy kátóbőző - légőti,. bélrendszeri nyáfahártya-metóránokban vagy más szövetekben szaporodó - fertőző -ágensek ellen ttyáStahártyaroetíferánbat! lévő smmonválasz itrdsrkáklsára képes antigént expresszi. A találmány szsrtntl vektorok jól alkat♦ * ~ 53 ~ >.χ* «♦ ♦* masak immunitás mdukáiásúra nyáíkahártya-JBeHíteáHtíkbau, valamim: laktogén immunitás máokáiásárs, ami kalőnősea jelentős úiszalöttek bélrendszeri fertőzésekkel szembeni védelnfehsn.
.Egy másik előnyős asegvaiősltási mód: szerkő a találmány szerinti oltóanyag legalább egy találmány szerinti vlrusvektort tartalmnz, amely legalább egy olyas gént expresszál, amely bármilyen izobpusú (például IgGi, IgA, stb,}, fertőző ágenssel szem!>eo védő ellenanyag könnyű. vagy sebez láncát kódolja,
A íitjspeciftiásl ágy szabályozhatjuk, hogy a vlrusvektor a kívánt fejt (ember, kutya, .macska, sertés, stb.) megfertőző koronavírus burkának S-fehésjéjéi expresszálbaíja, amely alkalmas a megfelelő fajok sejtjein lévő receptorok által történő fejisotofesre.
A találmány szerinti oltöasryagok lehelnek mono- vagy mnllivafeHsek, attól Inggben, hogy a találmány szerinti vmjsvcktorok egy vagy főbb olyan antigént espresszáinak, amely képes immunválasz indukálására egy vagy több fertőző ágenssel szemben, vagy ggy vagy több ellenanyagot, amely védelmei nyújt egy vagy több fertőző ágenssel szemben,
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik monovafens oltóanyagok, amelyek képesek ember, sertés, knlya és macska váfehnére különböző barnán, sertés, kutya és macska .ágensekkel szemben, és a sropiznmst a kívánt lajspedfiláss koronavíms S-giikoptoteinjéoek expresszálásávnl szabályozzak,
A sertés fertőző ágens elírni meuovafens oltóanyag olyat; vektort tartalmazhat, amely lényegében az alábbi sertés kórokozók antigénjei bármelyikét expresszálja: .••tefósoőoci/ias rAfenroprís.mmf>m«t:\ zh.'rt'm.dsocíí'ho' sart. Ηο-ηηηρΜίίΐ jmws, sertés parvoviras, feptosptra, Escórrfehio cori, rfenyadóme.
Aiísítíííríd/ií mídtoekfeí, Ztoyrfemífe broneőófíyafeat édosíridíut?? sp., ákrpnbpn áyoko,se?m%rimí. áfeop/nstmz /nop.oeamwrön·. sertés járványos hasmenése kas (FEDV), sertés légúti koronavlrtís, rotavlrtss, vagy olyan kórokozók ellen, amelyek sertés légúti és reproduktív szindrómát okoznak, Anieszky-fele betegség (pszcudoveszettség), sertés influenza, vagy átadható gasrtroeoteritisz, és afroíikas rÍródsz és probferaftv l.isinsz járványos ágensei. A katyn fertőző ágens elleni: monovafens oltóanyag olyan expressziős vektort tartalmazhat, amely lényegében az alábbi kutya kórokozók antigénjei bármelyikét expresszáijss; kutya herpeszvínssok, i -es és .2-es típusú kutya adenovírns, I -es és 2-es típusú kutya parvoviras, kutya reoviras, kutya rotavirns, kutya koronavírus, kutya parairtflaeuza vírus, kutya Influenzavírus, disziemper vírus, veszeísség vírus, reírovírus, és kutya, k&ifcivírus.
A macska fertőző ágens elleni monovafens oltóanyag olyan cxpressziós vektort tartalmazhat, amely lényegében az alábbi macska kórokozók antigénjei bármelyiket expsosszáija: macska kaifeivirns, macska imnmnbtány vírus, macska herpeszvírtisok, macska pánfettkopéula vírus, macska reoviras, macska rofavlrus, macska koronavirnx, macska fertőző peritonlílsz vírus, veszettség vírus, macska C/femortfe psfe'ncí, és macska leukémia vírus.
A vektorok olyan eiiemanyagot expresszálhatnak, amely védelmet nyújt fertőző ágens ellen, példátd a fen; idézed sertés, kutya vagy macska fertőző ágens ellett. Egy előnyös taegvalőslíási mód szerint a vektor a ŐA.C3 jelű rekemóistáos moooklonáhs ellenanyagot expresszólja, amely semlegesíti a TGEV-et IgCk vagy ig.A ízotipusként evpresszálva, amelyben az immunglobulin állandó része sertés-eredetik vagy humán. vtsgy sertés róla vírusokat xesnlegesbő e llenanyagokaí,
9r * * *
- Í4-Kötőanyagként oldószert, mint például fiziológiás söoldatot, vagy más hasonló- sóoldatot alkahnazhatnnk, Hason jóképpen ezen oltóanyagok tartalmazhatnak adítsvánst b azok közül, amelyeket általában alkakaazv nak míaá vizes oltóanyagok, mist példán! altuninimn-hlőroxkl, QtülA, abtnttúurst-géfek: szttszpcrtzioi és. hasonlók. mind ásványi olajokon, gücerídeken, zsírsav-származékokon és azok: keverékem alapuló olajos oltóanyagok kiszerelésében.
A találmány szerinti oltóanyagok tartalmazhatnak. sejtválaszt potenciáin (CR.P) anyagokat is, azaz-olyan anyagokat, amelyek poteneiálják segítő T-sejték szítbpöpuiáeiőis (¾ és Ttijj, mim például imerí.enfc«t-l (11-1), lb-2,31,-4,31,-5,11,-6,31,-12, gasntna-IFN (gamma-mtöábnas), sejtes nekrózls faktor, és hasonló anyagok, amelyek elstefeíiias. sejtes immunitást válthatnak ki vakcináit állasokban. Ezen Cftls anyagokat alkalmazhatjuk oltóanyogdoszereléseklxm vizes vagy olajos ndpiváasokkak Adjavteofc másik típusai - amelyek modulálják és immunológiáiig stimulálják a sejtes választ - szintén alkaisnazhatők, mint például. MDP (nwatnil-dipeptid), ÍSCOM (Immmsíámtláns Komplex), vagy iiposzőtnák,
A találmány tárgyát képezik m.oítivaiens oltóanyagok, amelyek képesek állasok kőlönbözö fertőző ágensek által okozott fertőzésekkel · szembeni megelőzésére és védelmére, Ezen mnlti-valens oltóanyagokat találmány szemti vírus vektorokból édlithatjbk: elő, amelyekben a tstegielelö antigéneket kódoló különböző szekvenciák.» azonos vektorba iazertáiíak, vagy független rekomhináns vektorok előállításával, amelytáteí később -összekevernénk együttes beoltáshoz. Tehát ezen maltivaless oltóanyagok olyan vimsvektort tartalmaznak, amely egynél több heterológ .neklejnsav-szefcvenciát tartalmaz, amely egynél több antigént kódol, vagy más megoldásként több vírtssveklort tartalmaznak, amelyek mindegyike legalább egy eltérő antigént expeesszál.
Analóg módos elixslhthasók olyan mohi valerts oltóanyaguk, amelyek maltívalens vektomkaf tartalmaznak, olystst szekvenciák alkalmazásával, amelyek fertőző ágensek ellen védő elfenanyagofcat kódolnak az antigéneket kódoló szekvenciák helyett.
A taláknány egy előnyös megvalósítási módja szerint a táláltnány tárgyát képezik olyan oltóanyagok, amelyek képesek emberek, sertések, kutyák és macskák: immunizálására különböző sertés, kutya és macska fertőző ágensek ellen. Ebből a célból az oltóanyagban lévő virnsvekíoroksak különböző antigéneket kell espresszálolsdí a fent említett vagy egyéb hsnnátj, sertés, kutya vagy macska kórokozókból.
A találmány szerinti ohőanyagekat folyadék vagy iioíilizált lormábtm lehetnek, és a rekombináns rend* szemek a. kötőanyagban történő fefczuszpeadálásával állíthatjuk elő. Ha a rendszer liodlizált tbrmábao van, a. kőtőattyag maga lehet a rekottstitóciós anyag.
Más megoldásként a találmány szerinti oltóanyagokat együtt alkalmazhatjuk más hagyományos eltóauyttgokkai, akár ástok részeként, akár oldószerként, vagy tnás hagyományos oltóanyaggal lelolásndő liófilizálí frakcióként:.
A. találmány szerinti oltóanyagokat beadhatjuk az állatnak orálisan, nazálisa», szubkutás, brtradeoroáissau, iftíraperiiosteálisan, mtrauruszktóárísss vagy aeroszolban.
A találmány tárgya tovább eljárás állatok, különösen sertések, kutyák és macskák tmmnníssálásáta, egyidejűleg egy vagy több fertőző ágens ellen, amely szerint találmány szerinti refcombmáns rendszer imsnunoiógiadag hatásos mennyiségét tartalmazó oltóanyagot beadunk otáiís, nazális, szubkután, tníradermális, mteapenfeneáhs, Intramnszkuláris vagy aeroszol ütött: (vagy ezek kombinációjában).
« *
Esenfelal a téíáteáay tárgya továbbá eljárás ássziiiöii: állatok védelmére az állatot megfertőző fertőző ágens éllé®, amely szerint találmány szedeti oltóanyagot beadunk orális, nazális, szubkután, nütadennálís, lotrapedtoneálls, indwtasakuláns vagy aeroszol átnő (vagy1 esek. kombinácíójálsm) anyáknak a szülés- előtt vagy alatt, vagy azok utódainak.
A találmányt -az. alábbi példákkal szemlélfetjnk, amelyek részletesebbe® is leírják a találmány szedeti fertőző klánok előállítását ás a találmány szertárt vi'rns vek torok konstruálását. Ezen példák nem tekintendők a találmány oltalmi körét korlátozónak, baoetn szemléltetik azt;. Az említett példában a baktériumok transzformálását és tenyésztését, a szekvenoia-efenmrést, és a plazntidok stabilitását értékelő vizsgálati eljárást az alábbi módszerekkel hajtottuk végre.
Baktériumok transzformálása
Az összes piazroidor. az £. coő DlllOB-törzsbe ekrétroporáiiuk. (Ötbco-BRL), kisebb módosításokkal a korábban lein protokollhoz képest {Shizoys és mts&k, 1992); Minden egyes fmuszlörmáláshoz a ilgálás 2 pl-ét és 50 td kompetens haktérinntoí kevertünk össze 8,2 csn-es csészékben (Biorad), és dekíropofáltonk. 28Ö ít, 2,5 kV és 25 p.F melled. Azután I ml SOC-tápkÖzeget (Maniatis és mtsai,, sárii) adtunk· az egyes transzformációkhoz, a sejteket inkubáitnk 37' C-oa 45 percen keresztül, és végül a rekombináns kolóniákat LB-SOC-császékeo detektáltuk (Maniatis és mtsak, 1989) 1.2,5 ggÁnl kloramfesnkoilal..
Baktériumok tenyésztési körülntényei
Az eredeti plazmidőkat tartalmazó baktériurookat, amelyekbe a TGBV nem teljes genomját kiönoztuk (3, ábrás, 3?':'C-en tenyésztettük, normális növekedési kinetikával. Másrészről a teljes cDNS-t tartalmazó BACot 3043-οη tcnyészréltők, az instabilitás lehető iegnagy-obb nnrnmshzálása. érdekében. Még így is a kolóniák mérnie csókkeni, és 24 órás inkubációs időkre volt szükség normális kolóniámén?! elérésére.
DNS tisztítása.
A Woo állal lein protokoll! (W’oo és ontsak, 1994) követtük, kisebb módosításokkal, Egyetlen kolóniához 4 L LS-t oltottunk be kleramfemkollai (12,5 gg/ml). SFC-on való 18 órás inkubációs idő után a baktérinmokat összegyűjtöttük eenlrii'ugálással bÖOO g-n, és pfezmldöt ntegdszsííuituk élfegm? /Afesmá?' áázciőrepuforimss tói alkalmazásával a gyártó javaslatai szerint. Ezzel az eljárással azt figyeltük meg, hogy a kapott plszmíd DNS bakteriális DNS-sel volt szennyezve. A szesmyezö bakteriális DNS eliminálására a aláznád DNS-t cemtrifugálással tísztitottak 55000 rpm-mei lő órán keresztül CsCi-gradicnsen, .A kapott kitermelés 15 és 30 gg/L között volt, a plaznrid méretétől függően.
Szckveneiaelemzés
A DNS-t nuígszekvenátek automata szak vénáimban (3/3 £>ΛΜ őA/mmcez, Applied Biosystems) iloosükrémokkal jelölt dideoxtonkieotidok és feostabíi polsaetáz alkalmazásával (Ernáin Elmer). A reagenseket reagenskészlef formájában szereztük be (.4/5/ BfelW .öye 'fermfeörér Crcfe .$ítg«e«efeg feafe Afeoc'rém O) az Applied: Biosystems cégtől, A szekvenálás végrehajtására alkalmazott PCK-készőiék a Dezíe/ímpBCS ^sa» W (Peréin Elmer) volt.
A szekvenciák összekapcsolását és azok összehasonlítását a TGBV konszenzus szekvenciájával sorrendben a őivrérim // és dógn programokkal hajtottuk végre (DNASTA.R). Nem. detektáltunk különbséget az elfogadott szekvenciához viszonyává.
A piazmláok stabilitása « » « « X « ♦ X
Az eredeti glicerines tenyészetekből növeszteítsk. a rekomhiaáns pBdoBACU plaztnidol tartalmazó baktériumokat 20 mt l..S-bea, kloramfemköi'fel (12,5 pg-kítí,) I§ órán kérésziül 3ÖX és 37Χ1-ΟΠ. Ezt tsz anyagot. tekintetűik ö. passzálásaak. A. baktériumokat. löMzeawa Idgrioitok, és 3öcC és 37 -C-ors tenyésztettük 16 órán keresztül. Sorozatos passzázst végezíSnk: 8 egymást követő napos keresztül (tmades posszélás .megközelítőleg 20 generációt repezeotál). A pfeztnlá DNS-t íKegusztltöitísk misnípreppd a 6. ás 8.posszálásböí (160 generáció). és- elemeztük restrikciós emfonakleázokkaL A TGEV genomjának részét tartalmazó két ploztnld nagyon stabil volt, nag a TGEV teljes genomját tartalmazó piszmidok bizonyos instabilitást mutattak 40 generáció urán (ennél a pontnál a DNS .$Ö%-a matatta a helyes restrikciós ntírádzatot).
1. példa
Rekomhináns vektor kousttnálása TGEV-böl származó fertőző· cDNS któnja alapján
1.1 TGEV fertőző cDNS-ének előállítása
A teljes TÖEV-genomot kódoló cDNS· előállítása céljából eredetileg a defektív Dl-G-genomoí kódoló cDNS-bői indaitank ki (Mendez és mtsai.., 1996). Ezt a clDfeS, amelynek a hossza megközelítőleg egyhsnsraőa a TGEV-genomnak, az alacsony kőpíaszástü pACNRl 186 plazmidba klónozlak (Ragglí és ntlsai... 1996), ás meghatároztak a szekvenciáját, A detektív geríomot kódoló cDNB-t hatékonyan kimemettők (repltkáltuk. és pakoltuk) kompiemearáló vitás segítségével (Ménhez és mtsai., 1996; ízeta és mtsai., 1999).
A Dl-C-gesorn három deléciót (Ál, Δ2 és Λ3) tartalmaz, amelyek megközelítőleg lő, 1 és 8 kiiobáz-rt (kb) méretűek, sorrendben az la, Ib és az S és 7 jelű gének közötti ÖRF-okná! (lásd a 1. ábrát). A fertőző TöEV-geaomot kódoló cDNS-szekvencia teljessé léteiére alkalmazott stratégia az volt, hogy lépésenként heépítjük a Dl-C-gesotuból delerák .szekvenciákat, az ójottnsn létrehozott konstrukció baktériumokra gyakorolt toxic kásának elemzésével, Ez á szempont nagyon fontos, mivei a tudományos szakirodalomban széles körbe» dokumentálva van, hogy RNS-vírusok eDNS-ét prezentáló rekombináns plazmidok álíalábao gyengén növekednek és instabilak (Boyerés Ráenni, 1999; Rice és mtsai·., 1989; Mandl és mtsai., 1997).
Az első kiegészítendő deléció az ib ORF rkb hosszúságé A2-de.léeiója volt, ami stabil rekombiate plazmjdot eredményezett. Az; la ORF-ot nem. tartalmazó- szekvenciái az A, B, € és D cDNS-frágmensek klónozásával építettük. 'be (1, éhraXAlmazan és mtsai., 2tíOŐ) oly módost, hogy a replikáz géssjéhez szükséges összes információt teljes fest. A kapón rekombisráns plazmid hsstííbl! volt a bstktéritsotokbso. új plazmáinkat létrehozva, •amelyek addicíókat és deléeíókat tartalmaztak a B-fragraenshett (Ahnazan és mtsai., 2000), Érdekes módon egy 3198 hp hosszúságé C'laí-Chtí restrikciós frsgrneos eliminálása - amely a 4417. és 9615. nukleotidok közötti genomrágiöt tartalmazta (Pouzos és mtsm., I999) - egy viszonylag stabil plazmádét eredményezett -az £ coA DHlöB-tőrzsfees, Résóbő a A3-de!éeló szekvenciáját adtuk hozzá a 'TGEV-gemom 3' végén lévő- szerkezeit és nem szerkezeti lekérték összes genetikai információjának klónozására < 1. ábra).
A TGEV cDNS srábldrásának növelése céljából ágy dömötítrák, hogy az szaibklónozzak BAC-han a pBeloBAO l.-p.lazorid alkráoiuzásóval (Kim és· mráai,, 1992)(!ásd a 2, ábrái). A. pBcloBACI l-plazraid H. Sbfenyo és M, Simon (Cítíltóraia lariitate: of Toerátoiogy) nagylelkű ajándéka volt. A plazmid 750? bp mérető, és tartalmazza az £ coö porB-tí parCrt és az F-faktor repükásiós origóját (oriS), és a práamid sejtenként egy példányban való burásához szükséges géneket (parA és repE). A plazmid tartalmazza a kleramieníkoi reztszleuctagént (cet) is szelekciós tuarkerként. A oDNB-t CMV lE-premótsre szabályozása alatt klónoztak, st promóter alkalmazásával kopott magos szintű expresszié torait (Dahcttsky és nstsfe., 1.996), és a laboratóriumunkban ko· π0 » X ♦ X ♦ » » * * » *
X ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ *<♦ X ♦ ♦♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ' ♦
0· # X « 0 » ♦ * * * * rébban kapott korábbi eredmények miatt* amelyek as$ jelzik, hogy nagy (9,7 kb és 15 kb), TGEV-ből szárásszá deíéktiv genomok olyas RMS-eket expresszábak, amelyeken nem megy végbe· ’xplfeing' a sejtmagból ···· ahol szűüciizálódnak - a citoplazmába való transzport során (Izóra és stisai,, 1999; Pénzes és sstsai,, 1999; A'lmazaa és mtsal.. 2000), Az látóhoz©» TGBV el>NS (pB/lC-TcDNA-Aelal) tartalmazta a repiikáz génjeinek az információját, a delétáh 5 198 bp mérető CM-lragmens kivételével, és a szerkezeti és sem. szerkezeti gének összes sslormáciöját. A cDNS 3' véges egy 24 onkleoiídnyi pölnÁj-szekvencia, a HDV-ribozirtr» és a BGH tmnszkripe:ió-termtnácíds szék vette iája található (Izem és mtsal, 1999). Másrészről a TGBV genomjátsak teljessé tételéhez szükséges Cksl-íregmenst BAC-ba klónoztak, a pBÁC-B*C*D5’' plaztnidot létrehozva, amely tartalmazta a TGEV 43:10, és 9758, nokleotsd közötti régióját (lásd a X ábrát). Mindkét ptemldoí tenyésztettük & coő GHIöB-törzsben, és teljes egészében megsxekvenálink. A kapott szekvencia azonos volt a bejelentés végén közölt IAiR46~sMAD jelű TGEV-ízoláPsm elfogad©» szekvenciájával (1. m-íonosiídszáínó szekvencia)- két helyettesítés kivételével, a 6752. tníkleotidpozfciboál (A -> G, csendes) és 18997. pozíciónál (T :-> C, csendes), és feJRáé-MAD 8-génjének a ül-izolátora D-génjével történő helyettesítése kivételével (ezeket a változásokat jelezzük a 4, ábrán).
Ezenkívül virulens TGBV-t kódoló cDNS létrehozása céljából a PliR4ö-MÁD-iz.nlátuin 8-génjéz, arttely magas szinten reptikálödik a légzöcntkíusban (:>I(B RFli/g szövet), és alacsony szinten a béltmkmsban (< 10' FEUótíL), teljeses helyettesítettük a I l~es TGBV klón: S-génjcvel, amit ezentúl C l fenek nevezünk, atnely megemelkedett ikerrel repllká'tóőlk mind a iégzőirsktósba® feKB FPli.óaLE mind a békraktuxb&n (<106 PEU/mLjCSánchez és oltsak, 1999), A CK S-géoje 14 nukleoíidban tér el a Rl.lB4ő-.MAD-izoláfmn S-génjétől, plnsz 6 nekleotid Inzereidval az S~gén 5’ végénél (lásd: a 4. ábrái) (Sáochez és srássk. 19991 Korábbi eredmények a iahoTatórhmmokisarí (Sánshez és rnísai,, 1999) azt matatták, hogy irányított rekombinációvá} létrehozott .nmlánsok, amelyekben a TGBV FUR46-MAlkizolátómsc-ak S-gémjél helyettesítettük a Cl 1 bélrendszeri izeláitím S-génjével, bélrendszeri, bopizmusőak és megnövekeáeti vírnteneájüak lettek, ellentétben a természetes PVR46-MAD TGBV-íxoláíummal, amely csak nagyon kissé vagy egyáltalán nem repiikáiódik fertőzött sertések béltraktosáhao.
cÖNS-t konstruáltunk a PUR46-MAG TGEV-lzolátomböi a bélrendszeri Cl feizoláünn S-génjével, a pBAC-B'-KA-DS’ piazmldböi előállított 5198 bp hossxóságá Clal-feagntensnek a p.RÁC-TcDNA'plaznüdba történd bekiőnozásávak létrehozva a pBA-C.....Tc.Öhl A5'1 plazsnídot, amely tartalmazza a teljes TCdsV-genemot kódoló cDNS-t {3. ábra). Elemeztük a fertőző cDNS klónjúnak konstruálásban alkalmazott plazmldok (p8ACTcDbtA''·,w> és pBAC~~T?Cial’), valamint a teljes cÖNS-t tartalmazó plazmid (pBAC-TcDNA'^) stabilitását baktérímnokban, mintán 160 generáción: keresztül tenyésztettük co/i-baa. A stabilitási a tisztított DNS-ek restrikciós enzimes emésztésével elemeztük. Nem detektáltunk sem inzerelókaí, sem deléelókat, habár az elemzési módszer által nem detektálható kisebb vtiltozások jelenlétét nem zárhatjuk ki a pBAC-TeGNTV^!sí piaznüd és a pSAC-B-t-C-t-DS* plazmld esetében. A pBAC-TéÖNA plazmái esetében, aussly a TGBV teljes genomjái tartalmazza. bizonyos instabilitást detektáltunk 46 generáció után fennél a pontnál a DHS 80%-a matatta a helyes restrikciós mmtázatot.!. Ez a kis instabilitás azonban nem jelent akadályt a kettőző vírus kimentésénél, mivel 2Ö genesáeídnyi <4 L tenyészet esetért) bakteriális növekedés elegendő a vírus kimentéséhez szükséges plazznidDNS tnennyíségétsck létrehozására.
.Fertőző TGEV kímesnése a teljes genomot kódoló- eOöiS-böl
ST-xejteket transzfektátesik pBAC-'i'cDNA^' ptemiddak 48 órával a tranxzíekbilás «táa a tenyészet fiílölúszóját összegyűjtöttük és ST-sejtekbe passzáiíuk 6 alkalommal (lásd a 5, ábrát). A 2, pssaszálástöl kezdve, 14 öraval a fertőzés «tán, a ciíopátiás hatás láthatóvá vált, és tovább terjedt a feslözós ntán 20 órával gyakorlatilag az összes, az egysejtes rétegei alkotó sejtre (lásd a ó. ábrát). Másrészről a kimentett vitás litere gyorsa» növekedett a passzálásck sorsa, lő PFU/mL nagyságrendet elérve a 3. passzálásra (lásd a 7. ábrát), A kísérletet ötször megtssnéíelíük, és az összes esetbest hasonló tfeö fertőző virtsst kaptunk, míg a oem transzíekiált STsejíek vagy hasonló phszmiddal íranszfökíáit S í-sejtek esetében, ahol a Claí-CIal-feagrssetts íórdífott tréssyitstosághan volt található, nem kapósak soha virtsst
Azon lehetőség elnrsíriáíása céljából, hogy a kapott vírns szessrsyezés terméke, meghatároztuk a szekvenciát· a 6752, és 13^7. pozícióban a kimenteit vírus geaemlálís DfeS-ének tesstplátkésst törtésó alkalmazásával, RT-PCR-rel ssosplsfekáh -eöNS-fiagmeos szekvenciába sitjáss. A szék véne la elemzése meghatározta, hogy a 6752. és 13997, pozícióba!? lévő mskleoíidok a cDNS-ben jelen lévők voltak. Ezenkívül a kimentett vírus S~ génjének cDNS-éheu a örelíl restrikciós hely volt a 2ÖÓ9Ö. pozícióban, amint aztaCl-l. S-génjébe»: vártuk (8. ábra). Ezen három gesíesikal rn&rker jelenléte megerősítette, hogy a izolált vírus a cDNS-ból jött.
A keletkezed vírus alaposabb jellemzésére összebasoolito elemzést végeztünk a p8A€-TcDNAa' plazmáddal történd trsmszfeksáó «társ nyert vírussal (TcöMA) fertőzött sejtek vagy PÜR4Ó-MAD TGEVizosádmnstsl fertőzött .sejtek itmrnmfíeöresxcenemja uíkahnzzásával. Ebből a célból specifikus poliklonálís és tnonoklooálís eilesuusyagokat alkalmaztunk, amelyek fehsuserík snirsd a €11, mmd a EUR464MAÖ izoláfamot, vagy csak az utóbbit (lásd a 10. ábrát), A kapod eredmények igazolták az áj TcDNA-vfrus várt sstogersítását. A TGEV-re specifikus poüklorsális -ellenanyag, az S-fehérjére specifikus msKSöklonális ellemrayag (10.1312 és 6A.C3-X valamint az M-fehésjére specifikus (38-.83) és öt-fehérjére specifikus (38.83) monokionális ellenanyag felismertek mind a TcDNA-t, snind a RVR4ő-MA.D-of. A kapott adatok azt jelezték, hogy a keletkezett vírus prezentálta a Fi.ife46--M.A1> izolátora M- és N-íéhésjéiS: és a Cl í-izolátotn 8-fehésjéjéf, amist az eredeti c-DNS-t tervezték,
1.3 /?; vöm leríözöképesség és viruleneia
A TcDNA-virus ín vőv> fertőzöképességérsek elemzése céljából 5 újszülött malacot olíodank be a .klónozott vírussal a ö, passzázsból, és elemezhsk a mortalitást Az öt beoltott snalac elpusztult a 3-4. napon az oltás «tán, jelezve, hogy a TcDhlÁ-vírtss virulens volt.. Ezzel eiléatélbers a csak a vírus oldőszesével oltott és azotsos körülnsények közöd tartod két. malac állapota nem változott.
1.4 Az expresszié szintjének optimalizálása a úarsszkripcks-szabáíyozó szekvenciák módosítása shján
A kortsnavirns RNS-szintézise KNS-íüggő folyamatba» ntegy végbe, amelyben az mRNS ssogativ polaritással íródik át n tempíáiróE A TGEV-ben CUAAAC konszenzus szekvencia található, amely a gének többsége előd helyezkedik et. Ezen szekvenciák szignál! jelentenek. a szubgesmmhills mRNS-ek dnssszkrlpeiójása. A koronavírusban ő-8 tipuss, kíilös?böző hosszúságú: niRNS vats, a korotsavínts és s gazda típusától íUggóen. A legnagyobb megjelel a genorstlálts RNS-nek, és mRNS-ként szolgái az la és Ib ORP-oknak. A többi mRNS szobgenossíábs ssRNS-nek. felei meg. Ezen RNS-eket 1-7-es snRNS-nek nevezik, méret szerint csökkend sorrendben. Másrészről bizonyos srsKN S-eket, amelyeket az eredetileg leírt.mRNS-eket elnevezése után fedezsek fel. a meg« * »« «♦
X *
felelő mRNS-ek nevével «evezték el, plusz egy kőíőjdkd és egy számmal, példás! 2-1-es mRNS. Az mRNS-ek .kotenmális szerkezetet képviselnek a genotniáiis RNS szerkezete mellett A legkisebb mRNS kivételével a többi poiteisztronos, inig; általában csak az S’ véghez legközelebbi 0RF tnmszlálódik.
Tmulmányoztuk markergén (GUS) expresszlójárs&k hatékonyságát olyan különböző szekvenciákkal, amelyek az internén i'IG) CGAAAC-szekvesela 5’ végét szegélyezik. (IK ábra), amelyek az IG-szekvencis 3’ végét szegélyezik 02. ábra), és különféle fezerciős helyeket szegélyeznek 03. óbbra). A kapott eredmények <1113. ábrák) azt jelezték, hogy optimális expressziét értőnk el olyan TRS-sel, amely az alábbiakat tartalmazta: (i) a TCsEV N-génjénck elfogadott szekvenciáját szegélyező -SS nskiootid; (ti) az IG-szekvencia; és (hí) az S-gén lüszekvene iájának .3’ szegélyező szekvenciája.. Ezenkívül megegyezően a betérőkig gétt inzerciós pontjával kapcsolatban kapott eredinényekkel, a legnagyobb szintű expressziét akkor értök el, amikor a heteroióg gén a genom 3’ végén helyezkedett el. A leírt TRS tehetővé teszi, a GUS 2-8 gfei Ö4' sejt szintű expresszióját
l.S Az expressziós rendszer szöveíspectfttása
Sok kórokozó jnt be a gazdába a nyálkahártyákon keresztül. A fertőzések ezen. típusának megakadályozására fontos olyan expressziós rendszereket, kifejleszteni, amelyek lehetővé teszik: -magas szintit szekréciós lm«ámítás fednkáiáxát.. fezt alapvetően antigének légxötrsktasssí és béitraktessai kapcsolatos nyirokcsomókba történő beadásával érhetjük el. A cél elérése, és általában gén jelentőséggel bíró szövetben történő expresszipjának irányítása végett tanulmányoztuk TG EV trepiznmsámk molekulám alapjait. Ezen vizsgálatok azt mutatták, hogy a TGEY szőveispecshtásáí módosíthatjuk olyan rekottfománs vírusok koash-nálásával, amelyek a kívánt tropizmt3sú korottasdnts S-génjét. tartalmazzák (Ballesteros és ratsat., 1997; Sánchoz és tntsai., 1999)- Ez az inÍbí-fnáciö lehetővé teszi koronavíros ciáNS-genontján alapuló expressziós rendszerek .konstruálását légúti vagy bélrendszert, tropikussal.
Ló RRR.SV ORES-je által kódolt vlrális antigéu expresszáliatása fertőző cDNS alkalmazásával í-feteroiög gének expressziós szintjének optimalizálása céljából klónozó szekvenciákkal. szegélyezett.
cserélhető modulokat tartalmazó vektort konswáhunk, amely elősegítette a T'RS-ek és heteroióg gének kicserélését ; vektorban. A konsfotkeie - amely tartalmazta a FRRSV (sertés respüatorlte és reproduktív szindrótoa vírus) ÖRFS-jét, az 5' végen. szegélyezve a rninimáfis IGS konszenzus szekvenciával (CUAAAC), megelőzve azt a virális nnkleokapszkl (N) génjének -88 rmklsöíidjaival, és a 3 ’ végen szegélyezve a Sáli restrikciós hellyel (GTCGAC) és a Kozák (AC)GACG-vel analóg, szekvenciával - optimális expressziót eredsnényezetí: (körülbelül l.Ö gg/lö'* sejt). Elvben a beterológ génnek, ez az expressziós ssfoije több ráírat elegendő intnntnváiasz iodnkáiásásrt. A heteroióg gént a vírus ttelkaíözheíö 3a és 3fe génjei által korábban elfoglalt pozícióba mzertákuk.
1.7 Immunválasz indukáiása sertésben cDNS-ereáeta vírwvekferaml expresszáitatob. amígéure
A fenti típusú eDNS-eredeSú vírus vektort és a feni leirt TRS-eket alkalmazva magas szinten <20 gg miihő sejtenként, sertés hegsejtekben, Sl'-sejtek) expresszáisatktk a zöld Ruorwcens fehérjét (GFP) kódoló gént. Az expressziós színi stabil volt több mfot 2Ö pasSzálásura keresztül sejtevészethen. Ezenkívül sertéseket immuntzálímk áz él.ö vírus vektorral, amelyet orális, foítanazáJis és inteagaszirikas úton adtsnk be, és erős Immorális immunválaszt detektáltunk trend a vírusvekíor, mind a GFP ellen. Érdekes módon nem íígyeifook meg másodlagos hatásokat az oltod állatokban a vírusvekíor három dózisának beadása «tán.
1.8 Biztonságos virtts vektor konstruálása, amely expicsszálja az idegen gént fertőző vírus létrehozása nélkül >«** »«
-20- ♦♦ *«·· ··
Humán alkalmazásra abto vektorok tervezésekor a biológiai biztonság elsődleges. Ezexs cél elérésére bármrtíska. biztonsági megoldást épltettífek be a vektorba. Ezek. közöl kettő két. víruskomponens dotációján alapul, amelyek a vírusgénem külósbözö pozícióiban találhatók, és esszenciálisak a vírus teplikádöjáboz. Ezen komponenseket wm-s módon bizsoshjnk,. pakoló sejtvonai htján. Ez a sejt CBaby Hatnsíer Kidseyú fíHK) expresszálja a vírus hiányzó esszenciális szerkezeti fehérjén (az E bmokiehérjét és az M nmmfcránfetójét) kódoló TGEV-géoeket A harmadé biztonság? megoldás a vírusgénem· pakoló szignáljának az áthelyezése, oly módon, hogy az megakadályozza fertőző vírus rekombináció útján, történő kialakulását., öngyilkos vektor keletkezéséhez vezetve, amely hatékonyan oxpresszátja a heterológ gént, de képtelen szaporodni meg a legközelebbi •szomszédos sejtben is.
.Az emberi alkalmazásra tervezett éj vektorral «etn álh'ásnk elő éj vírust, amely szaporodhat az emberi fajban, mivel a vektor nem vihető át sejttől sejtre emberekben. A vektor replikáciö-deféktiv víruson alapul. Csak oltóanyag-gyárban tenyészthető a vimsban lévő deléciót komplesnesnálő p&kolősejiekben. Ezen biztimság? megoldások új eljárásokat .képviselnek koronsvifw tervezésében, Az új tropizmusú rekosnbináns vírus replikáeiófcépes lehet legalább maeskssejtekben, mivel ezen sejtek, replikáinak humán, sertés, kutya és macska, koronavlrusoktá..
Mskroorgiusizmasok letétbe helyezése
Az őbohítfffeií; cö/bfeol szárutazó haktériamot, asucty a találmány szénád fertőző kiírni tartalmazó piazmktot hordozza, lotétlx; helyczíök CECf 5265 lajsíromszám alatt a 'Spanish Collectioo of fype Culhnes’nél (CECT, Btujasset, Vafesteta), 1999. november 24-én.
.77.
Hivatkozások
Ahlgtifei, P., R. Freneh, M. fesd», és EK Loeseh-fnes, „Moibcompottenl RNA plánt vírus tnfecdoo derived frotn elöned viral eDNÁz, Proc. AbíZ ,4cu<í &/. íZteí. 81, 7066-7979, old. (1989)
Almasan, F,, XM. González^ Z. Pénzes, A. baka, E, Calvo, X Piana-Dmán és E. Enjaartes, „Ettgfeeeríng tbe largest RNLA vírus genoute as an infecíiotis baeteríai artioml -dtKunostune.” Jteoo. M ,4ead Scí GSH. 97, 5516-5521. oíd. (2000)
Ifellesteros, M.L., C.M, Sánchoz és E. Emnanos, J«® ammo aeid changes at tbe N-istminus of transndssíbie gsstroeriterteis corona viríts spíke protein resah ás ttee loss of entorie teopisnv’, teteo/ogy 227,.378388. old. {19971
Báron, M,.D, és T. Barmit, „Rescse of riudenpest vírus front etoned cDNA.”, ,Z feroZ 7'f, 1265-1271, old. (1997)
Boyer, j.C. és A.L. Haenai, „Iniéctious iranscrípts and eDNÁ dőaes of RNA vírusé»”. PmoZogr. 19S, 415-426. old. (1994)
Chaag, R. ¥„ M, A. Hofínasö, P. B. Sodra» és D. A. Brían, „A ds-aehsg fenoíios fór the coronavíras leader is. defectíve Interfermg RNA ropftcaSíon?', >/. FAoZ 68, 8223-823 X old. (1-994)
Colliss, P.E., M.G. Hűl, E. Csmargo. H. Grosfeid, R.M. Chanoe'k és B.R. Murphy, „Produetíon of itífeeóous humán respiratory syticytial vírus front döfted oBhiA eoaltats an esseaikd roie ídr the tesstsenptkm elongateon ihdor írom ihe 5’ proxúual opett rendíng teamé of fe ,M2 rnSNA itt gene expresslnn and provkfes a capábílity fór vaeeíne development”, /Voc. AmZ ΑηοζΖ &?. (ZS-te 92, 11563-1 i 567. old: (1995)
Davis, M.L., L.V. Wilhs, XF, Sntiíh és R.E. .lohaston, ,,/« vkro symhesls of infecíious Venezuelán eqtttne eaeephalibs vírus-RN A. írom a cDNA clöne: aaaiysis of a víable deleíioo muíant”, FAo/c-gy 171, 189204. old. (1989)
Dnbensky, XT.W., D.A. Driver, XM. Polo, B..A. Belli, BM. hadiam, C.E. Ibaaez. £. Cltada, D. Briüran, T.A, Banks, SJ. Vtem.to, DJ. lolly és -S-.M..W, Chaag, „Siodbis viras DNA-based espressioa veotors: utlliíy fór in vilro and ín vivő gene transter?) X Ftraf. 70, SÖ8-519. oki. < 19961
Derbin, A.P., S.E. Hali, XW. Siew, S.S. Whiídtöad, P.h, Collias és B.R. Mnrphy. „Reeovery of infechüiís humán paramifeenza vírus type.3 írom cDNA..”, Ptroíogy 235,323-332. old. (19971
Enjuanes, X., S.G. SíddeiI és W.X Spaan, „Corottavlruses and .dteerbszasev ”, kiad.: Fleninu Press, New York (1998)
Ettjoattes, L. és B.A.M. Van dér Zeijsá, „Mol.ecuhtr hasis of teansodsssbb gasiroenterhfe eoroaitvirus egídemsoiogy,”, „The Coro««vWdűí?,”, 337-376. oki... szerte; S.G. Sidáell, kiad.: Piemtm Press, New York (1995)
Frolov, E, T,A. Hoftenart, B.M. Prágái, S.A, Diyga, N.V. Ifeang, S. Schlesinger és C..M. Sicc, „Aiphavlros-hased expresskm veotors, Strategíes and applicaíioosf', ZVoo. ,Y<»7. Anad &d. <zS4. 93, 13,37111377. old. (49961:
Garein, D., T, Petet, P, Calain, E. Romi, X Cnrran és B. teolakof&ky, „A hlghly recontfeinogeítio System fór Ihe recovery of infechous settdai parsmyxövhw feom oDNÁ, geoeratioo of a növel.”' £A/Bé3 9. 14, 69876994. old. (19951 ♦ *·χ· *
-23-.
Geigenntóíer, U„ Ν.Η. Gitóon és S.M. Maisai, ..Consirsodon of a genome-iensth cDNÁ ciáné fór humán asfrovifus xeroiype 1 and synihesis el' inlsctions RNA tíwscffpfs.”. J, P'ízoí, 71, 1713-1717, old. (199?)
Izela, A... C. Smerdöö, S. Ateaso, Z, Pénzes, A. Méndez, J. Plana-fbmáo és t. Eojuanes, „Replkaíion and paekssing of íraossuissifeie gasöwnteritls eorooavitus-deíived. synthetie mmígenomes,”, J. P7to.(. 73, 15351545. old. (1999)
Kim, U.-l., H- Slózoya, B. de leng, B.W, Bírren és MJ. Simon, „Sínble propagatioo of costnid-sized humán DNA inserts ín sn IMaeser fessed veetor,”, A’so/éicAefűb Kas. 20, 1033-1085. old. (1992)
Lai, C.-X, S. Xfeae, H. líorí és M, Bray, „Infeebons RNA Ranscríhed Rom stably closed fall-lenglb eDN'A of designé type 4 vírus.” fw. >¥< zKzaf Kei. íiRI. SS, 5139-5143. old. (1991)
Fai. M.M.C. és D. Cavaaagh, „The medeenlar biolegy of cöernsvirases.”, zfdfc fs-» Rés. 48, 1-100, oki. (199?)
Laí, M.M.C., C.-t. Liae, V.-3, Lín és X, Zhasg, „Coronavbus, how a large RNA viraí genome is replíeated and íranserlbedf', Áf/ncf. zlgcnzr Dia. 3,98-105. oki. (1994)
EiljesírOm, P., „Alpbavinss exps'easíos sysiems.”, far. éfeóí. Sioigefe. 5, 495-500. ofd. 0994) luljeslrőm, P. és fi, fJatuip ,,A new geseratiofs of animal eeil expressím veeloss based oa tbe Sémiik!
Porost vírus replieon.”, BioDbeO«o(ogy. 9, 1356-1301. old. (199 íj
Luyises, W,, M, Xryslai, M, Ensnu, ID. Pánin és P, Palese, „Aa^tífic&don, exprossíon és packagmg of a fsxreign getse fey inSueuza vírus.”, G'eB. 59, 1197-1113. oki.. (1989)
Mand.1, C.W., M, Ebkor. 1?1. Holzntann, C. Kösz, F.X. Heinz, „Infeedoas cDNA clones of íkk-borne encepbalkís vírus Enropeats subtype prssíoíypie sirass Neszdoeríl ássd lágfe vinslenee sirabi llypr.k „!. ί.ϊο«, Ptro/. 78, 1049-1057. old. (1997)
M.aniaíls, T,, E.F. Eríisfe és <1. Samferook,. .TDö/íjchAíí· e/owiatg, ar /«boí-sínry .nmnne/,”, kiad.: Coíd Spriug 1-larbour Laóoratory Press, New York (1989)
Méndez, A, €. Síses'dou, A. Izeta. F. Gehaser és I., Enjuanes, „Molecular ehar&cíerizatlon of iransmissible gastroeatentB Cörosawus deíécbve ínferfermg. genomes, pacitagiog and ixtíerogeneny,”, krofogy 217, 495-507. oki. 0996)
Pénzes, X, A, ízem, C. Simerdon, A. Méndez, 'M.l,. Baliesieros és E. Enjuanes, ..Cbsnplele nuclootlde seqaeoce of transndssible gtsslroenterilis eorsmsvims slrain EGR46-MAD7', közlésre leadva
Pualdco, P-, M, Parker, G.V. Lödwmg, N.L, Davis, k.E, Jöhnslon és J.F. Srrsiih, „Replícaiien-feelper Systems Irosn aitesasaiéd Venezuelán eqisme eneepmdibs viras, expressfau of óeterotagous genus ín víszo and imraunízaíion agalnsí feeierologous patbogens In vivő,” Fkokig? 239, 389-401. old, (1997)
Racaniello, V.R. és D. Baliíosore, „Cí.oned políoviros cDNA is ínfecdous in m.annnalíao eells.'k 5kw«co. 214, 916-919, old. ÍI9S1)
Radeeke, F,, P. Spisihofer, H. Senneidsr, K. Kueíis, M. Habar, €, Dolseh, G. Cferistíansen és M.A, Bdletes·, „Reseue of tneasles vítuses form elmed DMA.”, íMOJ. 14, .5773-5784. old. (1995)
Rke, C.M., A. (3rakouí, R. Gallér és f..l. Cbambers. „Transcrigden of iníéeiioös yellosv lever SNA írom. iuil-ienglh cDNÁ templates pr&dnced by ín siís’o ligáik®.”, .AVw BioiogAí. 1,285-296. old.. (1989) **»* «Λ » » « » * »«* * » * ♦ ♦ ♦ * ♦«- *» «♦·«
Ríce, CM, R. Levis, XH, Sttanss és ELV. Huaog, „Prodoeíion of ínfeeboos SNA íraaseripts S» Siudbis vírus cDNA elorses, Mapping of kihal nnggüons, fescue of s tempefamm-seusítive markor és in vítro nmlagenesis to generáló delloed mnsanls/',,/. Fiad 61, 3899-38I9. old. (1987)
Rica, CM és 3.H, Suwss, „Svoshesis, deavage-és sepoenee aa&lysis of DMA eoroplemeutary to the 26S messenger RN.A of Siudbis vírus., ,/. ΛΖοΖ. Rád. 150; 315-340, old. <19S!)
RugglL N,> XD. d'ráísehlru C. Mlöelhelzer, MA. Hofitsaaa, Jiacieoűde segusssce of dassieal swíne tever vírus síraín Alrort/187 and Raaselpdon of ínfeetíow RNA. fmm síably eloned fnll-leagíb eDNA.T, J. iékei 70,3479-3487. old, (1996)
Sánebez, C. M,> G, Jnnéaez, M I>. Lavsasla, í. Corea C. SuSé, M', 3. Bslbdrs, F. Gebnuer, €'. Snterdoa, P. Caiiebaut .1. M. Eseribajxi és L. Ónjaimé»,. ..Antíggnie boraoiogy mmgeonstawuses related to transmíssible gasirixsííeritis vírus, Flrofcgy 174,4IÖ-4I7 old, (1990)
Sánchőz, CM, F. öebaaer, C. Sufté, A, iMéndez, X Dopazo és L, Rnjuaue.s, „Genetlc evolution md íFögísm of tmustmssi&le gasíroeraerids eoromvnases., Fó-ology 199,92-iöS. old, (1992)
S'ánchez, C.M., A. ízeta, l.M. Saoeííez-Morgado, S. Alonso. I. Soia, M. Balaacb, 3. Plana-Darán és L. Eiijuaoes, „Tatgeted reeomhínaímn detnoosttams that tb« spike gese of trsnsmísslbk gastroenteritis eerouavtras is a determinál® of te eaterie íropíssaand vlreksee,”. J, Fá-öf 73,7607-7618. old, (1999)
Sawickr, S.8. és Dl.. SawkkL „Coronavinss- trmtscriptiő-n, sabgeaomíe tnouse hepatitis vírus xepíicative inteneediutes tünetien in RNA syotbesis.”, 3. Fá-ol. 64, 10SÖ-19S6. old. (1990)
ScimeO, M.I., T. Mefcatsíoa és K.-K, Coozehoaoa, „ínfeetieus rafeíes vírussá! from elmed cDNA , SAffiÖ J. 13,4195-4203, old. {1994)
Séíhna, F.B., S.-L. khrpg és £>,A. Briatp „Cooaaavíras suhgenomíe minas-sírand KNAs and íhe pötetkiaí fór ntRNA replícoss.A Proe. 6W, AíW Zxx. DS,4. 86,5626-5630, old. (1989)
Siázuya, IL, 8. ökrén, ö.-J. Kim. V. Mand.no, T. Síepsk, T. Taebüri és M. Simon, „Clooing taxi stahk maintsnanee of 390~kdobase~pair ttagments of Inxnan DMA k RscAmuAín eod using a® F-faetor-based veetor.y Proc. AW. Amf Séf DSA. 89,8794-8797. old. (1992)
Siddell, Sík, „The 6.á.Wí?OYávrZöew, 418. old., kiad.: Plenum Press, New York (1995)
Smeráou, C. és P. i..iljsströrn, „Nou-vinsl ampbfieaílon syslems fór gene ttansfér, vectors based oa aiphavkssesA, Cmr. <2pó?. Λ-ZoL ZTsar^o. I, 244—251. óid. (1999)
Tanigachi,. M. és RAJ5., kffikr, „Speeífse suppressive factors prodoeed by hyferidomas derived izom. ths tusion of emicheá suppressöc Teelis aod ,4 T iyinphotau eeö!mo.\ ,Z Jög?; 148, 373-382. old, (1978) van dér Mosd R-G. és W.7.M Spsao, „Coronavlrus replkaíios, Rxasérípdoo és RNA rrícosríbiaadon.·', „The Coronavíridae,”, 11 -31. old,, szak. ; S.G. Siddell, kiad.: Plenum Press, New York (1995)
Wasg, &., C. Boyseu, H- Sfeuya, M.L Simon és L. Eleod, „Compkfe oucleodáé sequence of öto gessraboos of a bacíerial artillcial chromosome clooiag vodoro, 6’ίοΓα?Ζι??άρ·ίί?.$. 23,992-994. old, (199?)
Woö, S.-S., J, diang:, 8X Glik AM Fahosort és R.A.. W'ieg, „Cmsttueiion and cixuneíerizadon of a baéla'ial ardfkial ctasmosőíse ífesmty of borybawf 6kv>ZfX-?’, Aki2i?ié Aoidv ,/tes. 22, -4922-4931. old, (1994)
Zbung, X., C..L. l.iao és M.M.C. Lai, „Coroosviras káder SNA regulása; ássd ruhiaies sobgeríonse toRNA 'trauseriprion Wb ín rmus and ín·<?&” J. PfeöZí 68,4738-4746. old. (1994)
Λ J χΛ •25SZEKVENCIALISTA ’ »- « * ♦ > »<w φ« y»»« «<» <110> I <211> 28588 <212> DNS <213> Sertés átadható Gasztroente-rtitiss vírus <400> 1 ser. tttaaag gtgcfcagatt aatcacagag gg·:-gagcsa a.gt.ge:gg.fc.tc cggccgceag tc&acgfcgce atggatttga gtsaggafcca. fctctcaccga tfccttgagga aatacatgtg gtgatgaaga gcgafcgagaa tggacattcfc ag.aacecr.aa tcfctfcafcggg ctactettág agaefcgcctg. ctggrgatgc gtgrrctcca tfcacagfctga aacctgagag ttgatgatgc ttggtaat.gr. fctttrgtaga agcaaat c ta agccaacatfc rtcttgtasa aafc.gcrttgfc gtgtfcaaaat fcggttggtgc acaaggttga cttfcctacaa acaatgtfctt afcaccaaaag atgctgctat fccagagcttt fcgccagcatg •agagsggetfc atatteaggc ccatfctggra tfcfctgatcgg fcttcaaaagg taceatfcfcce attcagttat acaatggtac t:aaa.gt.gagfc ttgtctfcegg g-acaagegte acggtgcagt cgcc.cgt.ac a gagaafcgage tagtctcccr g.ggcrafcgfct Ctacgtcatt accctccgtc cttfcgacctt tggtg&tgat. catcatrgaa accgecgaafc tca&asafctg. aatagtectg aaatggtgac atgcccgtgt txgtggtctt fcgtfcgtcacfc afcafcgctggt tgagactgra caaatcacfca tgtaeargat tggtctar ta cgcrfcggaaa tgaagttgra tgrggrtcca agcatttgat gctcggtgct ccttggcaag aactgttaat tg.afc.gc tges gageggegaa fcaaagcagtt caaa.at.gatt tgfc&asagfcc ta.sigg:£cgac cc.ttgc.aaaa tcfctaatct.c tatfcasaaac caafctgcatg taa tg.gr § tg fctacaac&ag cacttrtaaa tgaacaaggt carfctctaefc gtagcgtggc tatatccctt cttfctsettc aactagcctt acaccaactc gaa.ctaaacg aaatat.tr.gt cettccatga gsctatttcc atteagtttg geaatcactc ettgg&acgg ásggtteegt cectattfccg taagfccgcct agtagtagcg ac g £tggg.ta gac c gg g t tc c g t cc t gr g a t c t c c c te g c tccaaácaafc. tcaagatccr. rgetaatgag gacfcatcaag attcstgacg tgttscagga ásítsagtac egetaceg.ta ttcgtaccag aatactgfccg tgaectagte gatfcgegatc gstgfcfccfctg gtaacggagt aagtgatctt aaacccgtcc atgctgcaag gctetáírgt tagagctaac tgcaatggcg aaaarxgete gcaccggcag aggtgccsta tasgttg-atc sgaaaaccas Ecattga&gg cgafcfcteaag gactacrecg fcttgaaggag aggagtacca ttgcgcttgg acaactgtgc caseaaactc ectttaceat fccaggaaatc caatacaatc ccaaactgtg cfcactagaea tgeagcaeca ccagtcaasa tetgaagáfcfc acaagaágct ttatg.at.afcc fctcggaccac tgfcct.fcag.ea aatgcfctrga cactcfcfccat fcttatcgccg ggttcfcgaaa .gfcagcggcgfc tggagattgg aceggttfcta tctggcaaag. rtaagggtgfc cacfcttggge garattaagc agfcafcgagcg caggta&ggg agttaagtte tt.tgec.aact gatgttgaaa gtgfcetecar cfcgg.aasg.tr artaaaact.?. tgcsccccfcg gtrrtgaagg cgaattgaac gacttcarca grfcgcstgca gcgtfcaaaag agcattcsfct. acfcggrgaea tgtatcatea caggaaaatt ggsfcctfcagt accaacctct ttcaagaaga ctccsegget tgtacaasag cgcggtgcac gtagtagagg agcttcgtgg ttcactcaca cttacataca gcarcacttt gcacfctcfcgc fctttacgatt gtaaaetsea gacaatcgtg ttaaagatct tgfcagacaag tgtgtgaaag gettttaege agattateás aatagcrggt aetgaggcea aaaeaccegt tgfcfccaacaa fcgcscttgte aaactfcgtca aagcaaaagg gtcfcfcgaafcg cgcafcfcct.tr gcfcactagct gtgacaccta aaagaacaga gactgccact atcagctfcga gcaccaggag agggrratat cgtc.atr.gtfc ggtgatatgg tattattfcca tgat.gtcfc.ag tcctaact.tr. gtrettaeta aaasttccat cttatgacat cgtrtatgac getgataatg scaaaacrtg gtrc.atcafct tgaaratgat ggtgafcattg aacgaactac tcatfcgaa.et taggcagcaa agcttgtgct aaaagcattt ttgttgaagc ct&ttttaaa aagtatsaaa catafctggtt tgtggsacar cataaagaaa gatteatgta fcte.aat.cact tgaatgaatt. ggaagatafcc aaagaaacta attcfctcg.cc cfcgatcctet fccctgafcctg gafctafcggtg cca>tgct ctgatcctrc agtttcgggg agtgtfccaae aaagtagtfct gfcgafcggcfcg caaaggttfct gctaaccaac •etetstaata cgsctcscaa tgatatfcgag ateggtggfcs acacctacaa atactfcfctat tgaaat.gaea gar.gct2t.ct aagseattat. ccttfcagaga tgergat.gtg ecagttgtag getgateggt ctgaacccat teegettgaa cctgcrgaat
120 180 240 300 380 020 <00 540 SOS 880 720 7S0 800 000 $00 1020 1080 1100 1200 1200 1320 1380 1000 2500 1580 1020 ISSO 17 00 1800 1880 1$ 20 lOSO 2000 2100 8180 2220 2280 2300 2000 2060 2520 2S00 266 0 2000 2380 2320 » * φφ Φ·φ φ atgtasaace asag&aeaat ggc&atgtca εtgttattgc ssgtt.st.acs stttstsaas· 28S0 atgaggsfcga acatcctsat csttafcggtfc tfggtaaaat tgsgcsgaga atgtataata 2040 asatgggegg tggtgacaaa actgtctcas. tttcagaaga agtsgatget csagaaattg 3000 cacctgttsc scgtgttaaa cttgaattcg aatttgacaa tgaaattgts acfggtgtte 3060 ttga.scg.ggc tsfctggtact ag&tacaaat efcactggtac aácttgggaa gaattegaag 8128 agtctatttc tgaag.sscr.c gatgcsatcfc ttgatactet sgcaa&cc&a ggfcgtegaae 2150 fctgaaggsea ettcattcst gaeacs tg tg: gtggcttfcga tataaaasafc ccagatggfca 2240 tcstgatctc tcagtatgat accaatates ctg.cfcgafcga aaaatcagaa gttagtgcat 3300 •caagegaaga agsag&sgtt gaacctgttg sagaagstcc fcgag.&afcgaa attgtsgaag 3 360 eatctgsagg tgctgaaggg acttettete aag.aagaggt fcgssscagta gaagftgcag 3428 atattactte tacagaagaa gatgefcgaea tegttgaagt afccegetaaa gatgsccctt 3438 g<§ctgcage tgttgatgta caagaagctg· aacaafcttáa tecttctcea ccaectfeea 3598 agscaacgaa teecaacgga aas.attatcc etaa.gcs.sgg ggataataat tgttggataa 3600 atgcttgttg -~c — <·--- caggcctttg afccttttcaa caatgaagct tgggagaaat 3660 fctaagaaagg % gaetetgtas acetttgtta tgcagcaaea acactagcaa 3?20 gsggteatxc ·«% gagtatette ttg.aactt.at gctcaaegat «.-atagcacag 3788 ccaagatagr. áagtgtggtt gtggtgaaaa ágaa&ttgtfc tcgga&agag 3040 ctgt.tf.ttaa actcacccca cttaagg&ga getttaatta fcggtgtttgt ggtgactgca 3900 tgcaagetaa caccsgtaga tttttaagtg ttgaaggete eggfcgfcttfct gtseatgaca 3960 cattaagcaa gcaaacgcca gaagctatgt tegtfgteaa sccsgetatg catgcagtft 9020 scaceggcac aactcsssst ggccaetaca tggetgafcga tattgaacac ggttattgtg 4080 tagafggtst gggtattaaa ccacttaaga aacggtgtta taeatecsca tegtteaeta 9148 atgccsatgt aafcgactaga gctgaaaaac caaiácaaga gtttaaagxe gsaaa&gxag 4288 aacagcaácc gatagtggag gaaaaeaaat cctctstfgs aaaagaggsa attcaaagtc 9268 ctaaaaacga tgaccr.tata ettccatttt acaaag.etg:g eaaactttcc tfttatcdgg 9328 gegctttgga tgtfttgatc aattecttgg as.cctg.atgt tatfcgttasf getgetastg 93S8 gtgatcttaa acacacgggx ggtgtcgcáá gagccátc.ga tgxtttcact ggtggcaaat 8998 ta.scaga.acg ttctaagg.sc xatctxaaaa agsacaaatc tstfgctcct .ggts.afc.ge tg 9308 ttftetttga aaatgtcatt gagcasctfca gtgttttgaa tgcagfctgga ccacgtaatg 4560 gtgacagccg agttgaagcc saaatttgts. atgx.fcfcaeaa agcaatfcgca. aagtg.t.gaa.g 4820 gaaaaatatt aacaceaett atsagfgtfcg gtatcfcfcc.aa tgttagaett gaasesteat 4800 •fcgcagtgctf acsx.aag.aet gtgaatgsca. ggggattgaa tgtettegta ta-eactga-ec 9740 aggagaggea ascxattgag aatetettet ettgtxceat ecctgtcaat gtt.setgagg· 4800 ataatgttaa ccaxgaacgt gtgtefgttt ctttxgacaa aaeatscggt gaatagetta 4860 agggcscegt tgfccatcasa gacaaagatg ttacaaacca .gttgcctagc gctttfcgstg. ttggtcaaaa sgttattaag getattgata tagattggta agctcattát ggtttccgtg atgctgctgc ttttageget agtagtcatg atgcttataa stttgaagtt gttscacata .5090 gcaattccat tgegcataag csgactgacs acasetgttg gattastgea atttgtettg 5100 cattacagag acscaagcss csgtggasst ttcctggtgí tagaggtete tggsasgasx t fccttgagcg tassacacaa ggt tttgt.se atar.gr t gt a teaest etet ggagtsaaga aaggtgagce aggtgafcgtfc. gaattaátgc tgestsaset tggtgseetg stggscsatg 5280 attgtgaaat cattgtcaca cacsctacsg catgrgacaa gtgegcasaa gtagsasagt 5340 ttgttggacc agtggssgca gcacctcttg caat:.ca\gg caetgacgaa acatgügtgc 5480 atggcgtt'ag tgtessfcgtc aaagt.caccc aaattaaggg cactgttget- attaettett -5480 tgattggtcc fcattattgga gaagtactag aagcaactgg tfcatatttgt tacagcggtt 5520 ctaacaggaa tggteattae acccatfacg atsaccgtaa tggactagtg gttgatgcag 3500 asaaggetta ccattttaat agagaettas tacaggttac aacagctatt gcaagtaatt 5040 fcgttgtcaa gaaaccacaa gcagaggaaa gacctaagaa ttgtgctttt aacaaagttg 5700 eagcatctcc taagactgta caagaáeaaa aategtegge tatcgaaagt ggtgetaaet atgetettse tgaatrtgga agatatgetg acatgstcst tatggctgga gatsssatee ttsgg-.tget gettgaagte tttaastasf tgctggcttt atttatgtgt ettsgaagta 5600 etaagatgce taaagctaaa gtcaaaccac ctctfcgcact tasagatttt ggtgctaagg 5940 tcsgaacget eaattacatg agaeaattgs acaaaccctc tgtctggcgt tacgcaaaac 8000 tagttttatt. gttgstagea atst.ataat.t. ectt.tt.at11 gtttgtcagt ataccagtag 8060 tgcatsaast ascatgtaae ggtgctgtac aggestataa aaattctagt tetataaagt 812.0 ctgcagt-ctg tggcaactce áttttatgea aag.eefgttt ggett.eetat gatgagttgg ^7.60 ctgattttca acatctccas gctacttggg afc.ttcss.atc tga-eecscta· tggaaeagsc S240 tggxacsatt gtctfcacttt gcattcfctgg cfcgtttttgg taatasetat gctsggagts. 5300 ttcetatgt-s ttetgcates cagtac.cfcca ac.ctttggc t ttcttaeett ggttafcgtag: 5360 agtscagefcg gte.eetgcat geegtcaact tegaatccas etcageegag eetgtgaeeg 5420 tagttafc> ggttaaggca gttctcgccc fctaaacatas fcgfctttegca egctcsaaec 54S0 cgtctegcaa áacgtgctce aggattgesa ggcagacacg. eatteetate caagttgetg 6540 ftaatggfcte aatgaagset gtttatgttc stgefcaatgg fcscfcggtass ttetgesaga 8680 sacacáaett fr.afcfcgtaag aactgfcgatt cstatggcet tgaaaacacs ttcatctgeg ö-650 acgaaattgt acgtgatctt agfcaStagtg ttaaacsssc tgtttacgcc actgaeagafc 5/20 ctcatcaaga agtcscaaaa gttgaatget csgatggctε ttacagatít catgtfcggtg acga&ttcac ttcatstgac tatgatgtaa aacacaagaa afc&eagtsgt caagsggetc »890
82.0 40S0
5160
5220
5760
5820 « Φ > χ φ φ V φ teaagagcat essaegtexg
e.taaesgtgs xssagastgt satgttscag atgc te atag aagctaagce atgetaagat gccaggattt aagaaggtgt atgaaagatt eacagcttaa ctgttt-acag ttattaagaa ataaaggátt cstgtecaat tgccε gcsfca gtgt. cactsa átácttgtgt attgtgcsaa xetxttstga gtccacgttt .gtasagetgg atggstac at setetasexe gctt.agcc.at ctttcctcat ct'caaaacac tegcxtxcee ggtaegtg&t aaettaaagt ctgctatggg ctattgctag caat.g-g.gaga ac tat te tg e.
cacstcagtc taagagtfctc gccctágasa ttagtgtgag ctgccagata csgaacataa aaggatgtce cttttatagé ttgtaeacat gagaaatgts tgtcatcaga.
ttgttscaaa tcacagaact ctgagáaatt tttcttatgg gtgtaaatct caaütctctt cascettcgt gcatcaaaca cagcacacaa atáctaacac tt.att gtett fctgct.gt.gac aaccatggac gtcttactac ttgtatgtgfc tfcgtttscafc acagattxac aatacatgac gtgctaaatt aace1 acaga tegagtcfcaa gccettgcfct asatgeetgt tttgcttgáa aattaagaat. ggctfcgcaat gtttggextt tggr. teseet tgttaafcget tgcsgcactt eaactfcttca cactgastct acaaattgfcg cgttgctaca tggaatfcgtt «ggtgaccgg fcgttgfcaggs tgttte tatr. tátgtgctat gtfcfcaatsct gcaaggttts gcafcgctagt tgtgaaaaca tfceregette ctgtggfcaat gtctgtggfca tgcaatg'tgt tgttatgatc gttctfctatg aggtattett taccgcstat ttcaacaaat tact.tttgfct .aattaaatca agctgactac taatagaaea aggtttgegg ctafcggtaac tgttattgcfc actt.csex.sc tasgggtgtg atttaagtet tggcagtgfct tggtacttgfc geateaefcts cggtggcfcxt taatgtggfct cscatcgatg tecttcsact actagatágé eresfctgtgt tcaggctggt tgcctfcttgg tageattgta caagatgttg tttgfcfcctgg tatgttsttg tgt.tacat.at aáctafcfcctfc tgaxasccaa sáaggsttgg sat:?;e estet g.gcgtgcggt atgcatgact egets sex.se gáttggtgtt gatgasatgfc ctcaaasgag gatgaettea gtt tat ette Kxcctrtcrg tecttcaatg cttaatgttt ctgat esc. tg ggtgtgtcgg aasgttfctaa agctcaacfcg etcacatttagtgfcctccaa attc.fcggtt.fc cagtcctaca ess.ee te ttg éfctsaagcta actgcttttg gtgggtagat gatcafcactg gcgfcgcaccs gtfcgaaggtg ggtaacatgg taggt tataa .ggtggcgata tctgtgctag gctacatctg tacggfcgttc attgtcaccc atcatcfcacg gstgctgggfc atcctagfcfct ctttfctgaag attgacatgc tatgctaacs agaátggttt gacatgcttt aaaatggcac aatgfcgctta agtgafcacca ttttcagttt satcttgfcsc sttaaagctg tatggtgtca ggatcsgtsg gaa.ctt.ggaa gaagatcaac gcattcctat tcatfcagast gatgetttta átcgtaagac. gacgagttsa aaagtsaaat e e .tgaattet. ttggctgtta ttettts'tgt gacttttett cctgtfcgaca agtgttágxt gtgxtettes áttgcrfctcc atggttgtca gettttgtat tatttgttfct cgtggtgttt ec ete egese ggaggtaaga s cesat.gr cg tggasetser ergegexesg escsxc e rác
Cégérré ess ttgatgtctc eset ere esc ategtttett ccatggacafc ctea.aegt.gg ctcagassge atgctgtagg
a.aag.tggttc t tg te e.t est ttg&atctgc aegataccat agtatggttfc atcttgaaas ctcttgttfct gcaatgcagt ctctfcacagg ctaagcccts ttaaattgcc cttattgfcag act.ggttegt gattettess gc.gcgafc.gct ttsagtttaa tfcgctgtgaa eeattgttts itattátege ecetetatga gtgataaatt gtteatatga getteasess geestgetea scacacctét agectagtgg segg. ex tata cacgtgttat ctsagaafcaa ctaaagtcaa gsgaaágttfc scatgagsag gttsegtget.
atggetcgca ctagcatgca
«.tgetgeset estácsátse gc.atgttggc tcsac saggg, ctccaaetga ett estteta tcstgtscae caactttgat ctt.tt.gt.cct aetatgaaag tgeaaggtgt ecetesettg acatggttaa gtt.ttgtgss ctgcaecats.
ctgaettegg gttgetatfca attasé tese c~as§,.«.«c ge gaaaesttas tctt.gcee.gg gegetggsct te estet ege, tggtaageet sggg.gr.se re. sgssegeaxx xteegxxstg tsacsseet c tggtssgegt esassgrgtt teeggtexss ctcsgatgxe sggeérette etttattegt tgaaggetat t eastgrgt.t tatccctaet txtgxgxccs cg.ctsctaat eágtssggac tcetggtggt exgtgxtctt sgcastesr.e sgtgggagag ctscgscaxt gaxtgecttc tgetaxcstr. gaagattttt caatgtgtet etse tttxts. ttatattaat eteaecetet tgtgggxsac aactattget atatasgtse e.cttggtxxs taetgttsgt tcttgexgxg gttaggagat eaaet&tgaa fcgtgtttttg ccxggéexst taatáttett tesaggtscc agsaaatggs tgteggtecc axtggaagg-t tatesstggt stgggccaas tgcsasxxct etttggaggt sgte xt.ss gg cectaetatg accct ecset etegaeggtt e.xcesgtgct cet ecagtea csxgcccxcs tatsess eca aatesttgga esegeresét CXgSXt ege3 gttextgasg eggeáttett tgegterges atatgseget aa ette sstt tetettarét xexexxt.gsg tetgetettg S9öű acrsxgxceg SS«ö ettsatgtts 702;) aae.etr.gacg 7080 gctge.esx.es 7ICO tggecstesa ?200 atgaetretg 7280 gtttggetts '7320' ac 1111 g t s g 7 3 S 0 gstectcett 7440 gargtastrx 7300 ggtttgfgef 75S0 g ac ta c a t. g g 7 § 2 0 cauacac11 78Sö tteggeasst 7740 a 11 c e ta e g 7 8 0 0 getgettetg 7860 tettsetttg 7920 a e a a t e g t s e ? 9 S 0 stgeexgset SÖ40 agsggaettg 8100 tgeattgats 8360 gsgtcxggea 3220 x.s xe te tt e a 3 280 setsttgeat 8340 ggtgattgts 0400 t a e 11 e gt e a 8 4 6 0 aca&gaaaae SS20 atggcteeat 0500 tesetgttex 8840 tttgsatctg 8700 sactetsett 8760 tac ieexggt e 8820 getcCtatgg 8880 g t ex a t t e c. a S S 4 0 e c 11 ge a t e g 9 0 ö 0 gsagteatte. .8080 satgsaatgt 8120 §.gtgttgfcgt 9180 c e t a ae ae a e 92 4 0 ge e tgetatg 9300 atexssggse 9380· a t e e t c e. a t e ,9420. aattttgaag §480 actsatge.ca 9 S«0 gaxsggtggt 9800 actaaeagtt 9600 ggeesssgtg 9720 e g t a e e a t a e 9 780 eáaatgtatg §840 a c. t g e x s t g a § 90 0 t ggs e e x s t.2 990 0 ettgtetctg 10020 a t c c 11 g e g a 10 OS 0 a e t g e t g a g s 1014 ö gegtettget 20200 tggttctcse 10280 .scatctga tg 10320 atg&ttgtea 10380 t x e t ae a11 g 1044 0 tgtattagea 10500 eátrg.ggtts 10560 geegsaetrs 10620 s e g s 11e 11 a 20680 gtxesgteas 10740 aasat g e atg 10 600 xtsaseeett 10880
-28ergaegatee 3ácscsecse teeagsgtgt gcgctgatct etsasgtast tegaeaaaar gaaagtcaaa aratgtceag rcatttcagc ccaagsttag fetaaagatgc accttactrg ttsrgceagg érttéggesg ttatagcct-c ctattga-act agtarstgta tcggtgcaac tatrgacatt gag.gcas.gca tggctgttae tttgt-atrta aaggtaa-gs-t atgaagtrtg c&atgc&gag segaetsgsa caacaaagat sttggacaaa tgageaagtc escataásás eacaatgatg caaagsaatá gttrgatccs agccaatgct aggi.gr tata c-grgaagact gcctsta-atg tggtr-ctgat ccttttccaa racragtgac accaacgaca tg.stacfc.gca agacac-aatg tgtagratea gagtsctggt tttc&taaea etttgeaesg cacagtactt atgr.tatg.ac tgc tggctsfc ágssgsgeag aafcgaattrg acttettret aacscjcaat gctsaaaaat gtgtgaccgfc gcatgttggt agtseresea ra-gcggtg&t tgctaatgtfc atceatacaa tgtágfctgsg tggagtrg.eg ttr ta-aagca agaaecagas tgggeetgat fcgtgtttgct tgaastcgtt ttgtgacttt ggettcagtt tgaagagger t a acar.fcg.ce ggefcg>&g gatrgstrcfc fcgtcáacact tgcatcager gcaagaaaac taarggttea gccattgagc Saaacfctaaa rggsaagget agacaacaat tgaagcfccca ttstgscaag agtfccgtctg gfcgtgctsrfc aecagséaat aaaeggtgtc ttgcag&tgc egtgcaaa-sa tg fc fcgt c fcgt fcttfcactgtt ccctgcaatg gtfcgcgfcgta catgatgccfc tgttasaaeg gag.ggts.gat. gafccfcfctgrs. ctcgtgacag gttgaaaafcg segetaassr .acacrtgaca gctccgggtr gggatgaett rafcaagcagr aaataettta gagtgfcatfca gct.tr. fcggac sgttaccatfc aa-gttgagca agceetgcac sCt&eatatc gagtgrggsfc SStggrgaag gatatttgcc ggtgggtgca cett.rgasca gafcgcactsfc aaataegeta accafcgacfca gefcacfcgtgg ttaatgcgtg getttáccsá tgttgtacae gáagfcfcgtgc ggraeraesg áátaagettr egtaaaatrt tactrtagtc rgctacaaca acacfctrarr cttagtgtsg ggagactacfc gstgács tag ettgagaasc agcgaactta fcátgcfcgcat tan <5. a a a —. t. g. aagagtgstt getgeageta gcfcargcafca afcfcatfcgacc acaagacrtg aatgtscats. catgratate attacfcfcgrg gaaagagctg crtafcggcafc ettaagtatg tegegtstet aa t tfcaa &ca caagctggta rcaccrgátc aactgtgtaa gaagcfcaaca catgttgaac ct&actggca ggrfcgfctggc gafc-caaag.tr gtactgafccc fcfcggfcaaatfc acfcacafcfcgt atettaaaga gtgagttegg aegststcag taggtgcttg aa-gccataca gtgttgestt áccaagaxct ttggttgcgc catgettaga argatrraet agtactggga stcattgtge cacrtgtccg tcaaacaact tgactgaset ttrragacca agacagraaa tcfcttgaaga ctgctatgac aagctcaafcfc ttaa-tgeteg catseggtas. trgctrraac tttetggrsa cgagac&ata teattggtte atgtfcgatas aíat'gsfctag ataatgatag afcfcgcaeagg earstgcrss tg-ggaittga acga rsaátg arttgagaaa asgattatgc accagaataa gaccaeatga. areteeeera ttaa-aacaga egt (.egeret ts. gKsee.afcs tgectagccg asgttageee ttgagegega gtatgtstaa gcctaetttf agg.ctcgr.aa fctgttafcfcac argetggt-g.c ttaaggaagt agagsaccac tc.agsgc.gtc cfcgaaagfcgg ttaa-gtggga atgtfcgacgg etettagacg aacccaetga ergetaaage aa&tgcsete cacaacagga sS.ee fcgctafc eseeugstee fctaaeaafcgg art .taaaega agaccargrfc cctfcaagacg caaacgtrgfc S.S.et.ggS.geé taatgttgta aaatfctrgafc cactgaagaa tgaagtrrat ttgegatgcg taarggcaafc tfcgtgt .fcaca gtetgaaa.se ágertatgat tcgcacarat raattrtaac taaagtteat tggcatagta tettagattt geg.taet.gte seesggtese gggatctgag sg.se átess t tgttesesse egaagregte agctagact-r asagagaaat ggcaagagefc tcateagaag aacessgr tt tggttgfcrtg κsegge etet grtetaccgc tggtttfctar etetgetett ttcaaacg-ct tt. ateg.aagt acacttrtcr ggstttsggr egtefcttatg aattegeres tccagaeccg essegttsr t tsttgestse etttgsgsse gattgeaert tcaaat tfctg agtatcagfcg sgsagesegs tggtatgett tggtgrtets acctagcctt cattrggacfc eaccgetget aaagcttcag agcaactcrt as.aaagectr ga-ge-aataat cgctaatggfc tggtgeegtt sesteestet atargttgat ssafcggtget etcrtatggt tgatggatta aatteggtre ttgcatgtgc gtgcggggfct sgtagsgett aattgrtcaa sesssgsecg gtfcgergsge cgtaggsss.e gaaaagaact rrccttgaaa gcaaaaerrg atagtggaaa tt.cta.cgar.t teatattart tttgtgssss cttaeegsae cacccaaatt seattgtttt attgatggcg tggaatettg gtcaca-garc tgtttctcca éttascsaag etaaesttas eattateget. ata.getg.ge a gr taeaaaee taeesegass gttetseees cgtacagtag eatttga>. tstggtggte atgggatg.gg ge cár-garat ctcrccaatg tttasaeetg aacatetcte rgtsaesaeg agcagcarrg atgatgattt ratgragerg átesetté r.s eageataeaá rcc&gaattr a-tg-rtagaac ttetágteea aeeseeatae gaaaaagetc aageagetra sta.aaag.aa.ac getgeggaea aagsaacttg cerrtaagta gaagtgtttr sttgrtgaag sstgsattas sseaatgaas gatggtgaag argtargcat gstattar.se cctgaagtea ettgateata aaeagtagtr gergttaaga ggtaarggra ggtgcttcag' tgtegct&ea tgtstégsas garegtaett etagtgeage tcgacatcta gatttaggaa ttstggseea segsetteet ttacaaagta gtgaa-g.ttct ataaagattg gacccatrgt aaggetatae teggegstr x ettatatgat gtgacatcta atáaggagra grtétgattg crafcgacaar taccagtagt atgtaaaatt eaaca-ctr-c t tcgcagcttt sttectaegs aaeas.tr rtt acaasagagt agtacsttga asgacaagag etett teás..s es ss.gse tea gaggagttte caartgctgc gggacaatas actatccsaa raggrtcraa agr.tagctca.
gcggtacaac aagctgsttc ttacagtaaa asgaagaatt tatergatga seaátaatgc agtgstgggt
í.eeagstrgt tstcsgctgg gtraegrgte
9 2. 109S 1104 1.1.10'
11161.122: llaSí 11.3 4Í
I. 1 áöi 1146! 1152? tlSSi
II. 6 4; 1.170( 1.176( 118:21 21 sas
1194C UC<K 12066 2212C 221S1 12241 12301 123SC 12421 12406 1.2540 22600 226S0 22720 1.2780 12540 12S00 12060 22020 X30SÖ 1.3140 13200 13260 133 20 1.335 0 1344013500 13560 13620 1.3660 13740 13800 2 3600 13020 13S80 24040 141065 14160 14220 1.4200 14340 14400 14460 1.4 5 2.0 1.6SS0 14640 14 700 14760 1.462 0 24 580 ♦
-29attggctatt gacgcatacc cgctcacaaa acsecctasg cctgcttatc aaaaagtgxt 14S49 ttacactcta ctagattggg ttaaacatct- acagaaaaat ttgaatgxag gtgtt.ctr.ga 13989 txcgttttca gtgacaatgt tag.aggaa.gg tcaagataag ttctggagtg aagagtttxa 139S0 c-gctagcctc. tatgaaaagt: ctac tgtett. gcaagcxgca ggcatgtgxg tagtatgtgg 13129 ttcgca.a.ac-t gtactccgtt -gtggagaetg tcttaggags ccacttttax gcasgaaatg 1.5180 tgct-tacgac catgttafcgg gaac&aagca taaattcatt atgtetatca caccatatgt 15249 gtgtagtttt satggttgta atgtcaatga tg.?.tacaaag ttgtttttag gtggtcttag 25300 ttattattgt atgaaccaca aaccacagtt gtcantcccs ctctgtgcta atggcaacgt 153-59 a tataaaagta gtgcagtegg ctaagaggxt gttgaagatt tcaacaaact 2S478 tgtá ·> ” ?. gactggacta itgtsgaaga cucaaact.t gctaataasg ttaaggaat.t 13488 tctpco·', ε ttcgctgctg aaactgtgaa agctaaggag gagxckgtta aatctgaata 13348 tgctr.atgct gtattaaagg aggttitcgg -ccctaaggaa attgtactcc aatgggaagc 15899 ttctaagact aagccfcccac ttaacagaaa ttcagttttc acgtgttfctc agataagtaa 15660 ggatactaaa attcaattag gcgaattcgt gtttgagxaa tctgagtac-g gtagtgsxcx 25729 tgtttattac aagagcacga gtacttacaa attgscacca ggtatgattt ttgtgttgac 25788 ttctaataat gtgagtcctc fctaaagctcc asttr.tagtc aaccaagaaa agtacaatac 1584-8 tatatctaag ctctaxcctg tctttaatat agcggaggec tataatacac tggttcctta 15988 cxacca&atg ataggtaagc aaaa&tttac asctetccsa ggtcctccxg gtag.cggtaa 3 5960 at-ctcattgt gttataggtt tgggtttgta ttaccctcag gcgagaatag -tctacactgc 16028 atgttctcat gcggct-gt-ag acgctttatg cgaaaaagca gccaaaaacx tcaatgttga 16089 xaga-tgttca aggataatac ctcaaagaat cigagtrgat tgttacac&g gctttaagcc 16149 saat&acacc aatgcgca-gt acttgttttg. tactgtt.aat gctctaccag. aagcaagtcg 16298 tgacattgtt gtsgttgatg aggt-ctct-at gtgtacr-aat tatgatctta gtgtcataai 1.6268, tagcxgactg agttacaaac atattgttta tgxt.gg.agac cc.scsgcagc tsccagcfccc 16.320 tagaactttg attaataagg gtgtacttca accgcaggat r.-ac&asgtxg taaccaaaag 16360 aatgtgcata ctaggacctg atgtcttttt gcaxaaatgt tacaggtgcc ca-gctgaaat 16440 tgttaagaca gtctctgtac ttgtttatga aaataaat.tt gtacccgtca stccagaatc 16S09 •aaagcagfcgc xacaaaatgt ttgtssss.gg tcaggífccag attgagtcta scacttctat. 18368 aaac&.acaag caactagagg ttgtcaagge ctfcttaagca cataatccaa aacggcgtaa. 18628 agctgttttc axcxcaccct ataaragtca aaattatgxx gcxcggcgtc txcttggttfc 18888 gcaaacgcaa acfcgtggatt ccgctcaggg· tagtgagtax gattacgtca tctacacaca 16746 gacctccgat acacagcatg. ctictaatgfc tascagattt aatgttgcca ttasgagagc 16886 aaaggttggfc afcactttgta tcatgtgtga tagaactatg tatgagaatc txgatttcta 15859tgaacteaaa gattcaaaga *tggt.t.t.aea agcaaaaccx gaaaccxgtg gtttatttaa 15829 agattgfctcg -áagagcgai-c aatacatacx aéct-g-tttat gtaatgatai átatgagcfct- 25988 atctgataat tttaagacaa gtgaxggxtt agctgttaac atxggtacsaa aagatgttaa 27O&O atatgctaafc gxcatctcat atatgggatt caggtttgaa gccaátatac caggctatca 271.00 cacactatfcc. tgcacgcgag attttgcta-t gcgtsa-tgtt agagcatggc ttgggtxtga 2 7168 cgttgsaggt gcacatgtct gtggtgataa tgttggaáct aatgtaccás: tacagctggg 17229 tttctcaaac ggtgtggatt ttgcagfcgca aactgaagga fcgtgttatta ctgaaaaagg 17269 taatagca-tc gaggttgtaa aagcacgagc acc&cea ggt gagcaatttg cacacttgat 17.349 tccgctxatg agaaagggtc aaccttggta cattgttaga cgccgtatag tgcagatggt 17499 .ctgtgactat tttgatggct tatcagacat tctgstcttt-gtgcttxggg. exggtggtct 1745-8tgaactta-ca actatg&gat actttgttaa a.at.tgg.a.a:ga ccaeaaaait gtgaatgcgg 17329 caaaagxg-ca acttgttata gxagcfccfcca- atct.gtttac g-cttgtxtca agcacgcatt 1.7580aggatgtgat t&ttxa.tata acc-cttactg cattgatat-a cagcaatggg gttacacagg 27648 axctttgagc .atgaatcatc atgaagtctg ca-acatt-xat agaaatgagc axgxagotag 17798tggtgatgct axGatgacta. gatgtctcgx t.at.ac&.t.g.sc tgt-tttgxca aacgtgttga 17758ttggxxaatr. gtgtaccctt. ttattgacaa tgsagasaag stcaataaag ctggtcgcat |^3.-8agtgxagtca cacgtcatga aagctgctct gaaga·.?.?.?.?. aaxcctgctg c.aactcácga 17850
t.ztasgr«.xt acaaaag:gca cccgttgtgc tacaacatta ataccatggt xttgttatga 17943
t.cgtaa?..cct attaataaca atgttagatg tctggattat gattatatgg ta.catggtca 15000· aatgaa&ggt xttatgttat tttggsactg taatgtagac atgtacxcag agttttcaat 15080 xgtttgtaga tttgatactc gxactcgctc xaaa.t.tgtcx ttagaaggtt gtaaxggtgg 16128 tgcattgfcat gttaataacc atgctttcca cacacxagct tatgatagaa gagcxcctgc 16169 fcaagcttaaa cctatgccat txttttacta tgatgatagt aattgtgssc ttgtxgatgg ^®^49 gcaacct.aafc tatgr.accac ttaagtcaaa tgtt?.g.cata acasaatgca acattggtgg
?.gctgtctgc aagaagcatg ctgttcttta tagagcgtat gttgaggats: acsacaxttt 1.8380 tatgcaggct ggttttatai tatggtgtcc tcaaaacttt gacacctata tgctttggca 16420 tggttttgxx aatagcaaag tacttcagag tttagaaaat gtggctttta atatcgttaa 16480 gaaag.gt.gcc ttcaccggtt xaaaaggtga cttaccaaxt gccgttattg ctgscaaaat 18340 aatggtaags gatggaccua cugacaaatg. tatttttaca aataagacta gtttscctac l'86O8 aaatgtagct tttgagtcac atgcaaaaxg caaa-cstgga cccacacxtc cattsscaat lá«80 actta-ggaa-t tt&ggtgttg fccgcaacata taagttcgtg tcgxgggatt atgaagctga 26 720
-a-cgtcctttc tcaaatttca ctasgcaagt gtgttcctac actgattttg acagtgssgt ^760 cg-taacatgt tttaataata gtattgctgg ttcttttgag cgttttacta ctacaagsga 285*0 tg-ca:í?.tgctt atttctaata acactgtgaa agg.gctta.gt gccattaaat cacaatatgg 22800
-30ccttttgaat gacctacetg ta>actgt tggaaataaa e.c tg teaest gg-tatareta 18560 tgtgcgeaag aatggtgagt aegtcgaaea aategatagt tacratacae aaasacgtac 19020 ttttgaaacc ttcaaacctc gtagt&eaat ggaag&agat ttteuagta tggatactac 19030 acrcttcatc caaaagtatg gteetgaggs ttasggrttt. gaacacattg tárttsaaga 131*0 tgtetctaaa aetace&ttg g-tggt a sgea te £ tetta ra tcgcaagtge gc.ettgcaáa 19200 aatgggtttg tttteegtte aagaatttat gaataattce gacagtacac taaaaaattg .15260 tcgtattaca t.atg.ctg.at.g atccatette taagaatgtg tgcacttata tgsacatact 10320 cttggacgat tttgtgacta tcattaagag ettagatett aátgtrgtgt ecáaagttgt 19380 ggatgtcatt gtagategta aggcatggag atggatgttg tggtgtgaga attcaéatat 13**0 •taaaaccttc tatccacaac tccaatctgc tgaatggaat eccggctats •geargcctac 10000 actgtacaaa atceagegta tgtgtctcga acggtgtaat etetacaatt atggtgcaea 19360 agtgaaatta cetgtaggea i:taet.act.aa gtregtta-ag tataetcagt tgtgtcaata 15620 cettaacaet actaeattgt gtgtacsaea caaaargcgt gtsttgcatt tággagetge 13600 tggtgeatct ggtgttgetc ctggtagtac tgtattaaga agatggttae eagas.gatsc 19740 catattggct gataatgatt tgagagatta egtttecgac gcagacctea gtgttacagg 19800 tgatrgtact agtet'ttaca tcgaagsc&a getegarttg e tag te te tg atttatatga .15660 tggetecaca aaatcaattg acggtgaaaa eacgtegaaa gatggtttet ttaettatat .13320 taseggtrtc attaaagaga aactgtcact tggtg^atet gttgceatta aaateacgga 19985 arr.tagt.tgg. aataaagatt ratatgaatt jjKr-?aaag.s tttgagtatt ggactgtgtt 200*0 tt.gr.acaagt gttaacacgt eate.atca.ga aggéttte.tg attggtatta actaettagg 20100 aecatactgt gaeaaagcaa tagtagatgg aaatataatg eatgccaat,t atatatrctg 30100 gagaaactet acaatratgg etctatcaea. taaetcagec etagacaetc ctaaatteaa 30220 gtgtegctgt aacaacgcae -ttattgttaa tttaaaagaa aaagaattgs. atgaaatggt 20280 eartggarta ctaaggaagg gtaagrrgct eat.tagaaat. aatggtaagt tactaaactt 20040 tggtaaceac ttcgttaaca eaecatgaaa aaaetatttg tggttttgge egtaatgeca 20*00 ttgatttatg g&gaeaattt teettgttet aa&ttgacta atagaaetae aagcaaccag 20*00 tggaatctca t.tgaaacctt certctaa.at tatagtagta ggttaeeacc taatteag-at 30520 gtggtgttag gtgatra-ttt teetactgta caaeertggt ttaactgear tcgeaatgat 2058-0 agr.aatg.scc tttatgttac actggsaaat cttaaagcat tgtattggga fctatgctaca 208*0 gaa.s.atatea ettggaatca cagacaacgg. ttaaaegtag tegttaatgg átacecatae 20 700 tccatcacag. ttacaacaae cegcaacttt aattetgctg aaggtgctat tatatgeatt 20700 tgtaagggst eaccacctac taccaceaca gaatctagtt rgácttgcaa ttggggtagt 2.0820 gagtgcaggt taaaeescas gttccc&ata tgtccr.teta a.ttcagaggc aaattgtggt 20880 aatatgctgt atggcct&es at.gg.tttgea gatgaggttg ttgettattt aeatggtgc-t 209*0 agttaccgtá ttagttrrga aaáteaatgg tctg-gcactg tcaeatttgg tgatatgégt 21000 gcgacaaeat tagaagtege tggcaegctt gtagsecttt ggrggttt&a téctgtttat 21000 gatgtcagtt attatágggt taataataaa aatggtacta ccgtagttte. caattgcact 21120 gateaatgtg ctagrtatgt .ggctaatgtt tttactaeac ageeaggagg ttttatacea 21180 tcagatttta gttttaataa ttggttcctt ctaactaata gctecacgtt ggttagtggt 212*0 aaatcagtta ccaaacsgec gtcattagrt aattgettar ggecag.tcce tagetetgaa 22300 gaagcagcrt ctacattttg ttttgagggt get.gge.tttg ateaatgeaa tggtgcegtt 21380 ttaaataata ctgtagacgt cattaggttc aaccttaatt rtactacaaa tgtacaatea 21*20 ggtaagggtg ceácagtgtt ttcattgaae acaaegggtg gtgtcaetet tgaaatttca 21*00 tgstatacag tgagtgacte gagetsttte agttaegg-eg aaasecegtr. cggcgtaace 215*0 gasggaccae ggtactgtta egtacaetat aaeggeacsg etcteaa.gta tttaggaaca 21800 ttaccaccta gtgteaagga gsttgetatt -agtaagtggg gecaetttta tattaatggt 21800 tacaattrct £tagcacatt tcctattgat tgtatatett ttaatttgae eaetggtgat 21.720 agtgacgtrt sctggacaat -agcttacaca tcgtaeactg aagcattagt acaagttgaa 21.780 aaeacagcra ttaca-aaggt gá.cgt.at.tgt aatagte&cg ttaataacat taaatgctct 218*0 caaattactg eta-atttgaa taatggattt tarcetgttt ettcaagtga agttggteet 21900 gtcaataaga gtgttgtgrt acracctagc ttttacscas ataecattgt taacataact 21.300 attggtcttg gtatgaageg tagtggttar ggtcaaeeca tagectcase attaagtaac 22020 atcacaetae caatgcagga tcaeaacaee gatgtgtact gtattegtte cgaecaattt 22080.
eeagtttarg tteatretae trgcaaaagt gctttatggg acaatatttt taagegaaae 22.1*0 t-gcaeggaeg ttttagatgs caeagctgtt ataaaaactg gtacttgrcc. tttcteattt £2200 gataaattga aeaattactt aacttttaae aagttetgtt tgtcgttgag tcctgttggt 22260 getaattgta agtttgatgt agctgeecgt acaagaacca atgagcaggt tgttagaagt 22320 ttgtatgtaa tátacgaaga aggagacaae atagtgggrg taccgtetga taatagtggt 22380 gtgcaegatt tgtcagtgct acacetagat tecsgeaeag attacaatat atatggtaga 2244Ö aetggtgttg gtatraacag acaaaet-aae aggaegetae ttagtggett atattacaca teaetatcag gtgatttgtt aggttttaaa aatgtta.gtg atggtgtcat ctáetctgta £2580 aegecatgtg atgtaagc-gc aéaagcaget gtcattgatg graccatagt tggggctate *2620 acttecatta acaetgaaot gttag.grcta acacattgga caaeaacacc taattttrat 22.820 taceacteta ta tat a a “ * eacaaatgat aggaetegtg gcaetgcaat rgacagtaa r 2θ;·*0 gar.gttga.tt gtgaacetgr eataaeetstctaaeatag gtgtttgtaa. aaatggtges tttgttttta ttaacgtc.se acattctgsr ggsgaegtge aaceaattag cactggtaat £-1^60 gteacgatac ctacaaaett taceatatcc gtgeaagtcg aatatartca ggtttacaet 22020
-3iacsccagégfc ttgétaaca-c agácttgaaa gcatctgttg sststsggrg cgtaagtatc ggtseagttg sgxgtécaat sté sf.gr.se a gtggctatac gatgtattga attacacagt aetgrrgeés agccsccsaa att tat .aata agatétatag gctagtagac tteggattet atgattttcfc ggeeéétgég scttégttte: sgsgtrgces gcaactgtas caagacatat fcttaacgcaa aagctacata gtcaatcstg ctactaatag aeaggééget sg&e&stttg aattctacca aataaagtct atccatttac aactcttaaa ac r .eé.égté. caatagtcav easascsaté éggéggseté taacscagca tgttagtget tétté r agét gsttéé.aécs cstt §tf..3.CS taatágcagg ageégésecg aaa'ttat arg agcaatacgt éggtgsteet teetcsggeg egtttcctag ggééeergtt eatgesrggt acgségeee.s cstgaáctaa ggagaac.g-ct tergaétgrg tteagetggt ttcagetgge étggctetta ggetttagta reesttesgt sétettéseg ggtgtesete ggtstgaats gtctacacac grs.aaaters gaaaaaft«e.
caatagactg aataegttte acatggagg.t aagcattcaa gtétttggtt g-tteagetat atgaagatta actataatgg cagcatccct eettégesgt acaaaaacea caXtéggéaa ssgescégge eagtsesséé ggettgaega cacttaatgc aacttgc-caa gtggtsstgg ttcacacagt ct-tcaga-tgg .gtaateta-ga c ragététgs gegatcéget tagasaattt cetattr..aaa sesee.scr.gr aatggctc-a-a gettagtagé gtggatgcat aaaattacga tetgctavas -ttaagaacta aeatccgsag gtagaattva gctaaggsxa atagttgttt aa-agagag&t tttettagta aatgégcatc agaacacaaa ttgtaccgta atgacacttt acaactgtct tfctgaattta sxsaégagaa rrégégaatg ggettagete as.ttat.gtat gs.tctaaa.cg ggcattgact gatastts.es gégttgesae saagaattcc aeaaaatgaa sttgtgctas agetaégett crstaatstt tcgtgtatgg egasetttaa ttgcaggtge tgtacagaag staséges re tsseétéget étgacaaééé ttgttggeaa aagetggxga racatséggé escaagatas rgcatgéess égs r.tcxa.tg tagétcagas agáaggtcta sgsggaettg tsasegetgt esteseggég fcgGaggtgge sgtsgéécsg gcagatéefg ggttaatgat aaaagfcgcaa gcaaaataat atégsgtget 8Sttgt.gt.Ct agseaagstt r.a-cac.atttg geratésees égsregesét tgacaagttc etttgttess tagtattata tag-accaaat eetgaetggé agasettgee tagaategaa aatatttrge agg t égte.xa a-ccaattgaa t-agcagttgt aacttacgag atgxtgtact ag-aetggxaa aagtatatgc aatatcatta tavagaaaaa crcxgagttt axatacaaca accattaccc graessacrr taggacctat sat-c tttaag tctXafcacas grreéesesg ac:c~ esegt e atgctestet cttcacagga aaattgaexé gtcatags.r.g ttgat.ass.ac ttaggaagga atgegaasta gattttgsfca gaaatccgat ca&cggaggc gat-egttttt cattaaaatg tgcaéactcg. aatvgééacs gactaagtet sggssgaage tscagggaat acc s aaatac gaagtsgass ttactcaaca ataactaaac gttrgtsseg actat tgagc. ttgtttgttt stéítsgset aaasacatac c-.tttttg.at s. acaggtggtt cxacxtggtg ataacatxag gxtagaetta getagtget r gttatacatc gasgttgtca ttccaagcca gatgcscaag cagactctaa satgaatgeg Xtttcactcg aeggettstg tttggacttg xatttgaccc attgsagggr. cet gattata tggaetgtac gaaategeég srreeesétg accsasgtaa ktsccsresr. ggssgregét aaagrgeseg étetgee,ege teaetatagg tgacgaactt attac t-t gtg taagcxtggé aacacacaaa ct.gtcattcc égéssé égét agssegege é íkgsg esesse tssgsegegt se: rés reges sértgrteát tscssegsea etetatetat gestééégés aseégésgtt gecegésgtc ssaagassss acaat-ggaa r rétessé sge cagttattat aagcatacaa atattagegs acagatttgt gasettattt átaaetgtgc ettataatgr. gaataecaag é t égéaetet tggtggtctt vatgtgcécc fégésegetg gtaaéggttg geaagtagtg gsggcsegss r tetsssígg gtaaccctag aageaetége cxgaaaatgc ctatttacaa téccgécees sggXtgtaac «xgacatagc tggctaatgc gtgesettgg «ééaégéége scaatcaagc aascatcacg acatacaagg ttagtagtte ttgacaggct ccagacaagc ttaggtetea caaatgcagc aaaetgtgae éegé.ésaaga ccagsactafc gcgas.gtgcfc tr.g-atats.aa ctgagttgse aettagaatt acaacattaa aatggccttg tgetsttttg gtcactetat tceattaaat gsatteegtt tcctgsatgg gattgtgcax tgtsts.gg.tt ctccccasta acccaasgca aaattccatg agt&accatt atagtacaac atcgcsgtac gteggcaccs tatggtsact ttagcatactetcatgrtég gteacatcgt gseeetaége sgs.gesge.tg ggegtttsea gaagaagacc ggccattaac.
attgctaaa.t tgttecageg eeeegstggs gtgtgattgc eeégtegeas ggestettge eaeastatgg ggctattatg tgtccagata ggattatgta tcaacctsga ttctcgasgg aagggttcaa taeéaeetsg cgactggatg ctgasaaétfc ccaaccaggg gt.gtaac.aaa aatgggvgcc cctéaaastg agastggect taatagcaaa sr Céggéta tgac'ttagta tgaeeaaatg tggsggcgtc ccfcacaaact tsééggtaae aggétttget gessgeétts taétagégac gatescaggs ggaggvtagg gsettagaga sccaaatggc rgcétggcos t gtc-eagttg gsatcagcct gr r. egét.ser. tcsgaetgrs atttgscatfc taggteagaa ca.it avatta gtasgtgtgg ctgttgtagt atgtag'taga. ttaaaasgtt aaggatgátg acar. tgteaa actttgttgt ttggcgacac ttga-agaagt ttaa.gr.gtt'a cg&aaatgat c tatt.gt.taa agcatcatgt écttégéate taatgtttaa acaxtgatgg étéggtatgé. éacatggesg atggeggcsé ttgtaageat sseeéeteaa atgcagcctt atacctatga srestét cet ataattaagc caacatgtét gcactcc.ttg atgcgcatgt tagésesgeg aaactggaac s&gaectcaa gcccgttgtt tgsaatgstc tt r. tgtaaga aaccaaagca tgtgccaact aattgcaggt cagg.acr.att ggcteactat gagtgagcaa acaacgtgts
22$8<s
22030
22100
221S0
22220
22220
23230
22400
22ά§0
520 23580 23000 23/00 22700 23820 23800 23S30 2‘-800 2.40 S0 23120 23180 23230 23-300 2330Ö 23420 23360 24S30 24000 24SS0
220 247S0 23340 25000 24S6-3 2.S020 2S080 25140 25200 2S2S8 2S320 2S3S0 22350 .2 2500 22500 22020 25-580 25? 30 25800 25800 25020 2 3080 25040 25100 28150 20220 20230
330 283Ö0 25380 252-20 2-5580 28830 22/08 2 6 / 3 0 2.5820 25880 25840 s * ** ♦ « *♦ * φ
-32«gtcgggg&g aataacasac aacttatgtc tattggsaea sggtgjttct ttagseggag agtcgtggtg tttcaacttg cggtctagaa agígtagaac sagcaasgct cs.taagaatg tteéatgg&g agcagtgcca txxggasgct aaatacsast tatgctcgtc gcagaaaggt rt cgatgaca tcctcsatgc tagaaagact tatataggag •tceeactagg ctnsaactgg gt-aagcs-cgt atfctggcast caatggaaga tttssttttg atgaatctac ctcertcatf cgagagactí.
gac3aactcg tctacsactt ttgtctg&gfc ctaaraatga aagttaaica atagatctca .aagctgttct ctegttctaa aaaacaaaca ctagaagcag agcattaccc attggastte tgccaaagga catsagaagt cagagcaaga caca.gg&tga tgta.tttatt afcfcactE&at ttt.agca.gM attttgctgc tstttc-sgag gtaataggag gctagattta gctaasgtct atagtgatac caaa-acacgt cttcsacccc tgt.acsxa.aa ctatcgcatg aggtactgga tgccaaggst. afccxsaagct atcaagagas atetagagge tgcsgcactt atetaaag-aa cacctggiag ttcagccaat acaace^get aaaggaagat tgatcctaag ggcaaaagaa tgtggtacct gataattgat .acag.ttte.aa cac tt tea accagattac. t.acagat.fcgt gaattactgg gtacaagcaa gtaaextag® ggatctagtg. aaagaaaa ggecgetccs 3fcssccer.cc ggaat&ggta gtgaagggcc cstcatgcag ggtgc.c.atga etgaast reg aattcaaggfc aggcaacaat aaaasgfctag cgtagtaact agaactgsag ttfcggtg&ea gaatgtgfctc ggsgacsaga aerggacaat sagagaaaaa gafegcattaa gaggtaacga ecttactact atcttaaaac taaaagtggt tagtcacatt tcatcgcgce ecceattgca gaagttraaa attgttfcaaa aseescgtgg aacaaggtte se. sggg&t.c s aacgtaaaga atgacaaatt acaaacsaac atggtaaagt cacgctxtca tcaataacaa gtgttgacac ctaagacaag gtaaaggtga etgaettcgt -catcfcgtgtc tagaagrcac teetteagca gaaaatctcg tagaaaatta actaaacgag aattggt-aga tgtcaatgac gsstxgagza aa.tgtaag.ge gtctactctt tattaggaag gaéccgctac atgtaaaatt teggaagaae ssaatttegg acagattggt gcttecegaa taaagataaa cacgcttggt gecaggegaa sectagaect gaaggatgac agaaaaacaa agatactaca tgtgaeaaga t.geeaatggg tágeaetctg gttcacacac gattaatgec tre fca.sa.ee t tacagaxgtg atgcfccgtxt ctecaastat tttaataest a.fcc.ttfcctag aseec gat. gr. gtacagaafcg tfctagatefcg gatgagccaa gtfctgaaaafc
7000 27060 2? 3 20 271S0 27240 27300 27380 27420 2 7 480 2?S40 27600 27000 27720 27730 27840 27000 27960 20020 23080 23140 28200 28260 28320 28380 23440 28500 28530 28583 <210> 2 <211> 21 <212> ÖNS <213> Sertés átadható Gasztroentertitisz vírus <400> 2 cctaggattt aaatcctaa-g g <21O> 3 <2117- 22 <2í2> őriS <213> Sertés átadható Gasztroentert.itisz vírus <4ö0> 3 qcggccgcgc cggcgaggcc tqacgac »«*·♦ Χ#φ< & » » « « * * * e
<210 gg> <2.12> <213> <4 OO | 4 ö DGS | |
Sertés 4 | átadható | |
gtcuac | ||
<2 löt | .5 | |
<211> | ··> -9 .-ú <ζ. | |
<212> | DGS | |
<2l3> | Sertés | átadható |
<300 | ||
<400 | c V..' |
Gesxtroentsrtltiss vírus
Ga stt rο&πt art i t ΐ st vírus uctagcccag gcgcgcggts cc
Claims (14)
1. Eljárás koronavirus genomiáhs RNS-éből (g.RNS| származó szekvenciákat tartalmazó DNS előállítására, amely szekvenciák legalább őO%-hao homológok a vírus naSáv szekvenciájával, és RNS-föggö RN$|xdimerázt és legalább egy szerkezeti vagy nem szerkezeti fehérjét kőtfohsak, ahol a DNS egy íhtgmeose átífestő RNS~sé és viriomtá. állítható össze, neméyrifeínmve, hogy koronavírusból származó mterferáló detektív genomot klőísöznnk ptomöter szabályozása alak bakteriális: mesterséges kromoszómába (B.AC), és a detektív génemből deleiálí szekvenciákat vísszáitizertáljuk a gettómba.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás DNS előállítására, nemz /ΑΜ«ε, hogy azonosítják a vitális genom· ásson baktériumok számára toxikus szekvenciáit a DfeS-bc való visszsiozestálás előtt, nmelykbo insertáijok azokat.
.
3. Az I > vagy 2. igénypont szerinti eljárás DNS előállítására, <mm( yrifemezve, hogy a vírális genom toxikus szekvenciáit utoljára inzertáljuk vissza, araikor a genomot teljessé tesszük,
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás DNS előállítására, nsza/ /effenjezve, hogy előálltnak egy olyan fertőző kiónt, amely koronavfrus genomiáhs RNSEének (gRNS) teljes hosszúságú komplementer DNS-ét .(«DNS) tartalmazza, íranszkripeiő-szabályoző szekvencia szabályozása alatt, megkonstruáljuk a teljes hosszúságú cDNS-t a koronaviriss gRNS-éhbl, és összeállítjuk trtníszlripciő-szábályoző elemekkel.
5, A 4. 'igénypont szerinti ellátás DNS előállításúra, nsrat fericmccvsc hogy koronavírus gRNS-e teljes hosszúságú eDNS-klősjának előállítását az alábbiak szerint végezzők: (í> tmomta mterferáió defekíív genosnjút promóier szabályozása alatt DAC-ba klőnozznk; tji) kiegéxzitpik az wterferáló detektív genom ifelécióh és regeneráljuk a deleíált szekvenciákat a fertőző gRfeS-hex hasoulítvn; (in) azonosítjuk az azon baktériumok számúra toxikus szekvenciákat, amelybe azt klónozzuk, eltávolítjuk a toxikus szekvenciákat, és éppen csak akkor inzeríáljnk vissza a toxikus szekvenciákat, mielőtt eokaríötn sejteket tmnszfektálunk a kom.uavirns glXNS-ének megfelelő cDNS-kión előállítása végett.
ő. Fertőző klón, amely koronavlrus genomiáhs RblS-ének (gRNS) teljes hosszúságii komplementer DNS-ét (cDNS) tartalmazza, manszkripcíő-szabályozó szekvencia szabályozásit alatt, amelyben a fertőző cDNS bakteriális mesterséges kromoszómába (11AC) van klónozva,
7, Á ő. igénypont szerinti fertőző klón, amely sertés átadható gaszíroenteriíisz vírus (TGEV) ízolátíimáboi szúrstarik.
8. A ó, vagy 7. igénypont szerinti fertőző klón, s.meiylxm a promóier a eiíoíoegaiovíms (CMV) közvetlen korai (1E) promofere.
4. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti fertőző klón, améiybet? a teljes hosszúságú cDNS-t p6ü(Á> farok, hepatitisz § tlíDV) vírus ribozimja és a szarvasmurisa növekedési hormon fSGHj íermináeiós és poiiadeariációs szekvenciái szegélyezik a 3' végen.
10. A 6-9. igénypontok bármelyike szerinti fertőző klón, amelyben a fertőző cDNS & CBCT 5265 iajstromszám alatt a ’Spaníxh Colleetioo of Type Cnitares’-nél letétbe helyezett £. co/í bakteriális mesterséges
11. cofí, .weíy C'BCT 5265 laístrotnszám alatt tétéibe téti: .helyezve a ’Spamsh Coltéetion of Type Cuköres’-néL
12. Rekoolbináns virnsvektor, amely 6. igénypont szerinti fertőző klóm tartalmaz, és amely módosítva van heieroióg nokieinsavvnl a fertőző kiónba inzertálva. olyan kőrfdmények közöd,, amelyek lehetővé teszik a betérőkig nukfeinsav exptesszíöiát,
13. A 12. igénypont szerinti rekombinásts vírnsvektssí, amelyben a beteroiognoktéinsavjeténtőséggel bíró génterméket kódoló gén vagy génfragmess.
14. Állat fertőző ágens által okozott fertőzésével szembeni védelemre képes oltóanyag, amely tartalmaz fi) legalább egy 12. igénypont szériád rekontbínáns virtssvektort, amely vagy legalább egy, a fertőző ágens elleni mmmnvófesz indnkálására alkalmas antigént, vagy a fertőző ágens ellen védelmet nyújtó ellenanyagot expresszál, adott esetben együtt (ii) gyógyászatilag:elíogadhntö kötőanyaggal.
1 5, A 1.4. igénypont szerinti oltóanyag, amelyben a virnsvektor legalább egy, szisztémás immunválasz és/vagy - kőlönbőző légúti vagy bélrendszeri »yálká^ártyet-»)etnl»á»(^tb3a szaporodó fertőző ágensek elleni nyálkahártya! imíoanválasz índukálására képes antigént expresszál, lő. A 14. vagy 15. igénypont szerinti oltóanyag, amely egynél több fertőző ágens által okozott fertőzéssel szembeni védelemre képes moitivalens oltóanyag,
17. A lő. igénypont szerinti mnitivaténs oitősnyag, amely tartalmaz egynél több összekeverésre és egyQttes oltásra szolgáló független rekomhlnáns virasvektort amelyek mindegyike iegaláb egy antigént, vagy fegaláh egy ellenanyagot expresszál.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES009902673A ES2170622B1 (es) | 1999-12-03 | 1999-12-03 | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
PCT/EP2000/012063 WO2001039797A2 (en) | 1999-12-03 | 2000-11-30 | Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant rna-virus |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP0203305A2 HUP0203305A2 (hu) | 2003-01-28 |
HUP0203305A3 HUP0203305A3 (en) | 2004-07-28 |
HU228205B1 true HU228205B1 (en) | 2013-01-28 |
Family
ID=8310818
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0203305A HU228205B1 (en) | 1999-12-03 | 2000-11-30 | Infectious clones |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7445928B2 (hu) |
EP (2) | EP1234024B2 (hu) |
JP (1) | JP4637432B2 (hu) |
KR (1) | KR100755814B1 (hu) |
CN (3) | CN1872994A (hu) |
AR (1) | AR027893A1 (hu) |
AT (1) | ATE267246T1 (hu) |
AU (2) | AU785081B2 (hu) |
BR (1) | BR0016145A (hu) |
CA (1) | CA2393325A1 (hu) |
CZ (1) | CZ302785B6 (hu) |
DE (1) | DE60010921T3 (hu) |
DK (1) | DK1234024T4 (hu) |
ES (2) | ES2170622B1 (hu) |
HU (1) | HU228205B1 (hu) |
IL (2) | IL149859A0 (hu) |
MX (1) | MXPA02005525A (hu) |
NO (1) | NO331812B1 (hu) |
NZ (1) | NZ518990A (hu) |
PL (1) | PL206816B1 (hu) |
PT (1) | PT1234024E (hu) |
RS (1) | RS50372B (hu) |
SI (1) | SI1234024T2 (hu) |
SK (1) | SK7612002A3 (hu) |
TR (1) | TR200401186T4 (hu) |
WO (1) | WO2001039797A2 (hu) |
ZA (1) | ZA200203560B (hu) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2170622B1 (es) | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
US7556957B2 (en) | 2001-05-17 | 2009-07-07 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | Coronavirus-like particles comprising functionally deleted genomes |
ATE473274T1 (de) * | 2001-05-17 | 2010-07-15 | Univ Utrecht | Coronavirus-ähnliche partikel enthaltende funktionell deletierte genome |
US7906311B2 (en) | 2002-03-20 | 2011-03-15 | Merial Limited | Cotton rat lung cells for virus culture |
US7371837B2 (en) * | 2004-07-21 | 2008-05-13 | The University Of Hong Kong | Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof |
EP1619246A1 (en) * | 2004-07-23 | 2006-01-25 | Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II | RNA dependent RNA polymerases from coronavirus and their use in molecular biology and drug screening |
EP1632247A1 (en) * | 2004-09-03 | 2006-03-08 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Nucleic acid sequences encoding FMDV proteins capable of associating into a virus-like particle |
CA2591532A1 (en) | 2004-09-03 | 2006-03-09 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle |
JP2008517608A (ja) | 2004-10-22 | 2008-05-29 | レビビコア, インコーポレイテッド | 遺伝子改変された免疫系を有する有蹄動物 |
EP1792996A1 (en) | 2005-12-01 | 2007-06-06 | Consejo Superior de Investigaciones Cientificas | Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
JP2007312649A (ja) * | 2006-05-24 | 2007-12-06 | Japan Health Science Foundation | 再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンdna及びそれを含む微生物ならびにそれらの製造方法 |
ES2548377T3 (es) | 2008-10-27 | 2015-10-16 | Revivicor, Inc. | Ungulados inmunodeprimidos |
FR2947839A1 (fr) * | 2009-07-09 | 2011-01-14 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux agents antibacteriens |
EP2681232A1 (en) | 2011-03-02 | 2014-01-08 | Intervet International B.V. | Infectious bronchitis virus (ibv) spike protein as subunit vaccine |
GB201307528D0 (en) | 2013-04-26 | 2013-06-12 | Univ Leuven Kath | Bacterial artificial chromosomes |
EP3143144A4 (en) * | 2014-05-16 | 2017-12-20 | Yale University | VIRUS LIKE VESICLES (VLVs) BASED VACCINES TO PREVENT OR TREAT CHRONIC HEPATITIS B VIRUS (HBV) INFECTION |
JP2017515509A (ja) * | 2014-05-16 | 2017-06-15 | イエール ユニバーシティ | ワクチン用途のための高力価ウイルス様ベシクルの進化の方法 |
CA2961913A1 (en) | 2014-09-22 | 2016-03-31 | Regents Of The University Of Minnesota | Pichinde virus reverse genetics system and methods of use |
GB201603374D0 (en) | 2016-02-26 | 2016-04-13 | Ucl Business Plc | Packaging cell |
CN107190022B (zh) * | 2017-06-28 | 2020-10-30 | 浙江大学 | 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法 |
WO2019204654A1 (en) * | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Utah State University | Compositions and methods for zika virus characterization and vaccine development |
KR102119875B1 (ko) * | 2019-03-19 | 2020-06-05 | 한국화학연구원 | 한국형 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염성 변이 유전자 및 이의 용도 |
CN110468113A (zh) * | 2019-08-07 | 2019-11-19 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | 重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒强毒株及其应用 |
CN110656120A (zh) * | 2019-10-16 | 2020-01-07 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种乙脑病毒sa14-14-2的克隆方法及应用 |
CN111662885A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-15 | 扬州大学 | 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用 |
CN112852873B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-03-24 | 华中农业大学 | 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法 |
CN115094142B (zh) * | 2022-07-19 | 2024-05-28 | 中国医学科学院肿瘤医院 | 用于诊断肺肠型腺癌的甲基化标志物 |
Family Cites Families (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5833975A (en) * | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
US5288641A (en) | 1984-06-04 | 1994-02-22 | Arch Development Corporation | Herpes Simplex virus as a vector |
US4946787A (en) * | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5545412A (en) * | 1985-01-07 | 1996-08-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5106733A (en) * | 1987-06-25 | 1992-04-21 | Immunex Corporation | Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
CA2045129A1 (en) | 1989-02-01 | 1990-08-02 | Alfred I. Geller | Herpes simplex virus type i expression vector |
US5811103A (en) * | 1989-03-19 | 1998-09-22 | Akzo Nobel N.V. | Hog cholera virus vaccine and diagnostic |
US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
CA2039921A1 (en) | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
KR100242671B1 (ko) * | 1991-03-07 | 2000-03-02 | 고돈 에릭 | 유전학적으로 처리한 백신 균주 |
ES2026827A6 (es) * | 1991-03-26 | 1992-05-01 | Ercros Sa | Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino. |
US5382425A (en) * | 1992-01-13 | 1995-01-17 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
US6033904A (en) * | 1992-01-13 | 2000-03-07 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
US5658724A (en) | 1992-07-31 | 1997-08-19 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Herpes simplex virus strains deficient for the essential immediate early genes ICP4 and ICP27 and methods for their production, growth and use |
ES2152304T3 (es) * | 1993-02-08 | 2001-02-01 | Bayer Ag | Procedimiento para el crecimiento del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino y su uso en vacunas. |
CA2164088C (en) * | 1993-06-07 | 2005-06-14 | Gary J. Nabel | Plasmids suitable for gene therapy |
US20020146392A1 (en) | 1993-06-24 | 2002-10-10 | Frank L. Graham | Helper dependent adenovirus vectors based on site-specific recombinases |
WO1995003400A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Recombinationally targeted cloning in yeast artificial chromosomes |
US6015686A (en) * | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
EP0804249A2 (en) * | 1994-03-15 | 1997-11-05 | Brown University Research Foundation | Polymeric gene delivery system |
EP0758397B1 (en) * | 1994-04-29 | 2005-06-22 | Baxter Healthcare S.A. | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
DK53595A (da) * | 1994-05-13 | 1995-11-14 | Iberica Cyanamid | Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner |
US5585096A (en) | 1994-06-23 | 1996-12-17 | Georgetown University | Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells |
GB9415319D0 (en) | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Medical Res Council | HSV viral vector |
AU4367096A (en) | 1994-11-21 | 1996-06-17 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Unique associated kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof |
US5719131A (en) * | 1994-12-09 | 1998-02-17 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules |
CA2211743A1 (en) | 1995-02-21 | 1996-08-29 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Viral preparations, vectors, immunogens, and vaccines |
US6043232A (en) * | 1997-07-23 | 2000-03-28 | Nitromed, Inc. | Nitroso esters of beta-oxo-amides and aryl propionic acid derivatives of non-steroidal antiinflammatory drugs |
US5705385A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5820869A (en) * | 1995-06-07 | 1998-10-13 | American Home Products Corporation | Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection |
US6019980A (en) * | 1995-06-07 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
US5851826A (en) | 1995-07-26 | 1998-12-22 | Children's Medical Center Corporation | Helper virus-free herpesvirus vector packaging system |
US5795872A (en) * | 1995-09-19 | 1998-08-18 | Pharmadigm, Inc. | DNA construct for immunization |
US6133243A (en) | 1996-02-22 | 2000-10-17 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Liposomal-viral DNA complexes for treating disease |
ES2109189B1 (es) * | 1996-03-14 | 1998-05-16 | Iberica Cyanamid | Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas. |
FR2751224B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs |
US5990091A (en) * | 1997-03-12 | 1999-11-23 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
US6004777A (en) * | 1997-03-12 | 1999-12-21 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
DE19733364A1 (de) * | 1997-08-01 | 1999-02-04 | Koszinowski Ulrich H Prof | Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms |
US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
FR2781159B1 (fr) * | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
UA78180C2 (uk) * | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
US7211379B2 (en) * | 1997-10-03 | 2007-05-01 | Merial Sas | Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2 |
US6391314B1 (en) * | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
US6165493A (en) * | 1997-10-22 | 2000-12-26 | New York Blood Center, Inc. | "Methods and compositions for decreasing the frequency of HIV, herpesvirus and sexually transmitted bacterial infections" |
FR2772047B1 (fr) * | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
US20040062775A1 (en) * | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
PT1037909E (pt) * | 1997-12-11 | 2007-09-07 | Merial Sas | Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos |
US6277621B1 (en) * | 1998-02-26 | 2001-08-21 | Medigene, Inc. | Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences |
WO1999045956A1 (en) * | 1998-03-13 | 1999-09-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Vaccines against circovirus infections |
US6497883B1 (en) * | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
ES2170622B1 (es) | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
ATE352636T1 (de) | 1999-12-14 | 2007-02-15 | Novartis Pharma Gmbh | Auf dem rinderimmunschwächevirus (biv) basierte vektoren |
AU2001264802A1 (en) | 2000-05-21 | 2001-12-03 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Assembly of large viral genomes and chromosomes from subclones |
DE10044648A1 (de) * | 2000-09-08 | 2002-03-21 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Vermehrung oder zur Entfernung von Cirocoviren aus biologischem Material |
MXPA03008810A (es) * | 2001-03-27 | 2004-02-17 | Univ Saskatchewan | Metodos para cultivar circovirus. |
-
1999
- 1999-12-03 ES ES009902673A patent/ES2170622B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-11-30 SK SK761-2002A patent/SK7612002A3/sk unknown
- 2000-11-30 CN CNA2006100733455A patent/CN1872994A/zh active Pending
- 2000-11-30 EP EP00990628A patent/EP1234024B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-30 EP EP04007406A patent/EP1437400A3/en not_active Withdrawn
- 2000-11-30 HU HU0203305A patent/HU228205B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 MX MXPA02005525A patent/MXPA02005525A/es active IP Right Grant
- 2000-11-30 DK DK00990628.0T patent/DK1234024T4/da active
- 2000-11-30 ES ES00990628T patent/ES2218276T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-30 TR TR2004/01186T patent/TR200401186T4/xx unknown
- 2000-11-30 BR BR0016145-4A patent/BR0016145A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 CA CA002393325A patent/CA2393325A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-30 PT PT00990628T patent/PT1234024E/pt unknown
- 2000-11-30 US US10/148,669 patent/US7445928B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-30 JP JP2001541529A patent/JP4637432B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-30 NZ NZ518990A patent/NZ518990A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 CN CNA2004100789786A patent/CN1616670A/zh active Pending
- 2000-11-30 IL IL14985900A patent/IL149859A0/xx unknown
- 2000-11-30 KR KR1020027007118A patent/KR100755814B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 CN CNB008165904A patent/CN100402643C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-30 RS YUP-375/02A patent/RS50372B/sr unknown
- 2000-11-30 SI SI200030394T patent/SI1234024T2/sl unknown
- 2000-11-30 DE DE60010921T patent/DE60010921T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-30 WO PCT/EP2000/012063 patent/WO2001039797A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-30 CZ CZ20021882A patent/CZ302785B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 AT AT00990628T patent/ATE267246T1/de active
- 2000-11-30 PL PL356390A patent/PL206816B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 AU AU30051/01A patent/AU785081B2/en not_active Ceased
- 2000-12-04 AR ARP000106406A patent/AR027893A1/es active IP Right Grant
-
2002
- 2002-05-06 ZA ZA200203560A patent/ZA200203560B/xx unknown
- 2002-05-22 NO NO20022419A patent/NO331812B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-05-27 IL IL149859A patent/IL149859A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-09-11 US US10/238,786 patent/US7368557B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-08-03 AU AU2006203327A patent/AU2006203327B2/en not_active Ceased
-
2008
- 2008-09-30 US US12/285,213 patent/US20100167352A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-11-03 US US12/938,771 patent/US20110142879A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU228205B1 (en) | Infectious clones | |
CN103930551B (zh) | 猴腺病毒和杂合腺病毒载体 | |
CN107815441B (zh) | 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用 | |
KR100992235B1 (ko) | 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스 rna 발현계 및 백신 | |
HU230488B1 (hu) | Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására | |
EA004796B1 (ru) | Инфекционные клоны вируса ньюкаслской болезни, вакцины и диагностические анализы | |
CN107805631A (zh) | 编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体 | |
EP1736539A1 (en) | Attenuated SARS-CoV vaccines | |
US10717967B2 (en) | Duck enteritis virus and the uses thereof | |
JPH03504336A (ja) | 組換えポックスウイルス及び連鎖球菌mタンパク質ワクチン | |
CN109310750B (zh) | 编码传染性喉气管炎病毒和传染性法氏囊病病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体 | |
KR20150027836A (ko) | 마이코플라스마 히오뉴모니아를 형질전환하기 위한 벡터, 형질전환된 m. 히오뉴모니아 균주, 및 그것의 용도 | |
US6773709B2 (en) | Chicken embryo lethal (CELO) virus | |
KR20030013462A (ko) | cDNA로 부터 개 홍역 바이러스의 구출 | |
JP2019524154A (ja) | アヒル腸炎ウイルス及びその使用 | |
EP0690912B1 (en) | Recombinant avian adenovirus vector | |
WO2006024543A1 (en) | Vaccine against severe accute respiratory syndrome causing coronavirus (sars-cov) | |
EP1632247A1 (en) | Nucleic acid sequences encoding FMDV proteins capable of associating into a virus-like particle | |
WO2011077143A1 (en) | Transformation of commensal neisseria | |
KR20120066559A (ko) | 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 로타바이러스 유전자를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물 | |
BR112020013245A2 (pt) | sistema hospedeiro/vetor otimizado para a produção de vacinas de subunidades mono- e multivalentes protetoras à base da levedura kluyveromyces lactis | |
JP3675569B2 (ja) | 組み換えウイルス及びそれよりなるワクチン | |
AU676042B2 (en) | Recombinant avian adenovirus vector | |
WO2016114669A1 (en) | Combination vaccine for camelids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |