ES2218276T5 - Constructos de cromosomas artificiales que contienen secuencias de acidos nucleicos capaces de dirigir la formacion de un virus recombinante de arn. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para preparar un ADN que comprende unas secuencias derivadas del ARN genómico (gARN) de un coronavirus, presentando dichas secuencias una homología de por lo menos 60% respecto a la secuencia natural del virus y codificando para una ARN polimerasa ARN-dependiente y por lo menos una proteína estructural o no estructural, en el que el fragmento de dicho ADN puede ser transcrito en ARN y ensamblado a un virion, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de clonación de un genoma defectivo interferente de coronavirus bajo la expresión de un promotor en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y de inserción de nuevo en el genoma defectivo las secuencias delecionadas en dicho genoma.

Description

Constructos de cromosomas artificiales que contienen secuencias de ácidos nucleicos capaces de dirigir la formación de un virus recombianate de ARN.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los procedimientos para la preparación de un ADN o un ARN, a los ácidos nucleicos que pueden obtenerse por este procedimiento, y a su utilización como vacunas.
Antecedentes de la invención
Los avances en la tecnología del ADN recombinante han conducido al progreso en el desarrollo de transferencia de genes entre organismos. Actualmente se están dedicando numerosos esfuerzos para intentar producir productos químicos, farmacéuticos y biológicos de interés económico y comercial mediante el empleo de técnicas de transferencia de genes.
Uno de los elementos clave en la manipulación genética de células, tanto procarióticas como eucarióticas, es el desarrollo de vectores y sistemas vector-hospedador. En general, un vector es una molécula de ácido nucleico capaz de replicar o expresar en una célula hospedadora, mientras que un sistema vector-hospedador puede definirse como una célula hospedadora que porta un vector y permite la replicación y expresión de la información genética incluida en éste.
Se han desarrollado vectores a partir de virus tanto con genoma ADN como ARN. Los vectores virales derivados de virus ADN que se replican en el núcleo de la célula hospedadora presentan el inconveniente de poder llegar a integrarse en el genoma de dicha célula, por lo que, en general, no son muy seguros. Por el contrario, los vectores virales derivados de virus ARN que se replican en el citoplasma de la célula hospedadora son más seguros que los basados en virus ADN ya que la replicación transcurre vía ARN fuera del núcleo, con lo que las posibilidades de que se integren en el genoma de la célula hospedadora son muy pequeñas.
El documento WO99/43842 describe la utilización de cromosomas artificiales, en particular los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) en los cuales las secuencias ADN virales de Herpes simplex han sido clonadas para la producción de partículas virales recombinantes tanto in vivo como in vitro.
Se han obtenido clones de cADN a partir de virus ARN de cadena sencilla con polaridad positiva [ss-ARN(+)], por ejemplo, picornavirus [Racaniello & Baltimore, 1981]; bromovirus [Ahlquist et al., 1984]; alfavirus, género que incluye el virus Sindbis, el virus del bosque de Semliki (SFV) y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) [Rice et al., 1987; Liljeström and Garoff, 1991; Frolov et al., 1996; Smerdou and Liljestrom, 1999]; flavivirus y pestivirus [Rice and Strauss, 1981; Lai et al., 1991; Rice et al., 1989]; y de virus de la familia Astroviridae [Geigenmuller et al., 1997]. Asimismo, se han desarrollado vectores para la expresión de genes heterólogos a partir de clones de ADN complementario al genoma de virus ssARN(+), por ejemplo, alfavirus, entre los que se incluyen el virus Sindbis, el virus del bosque de Semliki (SFV) y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) [Frolov et al., 1996; Liljeström, 1994; Pushko et al., 1997]. Sin embargo todos los procedimientos para preparar los virus recombinantes que toman como material de partida los virus ARN se enfrentan con el problema de que la mayoría de los virus comprenden unas secuencias que son tóxicas para las bacterias. Por consiguiente, la preparación de un cADN del ARN viral y el subclonaje del cADN en las bacterias provoca a menudo la deleción o la redisposición de las secuencias ADN en el huésped bacteriano. Por este motivo, la mayoría de los vectores de subclonaje y expresión utilizados normalmente no pueden ser utilizados para la preparación de secciones de ADN grandes derivadas de los virus ARN recombinantes. A pesar de ello, y para varios objetivos, se requiere la obtención de vectores capaces de llevar secuencias largas de ADN ajeno en el desarrollo de fármacos, y en especial vacunas.
Los coronavirus son los virus ssARN(+) que presentan el genoma más grande conocido para un virus ARN, con una longitud comprendida entre aproximadamente 25 y 31 kilobases (kb) [Siddell, 1995; Lai & Cavanagh, 1997; Enjuanes et al., 1998]. Durante la infección por coronavirus se produce la replicación del ARN genómico (gARN) y la síntesis de un conjunto de ARNs subgenómicos (sgARN) de polaridad positiva y negativa [Sethna et al., 1989; Sawicki and Sawicki, 1990; van der Most & Spaan, 1995]. La síntesis de los sgARNs es un proceso dependiente de ARN que ocurre en el citoplasma de la célula infectada aunque su mecanismo preciso todavía no se conoce exactamente.
Se ha descrito la construcción de cADNs que codifican genomas defectivos interferentes (DI) [mutantes de deleción que requieren la presencia de un virus complementador para su replicación y transcripción] de algunos coronavirus, tales como el virus de la hepatitis murina (MHV), el virus de la bronquitis infecciosa (IBV), el coronavirus bovino (BCV) [Chang et al., 1994] y el virus de la gastroenteritis porcina (VGPT) [Solicitud de Patente Española P9600620] [Méndez et al., 1996; Izeta et al., 1999; Sánchez et al., 1999]. Sin embargo, debido al gran tamaño del genoma de los coronavirus y las secuencias tóxicas en dichos genomas, no ha sido posible la construcción de un clon de cADN que codifique un genoma completo de un coronavirus.
Para resumir, aunque se han desarrollado diversos vectores virales para replicar y expresar ácidos nucleicos heterólogos en células hospedadoras, la mayoría de los vectores conocidos de expresión de genes heterólogos no son muy apropiados para el subclonaje de los virus ARN. Además, los vectores virales obtenidos de esta manera presentan inconvenientes relacionados con su falta de especificidad de especie y limitación de órgano diana o tejido y con su limitada capacidad de clonaje, lo que restringe sus posibilidades de uso tanto en investigación básica como en investigación aplicada.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar nuevos vectores de expresión de genes heterólogos que superen los inconvenientes mencionados. En particular, sería muy ventajoso disponer de unos grandes vectores de expresión de genes heterólogos que tuvieran una elevada seguridad y capacidad de clonaje y que pudieran ser diseñados de forma que se pudiera controlar fácilmente su especificidad de especie y su tropismo.
Sumario de la invención
Los inconvenientes expuestos anteriormente se solucionan según la presente invención por medio de un procedimiento para la preparación de un ADN que comprende las secuencias derivadas del ARN genómico (gARN) de un coronavirus, presentando dichas secuencias una homología de por lo menos 60% a la secuencia natural del virus y codificación para una ARN polimerasa ARN-dependiente y por lo menos una proteína estructural o no estructural, en el que un fragmento de dicho ADN puede ser transcrito en ARN y ensamblado a un virion, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de clonaje de un genoma defectivo interferente de coronavirus bajo la expresión de un promotor en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y la reinserción en el genoma defectivo de las secuencias delecionadas en dicho genoma.
De manera sorprendente, los inventores de la presente invención descubrieron que los inconvenientes encontrados por los procedimientos según la técnica anterior para el subclonaje y expresión de secuencias grandes de ADN derivadas del gARN viral pudieron ser solucionados por medio de una utilización de los BAC como vector de clonaje. La utilización de los BAC presenta la ventaja particular de que estos vectores se hallan en las bacterias en número de una o dos copias por célula, limitando considerablemente la toxicidad y reduciendo las posibilidades de una recombinación interplásmidos.
La presente invención proporciona además un clon infectivo que comprende una copia de longitud completo de ADN complementario (cADN) al ARN genómico (gARN) de un coronavirus, clonado bajo una secuencia reguladora de transcripción, en el que dicho cADN infectivo es clonado en un cromosoma artificial bacteriano.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector viral recombinante que comprende un clon infectivo que comprende una copia de longitud completo de ADN complementario (cADN) al ARN genómico (gARN) de un coronavirus, clonado bajo una secuencia reguladora de transcripción, que se modificó para contener un ácido nucleico heterólogo insertado en dicho clon infectivo bajo condiciones que permiten la expresión de dicho ácido nucleico heterólogo.
La invención abarca una vacuna para proteger un animal contra la infección provocada por un agente infeccioso, que comprende:
(i) por lo menos un vector viral recombinante tal como se ha expuesto anteriormente en el que dicho vector viral expresa por lo menos un antígeno apropiado para inducir una respuesta inmunitaria contra dicho agente infeccioso, o bien un anticuerpo que proporciona una protección contra dicho agente infeccioso, y además, facultativamente,
(ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Dicha vacuna puede ser una vacuna multivalente para una protección contra la infección producida por más de un agente infeccioso.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la construcción de un clon cADN que codifica un ARN infectivo de VGPT. La Figura 1A muestra la estructura genética del VGPT indicando mediante letras y números los nombres de los genes [1a, 1b, S, 3a, 3b, E, M. N y 7]. La Figura 1B muestra la estrategia de clonaje del cADN que consistió en completar el genoma DI-C. Se indican las deleciones \DeltaA1, \Delta2, y \Delta3 que se han completado para restablecer la longitud completa del cADN. Los números situados debajo de la estructura del genoma DI-C indican los nucleótidos que flanquean cada deleción en dicho genoma DI-C. La Figura 1C muestra los cuatro fragmentos de cADN construidos para completar la deleción \Delta1 y la posición de los principales sitios de restricción utilizados durante el ensamblaje. La inserción del fragmento \Delta1 produjo un aumento en la toxicidad del cADN.
La Figura 2 muestra la estructura del plásmido pBeloBAC [Wang et al., 1997] utilizado en el clonaje del cADN infectivo de VGPT. El plásmido pBeloBAC fue proporcionado por H. Shizuya y M. Simon (California Institute of Technology) e incluye 7.507 pares de bases (pb) que contienen el origen de replicación del factor F de E. coli (oriS), los genes necesarios para mantener una copia única del plásmido por célula (parA, parB, parC y repE) y el gen de resistencia a cloranfenicol (CM^{r}). Se indican las posiciones de los promotores de T7 y SP6 y de los sitios de restricción únicos. CosN: sitio de cosn de lambda para facilitar la construcción del plásmido pBAC; lac Z: gen de la \beta-galactosidasa. También se indica la secuencia loxP utilizada durante la generación del plásmido.
La Figura 3 muestra la estructura de los plásmidos básicos utilizados en la construcción del cADN de VGPT. El plásmido pBAC-TcADN^{-\Delta ClaI} contiene toda la información del ARN de VGPT excepto un fragmento ClaI-ClaI de 5.198 pb. El cADN se clonó bajo el promotor de expresión inmediatamente temprano (IE) de citomegalovirus (CMV) y está flanqueado en el extremo 3' por una cola poli(A) con 24 residuos de A, la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) y las secuencias de terminación y poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). El plásmido pBAC-B+C+D5' contiene el fragmento ClaI-ClaI requerido para completar el pBAC-TcADN^{-\Delta ClaI} hasta un cADN de longitud completa. El plásmido pBAC-TcADN^{FL} contiene el cADN de longitud completa de VGPT. SAP: fosfatasa alcalina.
La Figura 4 muestra las diferencias en la secuencia de nucleótidos del gen S de los clones de VGPT PUR46-MAD (MAD) y C11. Los números indican las posiciones de los nucleótidos sustituidos, considerando como nucleótido uno de cada gen la A del codón de iniciación. Las letras situadas dentro de las barras indican el nucleótido correspondiente en la posición indicada. Las letras situadas debajo de las barras indican las sustituciones de aminoácido (aa) codificadas por los nucleótidos que están alrededor de la posición indicada. \Delta6 nt indica una deleción de 6 nucleótidos. La flecha indica la posición del codón de terminación del gen S.
La Figura 5 muestra la estrategia seguida para rescatar el VGPT infectivo a partir del cADN de longitud completa de VGPT. El plásmido pBAC-TcADN^{FL} se transfectó a células ST (células de testículo de cerdo) y a las 48 h post-transfección el sobrenadante se utilizó para infectar nuevas células ST. El pase de virus se realizó a los tiempos indicados. En cada pase, se recogieron alícuotas de sobrenadante y de monocapa celular para la titulación de virus y el aislamiento de ARN para análisis por RT-PCR, respectivamente. vgARN: ARN viral de longitud completa.
La Figura 6 muestra el efecto citopático (CPE) producido por el cADN de VGPT en las células ST transfectadas. Se muestra la ausencia de CPE en células ST no transfectadas (control) (Figura 6A) y el CPE observado a las 14 y 20 h post-transfección con pBAC-TcADN^{FL} en células ST (Figuras 6B y 6C, respectivamente).
La Figura 7 muestra la evolución del título viral con el pase. Se muestra una gráfica en la que se representa el título viral en el sobrenadante de dos series de monocapas celulares (1 y 2) a diferentes pases después de la transfección con pBAC-TcADN^{FL}. block 1 y 2, se refieren a células ST no transfectadas. TcADN 1 y 2, se refieren a células ST transfectadas con pBAC-TcADN^{FL}.
La Figura 8 muestra los resultados del análisis de la secuencia del virus recuperado después de transfectar células ST con pBAC-TcADN^{FL}. La estructura del genoma de VGPT se indica en la parte superior de la Figura. Asimismo, se indican las diferencias en la secuencia de nucleótidos (marcadores genéticos) entre el virus recuperado a partir del plásmido pBAC-TcADN^{FL} (TcADN), y los clones C8 y C11 de VGPT. La posición de las diferencias entre los nucleótidos se indica mediante los números situados sobre la barra. Las secuencias del cADN del virus TcADN y del clon C11 se determinaron por secuenciación de los fragmentos obtenidos por RT-PCR [transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa]. La secuencia de cADN del clon c8 del aislado PUR46-MAD de VGPT, identificada como SEC. ID. nº: 1, se recoge en el LISTADO DE SECUENCIAS. Se muestran los patrones de restricción con ClaI y DraIII de los fragmentos obtenidos por RT-PCR que incluyen los nucleótidos 18.997 y 20.990 de los virus TcADN y C8. Los patrones de restricción muestran la presencia o ausencia de los sitios ClaI y DraIII en el cADN de estos virus. El resultado de este análisis indicó que el virus TcADN recuperado tenía la secuencia del gen S esperada para el aislado C11. MWM: marcadores de peso molecular.
La Figura 9 muestra los resultados del análisis por RT-PCR del virus recuperado. El ARN viral se expresó bajo el control del promotor de CMV reconocido por la polimerasa celular pol II. En principio, este ARN podría sufrir "splicing" durante su transporte al citoplasma. Para estudiar si éste era el caso, se determinaron los sitios del ARN con una alta probabilidad de splicing utilizando un programa de predicción de sitios de splicing en secuencias de ADN humano (versión 2.1.5.94, Department of Cell Biology, Baylor College of Medicine) [Solovyev et al., 1994]. El sitio potencial de splicing con máxima probabilidad de corte tenía el sitio donador en el nt 7.243 y el aceptor en el nt 7.570 (Figura 9A). Para estudiar si este dominio había sufrido "splicing", se preparó un fragmento de RT-PCR flanqueado por los nt 7.078 y 7.802 (Figura 9B) a partir de ARN de los pases 0 y 2 de cultivos no transfectados (control), o de células ST transfectadas con el TcADN con el fragmento ClaI en orientación reversa (TcADN^{FL(-\Delta ClaI)RS}), o en la orientación correcta (TcADN^{FL}), y se analizaron los productos resultantes de la RT-PCR en geles de agarosa. Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 9C (pase 0) y 9D (pase 2).
La Figura 10 muestra los resultados del análisis por inmunofluorescencia del virus producido en cultivos de células ST transfectados con el TcADN. Se realizó tinción para inmuno-fluorescencia con anticuerpos específicos para el aislado VGPT PUR46-MAD, y para el virus recuperado después de la transfección con el plásmido pBAC-TcADN^{FL}. Para ello, se emplearon anticuerpos monoclonales específicos para el VGPT que se unen a ambos aislados o sólo al PUR46-MAD [Sánchez, et al., 1990]. El resultado confirmó que el virus TcADN tenía la antigenicidad esperada. El antisuero policlonal específico de VGPT se unió a ambos virus, pero no a los cultivos no infectados y sólo se unieron al virus TcADN los anticuerpos monoclonales esperados, específicos para las proteínas S (ID.B12 y 6A.C3), M (3B.B3) y N (3B.D8) [Sánchez et al., 1999].
La Figura 11 muestra la expresión de GUS bajo diferentes secuencias reguladoras de la transcripción (TRSs) que varían la región flanqueante 5' de la secuencia intergénica (CTAAAC, IG). El minigenoma M39 se clonó bajo el control del promotor de CMV. En el interior de este minigenoma se insertó una secuencia múltiple de clonaje [PL1, 5'CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3' (SEC. ID. nº:2)] y la unidad de transcripción formada por las secuencias reguladoras de la transcripción seleccionadas (TRS), otra secuencia múltiple de clonaje [PL2, 5'-GCGGCCGCGCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3' (SEC. ID. nº: 3) o PL3, 5'-GTCGAC-3' (SEC. ID. nº: 4)], secuencias con la estructura de un dominio de Kozak (K), el gen de la \beta-glucuroridasa (GUS), y otro sitio múltiple de clonaje [PL4, 5'-GCTAGCCCAGCCGCGCGGTACC-3' (SEC. ID. nº:5)]. Estas secuencias estaban flanqueadas en el extremo 3' por las secuencias 3' del minigenoma M39 (indicadas por un cuadrado gris), la ribozima de HDV, y las secuencias de terminación y poliadenilación de la BGH. Las TRSs tenían distinto número (0, -3, -8, y -88) de nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia IG (CUAAAC)^{1} y procedían de los genes N, S, o M, tal como se indica. Se transfectaron células ST con los distintos plásmidos, se infectaron con el virus complementador (PUR46-MAD), y los sobrenadantes se sometieron a 6 pases. La actividad GUS en las células infectadas se determinó mediante el protocolo descrito por Izeta [Izeta y col., 1999]. Los resultados obtenidos al relacionar la actividad GUS, expresada como unidades luminométricas relativas por millón de células, con el número de pase se recogen en la Figura 11B.
La Figura 12 muestra la expresión de GUS bajo diferentes TRSs que varían en la región flanqueante 3' de la secuencia IG (véase la Figura 11A). Utilizando esta unidad de transcripción con la región 5' flanqueante correspondiente a los -88 nt del gen N de VGPT más la secuencia IG (CUAAAC), se modificaron las secuencias 3' flanqueantes. Estas secuencias correspondían a las de los distintos genes de VGPT (S, 3a, 3b, E, M, N, y 7), tal como se indica en la Figura 12A. En dos casos, las secuencias 3' se reemplazaron por otras que contenían un sitio de restricción (SalI) y una secuencia de Kozak optimizada (Kz), o por una secuencia idéntica a la que sigue a la primera secuencia IG situada a continuación del líder del genoma viral. La actividad GUS en las células infectadas se determinó mediante el protocolo descrito previamente [Izeta et al., 1999]. cL12, indica una secuencia de 12 nucleótidos idéntica a la del extremo 3' de la secuencia "leader" del genoma del virus TGEV (ver la secuencia del virus indicada al final). Los resultados obtenidos al relacionar la expresión de GUS con el número de pase se recogen en la Figura 12B.
La Figura 13 muestra el efecto del sitio de inserción del módulo de expresión en el minigenoma sobre los niveles de expresión de GUS. La unidad de transcripción de GUS que contiene -88 nt del gen N flanqueando el extremo 5' de la secuencia IG (CUAAAC), y las secuencias Kz flanqueando el extremo 3' (véase la Figura 12A), se insertó en cuatro sitios únicos de restricción en el minigenoma M39 (Figura 13A) para determinar si todos estos sitios eran igualmente permisivos para la expresión del gen heterólogo. Se transfectaron células ST con estos plásmidos y se infectaron con el virus complementador (PUR46-MAD). La actividad GUS en las células infectadas se determinó en el pase 0 (PO) siguiendo el protocolo descrito previamente [Izeta y col., 1999]. Los resultados obtenidos se recogen en la Figura 13B.
Descripción detallada de la invención
Según la presente solicitud, un "cromosoma artificial bacteriano" es una secuencia ADN que comprende la secuencia del factor F. Los plásmidos que contienen esta secuencia, denominados plásmidos F, pueden mantener, de manera estable, las secuencias heterólogas de longitud mayor que 300 kb en bajo número de copia (una o dos copias por célula). Los BAC correspondientes son conocidos en la técnica (Shizuya et al., 1992).
Según la presente invención, el ADN clonado en el BAC presenta una homología de por lo menos 60%, preferentemente 75% y más preferentemente 85 o 95%, respecto a una secuencia natural de un virus ARN. La homología de secuencia está determinada preferentemente por medio del programa informático "Clustal" disponible en el Instituto Bioinformático Europeo (EBI).
Según la presente invención, el término "secuencia derivada de un coronavirus" se utiliza par hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico que presenta una homología de por lo menos 60%, preferentemente 75% y más preferentemente de 85 o 95%, respecto a una secuencia natural de un coronavirus. La homología de secuencia puede determinarse por medio del programa informático "Clustal" disponible en el Instituto Bioinformático Europeo (EBI).
El término "coronavirus" se utiliza según la presente invención para hacer referencia a un grupo de virus que presenta una única molécula de ssARN lineal, sentido positivo, de 25 a 33 kb. Estos virus normalmente contienen de 7 a 10 genes estructurales, es decir genes que codifican proteínas que determinan la estructura viral. Estos genes están dispuestos, típicamente, en el genoma viral aproximadamente en 5' replicasa-(hemaglutinina-esterasa)-pico-envolvente-membrana-nucleoproteína-3'. Adicionalmente, el genoma viral puede comprender una cantidad de genes no estructurales que codifican un conjunto encajado de mARN con un extremo 3' común y que son mayoritariamente no esenciales.
El término "capaz de transcripción en ARN que puede ser ensamblado en un virion" se utiliza para caracterizar una secuencia ADN, la cual - una vez introducida en una célula hospedadora apropiada - será transcrita en ARN y viriones generativos. Preferentemente los viriones son virus infectivos, pero también pueden ser desactivados, atenuados o virus de replicación defectiva que comprenden dicho ARN. Preferentemente, toda la información necesaria para la expresión del virion está codificada por la secuencia ADN de la presente invención.
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Los ácidos nucleicos según la presente invención pueden además comprender una secuencia que codifica uno o varios genes heterólogos de interés. Según la presente invención, un gen se caracteriza como un "gen heterólogo" si no está derivado del coronavirus utilizado como la fuente para los genes que codifican la ARN polimerasa ARN-dependiente y la proteína estructural o no estructural. Por lo tanto un "gen heterólogo" también hace referencia a los genes derivados de un tipo de coronavirus y expresados en un vector que comprende unas secuencias derivadas de otro tipo de coronavirus. Cualquier gen heterólogo de interés puede ser insertado en los ácidos nucleicos según la presente invención. Se prefiere en particular la inserción de genes que codifican peptidas o proteínas reconocidas como un antígeno de un agente infeccioso por el sistema inmunitario de un mamífero. El gen heterólogo puede por lo tanto codificar por lo menos un antígeno apropiado para inducir una respuesta inmunitaria contra un agente infeccioso, o por lo menos una molécula que interfiere con la replicación de un agente infeccioso o un anticuerpo que proporciona una protección contra el agente infeccioso. De modo alternativo o adicionalmente, el gen heterólogo puede codificar un modulador inmunitario, un citocina, un intensificador de la respuesta inmunitaria o un compuesto anti-infla-
matorio.
El fragmento del ADN según la presente invención que es transcrito en ARN presenta, preferentemente, un tamaño de por lo menos 25 kb. Se prefieren en particular los fragmentos con un tamaño de por lo menos 30 kb.
Según una forma de realización preferida de la presente invención, el ADN comprende además unas secuencias derivadas de un coronavirus, que codifican para varias o todas salvo una de las proteínas estructurales o no estructurales de un coronavirus. Alternativamente, el ADN según la presente invención comprende además unas secuencias que codifican para todas las proteínas estructurales o no estructurales de un coronavirus.
Según otra forma de realización, los ácidos nucleicos de la presente invención comprenden una secuencia que controla la transcripción de una secuencia derivada de un gARN coronavirus. Se puede utilizar para este objetivo cualquier transcripción de control de secuencia conocida en la técnica, que puede comprender las secuencias que solicitan la expresión de genes derivados de genomas ADN o ARN. Se prefiere la utilización del promotor inmediato temprano (IE) del citomegalovirus (CMV).
El ácido nucleico según la presente invención también puede tener un extremo 3' flanqueado por un extremo de poli (A). El ácido nucleico puede comprender unas secuencias de terminación y/o de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). Adicionalmente o alternativamente, los ácidos nucleicos pueden comprender unas secuencias que codifican una ribozima, por ejemplo la ribozima del virus de hepatitis \delta (HDV).
Los ácidos nucleicos según la presente invención pueden comprender unas secuencias derivadas de un coronavirus, derivadas por ejemplo de un aislado del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT), virus de la hepatitis murina (MHV), virus de la bronquitis infecciosa (IBV), coronavirus bovino (BoCV), coronavirus canino (CcoV), coronavirus felino (FcoV) o coronavirus humano. Según una forma de realización preferida el ácido nucleico es derivado de un virus de la gastroenteritis transmisible.
La presente invención proporciona, además, unos procedimientos para preparar un ADN según la presente invención, que comprende etapas en las cuales un genoma defectivo interferente derivado de un coronavirus es clonado bajo la expresión de un promotor en un vector BAC y las deleciones en el genoma defectivo son reinsertadas. El procedimiento puede también comprender etapas en las que las secuencias tóxicas en el genoma viral son identificadas antes de reinserción en el ADN genómico restante. Preferentemente, las secuencias tóxicas en el genoma viral son las últimas secuencias a reinsertar antes de completar el genoma. Según la presente invención, este procedimiento resulta apropiado para proporcionar unos clones infectivos de coronavirus que son estables en bacterias para un mínimo de 80 generaciones y por lo tanto proporciona un vector de clonaje muy eficaz.
La presente invención prevé el desarrollo de unos clones infectivos de cADN derivados de coronavirus (Almazan et al., 2000), así como unos vectores construidos de dichos clones infectivos que también incluyen unas secuencias de ácido nucleico heterólogas insertadas en dichos clones. Los clones y vectores proporcionados por la presente invención son apropiados para numerosas aplicaciones en investigación tanto básica como avanzada, así como para una capacidad de clonaje elevada, y pueden ser diseñados de tal modo que su especificidad de especie y tropismo puedan controlarse fácilmente.
La presente patente describe el desarrollo de un procedimiento que posibilita la obtención, por primera vez en la historia de los coronavirus, de un clon cADN infectivo de longitud completa que codifica el genoma de un coronavirus (Almazan et al., 2000).
Se ha desarrollado un nuevo vector o sistema de expresión de ácidos nucleicos heterólogos basado en un coronavirus generado a partir de un clon cADN infectivo que codifica el ARN genómico (gARN) de un coronavirus. En una realización particular de esta invención, el coronavirus es el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT).
El nuevo sistema de expresión puede ser utilizado en investigación básica o aplicada, por ejemplo, para obtener productos de interés (proteínas, enzimas, anticuerpos, etc.), como vector vacunal o en terapia génica tanto en humanos como en animales. El coronavirus infectivo obtenido a partir del clon infectivo de cADN puede se manipulado por técnicas convencionales de ingeniería genética con lo que se podrán introducir nuevos genes en el genoma del coronavirus y expresar estos genes de una manera específica de tejido y especie para inducir una respuesta inmune o para terapia génica. Además, se ha optimizado la expresión mediante la selección de nuevas secuencias reguladoras de la transcripción (TRS) que permiten incrementar los niveles de expresión más de 100 veces.
Los vectores derivados de coronavirus, en particular, del VGPT presentan varias ventajas para la inducción de inmunidad en mucosas con respecto a otros sistemas de expresión que no replican en éstas: (i) el VGPT infecta las mucosas entéricas y respiratorias [Enjuanes and Van der Zeijst, 1995] es decir, los sitios más adecuados para la inducción de inmunidad secretoria; (ii) su tropismo puede ser controlado mediante la modificación del gen S (spike) [Ballesteros et al., 1997]; (iii) se dispone de aislados no patógenos para el desarrollo de sistemas de expresión dependientes de virus complementador [Sánchez et al., 1992]; y, (iv) los coronavirus son virus ARN citoplásmicos que replican sin pasar por una etapa intermediaria de ADN [Lai and Cavanagh, 1997] haciendo prácticamente imposible su integración en el cromosoma celular.
El procedimiento que ha hecho posible recuperar un coronavirus infectivo a partir de un cADN que codifica el gARN de un coronavirus, incluye las siguientes estrategias:
(i)
la expresión del ARN del coronavirus bajo el control de un promotor apropiado;
(ii)
el clonaje del genoma del coronavirus en cromosomas bacterianos artificiales (BACs);
(iii)
la identificación de las secuencias de cADN del coronavirus tóxicas directa o indirectamente para la bacteria;
(iv)
la identificación del orden preciso de ensamblamiento de los elementos que componen el cADN que codifica un ARN infectivo de coronavirus (promotores, secuencias de terminación de transcripción, secuencias de poliadenilación, ribozimas, etc.); y
(v)
la identificación de un grupo de tecnologías y procesos (condiciones para el crecimiento de los BACs, modificaciones al proceso de purificación de ADN de BAC, técnicas de transformación, et.) que combinados entre sí permiten el rescate eficiente de un coronavirus infectivo a partir de un cADN.
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El promotor juega un papel importante para aumentar la expresión del ARN viral en el núcleo, donde es sintetizado, para ser transportado posteriormente al citoplasma.
El empleo de BACs constituye uno de los puntos clave del procedimiento de la invención. Como es conocido, a menudo, el clonaje de secuencias eucarióticas en plásmidos bacterianos no es posible debido a la toxicidad para la bacteria de las secuencias exógenas. En estos casos, la bacteria suele eliminar la toxicidad modificando las secuencias introducidas. Sin embargo, en la estrategia seguida en este caso, para evitar la posible toxicidad de las secuencias virales, se realizaron los clonajes necesarios para obtener un cADN completo del coronavirus en BACs. Esos plásmidos aparecen solo en una copia o máximo dos por célula, limitando considerablemente su toxicidad y reduciendo las posibilidades de recombinación interplásmidos.
Mediante la identificación de las secuencias de cADN del coronavirus tóxicas para la bacteria se puede completar la construcción de cADN que codifica el genoma completo de un coronavirus con la excepción de las secuencias tóxicas, las cuales se añaden en el último paso de la construcción del genoma completo, es decir, justo antes de la transfección en células eucarióticas, con lo que se evita su modificación por parte de la bacteria.
Un objeto de esta invención lo constituye un clon infectivo de doble cadena de cADN que codifica el gARN de un coronavirus, y su procedimiento de obtención.
Un objeto adicional de esta invención lo constituye un conjunto de vectores virales recombinantes que comprenden dicho clon infectivo y unas secuencias de ácidos nucleicos heterólogos insertadas en dicho clon infectivo.
Un objeto adicional de esta invención lo constituye un método para producir un coronavirus recombinante que comprende la introducción de dicho clon infectivo en una célula hospedadora, el cultivo de la célula transformada en condiciones que permiten la replicación del clon infectivo y la producción del coronavirus recombinante, y recuperar el coronavirus recombinante del cultivo.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para producir un coronavirus recombinante modificado que comprende introducir el vector viral recombinante en una célula hospedadora, cultivar ésta en condiciones que permiten la replicación del vector viral y la producción del coronavirus recombinante modificado, y recuperar el coronavirus recombinante modificado del cultivo. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para producir un producto de interés que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene dicho vector viral recombinante en condiciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN heteróloga.
Las células que contienen los clones infectivos o el vector viral recombinante mencionados constituyen otro objeto adicional de la presente invención.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituyen unas vacunas inductoras de la protección de animales frente a infecciones causadas por agentes infectivos. Estas vacunas comprenden los vectores infectivos que expresan, al menos, un antígeno adecuado para inducir una respuesta inmune frente a cada agente infectivo, o bien, al menos, un anticuerpo que proporciona protección contra dicho agente infectivo, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las vacunas pueden ser mono-, o multivalentes dependiendo de si los vectores expresan uno o más antígenos capaces de inducir una respuesta inmune frente a uno o más agentes infecciosos, o, alternativamente, uno o más anticuerpos que proporcionan protección contra uno o más agentes infecciosos.
Otro objeto proporcionado por esta invención comprende un método de inmunización de animales que consiste en la administración de dicha vacuna.
La invención proporciona un clon cADN que codifica el ARN infectivo de un coronavirus, denominado en lo sucesivo el clon infectivo según la invención, que comprende: (1) una copia del ADN complementario (cADN) al ARN genómico infectivo (gARN) de un coronavirus o del propio ARN viral; y (2) un módulo de expresión para un gen adicional, que comprende secuencias optimizadas de transcripción-promoción.
En una realización particular de esta invención, el coronavirus es un aislado de VGPT, en particular, el aislado PUR46-MAD [Sánchez et al., 1990], modificado por el reemplazamiento del gen S de este virus por el gen S del aislado VGPT clon C11 o el gen S de un coronavirus canino o humano.
La secuencia promotora de la transcripción, o promotor, es una secuencia ARN situada en el extremo 5'-terminal de cada ARN mensajero (mARN) de coronavirus, a la que se une la ARN polimerasa viral para iniciar la transcripción del ARN mensajero (mARN). En una realización particular y preferida el genoma viral es expresado de un cADN por medio del promotor IE de CMV debido al elevado nivel de expresión obtenido usando este promotor [Dubensky et al., 1996] y a resultados anteriores obtenidos en nuestro laboratorio que indicaban que genomas defectivos de gran tamaño (9,7 kb y 15 kb) derivados del coronavirus VGPT expresaban ARNs que no sufrían splicing durante su transporte desde el núcleo, donde son sintetizados, hasta el citoplasma.
El clon infectivo de la invención también contiene una secuencia de terminación de transcripción y una señal de poliadenilación como la procedente del gen de la BGH. Estas secuencias de terminación tienen que estar colocadas en el extremo 3' de la cola poli(A). En una realización particular, el clon infectivo de la invención contiene una cola poli(A) de 24 residuos de A y las secuencias de terminación y poliadenilación de la BGH separadas de la cola poli(A) por la secuencia de la ribozima del HDV.
El plásmido en el que se ha insertado el cADN infectivo del coronavirus es una molécula de ADN que posee un origen de replicación y es, por tanto, potencialmente capaz de replicarse en una célula adecuada. El plásmido utilizado es un replicón adecuado para mantener y amplificar el clon infectivo de la invención en una célula hospedadora adecuada, tal como, una bacteria, por ejemplo, Escherichia coli. El replicón, en general, porta un gen de resistencia a antibióticos que permite la selección de las células que lo llevan (por ejemplo, el cat).
En el ejemplo 1 se describe la construcción de un clon infectivo de VGPT bajo el control del promotor IE de CMV. El extremo 3' del cADN aparece flanqueado por una secuencia poli(A) de 24 nt, la ribozima de HDV y la secuencia de terminación de la transcripción de la BGH.
El procedimiento de obtención del clon infectivo de la invención comprende construir el cADN de longitud completa que codifica el gARN de un coronavirus y ensamblar los elementos reguladores de la transcripción.
El cADN que codifica el gARN infectivo de un coronavirus se obtuvo a partir de un genoma DI derivado de un coronavirus que se clona como un cADN bajo el control de un promotor apropiado en un BAC, con el fin de aumentar la estabilidad del cADN. A continuación, se identificaron las secuencias tóxicas para la bacteria y, con el fin de eliminar esa toxicidad, se retiraron dichas secuencias tóxicas y se insertaron al final de la construcción del genoma completo, justo antes de efectuar la transfección en células eucarióticas. La progenie viral se puede reconstituir mediante transfección del plásmido BAC que contiene el genoma de coronavirus en células eucarióticas que soportan la replicación viral.
El ensamblaje de los elementos reguladores de la transcripción se realiza mediante técnicas convencionales [Maniatis et al., 1989].
El clon infectivo de la invención se puede manipular por técnicas de ingeniería genética convencionales para insertar, al menos, una secuencia de un ácido nucleico heterólogo, que codifica una determinada actividad, bajo el control del promotor que esté presente en el clon infectivo y de las secuencias reguladoras contenidas en el vector de expresión resultante.
El clon infectivo de la invención presenta numerosas aplicaciones, por ejemplo, puede ser utilizado tanto en investigación básica, por ejemplo, para estudiar el mecanismo de replicación y transcripción de los coronavirus, como en investigación aplicada, por ejemplo, en el desarrollo de sistemas de expresión eficientes de productos de interés (proteínas, enzimas, anticuerpos, etc.).
A partir del clon cADN infectivo de la invención se pueden transformar células apropiadas, y recuperar los viriones obtenidos que contienen el genoma completo del coronavirus. Por tanto, la invención proporciona, además, un método para producir un coronavirus recombinante que comprende la introducción de un cADN infectivo de la invención en una célula hospedadora, el cultivo de dicha célula bajo condiciones que permiten la expresión y replicación del clon infectivo y la recuperación de los viriones obtenidos del coronavirus recombinante que contienen el genoma infectivo del coronavirus. La introducción del clon infectivo de la invención en la célula hospedadora puede realizarse de varias maneras, por ejemplo, por transfección de la célula hospedadora con un ARN transcrito in vitro a partir de un clon infectivo de la invención, o por infección de la célula hospedadora con el clon cADN infectivo de la invención. Dichas células
hospedadoras que contienen el clon infectivo de la invención constituyen un objeto adicional de la presente invención.
La invención también proporciona unos vectores virales recombinantes derivados de un clon infectivo de la invención, en adelante vectores virales de la invención. Los vectores virales de la invención comprenden un clon cADN infectivo de la invención modificado para contener un ácido nucleico heterólogo insertado en dicho clon infectivo bajo condiciones que permiten la expresión de dicho ácido nucleico heterólogo.
El término "ácido nucleico" tal como se utiliza en esta descripción incluye genes o fragmentos de genes así como, en general, cualquier molécula de ADN o ARN.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "heterólogo" aplicado a un ácido nucleico se refiere a una secuencia de ácido nucleico que no está presente normalmente en el vector empleado para introducir el ácido nucleico heterólogo en una célula hospedadora.
El ácido nucleico heterólogo que puede contener el vector viral de la invención puede ser un gen o fragmento que codifica una proteína, un péptido, un epítopo o cualquier producto génico de interés (tales como anticuerpos, enzimas, etc.). El ácido nucleico heterólogo se puede insertar en el clon infectivo de la invención mediante técnicas de ingeniería genética convencionales en cualquier región apropiada del cADN, por ejemplo, después de la ORF 1b o entre genes N y 7, siguiendo el codon iniciador (AUG) y en fase de lectura con ese gen; o, alternativamente, en las zonas correspondientes a otras ORFs. En la construcción del vector viral de la invención es esencial que la inserción del ácido nucleico heterólogo no interfiera ninguna de las funciones virales básicas.
El vector viral de la invención puede expresar una o más actividades. En este último caso, el vector viral incluirá tantas secuencias de ácido nucleico heterólogo como actividades se van a expresar precedidas de uno o varios promotores, o bien de un promotor y varios sitios de reconocimiento del ribosoma (IRES), sitios interiores de entrada de ribosoma, o bien de varios promotores y un sitio de reconocimiento del ribosoma.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para producir un producto de interés que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector viral de la invención bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico heterólogo y recuperar el producto de interés. Dichas células hospedadoras que contienen el vector viral de la invención constituyen un objeto adicional de la presente invención.
El vector viral de la invención puede ser diseñado de forma que se puede controlar fácilmente su especificidad de especie y su tropismo. Debido a estas características, una aplicación muy interesante de los vectores virales de la invención es su empleo en terapia génica como vector del gen de interés o como vector vacunal para inducir respuestas inmunes frente a diferentes patógenos.
La invención proporciona, además, vacunas capaces de inducir protección en un animal frente a la infección causada por un agente infeccioso que comprende (i) al menos, un vector viral de la invención que expresa, al menos, un antígeno adecuado para inducir una respuesta inmune frente a dicho agente infeccioso, o un anticuerpo que proporciona protección contra dicho agente infeccioso, junto con, opcionalmente, (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Por "inducir protección", en el sentido utilizado en esta descripción, debe entenderse la respuesta inmune del organismo receptor (animal a inmunizar) inducida por el vector viral de la invención, a través de los mecanismos adecuados tales como los inducidos por sustancias potenciadoras de la respuesta celular (inter-leuquinas, interferones, etc.), factores de necrosis celulares y sustancias similares que hacen que el animal quede protegido frente a infecciones causadas por agentes infecciosos.
Bajo el término "animal" están incluidos todos los animales de cualquier especie, preferentemente mamíferos, incluido el hombre.
El término "agente infeccioso" en el sentido utilizado en esta descripción incluye a cualquier agente infectivo viral, bacteriano, fúngico, parasitario, u otros que puedan infectar a un animal y ocasionarle una patología.
En una realización particular, la vacuna proporcionada por esta invención comprende al menos un vector viral de la invención que expresa, al menos, un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune sistémica y/o una respuesta inmune en mucosas frente a distintos agentes infecciosos que se propagan en mucosas respiratorias o entéricas. Los vectores objeto de la invención son muy adecuados para inducir inmunidad en mucosas así como inmunidad lactogénica, de especial interés en la protección de neonatos frente a infecciones del tracto intestinal.
En otra realización particular, la vacuna proporcionada por esta invención comprende, al menos, un vector viral de la invención que expresa, al menos, un gen que codifica para las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG_{1}, IgA, etc.) que proporciona protección contra un agente infeccioso.
La especificidad de especie se puede controlar de forma que el vector viral exprese la proteína S de la envuelta, de un coronavirus que infecta la especie deseada (humana, canina, felina, porcina, etc.), adecuada para ser reconocido por los receptores celulares de la especie correspondiente.
Las vacunas proporcionadas por esta invención pueden ser monovalentes o multivalentes dependiendo de si los vectores de la invención expresan uno o más antígenos capaces de inducir una respuesta inmune frente a uno o más agentes infecciosos o bien uno o más anticuerpos que proporcionan protección contra uno o más agentes infecciosos.
En una realización particular de esta invención se proporcionan vacunas monovalentes capaces de proteger al hombre, cerdos, perros y gatos contra distintos agentes infecciosos humanos, porcinos, caninos y felinos, y el tropismo se controla expresando la glicoproteína S del coronavirus con la especificidad de especie deseada.
Las vacunas monovalentes contra agentes infecciosos porcinos pueden contener un vector que exprese un antígeno seleccionado del grupo esencialmente constituido por antígenos de los siguientes patógenos porcinos: Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Parvovirus porcino, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelotrix rhusiopathiae, Pasterella multocida, Bordetella bronchiseptica, Clostridium pp., Serpulina hydiosenteriae, Mycoplasma hyopneumoniae, virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), coronavirus respiratorio porcino, rotavirus, o contra los patógenos causantes del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, la enfermedad de Aujeszky (Pseudorabies), influenza porcina o gastroenteritis transmisible y el agente etiológico de la rinitis atrófica y de la ileitis proliferativa. Las vacunas monovalentes contra agentes infecciosos caninos pueden contener un vector de expresión que exprese un antígeno seleccionado del grupo esencialmente constituido por antígenos de los siguientes patógenos caninos: herpesvirus caninos, adenovirus canino tipos 1 y 2, parvovirus canino tipos 1 y 2, reovirus canino, rotavirus canino, coronavirus canino, virus de la parainfluenza canina, virus de la influenza canina, virus del moquillo (Distemper virus), virus de la rabia, retrovirus y calicivirus canino.
Las vacunas monovalentes contra agentes infecciosos felinos pueden contener un vector de expresión que exprese un antígeno seleccionado del grupo esencialmente constituido por antígenos de los siguientes patógenos felinos: calicivirus del gato, virus de la inmunodeficiencia felina, herpesvirus felinos, virus de la panleucopenia felina, reovirus felino, rotavirus felino, coronavirus felino, virus de la peritonitis infecciosa del gato, virus de la rabia, Chlamydia psittaci felina, y virus de la leucemia felina.
Los vectores pueden expresar un anticuerpo que proporciona protección contra un agente infeccioso, por ejemplo, un agente infeccioso porcino, canino o felino como los citados previamente. En una realización particular, el vector expresa el anticuerpo monoclonal recombinante identificado como 6A.C3 que neutraliza el VGPT, expresado con isotipos IgG_{1} o IgA en el que la parte constante de la inmunoglobulina es de origen porcino o anticuerpos neutralizantes para rotavirus humanos y porcinos.
Como excipiente puede utilizarse un diluyente tal como suero salino fisiológico y otras soluciones salinas similares. Asimismo, estas vacunas pueden contener también un adyuvante de los habitualmente utilizados en la formulación de vacunas, tanto acuoso, tal como hidróxido de aluminio, QuilA, suspensiones de geles de alúmina y similares, como oleoso, a base de aceites minerales, glicéridos y derivados de ácido graso, y sus mezclas.
Estas vacunas también pueden contener sustancias potenciadoras de la respuesta celular (PRC), es decir, sustancias potenciadoras de subpoblaciones de células T helper (Th_{1} y Th_{2}) tales como interleuquina-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN (gamma interferón), factor de necrosis celular y sustancias similares, que podrían, teóricamente, provocar inmunidad celular en los animales vacunados. Estas sustancias PRC podrían utilizarse en formulaciones vacunales con adyuvantes acuosos u oleosos. También pueden utilizarse otro tipo de adyuvantes que modulan e inmunoestimulan la respuesta celular tales como el MDP (muramil dipéptido), ISCOM (Immuno Stimulant Complex) o liposomas.
La invención proporciona vacunas multivalentes capaces de prevenir y proteger animales de las infecciones causadas por distintos agentes infecciosos. Estas vacunas multivalentes pueden elaborarse a partir de vectores virales de la invención en los que se han insertado las distintas secuencias que codifican los antígenos correspondientes en el mismo vector recombinante o bien construyendo vectores recombinantes independientes que posteriormente se mezclarían para su inoculación conjunta. Por tanto, estas vacunas multivalentes comprenden un vector viral que contiene más de una secuencia de ácidos nucleicos heterólogos que codifican para más de un antígeno o, alternativamente, distintos vectores virales que expresan, cada uno de ellos, al menos un antígeno distinto.
Análogamente, se pueden preparar vacunas multivalentes que comprenden vectores multivalentes utilizando secuencias que codifican anticuerpos que proporcionan protección contra agentes infecciosos en lugar de secuencias que codifican los antígenos.
En una realización particular de esta invención se proporcionan vacunas capaces de conferir inmunidad a hombres, cerdos, perros y gatos contra distintos agentes infecciosos humanos, porcinos, caninos y felinos, respectivamente. Para ello, los vectores virales contenidos en la vacuna deben expresar distintos antígenos de los patógenos humanos, porcinos, caninos o felinos previamente mencionados u otros.
Las vacunas de esta invención pueden presentarse en forma líquida o liofilizada y pueden prepararse suspendiendo los sistemas recombinantes en el excipiente. Si dichos sistemas estuvieran en forma liofilizada, el propio excipiente podría ser el reconstituyente.
Alternativamente, las vacunas proporcionadas por esta invención se pueden utilizar en combinación con otras vacunas convencionales, ya sea formando parte de las mismas o bien como diluyente o fracción liofilizada para diluirse con otras vacunas ya sean convencionales o recombinantes.
Las vacunas proporcionadas por esta invención pueden administrarse al animal por vía oral, nasal, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular o por medio de aerosol.
La invención también proporciona un método para la inmunización de animales, en particular, hombres, cerdos, perros y gatos, contra uno o varios agentes infecciosos de forma simultánea, que comprende la administración por vía oral, nasal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular o por medio de aerosol (o formas combinadas de éstas) de una vacuna que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de un sistema recombinante proporcionado por esta invención.
Adicionalmente, la invención también proporciona un método para proteger a los animales recién nacidos contra agentes infecciosos que infectan a dichos animales, que consiste en la administración por vía oral, nasal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular o por medio de aerosol (o formas combinadas de éstas) a las madres antes de o durante el periodo de gestación, o a su progenie, de una vacuna de las proporcionadas por esta inven-
ción.
La invención se ilustra mediante el siguiente ejemplo que describe de forma detallada la obtención de clones infectivos y la construcción de vectores virales de la invención. Este ejemplo no debe ser considerado como limitativo del alcance de la invención sino como ilustrativo de la misma. En dicho Ejemplo, la transformación de bacterias, el crecimiento de las bacterias, la purificación del ADN, el análisis de secuencias y el ensayo para evaluar la estabilidad de los plásmidos, se realizaron según la metodología que se describe a continuación.
Transformación de bacterias
Todos los plásmidos fueron electroporados de la estirpe de E. coli DH10B (Gibco BRL), introduciendo ligeras modificaciones a protocolos previamente descritos [Shizuya et al., 1992]. Para cada transformación mezclaron 2 \mul de la ligación y 50 \mul de bacterias competentes en cubetas de 0,2 cm (BioRad) y se electroporaron a 200 \Omega, 2,5 kV y 25 \muF. A continuación, se añadió 1 ml de medio SOC [Maniatis et al., 1989] a cada transformación, se incubaron las células a 37ºC durante 45 minutos, y finalmente las colonias recombinantes se detectaron en placas de LB SOC [Maniatis et al., 1989] con 12,5 \mug/ml de cloranfenicol.
Condiciones de crecimiento de las bacterias
Las bacterias que contenían los plásmidos originales en los que se encontraba clonado el genoma incompleto del VGPT (Figura 3) se crecieron a 37ºC, mostrando cinéticas de crecimiento normales. Por otra parte, el BAC que contenía el cADN completo se creció a 30ºC con el fin de minimizar al máximo la inestabilidad. Aún así, el tamaño de las colonias era reducido y fueron necesarios periodos de incubación de hasta 24 h para conseguir tamaños de colonia normales.
Purificación de ADN
Se siguió el protocolo descrito por Woo (Woo et al., 1994) con ligeras modificaciones. A partir de una única colonia se inocularon 4 l de LB con cloranfenicol (12,5 \mug/ml). Después de un periodo de incubación de 18 h a 30ºC, las bacterias fueron recogidas por centrifugación a 6.000 g, y el plásmido purificado usando el kit de Maxipreparaciones de plásmidos de Qiagen de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Mediante este procedimiento se observó que el ADN plasmídico obtenido presentaba contaminación con ADN bacteriano. Con el fin de eliminar el ADN bacteriano contaminante, el ADN plasmídico fue purificado mediante centrifugación a 55.000 rpm durante 16 h en un gradiente de CsCl. El rendimiento obtenido fue entre 15 y 30 \mug por litro dependiendo del tamaño del
plásmido.
Análisis de secuencias
La secuenciación de ADN fue realizada en un secuenciador automático (373 ADN Sequencer, Applied Biosystems) utilizando didesoxinucleótidos marcados con fluorocromos y una polimerasa resistente a temperatura (Perkin Elmer). Los reactivos fueron obtenidos a modo de kit (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) de la compañía Applied Biosystems. El termociclador utilizado para hacer las reacciones de secuenciación fue un "GeneAmpPCR System 9600" (Perkin Elmer).
El ensamblaje de las secuencias y su comparación con la secuencia consenso del VGPT fueron realizados utilizando los programas SeqMan II y Align (DNASTAR), respectivamente. No se detectaron diferencias en relación con la secuencia consenso.
Estabilidad de los plásmidos
A partir de los glicerolados originales, las bacterias que contenían plásmidos pBeloBAC11 recombinantes fueron crecidas en 20 ml de LB con cloranfenicol (12,5 \mug/ml) durante 16 h a 30ºC y 37ºC. Este material fue considerado como pase 0. Las bacterias fueron diluidas 10^{6} veces y crecidas a 30ºC y 37ºC durante 16 h. Se realizaron pases seriados durante ocho días consecutivos (cada pase representa aproximadamente 20 generaciones). El ADN plasmídico fue purificado por Miniprep a pase 0 y 8 (160 generaciones) y analizado con endonucleasas de restricción. Los dos plásmidos que contenían parte del genoma VGPT presentaron una elevada estabilidad, mientras que el plásmido que contenía el genoma completo del VGPT mostró cierta inestabilidad después de 40 generaciones (en este punto aproximadamente el 80% del ADN presentaba el patrón de restricción correcto).
Ejemplo 1 Construcción de un vector recombinante basado en un clon de cADN infectivo derivado del VGPT 1.1 Generación de un cADN infectivo del VGPT
Con el fin de obtener un cADN que codificaba para el genoma completo del VGPT, se partió originalmente de un cADN que codificaba para el genoma defectivo DI-C [Méndez et al., 1996]. Este cADN, con una longitud aproximada de un tercio del genoma del VGPT, fue clonado en el plásmido de baja copia Pacnr1180 [Ruggli et al., 1996] y su secuencia determinada. El cADN que codificaba el genoma defectivo fue rescatado eficientemente (replicado y empaquetado) con la ayuda de un virus complementador [Méndez et al., 1996; Izeta et al., 1999].
El genoma DI-C presenta tres deleciones (\Delta1, \Delta2 y \Delta3) de aproximadamente 10, 1 y 8 kilobases (kb), en las ORFs 1a, 1b, y entre los genes S y 7, respectivamente (véase la Figura 1).
La estrategia seguida para completar la secuencia de un cADN que codificara para un genoma infectivo del VGPT fue incorporar paso a paso las secuencias delecionadas en el genoma DI-C, analizando la toxicidad en bacterias de las nuevas construcciones generadas. Este aspecto es de gran importancia ya que está ampliamente documentado en la literatura científica que plásmidos recombinantes que presentaban cADNs de virus ARN generalmente crecían mal y eran inestables [Boyer and Haenni, 1994; Rice et al., 1989; Mandl et al., 1997].
La primera deleción en completarse fue la deleción \Delta2, de 1 kb, de la ORF 1b, dando como resultado un plásmido recombinante estable. La secuencia que faltaba de la ORF la fue introducida clonando los fragmentos de cADN A, B, C y D (Figura 1) [Almazan et al., 2000] de tal modo que se completara toda la información requerida para el gen de la replicasa. El plásmido recombinante obtenido era inestable en la bacteria generándose nuevos plásmidos que habían incorporado adiciones y deleciones en el fragmento B [Almazan et al., 2000]. Interesantemente, la eliminación de un fragmento de restricción ClaI-ClaI de 5.198 pb que abarcaba la región del genoma comprendida entre los nucleótidos 4.471 y 9.615 [Penzes et al., 2000] permitió la obtención de un plásmido relativamente estable en la estirpe de E. coli DH10B. Posteriormente, la secuencia de la deleción \Delta3 fue añadida mediante el clonaje de toda la información genética para las proteínas estructurales y las proteínas no estructurales del extremo 3' del genoma del VGPT (Figura 1).
Con el fin de incrementar la estabilidad del cADN del VGPT se decidió subclonarlo en BAC utilizando el plásmido pBeloBAC11 [Kim et al., 1992] (véase la Figura 2). El plásmido pBeloBAC11 fue cedido generosamente por H. Shizuya y M. Simon (California Institute of Technology). El plásmido, con un tamaño de 7.507 pb, incluye el origen de replicación del factor F de E. Coli (oriS), y los genes necesarios para mantener una única copia del plásmido por célula (parA, parB, parC and repE). El plásmido también presenta el gen de resistencia a cloranfenicol como marcador de selección. El cADN fue clonado bajo e control del promotor IE de CMV debido al elevado nivel de expresión obtenido usando este promotor (Dubensky et al., 1996) y a resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio que indicaban que genomas defectivos de gran tamaño (9,7 kb- y 15 kb) derivados del VGPT expresaban ARNs, que no sufrían splicing durante su transporte desde el núcleo, donde son sintetizados, hasta el citoplasma [Izeta et al., 1999; Penzes et al., 1999; Almazan et al., 2000]. El cADN del VGPT, generado (pBAC-TcADN^{-\Delta ClaI}) contenía la información para los genes de la replicasa, con la excepción del fragmento ClaI de 5.198 pb delecionado, y toda la información de los genes estructurales y no estructurales. El extremo 3' del cADN aparece flanqueado por una secuencia poli A de 24 nt, la ribozima de HDV y la secuencia de terminación de la transcripción de la BGH [Izeta et al., 1999]. Por otra parte, el fragmento ClaI necesario para generar un genoma completo del VGPT fue clonado en BAC generando el plásmido pBAC-B+C+D5', el cual contenía la región del genoma del VGPT entre los 4.310 y 9.758 [véase la Figura 3]. Ambos plásmidos fueron crecidos en la estirpe de E. coli DH10B y secuenciados en su totalidad. La secuencia obtenida resultó ser idéntica a la secuencia consenso del aislado PUR46-MAD del VGPT proporcionada al final de este documento, con la excepción de dos sustituciones en las posiciones de los nucleótidos 6.752 (A \Rightarrow G, silenciosa) y 18.997 (T \Rightarrow C, silenciosa) y los cambios en el gen S del PUR46-MAD que se ha sustituido por el gen D del aislado C11 (estos cambios se indican en la Figura 4).
Además, con el fin de generar un cADN que codificara un VGPT virulento, el gen S del aislado PUR46-MAD, que replica a elevados niveles en el tracto respiratorio (>10^{6} ufp/g de tejido) y con niveles bajos en el tracto entérico (<10^{3} ufp/ml), fue reemplazado completamente por el gen S del clon 11 de VGPT, en adelante C11, el cual replica con títulos elevados tanto en el tracto respiratorio (<10^{6} ufp/ml) como en el entérico (<10^{6} ufp/ml) [Sánchez et al., 1999]. el gen S de C11 presenta 14 nucleótidos diferentes con respecto al gen S del aislado PUR46-MAD, más una inserción de 6 nt en el extremo 5' del gen S (véase la Figura 4) [Sánchez et al., 1999]. Resultados previos en nuestro laboratorio [Sánchez et al., 1999] pusieron de manifiesto que mutantes generados por recombinación dirigida, en los cuales el gen S del aislado entérico C11, adquirían un tropismo entérico e incrementaban la virulencia del aislado natural PUR46-MAD del VGPT fue reemplazado por el gen S del aislado natural PUR46-MAD del VGPT que replica muy poco o nada en el tracto entérico de cerdos infectados.
Se construyó un cADN del aislado PUR46-MAD de VGPT con el gen S del aislado entérico C11 mediante clonaje del fragmento ClaI-ClaI de 5.198 bp, obtenido del plásmido pBAC-B+C+D5', en el plásmido pBAC-TcADN^{-\Delta ClaI} para generar el plásmido pBAC-TcADN^{FL} que contiene el cADN que codifica para el genoma completo del VGPT (Figura 3).
La estabilidad en bacterias de los plásmidos utilizados en la construcción del clon de cADN infectivo (pBAC-TcADN^{\Delta ClaI} y pBAC-ClaI^{F}), así como el plásmido que contiene el cADN completo (pBAC-TcADN^{FL}) fue analizada después de ser crecidos en E. coli durante 160 generaciones. El análisis de estabilidad fue llevado a cabo mediante digestión con enzimas de restricción de los ADNs purificados. No se detectaron deleciones o inserciones, aunque no se puede descartar la presencia de cambios menores no detectados por la técnica de análisis utilizada, en el caso de los plásmidos pBAC-TcADN^{-\Delta ClaI}, y pBAC-B+C+D5'. En el caso del plásmido pBAC-TcADN, que contiene el genoma completo de VGPT, se detectó cierta inestabilidad después de 40 generaciones (en este punto aproximadamente el 80% del ADN presentaba el patrón de restricción correcto). Esta ligera inestabilidad, sin embargo, no representa un obstáculo para el rescate del virus infectivo, dado que 20 generaciones (4 litros de cultivo) de crecimiento bacteriano son suficientes para generar una cantidad de ADN plasmídico que permita rescatar el virus.
1.2 Rescate de un VGPT infectivo a partir de un cADN que codifica para el genoma completo
Células ST fueron transfectadas con el plásmido pBAC-TcADN^{FL}. A las 48 h post-transfección el sobrenadante de cultivo fue recogido y pasado en células ST seis veces (véase la Figura S). A partir del pase 2, a las 14 h post-infección el efecto citopático empezaba a ser aparente para posteriormente, a las 20 h post-infección, hacerse extensible a prácticamente la totalidad de las células que formaban la monocapa (véase la Figura 6). Por otra parte, el título del virus rescatado incrementó rápidamente con los pases llegando a valores del orden de 10^{8} ufp/ml a partir del pase 3 (véase la Figura 7). El experimento fue repetido cinco veces y en todos los casos se recuperó virus infectivo con títulos similares, mientras que en el caso de células ST no transfectadas o transfectadas con un plásmido similar donde el fragmento ClaI-ClaI se encontraba en la orientación contraria nunca se recuperó virus.
Con el fin de eliminar la posibilidad de que el virus obtenido fuera el producto de una contaminación, la secuencia en las posiciones 6.752 y 18.997 se determinó mediante secuenciación de fragmentos de cADN amplificados por RT-PCR utilizando como molde el ARN genómico del virus rescatado. El análisis de la secuencia determinó que los nucleótidos en las posiciones 6.752 y 18.997 eran aquéllos presentes en el cADN. Además, el virus rescatado presentaba en la secuencia del cADN del gen S un sitio de restricción DraIII en la posición 20.990, como se esperaba para el gen S de C11 (Figura 8). La presencia de estos tres marcadores genéticos confirmaba que el virus aislado procedía del cADN.
En una caracterización más profunda del virus generado, se llevó a cabo un análisis comparativo por inmunofluorescencia de células infectadas con el virus recuperado (TcADN) después de la transfección con el plásmido pBAC-TcADN^{FL} o células infectadas con el aislado PUR46-MAD del VGPT. Para ello, se utilizaron anticuerpos policlonales y monoclonales específicos que reconocían tanto el aislado C11 como el PUR46-MAD o solamente este último (véase la Figura 10). Los resultados obtenidos confirmaron la antigenicidad esperada para el nuevo virus TcADN. El anticuerpo policlonal específico para el VGPT, los monoclonales esperados específicos de la proteína S (ID.B12 y 6A.C3), así como los monoclonales específicos de las proteínas M (3B.B3) y N (3B.D8), reconocían tanto el TcADN como el PUR46-MAD. Los datos obtenidos indicaban que el virus generado presentaba las proteínas M y N del aislado PUR46-MAD y la proteína S del aislado C11, como había sido diseñado en el cADN original.
1.3 Infectivicidad in vivo y virulencia
Con el fin de analizar la infectividad in vivo del virus TcADN, un grupo de cinco cerdos recién nacidos fueron inoculados con virus clonado del pase 6, y la mortalidad analizada. Los cinco cerdos inoculados murieron entre los días 3 y 4 post-inoculación indicando que el virus TcADN era virulento. En contraste dos lechones inoculados solo con el diluyente del virus y mantenidos en las mismas condiciones no sufrieron alteraciones.
1.4 Optimización de los niveles de expresión mediante la modificación de las secuencias reguladoras de la transcripción
La síntesis de ARN en coronavirus tiene lugar mediante un proceso dependiente de ARN, en el cual los mARNs son transcritos a partir de moldes con polaridad negativa. En el VGPT aparece una secuencia consenso, CTAAACC, la cual se localiza justo por delante de la mayoría de los genes. Estas secuencias representan señales para la transcripción de los mARNs subgenómicos. En coronavirus existen entre seis u ocho tipos de mARNs con tamaños variables, dependiendo del tipo de coronavirus y del hospedador. El de mayor tamaño se corresponde con el ARN genómico, el cual a su vez sirve como mARN para las ORFs 1a y 1b. El resto de mARNs se corresponden con mARNs subgenómicos. Estos ARNs se denominan mARN 1 hasta 7, en orden decreciente de tamaño. Por otra parte algunos mARNs que han sido descubiertos con posterioridad al conjunto de mARNs descritos originalmente, han sido denominados con el nombre del mARN correspondiente, un guión y un número, por ejemplo, mARN 2-1. Los mARNs presentan una estructura coterminal en relación con la estructura del ARN genómico. Con la excepción del mARN de menor tamaño, el resto son estructuralmente policistrónicos, donde en general sólo la ORF localizada más hacia el 5' es traducida.
Se ha estudiado la eficiencia en la expresión de un gen marcador (GUS) utilizando diferentes secuencias flanqueantes al 5' terminal de la secuencia intergénica mínima (IG) CTAAAC (Figura 11), diferentes secuencias flanqueantes al 3' terminal de la secuencia IG (Figura 12), y varios sitios de inserción (Figura 13). Los resultados obtenidos (Figuras 11 a 13) indicaron que la expresión óptima se conseguía con una TRS constituida por: (i) los -88 nt flanqueantes de la secuencia consenso para el gen N del VGPT; (ii) la secuencia IG; y (iii) la secuencia flanqueante al 3' de la secuencia IG del gen S. Además, de acuerdo con los resultados obtenidos según el punto de inserción del gen heterólogo, los mayores niveles de expresión se conseguían cuando el gen heterólogo se localizaba en el extremo 3' del genoma. Una TRS como la descrita permite la expresión GUS a unos niveles de entre 2 y 8 \mug por 10^{6} células.
1.5 Especificidad de tejido del sistema de expresión
Muchos de los patógenos entran en el hospedador a través de las mucosas. Con el fin de prevenir este tipo de infecciones es importante desarrollar sistemas de expresión que permitan inducir niveles elevados de inmunidad secretora. Esto puede ser conseguido fundamentalmente mediante la administración de los antígenos en los nódulos linfáticos asociados al tracto respiratorio y/o entérico. Para conseguir este fin, y en general para dirigir la expresión de un gen al tejido de interés, se han estudiado las bases moleculares del tropismo del VGPT. Estos estudios han puesto de manifiesto que la especificidad de tejido del VGPT puede ser modificada mediante la construcción de virus recombinantes que contengan el gen S del coronavirus con el tropismo deseado [Ballesteros et al., 1997; Sánchez et al., 1999]. Esta información permite construir sistemas de expresión basados en genomas cADNs de coronavirus con tropismo respiratorio o entérico.
1.6 Expresión del antígeno viral codificado por la ORF 5 del PRRSV utilizando el cADN infectivo
Con el fin de optimizar los niveles de expresión de genes heterólogos, se hicieron construcciones a partir de un vector de módulos intercambiables flanqueados por secuencias de clonaje que facilitan el intercambio de TRSs y genes heterólogos dentro del vector. La construcción que incluía la ORF 5 del PRRSV flanqueado en su extremo 5' por la secuencia consenso mínima IGS (CUAAAC) precedida de los -88 nts flanqueantes del gen de la nucleocápsida viral (N), y en su extremo 3' por el sitio de restricción SalI (GTCGAC) y una secuencia análoga a la de Kozak (AC)GACC, dieron una expresión óptima (entorno a 10 \mug/10^{6} células). Estos niveles de expresión del gen heterólogo son en principio más que suficientes para la inducción de una respuesta inmune. El gen heterólogo se insertó en la posición previamente ocupada por los genes 3a y 3b del virus, que son dispensables.
1.7 La inducción, en ganado porcino, de una respuesta inmunitaria a un antígeno expresado con el vector viral derivado de cADN
Por medio del mismo tipo de vector viral derivado del cADN y los TRSs descritos anteriormente, el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GRP) fue expresado a niveles elevados (20 \mug de proteína por millón de células en células de teste porcino, ST). Los niveles de expresión se mantuvieron estables para más de 20 pasos en cultivo celular. Además, un grupo de ganado porcino fue inmunizado con el vector de virus vivo, que se administró por las vías oral, intranasal y intragástrica y se detectó una fuerte respuesta inmunitaria, tanto contra el vector viral como contra la GFP. De forma interesante, no se observaron efectos secundarios en los animales inoculados después de la administración de tres dosis del vector viral.
1.8 La construcción de un vector viral seguro que expresa el gen ajeno sin provocar la generación de un virus infectivo
En el diseño de vectores para seres humanos, la seguridad biológica es una prioridad. Para conseguir este objetivo, tres tipos de protección son construidos en el vector. Dos de estos tipos de protección son basados en la deleción de dos componentes virales, que se proyectan en posiciones diferentes del genoma viral, esenciales para la replicación del virus. Estos componentes son proporcionados en trans por una línea celular introductora. Esta célula (riñón de hámster juvenil, BHK) expresa los genes VGPT ausentes, codificando las proteínas estructurales esenciales del virus (las proteínas del envolvente E y de membrana M). El tercer tipo de protección es la redisposición del señal introductor del genoma viral, de modo que se previene la recuperación por recombinación de un virus infectivo, que ocasiona la generación de un vector suicida que eficazmente expresa los genes heterólogos pero que no puede propagarse incluso a la célula vécina más proxima.
Con el diseño de un nuevo vector para una utilización en seres humanos no se produce un nuevo virus apto para propagarse en la especie humana, puesto que este vector no puede transmitirse célula a célula en los seres humanos. El vector está basado en un virus de replicación defectivo. Su cultivo en la fábrica de vacunas únicamente es posible por medio de la utilización de líneas de células introductoras que complementan las deleciones en el virus. Estas medidas de seguridad representan unos procedimientos nuevos en la ingeneria de coronavirus. El virus recombinante con un nuevo tropismo será competente para la replicación por lo menos en células felinas, puesto que estas células reproducen los coronavirus humanos, porcinos, caninos y felinos.
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Depósito de microorganismos
La bacteria derivada de Escherichia coli, portadora de un plásmido con el clon infectivo de la invención, identificada como Escherichia coli pBAC-TcADN^{FL}, se ha depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot (Valencia), con fecha 24 de noviembre de 1999, correspondiéndole el número de depósito CECT 5265.
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<170> PatentIn Ver 2.1
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gctagcccag gcgcgcggta cc 
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Claims (17)

1. Procedimiento para preparar un ADN que comprende unas secuencias derivadas del ARN genómico (gARN) de un coronavirus, presentando dichas secuencias una homología de por lo menos 60% respecto a la secuencia natural del virus y codificando para una ARN polimerasa ARN-dependiente y por lo menos una proteína estructural o no estructural, en el que el fragmento de dicho ADN puede ser transcrito en ARN y ensamblado a un virion, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de clonación de un genoma defectivo interferente de coronavirus bajo la expresión de un promotor en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y de inserción de nuevo en el genoma defectivo las secuencias delecionadas en dicho genoma.
2. Procedimiento para preparar un ADN según la reivindicación 1, en el que las secuencias en el genoma viral que son tóxicas para la bacteria en la que se va a clonar son identificadas antes de la reinserción en dicho ADN.
3. Procedimiento para preparar un ADN según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que las secuencias tóxicas en el genoma viral son las últimas secuencias a ser reinsertadas para completar el genoma.
4. Procedimiento para preparar un ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se obtiene un clon infectivo que comprende una copia de longitud completa de ADN complementario (cADN) al ARN genómico (gARN) de un coronavirus, clonado bajo una secuencia reguladora de transcripción, comprendiendo dicho procedimiento la construcción del cADN de longitud completa del gARN de un coronavirus y el ensamblaje de los elementos reguladores de transcripción a dicho cADN de longitud completa.
5. Procedimiento para preparar un ADN según la reivindicación 4, en el que la construcción del cADN de longitud completa del gARN de un coronavirus comprende: i) clonar un genoma defectivo interferente derivado de dicho coronavirus bajo un promotor de expresión en un BAC; ii) completar las deleciones de dicho genoma defectivo interferente regenerando las secuencias delecionadas con respecto al gARN infectivo; iii) identificar las secuencias en el coronavirus que son tóxicas para la bacteria en la que se va a clonar, retirar dichas secuencias tóxicas, e insertar dichas secuencias tóxicas justo antes de efectuar la transfección en células eucarióticas para obtener el clon de cADN que corresponde al gARN del coronavirus.
6. Clon infectivo que comprende una copia de longitud completa de ADN complementario (cADN) al ARN genómico (gARN) de un coronavirus, clonado bajo una secuencia reguladora de transcripción, en el que dicho cADN infectivo es clonado en un cromosoma artificial bacteriano (BAC).
7. Clon infectivo según la reivindicación 6, en el que dicho coronavirus es un aislado del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT).
8. Clon infectivo según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho promotor es el promotor de expresión inmediatamente temprano (IE) de citomegalovirus (CMV)
9. Clon infectivo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho cADN de longitud completa está flanqueado en el extremo 3' por una cola poli(A), la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV), y las secuencias de terminación y poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGH).
10. Clon infectivo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicho cADN infectivo es clonado en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) de E. coli depositado bajo el CECT 5265 en la Colección Española de Cultivos Tipo.
11. E. coli depositado bajo el CECT 5265 en la Colección Española de Cultivos Tipo.
12. Vector viral recombinante que comprende un clon infectivo según la reivindicación 6, modificado para contener un ácido nucleico heterólogo insertado en dicho clon infectivo bajo condiciones que permiten la expresión de dicho ácido nucleico heterólogo.
13. Vector viral recombinante según la reivindicación 12, en el que dicho ácido nucleico heterólogo se selecciona entre un gen y un fragmento de un gen que codifica un producto génico de interés.
14. Vacuna capaz de inducir protección en un animal frente a la infección causada por un agente infeccioso que comprende (i) al menos, un vector viral recombinante según la reivindicación 12, que expresa, al menos, un antígeno adecuado para inducir una respuesta inmune frente a dicho agente infeccioso, o un anticuerpo que proporciona protección contra dicho agente infeccioso, junto con, opcionalmente, (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Vacuna según la reivindicación 14, en la que dicho vector viral expresa, al menos, un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune sistémica y/o una respuesta inmune en mucosas frente a distintos agentes infecciosos que se propagan en mucosas respiratorias o entéricas.
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16. Vacuna según la reivindicación 14 ó 15, en la que la vacuna es una vacuna multivalente para inducir protección contra la infección provocada por más de un agente infeccioso.
17. Vacuna multivalente según la reivindicación 16, que comprende vectores virales recombinantes independientes para una inoculación mixta o conjunta, en la que dichos vectores virales recombinantes expresan cada uno por lo menos un antígeno diferente o un anticuerpo diferente.
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