CN106459998A

CN106459998A - 预防或治疗慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染的基于病毒样囊泡(vlv)的疫苗

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Publication number: CN106459998A
Application number: CN201580025501.8A
Authority: CN
Inventors: M·罗贝克; J·罗斯; T·雷诺兹
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2017-02-22
Also published as: WO2015175380A1; AU2015259470A1; US9987353B2; JP2017515508A; EP3143144A4; EP3143144A1; CA2948181A1; BR112016026721A2; US20170056493A1

Abstract

本发明涉及用于治疗慢性乙型肝炎的治疗性免疫的组合物和方法的发现。本发明的方法包括生成进化的高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体的方法，治疗和/或预防HBV的方法，和诱导施用由此产生的VLV组合物的对象中抗HBV感染的记忆T和B细胞免疫应答的方法。而且，本发明包括用于给对象接种疫苗以保护对象免于HBV感染的药物组合物。

Description

预防或治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的基于病毒样囊泡 (VLV)的疫苗

相关申请的交叉引用

本申请在35 U.S.C.§119(e)下要求2014年5月16日提交的美国临时申请号61/994,166的优先权，该申请在此通过引用以其全部并入本文。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本发明在由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的拨款R37 AI040357和R01 AI45510下利用政府支持进行。政府享有本发明中的某些权利。

背景技术

肝炎是指“肝脏的炎症”的一般术语并且具有主要来自病毒起源的许多起因。乙型肝炎是世界上最常见的严重的肝脏感染。其由通过血液和体液传播的乙型肝炎病毒(HBV)引起。感染可以通过在递送过程期间的如下方式发生：直接的血液与血液接触、无防护措施的性行为、受污染的针的使用、和从受感染的妇女到她的新生儿。

HBV是属于肝DNA病毒科家族的嗜肝性(hepatotrophic)DNA病毒。病毒颗粒——病毒体，由外脂质包膜和由蛋白质构成的二十面体核衣壳芯组成。核衣壳包围病毒DNA和DNA聚合酶，该DNA聚合酶具有与逆转录病毒类似的逆转录酶活性(Locarnini S，2004.Semin.Liver Dis.24(Suppl 1)：3-10)。外包膜包含参与病毒结合和进入易感细胞的嵌入蛋白。病毒基因组的全长为大约3.2kb，并且其具有四个开放阅读框(ORF)，其包括表面抗原(“S基因”)、核心抗原(“C基因”)、DNA聚合酶(“P基因”)和被称为“X基因”的未确定功能的基因(Guo等，2009.Hbpd Int 8(1)：59-64)。

用HBV感染可导致急性或慢性肝炎。一般而言，测试对乙型肝炎病毒阳性持续超过六个月的人被诊断为患有可能导致肝功能衰竭、肝癌或肝硬化的慢性感染(Wolfram，VirolJ.2013；10：239and Dienstag JL.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med.2008；359：1486-1500)。

形成慢性乙型肝炎病毒感染的风险与受病毒感染的人的年龄直接地相关。如果暴露于乙型肝炎病毒，婴儿和儿童受到慢性感染的风险最大。例如，90％的暴露的婴儿将形成慢性感染，30-50％的暴露的儿童将形成慢性感染，和10％的暴露的成年人将形成慢性感染。患有慢性HBV感染的人形成肝细胞癌的风险比未患有慢性HBV感染的人高多达300倍。在全球，HBV引起世界上60-80％的原发性肝癌。每年，全世界大约1百万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化或HBV诱发的肝癌。因此，HBV在已知的人致癌物质中排第二，仅次于烟草(www.cdc.gov/hepatitis/HBV和www.mayoclinic.org/diseases-conditions/hepatitis- b/)。

虽然针对HBV的疫苗已经被广泛地使用数十年，但是人群中的HBV流行率仍然居高不下。当前用于慢性HBV感染的疗法对病毒RNA和蛋白表达仅仅具有有限的抑制作用并且通常抑制但不消除病毒。例如，通常使用的核苷逆转录酶抑制剂恩替卡韦(Entecavir)或替诺福韦(Tenofovir)抑制慢性HBV患者中的HBV复制，但是如果疗法停止，效果是可逆的。而且，尽管对治疗性免疫用于治疗慢性HBV做出了承诺，但是当前的HBV疫苗对于治疗性接种免疫是无效的。虽然其引起预防感染的强中和抗体应答，但是当前疫苗不诱导在感染后消除病毒所需要的CD8+T细胞应答。在世界的地方性发展中地区，当前疫苗对于普遍的预防性接种疫苗也不是最佳的，这是因为其不防护所有个体，抗体应答随时间推移减弱，并且对于长效免疫必须多次给药。以单一剂量提供长期免疫的改进的预防性疫苗或治愈慢性HBV的有效治疗性疫苗将对预防HBV相关性慢性肝疾病具有实质影响。

出于这些原因，在本领域中仍然对于用于预防性和治疗性用途二者的有效HBV疫苗存在需要。本发明解决了这种需要。

发明内容

本发明提供了包含含有启动子序列的DNA序列的高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体的组合物和使用方法，所述启动子序列可操作地连接至编码Semliki病毒(塞姆利基森林病毒)(SFV)非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至SFV次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2A DNA，其又可操作地连接至编码VSV G蛋白的水泡性口炎病毒(VSV)G DNA。本发明的高效价HBV载体的SFV非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C，并且本发明的载体缺乏编码SFV结构蛋白的核苷酸序列。而且，当载体在细胞培养物中增殖时，获得至少10⁷噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。

在另一方面，本发明提供了包含含有启动子序列的DNA序列的高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体的组合物和使用方法，所述启动子序列可操作地连接至编码甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至甲病毒属次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2A DNA，其又可操作地连接至编码VSV G蛋白的水泡性口炎病毒(VSV)G DNA。本发明的高效价HBV载体的甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C，并且本发明的载体缺乏编码甲病毒属结构蛋白的核苷酸序列。而且，当载体在细胞培养物中增殖时，获得至少10⁷噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。

本发明还包括针对HBV感染免疫对象的方法。该方法包括给对象施用包括由本发明的高效价HBV载体产生的至少10⁷pfu/ml VLV的组合物，其中HBV抗原的表达诱导对象中的免疫应答。

在另一方面，本发明提供了治疗和/或预防对象中的疾病的方法。该方法包括给需要这类治疗的对象施用治疗上有效量的由本发明的高效价HBV载体产生的组合物。

本发明还提供了给对象接种疫苗的方法，该方法包括给对象施用药学上可接受量的由本发明的高效价HBV载体产生的组合物，其中组合物的施用引起对象中的免疫应答。

在进一步方面，本发明提供了在对象中对HBV抗原或其片段生成记忆T细胞免疫应答的方法。该方法包括如下步骤：以有效引起对象中免疫应答的量给对象施用由本发明的高效价HBV载体产生的组合物；和在第二随后时间段，施用第二有效量的本发明的组合物，其中针对HBV抗原或其片段的T记忆细胞在对象中生成。

本发明进一步提供了在对象中对HBV抗原或其片段生成适应性B细胞免疫应答的方法。该方法包括如下步骤：以有效引起对象中免疫应答的量给对象施用由本发明的高效价HBV载体产生的组合物；和在第二随后时间段，施用第二有效量的本发明的组合物，其中针对HBV抗原或其片段的B记忆细胞在对象中生成。

在一些实施方式中，高效价HBV载体的启动子序列是组成型启动子。在其它实施方式中，启动子序列是巨细胞病毒立即早期启动子。在一些实施方式中，获得至少5 x10⁷pfu/ml的效价的VLV。在其它实施方式中，获得至少1 x 10⁸pfu/ml的效价的VLV。

在一些实施方式中，HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和其任意组合。在其它实施方式中，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎表面中蛋白(middle hepatitis B surface)(MHBs)。

在一些实施方式中，组合物包括由本发明的高效价HBV载体产生的病毒样囊泡(VLV)。在其它实施方式中，HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和其任意组合。在其它实施方式中，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎表面中蛋白(MHBs)。在又其它实施方式中，HBV抗原与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关联。

在一些实施方式中，由本发明的组合物和方法治疗和/或预防的疾病是乙型肝炎病毒(HBV)感染。在其它实施方式中，HBV感染是慢性感染。

在一些实施方式中，引起对象中免疫应答的组合物是预防性疫苗。在其它实施方式中，组合物是治疗性疫苗。在又其它实施方式中，组合物与佐剂组合施用。在进一步实施方式中，佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A、Detox、ISCOMs和角鲨烯。

在一些实施方式中，对象是哺乳动物。在其它实施方式中，哺乳动物是人。

附图说明

为了说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方式。但是，本发明不限于在附图中描绘的实施方式的精确布置和手段。

图1A-1B是图解VLV DNA构建体的一系列图。图1A：被重构入含有CMV启动子的DNA载体的p50RNA基因组的图谱：pCMV-SFVG-p50R。图1B图解了高效价进化的VLV的缺失和11个氨基酸改变。

图2A-2C是描绘表面抗原的表达的一系列图和图像：来自VLV的乙型肝炎表面中蛋白(MHBs)和核心抗原乙型肝炎抗原(HBcAg)蛋白。图2A：VLV构建体的图。图2B：蛋白表达的蛋白质印迹。图2C：蛋白表达的免疫荧光。

图3A-3B是示出表达HBV蛋白的VLV诱导HBV特异性免疫应答的一系列柱状图。图3A：用表达MHBs或HBcAg的1 x 10⁷IFU的VLV对小鼠肌肉内免疫。对MHBs或HBcAg的CD8 T细胞应答通过IFN-γELISPOT试验在免疫后7天进行测量，n＝10。图3B：用表达MHBs或HBcAg的1 x 10⁷IFU的VLV或1 x 10⁷PFU的VSV对小鼠肌肉内免疫，并且循环抗体应答通过ELISA在免疫后的30天进行测定，n＝5。*p＜0.01。

图4A-4E是表明保护VLV-MHBs免疫的小鼠免受HBV流体动力学攻击(challenge)的一系列图表和图像。利用10⁷IFU的VLV-HBcAg或VLV-MHBs，或10⁷PFU的VSV-MHBs或VSV-HBcAg对小鼠免疫。然后在免疫后6周通过流体动力学注入HBV 1.3质粒(10μg)来诱导HBV复制。图4A：在攻击后第1、4和7天通过ELISA测定血清HBeAg水平(n≥4)。示出了第一天的百分比水平。图4B：在攻击后第7天通过免疫组织化学法测定肝脏中的HBcAg表达。量化代表每100x视野中HBcAg阳性细胞的平均数目(n＝3，每个样本计数5个视野)。示出了代表性图像。图4C：在攻击后第7天，RNA印迹(NB)和DNA印迹(SB)分析分别用于测定肝脏相关的HBV RNA和DNA水平(n≥3)。示出了代表性样本。RC＝松环DNA，SS＝单链DNA。图4D-4E：在图4D脾细胞(n≥4)或图4E肝内白细胞(来自2只或更多只小鼠的合并样本)中，在攻击后第7天，通过IFN-γELISPOT试验，测量T细胞回忆应答。Un＝未免疫的。

图5是示出免疫方案的示意图的图像。图6是描绘与DNA或蛋白质相比，VLV-MHBs诱导优越的CD8 T细胞应答的柱状图。用50μg表达HBs的重组DNA(pCMV-S2.S)、10μg重组HBsAg或10⁷IFU的VLV-MHBs对小鼠肌肉内免疫，并且在免疫后第7天通过IFN-γELISPOT试验测定CD8 T细胞应答(n≥4)。

图7A-7C是表明使用VLV的初免-加强(Prime-boost)方案提高HBV特异性CD8 T细胞应答的一系列图和柱状图。图7A：VLV_NJ-MHBs构建体的图。表达的糖蛋白源自新泽西血清型VSV。图7B-7C：来自利用指定的表达MHBs的疫苗初免和加强的小鼠在加强后1周进行IFN-γELISPOT试验。值为每组(n≥5)的平均，误差条表示S.E.VLV＝VLV-MHBs、VLVNJ＝VLV_NJ-MHBs、VSV＝VSV-MHBs、DNA＝pCMV-S2.S。

图8是显示使用VLV-MHBs的初免-加强方案诱导HBV转基因小鼠中的CD8 T细胞应答的一系列图表。针对HBeAg表达，筛选HBV 1.3转基因小鼠并且将小鼠分成HBeAg低(OD450＜0.1)或HBeAg高(OD450＞0.3)组。所有小鼠用50μg pCMV-S2.S初免并在稍后4周用DMEM(n＝3)或10⁷IFU的VLV-MHBs(n≥4)加强。加强后1周时进行IFN-γELISPOT试验。值被表示为在每组中斑点平均数目/10⁶细胞，误差条表示S.E.。*p＜0.05。

具体实施方式

本发明涉及用于治疗慢性乙型肝炎的治疗性免疫的组合物和方法的发现。在本文描述的各个实施方式中，本发明的方法包括生成表达乙型肝炎病毒(HBV)结构蛋白的进化的杂交病毒疫苗载体，其中载体产生高效价的病毒样囊泡(VLV)。另外地，本发明包括针对HBV进行治疗和/或预防或免疫的方法，和针对HBV感染在施用表达HBV的本发明的VLV的对象中生成记忆T和B细胞免疫应答的方法。

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料可以在用于测试本发明的实践中使用，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明中，将使用下列术语。

还将理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并且不意欲是限制性的。

如本文所使用，冠词“一个(a和an)”被用于指一个或指多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。

如本文所使用，当提及可测量的值比如量、时段等时，术语“大约”意思是包含距规定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且仍更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行本公开的方法。

如本文所使用，“较大”指的是如此表达水平：其比对照高至少10％或更多，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，和/或比对照高1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或更多，和其间的任何和所有的整数或分数增量。

如本文所使用，术语“对照”或“参照”可交换地使用，并且指的是被用作比较标准的值。

如其中所使用，“对象”或“患者”可以是人或者非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，比如羊、牛、猪、狗、猫和鼠科哺乳动物。优选地，对象是人。

如本文所使用，“乙型肝炎病毒”或“HBV”意思是乙型肝炎病毒，其包括但不限于禽类——其包括鸭HBV，哺乳动物——其包括旱獭和人。病毒基于在其包膜蛋白上呈现的抗原表位被分为四个主要的血清型(adr、adw、ayr、ayw)，和根据基因组的总核苷酸序列变异限定的八个基因型(A-H)。因此，术语“HBV”涵盖乙型肝炎病毒的地理基因型以及乙型肝炎病毒的地理基因型的变异株。具体而言，人乙型肝炎病毒可以是下列人地理基因型的任一种：A(西北欧、北美洲、中美洲)；B(印尼、中国、越南)；C(东亚、韩国、中国、日本、波利尼西亚、越南)；D(地中海地区、中东、印度)；E(非洲)；F(美洲原住民、波利尼西亚)；G(美国、法国)；或H(中美洲)。

如本文所使用，“慢性乙型肝炎病毒(HBV)”或“慢性HBV感染”包括如此对象：该对象已经感染有HBV并且在某个时间段(即，6个月)之后该对象不能使其感染消退。在急性感染HBV之后大于6个月的HBsAg的持续是慢性HBV感染的标志。患有慢性HBV感染的人对象中有缺陷的抗病毒T细胞应答也已经被记载(Boni等，1998，J.Clin.Invest.，102(5)：968-975)。当与急性感染后能够清除病毒的那些个体相比时，这些对象可保持持久地感染HBV并且不显示能够引起对数种HBV抗原的多特异性多克隆免疫应答。在展现主动感染的慢性感染患者中，病毒在肝脏中复制并且疾病主要地由免疫应答介导。“HBV抗原”和“HBV蛋白”在本文中可以互换使用。

如本文所使用，术语“转染”包括对于本领域技术人员而言已知将核酸序列递送入细胞的任何手段。例如，将核酸转染入细胞的方法在Sambrook等，“Molecular Cloning”，Alaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第1-3卷，2001(ISBN-0879695773)中描述。通常的转染方法包括电穿孔和使用脂质或磷酸钙。

如其中所使用，“突变”是DNA序列的改变，其导致与其天然状态的变更。突变可以包括至少一个脱氧核糖核酸碱基比如嘌呤(腺嘌呤和/或胸腺嘧啶)和/或嘧啶(鸟嘌呤和/或胞嘧啶)的缺失和/或插入和/或复制和/或置换。突变可以产生或可以不产生生物(对象)的可观察的特性(表型)的可辨别的改变。

如本文所使用，术语“进化的(evolved)”或“进化(evolve)”指的是在连续数代内生物种群的遗传特性的改变(即进化)。进化过程引起每个水平的生物组织的多样性，包括物种、个体生物和分子，比如DNA和蛋白质(Hall和Hallgrímsson，eds.2008，Strickberger′s Evolution(第四版)，Jones&Bartlett)。在本发明的背景中，“进化的”杂交病毒累积有益突变，并且在培养中50次传代之后，与原始杂交病毒相比，产生具有高1000倍的效价的VLV。

“接种疫苗”指的是用抗原接种对象以引起对象中的免疫应答的过程，其帮助预防或治疗与该抗原有关联的疾病或紊乱。术语“免疫”在本文中与接种疫苗可互换地使用。

如本文所使用，术语“免疫原性”指的是当抗原或有机体被施用至动物时，抗原或有机体引起动物中的免疫应答的先天能力。因此，“增强免疫原性”指的是当抗原或有机体被施用至动物时，增加抗原或有机体引起动物中的免疫应答的能力。增加的抗原或有机体引起免疫应答的能力可以通过——除了别的之外——更多数目的抗体结合至抗原或有机体、抗原或有机体的抗体的更大多样性、更多数目的对抗原或有机体特异性的T细胞、对抗原或有机体的更多的细胞毒性或辅助性T细胞应答、响应抗原的细胞因子的更多表达等测量。

如本文所使用，术语“活化作用”指的是在充分的细胞表面部分连接以诱导可注意的生物化学或形态学改变之后细胞的状态。在T细胞的背景中，这种活化作用指的是已经被充分地刺激以诱导细胞增殖的T细胞的状态。T细胞的活化作用还可以诱导细胞因子产生和执行调节或细胞溶解效应子功能。在其它细胞的背景中，该术语推断上调或下调特定物理化学过程。术语“活化的T细胞”指当前正经历细胞分裂、细胞因子产生、执行调节或细胞溶解效应子功能的T细胞，和/或最近已经经历“活化作用”过程的T细胞。

“体液免疫”或“体液免疫应答”二者指的是B细胞介导的免疫并且通过由B淋巴细胞(B细胞)产生或分泌的高度特异性抗体介导。

“预防”指的是使用药物组合物对紊乱接种疫苗。

“佐剂”指的是能够加强抗原的免疫原性的物质。佐剂可以是一种物质或物质的混合物，并且通过直接作用于免疫系统或者通过提供抗原的缓慢释放起作用。佐剂的实例是铝盐、聚阴离子类、细菌糖肽类和缓释剂比如弗氏不完全佐剂。“递送运载体”指的是如此组合物：其有助于将抗原靶向至特定细胞并且促进免疫系统有效识别抗原。最著名的递送运载体是脂质体、病毒体、包括微球体和纳米球体的微粒、复合神经节(polymere)、细菌菌蜕(bacterial ghost)、细菌多糖、减毒细菌、病毒样颗粒、减毒病毒和ISCOMS。

“并入”或“封装在”指的是在递送运载体内的抗原肽，所述递送运载体比如微粒、细菌菌蜕、减毒细菌、病毒样颗粒、减毒病毒、ISCOMs、脂质体和优选地病毒体。

如本文所使用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且指的是由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对于可以构成蛋白质或者肽的序列的氨基酸的最大数目没有加以限制。多肽包含任何肽或蛋白质——其包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸。如本文所使用，该术语指的是短链和较长链二者，短链在本领域中还通常地被称为例如肽、寡肽和寡聚物，较长链在本领域中通常地被称为存在许多类型的蛋白质。“多肽”包括，例如，生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽类、重组肽类、合成肽类或其组合。

在本发明的背景中，对于通常出现的核酸碱基使用如下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞苷，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。

如本文所使用，术语“RNA”被限定为核糖核酸。

“转化(transform、transforming和transformation)”在本文中用于指将分离的核酸引入生物内部的过程。

如在本发明的背景内使用的术语“治疗”意思是包括疾病或紊乱的治疗性治疗以及预防性或抑制性措施。如本文所使用，术语“治疗”以及相关联的术语比如“治疗(treat、treating)”意思是疾病病况或其至少一个症状的进展、严重性和/或持续时间的缓解。因此，术语“治疗”指的是有益于对象的任何方案(regimen)。治疗可以针对现有病况或可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可以包括治愈的、缓解的或预防性的作用。在本文中提及“治疗性的”和“预防性的”治疗将以其最宽的内容考虑。术语“治疗性的”不必然暗示对象被治疗直到完全康复。类似地，“预防性的”不必然意思是对象将最终不感染疾病病况。因此，例如，术语治疗包括在疾病或紊乱的发病之前或之后施用药剂从而预防或去除疾病或紊乱的所有征兆。作为另一个实例，在疾病的临床表现之后施用药剂以防治(combat)疾病的症状包括“治疗”疾病。

术语“生物学样本”指的是从生物或从生物的组分(例如，细胞)获得的样本。样本可以是任何生物学组织或流体。经常地，样本将是“临床样本”，其是源自患者的样本。这种样本包括但不限于骨髓、心脏组织、痰、血液、淋巴液、血细胞(例如，白细胞)、组织或细针活检样本、尿、腹膜液、和胸膜液、或来自其的细胞。生物学样本还可以包括出于组织学目的获得的组织的切片，比如冰冻切片。

术语“等价物”，当关于核苷酸序列使用时，被理解为指编码功能上等价多肽的核苷酸序列。等价的核苷酸序列将包括通过一个或多个核苷酸置换、添加或缺失而具有差异的序列，比如等位基因变体；并且因此将包括由于遗传密码的简并性与本文描述的核酸的核苷酸序列不同的序列。

“杂交”指的是通过其核酸的链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。当两个单链核酸形成双链的双链体时，它们“杂交”。双链型(double-strandedness)的区域可以包括一条或两条单链核酸的全长，或一条单链核酸的全部和另一条单链核酸的子序列，或者双链型的区域可以包括每个核酸的子序列。杂交还包括形成包含某些错配的双链体，只要两条链仍然正在形成双链螺旋。“严格杂交条件”指的是导致基本上特异性杂交的杂交条件。术语探针与模板核酸的靶位点“特异性杂交”指的是探针主要地与靶点杂交，使得杂交信号可以被清楚地解释。如本文进一步描述的，导致特异性杂交的这类条件可以根据同源区域的长度、区域中的GC含量、杂化物的解链温度“Tm”而改变。因而，杂交条件将在盐含量、酸度以及杂交溶液和洗涤物的温度方面改变。

如本文关于核酸比如DNA或RNA使用的术语“分离的”指的是分别与存在于大分子的天然来源的其它DNA或RNA分开的分子。如本文所使用，术语分离的还指的是当由重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的核酸或肽。而且，“分离的核酸”意思是包括不天然作为片段存在和在天然状态中将不被发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还用于指与其它细胞蛋白分离的多肽并且意思是包含纯化的和重组的多肽二者。“分离的细胞”或“分离的细胞群”是在其天然环境中不存在的细胞或细胞群。

如本文所使用，术语“核酸”指的是多核苷酸比如脱氧核糖核酸(DNA)，并且在适合的情况下，核糖核酸(RNA)。该术语还应当被理解为包含，作为等价物，由核苷酸类似物制造的RNA或DNA的类似物；和当用于正在被描述的实施方式时，单链(有义或反义)和双链多核苷酸。EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA是可以被称为核酸的分子的代表性实例。

术语“变体”，当在多核苷酸序列的背景中使用时，可以包含与基因的多核苷酸序列或其编码序列相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括，例如，“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。多肽通常相对于彼此将具有显著的氨基酸同一性。多态变体是在给定物种的个体之间的特定基因的多核苷酸序列中的变化。多态变体可以包含在其中多核苷酸序列变化一个碱基的“单核苷酸多态性”(SNP)。SNP的存在可以指示例如某个群体、疾病状态或疾病状态的倾向。

术语“改善”或“治疗”意思是与疾病相关联的临床征兆和/或症状由于进行的动作而减小。待被监测的征兆或症状是熟练的临床医生熟知的。

如本文所使用，“组合治疗”意思是第一药剂连同另一种药剂一起被施用。“连同……”或“与……组合”指的是除了另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式。因此，“连同……”或“与……组合”指的是在将其它治疗模式递送至个体之前、期间或之后，施用一种治疗模式。这种组合被视为单一治疗方案或制度(regime)的一部分。

范围：贯穿本公开内容，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅出于方便和简洁并且不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及在那个范围内的单个数值。例如，范围比如从1到6的描述应当被视为已经具体地公开了在该范围内的子范围，比如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这都适用。

“效价”是与参照样本相比病毒或病毒载体的浓度的数值量度，其中浓度通过病毒的活性或通过测量单位体积缓冲液中病毒的数目来测定。病毒原液的效价例如通过如下手段测定：使用软琼脂方法(参见，Graham&Van Der eb(1973)Virology 52：456-467)测量病毒的溶液或多个溶液(通常地连续稀释)对例如海拉细胞的感染性或者监测给予细胞的抗性，例如通过病毒或载体编码的G418抗性，或者通过UV分光光度法定量病毒(参见，Chardonnet&Dales(1970)Virology 40：462-477)。

如本文所使用，术语“同时施用(concurrent administration)”意思是组合疗法中第一疗法的施用和第二疗法的施用彼此重叠。

如本文所使用，术语“药物组合物”指的是在本发明内有用的至少一种化合物与其它化学成分的混合物，化学成分比如载体、稳定剂、稀释剂、佐剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。药物组合物有助于将化合物施用给生物。本领域中存在多种施用化合物的技术，其包括但不限于：静脉内、口服、气溶胶、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。

语言“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的盐、药学上可接受的材料、组合物或载体，比如液体或固体充填剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化材料，其参与在对象内携带或运输本发明的化合物(一种或多种)或者携带或运输本发明的化合物(一种或多种)至对象，使得其可以执行其预期功能。通常，这类化合物从身体的一个器官或部分被携带或运输至身体的另一个器官或部分。每种盐或载体在与制剂的其它成分相容的意义下必须是“可接受的”，并且对于对象而言是无害的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，比如可可脂和栓剂蜡；油类，比如花生油、棉花籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，比如丙二醇；多元醇类，比如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，比如油酸乙酯或月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；稀释剂；粒化剂；润滑剂；粘合剂；崩解剂；湿润剂；乳化剂；着色剂；释放剂(release agent)；涂层剂；甜味剂；调味剂；芳香剂；防腐剂；抗氧化剂；增塑剂；胶凝剂；增稠剂；硬化剂；固化剂(setting agent)；悬浮剂；表面活性剂；致湿剂(humectant)；载体；稳定剂；和在药物制剂中采用的其它无毒的相容的物质，或其组合。如本文所使用，“药学上可接受的载体”还包括任何和所有涂层、抗菌剂和抗真菌剂、和吸收延迟剂，以及与化合物的活性相容的并且对于对象而言生理学上可接受的类似载体。补充的活性化合物也可以并入组合物。

如本文所使用，术语“抗体”或“Ab”指的是源自特异性地结合至抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。在本发明中有用的抗体可以以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab和F(ab)₂，以及单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等，1998，Using Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等，1989，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等，1988，Science 242：423-426)。抗体可以源自天然来源或源自重组来源。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。

如本文所使用，术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产生或特定的免疫活性细胞的活化，或二者。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽类，可以用作抗原。而且，抗原可以源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列——因此编码如本文中使用的术语“抗原”。而且，本领域技术人员将理解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合布置以引起期望的免疫应答。而且，本领域技术人员将理解，抗原根本不必由“基因”编码。容易显而易见的是，抗原可以被合成生成或者可以源自生物学样本。这样的生物学样本可以包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。

本文中使用的“异种抗原”指的是对包含或表达抗原的生物而言非内源的抗原。作为实例，包含或表达病毒或肿瘤抗原的病毒疫苗载体包括异种抗原。

如本文所使用，“融合蛋白”指的是蛋白质，其中该蛋白质包括通过肽键或其它化学键连接在一起的两个或更多个蛋白质。蛋白质可以通过肽键或其它化学键直接地连接在一起，或者利用在两个或更多个蛋白质之间的一个或多个氨基酸——在本文中称为间隔区——连接在一起。

如本文所限定，“甲病毒属”是IV组披膜病毒科病毒家族的成员。甲病毒属包括但不限于奥拉病毒、巴班肯病毒(Babanki virus)、巴马森林病毒(Barmah Forest virus)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、卡巴苏病毒(Cabassou virus)、屈曲病毒、东方马脑炎病毒、沼泽地病毒、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、格塔病毒(Getah virus)、高地病毒(Highlands virus)、克泽拉格齐病毒(Kyzylagach virus)、马亚罗病毒、Me Tri病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥尼翁-尼翁病毒(O′nyong′nyong virus)、皮克孙纳病毒、里奥内格罗病毒(Rio Negrovirus)、罗斯河病毒、Sagiama病毒、鲑鱼胰腺疾病病毒(Salmon pancreas diseasevirus)、Semliki病毒、辛德毕斯病毒、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、托莱特病毒(Tonate virus)、特罗卡拉病毒(Trocara virus)、乌纳病毒(Una virus)、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和沃达罗河病毒。

如本文所限定，“甲病毒属非结构蛋白”可以选自nsp1、nsp2、nsp3和nsp4。

如本文所限定，“甲病毒属结构蛋白”可以选自甲病毒属衣壳蛋白和至少一种突起蛋白。

术语“特异性地结合”、“选择性地结合”或“结合特异性”指的是人源化抗体或本发明的结合化合物结合至VSV上存在的靶表位的能力，该结合与当结合至非靶表位时产生的亲和力相比具有更大的亲和力。在某些实施方式中，特异性结合指的是结合至靶点的亲和力比对非靶表位的亲和力至少大10、50、100、250、500或1000倍。

如本文所使用，术语“有效量”或“治疗上有效量”意思是由本发明的载体生成的病毒样囊泡的量，其是预防特定的疾病病况所需的，或者其降低疾病病况或其至少一种症状或与其相关的病况的严重性和/或改善疾病病况或其至少一种症状或与其相关的病况。

如本文所使用，术语“启动子”被定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞的合成机器识别，或引入合成机器的DNA序列。

如本文所使用，术语“启动子/调节序列”意思是对于可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物的表达必需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，以及在其它情况下，该序列还可以包括对于基因产物的表达必需的增强子序列和其它调节元件。例如，启动子/调节序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子是如此核苷酸序列：当可操作地与编码或规定基因产物的多核苷酸连接时，其在细胞的大部分或所有生理学条件下使得在细胞中产生基因产物。

“诱导型”启动子是如此核苷酸序列：当可操作地与编码或规定基因产物的多核苷酸连接时，其基本上仅当与启动子对应的诱导物在细胞中存在时使得在细胞中产生基因产物。

“载体”是物质组合物，其包括分离的核酸并且其可以被用于递送分离的核酸至细胞内部。多种载体在本领域中是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。在本公开内容中，术语“载体”包括自主复制的病毒。

术语“2A”或“2A肽”或“2A样肽”是自加工病毒肽。2A肽可以分离单一ORF转录单位中的不同蛋白编码序列(Ryan等，1991，J Gen Virol 72：2727-2732)。虽然被称为“自切割”肽或蛋白酶位点，但是2A序列从一个转录物生成两个蛋白质的机制通过核糖体跳跃(skipping)——其中正常肽键在2A处受损——发生，其从一个翻译事件产生两个不连续蛋白片段。连接2A肽序列导致源自单一ORF的多种分离(discrete)蛋白(基本上等摩尔量)的细胞表达(de Felipe等，2006，Trends Biotechnol 24：68-75)。

描述

组合物

本发明部分地基于图1A-1B中图解的高效价杂交病毒载体的发现。该载体包括含有第一启动子序列的DNA序列，该第一启动子序列可操作地连接至编码Semliki病毒(SFV)非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列，该Semliki病毒(SFV)非结构蛋白核苷酸序列包括选自如下的如表2中示出的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C。这些序列可操作地连接至规定与SFV次基因组RNA启动子对应的第二启动子序列的DNA。该序列又可操作地连接至编码水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白的DNA。该载体缺乏编码SFV结构蛋白的功能性核苷酸序列。当载体在细胞培养物中增殖时，获得高效价的病毒样囊泡(VLV)，例如获得至少10⁷噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。

在一些实施方式中，本发明的载体包括含有第一启动子序列的DNA序列，该第一启动子序列可操作地连接至编码甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列，该甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列包括选自如下的如表2中示出的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C。这些序列可操作地连接至规定与甲病毒属次基因组RNA启动子对应的第二启动子序列的DNA。该序列又可操作地连接至编码水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白的DNA。该载体缺乏编码甲病毒属结构蛋白的功能性核苷酸序列。当载体在细胞培养物中增殖时，获得高效价的病毒样囊泡(VLV)，例如获得至少10⁷噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。

制造本发明的高效价杂交病毒载体的方法在本文中的实验实施例部分中详细地描述。

在一方面，编码VSV G蛋白的VSV可以来自本领域中已知的任何VSV血清型。VSV血清型的非限制性实例包括印第安纳(IND-VSV)血清型和新泽西(NJ-VSV)血清型。

在一方面，虽然巨细胞病毒立即早期启动子在本文中被示例，但是本发明不应当被解释为限于这种启动子序列。在本发明中有用的启动子序列包括诱导高水平基因表达的任何启动子。这类启动子可以包括但不限于本文其它地方公开的那些。

在本发明的另一方面，当杂交病毒载体在细胞培养物中增殖时，杂交病毒载体可以达到至少5 x 10⁷pfu/ml、至少1 x 10⁸pfu/ml或更多的效价。

在本发明的组合物的进一步方面，编码HBV蛋白的DNA插入次基因组SFV启动子和编码VSV G蛋白的DNA之间，其中编码异源蛋白的DNA可操作地连接至编码来自Thoseaasigna病毒的T2A肽的DNA(Szymczak等，2004.Nature Biotechnology 22：589-594)，该DNA又可操作地连接至编码VSV G蛋白的DNA。以这种方式，在本发明的所得VLV中HBV蛋白的表达有效地依赖于VSV G蛋白的表达，后者对于载体的复制是必要的。因此，HBV蛋白的表达被稳定化并且确保在杂交载体中表达该蛋白的基因持续存在。

在一些实施方式中，2A肽选自马鼻炎A病毒(E2A)、口蹄疫病毒(F2A)、猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(P2A)、Thosea asigna病毒(T2A)和本领域中已知的任何2A肽或其片段。在进一步实施方式中，2A肽是本领域中已知的T2A肽或其任何T2A片段。

在某些实施方式中，HBV基因可以在不必须是SFV次基因组启动子序列的RNA病毒启动子序列的控制下。当本领域技术人员实践本发明时，驱动异源启动子序列表达的RNA启动子序列的这些改变和变型对于本领域技术人员而言是显而易见的。载体也可以包括以如下方式可操作地连接至HBV基因的常规控制元件：该方式许可其在用本发明产生的杂交病毒载体感染的细胞中转录、翻译和/或表达。

以这种方式，HBV蛋白/抗原或其片段的表达有效地依赖于VSV G蛋白的表达，后者对于载体的复制是必要的。因此，HBV抗原或其片段的表达被稳定化并且确保在杂交载体中表达该蛋白的基因持续存在。这类的高效价杂交病毒载体在本文被称为“高效价杂交HBV载体”。

在某些实施方式中，编码HBV抗原或其片段的DNA在组成型启动子的控制下。在其它实施方式中，需要的成分(一种或多种)可以在诱导型启动子的控制下。适合的诱导型和组成型启动子的实例在本文的其它地方提供，并且在本领域中是熟知的。

载体也可以包括以如下方式可操作地连接至异源基因的常规控制元件：该方式许可其在用本发明产生的杂交病毒载体感染的细胞中转录、翻译和/或表达。

如本文所使用，“可操作地连接的”序列包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列和以反式作用或者远距离控制感兴趣基因的表达控制序列二者。表达控制序列包括适合的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，比如剪接和多聚腺苷化(polyA)信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和需要时，增强编码产物的分泌的序列。存在许多表达控制序列，包括本领域中已知的天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性的启动子，其可以用于本发明的组合物。“可操作地连接的”应当被解释为除了DNA表达和控制序列之外还包括RNA表达和控制序列。

另外的启动子元件例如增强子调节转录起始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，但是许多启动子最近已经被显示为也包含起始位点下游的功能性元件。启动子元件之间的间隔经常为柔性的，使得当元件被倒置或者相对于彼此移动时启动子功能被维持。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔在活性开始下降之前可以增加至50bp间距。取决于启动子，个体元件可以合作地或独立地起作用来激活转录。

在一个实施方式中，适合的启动子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。适合启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。但是，也可以使用其它组成型启动子序列，其包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼鼠白血病毒启动子、禽白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，比如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步，本发明不应当被限制为使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。使用诱导型启动子提供分子开关，其能够打开可操作地连接的多核苷酸序列的表达——当这样的表达期望时，或者关闭表达——当表达不期望时。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。本发明进一步包括使用组织特异性启动子，其驱动在一个或多个特定类型的细胞中给定异源基因的表达(例如，结蛋白启动子、肌红蛋白启动子、肌肉肌酸激酶启动子、哺乳动物肌钙蛋白1启动子和骨骼α-肌动蛋白(action)启动子)。而且，本领域中已知的任何人工合成启动子可以在本发明中使用，因为这些启动子可以为异源基因提供最佳效率和稳定性。另外地，增强子序列调节载体内包含的基因的表达。通常，增强子与蛋白因子结合以增强基因的转录。增强子可以位于其调节的基因的上游或下游。增强子还可以是组织特异性的，以增强特定细胞或组织类型中的转录。

为了评估编码HBV抗原的DNA的表达，待被引入细胞的表达载体还可以包含可选择的标记基因或报告基因或二者，以促进从寻求通过杂交病毒载体感染的细胞群识别和选择表达细胞。在其它方面，可选择的标记可以在单独块的DNA上携带并在共感染/转染过程中使用。可选择的标记或报告基因二者的侧翼可以具有适合的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择的标记包括，例如，抗生素抗性基因，比如新霉素抗性基因等。

报告基因用于识别潜在感染的细胞并用于评价调节序列的功能性。一般而言，报告基因是如此基因：该基因不存在于受体生物或组织中或者不被受体生物或组织表达，并且该基因编码多肽，所述多肽的表达被一些可容易检测的性质比如酶活性表明。适合的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等，2000 FEBS Letters 479：79-82)。

在本发明的高效价杂交HBV载体中有用的HBV抗原包括乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)和乙型肝炎病毒DNA聚合酶。在某些方面，抗原可以是HBsAg肽——大、中和/或小——的任意组合(pre-S1+pre-S2+S、pre-S2+S或S)。在进一步方面，HBV可以来自本领域中任何已知的如本文其它地方描述的血清型和基因型。在又进一步方面，HBV抗原可以包含HBV抗原(即，2、3或更多种)或其片段的组合。在一些方面，这些HBV抗原或HBV抗原的片段可以使用本领域中可获得的技术装配入融合蛋白。

在本发明的另一方面，当VLV在细胞培养物中产生时，杂交HBV载体可以产生表达HBV的至少5 x 10⁷pfu/ml、至少1 x 10⁸pfu/ml或更大的效价的VLV。

本发明的方法

本发明包括针对HBV的感染免疫对象的方法。该方法包括给对象施用包含由高效价杂交病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)的组合物，其中该高效价杂交病毒载体包含编码HBV基因或其片段的DNA。异源基因的表达诱导对在对象中由此编码的HBV蛋白或其片段的免疫应答。在一方面，本发明包括在对象中对HBV蛋白或其片段生成记忆T细胞免疫应答的方法。在另一方面，本发明包括在对象中对HBV蛋白或其片段生成适应性B细胞免疫应答的方法。

本发明进一步包括治疗有需要的对象的方法，其中该方法包括给对象施用包含由本发明的高效价杂交病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)的组合物，其中该高效价杂交病毒载体包含编码HBV基因或其片段的DNA并且其中HBV基因或其片段的表达为对象提供益处。

另外地，本发明包括的是降低对象将形成疾病的风险的方法。该方法包括给对象施用包含由本发明的高效价杂交病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)的组合物，其中该高效价杂交病毒载体包含编码HBV基因或其片段的DNA。HBV基因或其片段的表达诱导对在对象中由此编码的HBV蛋白或其片段的免疫应答，从而降低对象将形成HBV的风险。

在本发明的方法中有用的HBV抗原包括但不限于乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或其片段、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)或其片段、乙型肝炎e抗原(HBeAg)或其片段、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶或其片段、和抗原或抗原片段的任意组合。在一些方面，HBV抗原的组合可以装配入融合蛋白构建体。

在本发明的某些方面，在抗病毒疗法和HBeAg血清转化之后，在HBV病毒量和抗原的减少与通过T细胞的抑制受体程序性死亡-1(inhibitory receptor programmed death-1)(PD-1；还被称为PDCD1)——活化T细胞的负调节物——的表达的降低之间存在正相关(Evans等(2008)Hepatology 48：759)。

在另一方面，本发明考虑使用HBV的变体，其中该变体包括基因的核苷酸突变，该基因编码HBV DNA聚合酶、表面抗原和/或两个开放阅读框中的至少一种。突变导致突变的HBV蛋白的至少一种氨基酸添加、置换和/或缺失。

在一些实施方式中，疫苗生成短期和长期免疫应答。通过髓样树突细胞内化HBsAg抑制共刺激分子(即B7)的上调并且抑制T细胞刺激能力(den Brouw等(2008)Immunology126：280)，并且来自慢性感染患者的树突细胞还显示在HBsAg的存在下共刺激分子的表达、IL-12的分泌、和T细胞的刺激中的不足(Zheng等，2004，J.Viral Hepatitis11：217)。

在某些实施方式中，化合物或组合物被指定为第一药剂。在某些实施方式中，方法包括施用第一药剂和一种或多种第二药剂。在某些实施方式中，方法包括施用第一药剂和一种或多种第二药剂。在某些实施方式中，第一药剂和一种或多种第二药剂被共同施用。在某些实施方式中，第一药剂和一种或多种第二药剂顺序地或伴随地被共同施用。

在某些实施方式中，一种或多种第二药剂也是本文中描述的化合物或组合物。在某些实施方式中，一种或多种第二药剂不同于本文描述的化合物或组合物。一种或多种第二药剂的实例包括但不限于抗炎剂、化学治疗剂或抗感染剂。

在其它相关的实施方式中，额外的治疗剂可以是抗HBV剂、抗HCV剂、化学治疗剂、抗菌剂、镇痛剂、非甾体抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗恶心剂、止泻剂或免疫抑制剂。

在某些实施方式中，一种或多种第二药剂是抗HBV剂。在某些实施方式中，抗HBV剂可以包括但不限于干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1(聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)、利巴韦林；HBV RNA合成抑制剂；HBV衣壳装配抑制剂；第二反义寡核苷酸；HBV治疗性疫苗；HBV预防性疫苗；拉米夫定(3TC)；恩替卡韦(ETV)；富马酸替诺福韦二吡呋酯(tenofovir diisoproxil fumarate)(TDF)；替比夫定(LdT)；阿德福韦；或HBV抗体疗法(单克隆的或多克隆的)。

在某些实施方式中，一种或多种第二药剂是抗炎剂(即，炎症降低疗法)。在某些实施方式中，炎症降低疗法可以包括但不限于治疗性生活方式改变、类固醇、NSAID或DMARD。类固醇可以是皮质类固醇。NSAID可以是阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、COX抑制剂、吲哚美辛等。DMARD可以是TNF抑制剂、嘌呤合成抑制剂、钙依赖磷酸酶抑制剂、嘧啶合成抑制剂、柳氮磺胺吡啶、氨甲喋呤等。

在某些实施方式中，一种或多种第二药剂是化学治疗剂(即，癌症治疗剂)。化学治疗剂可包括但不限于柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、阿霉素、表阿霉素、去甲氧基柔红霉素、依索比星(esorubicin)、争光霉素、马磷酰胺(mafosfamide)、异环磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、双氯乙基亚硝基脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、强的松、羟孕酮、睾酮、三苯氧胺、达卡巴嗪、甲苄肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、氨吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧环磷酰胺((4-hydroxyperoxycyclophosphoramide)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、长春新碱、长春花碱、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷、顺铂、吉西他滨和己烯雌酚(DES)。

在某些实施方式中，一种或多种第二药剂是抗感染剂。抗感染剂的实例包括但不限于抗生素、抗真菌药和抗病毒药。

在一个实施方式中，提供了用于降低感染有乙型肝炎病毒的哺乳动物中HBVmRNA、DNA、蛋白质的量和/或HBV抗原的量的方法。该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗上有效量的如上面描述的包含病毒样囊泡(VLV)的组合物，从而与治疗之前哺乳动物中HBVmRNA、蛋白质的量和HBV抗原的量相比，降低乙型肝炎病毒感染和乙型肝炎抗原。

药物组合物和制剂

本发明的高效价杂交HBV载体可以被配制为药物组合物。

这类的药物组合物可以是适合于施用至对象的形式，或者药物组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种额外的成分、或这些的一些组合。药物组合物的各种成分可以以生理学上可接受的盐的形式存在，比如与如本领域中熟知的生理学上可接受的阳离子或阴离子结合。

在一个实施方式中，对于实践本发明的方法有用的药物组合物可以被施用以递送每次免疫在10⁵和10⁹PFU之间的剂量。多次剂量可以每周、每月或由本领域技术人员确定的任意组合被施用。

在一个实施方式中，对于实践本发明的方法有用的药物组合物可以包括佐剂。由本发明考虑的适合的佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A、Detox、ISCOMs或角鲨烯。在本发明的方法中有用的药物组合物可以被适当地开发用于吸入、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、经皮、肺部、鼻内、口腔(buccal)、眼部、鞘内、静脉内或其它施用途径。其它考虑的制剂包括投射纳米颗粒(projected nanoparticle)、脂质体制剂(preparation)、包含活性成分的重新包封的红细胞、和基于免疫学的(immunologically-based)制剂。施用途径(一种或多种)对于本领域技术人员而言是容易显而易见的并且取决于许多因素，包括正被治疗的疾病的类型和严重性、正被治疗的兽或人对象的类型或年龄等。

虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于伦理施用给人的药物组合物，但是本领域技术人员应当理解这类的药物组合物通常也适合于施用给所有种类动物。为了使组合物适合于施用给各种动物，对适合于施用给人的药物组合物的修改是很好理解的，并且普通技术的兽医药理学家可以在仅进行普通实验——若有的话——的情况下设计和进行这样的修改。本发明的药物组合物考虑施用至的对象包括但不限于人、其它灵长类和哺乳动物，其包括鸡、猪、松鼠和旱獭。

本发明的药物组合物可以包括按组合物的总重量计大约0.005％到2.0％的防腐剂。防腐剂被用于在暴露于环境中污染物的情况下防止变质。

施用/给药

施用方案可以影响什么构成有效量。例如，本发明的高效价杂交病毒载体可以以单次剂量、以数次分开的剂量施用给对象，以及交错剂量可以每日或顺序地施用，或者剂量可以连续地被注入，或者可以是快速浓注。进一步，可以根据治疗或预防情形的紧急性所指示的，成比例地增加或减少剂量。

将本发明的组合物施用至对象——优选地哺乳动物，更优选地人——可以使用已知的过程以对治疗对象中的疾病有效的剂量进行，并进行对治疗对象中的疾病有效的时间段。对于实现预期结果所必需的组合物的有效量将改变并将取决于多种因素，比如待治疗或预防的疾病，正被治疗的对象的年龄、性别、体重、病况、总体健康和之前的病史，以及医药领域中熟知的类似因素。在具体的实施方式中，尤其有利的是以便于施用和剂量均匀性的剂量单位形式配制组合物。如本文所使用，剂量单位形式指的是对于待治疗的对象适合作为单一剂量的物理不连续的单位；每个单位包含被计算以产生与必需的药物载体相关联的期望治疗效果的预定量的治疗化合物。本发明的剂量单位形式由组合物和待表达的异源蛋白的独特性质以及待实现的具体治疗效果规定并且直接地取决于其。

施用途径

本领域技术人员将认识到，虽然可以使用多于一种途径进行施用，但是具体的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。本发明的任何组合物的施用途径包括吸入、口服、鼻部、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如，舌下、舌的、(经)颊、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、灌胃、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。

试剂盒

在一些实施方式中，提供试剂盒，用于治疗、预防或改善本文描述的HBV相关的疾病、紊乱或病况、或其症状，其中试剂盒包括：a)本文描述的化合物或组合物；和任选地b)本文描述的额外的药剂或疗法。试剂盒可以进一步包括使用试剂盒治疗、预防或改善HBV相关的疾病、紊乱或病况的使用说明或标签。在进一步实施方式中，本发明是用于变体HBV的测试的试剂盒。例如，这类的试剂盒可以包含来自PCR或其它核酸杂交技术(微阵列)的试剂或者用于基于免疫学的检测技术(ELISpot、ELISA)的试剂。

实施例

现在参照下面的实施例描述本发明。仅仅出于说明的目的提供这些实施例，并且本发明绝不应当被解释为限制于这些实施例，而是应当被解释为包含由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有的变型。

在没有进一步描述的情况下，认为使用前面的描述和下面的说明性实施例，本领域普通技术人员可以制造和利用本发明的化合物并且实践要求保护的方法。因此，下面的实验实施例具体地指出了本发明的优选实施方式，并且不被解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。

现在描述在本文公开的实验中采用的材料和方法。

材料和方法

细胞系、杂交水泡性口炎病毒/Semliki病毒疫苗载体(VLV)生成。

将仓鼠BHK-21(BHK)上皮细胞在补充有10％胎牛血清、50U/ml青霉素和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium)(DMEM)中维持。

HBcAg和MHBs的开放阅读框从pHBV2质粒(血清型ayw)PCR扩增，引入上游Pac1和下游Sbf1位点用于定向克隆。使用的引物包括下列：对于HBcAg(核心)，5’-GAT CGA TCT TAATTA AAA TGG ACA TCG ACC CTT ATA AAG ATT TG-3’(正向，SEQ ID NO：1)和5’-GAT CGATCC CTG CAG GAC ATT GAG ATT CCC GAG ATT GAG ATC-3’(反向，SEQ ID NO：2)；并且对于MHBs，5’-GAT CGA TCT TAA TTA AAA TGC AGT GGA ATT CCA CAA CCT TC-3’(正向，SEQ IDNO：3)和5’-GAT CGA TCC CTG CAG GAA TGT ATA CCC AAA GAC AAA AGA AAA TTG-3’(反向，SEQ ID NO：4)。在用酶Pac1和Sbf1酶切之后，将PCR产物克隆入质粒pCMV-SFVT2AG以分别产生pCMV-SFVHBcT2AG和pCMV-SFVmST2AG。pCMV-SFVT2AG是源自pCMV-SFVG-p50R载体(SEQ ID NO：5，在本文的其它地方——实施例部分的结尾处——提供)的质粒，该pCMV-SFVG-p50R载体已经在SFV次基因组RNA启动子下游工程化有Pac1至Sbf1克隆位点。该质粒还编码位于克隆位点下游但是位于印第安纳血清型VSV糖蛋白(VSV G)上游的核糖体T2A跳跃位点。编码新泽西血清型VSV糖蛋白(pCMV-SFVT2AGNJ)的类似质粒也被用于克隆，以便于产生表达HBV蛋白和替代(alternate)糖蛋白的病毒样囊泡(VLV)。通过分别用质粒pCMV-SFVmST2AG、pCMV-SFVHBcT2AG或pCMV-SFVmST2AGNJ转染BHK细胞，回收VLV-MHBs(印第安纳血清型)、VLV-HBcAg或VLV_NJ-MHBs。对于VLV回收，根据制造商方案使用Lipofectamine(Invitrogen)和Opti-MEM培养基，利用10μg质粒转染在10cm盘中的BHK-21细胞(2x10⁶个细胞)。在5小时之后，用10mL Dulbecco改良伊格尔培养基(DMEM)加5％FBS替换转染培养基。然后将细胞在37℃、5％CO₂下孵育48小时。然后收集上清液。在一些情况下，VLV通过100kDaUltra filter(EMD Millipore Corporation)离心浓缩。等分试样在-80℃下储存。

间接免疫荧光

VLV原液的效价根据先前描述的(Rose等，2008，PNAS 105：5839-43)进行测定。简言之，将原液连续地稀释并将其用于感染在盖玻片上接种的BHK-21细胞持续21小时。然后，细胞用3％多聚甲醛固定并且用一次抗体对细胞的VSV糖蛋白进行染色，然后用AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen)染色。感染细胞的荧光噬斑然后被计数并且计算效价。对于HBV蛋白的免疫荧光，细胞用SFVG41-MHBs或SFVG41-HBcAg转染，并用3％多聚甲醛固定，然后用HBV核心(Dako)或preS2(Santa Cruz Biotechnology)的抗体对细胞进行染色。使用适合的二次抗体并且使用装配有CoolSnap EZ数码相机的NikonEclipse 80i显微镜对细胞拍摄图像。

免疫组织化学法

肝脏组织被收集并在10％福尔马林磷酸盐缓冲液(Fisher Scientific)中固定。在石蜡包埋之后，使用抗核心多克隆兔抗体(Dako)，通过由Yale University ResearchHistology执行的免疫组织化学染色来检测HBV核心。

蛋白质印迹

BHK-21细胞用VLV-MHBs或VLV-HBcAg(MOI为10)感染24小时。细胞然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并用2x SDS样本缓冲液裂解。将样本在10％SDS凝胶上运行，转移至硝化纤维膜，用抗preS2(Santa Cruz Biotechnology)、抗核心(Dako)、抗VSV或抗肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology)抗体探测，然后使用化学发光利用二次抗体检测。

T细胞试验

γ干扰素(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISPOT)实验(set)(BD Biosciences)用于根据制造商方案量化HBV特异性T细胞应答。简言之，在免疫/攻击后第7天，使小鼠安乐死并收集脾脏。使脾细胞通过70-μm粗滤器(strainer)(BD Falcon)并用ACK裂解缓冲液(Lonza)处理来纯化。细胞用Hanks平衡盐溶液(HBSS；Invitrogen)洗涤，悬浮在补充有10％胎牛血清、100μg/ml青霉素和2mM 1-谷氨酰胺的DMEM中，并在包被有纯化的抗小鼠IFN-γ抗体(1∶200)的96孔板中以2×10⁵个细胞/孔接种。然后利用HBV特异性肽(MHBs和HBcAg，下面的表1)以10μg/ml的浓度在37℃下刺激细胞过夜。使用PBS-吐温(0.05％[体积/体积])从板洗涤细胞，并且使用补充有10％胎牛血清、100μg/ml青霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM，在25℃下加入提供的生物素化抗小鼠IFN-γ抗体(1∶250)持续2h。在洗涤之后，将链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)(1∶100)加入到孔中并在25℃下孵育1h。在最终洗涤之后，将3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)色原-底物(BD Biosciences)加入到孔中并且使其在25℃下显色20到40min。加入将蒸馏水以停止反应，并且使板风干，然后计算形成斑点的细胞(SFC)。

表1：HBV包膜和核心CD8 T细胞表位。

小鼠

自Jackson Labs(Farmington，CT)获得六至八周龄的C57BL/6 x Balb/c F1(CB6F1J)小鼠。对于转基因(Tg)小鼠实验，将1.3.32 HBV Tg小鼠(15)和Balb/c小鼠(Charles River；Wilmington，MA)杂交(cross)一代以获得HBV.CB6F1小鼠。在5-6周时筛选小鼠的血清HBeAg水平作为转基因表达的量度。

免疫和攻击方案

用10⁷免疫荧光单位(IFU)的VLV-MHBs或VLV-HBcAg、10⁷PFU的VSV-MHBs或50μg的pCMV-S2.S肌肉内免疫小鼠。在一些情况下，在免疫之后4周时用10⁷PFU的VSV-MHBs、VLV-MHBs或VLV_NJ-MHBs加强小鼠。

对于攻击研究，使免疫的小鼠保持6周，然后使用流体动力学转染方案攻击，该方案包括以等于其体重9％的PBS的体积将10μg的pHBV1.3注入小鼠的尾静脉(Yang等，2002)。在攻击后第1、4和7天收集血清并通过HBeAg ELISA(International Immuno-Diagnostics)使用血清监测HBeAg水平。

ELISA

为了检测对MHBs和HBcAg的抗体应答和血清HBeAg水平，根据制造商方案——在FBS中以1∶50稀释血清样本，进行酶联免疫吸附测定(ELISA，InternationalImmunodiagnostics)。

肝内白细胞的分离

根据先前描述的(Cobleigh等，2010，Journal of virology 84：7513-7522)对肝内白细胞进行分离。简言之，使肝块通过70μm孔的粗滤器，并且利用0.5mg/mL胶原酶D(Roche)在37℃下处理所得悬浮液30min。然后用HBSS洗涤细胞，将细胞重新悬浮在44％Percoll的HBSS中(体积/体积)，并且在56％Percoll的PBS中(体积/体积)分层。在以850 xg离心梯度物(gradient)30min之后，收集处于中间相的细胞。细胞然后用HBSS洗涤并且重新悬浮在DMEM中用于进一步分析。

HBV RNA和DNA分析

在攻击之后，通过RNA和DNA印迹分析检测HBV RNA和DNA。来自肝脏的总基因组DNA根据先前描述的(Guidotti等，1995)进行纯化。然后通过利用HindIII酶切30μg的总肝脏DNA并将其在琼脂糖凝胶上分离，进行DNA印迹分析。对于RNA印迹分析，根据制造商的方案使用RNeasy minikit(Qiagen)对总肝脏RNA进行分离。通过琼脂糖(包含5％甲醛)凝胶电泳分离变性的RNA(20μg)。使用利用10×SSC(0.15M NaCl以及0.015M柠檬酸钠)的毛细管转移方法，将核酸转移至尼龙膜过夜。然后，核酸通过UV辐射被交联至膜并且被杂交至探针，该探针由具有32P标记的dCTP的3.2-kb HBV DNA和Roche随机引物(random-primed)DNA标记试剂盒制备。使用PhosophorImager(Fuji)检测信号。

统计学数据分析

使用学生T检验测定正常小鼠和转基因小鼠中CD8 T细胞应答的显著差别。＜0.05的P值被认为是统计学上显著的。

MHBS和HBcAg DNA的核苷酸序列在下面列出：

MHBs(5’-3’)(SEQ ID NO：6)

TTAATTAAAATGCAGTGGAATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCTGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACAACCAGCACGGGACCATGCCGGACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTA

CTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT

ATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCG

CTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTCCTGCAGGAG

灰色＝限制酶切位点

HBcAg(5’-3’)(SEQ ID NO：7)

TTAATTAAAATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCGTCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACAGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTCCTGCAGGAG

灰色＝限制酶切位点

MHBS和HBcAg蛋白的氨基酸序列在下面列出：

MHBs(SEQ ID NO：8)

MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVLTTASPLSSIFSRIGDPALNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI

HBcAg(SEQ ID NO：9)

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC

现在在下面的实施例中描述实验结果。

实施例1：大量传代生成高效价VLV。

为了在通过在组织培养物中大量传代进化之后生成生长至高效价的VLV，使用在图1A-1B中图解的起始DNA构建体。使用该构建体生成的SFV复制子从第一次基因组启动子表达VSV G和从第二启动子表达SFV衣壳蛋白。来自该构建体的感染颗粒被获得并发现为展示低效价(～10⁵感染单位/ml)的典型VLV。VLV在BHK细胞上的传代在一年的时期内继续以确定是否可能进化颗粒，其生长至更高效价。在初始传代中，将来自显示细胞病变效应(CPE)的细胞的5％的培养基转移至6cm盘上的新鲜BHK细胞上，并且强的CPE然后发展3-5天。SFV衣壳蛋白的表达通过八次传代完全失去，这表明其表达抑制颗粒产生。继续传代，注意到在少于24小时内增加的颗粒效价和更快速的CPE发展。通过50次传代，VLV已经进化为达到＞5x10⁷i.u./ml的效价并且在两天后它们在BHK细胞上形成可变大小的可视噬斑。此时，大的噬斑被选择并被用于生成将随后被称为“p50VLV”的克隆VLV原液。该p50VLV生长至大约5 x 10⁸pfu/ml的效价，超过起始载体增加了大约1000倍。

实施例2：p50 VLV基因组的序列

为了测定p50 VLV基因组的共有序列，进行逆转录和PCR以生成覆盖整个基因组的重叠DNA片段，然后对这些片段进行测序。装配的序列显示了1672个核苷酸的大缺失(在位于核苷酸13333和13334之间的载体缺失中)，其已经移除第二SFV启动子、整个衣壳基因、和除了poly(A)之前的187个核苷酸之外的全部SFV序列(图1A-1B)。

除了该缺失之外，在下表2中列举了16个单个碱基改变。这些中的十个改变所有四种SFV非结构蛋白中的氨基酸，一个改变VSV G中的氨基酸，和四种突变是沉默的(图1A-1B，表2)。

表2：p50VLV中的核苷酸和氨基酸改变

高效价杂交病毒载体的核苷酸序列：pCMV-SFVG-p50R(其被称为SEQ ID NO：5)在本文的其它地方(实施例部分的结尾处)提供。

实施例3：VLV构建和表达

HBV(ayw血清型)核心抗原(HBcAg)的开放阅读框和HBV包膜蛋白的中蛋白译本(version)(MHBs)使用PCR扩增，分别在5’和3’末端上添加Pac1和Sbf1的克隆位点。然后将基因克隆入质粒pCMV-SFVT2AG以分别产生pCMV-SFVHBcT2AG和pCMV-SFVmST2AG。pCMV-SFVT2AG是源自pCMV-SFVG-P50R的质粒，pCMV-SFVG-P50R已经在SFV次基因组RNA启动子下游工程化有Pac1至Sbf1克隆位点。该质粒还编码位于克隆位点下游但是位于印第安纳血清型VSV糖蛋白(VSV G)上游的核糖体T2A跳跃位点(Doronina等，2008，Molecular andcellular biology 28：4227-4239)(图2A)。编码新泽西血清型VSV糖蛋白(pCMV-SFVT2AGNJ)的类似质粒也被用于克隆，以便于产生表达HBV蛋白和替代糖蛋白的病毒样囊泡(VLV)。

在克隆入VLV载体骨架之后，回收VLV，并且测定HBV蛋白的表达。在VLV质粒的最初转染之后，进行间接免疫荧光以确定蛋白质是否被表达。事实上，VLV质粒的转染导致MHBs或HBcAg的表达(图2C)。接下来，确定回收的VLV在感染之后是否可以表达HBV蛋白。与转染数据一致，HBcAg和多种糖基化形式的MHBs(图2B)二者都容易地被检测到。另外地，还观察到在用生成的VLV感染之后VSV糖蛋白的强表达(图1C)。通常回收高于10⁸IFU/mL的效价的VLV。

实施例4：载体和免疫的生成

生成VLV载体，其表达乙型肝炎表面中蛋白(MHBs)(VLV-MHBs)或核心抗原乙型肝炎抗原(HBcAg)(图2)。这些载体诱导HBV抗原特异性CD8 T细胞应答的能力在小鼠中被检查。用1x10⁷噬斑形成单位(PFU)的VLV-MHBs或VLV-HBcAg肌肉内免疫动物，使用与已知的MHBs或HBcAg CD8 T细胞表位对应的肽通过IFN-γELISpot试验在7天后测量CD8 T细胞应答(图3A)。对VLV-MHBs免疫的小鼠中的四种MHBs表位特异性地引发CD8 T细胞应答(图3A)。相比之下，在VLV-HBcAg免疫的小鼠中，对HBcAg没有生成通过该试验可测量的应答。

虽然尚不清楚对HBV的抗体应答对于有效的治疗性疫苗是否是必需的，但是抗HBV应答可以潜在地在中和游离病毒并因而预防宿主肝细胞的感染或再感染中起作用。为了确定VLV疫苗是否能够引起HBV特异性抗体应答，如上所述对小鼠免疫。在免疫后30天时，通过ELISA检查血清HBs或HBcAb水平。与T细胞应答相比，VLV-MHBs免疫不引起可检测的HBsAb应答(图3B)。相比之下，利用VLV-HBcAg免疫确实引起对HBcAg特异性的抗体，但是这些应答不与表达HBcAg的VSV载体一样高(VSV-HBcAg；图3B)。总的来说，这些数据表明VLV疫苗平台能够表达可以引起HBV特异性免疫应答的HBV蛋白。

实施例5：由VLV-MHBs引起的CD8 T细胞在急性HBV感染模型中是保护性的。

为了确定由VLV-MHBs诱导的CD8 T细胞是否将是保护性的，使用模拟急性HBV感染的HBV流体动力学注入方案(Yang等，2002，PNAS 99：13825-13830)。该模型包括以近似等于小鼠体重的9％的体积将HBV 1.3基因组长度DNA表达质粒注入小鼠的尾静脉。该容量超负荷迫使通过小鼠的肝细胞摄取DNA，并且因而导致HBV蛋白和复制中间体的表达。因为在该方案中不存在病毒进入步骤，所以保护依赖于T细胞介导的机制来清除HBV感染。利用DMEM、10⁷IFU的VLV-MHBs或VLV-HBcAg、或10⁷PFU的VSV-MHBs或VSV-HBcAg对小鼠免疫。在免疫后六周时，进行流体动力学注入，并且监测小鼠的HBV复制。

为了检查攻击后HBV蛋白表达，检查血清中的HBeAg表达和肝脏中的HBcAg表达。在所有的小鼠中，血清HBeAg水平在攻击后的第1天显著地增加。在未免疫的或用VLV-HBcAg免疫的小鼠中，HBeAg在第4天时继续增加，然后在攻击后第7天时趋向平稳。但是，在用VLV-MHBs免疫的小鼠中，血清HBeAg在第4天时降低并且在攻击后第7天时变得几乎检测不到(图4A)。肝脏中的HBcAg水平在攻击后第7天通过免疫组织化学法测定。与检测的HBeAg水平一致，与未免疫的或VLV-HBcAg免疫的小鼠相比，表达HBcAg的肝细胞的数目在用VLV-MHBs免疫的小鼠中显著降低(图4B)。

接下来，肝脏中的HBV RNA和DNA的水平分别通过RNA和DNA印迹检查。这些分析表明VLV-MHBs完全保护小鼠免于HBV复制(图4C)。有趣的是，通过VLV-MHBs免疫证实的保护水平与对于VSV-MHBs——诱导非常强的HBV特异性免疫应答的载体——观察到的保护水平相似。与它们不能诱导T细胞应答一致，VLV-和VSV-HBcAg载体不保护小鼠免受攻击(图4C)。

最后，由于CD8 T细胞在该模型中可能负责清除，因此通过对脾细胞(图4D)和肝内白细胞(图4E)二者在攻击之后七天执行IFN-γELISPOT试验来测量T细胞回忆应答。结果表明对测试的4种表位中的至少2种产生强的CD8 T细胞应答。重要的是，这些应答比在初次免疫之后诱导的应答强大约5倍(比较图4D与图3A)。这些结果暗示VLV-MHBs颗粒诱导可以在HBV攻击期间被回忆和扩展的记忆T细胞。而且，这些结果表明由VLV-MHBs诱导的T细胞能够在不存在可检测抗体的情况下在该模型中控制HBV感染。

实施例7：在利用VLV-MHBs、VLV-rDNA或VLV-rHBsAg免疫之后，CD8 T细胞介导对四种MHBs表位的应答。

将在用VLV-MHBs免疫的小鼠中的MHBs与用表达MHBs或重组HBsAg蛋白(rHBsAg)的重组DNA(rDNA)免疫的小鼠中的MHBs之间的CD8 T细胞应答进行比较(图6)。用1x10⁷PFU的VLV-MHBs、50μg的rDNA或10μg的rHBsAg肌肉内免疫小鼠，并且在七天之后测量对四种MHBs表位的CD8 T细胞应答。用对照PBS或rDNA免疫的小鼠不引起可检测的应答。虽然小鼠的子集对HBsAg蛋白免疫响应，但是由VLV-MHBs免疫诱导的CD8 T细胞应答通常在量级方面更大并且在特异性方面更广。因此，与rDNA或rHBsAg相比，在小鼠中由VLV-MHBs生成的CD8 T细胞应答是可更加一致检测的并且通常更强。而且，在检测到应答的小鼠中，应答针对利用VLV-MHBs免疫的小鼠中的更多表位(图6)。这些数据表明VLV-MHBs免疫与其它测试的免疫策略相比引起更多的CD8 T细胞应答。

实施例8：初免-加强方案中的组合免疫策略提高HBV特异性免疫应答。

虽然VLV-MHBs颗粒以单次剂量引起保护性T细胞应答，但是在慢性感染期间克服免疫耐受性可能需要多次免疫。重要的是，VSV G蛋白的抗体将可能中和相同血清型的VLV加强载体。因此，为了使用VLV疫苗平台研究初免-加强策略，首先生成额外的VLV构建体。该构建体也表达MHBs，但是VSV G蛋白(印第安纳血清型)被替换为新泽西血清型VSV G(VLV_NJ-MHBs；图7A)。在构建VLV_NJ-MHBs之后，进行初免-加强实验，用VLV-MHBs或50μg表达MHBs的DNA质粒(pCMV-S2.S)肌肉内初免。然后，4周后用VLV-HBcAg、VLV-MHBs或VLV_NJ-MHBs加强小鼠。加强后7天，通过进行IFN-γELISPOT试验分析CD8 T细胞应答。如所预期的，用VLV-HBcAg或VLV-MHBs加强不诱导可测量的应答(图7B)。用VLV_NJ-MHBs加强确实产生可测量的HBV特异性应答；但是，观察到的应答不大于用VLV-MHBs免疫观察到的初次应答，这暗示加强是无效的。用DNA初免然后用VLV-MHBs加强倾向于产生比对于单独初次免疫观察到的应答更大的应答(图7B)。这些结果暗示，组合免疫策略可以诱导比使用单独的VLV更强的T细胞应答。

为了进一步研究异源的初免-加强策略，进行将VLV接种疫苗与VSV接种疫苗组合的初免-加强实验。在该实验中，小鼠用VLV-MHBs、VLV_NJ-MHBs或VSV-MHBs的不同组合初免和加强(图7C)。组合VLV_NJ-MHBs免疫与VSV-MHBs免疫导致HBV特异性T细胞的显著增加。重要的是，进行VLV_NJ-MHBs初免然后VSV-MHBs加强与任何其它免疫方案相比产生了大超过3倍的T细胞应答。总之，这些数据表明在初免-加强方案中组合异源免疫策略可以导致HBV特异性CD8 T细胞细胞应答的显著提高。

实施例9：VLV-MHBs免疫诱导慢性感染模型中的CD8 T细胞应答。

为了测试VLV-MHBs免疫的治疗潜力，1.3.32HBV转基因小鼠被用作慢性感染模型。这些小鼠表达可变水平的HBV转基因，其可以通过血清HBeAg水平测量(Guidotti等，1995，Journal of virology 69：6158-6169)。HBV治疗性接种疫苗可能可以与其它治疗形式比如抗病毒药或其它免疫调节药物组合使用。为了模拟可能存在于接受长期抗病毒疗法的人中的较低抗原负载，对HBeAg^低小鼠免疫。利用VLV-MHBs的单一免疫不诱导任何HBV特异性免疫应答。但是，利用DNA初免然后利用VLV-MHBs加强确实诱导对至少一种表位的T细胞应答(图8)。虽然免疫应答在HBeAg^低小鼠中被检测到，但是VLV-MHBs接种疫苗不引起HBeAg^高小鼠中的T细胞应答。这些结果暗示，VLV接种疫苗与其它治疗策略组合来降低抗原血症可以代表HBV免疫疗法的新途径。

实施例10：基于VLV的疫苗的优势

与当前可利用的HBV疫苗或其它潜在的基于病毒的疫苗载体相比，基于VLV的疫苗具有许多优势。这些优势包括但不限于：a)以单次剂量诱导长效免疫的潜力；b)在人群中缺乏对载体成分的预先存在的免疫；c)与重组蛋白或DNA疫苗相比，增加的T细胞生成潜能；d)与其它病毒疫苗载体相比，增加的安全性；和e)相对易于生产。

在HBV流体动力学攻击期间，在用VLV-MHBs免疫的小鼠中观察到HBV复制的显著降低。但是，与用VSV-MHBs免疫的小鼠不同，在通过注入而诱导之后，没有观察到丙氨酸转氨酶(ALT)水平的显著升高。该结果与缺乏组织病理学组合暗示了非细胞溶解(noncytolytic)机制可以在清除中起重要作用。考虑到非细胞溶解方法是HBV清除的重要模式和T细胞的细胞溶解功能可以通常介导疾病发病机理(Guidotti等，1996，Immunity4：25-36；Thimme等，2003，Journal of virology 77：68-76)，在VLV-MHBs免疫的小鼠中不存在可观察到的肝脏疾病暗示该疫苗不诱导过度的病原性免疫应答。

加强策略的目的是对特定抗原扩展记忆T细胞库。通常在加强期间，可以观察到比初次应答强的二次应答。但是，出人意料地，用血清型开关(switch)VLV构建体加强导致与对VLV-MHBs的初次应答相似量级的CD8 T细胞应答(图8)。该结果的一种可能性是利用VLV-MHBs的单一免疫不诱导能够被加强的记忆应答。但是，由于在免疫后6周时观察到保护和T细胞扩展，因此VLV-MHBs可能诱导持久的记忆应答。然而，可能的是记忆发育的动力学可能没有考虑在免疫后4周的最佳加强。事实上，在VLV接种后抗原持续多久——其是可以影响记忆T细胞发育的因素——是未知的(Kaech等，2002，Nature reviews，Immunology 2：251-262)。可选地，二次扩展的动力学可以使得在加强后1周时的分析不精确地反映峰值应答。最后，用较弱的VLV(VLV_NJ-MHBs)初免并用更多免疫原性的VLV-MHBs加强可以提高应答，因为递送较少免疫原性疫苗作为初免的这种概念通常增强初免加强免疫接种途径。这些因素的进一步分析可以改善或者更精确地反映加强后的CD8T细胞应答。

小结：

总的来说，本发明的表达MHBs的VLV疫苗证实了病毒疫苗系统与其它疫苗策略组合可以导致有效的HBV治疗。虽然进一步优化可能有益于该疫苗策略，但是在其它临床前模型中的研究可以突出VLV系统的潜力。而且，VLV系统诱导转基因小鼠的致耐受性环境中应答的能力暗示当设计用于其它病原体的疫苗时，该系统将可能是有用的。事实上，VLV已经显示了在HIV领域中的希望(Rose等，2008，PNAS 105：5839-5843；Schell等，2011，Journalof virology 85：5764-5772)。用于其它病原体和疾病的疫苗的进一步研究可以突出VLV疫苗系统的通用性和可用性。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其全部被被并入本文。

虽然已经参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是本发明的其它实施方式和变型可以由本领域其它技术人员设计而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求书意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等价变型。

高效价杂交病毒载体的核苷酸序列(5’-3’)：pCMV-SFVG-p50R(SEQ ID NO：5)

5’-CTAGTGCATCCAAAGAATTCAAAAAGCTTCTCGAGAGTACTTCTAGAGCGGCCGCGCATCGATTTTCCACCCGGGTGGGGTACCAGGTAAGTGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAGATCCAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCACAGTCCCAAGGCTCATTTCAGGCCCCTCAGTCCTCACAGTCTGTTCATGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCTAGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCTCAGGTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCGCTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGACAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCAGGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGATCGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATCGGCAGTGCGCCTTCCAGGAGAATGATGTCTACGCACAAATACCACTGCGTATGCCCTATGCGCAGCGCAGAAGACCCCGAAAGGCTCGTATGCTACGCAAAGAAACTGGCAGCGGCCTCCGAGAAGGTGCTGGATAGAGAGATCGCAGGAAAAATCACCGACCTGCAGACCGTCATGGCTACGCCAGACGCTGAATCTCCTACCTTTTGCCTGCATACAGACGTCACGTGTCGTACGGCAGCCGAAGTGGCCGTATACCAGGAC GTGTATGCTGTACATGCACCAACATCGCTGTACCATCAGGCGATGAAAGGTGTCAGAACGGCGTATTGGATTGGGTTTGACACCACCCCGTTTATGTTTGACGCGCTAGCAGGCGCGTATCCAACCTACGCCACAAACTGGGCCGACGAGCAGGTGTTACAGGCCAGGAACATAGGACTGTGTGCAGCATCCTTGACTGAGGGAAGACTCGGCAAACTGTCCATTCTCCGCAAGAAGCAATTGAAACCTTGCGACACAGTCATGTTCTC GGTAGGATCTACATTGTACACTGAGAGCAGAAAGCTACTGAGGAGCTGGCACTTACCCTCCGTATTCCACCTGAAAGGTAAACAATCCTTTACCTGTAGGTGCGATACCATCGTATCATGTGAAGGGTACGTAGTTAAGAAAATCACTATGTGCCCCGGCCTGTACGGTAAAACGGTAGGGTACGCCGTGACGTATCACGCGGAGGGATTCCTAGTGTGCAAGACCACAGACACTGTCAAAGGAGAAAGAGTCTCATTCCCTGTATGCACCTACGTCCCCTCAACCATCTGTGATCAAATGACTGGCATACTGGCGACCGACATCACACCGGAGGACGCACAGAAGTTGTTAGTGGGATTGAATCAGAGGATAGTTGTGAACGGAAGAACACAGCGAAACACTAACACGATGAAGAACTATCTGCTTCCGATTGTGGCCGTCGCATTTAGCAAGTGGGCGAGGGAATACAAGGCAGACCTTGATGATGAAAAACCTCTGGGTGTCCGAGAGAGGTCACTTACTTGCTGCTGCTTGTGGGCATTTAAAACGAGGAAGATGCACACCATGTACAAGAAACCAGACACCCAGACAATAGTGAAGGTGCCTTCAGAGTTTAACTCGTTCGTCATCCCGAGCCTATGGTCTACAGGCCTCGCAATCCCAGTCAGATCACGCATTAAGATGCTTTTGGCCAAGAAGACCAAGCGAGAGTCAATACCTGTTCTCGACGCGTCGTCAGCCAGGGATGCTGAACAAGAGGAGAAGGAGAGGTTGGAGGCCGAGCTGACTAGAGAAGCCTTACCACCCCTCGTCCCCACCGCGCCGGCGGAGACGGGAGTCGTCGACGTCGACGTTGAAGAACTAGAGTATCACGCAGGTGCAGGGGTCGTGGAAACACCTCGCAGCGCGTTGAAAGTCACCGCACAGCCGAACGGCGTACTACTAGGAAATTACGTAGTTCTGTCCCCGCAGACCGTGCTCAAGAGCTCCAAGTTGGCCCCCGTGCACCCTCTAGCAGAGCAGGTGAAAATAATAACACATAACGGGAGGGCCGGCCGTTACCAGGTCGACGGATATGACGGCAGGGTCCTACTACCATGTGGATCGGCCATTCCGGTCCCTGAGTTTCAAGCTTTGAGCGAGAGCGCCACTATGGTGTACAACGAAAGGGAGTTCGTCAACAGGAAACTATACCATATTGCCGTTCACGGACCGTCGCTGAACACCGACGAGGAGAACTACGAGAAAGTCAGAGCTGAAAGAACTGACGCCGAGTACGTGTTCGACGTAGATAAAAAATGCTGCGTCAAGAGAGAGGAAGCGTCGGGTTTGGTGTTGGTGGGAGAGCTAACCAACCCCCCGTTCCATGAATTCGCCTACGAAGGGCTGAAGATCAGGCCGTCGGCACCATATAAGACTACAGTAGTAGGAGTCTTTGGGGTTCCGGGATCAGGCAAGTCTGCTATTATTAAGAGCCTCGTGACCAAACACGATCTGGTCACCAGCGGCAAGAAGGAGAACTGCCAGGAAATAGTCAACGACGTGAAGAAGCACCGCGGACTGGACATCCAGGCAAAAACAGTGGACTCCATCCTGCTAAACGGGTGTCGTCGTGCCGTGGACATCCTATATGTGGACGAGGCTTTCGCTTGCCATTCCGGTACTCTGCTAGCCCTAATTGCTCTTGTTAAACCTCGGAGCAAAGTGGTGTTATGCGGAGACCCCAAGCAATGCGGATTCTTCAATATGATGCAGCTTAAGGTGAACTTCAACCACAACATCTGCACTGAAGTATGTCATAAAAGTATATCCAGACGTTGCACGCGTCCAGTCACGGCCATCGTGTCTACATTGCACTACGGAGGCAAGATGCGCACGACCAACCCGTGCAACAAACCCATAATCATAGACACCACAGGACAGACCAAGCCCAAGCCAGGAGACATCGTGTTAACATGCTTCCGAGGCTGGGTAAAGCAGCTGCAGTTGGACTACCGTGGACACGAAGTCATGACAGCAGCAGCATCTCAGGGCCTCACCCGCAAAGGGGTATACGCCGTAAGGCAGAAGGTGAATGAAAATCCCTTGTATGCCCCTGCGTCGGAGCACGTGAATGTACTGCTGACGCGCACTGAGGATAGGCTGGTGTGGAAAACGCTGGCCGGCGATCCCTGGATTAAGGTCCTATCAAACATTCCACAGGGTAACTTTACGGCCACATTGGAAGAATGGCAAGAAGAACACGACAAAATAATGAAGGTGATTGAAGGACCGGCTGCGCCTGTGGACGCGTTCCAGAACAAAGCGAACGTGTGTTGGGCGAAAAGCCTGGTGCCTGTCCTGGACACTGCCGGAATCAGATTGACAGCAGAGGAGTGGAGCACCATAATTACAGCATTTAAGGAGGACAGAGCTTACTCTCCAGTGGTGGCCTTGAATGAAATTTGCACCAAGTACTATGGAGTTGACCTGGACAGTGGCCTGTTTTCTGCCCCGAAGGTGTCCCTGTATTACGAGAACAACCACTGGGATAACAGACCTGGTGGAAGGATGTATGGATTCAATGCCGCAACAGCTGCCAGGCTGGAAGCTAGACATACCTTCCTGAAGGGGCAGTGGCATACGGGCAAGCAGGCAGTTATCGCAGAAAGAAAAATCCAACCGCTTTCTGTGCTGGACAATGTAATTCCTATCAACCGCAGGCTGCCGCACGCCCTGGTGACTGAGTACAAGACGGTTAAAGGCAGTAGGGTTGAGTGGCTGGTCAATAAAGTAAGAGGGTACCACGTCCTGCTGGTGAGTGAGTACAACCTGGCTTTGCCTCGACGCAGGGTCACTTGGTTGTCACCGCTGAATGTCACAGGCGCCGATAGGTGCTACGACCTAAGTTTAGGACTGCCGGCTGACGCCGGCAGGTTCGACTTGGTCTTTGTGAACATTCACACGGAATTCAGAATCCACCACTACCAGCAGTGTGTCGACCACGCCATGAAGCTGCAGATGCTTGGGGGAGATGCGCTACGACTGCTAAAACCCGGCGGCAGCCTCTTGATGAGAGCTTACGGATACGCCGATAAAATCAGCGAAGCCGTTGTTTCCTCCTTAAGCAGAAAGTTCTCGTCTGCAAGAGTGTTGCGCCCGGATTGTGTCACCAGCAATACAGAAGTGTTCTTGCTGTTCTCCAACTTTGACAACGGAAAGAGACCCTCTACGCTACACCAGATGAATACCAAGCTGAGTGCCGTGTATGCCGGAGAAGCCATGCACACGGCCGGGTGTGCACCATCCTACAGAGTTAAGAGAGCAGACATAGCCACGTGCACAGAAGCGGCTGTGGTTAACGCAGCTAACGCCCGTGGAACTGTAGGGGATGGCGTATGCAGGGCCGTGGCGAAGAAATGGCCGTCAGCCTTTAAGGGAGAAGCAACACCAGTGGGCACAATTAAAACAGTCATGTGCGGCTCGTACCCCGTCATCCACGCTGTAGCGCCTAATTTCTCTGCCACGACTGAAGCGGAAGGGGACCGCGAATTGGCCGCTGTCTACCGGGCAGTGGCCGCCGAAGTAAACAGACTGTCACTGAGCAGCGTAGCCATCCCGCTGCTGTCCACAGGAGTGTTCAGCGGCGGAAGAGATAGGCTGCAGCAATCCCTCAACCATCTATTCACAGCAATGGACGCCACGGACGCTGACGTGACCATCTACTGCAGAGACAAAAGTTGGGAGAAGAAAATCCAGGAAGCCATAGACACGAGGACGGCTGTGGAGTTGCTCAATGATGACGTGGAGCTGACCACAGACTTGGTGAGAGTGCACCCGGACAGCAGCCTGGTGGGTCGTAAGGGCTACAGTACCACTGACGGGTCGCTGTACTCGTACTTTGAAGGTACGAAATTCAACCAGGCTGCTATTGATATGGCAGAGATACTGACGTTGTGGCCCAGACTGCAAGAGGCAAACGAACAGATATGCCTATACGCGCTGGGCGAAACAATGGACAACATCAGATCCAAATGTCCGGTGAACGATTCCGATTCATCAACACCTCCCAGGACAGTGCCCTGCCTGTGCCGCTACGCAATGACAGCAGAACGGATCACCCGCCTTAGGTCACACCAAGTTAAAAGCATGGTGGTTTGCTCATCTTTTCCCCTCCCGAAATACCATGTAGATGGGGTGCAGAAGGTAAAGTGCGAGAAGGTTCTCCTGTTCGACCCGACGGTACCTTCAGTGGTTAGTCCGCGGAAGTATGCCGCATCTACGACGGACCACTCAGATCGGTCGTTACGAGGGTTTGACTTGGACTGGACCACCGACTCGTCTTCCACTGCCAGCGATACCATGTCGCTACCCAGTTTGCAGTCGTGTGACATCGACTCGATCTACGAGCCAATGGCTCCCATAGTAGTGACGGCTGACGTACACCCTGAACCCGCAGGCATCGCGGACCTGGCGGCAGATGTGCATCCTGAACCCGCAGACCATGTGGACCTCGAGAACCCGATTCCTCCACCGCGCCCGAAGAGAGCTGCATACCTTGCCTCCCGCGCGGCGGAGCGACCGGTGCCGGCGCCGAGAAAGCCGACGCCTGCCCCAAGGACTGCGTTTAGGAACAAGCTGCCTTTGACGTTCGGCGACTTTGACGAGCACGAGGTCGATGCGTTGGCCTCCGGGATTACTTTCGGAGACTTCGACGACGTCCTGCGACTAGGCCGCGCGGGTGCATATATTTTCTCCTCGGACACTGGCAGCGGACATTTACAACAAAAATCCGTTAGGCAGCACAATCTCCAGTGCGCACAACTGGATGCGGTCGAGGAGGAGAAAATGTACCCGCCAAAATTGGATACTGAGAGGGAGAAGCTGTTGCTGCTGAAAATGCAGATGCACCCATCGGAGGCTAATAAGAGTCGATACCAGTCTCGCAAAGTGGAGAACATGAAAGCCACGGTGGTGGACAGGCTCACATCGGGGGCCAGATTGTACACGGGAGCGGACGTAGGCCGCATACCAACATACGCGGTTCGGTACCCCCGCCCCGTGTACTCCCCTACCGTGATCGAAAGATTCTCAAGCCCCGATGTAGCAATCGCAGCGTGCAACGAATACCTATCCAGAAATTACCCAACAGTGGCGTCGTACCAGATAACAGATGAATACGACGCATACTTGGACATGGTTGACGGGTCGGATAGTTGCTTGGACAGAGCGACATTCTGCCCGGCGAAGCTCCGGTGCTACCCGAAACATCATGCGTACCACCAGCCGACTGTACGCAGTGCCGTCCCGTCACCCTTTCAGAACACACTACAGAGCGTGCTAGCGGCCGCCACCAAGAGAAACTGCAACGTCACGCAAATGCGAGAACTACCCACCATGGACTCGGCAGTGTTCAACGTGGAGTGCTTCAAGCGCTATGCCTGCTCCGGAGAATATTGGGAAGAATATGCTAAACAACCTATCCGGATAACCACTGAGAACATCACTACCTATGTGACCAAATTGAAAGGCCCGAAAGCTGCTGCCTTGTTCGCTAAGACCCACAACTTGGTTCCGCTGCAGGAGGTTCCCATGGACAGATTCACGGTCGACATGAAACGAGATGTCAAAGTCACTCCAGGGACGAAACACACAGAGGAAAGACCCAAAGTCCAGGTAATTCAAGCAGCGGAGCCATTGGCGACCGCTTACCTGTGCGGCATCCACAGGGAATTAGTAAGGAGACTAAATGCTGTGTTACGCCCTAACGTGCACACATTGTTTGATATGTCGGCCGAAGACTTTGACGCGATCATCGCCTCTCACTTCCACCCAGGAGACCCGGTTCTAGAGACGGACATTGCATCATTCGACAAAAGCCAGGACGACTCCTTGGCTCTTACAGGTTTAATGATCCTCGAAGATCTAGGGGTGGATCAGTACCTGCTGGACTTGATCGAGGCAGCCTTTGGGGAAATATCCAGCTGTCACCTACCAACTGGCACGCGCTTCAAGTTCGGAGCTATGATGAAATCGGGCATGTTTCTGACTTTGTTTATTAACACTGTTTTGAACATCACCATAGCAAGCAGGGTACTGGAGCAGAGACTCACTGACTCCGCCTGTGCGGCCTTCATCGGCGACGACAACATCGTTCACGGAGTGATCTCCGACAAGCTGATGGCGGAGAGGTGCGCGTCGTGGGTCAACATGGAGGTGAAGATCATTGACGCTGTCATGGGCGAAAAACCCCCATATTTTTGTGGGGGATTCATAGTTTTTGACAGCGTCACACAGACCGCCTGCCGTGTTTCAGACCCACTTAAGCGCCTGTTCAAGTTGGGTAAGCCGCTAACAGCTGAAGACAAGCAGGACGAAGACAGGCGACGAGCACTGAGTGACGAGGTTAGCAAGTGGTTCCGGACAGGCTTGGGGGCCGAACTGGAGGTGGCACTAACATCTAGGTATAAGGTAGAGGGCTGCAAAAGTATCCTCATAGCCATGGCCACCTTGGCGAGGGACATTAAGGCGTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACACAGAATTCTGATTGGATCCTCGAGGAATTCTGACACTATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATGATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGACTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAACTCAAATCCTGCACAACAGATTCTTCATGTTTGGACCAAATCAACTTGTGATACCATGCTCAAAGAGGCCTCAAACCATAACTGTATAACTTGTAACAAAGCGCAACAAGACCTGCGCAATTGGCCCCGTGGTCCGCCTCACGGAAACTCGGGGCAACTCATATTGACACATTAATTGGCAATAATTGGAAGCTTACATAAGCTTAATTCGACGAATAATTGGATTTTTATTTTATTTTGCAATTGGTTTTTAATATTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’

Claims

1.一种高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体，其包括含有启动子序列的DNA序列，所述启动子序列可操作地连接至编码Semliki病毒(SFV)非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至SFV次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2A DNA，其又可操作地连接至编码水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白的VSV G DNA，其中所述SFV非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C，其中所述载体缺乏编码SFV结构蛋白的核苷酸序列，进一步其中当所述载体在细胞培养物中增殖时，获得至少10⁷噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。

2.权利要求1所述的高效价杂交HBV载体，其中所述启动子序列包括组成型启动子。

3.权利要求2所述的高效价杂交HBV载体，其中所述所述启动子序列包括巨细胞病毒立即早期启动子。

4.权利要求1所述的高效价杂交HBV载体，其中获得至少5 x 10⁷pfu/ml的效价的VLV。

5.权利要求4所述的高效价杂交HBV载体，其中获得至少1 x 10⁸pfu/ml的效价的VLV。

6.权利要求1所述的高效价杂交HBV载体，其中所述HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和其任意组合。

7.权利要求6所述的HBV抗原，其中所述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎表面中蛋白(MHBs)。

8.一种组合物，其包括由权利要求1所述的高效价杂交病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)。

9.权利要求8所述的组合物，其中所述HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和其任意组合。

10.权利要求9所述的HBV抗原，其中所述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎表面中蛋白(MHBs)。

11.权利要求8所述的组合物，其中所述HBV抗原与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关联。

12.一种针对HBV感染免疫对象的方法，所述方法包括给所述对象施用包含至少10⁷pfu/ml的VLV的权利要求8所述的组合物，其中所述HBV抗原的表达诱导所述对象中的免疫应答。

13.权利要求12所述的方法，其中所述HBV抗原或其片段选自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒蛋白X(HBx)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶和其任意组合。

14.一种治疗或预防对象中的疾病的方法，所述方法包括给需要这种治疗的对象施用治疗上有效量的权利要求8所述的组合物。

15.权利要求14所述的方法，其中所述疾病是乙型肝炎病毒(HBV)感染。

16.权利要求15所述的方法，其中所述HBV感染是慢性感染。

17.一种给对象接种疫苗的方法，所述方法包括给所述对象施用药学上可接受量的权利要求8所述的组合物，其中所述组合物的施用引起所述对象中的免疫应答。

18.权利要求17所述的方法，其中所述组合物是预防性疫苗。

19.权利要求18所述的方法，其中所述组合物是治疗性疫苗。

20.权利要求17所述的方法，其中所述组合物与佐剂组合施用。

21.权利要求20所述的方法，其中佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A、Detox、ISCOMs和角鲨烯。

22.一种在对象中对HBV抗原或其片段生成记忆T细胞免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤：(a)以有效引起所述对象中免疫应答的量给所述对象施用权利要求8所述的组合物；(b)在第二随后时间段，施用第二有效量的权利要求8所述的组合物，其中针对所述HBV抗原或其片段的T记忆细胞在所述对象中生成。

23.一种在对象中对HBV抗原或其片段生成适应性B细胞免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤：(a)以有效引起所述对象中免疫应答的量给所述对象施用权利要求8所述的组合物；(b)在第二随后时间段，施用第二有效量的权利要求8所述的组合物，其中针对所述HBV抗原或其片段的B记忆细胞在所述对象中生成。

24.权利要求12、14、17、22和23中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

25.权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

26.一种高效价杂交乙型肝炎病毒(HBV)载体，其包括含有启动子序列的DNA序列，所述启动子序列可操作地连接至编码甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列的DNA序列、可操作地连接至甲病毒属次基因组RNA启动子、可操作地连接至编码HBV抗原或其片段的DNA、可操作地连接至编码2A肽的2A DNA，其又可操作地连接至编码水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白的VSV GDNA，其中所述甲病毒属非结构蛋白核苷酸序列包括选自以下的突变中的至少两种：G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G和T-11978-C，其中所述载体缺乏编码甲病毒属结构蛋白的核苷酸序列，进一步其中当所述载体在细胞培养物中增殖时，获得至少10⁷噬斑形成单位(pfu)/ml的效价的病毒样囊泡(VLV)。