CN101355960A - 使用α病毒复制子颗粒进行粘膜和全身免疫 - Google Patents

Abstract

本发明描述了粘膜或全身给予含有α病毒复制子颗粒的组合物以诱导对象免疫应答的方法。

Description

使用α病毒复制子颗粒进行粘膜和全身免疫

相关申请

本申请要求2005年10月18日提交的美国临时申请号60/727,731的优先权，将其内容全文纳入本文作参考。

政府支持

美国国立卫生研究院的R21资助1 R21 AI50430-01和IPCAVD资助1 U19AI51596完全或部分支持了本发明。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明一般涉及用粘膜和/或全身免疫技术调节或产生免疫应答的方法。具体说，本发明涉及通过粘膜和/或全身性给予对象α病毒复制子颗粒，在粘膜和/或全身区室水平调节或产生免疫应答的方法。

发明背景

α病毒复制子载体目前用作开发控制传染病的疫苗的载体平台。这类α病毒复制子载体衍生自α病毒，该病毒是有包膜的正链RNA病毒，包括披膜病毒科(Togaviridae)中遗传上、结构上和血清学上相关的虫媒病毒属。在α病毒属中已经鉴定分类了26种已知病毒和病毒亚型，包括塞姆利基森林病毒(SFV)、罗斯河病毒(RRV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)和辛德毕斯病毒(SIN)，它是该属的原型成员。目前开发成疫苗应用的复制子载体的α病毒成员包括例如，塞姆利基森林病毒(Liljestrom(1991)Bio/Technology 9：1356-1361；Berglund等(1998)Nat.Biotech.16：562-565)、委内瑞拉马脑炎病毒(Pushko等(1997)Virology239：389-401)、辛德毕斯病毒(Xiong等(1989)Science 243：1188-1191；Dubensky等(1996)J.Virol.70：508-519；Hariharan等(1998)J.Virol.72：950-958；Polo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：4598-4603)和其组合，包括例如VEE-衍生的复制子RNA和SIN-衍生的表面糖蛋白(VEE/SIN)(Perri等(2003)J.Virol.77：10394-10403)。基于α病毒的复制子载体不含病毒结构蛋白质基因，但保持了胞质RNA自身扩增和通过α病毒RNA启动子表达插入的异源基因所必需的复制元件。不含结构蛋白质基因保证该复制子是完全缺陷的，无法产生感染性病毒。

α病毒和其它复制子载体的递送方案主要集中在将RNA载体包装到复制缺陷型病毒样颗粒，从而使用天然受体介导的进入方法，类似于病毒感染。根据用于包装的结构外壳蛋白的母体病毒来源，携带RNA载体的复制子颗粒也对具体体内细胞类型有趋向性，从而能够具有所需特性，例如粘膜递送和体内靶向树突细胞。由于α病毒复制子载体不编码包装所需的病毒结构蛋白，所以通过在合适的培养细胞中反式提供结构蛋白产生复制子颗粒。一般地，通过瞬时共转染体外转录的复制子和编码结构蛋白的辅助RNA，或通过将该复制子引入由一种或多种DNA表达盒表达结构蛋白的包装细胞系(PCL)，来提供α病毒结构蛋白必需的补充物。以此方式产生复制子颗粒保持了载体的复制缺陷特性，因为仍然不存在结构蛋白的遗传信息。

用多种抗原在各种动物模型中评价用于RNA疫苗的α病毒复制子颗粒方案。已证明免疫后α病毒复制子颗粒能诱导细胞、体液和粘膜免疫应答。例如，粘膜给予表达人免疫缺陷病毒(HIV)抗原的α病毒复制子颗粒能诱导对HIV抗原的免疫应答(Vajdy等(2001)J.Infect.Dis.184：1613-1616；Gupta等(2005)J.Virol.79：7135-7145)。用表达呼吸道合胞病毒(RSV)抗原的α病毒颗粒进行全身或粘膜免疫能够诱导对RSV抗原的免疫应答。

尽管有这些结果，但仍然需要开发疫苗和疫苗接种方案，以改善对病原体的免疫应答并控制传染病。仍然需要开发疫苗和疫苗接种方案，以引发、诱导、刺激、提高或加强哺乳动物对目前仍为形成(或很少有)有效疫苗和/或治疗的各种病原体或癌症的免疫应答。

发明概述

本发明提供了在哺乳动物中诱导或产生针对一种或多种病原体(如细菌、病毒、肿瘤等)的免疫应答的方法。本发明提供了在哺乳动物中诱导或产生对至少一种抗原的免疫应答的方法。在本发明的一个方面，所述方法包括任意顺序的(i)经粘膜给予哺乳动物含有第一病毒复制子颗粒的第一组合物，和(ii)全身给予该哺乳动物含有第二病毒复制子颗粒的第二组合物。病毒复制子颗粒编码一种或多种(至少一种)感兴趣抗原(靶抗原)。病毒复制子颗粒包括α病毒复制子颗粒、腺病毒复制子颗粒和痘病毒复制子颗粒。在具体实施方式中，该方法包括任意顺序的(i)经粘膜给予哺乳动物含有第一α病毒复制子颗粒的第一组合物，和(ii)全身给予该哺乳动物含有第二α病毒复制子颗粒的第二组合物。所述第一和第二病毒复制子颗粒能够表达至少一种靶抗原。在具体实施方式中，所述第一和第二病毒复制子颗粒能够表达相同的靶抗原。在另一实施方式中，所述第一和第二病毒复制子颗粒能够表达至少一种不同的靶抗原。

在本发明的另一方面，所述方法包括任意顺序的(i)经粘膜给予哺乳动物含有α病毒复制子颗粒的第一组合物，和(ii)全身给予该哺乳动物含有非α病毒复制子颗粒的第二组合物。在本发明第三方面，该方法包括任意顺序的(i)经粘膜给予哺乳动物含有非α病毒复制子颗粒的第一组合物，和(ii)全身给予该哺乳动物含有α病毒复制子颗粒的第二组合物。如上所述，在各种方法中，病毒复制子颗粒编码一种或多种(至少一种)靶抗原。

在本发明第四方面，该方法包括(i)通过粘膜给药途径给予哺乳动物有效量的含有第一病毒复制子颗粒的初免组合物，和(ii)随后通过全身给药途径给予该哺乳动物有效量的含有第二病毒复制子颗粒的加强组合物。在本发明的另一方面，该方法包括(i)通过全身给药途径给予哺乳动物有效量的含有第一病毒复制子颗粒的初免组合物，和(ii)随后通过粘膜给药途径给予该哺乳动物有效量的含有第二病毒复制子颗粒的加强组合物。所述病毒复制子颗粒编码一种或多种(至少一种)感兴趣抗原(靶抗原)。所述第一和第二病毒复制子颗粒可以是相同或不同的病毒复制子颗粒。在具体实施方式中，所述第一和第二病毒复制子颗粒是α病毒复制子颗粒。所述第一和第二病毒复制子颗粒能够表达至少一种靶抗原。在具体实施方式中，所述第一和第二病毒复制子颗粒能够表达相同的靶抗原。在另一实施方式中，所述第一和第二病毒复制子颗粒能够表达至少一种不同的靶抗原。

在本发明的具体方面，在哺乳动物对象中诱导或产生免疫应答的方法包括(a)通过粘膜给药途径给予该对象含有一种或多种病毒复制子载体或颗粒的第一免疫原性组合物，所述载体或颗粒含有至少一种抗原；和(b)通过全身给药途径给予该对象含有一种或多种病毒复制子载体或颗粒的第二免疫原性组合物，所述载体或颗粒含有至少一种抗原，从而在对象中诱导或产生免疫应答。在另一方面，在哺乳动物对象中诱导或产生免疫应答的方法包括(a)通过全身给药途径给予所述对象含有一种或多种病毒复制子载体或颗粒的第一免疫原性组合物，所述载体或颗粒含有至少一种抗原；和(b)通过粘膜给药途径给予所述对象含有一种或多种病毒复制子载体或颗粒的第二免疫原性组合物，所述载体或颗粒含有至少一种抗原，从而在所述对象中诱导免疫应答。病毒复制子载体和颗粒编码一种或多种(至少一种)靶抗原。所述第一和第二免疫原性组合物可包含相同或不同的病毒复制子载体或颗粒。在具体实施方式中，所述第一和第二免疫原性组合物包含的病毒复制子载体或颗粒是α病毒复制子载体或颗粒。在一个实施方式中，所述第一和第二免疫原性组合物的病毒复制子载体和颗粒能够表达相同的靶抗原。在另一实施方式中，所述第一和第二免疫原性组合物的病毒复制子颗粒能够表达至少一种不同的靶抗原。

在某些实施方式中，给予本文所述的病毒复制子颗粒和免疫原性组合物以初免哺乳动物对象。初免在文中指用本文所述的病毒复制子颗粒或免疫原性组合物第一次免疫从而在用本文所述的含有至少一种相同抗原的病毒复制子颗粒或免疫原性组合物第二次免疫时产生针对靶抗原的免疫应答的任何方法，其中所述第二次免疫应答强于未提供第一次免疫或给予的第一次免疫含有不表达抗原的载体或颗粒时的免疫应答。初免包括以下方案，每小时、每天、每周、每月或每年给予一个剂量或多个剂量。在具体实施方式中，初免(或初次免疫)包括至少两次给药(包含一个或多个剂量)。例如，在具体实施方式中，通过粘膜给药途径给予本文所述的一种或多种病毒复制子颗粒或免疫原性组合物进行的初免需要至少两次(如2、3、4、5、6、7或更多次)粘膜给予(包括一个或多个剂量)病毒复制子颗粒或免疫原性组合物。相似地，通过全身给药途径给予本文所述的一种或多种病毒复制子颗粒或免疫原性组合物进行的初免需要至少两次(如2、3、4、5、6、7或更多次)全身给予(包括一个或多个剂量)病毒复制子颗粒或免疫原性组合物。粘膜和全身给药的时间间隔可能是数小时、数天、数周、数月或数年。另外，在某些实施方式中，可利用相同或不同的病毒复制子颗粒或免疫原性组合物进行重复步骤。

在其它实施方式中，作为加强剂量给予本文所述的病毒复制子颗粒和免疫原性组合物，以便加强哺乳动物对象初免后实现的免疫应答。在初免一段时间后，作为加强剂量给予病毒复制子颗粒或免疫原性组合物。作为加强剂量给予的病毒复制子颗粒或免疫原性组合物中至少一种抗原与初免步骤所给抗原相同。在具体实施方式中，在初免(或初次免疫)后约2周-27周进行加强(或加强免疫)。加强免疫方案包括以下方案，小时、每天、每周、每月或每年给予一个剂量或多个剂量。在某些实施方式中，加强(或加强免疫)包括至少一次给药。在其它实施方式中，加强(或加强免疫)包括至少两次给药(包括一个或多个剂量)。例如，在这种情况下，在具体实施方式中，通过粘膜给药途径给予本文所述的一种或多种病毒复制子颗粒或免疫原性组合物进行的加强需要至少两次(如2、3、4、5、6、7或更多次)粘膜给予(包括一个或多个剂量)病毒复制子颗粒或免疫原性组合物。相似地，在这种情况下，通过全身给药途径给予本文所述的一种或多种病毒复制子颗粒或免疫原性组合物进行的加强需要至少两次(如2、3、4、5、6、7或更多次)全身给予(包括一个或多个剂量)病毒复制子颗粒或免疫原性组合物。粘膜和全身给药的时间间隔可能是数小时、数天、数周、数月或数年。另外，在某些实施方式中，可利用相同或不同的病毒复制子颗粒或免疫原性组合物进行重复步骤。

在本发明的其它方面，病毒复制子颗粒可用于第一系列(包括一个或多个剂量)的粘膜和/或全身免疫(初次免疫)，随后是用基于DNA、细菌或病毒递送系统或基于蛋白质的疫苗进行第二系列(包括一个或多个剂量)免疫(加强免疫)。在另一方面，基于DNA、细菌或病毒递送系统或基于蛋白质的疫苗可用于第一系列(包括一个或多个剂量)免疫(初次免疫)，随后是用病毒复制子颗粒进行第二系列(包括一个或多个剂量)免疫(加强免疫)。可通过粘膜或全身或粘膜和全身同时免疫的途径用复制子颗粒或基于DNA、基于细菌或病毒或基于蛋白质的疫苗进行初次或加强免疫。因此，这些粘膜/全身初免-全身/粘膜加强方法可用于诱导或产生对各种抗原的免疫应答。

粘膜给药可以是，例如，口服、鼻内、胃内、肺、肠、直肠、眼和阴道途径。优选鼻内或口服给药。全身给药可以是，例如，肌肉内。粘膜和/或全身给药的本文所述组合物还可包含一种或多种其它物质，如佐剂和/或递送载体。

适用于本发明的抗原可衍生自病原体(如细菌或病毒)或肿瘤。适用于本发明的细菌抗原包括衍生自以下细菌的抗原：，例如，脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)亚型A、B和/或C，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和/或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。适用于本发明的病毒抗原包括衍生自以下病毒的抗原：，例如，甲型肝炎病毒(HAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、流感、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、丙型肝炎病毒(HCV)和/或人乳头瘤病毒(HPV)。

在本文所述的方法中，免疫应答可以是体液和/或细胞免疫应答、全身免疫应答(如产生IgG或细胞因子)、粘膜免疫应答(如产生IgA或细胞因子)或全身和粘膜应答的组合。

在本文所述的方法中，粘膜和全身给予的病毒载体和颗粒可包含编码同一病原体(如细菌、病毒和/或肿瘤)的抗原的序列。在某些实施方式中，通过粘膜和全身途径给予相同的病毒载体或颗粒。在其它实施方式中，通过粘膜和全身途径给予不同的α病毒颗粒(如含有来自同一病原体的不同抗原、不同抗原形式、来自不同病原体和/或不同α病毒的抗原)。

在本文所述的方法中，所述免疫原性组合物还可包含一种或多种多肽抗原和/或编码一种或多种抗原(如α病毒、痘病毒和/或腺病毒复制子和/或载体)的一种或多种多核苷酸。这些多肽和/或多核苷酸可与含有α病毒复制子颗粒的组合物分开(之前或之后)给药或同时(在相同或不同组合物中)给药。

在本文所述的方法中，代替含有α病毒复制子颗粒的组合物的或除此之外，可给予(粘膜或全身)对象一种或多种多肽抗原和/或编码一种或多种抗原的一种或多种多核苷酸(如α病毒复制子、痘病毒和/或腺病毒复制子和/或载体)。

本发明也提供了在哺乳动物中诱导或产生免疫应答的药盒。该药盒包括(i)含有第一病毒复制子颗粒并配制成粘膜给予哺乳动物的形式的第一种组合物，和(ii)含有第二病毒复制子颗粒并配制成全身给予哺乳动物的形式的第二种组合物，以任意顺序依次给药。病毒复制子颗粒包括α病毒复制子颗粒、腺病毒复制子颗粒和痘病毒复制子颗粒。所述第一和第二病毒复制子颗粒可以是相同或不同的病毒复制子颗粒。所述第一和第二组合物能够表达至少一种靶抗原。在具体实施方式中，所述第一和第二组合物能够表达相同的靶抗原。在另一实施方式中，所述第一和第二组合物能够表达至少一种不同的靶抗原。该药盒可包含一个或多个剂量的第一组合物、第二组合物或第一和第二组合物。因此，在具体实施方式中，为了有利于重复给药，该药盒包含含有一种或两种组合物的多个小瓶，各小瓶含有每次给药时给予对象的剂量。该药盒还可包含使用该药盒的说明书。在其它实施方式中，该药盒也可包含通过粘膜途径将第一组合物给予哺乳动物的施药器和/或通过全身途径将第二组合物给予哺乳动物的施药器。

因此，本发明包括但不限于以下实施方式：

1.一种使对象产生免疫应答的方法，包括

(a)粘膜给予含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第一免疫原性组合物，所述α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸；和

(b)全身给予含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第二免疫原性组合物，所述α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸，从而在所述对象中诱导免疫应答。

2.如1所述的方法，其中，所述粘膜给药选自鼻内、直肠内或阴道内途径。

3.如1所述的方法，其中，所述全身给药是肌肉内给药。

4.如1-3中任一项所述的方法，其中，步骤(a)进行至少两次。

5.如1-3中任一项所述的方法，其中，步骤(a)进行至少三次。

6.如1-5中任一项所述的方法，其中，步骤(b)进行至少两次。

7.如1-6中任一项所述的方法，其中，至少一种α病毒复制子颗粒衍生自辛德毕斯病毒(SIN)。

8.如1-6中任一项所述的方法，其中，至少一种α病毒复制子颗粒衍生自委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)。

9.如1-6中任一项所述的方法，其中，至少一种α病毒复制子颗粒衍生自塞姆利基森林病毒(SFV)。

10.如1-6中任一项所述的方法，其中，至少一种α病毒复制子颗粒是嵌合的VEE/SIN复制子颗粒。

11.如1-10中任一项所述的方法，其中，至少一种抗原是病毒抗原。

12.如11所述的方法，其中，所述病毒抗原衍生自HIV、SIV或FIV。

13.如12所述的方法，其中，所述抗原衍生自gag、env或pol多肽。

14.如11所述的方法，其中，所述病毒抗原衍生自选自下组的病毒：流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)和丙型肝炎病毒(HCV)。

15.如1-10中任一项所述的方法，其中，至少一种抗原是细菌抗原。

16.如15所述的方法，其中，所述细菌抗原衍生自脑膜炎奈瑟球菌。

17.如16所述的方法，其中，所述细菌抗原衍生自脑膜炎奈瑟球菌B亚组和脑膜炎奈瑟球菌C亚组。

18.如15所述的方法，其中，所述细菌抗原衍生自链球菌属(Streptococcusspp.)。

19.如1-10中任一项所述的方法，其中，至少一种抗原是肿瘤抗原。

20.如1-19中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二免疫原性组合物包含相同的抗原。

21.如1-29中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二免疫原性组合物包含不同抗原。

22.如21所述的方法，其中，所述不同抗原衍生自相同的病原体。

23.如21所述的方法，其中，所述不同抗原衍生自不同病原体。

24.如1-23中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二免疫原性组合物还包含其它递送载体。

25.如24所述的方法，其中，所述递送载体含有微粒。

26.如1-25中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二免疫原性组合物还含有佐剂。

27.如1-26中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二免疫原性组合物还含有一种或多种多肽抗原。

28.如1-27中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是全身免疫应答。

29.如1-27中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是粘膜免疫应答。

30.如1-27中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答是全身和粘膜免疫应答。

31.如1-30中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)之前进行步骤(a)。

32.如1-30中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)之前进行步骤(b)。

33.如1-27中任一项所述的方法，还包括将一种或多种多肽抗原或者编码一种或多种抗原的一种或多种多核苷酸给予所述对象。

34.如33所述的方法，其中，所述多核苷酸由α病毒复制子载体、痘病毒复制子和/或载体或腺病毒复制子和/或载体携带。

参照以下详述和附图，可以明显看出本发明的这些和其它方面。此外，下文列出的各种参考文献更详细地描述了某些方法或组合物(如α病毒复制子颗粒等)。

附图简要说明

图1是描述用VEE-GFP复制子颗粒(左侧)；SIN-GFP复制子颗粒(中间)；或VEE/SIN-GFP复制子颗粒(右侧)感染的外周血单核细胞(PMBC)百分数的图。

图2是描述用VEE-GFP复制子颗粒(白色)；SIN-GFP复制子颗粒(黑色)；或VEE/SIN-GFP复制子颗粒(灰色)感染PBMC中的CD11b⁺、CD14⁺和CD20⁺细胞的图。

图3是含有VEE-GFP复制子颗粒(左侧)；SIN-GFP复制子颗粒(中间)；或VEE/SIN-GFP复制子颗粒(右侧)的PBMC中GFP的表达图。

图4是描述研究设计#2第1组的4只动物的gp140 IgG血清效价的图。

图5是描述研究设计#2第2组的4只动物的gp140 IgG血清效价的图。

图6是描述研究设计#2第3组的4只动物的gp140 IgG血清效价的图。

图7是描述研究设计#2第1组的4只动物阴道洗液中gp140 IgG效价的图。

图8是描述研究设计#2第2组的4只动物阴道洗液中gp140 IgG效价的图。

图9是描述研究设计#2第3组的4只动物阴道洗液中gp140 IgG效价的图。

图10是描述研究设计#2第1组的4只动物的gp140 IgA血清效价的图。

图11是描述研究设计#2第2组的4只动物的gp140 IgA血清效价的图。

图12是描述研究设计#2第3组的4只动物的gp140 IgA血清效价的图。

图13是描述研究设计#2第1组的4只动物阴道洗液中gp140 IgA效价的图。

图14是描述研究设计#2第2组的4只动物阴道洗液中gp140 IgA效价的图。

图15是描述研究设计#2第3组的4只动物阴道洗液中gp140 IgA效价的图。

图16是描述研究设计#2第1组的4只动物唾液中gp140 IgA效价的图。

图17是描述研究设计#2第2组的4只动物唾液中gp140 IgA效价的图。

图18是描述研究设计#2第3组的4只动物唾液中gp140 IgA效价的图。

发明详述

除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的常规的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法。文献中充分解释了这些技术的详情。参见例如，Gennaro，A.R.(编)，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第20版(Mack Publishing Company(麦克出版公司)，2000)；Colowick，S.和Kaplan，N.(编)，Methods In Enzymology(酶学方法)(AcademicPress，Inc.(学术出版公司)，1984)；和Weir，D.M.(编)，Weir’s Handbook ofExperimental Immunology(韦氏实验免疫学手册)，第5版(Blackwell Publishers(布莱克威尔出版社)，1996)；Sambrook，J.，等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，2001)；Birdi，K.S.(编)，Handbook of Surface and ColloidalChemistry(表面和胶体化学手册)，第2版(CRC出版社，2002)；Ausubel，F.M.等(编)，Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学简单方法)，第5版(Current Protocols(新编实验方法)，2002)；Ream，W.和Field，K.G.，MolecularBiology技术s：An Intensive Laboratory Course(分子生物学技术：集中实验室教程)(Academic Press(学术出版社)，1999)；Newton，C.R.和Graham，A.(编)，PCR(Introduction to Biotechniques Series(生物技术简介丛书))，第2版(BIOSScientific Publishers(BIOS科学出版社)，1997)；Fields，B.N.等(编)，FieldsVirology(野外病毒学)，第4版(Lippincott Williams和Wilkins，2001)。

将上文或下文中引用的所有出版物、专利和专利申请全文纳入本文作参考。

本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非文中另有明确说明。因此，例如，提到“一种抗原”包括两种或多种这类物质的混合物。

在描述本发明之前，列出下文中所用的某些术语的定义。

“多核苷酸”是编码生物活性(如免疫原性或治疗性)蛋白质或多肽的核酸分子。根据多核苷酸编码的多肽的特性，多核苷酸可包含少至10个核苷酸，例如，当多核苷酸编码抗原时。而且，“多核苷酸”可包括双链和单链序列，例如但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，病毒(如RNA和DNA病毒和逆转录病毒)的基因组RNA和DNA序列或原核DNA，特别是合成DNA序列。该术语也包括含有DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，并包括对天然序列的修饰如缺失、加入和取代(通常为保守性)，只要该核酸分子编码治疗性或抗原性蛋白质。这些修饰可以是有意的修饰，如定位诱变，或者可能是偶然性修饰，如产生抗原的宿主发生突变。修饰多核苷酸可能产生许多作用，包括例如，促进宿主细胞表达多肽产物。

术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，不限于最小长度的产物。因此，该定义包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。该定义包括全长蛋白和其片段。该术语也包括多肽的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。而且，出于本发明目的，“多肽”指包含对天然序列的修饰如缺失、加入和取代(通常为保守性)的蛋白质，只要该蛋白质保持所需活性。这些修饰可以是有意的修饰，如定位诱变，或者可能是偶然性修饰，如产生该蛋白的宿主被修饰或PCR扩增错误。而且，修饰可产生以下一种或多种作用：降低毒性；促进细胞加工(如分泌、抗原递呈等)；和促进递呈给B细胞和/或T细胞。

“α病毒复制子载体”、“RNA复制子载体”、“复制子载体”或“复制子”指能够指导其在体内靶细胞中自身扩增或自身复制的核酸分子。参见例如，美国专利6,767,669；6,465,634；6,458,560；6,451,592；6,426,196；6,391,632；6,376,236；6,342,372；6,329,201；6,242,259；6,105,694；6,015,686；5,843,723；5,814,482；和5,789,245。我们可以看出，这些年出现的包括α病毒载体、α病毒载体构建物、α病毒复制子、α病毒RNA复制子、α病毒载体复制子、真核分层载体启动系统(ELVIS)、α病毒质粒复制子等在内的几种术语均可用于描述α病毒复制子载体。

“重组α病毒颗粒”或“α病毒复制子颗粒”指含有α病毒RNA载体复制子的病毒体样结构单元。通常，重组α病毒颗粒包含一种或多种α病毒结构蛋白、脂质包膜和RNA载体复制子。重组α病毒颗粒优选含有核衣壳结构，其包含在宿主细胞衍生的脂质双层(如质膜)中，脂质双层中包埋了α病毒编码的包膜糖蛋白。该颗粒也可含有指导产生α病毒的颗粒的趋向性的其它组分(如靶向元件、其它病毒结构蛋白或其它受体结合配体)。可由一种或多种α病毒制备α病毒复制子颗粒，α病毒包括但不限于：辛德毕斯病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)和/或塞姆利基森林病毒(SFV)。参见例如，美国专利6,770,283；6,376,236；6,015,694；6,531,135；和6,521,235。美国专利公开号2003/0232324和2003/0148262中描述了嵌合α病毒复制子颗粒(即含有衍生自一种以上α病毒的序列)。

“抗原”指含有能刺激宿主免疫系统，以产生先天性、体液和/或细胞抗原特异性应答的一种或多种表位(线性、构象或二者)的分子。该术语与术语“免疫原”可互换使用。正常情况下，表位包含约3-15个，通常约5-15个氨基酸。B细胞表位通常约为5个氨基酸，但可小至3-4个氨基酸。T细胞表位如CTL表位包含至少约7-9个氨基酸，T辅助细胞表位含有至少约12-20个氨基酸。表位通常包含约7-15个氨基酸，如9、10、12或15个氨基酸。术语“抗原”指亚单位抗原(即与天然情况下与抗原相结合的整个生物体分离或隔离的抗原)，以及杀伤、减毒或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生物或其它微生物以及肿瘤抗原，包括细胞表面受体的胞外区和可能含有T细胞表位的细胞的胞内部分。本文所用的抗原定义也包括抗体如抗-独特型抗体或其片段和合成肽模拟位，它可模拟抗原或抗原决定簇。相似地，本文所述的抗原定义也包括在体内例如基因治疗和DNA免疫应用中表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸。

可采用本领域熟知的许多表位作图技术鉴定给定蛋白质的表位。参见例如，Morris，G.E.(编)，Epitope Mapping Protocols(Methods in MolecularBiology)(表位作图实验方法(分子生物学方法))，第66卷(Humana Press(休曼出版社)，1996)。例如，可以(例如)在固体支持物上同时合成大量肽、将该肽对应于蛋白质分子的某部分并在该肽连接于支持物的同时使该肽与抗体发生反应，从而确定线性表位。这些技术是本领域已知的，参见例如，美国专利号4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen等(1986)Mol.Immunol.23：709-715。

相似地，通过，例如，x射线晶体学和核磁共振确定氨基酸的空间构象，从而容易地鉴定构象表位。参见例如，Epitope Mapping Protocols(表位作图实验方法)，同上。

出于本发明目的，抗原可衍生自肿瘤和/或任何已知或仍未鉴定的病毒、细菌、寄生物和真菌，下面更详细地描述了它们的非限制性例子。该术语也指需要对其产生免疫应答的各种肿瘤抗原或任何其它抗原。而且，出于本发明目的，“抗原”指包含对天然序列的修饰如缺失、加入和取代(通常为保守性)的蛋白质，只要该蛋白质保持引发本文所述免疫应答的能力。这些修饰可以是有意的修饰，如定位诱变，或者可能是偶然性修饰，如产生该抗原的宿主发生突变。因此，在物理上抗原(和编码这些抗原的多核苷酸)可衍生自野生型生物体和/或通过重组或合成方法产生(如基于已知序列)。

用术语“衍生自”标示出分子(如多核苷酸、多肽、α病毒复制子颗粒)的来源。如果第一种多核苷酸与第二种多核苷酸、其cDNA、其互补物的某区域碱基对序列相同或基本相同，或者如果第一种多核苷酸具有如上所述的序列相同性，那么第一种多核苷酸“衍生自”第二种多核苷酸。因此，如果病毒序列或多核苷酸(i)与某病毒的序列相同或基本相同或(ii)与上述病毒的多核苷酸具有序列相同性，那么该病毒序列或多核苷酸“衍生自”此特定病毒(如种类)。

如果(i)由衍生自第二种多核苷酸的第一种多核苷酸编码，或(ii)与上述第二种多肽具有序列相同性，那么第一种多肽“衍生自”第二种多肽。因此，如果(i)由病毒的多核苷酸(病毒多核苷酸)的开放阅读框编码，或(ii)与产生它的多肽具有如上所述的序列相同性和/或抗原功能相同，那么病毒抗原“衍生自”某特定病毒多肽。相似地，如果(i)由该α病毒的多核苷酸的开放阅读框编码，或者(ii)与产生它的α病毒具有序列相同性(如上所述)，那么α病毒复制子颗粒“衍生自”一种或多种α病毒。

对抗原或组合物的“免疫应答”是对象对感兴趣组合物中存在的抗原产生先天性、体液和/或细胞免疫应答。出于本发明目的，“先天性免疫应答”指由抗原递呈细胞如树突细胞或上皮细胞或内皮细胞诱导细胞因子或趋化因子。可通过α病毒复制子颗粒上的整体结构或亚结构产生先天性免疫应答，所述病毒复制子颗粒能结合参与启动先天性应答的细胞如树突细胞上的toll样受体或其它细胞受体。“体液免疫应答”指抗体分子，包括分泌性(IgA)或IgG分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的应答。细胞免疫的一个重要方面包括细胞溶解型T-淋巴细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对主要组织相容性复合物(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质一起递呈的肽抗原有特异性。CTL帮助诱导和促进胞内微生物的破坏，或感染这类微生物的裂解。细胞免疫的另一个方面包括辅助性T细胞的抗原特异性应答。辅助性T细胞用于帮助刺激对表面上展示肽抗原与MHC分子的细胞的非特异性效应细胞的功能，并集中其活性。“细胞免疫应答”也指产生细胞因子、趋化因子和活化T细胞和/或其它白细胞，包括衍生自CD4+和CD8+ T细胞的细胞产生的其它这类分子。此外，通过对给予抗原起反应，各种白细胞或内皮细胞可诱导趋化因子应答。

通过在细胞表面递呈抗原与MHC分子，引发细胞免疫应答的组合物或疫苗可用于致敏脊椎动物对象。细胞介导的免疫应答指向表面上递呈抗原的细胞或其附近。此外，可产生抗原特异性T-淋巴细胞，以便进一步保护免疫宿主。

可通过许多试验，如淋巴增殖(淋巴细胞增殖)试验、CTL细胞毒性细胞试验或在致敏对象中测定该抗原的特异性T-淋巴细胞的试验测定具体抗原刺激细胞介导免疫应答的能力。这类试验是本领域众所周知的。参见例如，Erickson等(1993)J.Immunol.151：4189-4199；Doe等(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376。近期，细胞介导免疫应答的测定方法包括测定T细胞群分泌的胞内细胞因子或细胞因子(如ELISPOT技术)，或者测定表位特异性T细胞(如四聚体技术)(综述见McMichael，A.J.和O’Callaghan，C.A.(1998)J.Exp.Med.187(9)：1367-1371；Mcheyzer-Williams，M.G.等(1996)Immunol.Rev.150：5-21；Lalvani，A.等(1997)J.Exp.Med.186：859-865)。

因此，本文所用的免疫应答可能是刺激CTL，和/或产生或激活T辅助细胞。也可能刺激产生趋化因子和/或细胞因子。感兴趣抗原也可引发抗体介导的免疫应答。因此，免疫应答可包括以下一种或多种作用：B细胞产生抗体(如IgA或IgG)；由抗原递呈细胞如树突细胞以及上皮细胞和内皮细胞等激活先天性免疫应答，包括分泌细胞因子、趋化因子或其它因子；和/或激活抑制性、细胞毒性或辅助性T细胞和/或特异性指向感兴趣组合物或疫苗上递呈的抗原的T细胞。这些应答可用于中和感染力，和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，以保护免疫宿主。可利用本领域熟知的免疫试验和中和试验测定这类应答。

“粘膜免疫应答”或“粘膜免疫”指诱导体液(即B细胞)和/或细胞(即T细胞)应答。优选地，此种免疫应答是用来免疫哺乳动物对象的抗原的特异性应答。可通过测定所需抗原引入宿主时响应的粘膜灌洗液中存在的抗原特异性抗体评估体液粘膜免疫应答。优选地，抗体应答主要由IgA或IgG抗体组成。可通过测定粘膜区域(如阴道或胃肠道)中分离的淋巴细胞或粘膜区域(如生殖器区域或胃肠道区域)排出的淋巴结的T细胞应答，来评估细胞粘膜免疫应答。

“免疫原性组合物”是含有抗原性分子的组合物，将该组合物给予对象导致该对象对感兴趣抗原性分子发生体液和/或细胞免疫应答。可将免疫原性组合物直接引入接受对象，如通过注射、吸入、口服、鼻内或任何其它胃肠道外或粘膜(如直肠内或阴道内)给药途径引入。

“亚单位疫苗”指含有一种或多种所选抗原而非所有抗原的疫苗组合物，所述抗原衍生自感兴趣病原体如病毒、细菌、寄生物或真菌的抗原或与其同源。这类组合物基本不含完整的病原体细胞或病原体颗粒，或者这类细胞或颗粒的裂解物。因此，可由至少部分纯化(优选基本纯化)的病原体的免疫原性多肽或其类似物制备“亚单位疫苗”。因此，获得亚单位疫苗中所含的抗原的方法可包括标准纯化技术、重组产生或合成产生。

“粘膜”或“通过粘膜给药途径”指通过任何粘膜表面，如鼻内、口服、阴道、直肠等引入体内。粘膜给药与“胃肠道外”或“全身”给药相反，“胃肠道外”或“全身”给药指通过例如皮下、肌肉内、经皮、皮内、透皮、静脉内或腹膜内给药途径给予非粘膜表面。

“共同给药”指将两种或多种组合物引入体内或靶细胞内。该术语包括以任何顺序给药或同时给药。

“免疫调节因子”指分子，如能够调节(特别是提高)免疫应答的蛋白质。免疫调节因子的非限制性例子包括淋巴因子(也称为细胞因子)，如IL-6、TGF-β、IL-1、IL-2、IL-3等)；和趋化因子(如分泌蛋白如巨噬细胞抑制因子)。某些细胞因子如TRANCE、flt-3L和CD40L的分泌形式能够提高APC的免疫刺激活性。可单独或联合用于实施本发明的细胞因子的非限制性例子包括白介素-2(IL-2)、干细胞因子(SCF)、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、G-CSF、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-11(IL-11)、MIP-1γ、白血病抑制因子(LIF)、c-kit配体、血小板生成素(TPO)、CD40配体(CD40L)、肿瘤坏死因子相关性活化诱导细胞因子(TRANCE)和flt3配体(flt-3L)。细胞因子可购自许多供应商，例如，基酶公司(Genzyme)(马萨诸塞州弗雷明汉(Framingham，MA))、安技公司(Amgen)(加州橡木城(ThousandOaks，CA))、R & D系统公司(R & D Systems)和伊缪尼克斯公司(Immunex)(华盛顿州西雅图(Seattle，WA))。可从，例如，GenBank数据库获得许多这些分子的序列。虽然不总是明确说明，但生物学活性与野生型或纯化细胞因子相似的分子(如重组合成的分子或其突变体)和编码这些分子的核酸应该属于本发明构思和范围。免疫调节因子可包含在本文所述的一种、一些或所有组合物中，或者可用作单独制剂。

术语“初免”指与不提供第一次免疫或第一次免疫给予含有不表达抗原的DNA载体时获得的免疫应答相比，采用随后用相同抗原再次免疫后能诱导较高水平的针对所需抗原的免疫应答的抗原进行第一次免疫的任何方法。该术语也包括多次初免给药。初免给药可以是全身或粘膜给药。优选地，初免给药是通过粘膜途径，如鼻内(IN)进行的。全身给药包括特征是在对象组织上进行物理开口和通过该组织开口给予药物组合物的任何胃肠道外给药途径。具体说，考虑的胃肠道外给药包括但不限于皮内、经皮、皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内或胸骨内注射，静脉内、动脉内或肾透析输注技术和所谓的通过组织“无针”注射。优选地，全身胃肠道外给药是肌肉内注射。疫苗的给药途径可能取决于准备预防或治疗的病原体或感染的种类。

“对象”指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人和其它灵长动物，包括非人灵长动物如黑猩猩和其它猿类和猴类物种；家畜如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养动物如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和捕猎鸟类，如鸡、火鸡和其它鸡类，鸭，鹅等。该术语不指特定年龄。因此，可包括成年和新生的个体。上述系统可用于任何上述脊椎动物种类，因为所有这些脊椎动物的免疫系统工作方式相似。

“脊椎动物对象”指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于哺乳动物，如牛、绵羊、猪、山羊、马和人；家养动物如狗和猫；以及鸟类，包括家养、野生和捕猎鸟类如公鸡和母鸡，包括鸡、火鸡和其它鸡类。该术语不指特定年龄。因此，可包括成年和新生的个体。

“哺乳动物对象”指任何雄性或雌性哺乳动物。哺乳动物对象优选为人。然而，该定义也包括其它灵长动物以及哺乳动物种类，包括但不限于狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔和大鼠等。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”指在生物学或其它方面无不良特性的物质，即在制剂或组合物中给予个体时不会引起任何不良的生物反应或与其中所含的任何组合物组分发生有害作用的物质。

本文所用术语大分子和/或微粒的“有效量”或“药学有效量”指无毒但足够提供所需应答，如免疫应答和相应疗效的大分子和/或微粒用量，或者在递送治疗性蛋白质的情况下，足以治疗对象(如下所述)的用量。如下文所述，准确的用量因不同对象而异，取决于对象的物种、年龄和总体状况、准备治疗的疾病的严重程度和感兴趣的具体大分子、给药方式等。在任何情况下，本领域普通技术人员可采用常规实验确定合适的“有效”量。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”指在生物学或其它方面无不良特性的物质，即与微粒制剂一起给予个体时不会引起任何不良的生物反应或与其中所含的任何组合物组分发生有害作用的物质。

“生理pH”或“生理范围的pH”指范围约为7.2-8.0的pH，更一般是范围约为7.2-7.6的pH。

本文所用术语“治疗”指(i)如同传统疫苗那样预防感染或再感染，(ii)减轻或消除症状和(iii)基本上或完全消除所关心的病原体或疾病。可以进行预防性(感染前)或治疗性(感染后)治疗。

A.α病毒复制子颗粒

如上所述，本文所述方法可采用任何α病毒复制子颗粒。

通常，重组α病毒颗粒含有一种或多种α病毒结构蛋白、液体包膜和RNA载体复制子。具体说，重组α病毒颗粒通常含有宿主细胞衍生的脂质双层如质膜中所含的核衣壳结构，其中包埋了一种或多种α病毒包膜糖蛋白(如E2、E1)。

A.1.核苷酸组分

而且，如上所述，本文所述颗粒一般包含一种或多种多核苷酸序列(如RNA)。在颗粒中发现时，这些多核苷酸被一种或多种结构蛋白包围(并与其相互作用)。因此，本文所述的复制子颗粒一般包含各种核酸序列(编码和非编码序列)。通常，颗粒含有不完整的α病毒基因组(如含有不全的α病毒基因组中的编码和/或非编码序列)。

A.1.A.非编码序列

非编码序列的非限制性例子包括非结构蛋白介导的扩增所需的5′序列、表达3′近端基因的元件(means)、亚基因组mRNA 5′端非翻译区(亚基因组5′NTR)和非结构蛋白介导的扩增所需的3′序列(美国专利5,843,723；6,015,694；和5,814,482；国际公开号WO 97/38087和WO 00/61772)。

合适5′序列的非限制性例子包括控制元件，如同源病毒的天然α病毒5′端、异源病毒的天然α病毒5′端、同源病毒的非天然DIα病毒5’端、异源病毒的非天然DIα病毒5’端、非-α病毒衍生的病毒序列(如披膜病毒、植物病毒)、细胞RNA衍生序列(如tRNA元件)(如Monroe等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3279-3283)、任何上述序列的突变/缺失(降低同源性)(参见例如，Niesters等(1990)J.Virol.64：4162-4168；Niesters等(1990)J.Virol.64：1639-1647)和/或辅助物中的最小5′序列(约200、250、300、350、400个核苷酸)。

复制子颗粒的多核苷酸序列通常也包括表达3’近端基因的元件(如异源序列、多肽编码序列)。这类元件的非限制性例子包括控制元件如启动子等，例如，异源病毒的天然α病毒亚基因组启动子、异源病毒的天然α病毒亚基因组启动子、核心α病毒亚基因组启动子(同源或异源)、核心亚基因组启动子上游或下游的最小序列、突变/缺失/加入核心或天然亚基因组启动子、非α病毒衍生的相容性亚基因组启动子(如植物病毒)、内部核糖体进入位点(IRES)和/或核糖体通读元件(如BiP)。

合适的亚基因组mRNA 5’端非翻译区(亚基因组5′NTR)包括但不限于：同源病毒的天然α病毒亚基因组5′NTR、异源病毒的天然α病毒亚基因组5′NTR、非α病毒衍生的病毒5′NTR(如植物病毒)、细胞基因衍生的5′NTR(如β-珠蛋白)、和/或相对天然α病毒亚基因组5′NTR含有突变、缺失和/或加入的序列。

非结构蛋白介导的扩增所需的3′序列的合适非限制性例子包括控制元件如同源病毒的天然α病毒3’端，异源病毒的天然α病毒3’端，同源病毒的非天然DIα病毒3’端，异源病毒的非天然DIα病毒3’端，非α病毒衍生的病毒序列(如披膜病毒，植物病毒)，细胞RNA衍生的序列，相对上述序列含有突变、缺失或加入以降低同源性的序列(参见例如，Kuhn等(1990)J.Virol.64：1465-1476)，辅助物中的最小序列(约为20、30、50、100、200核苷酸)和/或细胞修复的3′α病毒CSE的序列。也可将聚腺苷酸化序列掺入，例如，3’端序列。(参见例如，George等(2000)J.Virol.74：9776-9785)。

A.1.B.α病毒编码序列

本文所述颗粒也可包含编码各种α病毒多肽，如一种或多种非结构(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)或结构(如壳体(caspid)、包膜)α病毒多肽的一种或多种序列。参见例如，美国专利公开号2003/0232324和2003/0148262。

可以相对于野生型修饰复制子颗粒的一种或多种核苷酸序列。α病毒编码序列的修饰可包括但不限于核苷酸突变、缺失、加入或序列取代(全部或一部分)，如采用含有来自一种α病毒和另一种病毒(如α病毒、披膜病毒、植物病毒)的序列的杂交非结构蛋白。例如，在某些实施方式中，编码非结构蛋白基因的序列中存在一个或多个缺失。这类缺失可以在非结构蛋白(nsP)1、2、3或4中，以及一种以上nsP基因的缺失组合。例如但不限于，缺失至少包括编码VEE nsP1氨基酸残基101-120、450-470、460-480、470-490或480-500的核苷酸序列以及其中包含的更小区域，上述编号是相对于Kinney等(1989)Virology170：19-30中序列的序列编号。

在其它实施方式中，缺失至少包括编码VEE nsP2氨基酸残基9-29、613-633、650-670或740-760的序列以及其中包含的更小区域。在另一实施方式中，缺失至少包括编码VEE nsP3氨基酸残基340-370、350-380、360-390、370-400、380-410、390-420、400-430、410-440、420-450、430-460、440-470、450-480、460-490、470-500、480-510、490-520、500-530或488-522的序列以及其中包含的更小区域。在另一实施方式中，缺失至少包括编码VEE nsP4氨基酸残基8-28或552-570的序列以及其中包含的更小区域。应注意，虽然以VEE为例说明了上述氨基酸范围，但在其它α病毒中可利用相似的缺失类型。例如，在其它实施方式中，修饰的非结构蛋白包括α病毒复制子nsP4内高度保守位置上的修饰(如缺失、加入和/或取代)。

例如，包括辛德毕斯病毒(SIN)的nsP4氨基酸368-400、塞姆利基森林病毒(SFV)的375-407和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)的383-415以及雀麦花叶病毒(BMV)2a蛋白的氨基酸462-494在内的聚合酶区具有高度序列保守性，可用作修饰的靶区域。而且，也考虑对该区域上游或下游的相邻氨基酸序列1、2或3氨基酸进行修饰。

通常，虽然α病毒之间的氨基酸编号有些差异(主要是由于多聚蛋白长度略有差异)，但在不同α病毒之间进行序列比对提供了鉴定其它α病毒中相似区域的方式(代表性比对参见Kinney等(1989)Virology 170：19-30)。优选地，在多种α病毒中，本发明非结构蛋白基因的缺失局限在认为非保守的区域或片段。此外，也可对保守区进行缺失。

围绕(在某些情况下是相互作用)α病毒复制子或载体多核苷酸组分的结构蛋白可包括衣壳和包膜蛋白。在大多数情况下，多核苷酸组分被形成核衣壳的衣壳蛋白包围。进而，核衣壳蛋白被含有包膜蛋白的脂质包膜包围。应理解，虽然优选同时含有衣壳和包膜蛋白，但不一定如此。

α病毒衣壳蛋白和包膜蛋白通常参见Strauss等(1994)Microbiol.Rev.58：491-562。衣壳蛋白是α病毒结构多聚蛋白的N末端蛋白，由多聚蛋白加工后，能与α病毒RNA和其它衣壳蛋白单体相互作用形成核衣壳结构。

α病毒包膜糖蛋白(如E2、E1)由包膜颗粒突出形成表面“突刺”，在功能上，它参与了受体结合和进入靶细胞。

与野生型相比，这些结构蛋白之一或两者(或其区域)可包括一种或多种修饰。“杂交”结构蛋白(如含有衍生自两种或多种α病毒的序列的蛋白质)也可用于实施本发明。杂交蛋白可包括衍生自不同α病毒的一个或多个区域。这些区域可能是毗连或非毗连的。优选地，结构蛋白的特定区域(如功能区，如包膜蛋白的胞质尾部分或衣壳蛋白的RNA结合域)衍生自第一种α病毒。该蛋白中任何数量的“其余”序列(如所示区域外的任何序列)可能衍生自与第一种不同的一种或多种α病毒。“其余”部分中优选约25％-100％(或它们之间的任何百分数值)、更优选约35％-100％(或它们之间的任何百分数值)、更优选约50％-100％(或它们之间的任何百分数值)衍生自不同α病毒。杂交物中衍生自所述一种或多种不同α病毒的序列可以是毗连或非毗连的，换言之，衍生自所述一种或多种不同α病毒的序列与衍生自一种或多种不同α病毒的序列可能被间隔开。

该颗粒还可含有其它组分(如靶向元件如生物素、其它病毒结构蛋白或其部分、杂交包膜或其它受体结合配体)，它们指导产生该α病毒的颗粒的趋向性。通常，有效形成复制子颗粒或核衣壳所必需的α病毒RNA和结构蛋白之间的相互作用可能是衣壳蛋白和RNA中所含的包装信号(或包装序列)之间的RNA-蛋白质相互作用。

用于产生免疫应答时，α病毒复制子颗粒也含有编码至少一种抗原的序列。下面详细讨论这类抗原。

A.1.C.产生α病毒复制子颗粒

可采用许多公开的方法生产本发明嵌合α病毒复制子颗粒。这类方法包括，例如，瞬时包装法，如共转染体外转录的复制子和缺陷型辅助RNA(Liljestrom(1991)Bio/Technology 9：1356-1361；Bredenbeek等(1993)J.Virol.67：6439-6446；Frolov等(1997)J.Virol.71：2819-2829；Pushko等(1997)Virology239：389-401；美国专利5,789,245和5,842,723)或基于质粒DNA的复制子和缺陷型辅助构建物(Dubensky等(1996)J.Virol.70：508-519)，并将α病毒复制子引入稳定的包装细胞系(PCL)(Polo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：4598-4603；美国专利5,789,245；5,842,723；和6,015,694；国际公开号WO 97/38087；WO 99/18226；WO 00/61772；和WO 00/39318)。

在优选实施方式中，用稳定的α病毒包装细胞系生产复制子颗粒。可用体外转录的复制子RNA转染PCL，用基于质粒DNA的复制子(如ELVIS载体)转染，或用复制子颗粒接种母液感染，然后在一定条件下培育足够时间，以便在培养物上清液中产生高效价的包装复制子颗粒。在特别优选的实施方式中，将PCL用于两步法，其中第一步，用基于质粒DNA的复制子转染PCL而产生复制子颗粒接种母液。然后在第二个步骤中用接种母液感染PCL的新鲜培养物，从而产生多得多的复制子颗粒母液。可采用各种感染复数(MOI)，包括MOI＝0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、3、5或10进行这一转染过程。优选在低MOI(如小于1)下进行感染。随时间推移，可以从接种母液感染的PCL收获效价＞10⁸感染单位(IU)/ml的复制子颗粒。此外，可通过重复低感染复数感染，可将复制子颗粒传代到大量天然PCL培养物中，以便商业规模地制备相同高效价的制剂。重要的是，采用“裂解(split)”结构基因构型的PCL后，产生的这些复制子颗粒母液可能不含可检测的污染RCV。

可用生物反应器大规模生产α病毒复制子颗粒。优选地，生物反应器是外部部件生物反应器，它是对贴壁细胞进行大规模培养、生长和工艺控制的集成模块化生物反应器系统。在含有组织培养处理表面的容器或小室中使细胞(如α病毒包装细胞)贴壁和增殖，用新鲜培养基培养细胞以提高细胞产量。根据以下参数进行监测和调节，例如气体、温度、pH、葡萄糖等，用灌注泵收获粗载体。一般地，外部生物反应器的单独部件分离连接(即通过管道连接)的外部模块。外部部件可以是泵、库、充氧器、培养模块和气体非标准部件。外部部件生物反应器的代表性例子是CellCube^TM系统(Corning，Inc(康宁公司))。

在某些情况下，除了使用本文所述的外部部件生物反应器，还可采用更传统的搅拌池生物反应器来生产α病毒复制子颗粒。在搅拌池生物反应器中，α病毒包装细胞可能不贴附于任何基材(即漂浮在悬液中)或贴附于基材(如多个圆盘、微载体或巨载体、珠)。或者，可采用中空纤维培养系统。

收获后，可通过滤器(如0.2μM、0.45μM、0.65μM、0.8μM孔径)来澄清含有α病毒复制子颗粒的粗培养物上清液。任选地，可对粗上清液进行低速离心，然后过滤去除大细胞碎片。在一个实施方式中，在层析纯化步骤之前或之后将核酸内切酶(如Benzonase，西格玛(Sigma)#E8263)加入α病毒复制子颗粒制剂中，以消化外源性核酸。另外，在纯化之前可采用一种众所周知的方法浓缩该制剂(如切向流过滤)。

可通过层析技术(如离子交换层析、大小排阻层析、疏水相互作用层析、亲和层析)浓缩和纯化粗制或澄清的α病毒复制子颗粒。可依次进行两次或多次这种纯化方法。在优选实施方式中，至少利用离子交换树脂进行一个步骤的离子交换层析，如触手离子交换树脂，并且至少进行一个步骤的大小排阻层析。

简言之，可将澄清的α病毒复制子颗粒滤出液加载到含有带电的离子交换基质或树脂(如阳离子或阴离子交换树脂)的柱上。该基质或树脂可由各种物质组成，包括交联的琼脂糖、交联的聚苯乙烯、交联的苯乙烯、亲水性聚醚树脂、丙烯酸树脂和甲基丙烯酸树脂。离子交换组分可包含但不限于阳离子交换树脂，选自磺丙基阳离子交换树脂、羧甲基阳离子交换树脂、磺酸交换树脂、甲基磺酸阳离子交换树脂和SO₃-交换树脂。在其它实施方式中，离子交换组分可包含但不限于阴离子交换物，选自DEAE、TMAE或DMAE。最优选地，用触手阳离子交换树脂进行离子交换层析，其中离子交换树脂是甲基丙烯酸基树脂和SO₃-阳离子交换树脂(如FRACTOGEL^TM EDM SO₃)。

复制子颗粒可结合于离子交换树脂，然后用含有盐(如250mM或更少的NaCl)的缓冲液洗涤一次或多次。然后，用盐浓度提高的缓冲液从柱上洗脱纯化形式的复制子颗粒。在优选实施方式中，盐浓度为至少300mM、350mM、400mM、450mM或500mM。优选用分光光度计在280nm监测洗脱，但也可采用复制子滴定试验、表达转移(TOE)试验或蛋白质凝胶分析，随后用考马斯蓝染色或进行Western印迹。

随后可通过，例如，用合适的水溶液稀释或使含颗粒的洗脱液通过分子排阻柱，将更高的盐洗脱缓冲液更换为更想要的缓冲液。此外，在某些情况下，使用分子大小排阻柱也可提供进一步纯化。例如，在一个实施方式中，SephacrylS-500或S-400(Pharmacia(法玛西亚公司))层析可用作缓冲液交换，并进一步纯化由离子交换柱洗脱的含有复制子颗粒的组分。采用这种特定树脂时，通常在晚期孔隙溶剂中洗脱复制子颗粒，并且提高了纯度水平，因为一些污染物的分子量较小，并且在柱上保持的时间较长。然而，也可采用其它不同组合物的树脂以及大小排阻来获得相似或改进的结果。在这些方案中，可掺入较大的树脂如Sephacryl S-1000，它能使复制子颗粒进入基质中，从而保持的时间更长，以便分级。

B.抗原

本文所述方法可包括粘膜和全身给予一种或多种α病毒复制子颗粒，各颗粒含有编码抗原的一种或多种多核苷酸，所述抗原衍生自细菌、病毒、朊病毒、肿瘤或其它疾病的病原体。

出于本发明目的，可采用任何抗原。抗原可衍生自任何已知的病毒、细菌、寄生物和真菌，以及各种肿瘤抗原或需要对其产生免疫应答的任何其它抗原。而且，出于本发明目的，“抗原”指包含对天然序列的修饰如缺失、加入和取代(通常为保守性)的蛋白质，只要该蛋白质保持引发免疫应答的能力。这些修饰可以是有意的修饰，如定位诱变，或者可能是偶然性修饰，如产生该抗原的宿主发生突变。

用于实施本发明的抗原包括衍生自通过粘膜表面感染或传播的病原体的多肽抗原。通过粘膜表面传播的病原体和其衍生的抗原的非限制性例子包括衍生自细菌病原体(如脑膜炎奈瑟球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、衣原体、淋病和梅毒病原体)、病毒病原体(如人免疫缺陷病毒(“HIV”)、乙型肝炎和丙型肝炎病毒(分别是“HBV”和“HCV”)、人乳头瘤病毒(“HPV”)、单纯疱疹病毒(“HSV”)等)的抗原，以及寄生物、真菌和癌症抗原。关于肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的讨论参见Kalman等(1999)Nature Genetics 21：385-389；Read等(2000)Nucleic AcidsResearch 28：1397-1406；Shirai等(2000)J.Infect.Dis.181(增刊3)：S524-S527；国际公开号WO 99/27105；WO 00/27994；WO 00/37494；和WO 99/28457。

本发明文中所用的“免疫原性部分”指在合适条件下能够引发免疫应答(即细胞介导的免疫应答或体液免疫应答)的各抗原部分。“部分”的大小可变，但长度优选为至少9个氨基酸，可包括整个抗原。可通过I类主要组织相容性复合物(“MHC”)递呈、II类MHC递呈或二者介导细胞介导的免疫应答。本领域普通技术人员明白，可将本文所述抗原的各种免疫原性部分组合起来，以便在如本文所述给药时诱导免疫应答。

而且，免疫原性部分的长度可变，但该部分的长度通常优选为至少9个氨基酸，可包括整个抗原。特定序列的免疫原性常常难以预测，但可利用计算机算法如TSITES(马里兰州米迪缪尼公司(MedImmune，Maryland))预测T细胞表位，以扫描编码区中可能的T辅助细胞位点和CTL位点。通过这一分析，合成肽并且用作体外细胞毒试验的靶标。然而，也可利用其它试验，包括例如能检测是否存在新引入载体的抗体的ELISA，以及检测T辅助细胞的试验如γ干扰素试验、IL-2生产试验和增殖试验。

也可通过其它方法选择任何抗原的免疫原性部分。例如，HLA A2.1转基因小鼠可用作病毒抗原的人T细胞识别模型。简要说，在流感和乙型肝炎病毒系统中，鼠T细胞受体库能识别人T细胞识别的相同抗原决定簇。在这两种系统中，HLA A2.1转基因小鼠产生的CTL应答所指向的表位与HLA A2.1单体型的人CTL识别的表位基本相同(Vitiello等(1991)J.Exp.Med.173：1007-1015；Vitiello等(1992)Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia(乙肝病毒分子生物学特性研讨会摘要))。

可通过在各种位置上截短编码序列获得其它免疫原性部分，包括，例如，来自HIV基因组或一个或多个MenB表位等不同区域的一个或多个表位。如上所述，这类结构域包括诸如Gag、Gag-聚合酶、Gag-蛋白酶、逆转录酶(RT)、整合酶(IN)和Env等结构域。常常将结构域进一步分为多肽，如p55、p24、p6(Gag)；p160、p10、p15、p31、p65(pol、prot、RT和IN)；和gp160、gp120和gp41(Env)。HIV和其它性传播疾病的其它表位是已知的，或者不难用本文所述方法测定。本发明也包括这类多肽的分子变体，如国际公开号WO00/39302；WO 00/39304；和WO 00/39303所述。

用于实施本发明的抗原包括但不限于：下列一种或多种抗原，衍生自下列一种或多种病原体的抗原。抗原可单独使用或以任意抗原组合使用(参见例如，描述细菌抗原组合的应用的国际公开号WO 02/00249)。所述组合可包括来自同一病原体的多种抗原、来自不同病原体的多种抗原或来自相同或不同病原体的多种抗原。因此，细菌、病毒、肿瘤和/或其它抗原可包含在同一组合物中，或者可分别给予同一对象。

通常优选联合使用用于产生免疫应答的抗原组合。对胃肠道外递送和粘膜递送而言，用多种病原体或抗原进行免疫是有利的(降低给药次数)，因为能改进患者顺从性且有利于药物的运输/储存。可以预防性或治疗性使用本文所述的免疫。

B.1.细菌抗原

适用于本发明的细菌抗原包括可由细菌分离、纯化或产生的蛋白质、多糖、脂多糖和外膜囊泡。此外，细菌抗原可包括细菌裂解物和灭活的细菌制剂。细菌抗原可由重组表达方法产生。细菌抗原优选包含至少在生命周期某一阶段暴露在细菌表面上的表位。细菌抗原优选在多种血清型中保守。细菌抗原包括衍生自下列一种或多种细菌的抗原以及下文鉴定的特定抗原例子。

脑膜炎奈瑟球菌：脑膜炎球菌抗原可包括纯化或衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清组如A、C、W135、Y和/或B的蛋白质(如国际公开号WO 99/24578；WO99/36544；WO 99/57280；WO 00/22430；WO 96/29412；Tettelin等(2000)Science287：1809-1815；和Pizza等(2000)Science 287：1816-1820鉴定的蛋白)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡(国际公开号WO 01/52885；Bjune等(1991)Lancet 338(8775)：1093-1096；Fuskasawa等(1999)Vaccine 17：2951-2958；和Rosenqist等(1998)Dev.Biol.Strand 92：323-333)。脑膜炎球菌蛋白质抗原可选自粘附素、自身转运蛋白、毒素、获铁蛋白和膜结合蛋白(优选完整的外膜蛋白)。也参见参考文献63-71。

肺炎链球菌：肺炎链球菌抗原可包括肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。糖抗原可选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F。蛋白抗原可选自国际公开号WO 98/18931；国际公开号WO 98/18930；美国专利号6,699,703；美国专利号6,800,744；国际公开号WO 97/43303；或国际公开号WO 97/37026所鉴定的蛋白质。肺炎链球菌蛋白可选自聚组氨酸三聚体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133。也参见Watson等(2000)Pediatr.Infect.Dis.J.19：331-332；Rubin等(2000)Pediatr.Clin.North Am.47：269-284；和Jedrzejas等(2001)Microbiol.Mol.Biol.Rev.65：187-207。

酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)：A群链球菌抗原可包含国际公开号WO 02/34771或国际公开号WO 2005/032582中鉴定的蛋白质(包括GAS40)、GAS M蛋白片段的融合物(包括国际公开号WO 02/094851；Dale(1999)Vaccine 17：193-200；和Dale(1996)Vaccine 14(10)：944-948所述融合物)、纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)、链球菌血红素相关蛋白(Shp)和链球菌素S(SagA)。也参见Dale等(1999)Infect.Dis.Clin.North Am.13：227-243；和Ferretti等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4658-4663。

粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)：莫拉菌抗原包括国际公开号WO02/18595和WO 99/58562中鉴定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。也参见参考文献McMichael(2000)Vaccine 19增刊1：S101-S107。

百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：百日咳抗原包括百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，还任选与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3联用。参见例如，Gusttafsson等(1996)N.Engl.J.Med.334：349-355；和Rappuoli等(1991)TIBTECH 9：232-238。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：金黄色葡萄球菌抗原包括任选地偶联于无毒重组绿脓假单胞菌外毒素A的5型和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖，如StaphVAX^TM，或衍生自表面蛋白、侵袭素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)、抑制吞噬细胞吞噬、类胡萝卜素、过氧化氢酶产生的表面因子(荚膜、蛋白质A)、蛋白质A、凝固酶、凝血因子和/或裂解真核细胞膜的膜损伤性毒素(任选地脱毒)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)。参见例如Kuroda等(2001)Lancet 357：1225-1240。

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)：表皮葡萄球菌抗原包括黏液相关性抗原(SAA)。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)：破伤风抗原包括破伤风类毒素(TT)，优选用作与本发明组合物结合/偶联的载体蛋白。

白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素，优选其脱毒形式，如CRM₁₉₇。此外，考虑将能够调节、抑制ADP核糖基化或与其相关的抗原与本发明组合物组合/共同给予/偶联。这些白喉类毒素可用作载体蛋白。

流感嗜血杆菌B(Hib)：Hib抗原包括Hib糖抗原。参见例如，Costantino等(1999)Vaccine 17：1251-1263)。

绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)：假单胞菌抗原包括内毒素A、Wzz蛋白、绿脓假单胞菌LPS(更具体是分离自PAO1(O5血清型)的LPS)和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)(Price等(2001)Infect.Immun.69(5)：3510-3515)。

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。细菌抗原可衍生自嗜肺军团菌。

无乳链球菌(B类链球菌)：B类链球菌抗原包括国际公开号WO 02/34771、WO 03/093306、WO 04/041157或WO 2005/002619中鉴定的蛋白质或糖抗原(包括蛋白GBS 80、GBS 104、GBS 276和GBS 322，并且包括衍生自血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII和VIII的糖抗原)。也参见Schuchat(1999)Lancet353：51-56；和GB专利申请0026333.5；0028727.6；和015640.7。

淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)：淋病球菌抗原包括Por蛋白(或通道蛋白)如PorB(参见Zhu等(2004)Vaccine 22：660-669)、转运结合蛋白如TbpA和TbpB(参见Price等(2004)Infect.Immun.71(1)：277-283)、不透明蛋白(如Opa)、可还原修饰的蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制剂(参见Plante等(2000)J.Infect.Dis.182：848-855)。也参见国际公开号WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280和WO02/079243。

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：沙眼衣原体抗原包括衍生自血清型A、B、Ba和C(沙眼病原体，引起失明)，血清型L₁、L₂和L₃(与性病淋巴肉芽肿有关)和血清型D-K的抗原。沙眼衣原体抗原也可包括国际公开号WO00/37494、WO 03/049762、WO 03/068811或WO 05/002619中鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH样(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。

苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒)：梅毒抗原包括TmpA抗原。

杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)(引起软下疳)：杜氏嗜血菌抗原包括外膜蛋白(DsrA)。

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)：抗原包括美国专利号6,756,361提供的三糖重复(抗原)或其它肠球菌衍生抗原。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)：幽门螺杆菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。参见例如，国际公开号WO 93/18150；WO99/53310；和WO 98/04702。

腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)：抗原包括腐生葡萄球菌抗原的160kDa血凝素。

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)抗原包括LPS(Infect Immun.2002年8月；70(8)：4414)。

大肠杆菌(Escherichia coli)：大肠杆菌抗原可衍生自产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)、肠凝聚性大肠杆菌(EAggEC)、扩散粘附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)的抗原。

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)；炭疽杆菌抗原任选其脱毒抗原，选自A组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者共享的共同B组分，称为保护性抗原(PA)。

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)：鼠疫抗原包括F1荚膜抗原(Grosfeld等(2003)Infect.Immun.71(1)：374-383)、LPS(Fields等(1999)Infect.Immun.67(10)：5395-5408)、鼠疫耶尔森菌V抗原(Hill等(1997)Infect.Immun.65(11)：4476-4482)。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)：结核病抗原包括脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)的融合蛋白和/或任选地配制到阳离子脂质囊泡中的ESAT-6(Olsen等(2004)Infect.Immun.72(10)：6148-6150)，结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原(Banerjee等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12652-12657)和/或MPT51抗原(Suzuki等(2004)Infect.Immun.72(7)：3829-3837)。

立克次体：抗原包括外膜蛋白，包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)(Chao等(2004)Biochim.Biophys.Acta.1702(2)：145-152)、LPS和表面蛋白抗原(SPA)(Carl等(1989)J.Autoimmun.2增刊：81-91)。

单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)：细菌抗原可衍生自单核细胞增生利斯特菌。

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：抗原包括国际公开号WO 02/02606中鉴定的抗原。

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)：抗原包括蛋白酶抗原LPS，具体是霍乱弧菌II脂多糖、O1 Inaba O-特异性多糖、霍乱弧菌O139、IEM108疫苗抗原(Liang等(2003)Infect.Immun.71(10)：5498-5504)和/或封闭小带(Zonula occludens)毒素(Zot)。

鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(伤寒)：抗原包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi，即vax-TyVi)。

布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)：抗原包括脂蛋白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相关蛋白(Erps)，核心蛋白聚糖结合蛋白(如DbpA)和抗原性可变的VI蛋白，如与P39和P13(完整的膜蛋白，(Noppa等(2003)Infect.Immun.69(5)：3323-3334))结合的抗原以及VlsE抗原性可变蛋白(Lawrenz等(1999)J.Clin.Microbiol.37(12)3997-4004)。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)：抗原包括牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白(OMP)。参见例如，Ross等(2001)Vaccine 19：4135-4132。

克雷伯菌(Klebsiella)：抗原包括OMP(包括OMP A)或任选地偶联于破伤风类毒素的多糖。

其它细菌抗原可以是上述任何一种细菌的荚膜抗原、多糖抗原或蛋白质抗原。其它细菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制剂。此外，抗原包括活、减毒和/或纯化的任何上述细菌。抗原可衍生自革兰阴性菌或革兰阳性菌。抗原可衍生好氧或厌氧性细菌。

此外，可将任何上述细菌衍生的糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)偶联于另一种物质或抗原，如载体蛋白(如CRM₁₉₇)。这类偶联可以通过将糖上的羰基部分还原性胺化到蛋白质上氨基而进行的直接偶联，如美国专利号5,360,897和Roy等(1984)Can.J.Biochem.Cell.Biol.62(5)：270-275所述。或者，糖可通过接头偶联，这些接头包括例如Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)(1996)和CRC，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(CRC，蛋白质偶联和交联的化学)(1993)中提供的琥珀酸酰胺或其它连接。

B.2.病毒抗原

用于本发明的病毒抗原包括灭活(或杀死的)病毒，减毒病毒，分离的病毒制剂，纯化的亚单位制剂，分离、纯化或衍生自病毒的病毒蛋白，以及病毒样颗粒(VLP)。病毒抗原可衍生自在细胞培养物或其它基质上增殖的病毒。或者，可重组表达病毒抗原。病毒抗原优选包含在病毒生活周期的至少一个阶段中暴露于病毒表面上的表位。病毒抗原优选在多种血清型或分离物之间的保守抗原。病毒抗原包括衍生自一种或多种下述病毒的抗原以及下面鉴定的特定抗原例子。

正粘病毒：病毒抗原可衍生自正粘病毒，如流感病毒A、B和C。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组件(PB1、PB2和PA)。优选抗原包括HA和NA。已鉴定到A型流感病毒的许多HA亚型(Kawaoka等(1990)Virol.179：759 767；Webster等，″Antigenicvariation among type A influenza viruses″(A型流感病毒的抗原性变异)，第127-168页，刊于P.Palese和D.W.Kingsbury(编)，Genetics of influenzaviruses(流感病毒的基因组学)(纽约的施普林格出版社(Springer Verlag))。

流感抗原可衍生自暴发流行期(一年一次)的流感毒株。或者，流感抗原可衍生自可能引起爆发流行的毒株(即与目前流行毒株的血凝素相比具有新型血凝素的流感毒株，或对禽类有致病性并可能水平传播给人群的流感毒株，或对人有致病性的流感毒株)。

副粘病毒科：病毒抗原可衍生自副粘病毒科病毒，如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。

肺炎病毒：病毒抗原可衍生自肺炎病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒，小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。肺炎病毒优选为RSV。肺炎病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白，包括表面蛋白融合物(F)，糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)，基质蛋白M和M2，核衣壳蛋白N、P和L以及非结构蛋白NS1和NS2。优选的肺炎病毒抗原包括F、G和M。参见例如Johnstone等(2004)J.Gen.Virol.85(Pt 11)：3229-3238)。肺炎病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。

副粘病毒：病毒抗原可衍生自副粘病毒，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎、仙台病毒、猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白质：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。副粘病毒蛋白优选包括HN、F1和F2。副粘病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。市售腮腺炎疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗(MMR)混合的减毒活腮腺炎病毒。

麻疹病毒：病毒抗原可衍生自麻疹病毒，如麻疹。麻疹病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。市售麻疹疫苗包括减毒的活麻疹病毒，一般与腮腺炎和风疹(MMR)联用。

小核糖核酸病毒：病毒抗原可衍生自小核糖核酸病毒，如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒。优选抗原衍生自肠道病毒，如脊髓灰质炎病毒的抗原。小核糖核酸病毒(如脊髓灰质炎病毒等)的描述参见，例如，Sutter等(2000)Pediatr.Clin.North Am.47：287-308；以及Zimmerman和Spann(1999)Am.Fam.Physician 59：113-118，125-126)。

肠道病毒：病毒抗原可衍生自肠道病毒，如1、2或3型脊髓灰质炎病毒，1-22型和24型柯萨奇病毒A，1-6型柯萨奇病毒B，1-9、11-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和肠道病毒68-71。肠道病毒优选脊髓灰质炎病毒。肠道病毒抗原优选选自一种或多种下述衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。市售脊髓灰质炎疫苗包括灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。

嗜肝RNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。参见例如Bell等(2000)Pediatr.Infect.Dis.J.19：1187-1188；以及Iwarson(1995)APMIS 103：321-326。市售HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。

披膜病毒：病毒抗原可衍生自披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选抗原衍生自风疹病毒(rubivirus)，如风疹病毒抗原。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原优选选自E1、E2或E3。市售风疹疫苗含有冷适应活病毒，一般与腮腺炎和麻疹疫苗(MMR)联用。

黄病毒：病毒抗原可衍生自黄病毒，如蜱媒脑炎(TBE)、登革热(1、2、3或4型)、黄热病、日本脑炎、西尼罗河脑炎、圣路易斯脑炎、俄国春夏脑炎、波瓦生脑炎。黄病毒抗原可选自PrM、M、C、E、NS-I、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b或NS5。黄病毒抗原优选选自PrM、M或E。市售TBE疫苗包含灭活的病毒。

瘟病毒：病毒抗原可衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)病毒。

嗜肝DNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。参见例如Gerlich等(1990)Vaccine 8 增刊：S63-68 & 79-80。嗜肝DNA病毒抗原可选自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。此外，嗜肝DNA病毒抗原可选自前表面(presurface)序列、前S1或前S2(以前称为前S)，以及它们的组合，如sAg/前S1、sAg/前S2、sAg/前SI/前S2和前SI/前S2。参见例如，″HBV Vaccines from the laboratory to license：a case study″(从实验室到批准上市的HBV疫苗：案例研究)，刊于Mackett，M.和Williamson，J.D.，Human Vaccines and Vaccination(人疫苗和疫苗接种)，第159-176页关于HBV结构的讨论；以及美国专利号4,722,840；5,098,704；和5,324,513；Beames等(1995)J.Virol.69：6833 6838，Birnbaum等(1990)J.Virol.64：33193330；和Zhou等(1991)J.Virol.65：5457 5464。市售HBV疫苗包含含有表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。

丙肝病毒：病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可选自E1、E2、E1/E2、NS345聚蛋白、NS345-核心聚蛋白、核心和/或非结构区肽中的一种或多种(Houghton等，Hepatology(1991)14：381)。

杆状病毒：病毒抗原可衍生自杆状病毒，如恐水病病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。杆状病毒(如狂犬病病毒等)参见例如Dressen等(1997)Vaccine 15增刊：s2-6；MMWR Morb.Mortal Wkly Rep.1998年1月16日：47(1)：12，19)。杆状病毒抗原可选自糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。市售狂犬病病毒疫苗包含用人双倍体细胞或胎猴肺细胞培养的灭活病毒。

杯状病毒科：病毒抗原可衍生自杯状病毒科，如诺沃克病毒和诺沃克样病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。

冠状病毒：病毒抗原可衍生自冠状病毒、SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自刺突(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和/或血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原优选衍生自SARS病毒。国际公开号WO 04/92360中描述了SARS病毒抗原。

呼肠病毒：病毒抗原可衍生自呼肠病毒，如正呼肠病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱传热病毒。呼肠病毒抗原可选自结构蛋白λ1、λ2、λ3、μl、μ2、σ1、σ2或σ3，或者非结构蛋白σNS、μNS或σ1s。优选的呼肠病毒抗原可衍生自轮状病毒。轮状病毒抗原可选自VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)和VP7。

细小病毒：病毒抗原可衍生自细小病毒，如细小病毒B19。细小病毒抗原可选自VP-1、VP-2、VP-3、NS-1和NS-2。细小病毒抗原优选衣壳蛋白VP-2。

δ-肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可以是衍生的HDV，特别是HDV的δ-抗原(参见例如，美国专利号5,378,814)。

戊肝病毒(HEV)：病毒抗原可衍生自HEV。

庚肝病毒(HGV)：病毒抗原可衍生自HGV。

人疱疹病毒：病毒抗原可衍生自人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人疱疹病毒6(HHV6)，人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可选自糖蛋白gB、gC、gD和gH、融合蛋白(gB)，或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、外被膜或包膜蛋白。可购得减毒的活VZV疫苗。EBV抗原可选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)或膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)或外被膜蛋白。(参见例如Chee等，Cytomegaloviruses(巨细胞病毒)(J.K.McDougall编，施普林格出版社(Springer-Verlag)，1990)第125-169页，关于巨细胞病毒的蛋白编码内容的综述；McGeoch等(1988)J.Gen.Virol.69：1531-1574，关于各种HSV-1编码蛋白的讨论；美国专利号5,171,568，关于HSV-1和HSV-2 gB和gD蛋白和其编码基因的讨论；Baer等(1984)Nature 310：207-211，关于在EBV基因组中鉴定蛋白质编码序列；以及Davison和Scott(1986)J.Gen.Virol.67：1759-1816，关于VZV的综述)。

乳头状多瘤空泡病毒：抗原可衍生自乳头状多瘤空泡病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7，或其融合物。优选将HPV抗原制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可选自VP1、VP2或VP3。

逆转录病毒：病毒抗原可衍生自逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可衍生自，例如，HTLV-1、HTLV-2、HTLV-5或HTLV-11。慢病毒抗原可衍生自HIV-1(也称为HTLV-III、LAV、ARV、HTI，R等)或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu或vpr。HIV抗原可选自gag(如p24gag和p55gag)、env(如gp160和gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、小蛋白(优选p55 gag和gp140v缺失)。HIV抗原可衍生自以下一种或多种HIV毒株：例如HIV_IIIb、HIV_SF2、HIV_LAV、HIV_LAI、HIV_MN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4。

已知且报道了任何上述HIV分离物(包括各种HIV遗传亚型的成员)的gp120包膜蛋白(参见例如，Myers等(1992)洛斯阿拉莫斯(Los Alamos)数据库，洛斯阿拉莫斯国家实验室，新墨西哥州洛斯阿拉莫斯；Myers等(1990)HumanRetroviruses and AIDS(人逆转录病毒和AIDS)(新墨西哥州洛斯阿拉莫斯：洛斯阿拉莫斯国家实验室)；和Modrow等(1987)J.Virol.61：570-578，用以比较各种HIV分离物的包膜序列)，衍生自这些分离物的抗原可用于本发明方法。衍生自各种HIV分离物的其它免疫原性蛋白质，包括各种包膜蛋白，如gp160和gp41，gag抗原如p24gag和p55gag，以及衍生自pol区的蛋白质，也适合用于本发明。

此外，由于发现不同地理区域的HIV开放阅读框中免疫学差异很大，所以在特定地理区域可能优选给予某特定抗原组合。简要说，已经鉴定了至少8种不同的HIV亚型，在这些亚型中，B病毒亚型在北美、拉美和加勒比海地区、欧洲、日本和澳大利亚较普遍。在非洲亚撒哈拉地区，几乎每一种亚型都有分布，非洲中部和东部主要是A和D亚型，非洲南部主要是C亚型。C亚型也在印度广泛分布，近年来也在巴西南部鉴定到这种亚型。最初在泰国鉴定到E亚型，也分布于中非共和国。F亚型最初出现在巴西和罗马尼亚。最近才有描述的亚型是分布于俄罗斯和加蓬的G亚型，分布于扎伊尔和喀麦隆的H亚型。已经在喀麦隆和加蓬鉴定到O病毒亚型。因此，如本领域普通技术人员所了解，通常优选构建适合在某给定地理区域普遍分布的特定HIV亚型的给药载体。可通过二维双向免疫扩散或测序分离自该区域内个体的HIV基因组(或其片段)确定特定区域的亚型。

如上所述，HIV递呈的是各种Gag和Env抗原。HIV-1 Gag蛋白参与了病毒生活周期的许多阶段，包括组装、颗粒释放后的病毒体成熟化和病毒复制中的早期进入后步骤。(Freed，E.O.(1998)Virol.251：1-15)。

本发明Env编码序列包括但不限于：编码以下HIV编码多肽的多核苷酸序列：gp160、gp140和gp120(参见例如，美国专利号5,792,459中关于HIV-1_SF2(“SF2”)Env多肽的描述)。HIV-1的包膜蛋白是约160kD的糖蛋白(gp160)。在病毒感染宿主细胞的过程中，宿主细胞蛋白酶切割gp160形成gp120和完整的膜蛋白gp41。gp41部分锚定在(并跨越)病毒体的膜双层上，而gp120节段突出到周围环境中。因为gp120和gp41之间没有共价连接，由病毒体表面和感染细胞释放游离的gp120。因此，gp160包括gp120和gp41的编码序列。多肽gp41由几个结构域组成，包括寡聚结构域(OD)和跨膜结构域(TM)。在天然包膜中，需要寡聚结构域来非共价地连接三个gp41多肽，形成三聚体结构：通过gp41三聚体(和其本身)的非共价相互作用，也以三聚体结构组织gp120多肽。切割位点大约存在于gp120多肽序列和对应于gp41的多肽序列之间。可突变该切割位点以防止在该位点上发生切割。得到的gp140多肽对应于gp160的截短形式，其中缺失了gp41的跨膜结构域。由于gp41部分中存在寡聚结构域，这种gp140多肽可以单体和寡聚体(即三聚体)形式存在，寡聚形式可称为“o”，如“ogp140”指寡聚化的gp140。在使切割位点突变以防止切割和缺失了gp41的跨膜部分的情况下，得到的多肽产物可称为“突变的”gp140。本领域技术人员明白，可以各种方式突变该切割位点。(也参见国际公开号WO00/39302)。

在某些实施方式中，一种或多种抗原衍生自HIV。HIV的基因位于原病毒DNA的中心区域，编码至少9种蛋白质，这9种蛋白质分为三种主要类型：(1)主要结构蛋白Gag、Pol和Env；(2)调节蛋白Tat和Rev以及(3)辅助蛋白Vpu、Vpr、Vif和Nef。虽然在本文中相对于获自HIV_SF2的抗原进行了描述，但可以按照本说明书的内容以相似方式操作获自其它HIV变体的序列。这类其它变体包括但不限于：获自分离物HIV_IIIb、HIV_SF2、HIV-1_SF162、HIV-1_SF170、HIV_LAV、HIV_LAI、HIV_MN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4，HIV-1毒株的其它各种亚型(如亚型A-G和O)，HIV-2毒株和各种亚型(如HIV-2_UC1和HIV-2_UC2)和猿免疫缺陷病毒(SIV)的Gag蛋白编码序列。(关于这些和其它相关病毒的描述参见例如，Virology(病毒学)，第3版(W.K.Joklik(编)1988)；Fundamental Virology(基础病毒学)，第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe(编)1991)；Virology(病毒学)，第3版(Fields，B.N.，D.M.Knipe，P.M.Howley(编)1996，Lippincott-Raven，美国宾西法尼亚州费城)。

本发明还提供了Vaccine(疫苗)，第4版(Plotkin和Orenstein编，2004)；Medical Microbiology(医学微生物学)第4版(Murray等编，2002)；Virology(病毒学)，第3版(W.K.Joklik编，1988)；和Fundamental Virology(基础免疫学)，第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)中包含的抗原和微生物。

B.3.真菌抗原

用于本发明的真菌抗原可衍生自下述真菌组的一种或多种真菌。

真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophytonfloccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，(Microsporumcards)，犬小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporumequinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，(Trichophyton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)，(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophytontonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)album变种、discoides变种、ochraceum变种，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)。

真菌病原体可衍生自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲霉(Aspergillusflavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomycescapitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、(Candidaparakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、Pythiumn insidiosum、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、(Scedosporiumapiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌(Malassezia spp.)、着色真菌(Fonsecaeaspp.)、王氏霉菌(Wangiella spp.)、孢子丝菌(Sporothrix spp.)、蛙粪霉(Basidiobolus spp.)、耳霉(Conidiobolus spp.)、根霉(Rhizopus spp.)、毛霉(Mucor spp.)、犁头霉(Absidia spp.)、被孢霉(Mortierella spp.)、小克银汉霉(Cunninghamella spp.)、瓶霉(Saksenaea spp.)、链格孢菌(Alternaria spp.)、弯孢菌(Curvularia spp.)、长蠕孢菌(Helminthosporium spp.)、镰胞菌(Fusariumspp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Penicillium spp.)、Monolinia spp.、丝核菌(Rhizoctonia spp.)、拟青霉(Paecilomyces spp.)、皮司霉(Pithomyces spp.)和枝孢霉(Cladosporium spp.)。

B.4.STD抗原

适用于本发明的一种或多种抗原可衍生自性传播疾病(STD)。这种抗原可预防或治疗一种或多种STD，如衣原体、生殖器疱疹、肝炎(如HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软下疳(见WO00/15255)。抗原可衍生自一种或多种病毒或细菌性STD。用于本发明的病毒STD抗原可衍生自，例如，HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV)和肝炎(HCV)。用于本发明的细菌STD抗原可衍生自，例如，淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体、苍白密螺旋体、杜氏嗜血菌、大肠杆菌和无乳链球菌。上面已描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

B.5.呼吸道抗原

适用于本发明的一种或多种抗原可衍生自引起呼吸道疾病的病原体。例如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒如正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PrV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起呼吸道疾病的细菌，如肺炎链球菌、绿脓假单胞菌、百日咳博德特菌、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体、炭疽杆菌和粘膜炎莫拉菌。上面描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

B.6.儿科抗原

适用于本发明的一种或多种抗原可包含适用于儿童对象的一种或多种抗原。儿童对象一般年龄小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。儿童用抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间中给予多次。儿童用抗原可衍生自可靶向儿童群体的病毒和/或儿童群体易受感染的病毒。儿童用病毒抗原包括衍生自正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)的一种或多种抗原。儿童用细菌抗原包括衍生自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、绿脓假单胞菌、无乳链球菌(B群链球菌)和大肠杆菌的一种或多种抗原。上面描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

B.7.适用于老年人或免疫力减弱个体的抗原

适用于本发明的一种或多种抗原可包含适用于老年人或免疫力减弱个体的一种或多种抗原。这些个体可能需要接种多次较高计量或用佐剂配制的疫苗，以提高他们针对靶抗原的免疫应答。目标用于老年人或免疫力减弱个体的抗原包括衍生自一种或多种以下病原体的抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、绿脓假单胞菌、嗜肺军团菌、无乳链球菌(B群链球菌)、粪肠球菌、幽门螺杆菌、肺炎衣原体、正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。上面描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

B.8.适用于青少年疫苗的抗原

适用于本发明的一种或多种抗原可包含适用于青少年对象的一种或多种抗原。青少年可能需要用先前已给予的儿童用抗原作加强接种。上面描述的儿童用抗原可能适用于青少年。此外，青少年是接受衍生自STD病原体抗原免疫接种的目标人群，以保证在开始性活动之前产生保护性或治疗性免疫力。上面描述了可能适用于青少年的STD抗原。

B.8.肿瘤抗原

适用于本发明的一种或多种抗原可包含一种或多种肿瘤抗原或癌抗原。肿瘤抗原可以是，例如，含肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。肿瘤抗原也可以是，例如，含糖的肿瘤抗原，如糖脂肿瘤抗原或神经节苷脂肿瘤抗原。肿瘤抗原还可以是，例如，表达含多肽的肿瘤抗原的含多核苷酸的肿瘤抗原，如RNA载体构建物或DNA载体构建物，如质粒DNA。

适用于实施本发明的肿瘤抗原包括各种分子，如(a)含多肽的肿瘤抗原，包括多肽(长度范围可以是，例如，8-20个氨基酸，虽然超出此长度以外的也常见)、脂多肽和糖蛋白，(b)含糖肿瘤抗原，包括多糖、粘蛋白、神经节苷脂、糖脂和糖蛋白；(c)表达抗原性多肽的多核苷酸。

肿瘤抗原可以是，例如，(a)与癌细胞相关的全长分子，(b)它们的同源或修饰形式，包括含有缺失、添加和/或取代部分的分子，以及(c)它们的片段。肿瘤抗原可以是重组形式。肿瘤抗原包括例如：CD8+淋巴细胞识别的I型-限制性抗原或CD4+淋巴细胞识别的II型-限制性抗原。

本领域已知多种肿瘤抗原，包括但不限于：(a)睾丸癌-抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族的多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(可用于，例如，检测黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、NSCLC、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌有关)、p21/Ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4(与例如黑色素瘤有关)、MUM1(与例如黑色素瘤有关)、胱冬酶-8(与例如头颈癌有关)、CIA0205(与例如膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β连环蛋白(与例如黑色素瘤有关)、TCR(与例如T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-ab1(与例如慢性髓细胞性白血病有关)、丙糖磷酸异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)过度表达的抗原，例如半乳凝集素4(与例如结直肠癌有关)、半乳凝集素9(与例如霍奇金病有关)、蛋白酶3(与例如慢性髓细胞性白血病有关)、WT1(与例如各种白血病有关)、碳酸酐酶(与例如肾癌有关)、醛缩酶A(与例如肺癌有关)、PRAME(与例如黑色素瘤有关)、HER-2/neu(与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌有关)、甲胎蛋白(与例如肝细胞瘤有关)、KSA(与例如结直肠癌有关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白MUC-1(与例如乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250(与例如肾细胞癌有关)、p53(与例如乳腺癌、结肠癌有关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌症如结直肠癌有关)，(d)共享抗原，例如，黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑素细胞刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(与例如黑色素瘤有关)，(e)前列腺相关抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，与例如前列腺癌有关，(f)免疫球蛋白独特型(与例如骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)和(g)其它肿瘤抗原，如含有多肽-和糖-的抗原，包括(i)糖蛋白如唾液酸Tn和唾液酸Le^x(与例如乳腺癌和结直肠癌有关)以及各种粘蛋白；糖蛋白可偶联于载体蛋白(如MUC-1可偶联于KLH)；(ii)脂多肽(如连接有脂部分的MUC-1)；(iii)多糖(如Globo H合成六糖)，可偶联载体蛋白(如KLH)，(iv)神经节苷脂如GM2、GM12、GD2、GD3(与例如脑癌、肺癌、黑色素瘤有关)，也可偶联载体蛋白(如KLH)。本领域已知的其它肿瘤抗原包括p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原(包括E6和E7)、乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原、人T细胞亲淋巴病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA 27.29\BCAA)、CA195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C结合蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。这些和其它细胞组分参见例如：美国专利公开号2002/0007173和其中引用的参考文献。

本发明中含多核苷酸的抗原一般包含编码以上所列癌多肽抗原的多核苷酸。优选的多核苷酸抗原包括DNA或RNA载体构建物，如质粒载体(如pCMV)，它们能在体内表达癌多肽抗原。

肿瘤抗原可衍生自，例如，突变或改变的细胞组分。改变后，这些细胞组分不再行使其调节功能，因此细胞可能发生不受控制的生长。改变的细胞组分的例子包括ras，p53，Rb，Wilms肿瘤基因编码的改变的蛋白，遍在蛋白，粘蛋白，DCC、APC和MCC基因编码的蛋白，以及受体或受体样结构，如neu、甲状腺激素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、胰岛素受体、表皮生长因子(EGF)受体和集落刺激因子(CSF)受体。美国专利号5,693,522和其中引用的参考文献描述了这些和其它细胞组分。

此外，一种或多种细菌和病毒抗原可与一种或多种肿瘤抗原联用以治疗癌症。具体说，载体蛋白如CRM₁₉₇、破伤风类毒素或鼠伤寒沙门菌抗原可与本发明化合物联用以治疗癌症。癌抗原联合疗法的效力和生物利用度高于现有疗法。

关于癌症或肿瘤抗原的其它信息可参见，例如，Moingeon(2001)Vaccine19：1305-1326；Rosenberg(2001)Nature 411：380-384；Dermine等(2002)Brit.Med.Bull.62：149-162；Espinoza-Delgado(2002)The Oncologist 7(增刊3)：20-33；Davis等(2003)J.Leukocyte Biol.23：3-29；Van den Eynde等(1995)Curr.Opin.Immunol.7：674-81；Rosenberg(1997)Immunol.Today 18：175-182；Offringa等(2000)Curr.Opin.Immunol.2：576-582；Rosenberg(1999)Immunity10：281-287；Sahin等(1997)Curr.Opin.Immunol.9：709-716；Old等(1998)J.Exp.Med.187：1163-1167；Chaux等(1999)J.Exp.Med.189：767-778；Gold等(1965)J.Exp.Med.122：467-468；Livingston等(1997)Cancer Immunol.Immunother.45：1-6；Livingston等(1997)Cancer Immunol.Immunother.45：10-19；Taylor-Papadimitriou(1997)Immunol.Today 18：105-107；Zhao X-J等(1995)J.Exp.Med.182：67-74；Theobald等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11993-11997；Gaudernack(1996)Immunotechnology 2：3-9；国际公开号WO91/02062；美国专利号6,015,567；国际公开号WO 01/08636；国际公开号WO96/30514；美国专利号5,846,538；和美国专利号5,869,445。

C.递送

本文所述方法包括粘膜和全身(胃肠道外)给药，包括例如通过静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、经皮途径进行全身给药，以及通过口服、直肠、眼内、耳或鼻内全身粘膜给药。

全身给予组合物的方法是众所周知的，包括例如(1)直接注射到血流中(如静脉内给药)；(2)直接注射到特定的组织或肿瘤中；(3)皮下给药；(4)经表皮给药；(5)皮内给药；(6)腹膜内给药；(7)经皮给药(如在可能或可能未经处理去除第一层上皮细胞的皮肤表面上给予疫苗)和/或(8)肌肉内给药。其它胃肠道外给药方式包括经肺给药、栓剂、无针注射、经皮和透皮给药。

相似地，本领域已知粘膜递送方法，如Remington′s(雷明顿药物科学)，同上，这些方法包括经鼻、直肠、口服和阴道递送。例如，任选为包肠溶衣、液体、转基因植物的片剂或胶囊可用于口服给药。将该组合物用于鼻内给药时，可以鼻喷雾、鼻滴剂、凝胶或粉末的形式给药。

可用于粘膜和/或全身给予组合物(如α病毒复制子颗粒、痘病毒颗粒、腺病毒颗粒、多肽、α病毒复制子载体、痘病毒载体、腺病毒载体等)的其它物理方法包括但不限于：脂质转染(Felgner等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413-7417)、直接DNA注射(Acsadi等(1991)Nature 352：815-818)；微粒轰击(Williams等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2726-2730)；数种类型的脂质体(参见例如，Wang等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855)；CaPO4(Dubensky等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7529-7533)；DNA配体(Wu等(1989)J.Biol.Chem.264：16985-16987)；单独给予复制子颗粒；单独给予核酸(国际公开号WO 90/11092)；或者给予连接于杀死的腺病毒的DNA(Curiel等(1992)，Hum.Gene Ther.3：147-154)；通过聚阳离子化合物如聚赖氨酸，利用受体特异性配体；以及采用补骨脂素灭活的病毒如仙台病毒或腺病毒。经皮给药可包括使用穿透增强剂、屏障破坏剂或其组合。参见例如WO99/43350。此外，给药可以是直接(即体内)给药，或给予取出(离体)且随后放回的细胞。

剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。可以任何顺序给予组合物，如一次粘膜给药后接一次全身给药；多次粘膜给药后接一次全身给药；多次粘膜给药后接多次全身给药；一次全身给药后接一次粘膜给药；多次全身给药后接一次粘膜给药；多次全身给药后接多次粘膜给药；(一次或多次)粘膜给药后接(一次或多次)全身给药，再接(一次或多次)粘膜给药；(一次或多次)全身给药后接(一次或多次)粘膜给药，再接(一次或多次)全身给药；同时给药等。

如上所述，本文所述方法优选包括至少一个初免步骤，后接至少一个加强步骤。初免和加强步骤包括将一种或多种抗原给予哺乳动物对象。在优选实施方式中，初免步骤包括粘膜给予至少一种含抗原的组合物，加强步骤包括全身给予至少一种含抗原的组合物。

可通过气溶胶、喷雾器或通过使液体沉积在鼻腔内进行粘膜递送。或者，可通过栓剂、灌肠剂或阴道灌洗剂进行加强，或者需要在感兴趣的不同粘膜表面进行直接免疫的其它吸入方法。相似地，可通过给予未覆盖粘膜的任何部位进行全身递送(如全身给药排除了给予鼻内、口服、阴道、气管内、小肠或直肠粘膜表面)。在某些实施方式中，通过特征是在对象组织上进行物理开口和通过该组织开口给予药物组合物的胃肠道外给药途径进行全身给药。具体说，胃肠道外给药应该包括但不限于：皮内、经皮、皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内或胸内注射，静脉内、动脉内或肾透析输注技术和所谓的通过组织“无针”注射。优选地，全身胃肠道外给药是肌肉内注射。

初免和/或加强组合物可以是多肽和/或DNA疫苗组合物。初免和/或加强疫苗优选含有携带编码感兴趣抗原的核酸的α病毒复制子颗粒。合适α病毒复制子颗粒的非限制性例子包括SIN、VEE和嵌合VEE/SIN复制子颗粒。在下述实施例中，示范性初免DNA疫苗是含有HIV基因作为抗原的α病毒复制子颗粒，HIV基因例如Env(gp120、gp140、g160)、Gag、Prot、Pol、tat、rev、nef、vpr、vpu、vif或其组合。在其它实施方式中，初免和/或加强组合物含有痘病毒复制子颗粒。痘病毒复制子颗粒的非限制性例子包括正痘病毒、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒(caripoxvirus)、兔痘病毒、猪痘病毒、软疣痘病毒和亚塔痘病毒复制子颗粒。在其它实施方式中，初免和/或加强组合物含有腺病毒复制子颗粒。

任选地，初免和/或加强步骤还包括与DNA疫苗组合物一起给予合适量的任何生物活性因子如细胞因子、白介素、趋化因子、配体和其最优组合，与编码抗原的DNA疫苗一起给予时，与给予仅编码抗原的DNA疫苗后产生的免疫应答相比，这些因子能提高抗原特异性免疫应答。

示范性的初免-加强方法参加下述实施例，其中经粘膜初免对象，然后用α病毒复制子颗粒全身加强。按照本发明，用α病毒复制子颗粒全身(如IM)加强后诱导免疫应答(如IgA和/或IgG)，通过粘膜免疫的初免能显著增加全身(IM)加强。

给药间隔取决于许多因素，例如患者年龄和组合物特性，医生可评价这些因素。首次初免和加强剂量之间通常间隔至少2周，一般至少4周。本发明方法可包括一个以上粘膜初免剂量和/或一个以上加强剂量，例如，两个或多个初免剂量，后接两个或多个加强剂量。术语“记忆”加强指初次加强后给予的任何加强剂量。初次加强后给予“记忆”加强的时间可以是数小时(如1-72小时或其间的任何时间点)或数天(如1-90天或其间的任何时间点)至数月(如1-36个月或其间的任何时间点)，甚至数年。可以相同或不同的时间间隔给予一个以上的记忆加强剂量。各初免剂量可采用相同或不同的免疫原性组合物。因此，可通过给药途径，而非给药时间区分初免和加强剂量。

在某些实施方式中，可通过评估免疫应答确定给药之间的时间，产生所需免疫应答时给予后续免疫原性组合物。测定对象的免疫应答的技术是已知的，包括但不限于，测定阴道和/或鼻洗液、体液(肺、阴道、鼻子等)或组织(肺等)中的体液或细胞免疫应答。

给予该组合物的哺乳动物一般是灵长动物，如人。人可以是儿童或成年人。合适的低等哺乳动物可包括小鼠。

D.药物组合物

如上所述，本文所述组合物(如α病毒复制子颗粒)也可含有其它组分，包括但不限于：肽、佐剂、运载体、载体或其它物质。

因此，在某些实施方式中，含有本文所述α病毒复制子颗粒的组合物可与一种或多种药学上可接受的盐、运载体、稀释剂或赋形剂(recipient)一起给药。

药学上可接受的盐包括但不限于：无机盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。特别有用的蛋白质基质是血清白蛋白、匙孔

血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素和本领域技术人员熟知的其它蛋白。本发明组合物还可含有脂质或赋形剂，如水、盐水、甘油、右旋糖、乙醇等(单用或联用)，以及诸如湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂等物质。脂质体还可用作本发明组合物的运载体，上文描述了这类脂质体。

在某些实施方式中，所述组合物含有一种或多种多肽，如一种或多种多肽抗原。本领域技术人员知道含有免疫原性多肽作为活性成分的免疫原性化合物制剂。一般将这类免疫原性化合物制备成溶液或悬液形式的注射剂；也可制备适合在注射前溶解、悬浮于液体的固体形式。也可以乳化该制剂，或者将蛋白质包裹在脂质体中。多肽抗原可与α病毒复制子颗粒分开给药，例如在给予含有上述α病毒复制子颗粒的组合物之前、同时或之后给予多肽抗原。可通过任何途径给予多肽抗原，包括粘膜、全身或其组合。

相似地，也可将编码一种或多种抗原的一种或多种多核苷酸给予该对象。多核苷酸抗原可与α病毒复制子颗粒分开给药，例如在给予含有上述α病毒复制子颗粒的组合物之前、同时或之后给予多核苷酸抗原。在其它实施方式中，用痘病毒(如牛痘)颗粒和/或腺病毒颗粒给予多核苷酸抗原。参见例如，Doria-Rose等(2003)J.Virol.77(21)：11563-11577；Shayakhmetov等(2000)J.Virol.74：2567-2583。可通过任何途径给予多核苷酸抗原，包括粘膜、全身或其组合。在某些实施方式中，多核苷酸含有一种或多种α病毒复制子载体，各载体含有编码一种或多种抗原性多肽的至少一种序列。在其它实施方式中，多核苷酸含有一种或多种痘病毒载体，包括例如金丝雀痘病毒或牛痘病毒(如Fisher-Hoch等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：317-321；Flexner等(1989)Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103；Flexner等(1990)Vaccine 8：17-21；美国专利4,603,112；4,769,330；和5,017,487；国际公开号WO 89/01973)，各载体含有编码一种或多种抗原性多肽的至少一种序列。在其它实施方式中，多核苷酸含有一种或多种腺病毒病毒载体(参见例如，Berkner(1988)Biotechniques 6：616-627；Rosenfeld等(1991)Science 252：431-434)，各载体含有编码一种或多种抗原性多肽的至少一种序列。

而且，如上所述，粘膜或全身给药的免疫原性组合物可含有一种或多种载体或运载体。本领域熟知药学上可接受的运载体。药学上可接受的运载体本身应不诱导产生对宿主有害的抗体。合适的运载体一般是代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(如油滴或脂质体)和灭活病毒颗粒。颗粒运载体的例子包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的颗粒，以及衍生自聚(丙交酯)和称为PLG的聚(丙交酯-乙交酯共聚物)的微粒。参见例如，Jeffery等(1993)Pharm.Res.10：362-368；McGee等(1997)J.Microencapsul.14(2)：197-210；O′Hagan等(1993)Vaccine 11(2)：149-154。本领域普通技术人员熟知这类运载体。此外，这些运载体可用作免疫刺激剂(“佐剂”)。

本文所述组合物也可采用一种或多种佐剂。佐剂是特异性或非特异性提高对抗原的免疫应答的物质，包括例如，免疫加强分子如CpG寡核苷酸和咪唑并喹啉化合物。

可用于本文所述组合物的佐剂的例子包括但不限于：一种或多种下列物质：

A.油乳剂

适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物和制剂(含有或不含其它特异性免疫刺激剂如胞壁酰肽或细菌细胞壁组分)包含鲨烯-水乳剂，如MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。参见WO 90/14837。也参见Podda(2001)Vaccine 19：2673-2680；Frey等(2003)Vaccine 21：4234-4237。将MF59用作FLUAD^TM流感病毒三价亚单位疫苗的佐剂。

用于组合物的尤其优选的佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选地含有各种含量的MTP-PE的鲨烯/水乳剂，如含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80^TM(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85^TM(脱水山W梨糖醇三油酸酯)，以及任选的N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂，例如，称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(WO 90/14837；美国专利号6,299,884；美国专利号6,451,325；和Ott等，“MF59-Design and Evaluation of a Safe and PotentAdjuvant for Human Vaccines”(MF59-一种用于人疫苗的安全有效佐剂的设计和评价)，刊于Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计：亚单位和佐剂方法)(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)(纽约：普利纳母出版社(Plenum Press))1995，第277-296页)。MF59含有4-5％w/v鲨烯(如4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80^TM和0.5％w/v Span 85^TM，任选含有不同量的MTP-PE，用微流化床如110Y型微流化床(微流体公司(Microfluidics)，马萨诸塞州牛顿)制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的含量可以是约0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选0-100μg/剂。本文所用术语“MF59-0”指不含MTP-PE的上述亚微米水包油乳剂，而术语MF59-MTP指含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”每剂量含有100μg MTP-PE，等等。另一种本文所用的亚微米水包油乳剂MF69含有4.3％w/v鲨烯、0.25％w/v吐温80^TM和0.75％w/v Span 85^TM，任选含有MTP-PE。另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10％鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，也将其微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP指含有MTP，如每剂量100-400μg MTP-PE的MF75制剂。

用于本发明组合物的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂如胞壁酰肽详见WO 90/14837；美国专利号6,299,884；和美国专利号6,451,325。

完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作本发明佐剂。

B.含有矿物质的组合物

适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(参见例如，Vaccine Design：TheSubunit and Adjuvant Approach(疫苗设计：亚单位和佐剂方法)(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)(纽约：普利纳母出版社(Plenum Press))1995，第8章和第9章)，或不同无机化合物的混合物(如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地含有过量磷酸盐)，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附于该盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒(WO 00/23105)。

本发明疫苗中可包含铝盐，Al³⁺剂量为每剂量0.2-1.0mg。

在一个实施方式中，用于本发明的铝基佐剂是明矾(硫酸铝钾(AlK(SO₄)₂))或明矾衍生物，如通过将磷酸盐缓冲液中的抗原与明矾混合原位形成的明矾衍生物，然后用碱如氢氧化铝或氢氧化钠滴定和沉淀。

用于本发明疫苗制剂的另一种铝基佐剂是氢氧化铝佐剂(Al(OH)₃)或羟基氧化铝结晶(AlOOH)，它是一种出色的吸附剂，表面积约为500m²/g。或者，提供了磷酸铝佐剂(AlPO₄)或羟基磷酸铝，这类佐剂中用磷酸基团取代了一部分或所有的氢氧化铝佐剂羟基。本文提供的优选磷酸铝佐剂在酸性、碱性和中性介质中是无定形和可溶的。

在另一实施方式中，本发明佐剂含有磷酸铝和氢氧化铝。在其更具体的实施方式中，该佐剂中磷酸铝的含量大大高于氢氧化铝，例如，磷酸铝与氢氧化铝的重量比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或更高。更具体地，疫苗中的铝盐含量为每疫苗剂量0.4-1.0mg，或每疫苗剂量0.4-0.8mg，或每疫苗剂量0.5-0.7mg，或每疫苗剂量约0.6mg。

通常，通过优化分子间静电引力选择优选的铝基佐剂，或多种铝基佐剂如磷酸铝与氢氧化铝的比例，以使该抗原在所需pH下携带与佐剂相反的电荷。例如，磷酸铝佐剂(iep＝4)在pH 7.4时吸附溶菌酶，而非清蛋白。如果清蛋白是靶标，应选择氢氧化铝佐剂(iep 11.4)。或者，用磷酸盐预处理氢氧化铝能降低其等电点，使其成为碱性较强抗原的优选佐剂。

C.皂苷制剂

皂苷制剂也适合用作本发明佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。皂苷佐剂制剂包括STIMULON

佐剂(Antigenics，Inc.(安替基尼公司)，马萨诸塞州列克星敦(Lexington，MA))。

已采用高效薄层层析(HP-TLC)和反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见美国专利5,057,540.。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇(参见WO 96/33739)。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。EP 0 109 942、WO 96/11711和WO 96/33739中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂，参见WO 00/07621。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献Barr等(1998)Adv.Drug Del.Rev.32：247-271。也参见Sjolander等(1998)Adv.Drug Del.Rev.32：321-338。

D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也适合用作本发明佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选地与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白。病毒体和颗粒通常无病原性、不能复制，通常不含任何天然病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到这种病毒蛋白。这些适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。WO 03/024480；WO 03/024481；Niikura等(2002)Virology 293：273-280；Lenz等(2001)J.Immunol.166(9)：5346-5355；Pinto等(2003)J.Infect.Dis.188：327-338；和Gerber等(2001)J.Virol.75(10)：4752-4760中进一步描述了VLP。在，例如，Gluck等(2002)Vaccine 20：B10-B16中进一步描述了病毒体。免疫加强重建的流感病毒体(IRIV)用作鼻内三价INFLEXAL^TM产品(Mischler and Metcalfe(2002)Vaccine 20增刊5：B17-B23)和INFLUVAC PLUS^TM产品的亚单位抗原递送系统。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如：

(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物：这类衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“微粒”形式见EP 0689 454所述。3dMPL的这种“微粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22微米膜(参见EP 0 689 454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物如RC-529，参见Johnson等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2273-2278。

(2)脂质A衍生物：脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)，如OM-174的脂质A衍生物。OM-174参见例如Meraldi等(2003)Vaccine 21：2485-2491；和Pajak等(2003)Vaccine 21：836-842。

(3)免疫刺激性寡核苷酸：适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸或聚合物分子包括含有CpG基序(含有未甲基化胞嘧啶、后接鸟苷并通过磷酸键连接的序列)的核苷酸序列。含有回文序列或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也具有免疫刺激性。CpG可包括核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链或单链。任选地，可用类似物如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参见Kandimalla等(2003)Nucl.Acids Res.31(9)：2393-2400；WO 02/26757；和WO 99/62923中有关可能的类似物取代的例子。Krieg(2003)Nat.Med.9(7)：831-835；McCluskie等(2002)FEMS Immunol.Med.Microbiol.32：179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116；和美国专利号6,429,199中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等(2003)Biochem.Soc.Trans.31(第3部分)：654-658。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。Blackwell等(2003)J.Immunol.170(8)：4061-4068；Krieg(2002)TRENDS Immunol.23(2)：64-65；和WO 01/95935中讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选CpG-A ODN。

优选构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，Kandimalla等(2003)BBRC 306：948-953；Kandimalla等(2003)Biochem.Soc.Trans.31(第3部分)：664-658；Bhagat等(2003)BBRC 300：853-861；和WO03/035836。

免疫刺激性寡核苷酸和聚合物分子也包括其它聚合物主链结构，例如但不限于，聚乙烯基主链(Pitha等(1970)Biochem.Biophys.Acta 204(1)：39-48；Pitha等(1970)BioPolymers 9(8)：965-977)和吗啉代主链(美国专利号5,142,047；美国专利号5,185,444)。本领域知道各种其它带电和不带电的多核苷酸类似物。本领域知道许多主链修饰，包括但不限于：不带电的连接(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺和氨基甲酸酯)和带电连接(如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)。

(4)ADP-核糖基化毒素和其脱毒衍生物：细菌ADP-核糖基化毒素和其脱毒衍生物可用作本发明佐剂。该蛋白质优选衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)菌。WO 95/17211中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，WO 98/42375中描述了将其用作胃肠道外佐剂。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。以下参考文献中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂：Beignon等(2002)Infect.Immun.70(6)：3012-3019；Pizza等(2001)Vaccine 19：2534-2541；Pizza等(2000)Int.J.Med.Microbiol.290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等(2000)Infect.Immun.68(9)：5306-5313；Ryan等(1999)Infect.Immun.67(12)：6270-6280；Partidos等(1999)Immunol.Lett.67(3)：209-216；Peppoloni等(2003)Vaccine 2(2)：285-293；和Pine等(2002)J.ControlRelease 85(1-3)：263-270。优选根据Domenighini等(1995)Mol.Microbiol.15(6)：1165-1167中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比对氨基酸取代基编号。

F.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球(Singh等(2001)J.Cont.Release 70：267-276)或粘膜粘着剂如聚丙烯酸交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂(参见WO 99/27960)。

G.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直径约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的微粒)，这些微粒任选经处理而具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

H.脂质体

适合用作本发明佐剂的脂质体的例子参见美国专利号6,090,406；美国专利号5,916,588；和EP 0 626 169。

I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚类和聚氧乙烯酯类(参见例如，WO 99/52549)。这种制剂还包括聚氧乙烯失水山梨糖醇酯类表面活性剂和辛苯聚醇(WO 01/21207)以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯聚醇(WO 01/21152)的混合物。

优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬酯基醚(steoryl ether)、聚氧乙烯-8-硬酯基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。

J.聚磷腈(PCPP)

Andrianov等(1998)Biomaterials 19(1-3)：109-115；和Payne等(1998)Adv.Drug Del.Rev.31(3)：185-196中描述了适合用作本发明佐剂的PCPP制剂。

K.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

L.咪唑并喹啉化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特和其类似物，参见Stanley(2002)Clin.Exp.Dermatol.27(7)：571-577；Jones(2003)Curr.Opin.Investig.Drugs 4(2)：214-218；和美国专利4,689,338；5,389,640；5,268,376；4,929,624；5,266,575；5,352,784；5,494,916；5,482,936；5,346,905；5,395,937；5,238,944；和5,525,612。

适合用作本发明佐剂的缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选这类化合物的方法包括WO 04/60308所述内容。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

N.色胺酮化合物

适合用作本发明佐剂的色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选这类化合物的方法包括WO 04/64759所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

本发明也可包括一种或多种上述佐剂的组合。例如，本发明可采用以下佐剂组合物：

(1)皂苷和水包油乳剂(WO 99/11241)；

(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)(见WO 94/00153)；

(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；

(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO 98/57659)；

(5)3dMPL与，例如，QS21和/或水包油乳剂的组合(参见EP 0 835 318；EP 0 735 898；和EP 0 761 231)；

(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或涡旋产生粒度较大的乳剂；

(7)Ribi^TM佐剂体系(RAS)(Ribi免疫化学公司(Ribi Immunochem)，汉密尔顿(Hamilton)，MT)，其含有2％鲨烯、0.2％吐温80和选自单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉酚酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(Detox^TM)；

(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dPML)；

(9)一种或多种无机盐(如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(如含有CpG基序的核苷酸序列)。

O.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。

铝盐和MF59是用于流感疫苗注射剂的优选佐剂。细菌毒素和生物粘着剂是用于粘膜递送疫苗如鼻疫苗的优选佐剂。

例如，在某些实施方式中，粘膜递送的免疫原性组合物还含有粘膜佐剂。合适佐剂包括：含CpG的寡核苷酸、生物粘着性聚合物，参见国际公开号WO99/62546和WO 00/50078；大肠杆菌不耐热肠毒素(“LT”)或其脱毒变体或者霍乱毒素(“CT”)或其脱毒变体或者由可生物降解的无毒材料形成的微粒。优选的LT突变体包括K63或R72。参见例如，国际公开号WO 93/13202；WO95/017211；WO 97/02348；和WO 97/29771；欧洲专利EP 0 620 850 B1；EP 0869 181 B1；和EP 0 732 937 B1。

冻干该组合物，或通过其它方式使其在储存中稳定。

该组合物优选含有“治疗有效量”的感兴趣大分子。即，该组合物中所含的α病毒复制子颗粒/多肽抗原/多核苷酸载体/等的含量能引起对象产生足够的反应，以防止、降低、消除或诊断症状。所需的准确量取决于所治疗的对象；治疗对象的年龄和总体状况；所治疗疾病的严重程度；在免疫应答的情况下，对象免疫系统合成抗体的能力；所需保护程度和所选的具体抗原及其给药方式等等。本领域技术人员不难确定合适的有效量。因此，“治疗有效量”落入可通过常规试验确定的较宽范围。

例如，出于本发明目的，本文所述组合物中α病毒复制子颗粒的效价优选高于每剂量10⁶IU(感染单位)，更优选高于约每剂量10⁷IU，更优选至少约每剂量10⁸IU。多肽抗原的剂量在微克至毫克量级或更高，如约1μg/剂至10mg/剂(包括其间的任何量)，优选约100μg-5mg/剂(包括其间的任何量)和更优选约250μg-750μg/剂(包括其间的任何量)。在某些实施方式中，每剂给予约0.5mg蛋白。

E.药盒

本文也描述了诱导和提高针对靶抗原的粘膜免疫应答的药盒。这类药盒优选包含初免量的α病毒复制子颗粒，其含有编码用于产生针对靶抗原的免疫应答的一种或多种抗原或其免疫活性片段的核酸。该药盒也包含有效量的含有α病毒复制子颗粒的加强疫苗组合物，所述复制子颗粒含有编码用于加强针对靶抗原的免疫应答的一种或多种抗原或其免疫活性片段的核酸。该药盒可包含一个或多个剂量的初免组合物、加强组合物或者初免和加强组合物。因此，在具体实施方式中，为了有利于重复给药，该药盒可包含一种或两种组合物的多个药瓶，各药瓶含有在每次给药时给予对象的剂量。

该药盒的其它组分包括给予各组合物的施药器。本文所用术语“施药器”指任何装置，包括但不限于皮下注射器、基因枪、喷雾器、滴药器、支气管镜、栓剂、浸渍或包被的可插入阴道的材料如软塞、灌洗制剂、阴道冲洗溶液、保留灌肠制剂、栓剂或直肠或结肠灌洗溶液，分别对人畜患者全身或粘膜施加初免和/或加强组合物。

另一个组分包括使用该药盒的说明书。使用该药盒的说明书取决于该药盒所用的抗原。该药盒也可包括如何施用初免和/或加强组合物，如施用本文提供的施药器的说明书。例如，在采用以下实施例的组合物进行粘膜免疫的情况下，说明书包括如何通过粘膜(如鼻内)给予初免DNA疫苗组合物和如何随后全身(如肌肉内)给予加强组合物的指南。

通过说明而非限制的方式提供以下实施例。

实施例1

用基于嵌合α病毒的复制子颗粒同时进行

粘膜和全身免疫后猕猴的抗-HIV-ENV抗体应答提高

人免疫缺陷病毒(HIV)在世界范围内继续引起大量感染，导致获得性免疫缺陷综合征。大多数HIV传染是通过阴道粘膜发生的。

鼻内(IN)免疫不仅能在鼻相关淋巴组织和肺中诱导局部免疫，而且能在啮齿动物(Vajdy等(2001)J.Infect.Dis.184：1613-1616；Gupta等(2005)J.Virol.79：7135-7145；Wu等(1992)Infect.Immun.61：314-322；Giuliani等(1998)J.Exp.Med.187：1123-1132；Ugozzoli等(1998)Immunology 93：563-571；Asanuma等(1998)Vaccine 16：1257-1262；Lowell等(1997)J.Infect.Dis.175：292-301)以及人和非人灵长动物(Russell等(1996)Infect.Immunity 64：1272-1283；Imaoka等(1998)J.Immunol.161：5952-5958；Moldoveanu等(1995)Vaccine13：1006-1012；Bergquist等(1997)Infect.Immun.65：2676-2684)的雌性生殖道中诱导局部免疫。相似地，啮齿动物和人的阴道内和直肠内免疫也诱导生殖道的局部免疫。参见例如Vajdy等(2001)J.Infect.Dis.184：1613-1616；Kozlowski等(1999)J.Infect.Dis.179增刊3：S493-S498；Eriksson等(1998)Infect.Immun.66：5889-5896)。

例如，与载体一起全身(IM)免疫小鼠后，VEE衍生的复制子颗粒与表达HIV-1 gag抗原的具有VEE衍生的复制子RNA和SIN-衍生的表面糖蛋白的嵌合复制子颗粒(VEE/SIN)诱导的全身细胞介导应答比前述SIN复制子颗粒高得多(Perri等(2003)J.Virol.77：10394-10493)。此外，用表达HIV-gag的VEE/SIN(VEE/SIN-gag)进行粘膜或全身免疫导致细胞IFNγ应答提高，并更好地保护阴道不受表达HIV-gag的牛痘病毒攻击(Gupta等(2005)J.Virol.79：7135-7145)。而且，与单用全身或粘膜免疫相比，粘膜免疫后用诱导的蛋白质抗原和佐剂进行全身免疫能提高粘膜和全身免疫应答(Vajdy等(2003)Immunol.110：86-94；Vajdy等(2004)AIDS Research and Human Retroviruses20：1269-1281)。

因此，为了采用粘膜初免-全身加强的灵长动物模型测定复制子颗粒的免疫原性，进行以下实验。

A.材料和方法

1.制备α病毒复制子颗粒

如Perri等(2003)J.Virol.77：10394-10493所述制备VEE/SIN-Env gp140和SIN-Env gp140或绿色荧光蛋白(GFP)复制子颗粒。简要说，通过共转染对应于复制子和两种缺陷型辅助物-一种辅助物表达衣壳蛋白而另一种辅助物表达包膜糖蛋白E2和E1-的体外转录RNA产生复制子颗粒，如Polo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：4598-4603所述。如Perri等(2000)J.Virol.74：9802-9807所述测定复制子颗粒对BHK-21细胞的效价。

在转染后20小时和30小时，收获培养物上清中表达HIV Env gp140或GFP的复制子颗粒，通过过滤澄清，用阳离子交换层析纯化。用连续稀释的颗粒过夜感染BHK-21细胞后，通过表达的gp140或GFP的胞内染色以感染单位(IU)/毫升确定复制子颗粒效价。

2.动物和免疫

每组用10⁸IU(感染单位)的编码HIV-gp140的VEE/SIN或SIN复制子颗粒鼻内(INS)免疫四只幼年雌性猕猴(Macaca mulatta)3次，间隔4周，然后用10⁸IU VEE/SIN肌肉内(IM)免疫这两组。此外，用1mg编码Env gp140的PLG-DNA肌肉内免疫四只幼年雌性猕猴2次，间隔4周，然后用10⁸IUVEE/SIN肌肉内免疫。任选地，也用寡聚gp140(o-gp140蛋白)肌肉内免疫这些小组2次，如下所示(研究设计#2)：

免疫前收集外周血单核细胞(PBMC)，每次免疫2周后收集血清、阴道洗液和唾液样品。

按照“实验动物护理的评估和鉴定联合会”(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care)和“加州大学戴维斯动物护理和使用委员会”(University of California at Davis’s Animal Care and Use Committee)的标准，在加州大学戴维斯灵长动物研究中心(Davis Primate Research Center)饲养所有动物。研究人员遵守“国家研究理事会实验室来源研究所实验动物护理和使用委员会”(Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute ofLaboratory Resources，National Research Council)制定的“实验室动物护理和使用指南”(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)。

3.收集样品

每次免疫之前和2周之后，在麻醉下对所有组的猕猴采血。共收集30ml肝素化全血。用标准程序通过Ficol分离法分离外周血单核细胞(PBMC)，立即用于ELISPOT试验或冻存待用。收集该30ml全血的血浆，储存于-20℃。而且，在麻醉下从各猕猴收集约1ml阴道灌洗液或唾液，立即在干冰上冷冻，储存于-80℃。

4.ELISA试验

用标准ELISA试验确定HIV-1 o-gp140 env-特异性血清IgG效价，如Vajdy等(2004)AIDS Res Hum Retroviruses 20(11)：1269-81和Vajdy等(2004)Immunol Cell Biol.82(6)：617-27所述。简言之，用5mg/ml的p55或o-gp140蛋白包被ELISA平板(能马希缩公司(Nunc Maxisorp)制造的96孔U形底板)。用1X PBS+0.03％吐温20(西格玛公司(Sigma))洗涤后，封闭各孔，将连续稀释的样品加到试验体系中，其中稀释剂由1X PBS+5％山羊血清(吉布科公司(GibcoBrl))+0.03％吐温20(西格玛公司)组成。各试验体系中包含血清标准品，以便进行定量。37℃培育样品和标准血清1小时，用PBS/0.03％吐温洗涤。然后用1∶40,000稀释的山羊抗-小鼠IgG-HRP(卡太格公司(Caltag))培育样品，用四甲基联苯胺(TMB-Kirkegaard and Perry(TMB-科-裴公司))发色15分钟，用2N HCl终止反应。用Titertek在450nm处测定各孔的光密度。

如Giulani等(1998)J.Exp.Med.187：1123-1132和Vajdy等(2004)AIDS ResHum Retroviruses 20(11)：1269-81和Vajdy等(2004)Immunol Cell Biol.82(6)：617-27所述，用生物发光免疫吸附实验(BIA)测定阴道灌洗液和唾液样品中的总IgA和IgG以及gp140特异性IgA和IgG。简言之，先用o-gp140抗原(5mg/ml)或山羊抗-猕猴IgA或IgG培育ELISA平板(MicroLite，获自代纳科技公司(Dynatech))过夜。封闭(5％山羊血清，25mM Tris，10mM EGTA，150mM KCl，2mg/ml BSA，0.3％吐温-20，pH 7.5)后，将用封闭缓冲液中1∶3连续稀释的阴道洗液样品加入平板中。用1∶1000稀释的山羊抗-猕猴IgA或IgG生物素偶联物(与包被抗体的来源不同)使该平板发色。

用1∶500稀释的链霉亲和素-水母发光蛋白偶联物(视莱科学公司(SeaLiteSciences)，佐治亚州博加特(Bogart，GA))培育该平板。用10mM乙酸钙引发发光，用发光计(代纳技术公司(Dynatech)ML3000)测定。根据相对光单位(RLU)进行定量，相对光单位代表在三秒(任意单位)内积分的总发光量。效价代表由截止值的RLU对数数据线性外推平均背景以上至少两个标准差的对数稀释度值。

5.用VEE、SIN或VEE/SIN离体感染猕猴PBMC

由幼年猕猴制备外周血单核细胞(PBMC)。将细胞重悬于50μl 1％RPMI(20×10⁶/ml)，然后用各自表达绿色荧光基因(GFP)的250μl VEE或500μlVEE/SIN或SIN感染，感染复数(MOI)为1∶100。然后，37℃振荡培育细胞和颗粒90分钟，然后转移到24孔板中，37℃培育过夜。BHK细胞用作阳性对照。第二天，用小鼠抗人CD14、CD11b和CD20(法明基公司(Pharmingen)，加州圣地亚哥)对细胞表面染色，并用FACS分析。

6.统计学分析

用微软Excel软件提供的斯氏T检验进行统计学分析。先进行F-检验以确定两组间单个对数值的方差是否相等，然后以95％置信区间进行斯氏t检验(双尾，假定方差相等的两个样品)。

B.结果

1.抗体应答：IgG

如上所述免疫雌性猕猴。

1.A.VEE/SIN与SIN复制子颗粒

3次IN免疫后，用VEE/SIN免疫的4只猕猴中3只发生血清转换，而用SIN免疫的4只猕猴中2只发生血清转换，但这两组之间没有显著性差异(表1)。有趣的是，与SIN的IN免疫相比，用VEE/SIN嵌合复制子颗粒进行IN免疫诱导的阴道和唾液抗-HIV-env IgG应答水平较高(表1)。

如表1和2所示，用SIN或VEE/SIN进行鼻内初次免疫后诱导抗-gp140血清IgG应答，用VEE/SIN肌肉内加强免疫后提高了这种应答。另外，用SIN或VEE/SIN鼻内初次免疫后诱导了抗-gp140阴道IgG应答，但用VEE/SIN进行肌肉内加强免疫后没有提高这种应答。

表1

1.B.研究设计#2

此外，也测定接受其它蛋白质加强的小组的血清(图4、5和6)和阴道洗液(图7、8和9)的IgG效价。

这些结果表明，用复制子颗粒进行IN/IM初免后，用MF59中的o-gp140蛋白进行肌肉内加强免疫后，显著提高了抗-gp140血清IgG应答。相似地，用复制子颗粒进行IN/IM初免后，用MF59中的o-gp140蛋白进行肌肉内加强免疫后，显著提高了抗-gp140阴道IgG应答。

2.抗体应答：IgA

2.A.VEE/SIN与SIN复制子颗粒

此外，用VEE/SIN与SIN复制子颗粒进行3次鼻内(IN)免疫、随后用VEE/SIN颗粒进行一次肌肉内免疫后，在两组中抗体应答都有显著提高。与之前用SIN颗粒IN免疫的猕猴相比，之前用VEE/SIN复制子颗粒IN免疫的猕猴的血清以及阴道和唾液IgG抗体应答水平显著较高(表2)。具体说，用SIN或VEE/SIN进行鼻内初次免疫后诱导了抗-gp140血清IgA应答，用VEE/SIN进行肌肉内加强免疫后提高了这种应答。而且，用SIN或VEE/SIN鼻内初次免疫后诱导了抗-gp140阴道和唾液IgA应答，但用VEE/SIN肌肉内加强免疫后没有提高这种应答。

表2

这些结果表明，IN初免和IM加强的动物的血清和粘膜IgG应答强于只用IM免疫的动物。此外，用VEE/SIN复制子颗粒进行IN初免和IM加强产生的效价高于用SIN进行IN初免、随后用VEE/SIN颗粒进行IM加强的情况。

3.B.研究设计#2：IgA

此外，也测定接受其它蛋白质加强的小组的血清(图10、11、12)、阴道洗液(图13、14、15)和唾液(图16、17、18)的IgA效价。

用复制子颗粒进行IN/IM初免后，用MF59中的o-gp140蛋白进行肌肉内加强免疫后，显著提高了抗-gp140血清和阴道IgA应答。然而，用复制子颗粒进行IN/IM初免后，用MF59中的o-gp140蛋白进行IM加强免疫后，没有提高了抗-gp140唾液IgA应答。

4.用VEE、SIN和VEE/SIN离体感染PBMC后比较感染的APC的特征

因为VEE/SIN和SIN具有相同的包膜糖蛋白结构，所以我们希望排除VEE/SIN相比SIN免疫原性提高是由于它们能够感染靶细胞。因此，为了确定复制子颗粒感染不同细胞群的能力，用表达绿色荧光蛋白(GFP)报道物的VEE、VEE/SIN或SIN复制子颗粒体外感染幼年猕猴的PBMC。

虽然与VEE/SIN(VEE对VEE/SIN，p＜0.029)或SIN(VEE对SIN，p＜0.00005)相比，VEE复制子颗粒能感染更高百分数的细胞，但VEE/SIN和SIN复制子颗粒感染相似百分数的细胞(图1)。而且，如图2所示，CD14+单核细胞谱系细胞是复制子颗粒的主要靶标。VEE复制子颗粒感染CD11b+单核细胞群的水平相对较低。CD20+B细胞群未被任何复制子颗粒感染。

这些数据表明，VEE/SIN和SIN复制子颗粒能感染相同百分数的细胞，它们在PBMC中的主要靶标是CD14+单核细胞谱系细胞。因此，相对SIN，VEE/SIN免疫原性提高可能不是由于它们感染靶细胞群能力的差异。

5.蛋白质表达

因为用VEE/SIN和SIN能感染相同百分数的细胞，所以也测定了编码蛋白表达水平较高是否可解释VEE/SIN相对于SIN的免疫原性较高。

用表达GFP的VEE/SIN、SIN和VEE离体感染PBMC后，与SIN相比VEE/SIN表达明显较高水平的GFP(p＜0.002)(图3)。

这些数据表明，相对于SIN，VEE/SIN免疫原性较高可能是由于感兴趣基因在感染靶细胞中的表达强度较高。

因此，本文所述实验证明，粘膜初免和胃肠道外加强免疫能刺激对象的免疫应答。

Claims (27)

1.含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第一免疫原性组合物和含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第二免疫原性组合物在制备通过粘膜给予所述第一免疫原性组合物和全身给予所述第二免疫原性组合物而使对象产生免疫应答的药物中的应用，其中所述第一和第二免疫原性组合物的α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸。

2.含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第一免疫原性组合物和含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第二免疫原性组合物在制备使对象产生免疫应答的药物中的应用，其中通过粘膜给予所述第一免疫原性组合物，分别或依次通过粘膜给予所述第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二免疫原性组合物的α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸。

3.含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第一免疫原性组合物在制备通过粘膜给药使对象产生免疫应答的药物中的应用，其中随后全身给予所述对象含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二免疫原性组合物的α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸。

4.含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第二免疫原性组合物在制备通过全身给药使对象产生免疫应答的药物中的应用，其中所述对象已经接受含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第一免疫原性组合物，其中所述第一和第二免疫原性组合物的α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸。

5.一种分别或依次使用以便使对象产生免疫应答的混合制剂形式的产品，其包含：

(a)用于粘膜给药的第一免疫原性组合物，其含有一种或多种α病毒复制子颗粒，其中所述α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸；和

(b)用于全身给药的第二免疫原性组合物，其含有一种或多种α病毒复制子颗粒，其中所述α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸。

6.一种使对象产生免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)粘膜给予所述对象含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第一免疫原性组合物，其中所述α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸；和

(b)全身给予所述对象含有一种或多种α病毒复制子颗粒的第二免疫原性组合物，其中所述α病毒复制子颗粒含有至少一种编码抗原的多核苷酸，从而在所述对象中诱导免疫应答。

7.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述粘膜给药是鼻内、直肠内或阴道内给药。

8.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述全身给药是肌肉内给药。

9.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，将所述第一免疫原性组合物给予所述对象至少两次。

10.如权利要求1-8中任一项所述的应用、产品或方法，其特征在于，将所述第一免疫原性组合物给予所述对象至少三次。

11.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，将所述第二免疫原性组合物给予所述对象至少两次。

12.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，至少一种α病毒复制子颗粒衍生自选自下组的α病毒：辛德毕斯病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)和塞姆利基森林病毒(SFV)。

13.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，至少一种α病毒复制子颗粒是嵌合VEE/SIN复制子颗粒。

14.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，至少一种抗原选自：病毒抗原、细菌抗原和肿瘤抗原。

15.如权利要求14所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述病毒抗原衍生自选自下组的病毒：流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)和乙型肝炎病毒(HBV)。

16.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述第一和第二免疫原性组合物含有相同抗原。

17.如权利要求1-15中任一项所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述第一和第二免疫原性组合物含有不同抗原。

18.如权利要求17所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述不同抗原衍生自相同病原体。

19.如权利要求17所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述不同抗原衍生自不同病原体。

20.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述第一和/或第二免疫原性组合物还包含其它递送载体。

21.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述第一和/或第二免疫原性组合物还包含佐剂。

22.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述第一和/或第二免疫原性组合物还包含一种或多种多肽抗原。

23.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述免疫应答选自：全身免疫应答、粘膜免疫应答以及全身和粘膜免疫应答。

24.如权利要求1、2和5-23中任一项所述的应用、产品或方法，其特征在于，在给予所述第二免疫原性组合物之前给予所述第一免疫原性组合物。

25.如权利要求1、2和5-23中任一项所述的应用、产品或方法，其特征在于，在给予所述第一免疫原性组合物之前给予所述第二免疫原性组合物。

26.如前述任一项权利要求所述的应用、产品或方法，还包括给予所述对象一种或多种多肽抗原或编码一种或多种抗原的一种或多种多核苷酸。

27.如权利要求26所述的应用、产品或方法，其特征在于，通过α病毒复制子载体、痘病毒复制子颗粒、痘病毒复制子载体、腺病毒复制子颗粒、腺病毒复制子载体或它们的任意组合给予所述多核苷酸。

Images