PL206816B1 - Sposób otrzymywania DNA, klon zakaźny, E.coli, rekombinowany wektor wirusowy i szczepionka do ochrony zwierzęcia - Google Patents
Sposób otrzymywania DNA, klon zakaźny, E.coli, rekombinowany wektor wirusowy i szczepionka do ochrony zwierzęciaInfo
- Publication number
- PL206816B1 PL206816B1 PL356390A PL35639000A PL206816B1 PL 206816 B1 PL206816 B1 PL 206816B1 PL 356390 A PL356390 A PL 356390A PL 35639000 A PL35639000 A PL 35639000A PL 206816 B1 PL206816 B1 PL 206816B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- infectious
- coronavirus
- cdna
- rna
- sequences
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 38
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 5
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 title 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 95
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 27
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 116
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 104
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 77
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 54
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 50
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 37
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 20
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 20
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 20
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 20
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 19
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 18
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 17
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 16
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 11
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 claims description 10
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 10
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 claims description 9
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 claims description 9
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 8
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 8
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 claims description 7
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 claims description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 47
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 abstract description 12
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 94
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 92
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 60
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 13
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 5
- 241000711466 Murine hepatitis virus Species 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 241000711443 Bovine coronavirus Species 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 241000725579 Feline coronavirus Species 0.000 description 4
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 4
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 4
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 4
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 3
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 3
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 3
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 101100278012 Escherichia coli (strain K12) dnaG gene Proteins 0.000 description 2
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 2
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 2
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 2
- 101100165173 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) basS gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101100421924 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) spo0C gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- -1 epitope Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 101150004979 flmA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229940037201 oris Drugs 0.000 description 2
- 101150048892 parB gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000606731 Actinobacillus suis Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 241001533362 Astroviridae Species 0.000 description 1
- 208000004300 Atrophic Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241001148534 Brachyspira Species 0.000 description 1
- 241000724268 Bromovirus Species 0.000 description 1
- 241000680578 Canid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001279357 Canine calicivirus Species 0.000 description 1
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 1
- 241001493036 Canine rotavirus Species 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 1
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 1
- 241000579892 Colius Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108700002856 Coronavirus Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 1
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000701915 Feline panleukopenia virus Species 0.000 description 1
- 241000702679 Feline rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 208000036495 Gastritis atrophic Diseases 0.000 description 1
- 206010017964 Gastrointestinal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000724642 Human astrovirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710126256 Hydrolase in agr operon Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 1
- 241000711493 Porcine respiratory coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000702665 Porcine rotavirus Species 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000007230 Sorghum bicolor Nutrition 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012387 aerosolization Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940053200 antiepileptics fatty acid derivative Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000016644 chronic atrophic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 208000009326 ileitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 101150034434 repE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004929 transmission Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000023898 viral genome packaging Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
- A61K39/225—Porcine transmissible gastroenteritis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/20062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
- C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Description
(21) Numer zgłoszenia: 356390 (22) Data zgłoszenia: 30.11.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
30.11.2000, PCT/EP00/012063 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
07.06.2001,WO01/39797 (11) 206816 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12N 7/04 (2006.01)
C12N 1/21 (2006.01)
A61K 39/215 (2006.01) A61K 39/295 (2006.01) A61P 31/12 (2006.01)
| (54) Sposób otrzymywania DNA, klon zakaźny, E. coli, rekombinowany wektor wirusowy (54) i szczepionka do ochrony zwierzęcia | |
| (30) Pierwszeństwo: 03.12.1999, ES, 9902673 | (73) Uprawniony z patentu: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS, Madrid, ES |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 28.06.2004 BUP 13/04 | (72) Twórca(y) wynalazku: SANCHEZ LUIS ENJUANES, Madrid, ES |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.2010 WUP 09/10 | (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska |
PL 206 816 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania DNA zawierającego sekwencje pochodzące z genomowego RNA koronawirusa, klon zakaźny, E. coli, rekombinowany wektor wirusowy pochodzący z zakaźnego klonu i szczepionka do ochrony zwierzęcia przed zakażeniem wywołanym przez czynnik zakaźny.
Wynalazek odnosi się do sposobów otrzymywania DNA lub RNA, kwasów nukleinowych uzyskanych takimi sposobami oraz ich zastosowań jako szczepionek.
Dziedzina wynalazku
Rozwój technologii rekombinowania DNA doprowadził do rozwoju transferu genów pomiędzy organizmami. W tym czasie poczyniono wiele kroków zmierzających do wytworzenia chemicznych, farmaceutycznych i biologicznych produktów będących przedmiotem zainteresowania z punktu widzenia ekonomicznego i handlowego przy zastosowaniu technik transferu genów.
Jednym z kluczowych elementów w manipulacji genetycznej komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi jest opracowanie wektorów oraz systemów wektor-gospodarz. Generalnie, wektor to cząsteczka kwasu nukleinowego zdolna do replikacji i ekspresji w komórce gospodarza. System wektor-gospodarz może być zdefiniowany jako komórka gospodarza, która nosi wektor i zezwala na replikowanie i ekspresję informacji genetycznej w nim zawartej.
Wektory uzyskano z wirusów z genomami zarówno z DNA jak i RNA. Wektory wirusowe otrzymane z wirusów DNA, które replikują się w jądrach komórki gospodarza mają tę wadę, że są zdolne do włączania się do genomu wspomnianej komórki i dlatego nie są zbyt bezpieczne. W przeciwieństwie do tego, wektory wirusowe otrzymane z wirusów RNA, które replikują się w cytoplaźmie komórki gospodarza, są bezpieczniejsze niż te oparte na wirusach DNA, ponieważ replikacja RNA zachodzi poza jądrem. Jest zatem mało prawdopodobne aby te wektory włączały się do genomu komórki gospodarza.
Klony cDNA uzyskano z wirusów zawierających pojedynczy łańcuch RNA o dodatniej polarności [ssRNA(+)], na przykład pikornawirusa (Racaniello i Baltimore, 1981), bromowirusa (Ahlquist i wsp., 1984), alfawirusa, rodzaju który obejmuje wirusa Sindbis, wirusa lasów Semliki (SFV) oraz wenezuelskiego wirusa zapalenia mózgu u koni (VEE) (Rice i wsp., 1987; Liljestrom i Garoff, 1991; Frolov i wsp., 1996; Smerdou i Liljestrom, 1999), flawiwirusa i pestiwirusa (Rice i Strauss, 19881, Lai i wsp., 1991, Rice i wsp., 1989) oraz wirusów z rodziny Astroviridae (Geigenmuller i wsp., 1997). Podobnie wektory do ekspresji genów heterologicznych opracowano z klonów DNA komplementarnych do genomu ssRNA (+) wirusów, np. alfawirusa, obejmującego wirusa Sindbis, wirusa lasów Semliki (SFV) oraz wenezuelskiego wirusa zapalenia mózgu u koni (VEE) (Frolov i wsp., 1996, Liljestrom, 1994, Pushko i wsp., 1997). Jednakże wszystkie te metody otrzymywania rekombinowanych wirusów zaczynające od wirusów RNA są wciąż skomplikowane przez fakt, że większość wirusów zawiera sekwencje, które są toksyczne dla bakterii. Przygotowywanie cDNA z wirusowego RNA oraz subklonowanie cDNA w bakteriach prowadzi często do delecji i przeorganizowania sekwencji DNA u bakteryjnego gospodarza. Z tego powodu większość powszechnie używanych wektorów ekspresyjnych oraz przeznaczonych do subklonowania nie może być użyta do przygotowywania dużych obszarów DNA otrzymanych z rekombinowanych wirusów RNA. Jednakże pożądane jest uzyskanie wektorów, które mogą przenosić długie obce sekwencje DNA ze względu na ich przydatność przy opracowywaniu leków, zwłaszcza szczepionek.
Koronawirusy są wirusami ssRNA(+) które reprezentują największy znany genom u wirusa RNA, o długości pomiędzy około 25 a 31 kilozasad (kb) (Siddell, 1995, Lai & Cavanagh, 1997, Enjuanes i wsp., 1998). Podczas zakażenia koronawirusem, genomowy RNA (gRNA) replikuje się i następuje synteza zestawu subgenomowych RNA (sgRNA) o dodatniej i ujemnej polarności (Sethna i wsp.; 1989; Sawicki i Sawicki, 1990; van der Most & Spaan, 1995). Synteza sgRNA jest procesem zależnym od RNA, który odbywa się w cytoplaźmie zakażonych komórek, chociaż jego dokładny mechanizm nie jest wciąż znany.
Opisano konstruowanie cDNA, które kodują defektywne interferujące (ang. defective interfering, DI) genomy (mutanty delecyjne wymagające obecności wirusów uzupełniających do ich replikacji i transkrypcji) pewnych koronawirusów, takich jak mysi wirus zapalenia wątroby (MHV), zakaźny wirus zapalenia oskrzeli (IBV), bydlęcy koronawirus (BCV) (Chang i wsp; 1994) oraz świński wirus zakaźnego zapalenia żołądka (TGEV) (hiszpańskie zgłoszenie patentowe P9600620, Mendez i wsp., 1996, Izeta i wsp., 1999, Shάanchez i wsp., 1999). Jednakże konstrukcja klonów cDNA, które kodują komPL 206 816 B1 pletny genom koronawirusa nie była możliwa z powodu zbyt dużych rozmiarów i toksyczności sekwencji w genomie koronawirusa.
Podsumowując, chociaż opracowano dużą liczbę wektorów do replikacji i ekspresji heterologicznych kwasów nukleinowych w komórkach gospodarza, większość znanych wektorów do ekspresji heterologicznych genów nie nadaje się do subklonowania wirusów RNA. Co więcej wektory tak uzyskane mają swoje wady z powodu braku specyficzności gatunkowej oraz ograniczenia odnośnie docelowego organu lub tkanki i ograniczonej pojemności przy klonowaniu, co ogranicza możliwości ich użycia zarówno w badaniach podstawowych jak i aplikacyjnych.
W zwią zku z tym istnieje zapotrzebowanie na sposoby opracowywania nowych wektorów do ekspresji heterologicznych genów, które mogą ominąć wyżej wspomniane problemy. W szczególności będzie pożądane posiadanie większych wektorów do ekspresji heterologicznych genów o wyższym stopniu bezpieczeństwa i pojemności przy klonowaniu, które mogą być zaprojektowane tak, aby ich specyficzność gatunkowa oraz tropizm mógł być kontrolowany.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania DNA zawierającego sekwencje pochodzące z genomowego RNA (gRNA) koronawirusa, polegający na tym, że stosuje się sekwencje posiadające co najmniej 60% homologii do naturalnej sekwencji koronawirusa i kodujące zależną od RNA polimerazę RNA oraz co najmniej jedno strukturalne lub niestrukturalne białko, przy czym fragment tego DNA jest zdolny do podlegania transkrypcji do RNA i składania do wirionu, przy czym sposób ten obejmuje etapy, w których defektywny genom interferujący z koronawirusem klonuje się pod kontrolą ekspresyjną promotora do sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) i wstawia się ponownie do tego genomu sekwencje usunięte z defektywnego genomu.
Korzystnie sekwencje w obrębie genomu wirusowego, które są toksyczne dla bakterii do których ma być wstawiony ten genom identyfikuje się przed ponownym wstawieniem do tego DNA.
Korzystnie przy kompletowaniu genomu sekwencje toksyczne w obrębie genomu wirusowego wstawia się ponownie jako ostatnie.
Korzystnie otrzymuje się klon zakaźny zawierający pełnej długości kopię DNA komplementarnego (cDNA) do genomowego RNA (gRNA) koronawirusa, sklonowaną pod sekwencją regulującą transkrypcję, przy czym sposób ten obejmuje konstruowanie pełnej długości cDNA z gRNA koronawirusa i łączenie elementów regulujących transkrypcję do tego pełnej długości cDNA.
Korzystniej konstruowanie pełnej długości cDNA z gRNA koronawirusa obejmuje etapy, w których (i) klonuje się interferujący defektywny genom pochodzący z tego koronawirusa pod promotorem ekspresyjnym w BAC; (ii) kompletuje się delecje w tym interferującym defektywnym genomie poprzez odtworzenie sekwencji poddanych delecji w odniesieniu do zakaźnego gRNA; (iii) identyfikuje się sekwencje w koronawirusie, które są toksyczne dla bakterii, w których ma on być sklonowany, usuwa się te sekwencje toksyczne i wstawia się te sekwencje toksyczne bezpośrednio przed przeprowadzeniem transfekcji w komórkach eukariotycznych z uzyskaniem klonu cDNA odpowiadającego gRNA koronawirusa.
Przedmiotem wynalazku jest również klon zakaźny, charakteryzujący się tym, że zawiera pełnej długości kopię DNA komplementarnego (cDNA) do genomowego RNA (gRNA) koronawirusa, sklonowaną pod sekwencją regulującą transkrypcję.
Korzystnie koronawirusa stanowi izolat świńskiego wirusa zakaźnego zapalenia żołądka (TGEV).
Korzystniej promotor stanowi najwcześniejszy promotor (lE) cytomegalowirusa (CMV).
Korzystnie pełnej długości cDNA jest flankowany na końcu 3' ogonem poli(A), rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) oraz sekwencjami terminacji i poliadenylacji wołowego hormonu wzrostu (BGH).
Korzystnie zakaźny cDNA sklonowany jest do sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC).
Korzystnie zakaźny klon cDNA otrzymany jest ze sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) E. coli zdeponowanej pod numerem dostępu CECT 5265 w Spanish Collection of Type Cultures.
Przedmiotem wynalazku jest również E. coli zdeponowana pod numerem dostępu CECT 5265 w Spanish Collection of Type Cultures.
Przedmiotem wynalazku jest także rekombinowany wektor wirusowy pochodzący z klonu zakaźnego, charakteryzujący się tym, że zawiera klon zakaźny cDNA koronawirusa zmodyfikowany tak, że zawiera heterologiczny kwas nukleinowy wstawiony do tego klonu zakaźnego w warunkach pozwalających na ekspresję tego heterologicznego kwasu nukleinowego.
PL 206 816 B1
Korzystnie DNA komplementarny (cDNA) do genomowego RNA (gRNA) koronawirusa jest sklonowany pod sekwencją regulującą transkrypcję.
Korzystnie koronawirusa stanowi izolat świńskiego wirusa zakaźnego zapalenia żołądka (TGEV).
Korzystnie promotor stanowi najwcześniejszy promotor (lE) cytomegalowirusa (CMV).
Korzystnie pełnej długości cDNA jest flankowany na końcu 3' ogonem poli(A), rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) oraz sekwencjami terminacji i poliadenylacji wołowego hormonu wzrostu (BGH).
Korzystnie zakaźny cDNA jest sklonowany w sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC).
Korzystnie heterologiczny kwas nukleinowy wybrany jest spośród genu albo fragmentu genu kodującego będący przedmiotem zainteresowania produkt genu.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka do ochrony zwierzęcia przed zakażeniem spowodowanym przez czynnik zakaźny, charakteryzująca się tym, że zawiera: (i) co najmniej jeden rekombinowany wektor wirusowy określony powyżej, który to wektor wirusowy eksprymuje albo co najmniej jeden antygen odpowiedni do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu czynnikowi zakaźnemu, albo przeciwciało nadające ochronę przeciwko temu czynnikowi zakaźnemu, ewentualnie, z (ii) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
Korzystnie wektor wirusowy eksprymuje co najmniej jeden antygen odpowiedni do indukcji układowej odpowiedzi immunologicznej i/lub odpowiedzi immunologicznej w błonach śluzowych przeciwko różnym czynnikom zakaźnym, które namnażają się w błonach śluzowych jelit.
Korzystnie stanowi szczepionkę multiwalentną do ochrony przeciwko zakażeniu spowodowanemu przez więcej niż jeden czynnik zapalny.
Korzystniej zawiera niezależne rekombinowane wektory wirusowe do zmieszania i jednoczesnej inokulacji, przy czym każdy z tych rekombinowanych wektorów wirusowych eksprymuje co najmniej jeden antygen albo jedno przeciwciało, które są od siebie różne.
Ku zaskoczeniu, twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że problemy napotykane we wcześniejszych metodach klonowania i ekspresji dużych sekwencji DNA pochodzących z wirusowych gRNA można przezwyciężyć poprzez zastosowanie BAC jako wektorów do klonowania. Użycie BAC ma tę szczególną zaletę, że wektory te są obecne w bakteriach w jednej lub dwóch kopiach na komórkę, co znacząco ogranicza toksyczność oraz zmniejsza możliwość międzyplazmidowej rekombinacji.
Krótki opis figur
Figura 1 pokazuje konstrukcję klonu cDNA, który koduje zakaźny RNA TGEV. Figura 1A pokazuje strukturę genetyczną TGEV, gdzie nazwy genów są przedstawione za pomocą liter i liczb (1a, 1b, S, 3a, 3b, E, M, N i 7). Figura 1B pokazuje strategię klonowania cDNA, która polega na kompletowaniu genomu DI-C. Pokazano delecje Δ1, Δ2 oraz Δ3 które uzupełniono aby odtworzyć cDNA pełnej długości. Liczby umieszczone poniżej struktury genomu DI-C wskazują na nukleotydy, które flankują każdą delecje we wspomnianym genomie DI-C. Figura IC pokazuje cztery fragmenty cDNA skonstruowane do uzupełnienia delecji Δ1 oraz pozycję zasadniczych miejsc restrykcyjnych podczas łączenia. Insercja fragmentu Δ1 powoduje wzrost toksyczności cDNA.
Figura 2 pokazuje strukturę plazmidu pBeloBAC (Wang i wsp., 1997) użytego do klonowania zakaźnego cDNA TGEV. Plazmid pBeloBAC był dostarczony przez H. Shizuya i M. Simon (California Institute of Technology) i zawiera 7507 par zasad (pz), które obejmują początek replikacji czynnika F E. coli (oriS), geny potrzebne do utrzymania jednej pojedynczej kopii plazmidu na komórkę (parA, parB, parC oraz rep E) oraz gen oporności na chloramfenikol (CMr). Przedstawiono pozycje promotorów T7 i SP6 oraz unikalne miejsca restrykcyjne. CosN: miejsce cosN faga lambda do ułatwienia konstrukcji plazmidu pBAC; lacZ: gen β-galaktozydazy. Pokazano również sekwencję loxP użytą podczas tworzenia plazmidu.
Figura 3 pokazuje strukturę podstawowych plazmidów zastosowanych przy konstruowaniu cDNA TGEV. Plazmid pBAC-TcDNAΔC1al zawiera wszystkie informacje z RNA z TGEV z wyjątkiem jednego fragmentu C1al-C1al o długości 5 198 bp. cDNA sklonowane przy pomocy najwcześniejszego (lE) (ang. immediately Elary) promotora do ekspresji cytomegalowirusa (CMV) i jest on oflankowany na końcu 3' przez ogon poli(A) składający się z 24 reszt A, rybozym wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) oraz sekwencji terminacji i poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH). Plazmid pBAC-B + C+D5' zawiera fragment C1al-C1aI wymagany do uzupełnienia pBAC-TcDNA ΔC1al tak aby cDNA był pełnej długości. Plazmid pBAC-TcDNA FL zawiera cDNA TGEV pełnej długości. SAP: fosfataza zasadowa krewetki.
PL 206 816 B1
Figura 4 pokazuje różnice pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi genu S z klonów TGEV PUR46-MAD (MAD) i C11. Liczby wskazują na pozycje podstawionych nukleotydów, gdzie pierwszy nukleotyd każdego genu stanowi A kodonu inicjującego. Litery w klamrach wskazują na odpowiedni nukleotyd we wskazanej pozycji. Litery pod klamrami pokazują podstawienia aminokwasowe (aa) kodowane przez nukleotydy, które są wokół zaznaczonej pozycji. Δ6 nt oznacza 6-nukleotydową delecje. Strzałki wskazują pozycję kodonu terminacyjnego genu S.
Figura 5 pokazuje strategię postępowania mającą na celu odzyskanie zakaźnego TGEV z cDNA TGEV pełnej długości. Plazmid pBAC-TcDNA FL transfekowano do komórek ST (komórki jąder świni) i po 48 godzinach od transfekcji nasącz użyto do zakażenia nowych komórek ST. Wirusy pasażowano we wskazanych czasach. W każdym pasażu, zbierano próbki nadsączu i warstwy komórek, odpowiednio, do miareczkowania wirusa i izolacji RNA, do analizy RT-PCR. vgRNA: wirusowy RNA pełnej długości.
Figura 6 pokazuje efekt cytopatyczny (CPE) spowodowany przez cDNA TGEV w transfekowanych komórkach ST. Na figurze pokazano brak CPE w nietransfekowanych komórkach ST (kontrola) (Figura 6A) i CPE obserwowany po 14 i 20 godzinach od transfekcji komórek pBAC-TcDNA w ST.
Figura 7 pokazuje zmianę miana wirusa w trakcie pasaży. Pokazano wykres miana wirusa w nadsą czu z dwóch serii monowarstw komórkowych (1 i 2) przy róż nych pasaż ach po transfekcji pBAC-TcDNA TL. Ślepa próbka 1 i 2 odnosi się do nietransfekowanych komórek ST. TcDNA 1 i 2 odnosi się do komórek ST transfekowanych pBAC-TcDNA FL.
Figura 8 pokazuje wyniki analizy sekwencji wirusa odzyskanego po transfekcji komórek ST pBAC-TcDNA FL. Struktura genomu TGEV jest przedstawiona na górze figury. Podobnie, pokazano różnice w sekwencji nukleotydów (markery genetyczne) pomiędzy wirusami uzyskanymi z plazmidu pBAC-TcDNAFL (TcDNA) oraz klonów TGEV C8 i C11. Pozycje różnic pomiędzy nukleotydami pokazano przez numery umieszczone nad kreską. Sekwencje cDNA wirusów TcDNA i klonu C11 określono poprzez sekwencjonowanie fragmentów uzyskanych przez RT-PCR (odwrotna transkrypcja i łańcuchowa reakcja polimerazy. Sekwencję klonu C8 wysłano do publikacji (Penzes i wsp., 1999) i załączono na końcu tego opisu. Wzory restrykcyjne pokazano dla fragmentów C1al i Dralll uzyskanych poprzez RT-PCR, które obejmują nukleotydy 18997 i 20990 wirusów TcDNA i C8. Wzory restrykcyjne pokazują obecność lub nieobecność miejsc C1aI i DraIII w cDNA tych wirusów. Wyniki tej analizy pokazują, że odzyskany wirus TcDNA ma sekwencję S-genu oczekiwaną dla izolatu C11. MWM: markery masy cząsteczkowej.
Figura 9 pokazuje wyniki analizy RT-PCR odzyskanych wirusów. Wirusowy RNA poddano ekspresji pod kontrolą promotora CMV rozpoznawanego przez komórkową polimerazę polII. W zasadzie ten RNA mógłby ulegać składaniu podczas jego transportu do cytoplazmy. Aby zbadać czy tak jest, określono miejsca w RNA o wysokim prawdopodobieństwie składania za pomocą programu do przewidywania miejsc składania w sekwencji ludzkiego DNA (wersja 2.1.5.94, Department of Cell Biology, Baylor College of Medicine) (Solovyev i wsp., 1994). Potencjalne miejsce składania o maksymalnym prawdopodobieństwie cięcia miało miejsce donorowe w pozycji 7243 i akceptorowe w pozycji 7570 (Figura 9A) . W celu zbadania czy ta domena podlega składaniu, wytworzono fragment RT-PCR flankowany przez nukleotydy 7078 i 7802 (Figura 9B) z pasaży RNA 0 i 2 z nietransfekowanych hodowli (kontrola) lub z komórek ST transfekowanych TcDNA, z fragmentem C1al w odwrotnej orientacji (TcDNAfl (-ACIal)RS), albo w prawidłowej orientacji (Tc DNAFL) i produkty RT-PCR badano na żelach agarozowych. Uzyskane wyniki pokazano na Figurach 9C (pasaż 0) i 9D (pasaż 2).
Figura 10 pokazuje wyniki analizy immunofluorescencyjnej wirusa wytworzonego w hodowli komórek ST transfekowanych TcDNA. Barwienie immunofluoroscencyjne przeprowadzono za pomocą przeciwciał swoistych dla izolatu PUR46-MAD TGEV i dla wirusa odzyskanego po transfekcji plazmidem pBAC-TcDNAFL. W tym celu użyto przeciwciała monoklonalne swoiste wobec TGEV, które wiążą się do obydwu izolatów lub tylko do PUR46-MAD (Sanchez i wsp., 1990). Wyniki potwierdziły, że wirus TcDNA wykazywał spodziewaną antygenowość. Swoista poliklonalna surowica odpornościowa wobec TGEV wiązała się do obydwu wirusów, ale nie do niezakażonych hodowli i jedynie oczekiwane przeciwciała monoklonalne swoiste wobec białek S (ID. B12 i 6A.C3), M.(3B,B3) i N(3B,D8) wiązały się z wirusem TcDNA (Sanchez i wsp., 1999).
Figura 11 pokazuje ekspresję GUS pod kontrolą różnych sekwencji regulujących transkrypcję (TRS), które różnią się regionem flankującym po stronie 5' sekwencji międzygenowej (IG). Minigenom M39 sklonowane pod kontrolą promotora CMV. Do minigenomu była wstawiona sekwencja z wieloma miejscami do klonowania (PL1, 5'-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3'; SEQ ID NO:2) i jednostka trans6
PL 206 816 B1 krypcyjna utworzona z wybranej sekwencji regulującej transkrypcję (TRS), następnej sekwencji z wieloma miejscami do klonowania (PL2, 5'-GCGGCCGCGCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3';SEQ ID NO:3 ; lub PL3, 5'-GTCGAC-3'; SEQ ID NO:4) sekwencji o strukturze domeny Kozak (Kz), genu B-glukuronidazy (GUS) i następnej sekwencji z wieloma miejscami do klonowania (PL4, 5'-GCTAGCCCAGGCGCGCGGTACC-3'; SEQ ID NO:5). Sekwencje te były flankowane na końcu 3' przez sekwencję 3' minigenomu M39, rybozym HDV i sekwencje terminacji i poliadenylacji BGH. TRS miały różną liczbę (0, 3, -8 i -88) nukleotydów na końcu 5' sekwencji IG (CUAAAC)1 i pochodzą z genów N, S lub M, jak to przedstawiono. Komórki ST transfekowano różnymi plazmidami, zakażono wirusami uzupełniającymi (PUR46-MAD) a nadsącza pasażowano 6 razy. Aktywność GUS w zakażonych komórkach określono za pomocą protokołu opisanego przez Izeta (Izeta i wsp., 1999). Wyniki uzyskane przez odniesienie aktywności GUS do numeru pasażu zebrano na Figurze 11B.
Figura 12 pokazuje ekspresję GUS pod różnymi TRS, które różnią się regionem flankującym sekwencję IG po stronie 3' (zobacz Figura 11A). Przy użyciu tej jednostki transkrypcyjnej z regionem flankującym po stronie 5' odpowiadającym 88 nt genu N TGEV plus sekwencja IG (CUAAAC), zmodyfikowano sekwencję flankującą po stronie 3'. Te sekwencje odpowiadały sekwencjom z różnych genów TGEV (S, 3a, 3b, E, M, N i 7) jak to pokazano na Figurze 12A. W dwóch przypadkach, sekwencje po stronie 3' zastąpiono innymi, które zawierały miejsce restrykcyjne (SalI) i zoptymalizowaną sekwencję Kozak (Kz) lub sekwencję identyczną z tą, która następuje po pierwszej sekwencji IG znajdującej się za liderem genomu wirusowego. Aktywność GUS w zakażonych komórkach określono za pomocą protokołu opisanego powyżej (Izeta i wsp., 1999). cL12 przedstawia sekwencję 12 nukleotydów identycznych do końca 3' sekwencji „liderowej genomu TGEV (zobacz sekwencję wirusa przedstawioną na końcu). Wyniki uzyskane poprzez odniesienie ekspresji GUS do numeru pasażu zebrano na Figurze 12B.
Figura 13 pokazuje wpływ miejsca wstawienia modułu ekspresyjnego do minigenomu na poziomy ekspresji GUS. Jednostka transkrypcyjna GUS zawierająca 88 nt genu N flankująca koniec 5' sekwencji IG (CUAAAC) oraz sekwencje Kz flankujące koniec 3' (zobacz Figura 12A) wstawiono do czterech pojedynczych miejsc restrykcyjnych w minigenomie M39 (Figura 13A) w celu określenia, czy wszystkie miejsca były jednakowo permisywne dla ekspresji heterologicznego genu. Komórki ST transfekowano plazmidami i zakażono wirusem uzupełniającym (PUR46-MAD). Aktywność GUS w zakaż onych komórkach okreś lono dla pasaż u 0 (P0) zgodnie z protokoł em opisanym powyż ej (Izeta i wsp., 1999). Uzyskane wyniki s ą przedstawione na Figurze 13B.
Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z prezentowanym zastosowaniem „sztuczny chromosom bakteryjny to sekwencja DNA zawierająca sekwencje czynnika F. Plazmidy zawierające tę sekwencję, tak zwane plazmidy F są zdolne do stabilnego utrzymywania heterologicznych sekwencji dłuższych niż 300 Kb w niskiej liczbie kopii (jedna lub dwie kopie na komórkę). Odpowiednie BAC są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (Shizuya i wsp., 1992).
Zgodnie z prezentowanym wynalazkiem DNA wklonowane do BAC wykazuje homologię co najmniej 60%, zwłaszcza 75% a w szczególności 85% lub 95% do naturalnej sekwencji wirusa RNA. Homologię sekwencji dogodnie określa się za pomocą programu komputerowego Clustal dostępnego z European Bioniformatics Institute (EBI).
Zgodnie z prezentowanym wynalazkiem termin „sekwencja pochodząca z koronawirusa odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego wykazującej co najmniej 60%, zwłaszcza 75%, a w szczególności od 85 do 95% homologii do naturalnej sekwencji koronawirusa. Homologię sekwencji można określić za pomocą programu komputerowego Clustal dostępnego z European Bioniformatics Institute (EBI).
Termin „koronawirus użyty zgodnie z prezentowanym wynalazkiem odnosi się do grupy wirusów mających pojedynczą cząsteczkę, liniowego, sensownego ssRNA o długości od 25 do 33 kb. Wirusy te zwykle zawierają od 7 do 10 genów struktury, tj. genów kodujących białka, które określają strukturę wirusa. Geny te przeważnie zorganizowane są w genomie wirusa w porządku 5'-replikaza-(hemaglutynina-esteraza)-kolec-otoczka-błona-nukleoproteina-3'. Dodatkowo genom wirusowy może zawierać kilka genów niestrukturalnych, które kodują zagnieżdżony zestaw mRNA o wspólnym końcu 3' i nie są przeważnie niezbędne.
Termin „zdolny do podlegania transkrypcji do RNA, który może być włączony do wirionu jest stosowany do charakteryzacji sekwencji DNA, która po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza będzie ulegała transkrypcji do RNA i utworzy wiriony. Wiriony są dogodnie zakaźnymi wirusami, ale mogą być także inaktywowanymi, atentowanymi lub replikacyjnie defektywnymi wirusami
PL 206 816 B1 zawierającymi wspomniany RNA. Dogodnie wszystkie informacje niezbędne do ekspresji wirionu są kodowane przez sekwencję DNA tu opisaną.
Kwasy nukleinowe tu opisane mogą zawierać ponadto sekwencję kodującą jeden lub kilka genów heterologicznych będących przedmiotem zainteresowania. Zgodnie z prezentowanym wynalazkiem gen jest scharakteryzowany jako „gen heterologiczny jeśli nie pochodzi z koronawirusa, który został użyty jako źródło genów kodujących polimerazę RNA zależną od RNA oraz strukturalne lub niestrukturalne białko. Zatem „gen heterologiczny odnosi się również do genu otrzymanego z jednego typu koronawirusa, a podlegającego ekspresji w wektorze zawierającym sekwencje pochodzące z innego typu koronawirusa. Dowolny gen heterologiczny będący przedmiotem zainteresowania może być wstawiony do kwasu nukleinowego tu opisanego. Szczególnie zalecane jest wstwienie genów kodujących peptydy lub białka, które są rozpoznawane jako antygen z czynnika zakaźnego przez system immunologiczny ssaka. Gen heterologiczny może zatem kodować co najmniej jeden antygen odpowiedni do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko czynnikowi zakaźnemu, co najmniej jedną cząsteczkę zakłócającą replikację czynnika zakaźnego lub przeciwciało nadające ochronę przed czynnikiem zakaźnym. Alternatywnie lub dodatkowo gen heterologiczny może kodować immunomodulator, cytokinę, wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej lub związek przeciwzapalny.
Fragment DNA tu opisanego, który ulega transkrypcji do RNA, ma dogodnie wielkość co najmniej 25 kb. Szczególnie zalecane są fragmenty o wielkości co najmniej 30 kb.
W zalecanym wykonaniu DNA zawiera ponadto sekwencje pochodzące z koronawirusa kodujące kilka lub wszystkie z wyjątkiem jednego strukturalnego lub niestrukturalnego białka koronawirusa. Alternatywnie DNA tu opisany zawiera ponadto sekwencje kodujące wszystkie strukturalne lub niestrukturalne białka koronawirusa.
W nastę pnym wykonaniu kwas nukleinowy tu opisany zawiera sekwencję kontrolują c ą transkrypcję sekwencji pochodzącej z gRNA koronawirusa. W tym celu może być użyta jakakolwiek sekwencja kontrolująca transkrypcję dobrze znana w tej dziedzinie, w tym sekwencje kierujące ekspresją genów pochodzących z genomów DNA lub RNA. Korzystne jest zastosowanie najwcześniejszego (lE) promotora cytomegalowirusa (CMV).
Kwas nukleinowy tu opisany może być także oflankowany na końcu 3' przez ogon poli(A). Kwas nukleinowy może zawierać sekwencje terminacji i/lub poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH). Dodatkowo lub alternatywnie, kwasy nukleinowe mogą zawierać sekwencje kodujące rybozym, na przykład rybozym wirusa zapalenia wątroby δ (HDV).
Kwasy nukleinowe tu opisane mogą zawierać sekwencje pochodzące z jakiegokolwiek koronawirusa, np. otrzymane z izolatu świńskiego wirusa zakaźnego zapalenia żołądka i jelit (TGEV), mysiego wirusa zapalenia wątroby (MHV), wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV), bydlęcego koronawirusa (BoCV), psiego koronawirusa (CCoV), kociego koronawirusa (FcoV) lub ludzkiego koronawirusa. Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku kwas nukleinowy pochodzi z wirusa zakaźnego zapalenia żołądka i jelit.
Prezentowany wynalazek dostarcza ponadto sposobów otrzymywania DNA tu opisanego obejmujących etapy, gdzie interferujący defektywny genom otrzymany z koronawirusa jest klonowany pod kontrolą ekspresyjną promotora w wektorze BAC i delecje w defektywnym genomie są ponownie wstawiane. Sposób może dodatkowo obejmować etapy, gdzie toksyczne sekwencje w obrębie wirusowego genomu są identyfikowane przed ponownym wstawieniem do pozostałego genomowego DNA. Korzystnie, jeżeli toksyczne sekwencje w obrębie wirusowego genomu są ostatnimi sekwencjami mającymi być ponownie wstawionymi przed skompletowaniem genomu. Zgodnie z prezentowanym wynalazkiem sposób ten jest odpowiedni do uzyskania zakaźnych klonów koronawirusów, które są stabilne w bakteriach przez co najmniej 80 generacji a zatem dostarczają wysoce wydajnego wektora do klonowania.
Zgodnie z wynalazkiem opracowano sposoby uzyskiwania zakaźnych klonów cDNA pochodzących z koronawirusa (Almazan i wsp., 2000), jak również wektorów skonstruowanych ze wspomnianych zakaźnych klonów, które zawierają także heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego wstawione do tych klonów. Zakaźne klony oraz wektory dostarczone przez ten wynalazek mają wiele zastosowań zarówno w badaniach podstawowych, jak i aplikacyjnych, a także wysoką pojemność przy klonowaniu i mogą być tak zaprojektowane, że ich swoistość gatunkowa i tropizm może być z łatwością kontrolowany.
PL 206 816 B1
Zgodnie z wynalazkiem opisano opracowanie sposobu, który umożliwia uzyskanie po raz pierwszy w historii koronawirusa, pełnej długości zakaźnego klonu cDNA, który koduje genom koronawirusa (Almazan i wsp., 2000).
Opracowano nowy wektor lub system do ekspresji heterologicznych kwasów nukleinowych oparty na koronawirusie, wytworzonym z zakaźnego klonu cDNA, który koduje genomowy RNA (gRNA) koronawirusa. W konkretnym wykonaniu tego wynalazku koronawirusem jest świński wirus zakaźnego zapalenia żołądka i jelit (TGEV).
Nowy układ ekspresyjny może być użyty w badaniach podstawowych lub aplikacyjnych, np. do uzyskania produktów będących przedmiotem zainteresowania (białek, enzymów, przeciwciał, itp.), jako wektor wirusowy lub w terapii genowej, zarówno u zwierząt, jak i ludzi. Zakaźny koronawirus uzyskany z zakaźnego klonu cDNA może być poddany manipulacjom za pomocą konwencjonalnych technik inżynierii genetycznej, w taki sposób, że do genomu koronawirusa mogą być wprowadzone nowe geny i tak, że te geny mogą ulegać ekspresji specyficznie tkankowo i gatunkowo w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej lub do terapii genowej. Dodatkowo zoptymalizowano ekspresję poprzez wybór nowych sekwencji regulujących transkrypcję (TRS) co umożliwia zwiększenie poziomu ekspresji więcej niż stukrotnie.
Wektory uzyskane z koronawirusa, szczególnie TGEV, wykazują kilka zalet jeśli chodzi o indukcję immunogenności w błonach śluzowych w porównaniu do innych układów ekspresyjnych, w których nie replikują się: (i) TGEV zakaża błony śluzowe jelit i dróg oddechowych (Enjuanes i Van der Zeijst, 1995), to jest, najlepsze miejsca do indukcji odporności wydzielniczej; (ii) jego tropizm może być kontrolowany przez modyfikację genu S (kolec) (Ballesteros i wsp., 1997), (iii) istnieją niepatogenne szczepy do opracowania systemów ekspresyjnych, które zależą od wirusów uzupełniających (Sanchez i wsp., 1992); i (iv) koronawirusy to cytoplazmatyczne wirusy RNA, które replikują się bez przechodzenia przez pośredni stan DNA (Lai i Cavanagh, 1997), co czyni ich włączenie do chromosomu komórkowego praktycznie niemożliwym.
Procedura, która umożliwia uzyskanie zakaźnych koronawirusów z cDNA, który koduje gRNA koronawirusa obejmuje następujące strategie:
(i) ekspresję RNA koronawirusa pod kontrolą odpowiedniego promotora;
(ii) klonowanie genomu koronawirusa w sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC);
(iii) identyfikację sekwencji cDNA koronawirusa, które są bezpośrednio lub pośrednio toksyczne dla bakterii;
(iv) identyfikację dokładnego porządku łączenia składników cDNA, które kodują zakaźny RNA koronawirusa (promotorów, sekwencji terminacji transkrypcji, sekwencji poliadenylacji, rybozymów, itp.); oraz (v) identyfikację grup technologii i procesów (warunków wzrostu dla BAC, modyfikacji procesu oczyszczania DNA BAC, technik transformacji, itp.), które łącznie umożliwiają wydajne odzyskanie zakaźnego koronawirusa z cDNA.
Promotory odgrywają istotną rolę w zwiększaniu ekspresji wirusowego RNA w jądrze, gdzie jest on syntetyzowany aby być później przetransportowany do cytoplazmy.
Użycie BAC stanowi kluczowy punkt procedury według wynalazku. Jak wiadomo, klonowanie sekwencji eukariotycznych w plazmidach bakteryjnych jest często niemożliwe z powodu toksyczności egzogennych sekwencji dla bakterii. W tych przypadkach, bakterie zwykle eliminują toksyczność przez modyfikowanie wprowadzonych sekwencji. Pomimo tego w strategii stosowanej w tym przypadku, aby ominąć możliwą toksyczność tych wirusowych sekwencji przeprowadzono pożądane etapy klonowania aby uzyskać całkowity cDNA koronawirusa w BAC. Te plazmidy występują tylko w jednej kopii lub maksymalnie dwóch na komórkę, co znacząco ogranicza ich toksyczność i zmniejsza możliwości rekombinacji międzyplazmidowej.
Dzięki identyfikacji bakteriotoksycznych sekwencji cDNA koronowirusa, można skompletować cDNA, który koduje całkowity genom koronowirusa z wyjątkiem sekwencji toksycznych, które są dodawane w ostatnim etapie konstrukcji całkowitego genomu, to jest tuż przed transfekcją do komórek eukariotycznych, unikając ich modyfikacji przez bakterie.
Celem prezentowanego wynalazku jest zatem zakaźny dwuniciowy klon cDNA, który koduje gRNA koronowirusa, jak również sposób jego otrzymywania.
Dodatkowym celem prezentowanego wynalazku jest zestaw rekombinowanych wektorów wirusowych, które zawierają taki zakaźny klon oraz sekwencje heterologicznych kwasów nukleinowych wstawione do tego zakaźnego klonu.
PL 206 816 B1
Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób wytwarzania rekombinowanego koronawirusa, który obejmuje wprowadzenie takiego zakaźnego klonu do komórki gospodarza, hodowlę transformowanej komórki w warunkach, które pozwalają na replikację zakaźnego klonu i wytwarzanie rekombinowanego koronawirusa, oraz odzyskiwanie rekombinowanego koronawirusa z hodowli.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też sposób wytwarzania zmodyfikowanego rekombinowanego koronawirusa, który obejmuje wprowadzenie rekombinowanego wektora wirusowego do komórki gospodarza, jej hodowlę w warunkach zezwalających wektorowi wirusowemu na replikację i wytwarzanie zmodyfikowanego rekombinowanego koronawirusa, oraz odzyskiwanie zmodyfikowanego rekombinowanego koronawirusa z hodowli.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też sposób wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania, który obejmuje hodowlę komórki gospodarza, która zawiera ten rekombinowany wektor wirusowy w warunkach, które umożliwiają ekspresję sekwencji heterologicznego DNA.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też komórki zawierające wyżej wspomniane zakaźne klony lub rekombinowany wektor wirusowy według wynalazku.
Inny przedmiot tego wynalazku stanowi zestaw szczepionek do ochrony zwierząt przed zakażeniami zawierającymi zakaźne wektory, które dają ekspresję co najmniej jednego odpowiedniego antygenu odpowiedniego do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko każdemu zakaźnemu czynnikowi lub co najmniej jednego przeciwciała, które nadaje ochronę przed wspomnianym czynnikiem zakaźnym, wraz z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką. Szczepionki mogą być mono lub multiwalentne, w zależności od tego czy wektory dają ekspresję jednego lub większej liczby antygenów zdolnych do indukowania odpowiedzi immunologicznej wobec jednego lub większej liczby czynników zakaźnych, lub, ewentualnie, jednego lub większej liczby przeciwciał, które nadają ochronę przed jednym lub większą liczbą czynników zakaźnych.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też sposób immunizacji zwierzęcia, który obejmuje podawanie wspomnianej szczepionki.
Wynalazek dostarcza klonu cDNA, który koduje zakaźny RNA koronawirusa, odtąd zakaźny klon według wynalazku, który zawiera (1) kopię komplementarego DNA (cDNA) wobec zakaźnego genomowego RNA (gRNA) koronawirusa lub samego wirusowego RNA, oraz (2) moduł ekspresyjny dla dodatkowego genu, który zawiera zoptymalizowane sekwencje promujące transkrypcję.
W jednym konkretnym wykonaniu wynalazku, koronawirus jest izolatem TGEV, konkretnie, izolatem PUR46-MAD (Sanchez i wsp., 1990), zmodyfikowanym przez zamianę genu S tego wirusa przez gen S z klonu C11 izolatu TGEV lub gen S koronawirusa psiego lub ludzkiego.
Sekwencja promująca transkrypcję, lub promotor, jest sekwencją RNA zlokalizowaną na końcu 5' każdego informacyjnego RNA (mRNA) koronawirusa, do której wiąże się wirusowa polimeraza RNA aby rozpocząć transkrypcję informacyjnego RNA (mRNA). W konkretnym i korzystnym wykonaniu ekspresja genomu wirusowego cDNA następuje przy użyciu promotora lE CMV, z powodu wysokiego poziomu ekspresji uzyskiwanej przy użyciu tego promotora (Dubensky i wsp., 1996) i wcześniejszych wyników uzyskanych w laboratorium twórców niniejszego wynalazku, które wskazują, że duże defektywne genomy (9,7 kb i 15kb) uzyskane z koronawirusa TGEV dają ekspresję RNA, które nie podlegają składaniu podczas transportu z jądra, gdzie są syntetyzowane, do cytoplazmy.
Klon zakaźny według wynalazku zawiera także sekwencje terminacji transkrypcji oraz sygnał poliadenylacji takie jak te pochodzące z genu BGH. Te sekwencje terminacyjne muszą być umieszczone na końcu 3' ogona poli(A). W konkretnym wykonaniu zakaźny klon według wynalazku zawiera ogon poli(A) złożony z 24 reszt A oraz sekwencje terminacji i poliadenylacji z BGH oddzielone od ogona poli(A) przez sekwencję rybozymu z HDV.
Plazmid, do którego wstawiono zakaźny cDNA wirusa jest cząsteczką DNA, która posiada początek replikacji i jest zatem potencjalnie zdolna do replikacji w odpowiedniej komórce. Użyty plazmid to replikon odpowiedni do utrzymywania i powielania zakaźnego klonu według wynalazku w odpowiedniej komórce gospodarza, takiej jak bakteria, np. Escherichia coli. Replikon generalnie niesie gen oporności na antybiotyki, który pozwala na selekcję komórek, które go niosą (np. cat).
W przykładzie 1 opisano konstrukcję zakaź nego klonu TGEV pod kontrolą promotora lE CMV. Koniec 3' cDNA jest oflankowany przez 24 nt sekwencję poli (A), rybozym HDV, oraz sekwencję terminacji transkrypcji z BGH.
Sposób otrzymywania zakaźnego klonu według wynalazku obejmuje konstruowanie cDNA pełnej długości z gRNA koronawirusa i łączenie elementów regulujących transkrypcję.
PL 206 816 B1 cDNA, który koduje zakaźny gRNA koronawirusa uzyskano z genomu DI pochodzącego z koronawirusa, sklonowanego jako cDNA pod kontrolą odpowiedniego promotora w BAC, w celu zwiększenia stabilności cDNA. Następnie zidentyfikowano sekwencje bakteriotoksyczne i w celu zmniejszenia toksyczności, te toksyczne sekwencje usunięto i wstawiono na zakończenie konstruowania kompletnego genomu, tuż przed transfekcją do komórek eukariotycznych. Potomstwo wirusa można odzyskać poprzez transfekcję plazmidu BAC, który zawiera genom koronawirusa do komórek eukariotycznych, które podtrzymują replikację wirusa.
Elementy regulujące transkrypcję są łączone za pomocą technik konwencjonalnych (Maniatis i wsp., 1989).
Zakaźny klon według wynalazku można poddać manipulacjom za pomocą konwencjonalnych technik inżynierii genetycznej w celu wstawienia co najmniej jednej sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego, która koduje określoną aktywność, pod kontrolą promotora, który jest obecny w zakaźnym klonie i sekwencjach regulacyjnych zawartych w uzyskanym wektorze ekspresyjnym.
Zakaźny klon według wynalazku ma wiele zastosowań, np. może być użyty zarówno w badaniach podstawowych, np. do badania mechanizmu replikacji i transkrypcji koronawirusa, jak i badaniach aplikacyjnych, np. do opracowywania wydajnych systemów do ekspresji produktów będących przedmiotem zainteresowania (białek, enzymów, przeciwciał).
Odpowiednie komórki mogą być transformowane zakaźnym klonem cDNA według wynalazku i można odzyskać otrzymane wiriony zawierające cały genom koronawirusa. Tak więc zgodnie z wynalazkiem opisano sposób wytwarzania rekombinowanego koronawirusa, który obejmuje wprowadzenie zakaźnego cDNA według wynalazku do komórki gospodarza, hodowlę takiej komórki w warunkach, które zezwalają na ekspresję i replikację zakaźnego klonu i odzyskanie wirionów otrzymanych z rekombinowanego koronawirusa, które zawierają zakaźny genom koronawirusa. Zakaźny klon według wynalazku może być wprowadzony do komórki gospodarza na różne sposoby, np. przez transfekcję komórki gospodarza RNA transkrybowanym in vitro z zakaźnego klonu według wynalazku lub poprzez zakażenie komórki gospodarza zakaźnym klonem cDNA według wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem opisano więc również komórki gospodarza, które zawierają zakaźny klon według wynalazku.
Wynalazek dostarcza także zestawu rekombinowanych wektorów wirusowych pochodzących z zakaźnego klonu według wynalazku, odtąd wektorów wirusowych według wynalazku. Wektory wirusowe według wynalazku zawierają zakaźny klon cDNA według wynalazku zmodyfikowany tak, aby zawierał hetrologiczny kwas nukleinowy wstawiony do tego zakaźnego klonu w warunkach, które zezwalają na ekspresję heterologicznego kwasu nukleinowego.
Termin „kwas nukleinowy stosowany w tym opisie obejmuje geny lub fragmenty genów jak również, ogólnie, jakąkolwiek cząsteczkę DNA lub RNA.
W znaczeniu stosowanym w tym opisie, termin „heterologiczny stosowany wobec kwasu nukleinowego odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego, która nie jest normalnie obecna w wektorze użytym do wprowadzania heterologicznego kwasu nukleinowego do komórki gospodarza.
Heterologiczny kwas nukleinowy, który może zawierać wektor wirusowy według wynalazku może być genem lub fragmentem, który koduje białko, peptyd, epitop lub jakikolwiek produkt genowy będący przedmiotem zainteresowania (taki jak przeciwciała, enzymy, itp.). Heterologiczny kwas nukleinowy może być wstawiony do klonu zakaźnego według wynalazku za pomocą konwencjonalnych technik inżynierii genetycznej w dowolnym odpowiednim regionie cDNA, np. po ORF 1b lub pomiędzy genami N i 7, po kodonie inicjacyjnym (AUG) i w ramce odczytu z genem, lub alternatywnie, w obszarach odpowiadających innym ORF. W konstrukcji wektora wirusowego według wynalazku, istotne jest aby wstawienie heterologicznego kwasu nukleinowego nie kolidowało z żadną z podstawowych funkcji wirusa.
Wektor wirusowy według wynalazku może wykazywać jedną lub większą liczbę aktywności. W tym drugim przypadku, wektor wirusowy będzie zawierać tak wiele sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego jak wykazywanych aktywności, poprzedzonych przez jeden lub kilka promotorów lub przez promotor i różne miejsca rozpoznawane przez rybosomy (IRES, wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu) albo poprzez różne promotory i jedno miejsce rozpoznawane przez rybosom.
Tak więc zgodnie z wynalazkiem opisano sposób wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania, który obejmuje hodowanie komórki gospodarza, która zawiera wektor wirusowy według wynalazku w warunkach, które zezwalają na ekspresję heterologicznego kwasu nukleinowego i odzyskanie produktu. Zgodnie z wynalazkiem opisano więc również komórkę gospodarza, która zawiera wektor wirusowy według wynalazku.
PL 206 816 B1
Wektor wirusowy według wynalazku może być zaprojektowany tak, aby jego specyficzność gatunkową oraz tropizm można było łatwo kontrolować. Z powodu tych właściwości, bardzo ciekawym zastosowaniem wektorów wirusowych według wynalazku jest ich użycie w terapii genowej jako wektora dla genu będącego przedmiotem zainteresowania albo jako wektora szczepionkowego do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko różnym patogenom.
Wynalazek dostarcza ponadto szczepionek, zdolnych do ochrony zwierzęcia przed zakażeniem powodowanym przez czynnik zakaźny, które zawierają (i) co najmniej jeden wektor wirusowy według wynalazku, który daje ekspresję co najmniej jednego antygenu odpowiedniego do indukcji odpowiedzi immunologicznej wobec tego czynnika zakaźnego, lub przeciwciała, które nadaje ochronę przed tym czynnikiem zakaźnym, ewentualnie wraz z (ii) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
Stosowany w opisie zwrot „nadający ochronę powinien być rozumiany jako odpowiedź immunologiczna otrzymującego organizmu (zwierzęcia które ma być poddane immunizacji) indukowaną przez wektor wirusowy według wynalazku, poprzez odpowiednie mechanizmy, takie jak te indukowane przez substancje, które wzmacniają odpowiedź komórkową (interleukiny, interferony, itp.), komórkowe czynniki martwicy oraz podobne substancje, które chronią zwierzę przed zakażeniami powodowanymi przez czynniki zakaźne.
Termin „zwierzę obejmuje wszystkie zwierzęta dowolnego gatunku, zwłaszcza ssaki, w tym człowieka.
Termin „czynnik zakaźny w sensie użytym w opisie obejmuje wirusowy, bakteryjny, grzybowy, pasożytniczy lub inny czynnik zakaźny, który może zakażać zwierzę i wywoływać u niego stan patologiczny.
W konkretnym wykonaniu, szczepionka dostarczona przez ten wynalazek zawiera co najmniej wektor wirusowy według wynalazku, który daje ekspresję co najmniej jednego antygenu zdolnego do indukowania układowej odpowiedzi immunologicznej i/lub odpowiedzi immunologicznej w błonach śluzowych wobec różnych czynników zakaźnych, które namnażają się w błonach śluzowych układu oddechowego lub jelit. Wektory według wynalazku są całkiem odpowiednie do indukowania odporności w błonach śluzowych, jak również odporności laktogennej, co jest szczególnie interesujące z punktu widzenia ochrony noworodków przeciwko zakażeniom przewodu pokarmowego.
W innym konkretnym wykonaniu, szczepionka dostarczona przez ten wynalazek zawiera co najmniej jeden wektor wirusowy według wynalazku, który daje ekspresję co najmniej jednego genu, który koduje lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała dowolnego izotypu (np. IgG1, IgA, itp.), które nadaje ochronę przed czynnikiem zakaźnym.
Specyficzność gatunkowa może być kontrolowana, tak aby wektor wirusowy mógł dawać ekspresję białka S otoczki koronawirusa, który zakaża pożądane gatunki (człowiek, pies, kot, świnia, itp.), odpowiedniego do rozpoznania przez receptory komórkowe odpowiedniego gatunku.
Szczepionki dostarczone przez ten wynalazek mogą być monowalentne lub multiwalentne, w zależności od tego czy wektory wirusowe według wynalazku dają ekspresję jednego lub większej liczby antygenów zdolnych do indukowania odpowiedzi immunologicznej wobec jednego lub większej liczby czynników zakaźnych, lub jednego lub większej liczby przeciwciał, które nadają ochronę przed jednym lub większą liczbą czynników zakaźnych.
W konkretnym wykonaniu tego wynalazku, dostarczono monowalentną szczepionkę zdolną do ochrony człowieka, świń, psów i kotów przed różnymi czynnikami zakaźnymi ludzkimi, świńskimi, psimi oraz kocimi, a tropizm jest kontrolowany przez ekspresję glikoproteiny S koronawirusa o pożądanej swoistości gatunkowej.
Szczepionki monowalentne przeciwko świńskim czynnikom zakaźnym mogą zawierać wektor, który daje ekspresję antygenu wybranego z grupy składającej się zasadniczo z antygenów następujących patogenów świń: Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, świński parwowirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelotrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida,
Bordetella hronchiseptica, Clostridium sp., Serpulina hydiosenteriae, Mycoplasma hyopneumoniae, świński wirus epidemi biegunki (PEDV), świński wirus układu oddechowego, rotawirus, lub przeciwko patogenom, które powodują świński zespół oddechowy i reprodukcyjny, chorobę Aujeszkyego (psudowściekliznę), świńską grypę lub zakaźne zapalenie żołądka i jelit oraz czynnik etiologiczny zanikowego nieżytu żołądka i zapalenia jelita krętego. Monowalentne szczepionki przeciwko psim czynnikom zakaźnym mogą zawierać wektor ekspresyjny, który daje ekspresję antygenu wybranego z grupy składającej się zasadniczo z antygenów następujących psich patogenów: psi wirus opryszczki, ade12
PL 206 816 B1 nowirusy typu 1 i 2, psi parwowirus typu 1 i 2, psi reowirus, psi rotawirus, psi koronawirus, psi wirus grypy rzekomej, psi wirus grypy, wirus nosówki, wirus wścieklizny, retrowirus oraz psi kalicywirus.
Monowalentne szczepionki przeciwko kocim czynnikom zakaźnym mogą zawierać wektor ekspresyjny, który daje ekspresję antygenu wybranego z grupy zasadniczo złożonej z antygenów następujących patogenów kocich: kociego kalicywirusa, kociego wirusa niedoboru odporności, kociego wirusa opryszczki, kociego wirusa panleukopenii, kociego reowirusa, kociego rotawirusa, kociego koronawirusa, kociego zakaźnego wirusa zapalenia otrzewnej, wirusa opryszczki, kociej Chlamydia psittaci oraz kociego wirusa białaczki.
Wektory mogą dawać ekspresję przeciwciała, które nadaje ochronę przed czynnikiem zakaźnym, np., świńskim, psim lub kocim czynnikiem zakaźnym takim jak cytowane powyżej. W jednym konkretnym wykonaniu wektor daje ekspresję rekombinowanego przeciwciała monoklonalnego identyfikowanego jako 6AC3, które neutralizuje TGEV, wyrażanego z izotypami IgG1 lub IgA, w których stała część immunoglobuliny jest pochodzenia psiego, lub neutralizujących przeciwciał dla ludzkich lub świńskich rotawirusów.
Jako zaróbki można użyć rozcieńczalnik, taki jak sól fizjologiczna lub inne podobne roztwory soli. Podobnie szczepionki te mogą zawierać adiuwant spośród powszechnie używanych przy wytwarzaniu zarówno szczepionek wodnych, taki jak wodorotlenek glinu, QuilA, zawiesiny żeli tlenku glinu i tym podobne, jak i szczepionek olejowych bazujących na olejach mineralnych, glicerydach, pochodnych kwasów tłuszczowych oraz ich mieszanek.
Szczepionki według prezentowanego wynalazku mogą także zawierać substancje wzmacniające odpowiedź komórkową (CRP), to jest substancje, które wzmacniają subpopulacje pomocniczych komórek T (Th1 i Th2) takie jak interleukina 1 (IL-2), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, gamma-IFN (interferon gamma), komórkowy czynnik martwicy oraz podobne substancje, które teoretycznie mogłyby prowokować odporność komórkową u zaszczepionych zwierząt. Te substancje CRP mogą być zastosowane w kompozycjach szczepionek wraz z adiuwantami wodnymi lub olejowymi. Możliwe jest również zastosowanie adiuwantów innego typu, które modulują i immunostymulują odpowiedź komórkową, takich jak MDP (dipeptyd muramylowy), ISCOM (ang. Immunostimulant Complex, kompleks immunostymulujący) lub liposomy.
Wynalazek dostarcza też szczepionek multiwalentnych, zdolnych do zapobiegania i ochrony zwierząt przed zakażeniami wywołanymi przez różnego typu czynniki zakaźne. Takie szczepionki multiwalentne można wytworzyć z wektorów wirusowych według wynalazku, do których wstawiono różne sekwencje kodujące odpowiednie antygeny w tym samym rekombinowanym wektorze, lub poprzez skonstruowanie niezależnych rekombinowanych wektorów, które mogą być następnie mieszane do łącznej inokulacji. Zatem, tego typu szczepionki multiwalentne zawierają wektor wirusowy, który zawiera więcej niż jedną sekwencję heterologicznych kwasów nukleinowych, kodujących więcej niż jeden antygen lub, alternatywnie, różne wektory wirusowe, z których każdy daje ekspresję przynajmniej jednego, odmiennego antygenu.
Analogicznie, szczepionki multiwalentne, zawierające wektory mogą być otrzymane przy użyciu sekwencji, które kodują przeciwciała nadają ochronę przed czynnikami zakaźnymi, zamiast sekwencji kodujących antygeny.
W jednym z konkretnych wykonań opisano szczepionki zdolne do immunizacji ludzi, świń, psów i kotów przeciw różnym, odpowiednio, świńskim, psim i kocim czynnikom zakaźnym. W tym celu, wektory wirusowe zawarte w szczepionce muszą dawać ekspresję różnych antygenów ludzkich, świńskich, psich czy kocich, wspomnianych wyżej lub innych patogenów.
Szczepionki według tego wynalazku mogą występować w postaci ciekłej lub liofilizowanej i mogą być otrzymane w wyniku zawieszenia rekombinowanych systemów w zaróbce. Jeżeli systemy te były w postaci liofilizowanej, sama zaróbka może stanowić substancję odtwarzającą.
Alternatywnie, szczepionki dostarczone przez ten wynalazek mogą być stosowane łącznie z innymi konwencjonalnymi szczepionkami, albo stanowiąc ich część albo frakcję rozcieńczającą czy liofilizowaną do rozcieńczania z innymi konwencjonalnymi lub rekombinowanymi szczepionkami.
Szczepionki według wynalazku mogą być podawane zwierzęciu doustnie, donosowo, podskórnie, przezskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo lub w formie aerozolu.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób jednoczesnej immunizacji zwierząt, szczególnie świń, psów i kotów, przeciwko jednemu lub różnym czynnikom zakaźnym jednocześnie, obejmujący podawanie doustne, donosowe, podskórne, przezskórne, dootrzewnowe, domięśniowe lub w formie aerozolu (lub ich kombinacji) szczepionki zawierającej immunologicznie skuteczną ilość rekombinowanego systemu tu opisanego.
PL 206 816 B1
Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano również sposób ochrony nowonarodzonych zwierząt przed czynnikami zakaźnymi, które zakażają te zwierzęta, obejmujący podawanie doustne, donosowe, podskórne, przezskórne, dootrzewnowe, domięśniowe lub w formie aerozolu (lub ich kombinacji) szczepionki według wynalazku matkom przed lub podczas okresu ciąży, albo ich potomstwu.
Wynalazek zilustrowano za pomocą następujących przykładów, które szczegółowo przedstawiają otrzymywanie klonów zakaźnych i konstrukcję wektorów wirusowych według wynalazku. Przykłady te powinny być traktowane jedynie jako ilustrujące, a nie ograniczające zakres wynalazku. We wspomnianym przykładzie, transformację i hodowlę bakterii, oczyszczanie DNA, analizę sekwencji i test do oceny stabilnoś ci plazmidów przeprowadzono zgodnie z metodami opisanymi poniżej.
Transformacja bakterii
Wszystkie plazmidy poddano elektroporacji do szczepu E. coli DH10B (Gibco BRL), wprowadzając nieznaczne modyfikacje opisanych wcześniej protokołów (Shizuya i wsp., 1992). W celu każdej z transformacji, na 0,2 cm płytkach (BioRad) mieszano 2 μΐ mieszaniny ligacyjnej i 50 μΐ kompetentnych bakterii, po czym prowadzono elektroporację przy 200 Ω, 2,5 kV i 25 pF. Następnie, do każdej transformacji dodawano 1 ml podłoża SOC (Maniatis i wsp., 1989), komórki inkubowano w 37°C przez 45 min i, ostatecznie, rekombinowane kolonie wykrywano na płytkach podłoża LB SOC, (Maniatis i wsp., 1989) z 12,5 pg/ml chloramfenikolu.
Warunki hodowli bakterii
Bakterie zawierające wyjściowe plazmidy, do których wklonowano niepełny genom TGEV (Figura 3) hodowano w 37°C obserwując prawidłową kinetykę wzrostu. Z drugiej strony, BAC zawierający pełny cDNA hodowano w 30°C w celu jak największego zminimalizowania jego niestabilności. Pomimo tego, wielkość kolonii była zmniejszona i konieczne było wydłużenie czasu inkubacji do 24 godzin, w celu osiągnięcia normalnej wielkości kolonii.
Oczyszczanie DNA
Zastosowano, z małymi modyfikacjami, protokół opisany przez Woo (Woo i wsp., 1994). Z pojedynczej kolonii zaszczepiano 4 l LB z dodatkiem chloramfenikolu (12,5 pg/ml). Po 18 godz. okresie inkubacji w 30°C, bakterie zbierano poprzez wirowanie przy 6000 g, a plazmidy oczyszczano stosując zestaw Qiagen Plazmid Maxipreparations według zaleceń producenta. Przy użyciu tej procedury, zaobserwowano, że uzyskany plazmidowy DNA był zanieczyszczony bakteryjnym DNA. W celu wyeliminowania zanieczyszczającego bakteryjnego DNA, DNA plazmidowy oczyszczano poprzez wirowanie przy 55000 rpm przez 16 godz. w gradiencie CsCl. Uzyskana wydajność mieściła się między 15 a 30 pg/l, zależnie od wielkości plazmidu.
Analiza sekwencji
DNA analizowano stosując automatyczny sekwenator (373 DNA Sequencer, Applied Biosystems), z użyciem dideoksynukleotydów ze znacznikiem - fluorochromem oraz termostabilną polimerazę (Perkin Elmer). Odczynniki pochodziły z zestawu (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) z Applied Biosystems. Do reakcji sekwencjonowania zastosowano termocykliczny aparat „GeneAmpPCR System 9600 (Perkin Elmer).
Połączenia sekwencji i ich porównania z sekwencją konsensusową TGEV dokonano stosując, odpowiednio programy SeqMan II i Align (DNASTAR). Nie wykryto żadnych różnic względem sekwencji konsensusowej.
Stabilność plazmidów
Otrzymane z początkowych zapasów glicerolowych bakterie zawierające rekombinowane plazmidy pBeloBAC11 hodowano w 20 ml LB z dodatkiem chloramfenikolu (12,5 pg/ml) przez 16 godzin w 30°C i w 37°C. Materiał ten uznano za pasaż 0. Bakterie rozcieńczano 106 razy i hodowano w 30°C i w 37°C przez 16 godzin. W ciągu ośmiu kolejnych dni wykonano seryjne pasaże (każdy pasaż reprezentuje w przybliżeniu 20 pokoleń). Plazmidowy DNA oczyszczano stosując Miniprep na poziomie pasażu 0 18 (160 pokoleń) i analizowano przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych. Dwa plazmidy, zawierające część genomu TGEV były bardzo stabilne, natomiast plazmid posiadający pełen genom TGEV wykazywał pewną niestabilność po 40 pokoleniach (w tym momencie, w przybliżeniu 80% DNA wykazywało prawidłowy wzór restrykcyjny).
P r z y k ł a d 1
Konstrukcja rekombinowanego wektora, opartego na klonie zakaźnego cDNA pochodzącego z TGEV
1.1 Otrzymanie zakaźnego cDNA z TGEV
PL 206 816 B1
W celu otrzymania cDNA kodującego całkowity genom TGEV, eksperyment rozpoczęto od cDNA, który kodował defektywny genom DI-C (Mendez i wsp., 1996). Ten cDNA, o długości, w przybliżeniu, jednej trzeciej genomu TGEV, wklonowano do plazmidu pACNR1180 o niskiej liczbie kopii (Ruggli i wsp., 1996) i określano jego sekwencję. cDNA kodujący defektywny genom skutecznie odzyskiwano (replikowano i pakowano) stosując wirus uzupełniający (Mendez i wsp., 1996; Izeta i wsp., 1999).
Genom DI-C zawiera trzy delecje (Δ1, Δ2 i Δ3) o długości, w przybliżeniu, 10, i 18 kilozasad (kb), odpowiednio, w ORF 1a, 1b oraz pomiędzy genami S i 7 (patrz. Figura 1).
Strategia prowadząca do uzyskania pełnej sekwencji cDNA kodującego zakaźny genom TGEV, obejmowała włączenie, krok po kroku, sekwencji, które poddano delecji w genomie DI-C i analizę bakteriotoksyczności nowo otrzymanych konstruktów. Jest to bardzo ważne zagadnienie, ponieważ, jak to opisano szeroko w piśmiennictwie naukowym, rekombinowane plazmidy zawierające cDNA wirusów RNA wykazują na ogół słaby wzrost i są niestabilne (Boyer i Haenni, 1994; Rice i wsp., 1989; Mandl i wsp., 1997).
Pierwszą uzupełnioną delecją była delecja Δ2, długości 1 kb, z ORF 1b, dająca stabilny rekombinowany plazmid. Sekwencja, której brakowało w ORF 1a została wprowadzona poprzez klonowanie fragmentów A, B, C i D cDNA (Figura 1) (Almazan i wsp., 2000) w taki sposób, żeby uzupełnić wszystkie informacje wymagane dla genu replikazy. Otrzymany rekombinowany plazmid był niestabilny w bakteriach, co przejawiało się powstawaniem nowych plazmidów o wstawionych i wyciętych sekwencjach w fragmencie B (Almazan i wsp., 2000). Interesujący jest fakt, że eliminacja fragmentu restrykcyjnego C1al-C1al o długości 5198 pz, obecnego w tym regionie genomu między nukleotydami 4 417 a 9 615 (Penzes i wsp., 1999), dała plazmid względnie stabilny w szczepie E. coli DH10B. Następnie, dodano sekwencję delecji Δ3 poprzez wklonowanie wszystkich informacji genetycznych dla strukturalnych i niestrukturalnych białek końca 3' genomu TGEV (Figura 1).
W celu zwiększenia stabilności cDNA z TGEV, zdecydowano, że odpowiednie będzie subklonowanie w BAC z użyciem plazmidu pBeloBAC11 (Kim i wsp., 1992) (patrz. Figura 2). Plazmid pBeloBAC11 został podarowany przez H. Shizuya i M. Simon (California Institute of Technology). Plazmid, wielkości 7 507 pz zawiera początek replikacji czynnika F z parB, parC E. coli (oriS) oraz geny niezbędne do utrzymania pojedynczej kopii plazmidu na komórkę (parA i repE). Na plazmidzie obecny jest także gen oporności na chloramfenikol (cat) służący jako marker selekcyjny. cDNA klonowano pod kontrolą promotora lE z CMV, zapewniającego wysoki poziom ekspresji (Dubensky i wsp., 1996). Kierowano się również wcześniejszymi wynikami uzyskanymi w laboratorium twórców niniejszego wynalazku, wskazującymi, że duże (9,7 kb i 15 kb) defektywne genomy pochodzące z TGEV dawały ekspresję RNA, które nie podlegały składaniu podczas transportu z jądra, gdzie są one syntetyzowane, do cytoplazmy (Izeta i wsp., 1999; Penzes i wsp., 1999; Almazan i wsp., 2000). Otrzymany cDNA TGEV (pBAC-TcDNA-.-\C1al) zawierał informację dla genów replikazy, z wyjątkiem brakującego fragmentu C1al o wielkości 5 198 pz oraz wszystkie informacje dla strukturalnych i niestrukturalnych genów. Koniec 3' cDNA był oflankowany przez 24 nt sekwencję poliA, rybozym HDV i sekwencję terminacji transkrypcji z BGH (Izeta i wsp., 1999). Z drugiej strony, fragment C1al, niezbędny do uzyskania pełnego genomu TGEV, klonowano w BAC, otrzymując plazmid pBAC-B+C+D5', zawierający region genomu TGEV między pozycją 4310 a 9758 (patrz. Figura 3). Oba plazmidy namnażano w szczepie DH10B E. coli i sekwencjonowano w całości. Uzyskane sekwencje były identyczne z odnośnikową sekwencją izolatu PUR46-MAD z TGEV, załączoną na końcu tego dokumentu (SEQ ID NO:1), z wyjątkiem dwóch zastąpień w pozycjach nukleotydów 6752 (A G, zmiana cicha) oraz 18997 (T C, zmiana cicha) oraz zmian w genie S z PUR46-MAD, który był zastąpiony genem D z izolatu C11 (zmiany te wskazano na Figurze 4).
Ponadto, w celu otrzymania cDNA, który mógłby kodować wirulentnego TGEV, gen S izolatu PUR46-MAD, replikujący się na wysokim poziomie w drogach oddechowych (>106 pfu/g tkanki) i na niskim poziomie w przewodzie jelitowym (<103 pfu/ml), zastąpiono całkowicie genem S z klonu 11 TGEV, nazywając go odtąd C11. Gen ten ulega replikacji w podwyższonych mianach zarówno w układzie oddechowym (<106 pfu/ml), jak i w przewodzie jelitowym (106 pfu/ml) (Sanchez i wsp., 1999). Gen S z C11 zawierał 14 nukleotydów odmiennych od genu S z izolatu PUR46-MAD, plus 6 nukleotydową insercję na końcu 5' genu S (patrz. Figura 4) (Sanchez i wsp., 1999). Wcześniejsze wyniki uzyskane w laboratorium twórców niniejszego wynalazku (Sanchez i wsp., 1999) wykazały, że mutanty otrzymane w wyniku ukierunkowanej rekombinacji, w których gen S z izolatu PUR46-MAD z TGEV zastąpiono genem S izolatu jelitowego C11, nabywały tropizm jelitowy oraz zwiększoną wirulencję,
PL 206 816 B1 przeciwnie niż w przypadku naturalnego izolatu PUR46-MAD z TGEV, bardzo rzadko replikującego lub wcale w przewodzie jelitowym zakażonych świń.
W celu otrzymania plazmidu BAC-TcDNAFL, zawierającego cDNA kodujący całkowity genom TGEV (Figura 3), otrzymano cDNA izolatu PUR46-MAD z TGEV wraz z genem S z izolatu jelitowego
C11, poprzez klonowanie fragmentu Clal-Clal o wielkości 5198 pz, uzyskanego z plazmidu pBACB+C+D5', w plazmidzie BAC-TcDNA a a.
Stabilność w bakteriach plazmidów stosowanych do otrzymywania klonu zakaźnego cDNA (pBAC-TcDNA'a i pBAC-C7alF), jak również plazmidu zawierającego całkowity cDNA (pBACTcDNAFL), analizowano po hodowli E. coli przez 160 pokoleń. Stabilność badano poprzez trawienie oczyszczonych cDNA enzymami restrykcyjnymi. Nie wykryto żadnych delecji czy insercji, mimo że obecność mniejszych zmian, nie wykrytych za pomocą zastosowanej techniki analizy, nie może być wykluczona w przypadku plazmidu pBAC-TcDNA'a i plazmidu pBAC-B+C+D5'. W przypadku plazmidu pBAC-TcDNA, zawierającego pełen genom TGEV, wykryto pewną niestabilność po 40 pokoleniach (w tym momencie w przybliżeniu 80% DNA wykazywało prawidłowy wzór restrykcyjny). Jednakże, ta lekka niestabilność nie stanowi przeszkody w otrzymaniu zakaźnego wirusa, ponieważ okres obejmujący 20 pokoleń (4 l hodowli) podczas wzrostu bakterii jest wystarczający do uzyskania ilości plazmidowego DNA, pozwalającego na otrzymanie wirusa.
1.2 Otrzymanie zakaźnego TGEV z cDNA kodującego pełen genom
Komórki ST transfekowano plazmidem pBAC-TcDNAFL. 48 godz. po transfekcji, zbierano nadsącz hodowlany i przepuszczano przez komórki ST sześć razy (patrz. Figura 5). Poczynając od pasażu 2, 14 godzin po infekcji, pojawił się efekt cytopatyczny, obejmujący później, 20 godzin po infekcji, praktycznie wszystkie komórki tworzące monowarstwę (patrz. Figura 6). Z drugiej strony, miano otrzymanego wirusa szybko wzrastało wraz z pasażami, osiągając wartości rzędu 108 pfu/ml na poziomie trzeciego pasażu (patrz. Figura 7). Doświadczenie wykonano w pięciu powtórzeniach i we wszystkich przypadkach odzyskiwano zakaźnego wirusa w podobnych mianach, natomiast w przypadku nietransformowanych komórek ST lub komórek ST transfekowanych podobnym plazmidem, w którym fragment C1al-C1al występował w przeciwnej orientacji, wirusa nigdy nie otrzymano.
W celu wyeliminowania możliwości, że uzyskany wirus mógłby być produktem zanieczyszczenia, określono sekwencję w pozycjach 6752 i 18997, sekwencjonując fragmenty cDNA amplifikowane drogą RT-PCR, przy użyciu jako matrycy genomowego RNA otrzymanego wirusa. Analiza sekwencji wykazała, że nukleotydy w pozycjach 6752 i 18997 były takie jak obecne w cDNA. Ponadto, odzyskany wirus wykazywał, w sekwencji cDNA genu S, miejsce restrykcyjne DraIII w pozycji 20990, jak oczekiwano dla genu S z C11 (Figura 8). Obecność tych trzech markerów genetycznych potwierdziła, że wyizolowany wirus pochodził z cDNA.
W celu bardziej pogłębionej charakterystyki otrzymanego wirusa wykonano analizę porównawczą stosując immunofluorescencję komórek zakażonych otrzymanym wirusem (TcDNA) po transfekcji plazmidem pBAC-TcDNAFL lub analizę komórek zakażonych izolatem PUR46-MAD TGEV. W tym celu, zastosowano swoiste poliklonalne i monoklonalne przeciwciała rozpoznające zarówno izolat C11, jak i izolat PUR46-MAD, lub jedynie ten drugi (patrz. Figura 10). Uzyskane wyniki potwierdziły antygenowość oczekiwaną dla nowego wirusa TcDNA. Poliklonalne przeciwciało swoiste wobec TGEV, oczekiwane swoiste przeciwciała monoklonalne dla białka S (ID.B12 i 6A.C3), jak również swoiste monoklonalne dla białka M (3B.B3) i dla białka N (3B.D8) rozpoznawały zarówno TcDNA, jak i PUR46-MAD. Uzyskane dane wskazują na to, że otrzymany wirus posiadał białka M i N izolatu PUR46-MAD oraz białko S izolatu C11, zgodnie z tym jak został zaprojektowany wyjściowy cDNA.
1.3 Zakażność i zjadliwość in vivo
W celu analizy zakaźności in vivo wirusa TcDNA, grupie pięciu nowonarodzonych świń podawano wirusa klonowanego z pasażu 6 i analizowano ich umieralność. Pięć świń, którym podano wirusa padło 3 do 4 dni po podaniu, co wskazywało na wirulencję wirusa TcDNA. Przeciwnie, dwie świnie którym podano jedynie rozcieńczalnik dla wirusa i przetrzymywane w tych samych warunkach nie wykazywały zmian chorobowych.
1.4 Optymalizacja poziomów ekspresji poprzez modyfikację sekwencji regulujących transkrypcję
Synteza RNA koronawirusa przebiega w RNA-zależnym procesie, w którym mRNA są transkrybowane z matryc o ujemnej polarności. W TGEV, występuje konserwatywna sekwencja konsensusową, CUAAAC, położona tuż przed większością genów. Sekwencje te stanowią sygnały dla transkrypcji subgenomowych mRNA. W koronawirusie występuje od 6 do 8 typów mRNA różnej długości, zależnie od typu koronawirusa i gospodarza. Największe odpowiadają genomowemu RNA, który z kolei służy
PL 206 816 B1 jako mRNA dla ORF 1a i 1b. Pozostałe mRNA odpowiadają subgenomowym mRNA. Te RNA oznaczono jako mRNA 1 do 7, w porządku według malejącej długości. Z drugiej strony, kilka mRNA odkrytych po zestawie początkowo opisanych mRNA, oznaczono nazwą odpowiedniego mRNA, kreską i liczbą , np. mRNA 2-1. mRNA wykazują obecność struktury koterminalnej zgodnej ze strukturą genomowego RNA. Z wyjątkiem najmniejszego mRNA, pozostałe cząsteczki mają strukturę poliestronową, natomiast, generalnie, jedynie ORF położona najbliżej końca 5' podlega translacji.
Badano wydajność ekspresji genu markerowego (GUS) stosując różne sekwencje flankujące koniec 5' minimalnej sekwencji międzygenowej (IG) CUAAAC (Figura 11), różne sekwencje flankujące koniec 3' sekwencji IG (Figura 12) i różne miejsca insercji (Figura 13). Otrzymane wyniki (Figura 11 do 13) wskazywały, że optymalną ekspresję uzyskano z TRS składającej się z: (i) -88 nukleotydów flankujących sekwencję konsensualną genu N z TGEV; (ii) sekwencji IG i (iii) sekwencji flankującej po stronie 3' sekwencję IG genu S. Ponadto, w zgodzie z wynikami otrzymanymi w zależności od punktu insercji genu heterologicznego, najwyższy poziom ekspresji uzyskano gdy heterologiczny gen położony był na końcu 3' genomu. TRS, taka jak opisana w wynalazku, pozwala na ekspresję GUS na poziomie między 2 a 8 μg na 106 komórek.
1.5 Swoistość tkankowa systemu ekspresji
Wiele patogenów dostaje się do gospodarza przez błony śluzowe. W celu zapobiegania tego typu zakażeniom, istotne jest opracowanie systemów ekspresji pozwalających na indukcję wysokiego poziomu odporności wydzielniczej. Może być to osiągnięte głównie poprzez podawanie antygenów do węzłów limfatycznych związanych z drogami oddechowymi i jelitowymi. W tym celu, i ogólnie, aby skierować ekspresję genu w kierunku tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, badano molekularne podstawy tropizmu TGEV. Badania te wykazały, że swoistość tkankowa TGEV może być modyfikowana poprzez otrzymywanie rekombinowanych wirusów zawierających gen S koronawirusa o pożądanym tropizmie (Ballesteros i wsp., 1997; Sάnchez i wsp., 1999). Informacja ta umożliwia uzyskanie systemów ekspresji opartych na genomach cDNA koronawirusów o tropizmie oddechowym lub jelitowym.
1.6 Ekspresja antygenu wirusa kodowanego przez ORF5 z PRRSV przy użyciu zakaźnego cDNA
W celu optymalizacji poziomu ekspresji heterologicznych genów, otrzymywano konstrukty z wektora o wymiennych modułach flankowanych przez sekwencje do klonowania, co ułatwia wymianę TRS i heterologicznych genów w wektorze.
Zastosowanie konstrukcji obejmującej ORF 5 z PRRSV (świńskiego wirusa zespołu oddechowego i reprodukcyjnego), oflankowaną na końcu 5' przez minimalną sekwencję konsensusową IGS (CUAAAC), poprzedzoną przez -88 nukleotydów flankujących gen nukleokapsydu wirusowego (N) a na końcu 3' przez miejsce restrykcyjne SalI (GTCGAC) oraz sekwencję analogiczną do sekwencji Kozak (AC)GACC, pozwoliło na uzyskanie optymalnego poziomu ekspresji (około 10 μg/106 komórek). W zasadzie, takie poziomy ekspresji heterologicznego genu są bardziej niż wystarczające do indukcji odpowiedzi immunologicznej. Heterologiczny gen wstawiano w pozycji zajmowanej uprzednio przez geny 3a i 3b wirusa, których obecność nie była konieczna.
1.7 Indukcja odpowiedzi immunologicznej u świni wobec antygenu powstającego w wyniku ekspresji wektora wirusowego pochodzącego z cDNA
Stosując ten sam typ wektora wirusowego pochodzącego z cDNA i wyżej opisane TRS, gen kodujący białko zielonej fosforescencji (GFP) poddawano ekspresji na wysokim poziomie (20 μg białka na milion komórek w komórkach jąder świni ST). Poziomy ekspresji były stabilne przez ponad 20 pasaży hodowli komórkowej. Ponadto, grupę świń immunizowano żywym wektorem wirusowym, podawanym doustnie, donosowo i dożołądkowo. Wykryto silną humoralną odpowiedź immunologiczną, zarówno przeciwko wektorowi wirusowemu, jak i GFP. Interesujące było odnotowanie braku wtórnego efektu po podaniu trzech dawek wektora wirusowego u zaszczepionych zwierząt.
1.8 Konstrukcja bezpiecznego wektora wirusowego z ekspresją obcego genu bez wytwarzania wirusa zakaźnego
Przy projektowaniu wektora dla ludzi bezpieczeństwo biologiczne jest sprawą priorytetową. Dla osiągnięcia tego celu, w wektorze zaplanowano trzy elementy zabezpieczające. Dwa z nich opierały się na delecji dwóch składników wirusa, położonych w różnych pozycjach genomu wirusa, istotnych dla replikacji wirusa. Składniki te dostarczono w układzie trans stosując pakującą linię komórkową. W takiej komórce (komórka nerki młodego chomika. Baby Hamster Kidney, BHK) następuje ekspresja brakujących genów TGEV kodujących istotne strukturalne białka wirusa (białka otoczki E i błony M). Trzeci element bezpieczeństwa polegał na zmianie położenia sygnału pakowania genomu wirusa,
PL 206 816 B1 w taki sposób, że zapobiegało to odtworzeniu zakaźnego wirusa poprzez rekombinację, prowadząc do wytwarzania wektora samobójczego z wydajną ekspresją heterologicznych genów, lecz niezdolnego do namnażania, nawet w najbliższej sąsiadującej komórce.
Projektując nowy wektor do zastosowania u ludzi, twórcy wynalazku nie wytwarzają nowego wirusa, który mógłby być powielany u człowieka, ponieważ wektor ten nie może być przenoszony z komórki do komórki w istotach ludzkich. Wektor oparty jest na wirusie replikacyjnie defektywnym. Można go hodować jedynie w wytwórni szczepionek, poprzez zastosowanie komórek pakujących uzupełniających delecje wirusa. Tego typu zabezpieczenia stanowią nowe procedury w inżynierii koronawirusów. Rekombinowany wirus o nowym tropizmie będzie replikacyjnie kompetentny przynajmniej w komórkach kocich, ponieważ komórki te replikują ludzkie, świńskie, psie i kocie koronawirusy.
Depozyt mikroorganizmów:
Bakterię pochodzącą z Escherichia coli, niosącą plazmid z zakaźnym klonem według wynalazku, określoną jako Escherichia coli pBAC-TcDNAFL, zdeponowano w hiszpańskiej kolekcji Spanish Collection of Type Cultures (CECT), Burjassot (Valencia), 24 listopada, 1999, pod numerem dostępu CECT 5265.
Bibliografia
Ahlquist, P., R. French, M. Janda, and L. S. Loesch-Fries.
(1984). Multicomponent RNA plant'virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 7066-7070.
Almazan, F., J. M. Gonzάlez, Z. Penzes, A. Izeta, E. Calvo, J Plana-Duran, and L. Enjuanes. (2000). Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 5516-5521.
Ballesteros, M. L., C. M. Sanchez, and L. Enjuanes. (1997). Two amino acid changes at the N-terminus of transmissible gastroenteritis coronavirus spike protein result in the loss of enteric tropism. Virology. 227: 378-388.
Baron, M. D., and T. Barrett. (1997). Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol. 71: 1265-1271.
Boyer, J. C, A. L. and Haenni. (1994). Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses.
Virology. 198: 415-426.
Chang, R. Y., M. A. Hofmann, P. B. Sethna, and D. A. Brian.
(1994). A cis-acting function for the coronavirus leader in defective interfering RNA replication.
J. Virol. 68: 8223-8231.
Collins, P. L., M. G. Hill, E. Camargo, H. Grosfeld, R. M. Chanock, and B. R. Murphy. (1995) . Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned dCNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 : 11563-11567.
Davis, N. L., L. V. Willis, J. F. Smith, and R. E. Johnston. (1989). In vitro synthesis of infectious Venezuelan equine encephalitis virus RNA from a cDNA clone: analysis of a viable deletion mutant.
Virology.171 : 189-204.
Dubensky, J. , T. W., D. A. Driver, J. M. Polo, B. A. Belli, E. M. Latham, C. E. Ibanez, S. Chada, D. Brumm, T. A. Banks, S. J. Mento, D. J. Jolly, and S. M. W. Chang. (1996), Sindbis virus DNAbased expression vectors: utility for in vitro and in vivo gene transfer. J. Virol. 70 : 508-519.
Durbin, A. P., S. L. Hall, J. W. Siew, S. S. Whitehead, P. L. Collins, and B. R. Murphy. (1997). Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235: 323-332.
Enjuanes, L., S. G. Siddell, and W. J. Spaan. 1998. Coronaviruses and Arteriviruses. Plenum Press, New York.
Enjuanes, L., and B. A. M. Van der Zeijst. 1995. Molecular basis of transmissible gastroenteritis coronavirus epidemiology. In Tha Coronaviridae. S. G. Siddell, wydawca. Plenum Press, New
York.337-376.
Frolov, I., T. A. Hoffman, B. M. Pragai, S. A. Dryga, H. V. Huang, S. Schlesinger, and C. M. Rice. (1996). Alphavirus-based expression vectors : Strategies and applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 : 11371-11377.
Garcin, D., T. Pelet, P. Calain, L. Roux, J. Curran, and D.
Kolakofsky. (1995). A highly recombinogenic system for the recovery of infectious sendai paramyxovirus from cDNA : generation of a novel. EMBO J. 14: 6087-6094.
PL 206 816 B1
Geigenmuller, U., N. H. Ginzton, and S. M. Matsui. (1997). Construction of a genome-length cDNA clone for human astrovirus serotype 1 and synthesis of infectious RNA transcripts. J. Virol. 71: 1713-1717.
Izeta, A., C. Smerdou, S. Alonso, Z. Penzes, A. Mendez, J. Plana-Duran, and L. Enjuanes. (1999). Replication and packaging of transmissible gastroenteritis coronavirus-derived synthetic minigenomes. J. Virol. 73 : 1535-1545.
Kim, U.-J., H. Shizuya, P. de Jong, B. W. Birren, and M. I. Simon. (1992). Stable propagation of cosmid-sized human DNA inserts in an F-factor based vector. Nucleic Acids Res. 20:1083-1085.
Lai, C.-J., B. Zhao, H. Hori, and M. Bray. (1991). Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.88:5139-5143.
Lai, M. M. C, and D. Cavanagh. (1997). The molecular biology of coronaviruses. Adv. Virus Res. 48:1-100.
Lai, M. M. C, C.-L. Liao, Y.-J. Lin, and X. Zhang. (1994). Coronavirus: how a large RNA viral genome is replicated and transcribed. Infect. Agents Dis. 3:98-105.
Liljestrom, P. (1994). Alphavirus expression systems. Curr. Opin. Biotech. 5:495-500.
Liljestrom, P., and H. Garoff. (1991). A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon. BioTechnology. 9 : 1356-1361.
Luytjes, W., M. Krystal, M. Enami, J. D. Parvin, and P. Palese. (1989). Amplification, expression, and packaging of a foreign gene by influenza virus. Cell. 59:1107-1113.
Mandl, C. W., M. Ecker, H. Holzmann, C. Kunz, F. X. Heinz.
(1997). Infectious cDNA clones of tick-borne encephalitis virus European subtype prototypic strain Neudoerfl and high virulence strain Hypr. J. Gen. Virol. 78:1049-1057.
Maniatis, T., E. F. Fritsh, and J. Sambrook, (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press. New York.
Mendez, A., C. Smerdou, A. Izeta, F. Gebauer, and L. Enjuanes. 1996). Molecular characterization of transmissible gastroente ritis coronavirus defective interfering genomes : packaging and heterogeneity. Virology. 217:495-507.
Penzes, Z., A. Izeta, C. Smerdou, A. Mendez, M. L. Ballesteros, and L. Enjuanes. (1999). Complete nucleotide sequence of transmissible gastroenteritis coronavirus strain PUR46-MAD. Wysłane do publikacji.
Pushko, P., M. Parker, G. V. Ludwing, N. L. Davis, R. E. Johnston, and J. F. Smith. (1997). Replication-helper systems from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus: expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogens in vivo. Virology. 239:389-401.
Racaniello, V. R., and D. Baltimore. (1981). Cloned poliovirus cDNA is infectious in mammalian cells. Science. 214:916-919.
Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, C. Dotsch, G. Christiansen, and M. A. Billeter. (1995). Rescue of measles viruses form cloned DNA. EMBO J. 14 : 5773-5784.
Rice, C. M., A. Grakoui, R. Galler, and T. J. Chambers. (1989). Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biologist. 1: 285-296.
Rice, C. M., R. Levis, J. H. Strauss, and H. V. Huang. (1987). Production of infectious RNA transcripts from Sindbis virus cDNA clones:Mapping of lethal mutations, rescue of a temperature-sensitive marker, and in vitro mutagenesis to generate defined mutants. J Virol. 61:3809-3819.
Rice, C. M., and J. H. Strauss. (1981). Synthesis, cleavage, and sequence analysis of DNA complementary to the 26S messenger RNA of Sindbis virus. J. Mol. Biol.150 :315-340.
Ruggli, N., J. D. Tratschin, C. Mittelholzer, M. A. Hofmann. (1996). Nucleotide sequence of classical swine fever virus strain Alfort/187 and transciption of infectious RNA from stably cloned full-length cDNA. J. Virol. 70 : 3479-3487.
Sάnchez, C. M., G. Jimenez, M. D. Laviada, I. Correa, C. Suϋe, M. J. Bullido, F. Gebauer, C. Smerdou, P. Callebaut, J. M. Escribano, and L. Enjuanes. (1990). Antigenic homology among coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus. Virology. 174 : 410-417.
Sάnchez, C. M., F. Gebauer, C. Suϋe, A. Mendez, J. Dopazo, and L. Enjuanes. (1992). Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses. Virology. 190 :92-105.
Sάnchez, C. M., A. Izeta, J. M. Sanchez-Morgado, S. Alonso, I. Sola, M. Balasch, J. PlanaDuran, and L. Enjuanes. (1999). Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissible gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enteric tropism and virulence. J. Virol. 73:7607-7618.
PL 206 816 B1
Sawicki, S. G., and D. L. Sawicki. (1990). Coronavirus transcription: subgenomic mouse hepatitis virus replicative intermediates function in RNA synthesis. J. Virol. 64 : 1050-1056.
Schnell, M. J., T. Mebatsion, and K.-R. Conzelmann. (1994). Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13: 4195-4203.
Sethna, P. B., S.-L. Hung, and D. A. Brian. (1989). Coronavirus subgenomic minus-strand RNAs and the potential for mRNA replicons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:5626-5630.
Shizuya, H., B. Birren, U.-J. Kim, V. Mancino, T. Ślepak, Y. Tachiiri, and M. Simon. (1992) . Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 8794-8797.
Siddell, S. G. 1995. The Coronaviridae. Plenum Press, New York. 418 str.
Smerdou, C, and P. Liljestrom. (1999). Non-viral amplification systems for gene transfer:vectors based on alphaviruses. Curr. Opin. Mol. Therap. 1 : 244-251.
Taniguchi, M., and F. A. P. Miller. (1978). Specific suppressive factors produced by hybridomas derived from the fusion of enriched suppressor T cells and A T lymphoma cell Iine. J. Exp. Med. 148 : 373-382.
van der Most, R. G., and W. J. M. Spaan. 1995. Coronavirus replication, transcription, and RNA recombination. In The Coronaviridae. S. G. Siddell, wydawca. Plenum Press, New York. 11-31.
Wang, K., C. Boysen, H. Shizuya, M. I. Simon, and L. Hood. (1997). Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23:992-994.
Woo, S.-S., J. Jiang, B. S. Gill, A. H. Paterson, and R. A. Wing. (1994). Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor. Nucleic Acids Res. 22 : 4922-4931.
Zhang, X., C. L. Liao, and M. M. C. Lai. (1994). Coronavirus leader RNA regulates and initiates subgenomic mRNA transcription both in trans and in cis. J. Virol. 68 : 4738-4746.
PL 206 816 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Consejo Superior de Xnve5tigacian.es Cierstificas <120>
<130>
<150> E5 9902673 <151> 1999-12-03 <160> 3 ' <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23568 .
<212> DNA <213> zakaźne zapalenie żołądka świń V <400> 1 acctttaaag taaagtgagt gtagcgtggc tatatctctt cttttacttt aactagcctt 60 gtgctagatt ttgtcttcgg acaccaactc gaactaaacg aaatatttgt ctttccatga 120 aatcatagag gacaagcgtt gattatttcc attcagtttg gcaatcactc cttggaacgg 180 ggttgagcga acggtgcagt agggttccgt ccctatttcg taagtcgcct agtagtagcg 240 agtgcggćtc cgcccgtaca acgttgggta gaccgggttc cgtcctgtga tctccctcgc 300 cggccgccag gagaacgagt tccaaacaat tcaagatcct tgttaatgag gactatcaag 360 tcaacgtgcc tagtcttcct attcgtgacg tgttacagga aattaagtac tgctaccgta 420 atggatttga gggctatgtt ttcgtaccag aatactgtcg tgacctagtt gattgcgatc 480 gcaaggatca ctacgtcatt ggtgttcttg gtaacggagt aagtgatctt aaacctgttc 540 ttcttaccga accctccgtc atgttgcaag gctttattgt tagagctaac tgcaatggcg 600 tccttgagga ctttgacctt aaaattgctc gcactggcag aggtgccata tatgttgatc 660 aatacatgtg tggtgctgat ggaaaaccag tcattgaagg cgattttaag gactacttcg 720 gtgatgaaga catcattgaa tttgaaggag aggagtacca ttgcgcttgg acaactgtgc 780 gcgatgagaa accgctgaat cagcaaactc tctttaccat tcaggaaatc caatacaatc 840 tggacattcc tcataaattg ccaaactgtg ctactagaca tgtagcacca ccagtcaaaa 900 agaactctaa aatagttctg tctgaagatt acaagaagct ttatgatatc ttcggatcac 960 cctttatggg aaatggtgac tgtcttagca aatgctttga cacccttcat tttatcgctg 1020 ctactcttag atgcccgtgt ggttctgaaa gt4gcggcgt tggagattgg actggtttta 1080 agactgcctg ttgtggtctt tctggcaaag ttaagggtgt cactttgggt gatattaagc 1140 ctggtgatgc tgttgtcact agtatgagcg caggtaaggg agttaagttc tttgccaatt 1200 gtgttcttca atatgctggt gatgttgaag gtgtctccat ctggaaagtt attaaaactt 1260 ttacagttga tgagactgta tgcacccctg gttttgaagg cgaattgaac gacttcatca 1320 aacctgagag caaatcacta gttgcatgca gcgttaaaag agcattcatt actggtgata 1380 ttgatgatgc tgtacatgat tgtatcatta caggaaaatt ggatcttagt accaaccttt 1440 ttggtaatgt tggtctatta ttcaagaaga ctccatggtt tgtacaaaag tgtggcgcac 1500 tttttgtaga cgcttggaaa gtagtagagg agctttgtgg ttcactcaca cttacataca 1560 agcaaattta tgaagttgta gcatcacttc gcacttctgc ttttacgatt gtaaactaca 1620 agccaacatt tgtggttcca gacaatcgtg ttaaagatct tgtagacaag tgtgtgaaag 1680 ttctcgtaaa agcatttgat gtttttacgc agattatcac aatagctggt attgaggcca 1740 aatgctttgt gcttggtgct aaatacctgt tgttcaataa tgcacttgtc aaacttgtca 1800 gcgctaaaac ccttggcaag aagcaaaagg gtcttgaatg tgcattcttt gctactagct 1360 tggttggtgc aactgttaat gtgaeacęta aaagaacaga gactgccact atcagcttga 1920 acaaggttga tgatgttgta gcaccaggag agggttatat cgtcattgtt ggtgatatgg 19Θ0 ctttctacaa gagtggtgaa tattatttca tgatgtctag tcctaatttt gttcttacta 2040 acaatgtttt taaagcagtt aaagttccat cttatgacat cgtttatgat gttgataatg 2100 ataccaaaag caaaatgatt gcaaaacttg gttcatcatt tgaatacgat ggtgatattg 2160 acgctgctat tgtaaaagtc aatgaactac tcattgaatt taggcagcaa agcttgtgct 2220 tcagagcttt taaggacgac aaaagcattt ttgttgaagc ctatcttaaa aagtataaaa 2230 cgccagcatg ccccgcaaaa catattggtt tgtggaacat cataaagaaa gattcatgta 2340 agaggggttt tcttaatctc ttcaatcact tgaatgaatt ggaagatatc aaagaaacta 2400 atattcaggc tattaaaaac attctttgcc ctgatcctct tcttgatctg gattacggcg 2460 ccatttggta caattgcatg ccaggttgct ctgatccttc agttttgggg agtgttcaac 2520 ttttgatcgg caatggtgtg aaagtagttt gtgatggctg caaaggtttt gctaaccaac 2530 cttcaaaagg ttacaacaag ctctgtaatg cggctcgcaa tgatattgag atcegtggta 2640 taccattttc cacttttaaa acacctacaa atacttttat tgaaatgaca gacgctatct 2700 actcagttat tgaacaaggt aaggcattat cctttagaga tgctgatgtg ccagttgtag 2760 acaatggtac cactcctact gctgattggt ctgaacccat tctgcttgaa cctgctgaat 2320
PL 206 816 B1 atgtaaaacc atgaggatg3· aaatgggtgg cacctgttac tcgaacgggc agtctatttc ttgaaggtta ttatgatctc caagtgaaga catctgaagg atat tacttc gggctgcagc agacaac gaa atgcttgttg ttaagaaagg gaggtcattc ccaagatagt ctgtttttaa tgcaagttaa tattaagcaa acactggcac tagatggtat atgccaatgt aacagcaacc ctaaaaacga gtgctttgga gtgatcttaa taacagaacg ttttctttga gtgacagccg gaaaaatatt tgcagtgctt aggagaggca ataatgttaa agggcaccgt ttggtcaaaa atgctgctgc gcaatttcat cattacagag ttcttgagcg aaggtgagcc attgtgaaat ttgttggacc atggcgttag tgattggtcc ctaacaggaa aaaaggctta tcgttgtcaa cagcatctcc atgctcttac ttaggttgct ctaagatgcc tcłgaacgct tagttt tatt tgcataaatt ctgcagtctg ctgattttca tggtacaatt ttcttatgta agtacagttg cagttatagt cgtcttgcaa ttaatggttc aacacaattt acgaaactgt ctcatcaaga atgaattcac aaagaacaat acatttttat cggtgacaaa acgtgttaaa cattggtact tgaagaactc cctcatttat tcagtatgat agaagaagtt cgctgaaggg tacagaagaa tgttgatgta tctcaacgga ctaccagctc tgatgtcatg tggtgatgca acttgcagct actcacccca cacctgtaga gcaaacgcca aactcaaaat gggtattaaa aatgactaga gatagtggag tgaccttata tgttttgatc acacatgggt ttctaaggat aaatgtcatt agttgaagcc aacaccactt acttaagact aactattgag ccatgaacgt tgtcatcaaa agttattaag ttttagcgct tgtgcataag actcaagcca taaaacacaa aggtgatgct cattgtcaca agtggtagca cgtcaatgtc tattattgga tggtcattac ccattttaat gaaaccacaa taagattgta tgaatttgga gcttgaagtc taaagttaaa caattacatg gttgatagca aacatgtaac tggcaactct acatctccaa gtcttacttt ttttgtacct gtttttgcat ggttaaggca aacgtgctct aatgaagact ttattgtaag acgtgatctc agtcacaaaa cccatatgac ggtaatgtca ccttatggtt accgtctcat cttgaattcg agatacaaat gatgcaatct gacacttgtg atcaatatta gaatctgttg acttcttctc gatgttgaca caagaagctg aaaattatcc caggcctttg gactttgtaa gagtatctcc aagtgtggtt cttaaggaga tttttaagtg gaagctatgt ggccattaca ccacttaaga gctgaaaaac gaaaacaaat cttccatttt aatttcttgg ggtgtcgcaa tatcttaaaa gagcatc tta aaactttgta attagtgttg gtgaatgacaaatttcctct gtgtctgttc gacaaagatg gctattgata agtagtcatg cagactgaca cagtggaaat ggttttgtac gaattaatgc cacactacag gcacctcttg aaagtcaccc gaagtactag acctattacg agagacttat gcagaggaaa caagaacaaa agatatgctg tttaaatatt gtcaaaccac agacaattga atatataact ggtgctgtac attttatgca gttacttggg gcattcttgg cagtacctca gttgtcaact gttctcgccc aggactgcaa gtttatgttc aactgtgatt agtaatagtg gttgaatgtt tacgatgtaa ttgttattgc ttggtaaaat tttcagaaga aatttgacaa ttactggtac ttgatactct gtggctttga ctgctgatga aagaagatcc aagaagaggt ttgttgaagt aacaatttaa ttaagcaagg attttttcaa acctttgtta ttgaaęttat gtggtgaaaa gttttaatta ttgaaggctc ttgttgtcaa tggttgatga aacggtgtta caaaacaaga cctctattga acaaagctgg aacctgatgt gagccatcga agaacaaatc gtgttttgaa atgtttacaa gtatctttaa ggggattgaa cttgttctat cttttgacaa ttacaaacca tagattggca atgcttataa acaactgttg ttcctggtgt atatgttgta tgcataaact catgtgacaa caattcatgg aaattaaggg aagcaactgg ataaccgtaa tacaggtcac gacc taagaa aattgttggc acatgttctt tgctggtttt ctcttgcatt acaaaccctc tcttttattt aggcatataa aagcctgttt atttcaaatc ctgtttttgg acctttggct ttgaatccat ttaaacatat ggcagacacg atgctaatgg cttatggctt ttaaacaaac cagatggctt aacacaagaa aggttataca tgtgcagaga agtagatgtt tgaaattgta aacttgggaa agcaaaccaa tataaaaaat aaaatcagaa tgagaatgaa tgaaacagta atctgctaaa tcctcctcta ggataataat caatgaagct tgcagcaaca gctcaatgat agaaattgtt tggtgtttgt tggtgttttt acctgttatg tattgaacac tacatccaca gtttaaagtt aaaagaggaa taaactttcc
Łattgttaat tgttttcact tattgctcct tgcagttgga agcaattgca tgttagactt tgtcttcgta ccctgtcaat aacatacggt gttgcctagc agctcattat atttgaagtt gattaatgca tagaggtctc tcacatttct tggtgacttg gtgcgcaaaa cactgacgaa cactgttgct ttatatttgt tggattagtg aacagctatc ttgtgctttt tattgaaagt tatggctgga atttatgtgt taaagatttt egtctggcgt gtttgtcagt aaattctagt ggcttcttat tgacccacta taataactat ttcttatttt ctcagctgag tgttttcgca tattcctatt tactggtaaa tgaaaacaca tgtttacgcc ttacagattt atacagtagt tttcataaag atgtataata caagaaattg actggtgttc gaatttgaag ggtgtcgaac ccagatggta gttagtgcat attgtagaag gaagttgcag gatgaccctt ccacctttca tgttggataa tgggagaaat acactagcaa tatagcacag ttggaaagag ggtgactgca gttcatgaca catgcagttt ggttattgtg ttgttcatta gaaaaagtag attcaaagtc ttttatcagg gctgctaatg ggtggcaaat ggtaatgctg ccacgtaatg aagtgtgaag gaaacatcat tacactgacc gttactgagg gaacagctta gcctttgatg ggtttccgtg gttacacata atttgtcttg tggaatgaat ggagtaaaga atggacaatg gtagaaaagt acatgtgtgc actacttctt tatagcggtt gttgatgcag gcaagtaatt aacaaagttg ggtgctaact gataaaattc cttagaagta ggtgctaagg tacgcaaaac ataccagtag tttataaagt gatgagttgg tggaacagac gttaggtgtt ggttatgtag tttgtgatcg tgctcaaacc caagttgctg ttctgcaaga ttcatctgtg actgatagat tatgttggtg caagaggttc
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4030
4140
4200
4260
4320
4330
4440
4500
4560
4620
4680
4740
4800
4860
4920
4930
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5530
5640
5700
5760
5820
5880
5940
6000
6060
6120
6130
6240
6300
6360
6420
6480
6540
6600
6660
6720
6780
6840
PL 206 816 B1 gctctcgctt aaatgcctgt tttgcttgaa aactaagaat ggctcgcaat gcctggtatt tggttcatct tgttaatgct tgc tgcactt caacicttca cactgaatct acaaattgtg tgttgctaca tggaactgtt cggtgactgg tgttgtagga tgtttctatt tatgtgctat gtttaatact gcaaggttta gcatgctagt tgtgaaaaca ttcttgcttt ctgtggtaat gtccgtggta tgcaatgtgt tgttatgatc gttctttatg aggcattctt taccgcatat ttcaacaaat tacttttgtt aattaaatca agctgactac taatagaaca aggtttgcgg ctatggtaac tgttattgct acttcacaac taagggtgtg atttaagtct tggcagtgtt tggtacttgt gcatcactta cggtggttat taatgtggtt cac3tcgatg ttcttcaact actagatagc ctcattgtgt tcaggctggt tgCCCŁttgg tagcattgta taagatgttg tttgttctgg tatgtttttg tgttacatat aactattctt tgaaaaccaa aaaggattgg aatgccatct ggcgtgcggt atgcatgact cgctaacaac gattggtgtt gatgaaatgt ctcaaaagag tcaagagcat caaatgttag ttaacagtga aaaagaatgt aatgttacag atgctćatag aagt taagcc atgctaagat gccaggattt aagaaggtgt atgaaagatt cacagcttaa ctgtttacag ttattaagaa ataaaggatt catgtccaat tgcctgcata gtgttactaa atacttgtgt attgtgcaaa attattatga gtctacgttt gtaaagctgg atggatacat actctaacat gcttagctat ctttcctcat ctcaaaacac ttgcataccc ggtacgtgac aacttaaagt ctgctatggg ctattgctag caatgggaga actattctgt cacttcagtc taagagtttc gccctagaca ctagtgtgag ctgccagata c agaacataa aaggatgtcc cttttatagc ttgtatacat gagaaatgta tgtcatcaga ttgttacaaa tcacagaact ttgagaaatt tttcttatgg gtgtaaatct c aactctct t caacttttgt gcatcaaaca cagcacacaa acactaacac ttattgtctt ttgctgtgac aaccacggac gtcttactac ttgtatgtgt ttgtttacat acagatttac aatacatgac gtgccaaact aacttacaga tcgagtctaa ttgtgtacag cacaacttat tagattttaa ttgatgtctc cattttctac atcgttcttt ccatggacat ctcaacgtgg ctcagaaagt atgctgtagg aaagtggttc ttgtttttat ttgaatctgc acgataccat agtatggttt atcttgaaaa ctcttgtttt gcaatgcagt ctcttacagg ctaagctcta ttaaattgcc cttattgtag actggtttgt gattctttaa gtgcgatgct ttaagtttaa ttgttgtgaa ccattgttta ttattattgc tcctctatga gtgataaatt gttcatatga gcttcaataa gctatgctca acacacctcc agcctagtgg atggtttatg cacgtgttat ctaagaataa ttaaagtcaa gtgaaagttt acatgagaag gttatgtgtt atggctcgca ctagcatgca atgctgcact catacaatac gcatgttggc tcaacaaggg ctccaactga ctttcttcta ttatgtacac caac tttgat cttttgtcct actatgaaag tgcaaggtgt tcttcacttg acatggttaa gctttgtgaa ttgcatcata ctgactttgg gttgctatta atcaattcac ctaagaacgc gaaacatcaa tcttgcttgg gtgttggact gatgacttca gtttactttt gacctctctg tctttcaatg cttaatgttt ctgattactg ggtgtgtcgg aaagttttaa agc tcaactg ctcacattta gtgtctccaa attttggttt cagtcctaca caaccttttg tttaaagcta actgtttttg gtgggtagat gatcatactg gcgtgcacca gttgaaggtg ggtaacatgg caggctacaa ggtggcgata tctgtgctag gctacatctg tatggtgttc attgtcaccc atcatctacg gatgctgggt atcctagttt ctttttgaag attgacatgc tatgctaaca agaatggctt gacatgcttt aaaatggcac aatgtgctta agtgatacca ttttcagttt aatcttgtac attaaagctg tatggtgtca ggatcagtag gaacttggaa gaagatcaac gcattcctat tcattagaat gatgctttta atcgtaagac gacgagttca aaagtaaaat cttgaattct ttggctgtta ttctttatgt gacttttctt cctgttgaca agtgttagat gtgatcttta attgctttct atggttgtca gcttttgtat tatttgtttt tgtggtgLtt ctttctgcac ggaggtaaga accaatgttg tggaactatt tctgctcttg 6900 attaagattg 6960 tttaatgcca 7020 aatcttgacg 7080 gctgtcaaca 7140 tggccatcaa 7200 atgacttctg 7260 gtttggctta 7320 acttttgtag 7380 gatcttcctt 7440 gatgtaatta 7500 ggtttgtgct 7560 gactacatgg 7620 cataacactt 7630 tttggtaaat 7740 attcctgacg 7800 gctgcttttg 7860 tcttactttg 7920 acaattgtat 7980 atgccagact 8040 agaggacttg 8100 tgcattgata 8160 gagtttggca 8220 aaactcttta 8280 attattgcat 8340 ggtgattgta 8400 tattttgtca 8460 acaagaaaac 3520 atggctccat 8580 tcactgttta 8640 tttgaatctg 8700 aattctactt 8760 tacacaggtt 8820 gctcttatgg 8880 gttaattcta 3940 ccctgcattg 9000 gaagtC3ttt .9060 aatgaaatgt 9120 ggtgttgtgt 9iao cctaacacac 9240 gcttgttatg 9300 attaaaggat 9360 attctctatt 9420 aattttgaag 9480 actaatgtca 9540 gaaaggtggt 9600 actaacagtt 9660 ggtcaaagtg 9720 cgtactatac 9780 caaatgtatg 9840 actgcaatga 9900 tggattaatc 9960 tttgtctctg 10020 atccttgtga 10080 attgttgaga 10140 gtgttttgct 10200 tggttctcac 10260 acatctgatg 10320 atgattgtca 10380 tattatattg 10440 tgtattagca 10500 tattgggtta 10560 gctgaactta 10S20 atgattctta 10630 gtacagtcaa 10740 aaaacgcatg 10800 ataaaccttt 10860 tccatctggt tggtaagcct aggggcactt agaatgcaaa atttgaaatg taacaatttc tggtaagtgt taaaagtgtt tttggttaaa ttcagatgat aggctrtttc ctttatttgt tgaaggctat ttcatgtgtt tatccctact tatgagacca cgctattaat tagtaaggac tcttggtggt tagtgatctt agcaattatt agtgggagag ctacgacaat gaatgtcttc tgttaacatt gaagattttt caatgtgtct ctattttata ttatattaat ctcactccct tgtgggtaac aactattgtt atataagtac tcttggtaaa tac tgttagt tcttgtagag gttaggagat caactatgaa tgtgtttttg ccaggttaat taacattctt tcaaggtacc acaaaatgga tgttggttcc attggaaggt tatcaatggt atgggccaaa tgcaaaaact ttttggaggt agtcataagg ccctattatg acccttcac t ctcgacggtt tcctagtgtt tcttcagtca catgctcaca caaacaatca aatctttgga catgcttact cagaattgca gtttatgaag tggcattctt tgtgtctgca atatgacgct aatttcaact tctcttatct acacaatgag
PL 206 816 B1 gtgacgatcc aacataacac tccagagtgt gcgctgatct ctaaagcatt tcgacaaaac gaaagtcaaa atatgtccag tcattccagc ccaagactag ttaaagatgc ac.cttacttg ttatgccagg ctttcggcag ttatagcctc ctattgaact agtatttgta tcggtgcaac tattgacatt gaggcatgca tggctgttac tttgtattta aaggtaagtt atgaagtttg ctatgcagag tcgactagaa caacaaagat tttggacaaa tgagcaagtc cacatacaaa cacaatgatg caaagaaata gtttgatcca agccaatgct aggtgttata cgtgaagacc gcctttaatg tggttctgat cc ttttccaa tactagtgac accaatgaca tgttactgca agacacaatg tgtagcatca gagtactggt tttcataaca ctttgcacag cacagtactt atgttatgac cgctggctat tgaagagcag aatgaatttg ac ttctttct aacacgcaac gc t taaaaat gtgtgaccgt gcatgttggt agtactcaca tagcggtgat tgctaatgtt atccatacaa cgttgttgag tggagttgtg ttttaaagca agaaccagat cgggcctgat tgtgtttgtt tgaaatcgtt ttgtgacctt ggcttcagct tgaagaggct taacattgcc ggctgagcag gattgtttct tgtcaacact tgcatcagct gcaagaaaac taatggttca gccattgagc taaacttaaa tggaaaggct agacaacaat tgaagctcca ttttgtcaag agttcgtctg gtgtgctttt accagttaat aaacggtgtc ttgcagatgc cgtgcaaata tgttgtctgt ttttactgtt ccctgcaatg gttgcgtgta catgatgcct tgttataacg gagggtagat gatccttgtt ctcgtgacag gttgaaaatg atgcttaaat .acacttgaca gctccgggtt gggatgactt tataagcagt aaa tacttta gagtgtatta gctcttggac ggttaccatt aagttgagca agccctgcac actacatatc gagcgtggat ggtggtgaag gatatttgcc ggtgggtgca cc cttgaaca gatgcacttt aaatacgcta accatgacta gctactgtgg ttaatgcgtg gctttaccta tgttgtacac gaagttgtgc ggtactacag aataagcttt c gtaaaa111 tactttagtt tgctacaaca acactttatt cttagtgttg ggagactact gatgacatag tgttagctct tattgcattc ttctcgtcca 10920 ttgaatcata ctttgagaac accaccatac 10980 tgcctagctg gattgcactt gaaaaagctc 11040 atgttagccc tcaaattttg aagcagctta 11100 ttgagcgcga agcatcagtg caaaagaaac 11160 gtatgtataa agaagcacga gctgtggaca 11220 gcctactttt tggtatgctt aagaaacttg 11280 aggctcgtaa tggtgttcta cctttaagta 11340 tcgttattac acctagcctt gaagtgtttt 11400 atgctggtgc tatttggact attgttgaag 11460 ttaaggaagt caccgctgct aatgaattaa 11520 agagaaccac aaagcttcag aacaatgaaa 11580 tcagagcgtc agcaactctt gatggtgaag 11640 ctgaaagtgg aaaaagcttt atgtatgcat 11700 ttaagtggga gagcaataat gatattatac 11760 atgttgacgg cgctaatggt cctgaagtca 11820 cccttagacg tggtgccgtt cttggttata 11880 aacccactga acatccatct aacagtagtt 11940 ctgctaaagc atatgttgat gctgttaaga 12000 aaatgctctc aaatggtgct ggtaatggta 12060 cacaacagga ctcttatggt ggtgcttcag 12120 atcctgctat tgatggatta tgccgctaca 12180 cacaagatcc aattcggttc tgtattgaaa 12240 ttaacaatgg ttgcatgtgc gatcgtactt 12300 atttaaacga gtgcggggtt ctagtgcagc 12360 agaccatgtt agtagagctt ttgacatcta 12420 ccttaagacg aattgttcaa gatttaggaa 12480 caaacgttgt acaaagaccg tcatggacca 12540 ttctggtgct gttgctgagc atgacttctt 12600 taatgttgca cgtaggaatc ttacaaagta 12660 aaattttgat gaaaagaact gtgaagttct 12720 cactgaagaa ttctttgaaa ataaagattg 12780 tgaagtttat gcaaaacttg gacccattgt 12840 ttgcgatgcg atagtggaaa aaggctatat 12900 taatggcaat ttctacgatt tcggcgattt 12960 ttgtgttaca tcatattatt cttatatgat 13020 gtctgaaaac tttgtgaaaa gtgacatcta 13080 agcttatgat tttaccgaac ataaggagta 13140 tcgcacatat cacccaaatt gttctgattg 13200 taattttaac acattgtttt ctatgacaat 13260 taaagttcat attgacggtg taccagtagt 13320 tggtatagta tggaatcttg atgtaaaatt 13380 tctragattt gtcacagatc caacacttct 13440 gcgtactgtc tgtttctcca ttgcagcttt 13500 accaggtcac tttaacaaag atttctacga 13560 gggatctgag ttaacattaa aacatttttt 13620 agacttcaat tattatcgct acaatagagt 13680 tgtttacaaa atagttggca agtattttga 13740 tgaagttgtt gttacaaact atgacaagag 13800 agctagactt tactacgaaa ctctttcata 13860 aaagagaaat grtttaccca caatgactca 13920 ggcaagagct cgtacagtag gaggagtttc 13980 tcatcagaag catttgaagt caattgctgc 14040 aaccaagttt tatggtggtt gggacaatat 1*10° tggttgtttg atgggatggg actatcctaa 1*160 aatggcttct gccatgatat taggttctaa 14220 gttctaccgc ctctccaatg agttagctca 1*280 tggtttttat tttaaacctg gtggtacaac 1*3*° ctctgctctt aacatctttc aagctgtttc 1**00 ttcaaacgct tgtaacaacg ttacagtaaa 1**60 ttatcgtagt agcagcattg atgaagaatt 1452 acacttttct atgatgatct tatctgatga IjjSU ggatttaggt tatgtagctg acattaatgc 1*6*0 cgtctttatg tccacttcca agtgttgggt 1*'°° attttgttca cagcatacat tgcagattgt 1*760 tccagacccg tccagaatct tatcagctgg 1*820 caatgttatt atgttagaac gttacgtgtc 1*880 cttgagaaac agcgaactta tatgctgcat aagaaaaatg aagagtgatt gctgcagcta gctatgcata attattgacc acaagacttg aatgttcatt catgtacatc attacttgtg gaaagagctg cttatggcat cttaagtatg ttgcgtttct aatttaaaca caagctggta tcacctgatc aactgtgtaa gaagctaaca catgttgaac ccaactggca ggttgttggc gatcaaagtt gtactgatcc tcggtaaatt actacattgt atcttaaaga gtgagttcgg acgctatcag taggtgcttg aagccataca gtgttgcttt accaagatct ttggttgcgc catgcttaga atgatttact agtactggga ttcattgtgc cacttgtccg tcaaacaact
Łgactgatct ttttagacca agacagtaaa tctttgaaga ctgctatgac aagcrcaatt ttaatgctcg aatttggtaa ttgctttaac tttctggtaa cgagacaata tcattggtte atgttgataa atatgattag ataatgatag attgcacagg catatgctaa tgggggttga acgataattg atttgagaaa aagattatgc accagaataa gaccacatga atcttcccta ttaaaacaga
PL 206 816 B1 attggctatt gacgcatacc cgctcacaaa acaccctaag cctgcttatc aaaaagtgtt 14940 ttacactcta ctagattggg ttaaacatct acagaaaaat ttgaatgcag gtgttcttga 15000 ctcgttttca gtgacaacgt tagaggaagg tcaagataag ttctggagcg aagagtttta 15060 cgccagcctc tatgaaaagt ccactgtctt gcaagctgca ggcatgtgcg tagtatgtgg 15120 Ltcgcaaact gtacttcgtt gtggagactg tcttaggaga ccacttttat gcacgaaatg 15180 tgcttacgac catgttatgg gaacaaagca taaattcatt atgtctatca caccatatgt 15240 gtgtagtttt aatggttgca acgtcaatga tgctacaaag ttgtttttag gtggtcttag 15300 Łraccactgt atgaaccaca aaccacagtt gtcattccca ctctgtgcta atggcaacgt 15360 ttttggtcta tataaaagta gtgcagtcgg ctcagaggct gttgaagatt tcaacaaact 15420 tgcagtttct gactggacta atgtagaaga ctacaaactt gctaacaatg tcaaggaatc 15490 tctgaaaatt ttcgctgctg aaactgtgaa agctaaggag gagtctgtta aatctgaata 15540 tgcttatgct gtattaaagg aggttatcgg ccctaaggaa attgtactcc aatgggaagc 15600 ttctaagact aagcctccac ttaacagaaa ttcagttttc acgtgttttc agataagtaa 15660 ggatactaaa attcaattag gtgaatttgt gtttgagcaa tctgagtacg gtagtgattc 15720 cgtttattac aagagcacga gtacttacaa attgacacca ggtatgattt ttgtgttgac 15780 ttctcataat gtgagtcctc ttaaagctcc aattttagtc aaccaagaaa agtacaatac 15840 catatctaag ctctatcctg tctttaatat agcggaggcc tacaatacac tggttcctta 15900 ctaccaaatg ataggtaagc aaaaatttac aactatccaa ggtcctcctg gcagcggtaa 15960 atctcattgt gttataggtt tgggtttgta ttaccctcag gcgagaatag tctacactgc 16020 atgtcctcat gcggctgtag acgctttatg tgaaaaagca gccaaaaact tcaatgttga 16080 tagatgttca aggataatac ctcaaagaat cagagttgat tgttacacag gctttaagcc 16140 taacaacacc aatgcgcagt acttgttttg tactgttaat gctctaccag aagcaagttg 16200 tgacattgtt gtagttgatg aggtctctat gtgtactaat tatgatctta gtgtcataaa 16260 tagccgactg agttacaaac atattgttta tgttggagac ccacagcagc taccagctcc 16320 tagaactttg attaataagg gtgtacttca accgcaggat tacaatgttg taaccaaaag 16380 aatgtgcaca ctaggacctg atgtcttttt gcataaatgt tacaggtgcc cagctgaaat 16440 tgfcaagaca gtctctgcac ttgtttatga aaataaattt gtacctgtca acccagaatc 16500 aaagcagtgc ttcaaaacgt ttgtaaaagg tcaggttcag attgagtcta actcttctat 16560 aaacaacaag caactagagg ttgtcaaggc ctttttagca cataatccaa aatggcgtaa 16620 agctgttttc atctcaccct ataacagtca aaattatgtt gctcggcgtc ttcttggttt 16680 gcaaacgcaa actgtggatt ccgctcaggg tagtgagtat gattacgtca tctacacaca 16740 gacctccgat acacagcatg ctactaatgt taacagactt aatgttgcca ttacgagagc 16800 aaaggttggt atactttgta tcatgtgtga tagaactatg tatgagaatc tcgatttcta 16860 tgaactcaaa gattcaaaga ttggtttaca agcaaaacct gaaacttgtg gtttatttaa 16920 agartgttcg aagagcgaac aatacatacc acctgcttat gcaacgacaŁ acatgagctt 16980 atctgataat tttaagacaa gtgatggttt agc.tgttaac atcggtacaa aagatgttaa 17040 ac.ac.gct.aat gtcatctcat atatgggatt cag^tttgaa gccaacatac caggctacca 17100 cacactattc tgcacgcgag attttgctat gcgtaatgtt agagcatggc tcgggcttga 17160 cgttgaaggt gcacatgtct gtggtgacaa tgttggaact aatgtaccat cacagctggg 17220 cctcccaaac ggtgtggact ttgtagtgca aactgaagga tgtgttatta ctgaaaaagg 17280 taacagcatt gaggtcgtaa aagcacgagc accaccaggt gagcaatttg cacacttgat 17340 tccgcttatg agaaagggtc aaecttggca cattgttaga cgccgtatag tgcagatggt 17400 ccgtgactat tttgatggct tatcagacat tctgatcttt gtgctttggg ctggtggtct 17460 tgaacttaca actatgagat actttgttaa aattggaaga ccacaaaaat gtgaatgcgg 17520 caaaagtgca acttgtCata gcagccctca atctgtttat gcttgcttca agcatgcatt 17580 aggacgtgat Catttatata acccttactg cattgacata cagcaatggg gttacacagg 17640 acccttgagc atgaatcacc acgaagtttg caacattcat agaaatgagc atgcagctag 17700 Cggcgatgct atcatgacta gatgtctcgc tatacatgac tgtcccgtca aacgtgttga 17760 Łtggtcaatt gtgtaccctt ctattgacaa tgaagaaaag atcaataaag ctggtcgcat 17820 agtgcagtca catgtcatga aagctgctct gaagattttt aatcctgctg caactcacga 17830 tgtgggtaat ccaaaaggca tccgttgtgc tacaacacca ataccatggt tttgttacga 17940 tcgtgatcct attaataaca atgttagatg tctggattat gactatatgg tacatggtca 18000 aatgaatggt cccatgttat tttggaactg taatgtagac atgtacccag agttttcaat 18060 tgcccgcaga tttgatactc gcactcgctc taaactgtct ttagaaggtt gtaacggcgg 18120 tgcattgtat gttaataacc atgctttcca cacaccagct tatgatagaa gagcttttgc 18180 taagctcaaa cccatgccat tcttttacta tgatgatagt aattgtgaac ttgccgacgg 18240 gcaacctaat tatgtaccac ttaagccaaa tgtttgcata acaaaatgca acattggcgg 18300 tgc-gtctgc aagaagcatg ctgctcttta cagagcgtat gttgaggatt acaacatttt 18360 tatgcaggct ggccttacaa tatggtgtcc tcaaaacttt gacacctata tgctttggca 18420 tggttttgtt aatagcaaag cacttcagag tctagaaaat gtggctttta atatcgttaa 18480 gaaaggtgcc ttcaccggtt taaaaggtga cttaccaacc gctgttattg ctgacaaaat 18540 aatggtaaga gatggaccta ctgacaaacg tattettaca aataagacta gtctacccac 18600 aaacgtagct tttgagttat atgcaaaacg caaacttgga ctcacacctc cattaacaat 18660 acttaggaat ttaggtgttg tcgcaacata taagtttgtg ttgtgggatt atgaagctga 18720 acgtcctttc tcaaatttca ctaagcaagt gtgctcctac actgatcttg atagtgaagt 18780 tgtaacatgt tttgataata gtattgctgg ttcttttgag cgttttacta ccacaagaga 18840 tgcagcgctt atttctaata acgctgtgaa agggcttagt gccattaaat tacaatatgg 18900
PL 206 816 B1 ccctttgaat tgtgcgcaag tttcgaaacc actcttcatc tgtc tc taaa aatgggtttg ttgtattaca cttggacgat ggatgtcatt taaaaccttc actgtacaaa agtgaaatta ccttaacact tggtgcatct catattggtt tgattgtact tggctccaca taatggtttc acttagttgg ttgtacaagt accatactgt gagaaactct gtgtcgttgt cattggatta tggtaaccac ttgatttatg tggaatctca gtggtgtLag agtaatgacc gaaaatatca tccatcacag tgtaagggct gagtgcaggt aatatgctgt agttaccgta gzgacaacat gatgtcagtt gatcaatgtg tcagatttta aaattagtta gaagcagctt ttaaataata ggtaagggtg tgttatacag gatggaccac ttaccaccta tacaatttct agtgacgttt aacacagcia caaattactg gtcaataaga attggtctcg atzacactac tcagtttatg tgcacggacg gacaaattga gctaattgta ttgtatgtaa gtgcacgatt accggtgccg ccactatcag acgccatgtg acttccacta tactaczzta gatgttgatt tttgttttta gtcacgatac gazctacctg aatggtgagt ttcaaacctc caaaagtatg actaccactg ttttccgctc tatgctgatg tttgtgacta gtagattgta tatccacaac atccagcgta cctgtaggca actacattgt ggtgttgctc gataatgatt agtctttaca aaatcaattg attaaagaga aataaagatc gttaacacgz gacaaagcaa acaattatgg aacaacgcac ctaaggaagg ttcgttaaca gagacaattt ttgaaacctt gtgattattt tttatgttac cttggaatca ttacaacaac caccacctac taaaccatsa atggcctaca ttagttttga tagaagtcgc attatagggt ctagttatgc gttttaataa ccaaacagcc ctacattttg ctgtagacgt ccacagtgtt tgagtgactc ggtactgtta gtgtcaagga ttagcacatt tctggacaat ttacaaaggt ctaatttgaa gtgttgtgtt gtatgaagcg caatgcagga ttcattctac ttttaga^gc acaattactt agtttgatgŁ tatatgaąga tgtcagtgcc gtattactag gtgacttgtt atgtaagcgc acagtgaact tatacaacta gtg3acctgt ttaacgtcac ctacaaactt caagtactgt tggaaataaa cctgtcacat ggcataccta 18950 acgtcgaaca aatcgatagt tactatacac agggacgtac 19020 gtagtacaat ggaagaagat tttcttagta tggataccac 19080 gtcttgagga ttatggtttt gaacacgttg tatttggaga 19140 gtggtatgca tcttctcata tcgcaagtgc gccttgcaaa 19200 aagaacttat gaataattct gacagtacac tgaaaagtcg 19250 atccatcttc taagaatgtg tgcactcata tggacatact 19820 tcattaagag cttagatctt aatgttgtgt ccaaagttgt 19880 aggcatggag atggatgttg tggtgtgaga attcacatat 19440 tccaatctgc tgaatggaat cccggctata gcatgcctac 19500 tgtgtctcga acggtgtaat ctctacaatt atggtgcaca 19560 ttactactaa gttcgttaag tatactcagt tgtgtcaata 19620 gtgtaccaca caaaatgcgt gtattgcatt taggagctgc 19680 ctggtagtac tgtattaaga agatggttac cagatgatgc 19740 tgagagatta cgtttccgac gcagacttca gtgttacagg 19800 tcgaagacaa gtttgatttg ctcgtctctg atttacatga 19860 acggtgaaaa cacgtcgaaa gatggtttct ttacttatat 19920 aactgtcact tggtggatct gttgccatta aaatcacgga 19980 tatatgaatt gattcaaaga tttgagtatt ggactgtgtt 20040 catcatcaga aggctttctg attggtatta actacttagg 20100 tagtagatgg aaatataatg catgccaatt atatattttg 20160 ctctatcaca taactcagtc ctagacactc ctaaattcaa 20220 ttattgttaa tttaaaagaa aaagaattga atgaaatggt 20280 gtaagttgct cattagaaat aatggtaagt tactaaactt 20340 caccatgaaa aaactatttg tggttttggt cgtaatgcca 20400 cccttgttct aaattgacta atagaactat aggcaaccag 20460 ccttctaaac tatagtagta ggttaccacc taattcagat 20520 tcctactgta caaccttggt ttaattgcat tcgcaatgat 20580 actggaaaat cttaaagcat tgtattggga ttatgctaca 20640 cagacaacgg ttaaacgtag tcgttaatgg atacccatac 20700 ccgcaatttt aattctgctg aaggtgctat tatatgcatt 20760 taccaccaca gaatctagtt tgacttgcaa ttggggtagt 20820 gttccctata tgtccttcta attcagaggc aaattgtggt 20830 atggtttgca gatgaggttg tcgcttattt acatggtgct 20940 aaatcaatgg tctggcactg tcacatctgg tgatatgcgt 21000 tggcacgctt gtagaccttt ggtggtttaa tcctgtttat 21060 taataataaa aatggtacta ccgtagtttc caattgcact 21120 ggctaatgtt tttactacac agccaggagg ttctatacca 21180 ttggttcctt ctaactaata gctccacgtt ggttagtggt 21240 gttattagtt aattgcttat ggccagtccc tagctttgaa 21300 ttttgagggt gctggctttg atcaatgtaa tggtgctgtt 21560 cattaggttc aaccttaatt ttactacaaa tgtacaatca 21420 ttcattgaac acaacgggtg gtgtcactct tgaaatttca 21480 gagctttttc agttacggtg aaattc.cgtt cggcgtaact 21540 cgtacactat aatggcacag ctcttaagta tttaggaaca 21600 gattgctatt agtaagtggg gccattttta tattaatggt 21660 tcctattgat tgtatatctt ttaatttgac caccggtgat 21720 agcttacaca tcgtacactg aagcattagt acaagttgaa 21780 gacgtattgt aatagtcacg ttaataacat taaatgctct 21840 taatggactt tatcctgttt cttcaagtga agttggtctt 21900 actacctagc ttttacacac ataccactgt taacataact 21960 tagtggttat ggtcaaccca tagcctcaac attaagtaac 22020 tcacaacacc gatgtgtact gtattcgttc tgaccaattt 22080 ttgcaaaagt gcttcatggg acaatatttt taagcgaaac 22140 cacagctgtt ataaaaactg gtactcgtcc tttctcattt 22200 aacttttaac aagttctgtt tgtcgttgag tcctgttggt 22260 agctgcccgt ac3agaacca atgagcaggt tgttagaagt 22320 aggagacaac atagtgggtg taccgtctga taatagtggt 22380 acacctagat tcctgcacag attacaatat acatggtaga 2249-0 acaaactaac aggacgctac ttagtggctt atattacaca 22500 aggttttaaa aatgttagtg atggtgtcat ctactctgta 22560 acaagcagct gttattgatg gtaccatagt tggggctatc 22520 gttaggtcta acacattgga caacaacacc taatttttac t.2bau cacaaatgat aggactcgtg gcactgcaat tgacagtaat 22740 cataacctat tctaacatag gtgtttgtaa aaatggtgct 22800 acattctgat ggagacgtgc aaccaattag cactggtaat 22860 taccatatcc gtgcaagtcg aatataptca ggcttacact 22920
PL 206 816 B1 acaccagtgt caatagactg ttcaagatat gtttgtaatg ttgctaaca.c aatacgtttć tgcatgtcaa actattgagc agacttgaaa acatggaggt tgattccatg ttgtttgttt gcatctgttg aagcattcaa tagttcagaa actttagacc aatataggtg gttcttggct agaaggtcta aaatacatac cgtaagtatc gttcagctat agaggacttg ccttttgata ggtacagttg atgaagacta taaacgttgt acaggtggtt tgtgctcaat actataatgg catcatggtg ctacctggtg actacgtaca cagcatccct tgcaggtggt ataacattag gtggctatac cttttgcagt agcagttcag gctagactta gatgtattga acaaaaacca gcagattctg gctagtgctt attacacagt catttggtaa ggttaatgat gctatacatc actgttgcca aagcattggc aaaagtgcaa gatgttgtca agccacctaa cagtacaatt gcaaaataat ttccaagcca atttataata ggcttgacga attgagtgct gatgcacaag agacctacag cacttaatgc atttgtgtct cagactctaa gctagtagac aacttgccaa agacaaggtt aatgaatgcg ttcggattct gtggtaatgg tacacatttg ttttcactcg atgatcttct ttcacacagt gctattacca acggcttatg ggtatttgtg cttcagatgg tgatcgcact tttggacttg actttgtttc gtaatctaga tgacaagttc tatttgaccc agagctgcaa ctagttctga ctttgttcaa attgaagggt gcaactgtaa gtgatttgcc tagtattata cctgattata caagacatat tagaaaattt tagaccaaat tggactgtac tttaacgcaa cctatttaaa cctgactggt gaaattgatg aagctacata acaccactgt agaacttgcc attctcattg gt.caat.cttg aatggctcaa tagaattgaa acctatgtaa ctactaatag gcttagtagt aatattttgc ataccattac acaggttgct gtggatgcat aggttgttta ggaagttgtt agacaatttg aaaatcacga accaattgaa aaagtgcacg aattctatca tctgctataa tagcagttgt ttctgctaga aataaagtct ttaagaacta aacttacgag tcattacagg atccatttac acatccgtag atgctgtact tgacgaactt aactcttaaa gtagaattta agactggtaa attacttgtg acttcttgct gctaaggata aagcatatgc taagcttggt caatagtcat atagttgttt aatatcatta aacacacaaa caaaacaatt aaagagagat tatagaaaaa ctgtcattct tggtggactt tttcttagta ctctgagttt tgtaattgtt taacacagca aatgtgcatc atatacaaca agaacgtgtt tgttagtgct agaacacaaa actattaccc agagttcagc ttttctagct ttgtaccgta gtacaaactt taagacgtgt gattttatca atgacacttt taggacctat gcttatagca cattgttaca acaactgtct tatctttaag atttgtctac taatagtagg tttgaattta ttttatacaa tacaacgaca agctgcaccg tttatgagaa gttctcacag ctctatttat aaattacatg tttgtgaatg acctcacgtt gcattttgta agcaatacgt ggcttagctc atgctgatct aactgtagtt tggtgatttt atttatgtat tttcacagga gcccgtagtc ttctcaggcg gttctaaacg aaattgactt aaaagaagaa cgtttcctag ggcattgact gtcatagatg acaatggaat ggttcccgct gataattata ttgatattac tttcaatagc tatgcatggt gtgttgcaat ttaggaagga cagttattat acgatgccta taagaatttt acgcgaatta aagcatacaa cttgaactaa acaaaacgaa gattttgtta atattagcgt ggagaacgct attgtgctat gaaatccgat acagatttgt tctgattgtg agtcatgctt caacggaggc gatcttattt ttcagctggt ctataatatt gatcgctttt ataactgtgc ctcagctggt tcgtgtatgg cattaaaatg cttataatgt ttggctctta cgatttttaa tgcatactcg gaataccaag ggctttagta ttgcaggtgc aattgttaca tttgtactct cccattcagt tgtacagaag gactaagtct tggtggtctt attctttgcg ttagtgcatt aggaagaagc tatgtgcttc ggtgtcactc taactttgct tccagggaat ttgtacgctg ggtatgaaca tcgacaattt accaaaatac gtaatggttg atctacacac ttgttggcaa gaagttgaaa gcaagtagtg gtaaaatcca aagctggtga ttactcaaca gaggcaagaa gaaaaattat tacatatggt ataactaaac ttctaaatgg gtaaccctag aagcacttgc ctgaaaatgc ctatccacaa ttccgtccca aggttgtaac atgacatagc tggctaatgc gtgcacttgg attatgttgc tcaatcaagc aaacatcacg acatacaagg ttagtagttc ttgacaggct ccagacaagc ttaggtctca caaatgcagc aaactgtgac tcgttaaaga ccagaactat gcgatgtgct ttgatattaa ctgagttgac acttagaatt acaacattaa aatggccttg tgctatćttg gtcactctat tccattaaat gaattttgtt tcctgtatgg gattgtgcat tgtataggtt ctctccatta acccaaagca aaattccatg agtaaccatt atagtacaac atcgctgtac gtcggcatct tatggttact ttagcacact ctcatgtttg gtcacattgt gaccctatgc agagcagttg ggtgtttaca gaagaagacc ggtcattaac attgctaaat tgttccagcg ccccgatgga gtgtgattgc catgtcgcaa ggcatcttgc tacaatatgg ggctattatg tgtccagata ggattatgta tcaaccctga ctctcgaagg aagggttcaa cattacctag cgactggatg ctgataaŁtt ccaaccaggg gtgtaacaaa 22930 aatgggtgcc 23040 ccttaaattg 23100 agaatggcct 23150 taatagcaaa 23220 atctggttta 23230 tgactcagta 23340 tgacaaaatg 23400 tggaggcgcc 23460 tctacaaact 23520 tattggcaac 23580 aggtcttgct 23540 gcaagcttta 23700 tattagtgac 23760 gatcacagga 23320 ggaggttagg 23830 gtctcagaga 23940 accaaatggc 24000 tgcttggcca 24060 tgtccagttg 24120 gtatcagccŁ 24180 gtttgttaat 24240 tcagacrgtt 24300 atttgacatt 24360 taggtcagaa 24420 caatacatta 24480 gtatgtgtgg 24540 ctgttgtagt 24600 atgtagtaga 24660 ttaaaatgtt 24720 aaggatgatg 24780 acattgtcaa 24840 actttgctgt 24900 ttggtgacac 24960 ttgaagaagt 25020 ttaagtgtta 25080 cgaaaatgat 25140 ctattgttaa 25200 agcatcatgt 25260 tctttgtatc 25320 taatgtttaa 25330 acattgatgg 25440 tttggtatgt 25500 tacatggcag 25560 atggtggcat 25620 ttgtaagcat 25680 aacttetcaa 25740 atgcagcctt 25300 atacctatga 25860 atcattttct 25920 ataattaagc 25930 caacatgctt 25040 gcactccttg 26100 acgcgcatgt 26160 tagtacagcg 26220 aaactggaac 26280 aagacctcaa 26340 gcccgttgtt 26400 tgtaatgtcc 26460 ŁtŁtgtaaga 26520 aactaaagca 26580 tgtgccaact 26640 aattgcaggt 26700 caggactatŁ 26760 ggcttactat 26820 gagtgagcaa 26380 acaacgtgtc 26940
PL 206 816 B1 agttggggag atgaacctac caaaacacgt ggtcgtccęa attcccgtgg tcggaagaat 27000 aataacacac ctctttcatt cttcaacccc ataaccctcc aacaaggttc aaaactttgg 27060 aactcatgtc cgagagactt tgtacccaaa ggaataggta acagggatca acagattggt 27120 cattggaata gacaaactcg ctatcgcatg gtgaagggcc aacgtaaaga gcttcctgaa 27130 aggtggttct tctactactt aggtactgga cctcatgcag atgccaaatt taaagataaa 27240 ttagatggag ctgtctgggu tgccaaggat ggtgccatga acaaaccsac cacgcttggt 27300 agtcgtggtg Ctaataatga atccaaagct ttgaaattcg atggtaaagt gccaggegaa 27360 tttcaacccg aagttaatca atcaagagac aattcaaggt cacgctctca atctagatct 27420 cggtctagaa atagatctca atctagaggc aggcaacaat tcaataaeaa gaaggatgac 27430 agtgtagaac aagctgttct tgccgcactt aaaaagctag gtgttgacac agaaaaacaa 27540 cagcaacgct ctcgttctaa atctaaagaa cgtagtaact ctaagacaag agatactaca 27600 cctaagaatg aaaacaaaca cacctggaag agaactgcag gtaaaggtga tgtgacaaga 27660 ttttacggag ctagaagcag ttcagccaat tttggtgaca ctgacctcgt tgccaatggg 27720 aScagtScca agcattaccc aeaactggct gaatgtgttc catctgtgtc tagcattctg 27780 ttcggaagct attggacttc aaaggaagat ggcgaccaga tagaagtcac gttcacacac 27840 aaataccact tgccaaagga tgatcctaag actggacaat tccttcagca gattaatgcc 27900 tatgctcgtc catcagaagt ggcaaaagaa cagagaaaaa gaaaatctcg ttctaaatct 27960 gcagaaaggt cagagcaaga tgtggtacct gatgcattaa tagaaaatta tacagatgtg 28020 cttgatgaca cacaggttga gataattgat gaggtaacga actaaacgag acgctcgtct 28OS0 tcctccatgc tgtatttatt acagttttaa tcttactact aattggtaga ctccaattat 28140 tagaaagact attacttaat cactctttca atcttaaaac tgtcaatgac tttaatatct 23200 tacataggag tttagcagaa accagattac taaaagtggt gcttcgagta atctttctag 28260 tcttactagg attttgctgc tacagattgt tagtcacatt aatgtaaggc aacccgatgt 28320 ctaaaaccgg tttttccgag gaattactgg tcatcgcgct gtctąctctt gtacagaatg 23380 gtaagcacgt gtaataggag gtacaagcaa ccctattgca tattaggaag tttagatttg 28440 atttggcaat gctagattta gtaatttaga gaagtttaaa gatccgctac gacgagccaa 28500 caatggaaga gctaacgtct ggatctagtg attgtttaaa atgtaaaatt gtttgaaaat 23560 tttccttttg atagtgatac aaaaaaaa ’ 2S588 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> zakaźne zapalenie żołądka świń V <400> 2 cctaggattt aaatcctaag g 21 <2io> 3 <211> 27 <212> DNA <213> zakaźne zapalenie żołądka świń V <4O0> 3 ’ gcggccgcgc cggcgaggcc tgtcgac 27 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Zakaźne zapalenie żołądka świń V <4Q0> 4 <210> 5 ' <211> 22 , <212> DNA <?13> , “ Zakaźne zapalenie żołądka świń V <3Q0>
<400> 5 gctagcccag gcgcgcggta cc
PL 206 816 B1
Claims (23)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób otrzymywania DNA zawierającego sekwencje pochodzące z genomowego RNA (gRNA) koronawirusa, znamienny tym, że stosuje się sekwencje posiadające co najmniej 60% homologii do naturalnej sekwencji koronawirusa i kodujące zależną od RNA polimerazę RNA oraz co najmniej jedno strukturalne lub niestrukturalne białko, przy czym fragment tego DNA jest zdolny do podlegania transkrypcji do RNA i składania do wirionu, przy czym sposób ten obejmuje etapy, w których defektywny genom interferujący z koronawirusem klonuje się pod kontrolą ekspresyjną promotora do sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) i wstawia się ponownie do tego genomu sekwencje usunięte z defektywnego genomu.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencje w obrębie genomu wirusowego, które są toksyczne dla bakterii do których ma być wstawiony ten genom identyfikuje się przed ponownym wstawieniem do tego DNA.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przy kompletowaniu genomu sekwencje toksyczne w obrębie genomu wirusowego wstawia się ponownie jako ostatnie.
- 4. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że otrzymuje się klon zakaźny zawierający pełnej długości kopię DNA komplementarnego (cDNA) do genomowego RNA (gRNA) koronawirusa, sklonowaną pod sekwencją regulującą transkrypcję, przy czym sposób ten obejmuje konstruowanie pełnej długości cDNA z gRNA koronawirusa i łączenie elementów regulujących transkrypcję do tego pełnej długości cDNA.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że konstruowanie pełnej długości cDNA z gRNA koronawirusa obejmuje etapy, w których (i) klonuje się interferujący defektywny genom pochodzący z tego koronawirusa pod promotorem ekspresyjnym w BAC; (ii) kompletuje się delecje w tym interferującym defektywnym genomie poprzez odtworzenie sekwencji poddanych delecji w odniesieniu do zakaźnego gRNA; (iii) identyfikuje się sekwencje w koronawirusie, które są toksyczne dla bakterii, w których ma on być sklonowany, usuwa się te sekwencje toksyczne i wstawia się te sekwencje toksyczne bezpośrednio przed przeprowadzeniem transfekcji w komórkach eukariotycznych z uzyskaniem klonu cDNA odpowiadającego gRNA koronawirusa.
- 6. Klon zakaźny, znamienny tym, że zawiera pełnej długości DNA komplementarnego (cDNA) do genomowego RNA (gRNA) koronawirusa, sklonowaną pod sekwencją regulującą transkrypcję.
- 7. Klon zakaźny według zastrz. 6, znamienny tym, że koronawirusa stanowi izolat świńskiego wirusa zakaźnego zapalenia żołądka (TGEV).
- 8. Klon zakaźny według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że promotor stanowi najwcześniejszy promotor (IE) cytomegalowirusa (CMV).
- 9. Klon zakaźny według jednego z zastrz. 6 do 8, znamienny tym, że pełnej długości cDNA jest flankowany na końcu 3' ogonem poli(A), rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) oraz sekwencjami terminacji i poliadenylacji wołowego hormonu wzrostu (BGH).
- 10. Klon zakaźny według jednego z zastrz. 6 do 9, znamienny tym, że zakaźny cDNA sklonowany jest do sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC).
- 11. Klon zakaźny według jednego z zastrz. 6 do 10, znamienny tym, że zakaźny klon cDNA otrzymany jest ze sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) E. coli zdeponowanej pod numerem dostępu CECT 5265 w Spanish Collection of Type Cultures.
- 12. E. coli zdeponowana pod numerem dostepu CECT 5265 w Spanish Collection of Type Cultures.
- 13. Rekombinowany wektor wirusowy pochodzący z klonu zakaźnego, znamienny tym, że zawiera klon zakaźny cDNA koronawirusa zmodyfikowany tak, że zawiera heterologiczny kwas nukleinowy wstawiony do tego klony zakaźnego w warunkach pozwalających na ekspresję tego heterologicznego kwasu nukleinowego.
- 14. Wektor według zastrz. 13, znamienny tym, że DNA komplementarny (cDNA) do genomowego RNA (gRNA) koronawirusa jest sklonowany pod sekwencją regulującą transkrypcję.
- 15. Wektor według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że koronawirusa stanowi izolat świńskiego wirusa zakaźnego zapalenia żołądka (TGEV).
- 16. Wektor według jednego z zastrz. 13 do 15, znamienny tym, że promotor stanowi najwcześniejszy promotor (IE) cytomegalowirusa (CMV).
- 17. Wektor według jednego z zastrz. 13 do 16, znamienny tym, że pełnej długości cDNA jest flankowany na końcu 3' ogonem poli(A), rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) oraz sekwencjami terminacji i poliadenylacji wołowego hormonu wzrostu (BGH).PL 206 816 B1
- 18. Wektor według jednego z zastrz. 13 do 17, znamienny tym, że zakaźny cDNA jest sklonowany w sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC).
- 19. Wektor według jednego z zastrz. 13 do 18, znamienny tym, że heterologiczny kwas nukleinowy wybrany jest spośród genu albo fragmentu genu kodującego będący przedmiotem zainteresowania produkt genu.
- 20. Szczepionka do ochrony zwierzęcia przed zakażeniem spowodowanym przez czynnik zakaźny, znamienna tym, że zawiera (i) co najmniej jeden rekombinowany wektor wirusowy określony w zastrz. 13, który to wektor wirusowy eksprymuje albo co najmniej jeden antygen odpowiedni do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu czynnikowi zakaźnemu, albo przeciwciało nadające ochronę przeciwko temu czynnikowi zakaźnemu, ewentualnie, z (ii) farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
- 21. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że wektor wirusowy eksprymuje co najmniej jeden antygen odpowiedni do indukcji układowej odpowiedzi immunologicznej i/lub odpowiedzi immunologicznej w błonach śluzowych przeciwko różnym czynnikom zakaźnym, które namnażają się w błonach śluzowych jelit.
- 22. Szczepionka według zastrz. 20 albo 21, znamienna tym, że stanowi szczepionkę multiwalentną do ochrony przeciwko zakażeniu spowodowanemu przez więcej niż jeden czynnik zapalny.
- 23. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, że zawiera niezależne rekombinowane wektory wirusowe do zmieszania i jednoczesnej inokulacji, przy czym każdy z tych rekombinowanych wektorów wirusowych eksprymuje co najmniej jeden antygen albo jedno przeciwciało, które są od siebie różne.Rysunki
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES009902673A ES2170622B1 (es) | 1999-12-03 | 1999-12-03 | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
| PCT/EP2000/012063 WO2001039797A2 (en) | 1999-12-03 | 2000-11-30 | Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant rna-virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL356390A1 PL356390A1 (pl) | 2004-06-28 |
| PL206816B1 true PL206816B1 (pl) | 2010-09-30 |
Family
ID=8310818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL356390A PL206816B1 (pl) | 1999-12-03 | 2000-11-30 | Sposób otrzymywania DNA, klon zakaźny, E.coli, rekombinowany wektor wirusowy i szczepionka do ochrony zwierzęcia |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7445928B2 (pl) |
| EP (2) | EP1437400A3 (pl) |
| JP (1) | JP4637432B2 (pl) |
| KR (1) | KR100755814B1 (pl) |
| CN (3) | CN1616670A (pl) |
| AR (1) | AR027893A1 (pl) |
| AT (1) | ATE267246T1 (pl) |
| AU (2) | AU785081B2 (pl) |
| BR (1) | BR0016145A (pl) |
| CA (1) | CA2393325A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ302785B6 (pl) |
| DE (1) | DE60010921T3 (pl) |
| DK (1) | DK1234024T4 (pl) |
| ES (2) | ES2170622B1 (pl) |
| HU (1) | HU228205B1 (pl) |
| IL (2) | IL149859A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA02005525A (pl) |
| NO (1) | NO331812B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ518990A (pl) |
| PL (1) | PL206816B1 (pl) |
| PT (1) | PT1234024E (pl) |
| RS (1) | RS50372B (pl) |
| SI (1) | SI1234024T2 (pl) |
| SK (1) | SK7612002A3 (pl) |
| TR (1) | TR200401186T4 (pl) |
| WO (1) | WO2001039797A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200203560B (pl) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2170622B1 (es) | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
| US7556957B2 (en) | 2001-05-17 | 2009-07-07 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | Coronavirus-like particles comprising functionally deleted genomes |
| MXPA03010427A (es) * | 2001-05-17 | 2004-12-06 | Univ Utrecht | Particulas del tipo del virus corona que comprenden genomas funcionalmente eliminados. |
| US7906311B2 (en) | 2002-03-20 | 2011-03-15 | Merial Limited | Cotton rat lung cells for virus culture |
| US7371837B2 (en) * | 2004-07-21 | 2008-05-13 | The University Of Hong Kong | Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof |
| EP1619246A1 (en) * | 2004-07-23 | 2006-01-25 | Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II | RNA dependent RNA polymerases from coronavirus and their use in molecular biology and drug screening |
| EP1789566A1 (en) | 2004-09-03 | 2007-05-30 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle |
| EP1632247A1 (en) * | 2004-09-03 | 2006-03-08 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Nucleic acid sequences encoding FMDV proteins capable of associating into a virus-like particle |
| EP2527456B1 (en) | 2004-10-22 | 2018-05-16 | Revivicor Inc. | Transgenic porcines lacking endogenous immunoglobulin light chain |
| EP1792996A1 (en) * | 2005-12-01 | 2007-06-06 | Consejo Superior de Investigaciones Cientificas | Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| JP2007312649A (ja) * | 2006-05-24 | 2007-12-06 | Japan Health Science Foundation | 再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンｄｎａ及びそれを含む微生物ならびにそれらの製造方法 |
| ES2548377T3 (es) | 2008-10-27 | 2015-10-16 | Revivicor, Inc. | Ungulados inmunodeprimidos |
| FR2947839A1 (fr) * | 2009-07-09 | 2011-01-14 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux agents antibacteriens |
| US9597390B2 (en) | 2011-03-02 | 2017-03-21 | Utrech University | Infectious bronchitis virus (IBV) spike protein as subunit vaccine |
| GB201307528D0 (en) * | 2013-04-26 | 2013-06-12 | Univ Leuven Kath | Bacterial artificial chromosomes |
| EP3143145A4 (en) * | 2014-05-16 | 2017-12-27 | Yale University | Evolution of high-titer virus-like vesicles for vaccine applications |
| CA2948181A1 (en) * | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Yale University | Virus like vesicles (vlvs) based vaccines to prevent or treat chronic hepatitis b virus (hbv) infection |
| US10533159B2 (en) | 2014-09-22 | 2020-01-14 | Regents Of The University Of Minnesota | Pichinde virus reverse genetics systems and methods of use |
| GB201603374D0 (en) | 2016-02-26 | 2016-04-13 | Ucl Business Plc | Packaging cell |
| CN107190022B (zh) * | 2017-06-28 | 2020-10-30 | 浙江大学 | 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法 |
| WO2019204654A1 (en) * | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Utah State University | Compositions and methods for zika virus characterization and vaccine development |
| KR102119875B1 (ko) * | 2019-03-19 | 2020-06-05 | 한국화학연구원 | 한국형 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염성 변이 유전자 및 이의 용도 |
| CN110468113A (zh) * | 2019-08-07 | 2019-11-19 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒强毒株及其应用 |
| CN110656120A (zh) * | 2019-10-16 | 2020-01-07 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种乙脑病毒sa14-14-2的克隆方法及应用 |
| CN111662885A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-15 | 扬州大学 | 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用 |
| CN112852873B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-03-24 | 华中农业大学 | 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法 |
Family Cites Families (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5833975A (en) * | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
| US5288641A (en) * | 1984-06-04 | 1994-02-22 | Arch Development Corporation | Herpes Simplex virus as a vector |
| US5550289A (en) * | 1985-01-07 | 1996-08-27 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(1,(1-1)-dialkyloxy)-and N-(1,(1-1)-dialkenyloxy alk-1-yl-N-N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4946787A (en) * | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US5106733A (en) * | 1987-06-25 | 1992-04-21 | Immunex Corporation | Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| EP0448650A4 (en) * | 1989-02-01 | 1992-05-13 | The General Hospital Corporation | Herpes simplex virus type i expression vector |
| US5811103A (en) * | 1989-03-19 | 1998-09-22 | Akzo Nobel N.V. | Hog cholera virus vaccine and diagnostic |
| US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| CA2039921A1 (en) | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
| US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| EP0575491B1 (en) * | 1991-03-07 | 2003-08-13 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| ES2026827A6 (es) * | 1991-03-26 | 1992-05-01 | Ercros Sa | Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino. |
| US5382425A (en) * | 1992-01-13 | 1995-01-17 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
| US6033904A (en) * | 1992-01-13 | 2000-03-07 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
| US5658724A (en) * | 1992-07-31 | 1997-08-19 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Herpes simplex virus strains deficient for the essential immediate early genes ICP4 and ICP27 and methods for their production, growth and use |
| CZ289743B6 (cs) * | 1993-02-08 | 2002-03-13 | Bayer Corporation | Izolát viru vepřového reprodukčního a respiračního syndromu PRRSV, způsob kultivace PRRSV, tkáňová kultura, způsob přípravy vakcíny a vakcína obsahující PRRSV izolát |
| DE69434447T2 (de) * | 1993-06-07 | 2006-05-18 | Vical, Inc., San Diego | Für die gentherapie verwendbare plasmide |
| US20020146392A1 (en) | 1993-06-24 | 2002-10-10 | Frank L. Graham | Helper dependent adenovirus vectors based on site-specific recombinases |
| WO1995003400A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Recombinationally targeted cloning in yeast artificial chromosomes |
| US6015686A (en) * | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| EP0804249A2 (en) * | 1994-03-15 | 1997-11-05 | Brown University Research Foundation | Polymeric gene delivery system |
| JP3911010B2 (ja) * | 1994-04-29 | 2007-05-09 | イムノ・アクテイエンゲゼルシヤフト | 必須領域に外来ポリヌクレオチドを有する組換えポックスウイルス |
| GB2289279B (en) * | 1994-05-13 | 1998-09-16 | Iberica Cyanamid | Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins |
| US5585096A (en) * | 1994-06-23 | 1996-12-17 | Georgetown University | Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells |
| GB9415319D0 (en) | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Medical Res Council | HSV viral vector |
| AU4367096A (en) | 1994-11-21 | 1996-06-17 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Unique associated kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof |
| US5719131A (en) * | 1994-12-09 | 1998-02-17 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules |
| ATE324435T1 (de) | 1995-02-21 | 2006-05-15 | Cantab Pharmaceuticals Res Ltd | Virale zubereitungen, vektoren, immunogene und impfstoffe |
| US6043232A (en) * | 1997-07-23 | 2000-03-28 | Nitromed, Inc. | Nitroso esters of beta-oxo-amides and aryl propionic acid derivatives of non-steroidal antiinflammatory drugs |
| US6019980A (en) * | 1995-06-07 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US5820869A (en) * | 1995-06-07 | 1998-10-13 | American Home Products Corporation | Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection |
| US5705385A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
| US5851826A (en) | 1995-07-26 | 1998-12-22 | Children's Medical Center Corporation | Helper virus-free herpesvirus vector packaging system |
| US5795872A (en) * | 1995-09-19 | 1998-08-18 | Pharmadigm, Inc. | DNA construct for immunization |
| US6133243A (en) | 1996-02-22 | 2000-10-17 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Liposomal-viral DNA complexes for treating disease |
| ES2109189B1 (es) | 1996-03-14 | 1998-05-16 | Iberica Cyanamid | Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas. |
| FR2751224B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs |
| US6004777A (en) * | 1997-03-12 | 1999-12-21 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
| US5990091A (en) * | 1997-03-12 | 1999-11-23 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
| DE19733364A1 (de) * | 1997-08-01 | 1999-02-04 | Koszinowski Ulrich H Prof | Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms |
| UA78180C2 (uk) * | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| FR2781159B1 (fr) * | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
| US6391314B1 (en) * | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
| US7211379B2 (en) * | 1997-10-03 | 2007-05-01 | Merial Sas | Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2 |
| US6165493A (en) * | 1997-10-22 | 2000-12-26 | New York Blood Center, Inc. | "Methods and compositions for decreasing the frequency of HIV, herpesvirus and sexually transmitted bacterial infections" |
| FR2772047B1 (fr) * | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| US20040062775A1 (en) * | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
| PT2363488E (pt) * | 1997-12-11 | 2015-01-13 | Univ Belfast | Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos |
| US6277621B1 (en) * | 1998-02-26 | 2001-08-21 | Medigene, Inc. | Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences |
| US6287856B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-09-11 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Vaccines against circovirus infections |
| US6497883B1 (en) * | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| ES2170622B1 (es) | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
| NZ519034A (en) | 1999-12-14 | 2005-02-25 | Novartis Ag | Bovine immunodeficiency virus (BIV) based vectors |
| WO2001090340A2 (en) * | 2000-05-21 | 2001-11-29 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Assembly of large viral genomes and chromosomes from subclones |
| DE10044648A1 (de) * | 2000-09-08 | 2002-03-21 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Vermehrung oder zur Entfernung von Cirocoviren aus biologischem Material |
| RU2312142C2 (ru) * | 2001-03-27 | 2007-12-10 | Юниверсити Оф Саскачеван | Способы культивирования цирковирусов |
-
1999
- 1999-12-03 ES ES009902673A patent/ES2170622B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-11-30 CZ CZ20021882A patent/CZ302785B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 PT PT00990628T patent/PT1234024E/pt unknown
- 2000-11-30 BR BR0016145-4A patent/BR0016145A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 JP JP2001541529A patent/JP4637432B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-30 ES ES00990628T patent/ES2218276T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-30 AT AT00990628T patent/ATE267246T1/de active
- 2000-11-30 AU AU30051/01A patent/AU785081B2/en not_active Ceased
- 2000-11-30 CA CA002393325A patent/CA2393325A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-30 DK DK00990628.0T patent/DK1234024T4/da active
- 2000-11-30 SK SK761-2002A patent/SK7612002A3/sk unknown
- 2000-11-30 NZ NZ518990A patent/NZ518990A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 IL IL14985900A patent/IL149859A0/xx unknown
- 2000-11-30 US US10/148,669 patent/US7445928B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-30 EP EP04007406A patent/EP1437400A3/en not_active Withdrawn
- 2000-11-30 SI SI200030394T patent/SI1234024T2/sl unknown
- 2000-11-30 MX MXPA02005525A patent/MXPA02005525A/es active IP Right Grant
- 2000-11-30 TR TR2004/01186T patent/TR200401186T4/xx unknown
- 2000-11-30 KR KR1020027007118A patent/KR100755814B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 HU HU0203305A patent/HU228205B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 RS YUP-375/02A patent/RS50372B/sr unknown
- 2000-11-30 CN CNA2004100789786A patent/CN1616670A/zh active Pending
- 2000-11-30 WO PCT/EP2000/012063 patent/WO2001039797A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-30 EP EP00990628A patent/EP1234024B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-30 CN CNA2006100733455A patent/CN1872994A/zh active Pending
- 2000-11-30 CN CNB008165904A patent/CN100402643C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-30 PL PL356390A patent/PL206816B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-11-30 DE DE60010921T patent/DE60010921T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-04 AR ARP000106406A patent/AR027893A1/es active IP Right Grant
-
2002
- 2002-05-06 ZA ZA200203560A patent/ZA200203560B/xx unknown
- 2002-05-22 NO NO20022419A patent/NO331812B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-05-27 IL IL149859A patent/IL149859A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-09-11 US US10/238,786 patent/US7368557B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-08-03 AU AU2006203327A patent/AU2006203327B2/en not_active Ceased
-
2008
- 2008-09-30 US US12/285,213 patent/US20100167352A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-11-03 US US12/938,771 patent/US20110142879A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU785081B2 (en) | Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant RNA-virus | |
| US20070048862A1 (en) | Vectors based on recombinant defective viral genomes and their use in the formulation of vaccines | |
| EP1736539A1 (en) | Attenuated SARS-CoV vaccines | |
| US20060171962A1 (en) | SARS vaccine | |
| ENJUANES SANCHEZ | Patent 2393325 Summary | |
| US7279327B2 (en) | Methods for producing recombinant coronavirus | |
| MXPA04007178A (es) | SECUENCIA DE áCIDO NUCLEICO QUE COMPRENDE LA SENAL DE ENCAPSIDACION DEL RNA DE UN CORONAVIRUS DEL GRUPO 1 Y SUS APLICACIONES. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification | ||
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20131130 |