JP2009516529A - ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原 - Google Patents

ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原 Download PDF

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Abstract

ノロウイルスおよびサポウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物を記載する。特に、本発明は、１種以上のノロウイルスおよび／またはサポウイルスウイルスに由来する１種以上のキャプシドタンパク質または他の免疫原性ウイルスポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このような免疫原性ウイルスポリペプチドとアジュバントの共発現、ならびに免疫原性ウイルスポリペプチドおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）の免疫化および産生を含めた用途におけるポリヌクレオチドの使用方法に関する。また、ノロウイルスまたはサポウイルス由来のマルチエピトープ融合抗原またはポリタンパク質の産生方法、ならびに１種以上の免疫原性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＶＬＰ、および／またはアジュバントを含む免疫原性組成物も記載する。

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／７３９，２１７号の利益を請求し、この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、一般的にノロウイルスおよび／またはサポウイルスに対する免疫応答を誘発する組成物に関する。特に、本発明は、ノロウイルスおよび／もしくはサポウイルス抗原をコードする核酸、ならびに／または構造ポリペプチド、非構造ペプチド、およびポリタンパク質を含めた免疫原性ポリペプチド、ならびにそれらの断片、ならびに／またはマルチエピトープ融合タンパク質、および／または１つ以上の遺伝子型および／またはノロウイルスおよびサポウイルスの分離株に由来するウイルス様粒子を含む免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物はさらに、ロタウイルスに由来する抗原など、下痢性疾患の原因となる病原体に対する免疫化に使用することのできる抗原を含めた、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原以外の抗原を含んでもよい。また、本発明の免疫原性組成物により免疫応答を誘発する方法、ならびにノロウイルスおよび／またはサポウイルス感染症を治療する方法も記載する。
（背景）
ノロウイルス（ノーウォーク様ウイルスまたはノーウォークウイルスとしても知られる）およびサポウイルス（サッポロ様ウイルスとしても知られる）は、成人や子供における急性胃腸炎の病原体である（非特許文献１）。ノロウイルスおよびサポウイルスは、一本鎖のポジティブ鎖ゲノムＲＮＡを含む、直径２７〜３５ｎｍの、小さな非エンベロープウイルスのカリシウイルス科ファミリーのメンバーである。現在、ノロウイルスおよびサポウイルスは、ヒトの疾患を引き起こすことが知られているカリシウイルス科ファミリーの限られた２つの属である。
ノロウイルスは、９０％を超える割合で非細菌性胃腸炎を引き起こし、米国において年間推定２３００件の胃腸炎の原因とされている（非特許文献２；非特許文献３）。ノロウイルスのノーウォーク株は最初に発見されたが、ノーウォークウイルスが胃腸病の原因となっているのは１０％未満であり、９０％の症例はノロウイルスファミリーの他のメンバーが引き起こす可能性があることが現在明らかになっている（非特許文献４）。
ノロウイルス感染症の症状には、下痢および嘔吐、ならびに発熱、頭痛、悪寒および胃痛が含まれる。このような症状の原因は、イオン伝達における不均衡をもたらす、腸上皮細胞の炭水化物受容体へのノロウイルスの結合と関連すると考えられている（非特許文献５；非特許文献６）。極めて感染性の高いノロウイルスは、わずか１０個のウイルス粒子に感染するだけで疾患を引き起こす可能性がある。健康なヒトがウイルスに感染した場合は２〜４日以内に回復するが、症状を発症してから最長２週間の間はウイルスを発散し続けるとされる。そのため感染した個体は最長２週間隔離する必要がある。感染したヒトの約３０〜４０％は症状がないが、感染しやすい他人にウイルスを発散することにより感染を拡大させるとされる（非特許文献７）。一方、サポウイルスは胃腸炎の発生においてはあまり一般的でなく、ほとんどは乳児や子供に感染し、場合によっては成人にも感染する（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。サポウイルスも、最長２週間続くウイルスの発散により下痢や嘔吐を引き起こし、感染を拡大させる。
Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ３２２−３３０ Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８６：１−７ ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐ．（２０００）４９：２０７−２１１ Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７８：１５７１−１５７８；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（１０）：５７８２−６ Ｍａｒｉｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２２：１９６７−１９７７ Ｈｕｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４０５−４１５ Ｈｕｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００４ Ｊｕｎ；１２（６）：２７９−２８７ Ｚｉｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．５：２８１−２９０ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３７：２００−２０４ Ｒｏｃｋｘ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３５：２４６−２５３
以上により、ノロウイルスまたはサポウイルス感染症に関連する胃腸炎を患う罹患体を治療するための改良された治療法、および感染の拡大を防止する方法が依然として必要とされている。
（要旨）
本発明は、ノロウイルスおよびサポウイルス抗原を含む免疫原性組成物を提供する。特に、本発明は、１種以上のキャプシドタンパク質もしくはその断片、ならびに／またはノロウイルスおよび／もしくはサポウイルスの１種以上の株に由来する他の免疫原性ウイルスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また、ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するマルチエピトープ融合抗原またはポリタンパク質融合抗原の産生方法も記載する。免疫原性ポリペプチド、ペプチド、および／またはＶＬＰは、アジュバント（例えば、ＬＴ−Ｋ６３またはＬＴ−Ｒ７２などの大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）の解毒された突然変異体）と混合されるか共発現されてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、免疫化、または免疫原性ウイルスポリペプチドおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生において使用することができる。免疫原性組成物は、本明細書に記載するような、１種以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、ＶＬＰ、および／またはアジュバントを含んでもよい。特に好ましいのは、すべての病原性ノロウイルスおよび／またはサポウイルスのすべてまたは成分を含む免疫原性組成物である。さらに、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原以外の抗原を、免疫原性組成物（例えば、混合ワクチン）において使用してもよい。例えば、免疫原性組成物は、ロタウイルスに由来する抗原などの下痢性疾患を引き起こす病原体に対する免疫化において使用することのできる、他の抗原を含んでもよい。
本発明はまた種々のプロセスも提供する。
一実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを産生するプロセスであって、ポリペプチドの発現を誘導する条件下において本発明の核酸で形質転換される宿主細胞を培養することを含む、プロセスを提供する。一例として、ノロウイルスまたはサポウイルスタンパク質が組換え技術によって発現され、組換え型サブユニットノーウォークまたはノーウォーク関連ワクチンを含む免疫原性組成物を開発するために使用されてもよい。あるいは、酵母細胞内において、またはバキュロウイルス／昆虫細胞の方法またはＶＥＥ／ＳＩＮアルファウイルスの方法を使用して、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するために、ウイルスキャプシドタンパク質遺伝子が使用されてもよい。
本発明は、本発明のポリペプチドを産生するプロセスであって、化学的手段によりポリペプチドの少なくとも一部を合成する工程を含む、プロセスを提供する。
本発明は、本発明の核酸を産生するプロセスであって、核酸が（少なくとも部分的に）化学合成により産生される、プロセスを提供する。
本発明は、本発明の核酸を産生するプロセスであって、プライマーを使用した方法（例えば、ＰＣＲ）を使用して核酸を増幅する工程を含む、プロセスを提供する。
本発明は、本発明のタンパク質複合体を産生するプロセスであって、クラスＩのＭＨＣタンパク質を本発明のポリペプチドまたはその断片と接触させる工程を含む、プロセスを提供する。
本発明は、本発明のタンパク質複合体を産生するプロセスであって、本発明のポリペプチドまたはその断片を被験体に投与する工程を含む、プロセスを提供する。前記プロセスは、被験体から複合体を精製する工程もさらに含んでよい。
本発明は、組成物を産生するプロセスであって、本発明のポリペプチドおよび／または核酸を薬学的に許容される担体または希釈剤と混合することを含む、プロセスを提供する。
従って、本発明は、以下の番号を付けた実施形態によって表わされるが、これらに限定されない。
１．配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
２．配列番号２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
３．実施形態１または２に記載のポリヌクレオチドと作動可能に連結するプロモーターを含む組換え型ポリヌクレオチド。
４．前記プロモーターがハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターである、実施形態３に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
５．α因子ターミネーターもさらに含む、実施形態３に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
６．プロモーターと作動可能に連結するアジュバントをコードするポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態３に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
７．ノロウイルスまたはサポウイルス抗原をコードする配列、およびプロモーターと作動可能に連結するアジュバントをコードする配列を含む、組換え型ポリヌクレオチド。
８．前記アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）の解毒された突然変異体である、実施形態６または７に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
９．ａ）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）ウイルス様粒子を産生することができる、配列番号１の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）配列番号２の配列を含むポリヌクレオチド；
ｄ）ウイルス様粒子を産生することができる、配列番号２の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号３の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｆ）ノーウォークウイルスの主要キャプシドタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる、配列番号３の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｇ）配列番号４の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｈ）ノーウォークウイルスのマイナー構造タンパク質に対する免疫応答を誘発することができる、配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、実施形態８に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
１０．ａ）配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される少なくとも１種の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）ノロウイルスまたはサポウイルスに対する免疫応答を誘発することができる、配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である少なくとも１つの配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）ノロウイルスまたはサポウイルスに対する免疫応答を誘発することができる、免疫原性断片をコードする配列を含むａ）またはｂ）のポリヌクレオチドの断片
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、実施形態８に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
１１．実施形態３〜１０のいずれかに記載の組換え型ポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
１２．アジュバントもさらに含む、実施形態１１に記載の組成物。
１３．前記アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＭＦ５９、およびミョウバンからなる群より選択される、実施形態１２に記載の組成物。
１４．アジュバントをコードする配列を含むポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態１１〜１３のいずれかに記載の組成物。
１５．前記アジュバントがＬＴ−Ｋ６３またはＬＴ−Ｒ７２である、実施形態１４に記載の組成物。
１６．微粒子もさらに含む、実施形態１１〜１５のいずれかに記載の組成物。
１７．前記微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−Ｃｏ−グリコリド）微粒子である、実施形態１６に記載の組成物。
１８．キトサンもさらに含む、実施形態１１〜１７のいずれかに記載の組成物。
１９．ノロウイルスまたはサポウイルス由来のポリペプチドもさらに含む、実施形態１１〜１７のいずれかに記載の組成物。
２０．ａ）配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチド；ならびに
ｃ）ａ）またはｂ）のポリペプチドの免疫原性断片
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、実施形態１９に記載の組成物。
２１．ノロウイルスまたはサポウイルスの異なる分離株に由来する少なくとも２種のポリペプチドを含む、実施形態１９に記載の組成物。
２２．少なくとも１種のポリペプチドが、ノーウォークウイルス（ＮＶ）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）、およびハワイウイルス（ＨＶ）からなる群より選択されるウイルスに由来する、実施形態２１に記載の組成物。
２３．ＮＶポリペプチド、ＳＭＶポリペプチド、およびＨＶポリペプチドを含む、実施形態２２に記載の組成物。
２４．ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するウイルス様粒子もさらに含む、実施形態１１〜２３のいずれかに記載の組成物。
２５．ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するＯＲＦ１配列を含むポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態１１〜２４のいずれかに記載の組成物。
２６．ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するＯＲＦ２配列を含むポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態１１〜２５のいずれかに記載の組成物。
２７．ノロウイルスに由来するＯＲＦ３配列を含むポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態１１〜２６のいずれかに記載の組成物。
２８．実施形態３〜１０のいずれかに記載の組換え型ポリヌクレオチドで形質転換される細胞。
２９．ノロウイルスまたはサポウイルスの２種以上の株に由来する少なくとも２種のポリペプチドを含む組成物。
３０．ノロウイルスまたはサポウイルスの２種以上の株に由来する少なくとも２種のキャプシドポリペプチドを含む、実施形態２９に記載の組成物。
３１．ａ）配列番号３〜１２からなる群より選択される配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号３〜１２からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチド、
ｃ）ａ）またはｂ）のポリペプチドの免疫原性断片
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、実施形態２９または３０に記載の組成物。
３２．少なくとも１種のキャプシドポリペプチドが、ノーウォークウイルス（ＮＶ）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）、およびハワイウイルス（ＨＶ）からなる群より選択されるウイルスに由来する、実施形態３０に記載の組成物。
３３．ＮＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチド、ＳＭＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチド、およびＨＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチドを含む、実施形態３２に記載の組成物。
３４．サポウイルスキャプシドポリペプチドもさらに含む、実施形態３１〜３３のいずれかに記載の組成物。
３５．ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するＯＲＦ１によってコードされるポリペプチドもさらに含む、実施形態２９〜３４のいずれかに記載のポリペプチド。
３６．１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来する少なくとも２種のポリペプチドを含むマルチエピトープ融合タンパク質もさらに含む、実施形態２９〜３５のいずれかに記載の組成物。
３７．前記融合タンパク質が、同一のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来するポリペプチドを含む、実施形態３６に記載の組成物。
３８．前記融合タンパク質が、異なるノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来する少なくとも２種のポリペプチドを含む、実施形態３６に記載の組成物。
３９．前記融合タンパク質が、ノロウイルスまたはサポウイルスのポリタンパク質中に天然に存在する順番でない配列を含む、実施形態３６に記載の組成物。
４０．ノロウイルスもしくはサポウイルスのＯＲＦ１をコードするポリタンパク質、またはその断片もさらに含む、実施形態２９〜３９のいずれかに記載の組成物。
４１．ノロウイルスに由来するＯＲＦ３によってコードされるポリペプチドもさらに含む、実施形態２９〜４０のいずれかに記載の組成物。
４２．ａ）配列番号４、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
ｂ）ノロウイルスに対する免疫応答を誘発することができる、配列番号４、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチド；ならびに
ｃ）ノロウイルスに対する免疫応答を誘発することができる、ａ）またはｂ）のポリペプチドの免疫原性断片
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、実施形態４１に記載の組成物。
４３．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）もさらに含む、実施形態２９〜４２のいずれかに記載の組成物。
４４．１種以上のアジュバントもさらに含む、実施形態２９〜４２のいずれかに記載の組成物。
４５．前記１種以上のアジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＭＦ５９、およびミョウバンからなる群より選択される、実施形態４４に記載の組成物。
４６．微粒子もさらに含む、実施形態２９〜４５のいずれかに記載の組成物。
４７．前記微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−Ｃｏ−グリコリド）微粒子である、実施形態４６に記載の組成物。
４８．すべての病原性ノロウイルスのすべてまたは成分を含む、実施形態２９〜４７のいずれかに記載の組成物。
４９．すべての病原性サポウイルスのすべてまたは成分を含む、実施形態２９〜４７のいずれかに記載の組成物。
５０．すべての病原性ノロウイルスおよびサポウイルスのすべてまたは成分を含む、実施形態２９〜４７のいずれかに記載の組成物。
５１．ノロウイルスまたはサポウイルスの異なる株に由来する少なくとも２種の抗原を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物。
５２．少なくとも１種の抗原が、ノーウォークウイルス（ＮＶ）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）、およびハワイウイルス（ＨＶ）からなる群より選択されるウイルスに由来する、実施形態５１に記載の組成物。
５３．ＮＶ抗原、ＳＭＶ抗原、およびＨＶ抗原を含む、実施形態５２に記載の組成物。
５４．ノロウイルスまたはサポウイルスのＯＲＦ２配列を含むポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態２９〜５３のいずれかに記載の組成物。
５５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列、または配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含む、実施形態５４に記載の組成物。
５６．ノロウイルスまたはサポウイルスのＯＲＦ１配列を含むポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態２９〜５５のいずれかに記載の組成物。
５７．ノロウイルスのＯＲＦ３配列を含むポリヌクレオチドもさらに含む、実施形態２９〜５６のいずれかに記載の組成物。
５８．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の配列、または配列番号２と少なくとも９０％同一である配列を含む、実施形態５７に記載の組成物。
５９．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）配列番号１または配列番号２の配列を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）キャプシドタンパク質が発現し、ＶＬＰに構築する条件下において、前記形質転換した宿主細胞を培養する工程
を含む、方法。
６０．２種以上のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）２種以上のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来するキャプシドタンパク質をコードする配列を含む１種以上の発現ベクターで、宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）キャプシドタンパク質が発現し、ＶＬＰに構築する条件下において、前記形質転換した宿主細胞を培養する工程
を含む、方法。
６１．ノロウイルスまたはサポウイルスに由来する構造タンパク質をコードする１つ以上の配列を含む発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換することもさらに含む、実施形態５９または６０に記載の方法。
６２．ノロウイルスに由来するＯＲＦ３配列を含む発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換することを含む、実施形態６１に記載の方法。
６３．前記発現ベクターが配列番号２のヌクレオチド配列を含む、実施形態６０に記載の方法。
６４．前記発現ベクターが、ウイルス様粒子を産生することのできる配列番号２と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、実施形態６０に記載の方法。
６５．前記発現ベクターが、ノロウイルスまたはサポウイルスに由来する１種以上のＯＲＦ１配列もさらに含む、実施形態５９〜６４のいずれかに記載の方法。
６６．アジュバントをコードする配列を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することもさらに含む、実施形態５９〜６５のいずれかに記載の方法。
６７．前記アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）の解毒された突然変異体である、実施形態６３に記載の方法。
６８．ノロウイルスまたはサポウイルスの少なくとも２種のウイルス株に由来するキャプシドタンパク質を含むモザイクＶＬＰを産生する方法であって、
ａ）前記キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローニングする工程；
ｂ）前記キャプシドタンパク質が発現し、一緒に前記ＶＬＰ中に構築する条件下において同一の宿主細胞内で前記ベクターを発現させる工程
を含む、方法。
６９．前記宿主細胞が酵母細胞である、実施形態５９〜６８のいずれかに記載の方法。
７０．前記酵母がサッカロミセス・セレビシエである、実施形態６９に記載の方法。
７１．前記宿主細胞が昆虫細胞である、実施形態５９〜６８のいずれかに記載の方法。
７２．前記発現ベクターがバキュロウイルスベクターである、実施形態７１に記載の方法。
７３．前記発現ベクターがアルファウイルスベクターである、実施形態５９〜６８のいずれかに記載の方法。
７４．ノロウイルス抗原でもサポウイルス抗原でもない抗原もさらに含む、実施形態１１〜２７または２９〜５８のいずれかに記載の組成物。
７５．前記抗原が小児用ワクチンにおいて有用である、実施形態７４に記載の組成物。
７６．前記抗原が、高齢者または免疫不全個体を保護するために設計されたワクチンにおいて有用である、実施形態７４に記載の組成物。
７７．前記抗原が、下痢性疾患を引き起こす病原体に対する免疫応答を誘発する、実施形態７４に記載の組成物。
７８．前記抗原がロタウイルス抗原である、実施形態７７に記載の組成物。
７９．被験体における免疫応答を誘発する方法であって、実施形態１１〜２７、２９〜５８、および７４〜７８のいずれかに記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
８０．アジュバントを投与することもさらに含む、実施形態７９に記載の方法。
８１．前記免疫原性組成物を前記被験体に局所投与することを含む、実施形態７９に記載の方法。
８２．前記免疫原性組成物を前記被験体に非経口投与することを含む、実施形態７９に記載の方法。
８３．ＭＦ５９およびミョウバンからなる群より選択されるアジュバントを投与することもさらに含む、実施形態８２に記載の方法。
８４．前記免疫原性組成物を前記被験体に粘膜投与することを含む、実施形態７９に記載の方法。
８５．ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）の解毒された突然変異体を含むアジュバントを投与することもさらに含む、実施形態８４に記載の方法。
８６．ａ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第一の免疫原性組成物を粘膜投与する工程；および
ｂ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第二の免疫原性組成物を局所または非経口投与する工程
を含む、実施形態７９に記載の方法。
８７．１種以上の抗原が、ノーウォークウイルス（ＮＶ）抗原、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）抗原、およびハワイウイルス（ＨＶ）抗原からなる群より選択される、実施形態８６に記載の方法。
８８．前記第一の免疫原性組成物が、実施形態１１〜２７、２９〜５８および７４〜７８のいずれかの免疫原性組成物である、実施形態８６に記載の方法。
８９．前記第二の免疫原性組成物が、実施形態１１〜２７、２９〜５８および７４〜７８のいずれかの免疫原性組成物である、実施形態８６に記載の方法。
９０．前記第一の免疫原性組成物および前記第二の免疫原性組成物が同一である、実施形態８６に記載の方法。
９１．前記第一の免疫原性組成物および前記第二の免疫原性組成物が異なる、実施形態８６に記載の方法。
９２．工程（ａ）が２回以上実施される、実施形態８６に記載の方法。
９３．工程（ｂ）が２回以上実施される、実施形態８６に記載の方法。
９４．前記粘膜投与が鼻腔内投与である、実施形態８６に記載の方法。
９５．前記粘膜投与が経口投与である、実施形態８６に記載の方法。
９６．前記粘膜投与が直腸内投与である、実施形態８６に記載の方法。
９７．前記粘膜投与が膣内投与である、実施形態８６に記載の方法。
９８．前記粘膜投与が経皮投与である、実施形態８６に記載の方法。
９９．ノロウイルスまたはサポウイルスによる感染症を治療する方法であって、実施形態１１〜２７、２９〜５８および７４〜７８のいずれかに記載の免疫原性組成物の治療有効量を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
１００．前記免疫原性組成物の複数の治療有効量を前記被験体に投与する、実施形態９９に記載の方法。
１０１．ａ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第一の免疫原性組成物の治療有効量を粘膜投与する工程；および
ｂ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第二の免疫原性組成物の治療有効量を局所または非経口投与する工程
を含む、実施形態１００に記載の方法。
１０２．１種以上の抗原が、ノーウォークウイルス（ＮＶ）抗原、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）抗原、およびハワイウイルス（ＨＶ）からなる群より選択される、実施形態１０１の方法。
１０３．前記第一の免疫原性組成物が、実施形態１１〜２７、２９〜５８および７４〜７８のいずれかに記載の免疫原性組成物である、実施形態１０１に記載の方法。
１０４．前記第二の免疫原性組成物が、実施形態１１〜２７、２９〜５８および７４〜７８のいずれかに記載の免疫原性組成物である、実施形態１０１に記載の方法。
１０５．前記第一の免疫原性組成物および前記第二の免疫原性組成物が同一である、実施形態１０１に記載の方法。
１０６．前記第一の免疫原性組成物および前記第二の免疫原性組成物が異なる、実施形態１０１に記載の方法。
１０７．工程（ａ）が２回以上実施される、実施形態１０１に記載の方法。
１０８．工程（ｂ）が２回以上実施される、実施形態１０１に記載の方法。
１０９．前記粘膜投与が鼻腔内投与である、実施形態１０１に記載の方法。
１１０．前記粘膜投与が経口投与である、実施形態１０１に記載の方法。
１１１．前記粘膜投与が直腸内投与である、実施形態１０１に記載の方法。
１１２．前記粘膜投与が膣内投与である、実施形態１０１に記載の方法。
１１３．前記非経口投与が経皮投与である、実施形態１０１に記載の方法。
１１４．下痢性疾患を引き起こす病原体による感染症を治療する方法であって、実施形態７７に記載の免疫原性組成物の治療有効量を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
１１５．前記免疫原性組成物の複数の治療有効量を前記被験体に投与する、実施形態１１４に記載の方法。
１１６．ａ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第一の免疫原性組成物の治療有効量を粘膜投与する工程；および
ｂ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第二の免疫原性組成物の治療有効量を局所または非経口投与する工程
を含む、実施形態１１５に記載の方法。
１１７．１種以上の抗原が、ノーウォークウイルス（ＮＶ）抗原、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）抗原、およびハワイウイルス（ＨＶ）からなる群より選択される、実施形態１１４〜１１６のいずれかに記載の方法。
１１８．前記免疫原性組成物がロタウイルス抗原を含む、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．ノロウイルスまたはサポウイルスにより感染した被験体の治療効果を評価する方法であって、
ａ）実施形態１１〜２７、２９〜５８および７４〜７８のいずれかに記載の免疫原性組成物の治療有効量を、評価を必要とする被験体に投与する工程；および
ｂ）前記組成物の投与後に、前記ノロウイルスまたはサポウイルスによる感染について前記被験体を監視する工程
を含む、方法。
１２０．罹患体の予防的治療の効果を評価する方法であって、
ａ）実施形態１１〜２７、２９〜５８および７４〜７８のいずれかに記載の免疫原性組成物の治療有効量を、評価を必要とする被験体に投与する工程；および
ｂ）前記組成物の投与後に、前記組成物中の１種以上の抗原に対する免疫応答について前記被験体を監視する工程
を含む、方法。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示内容を鑑みれば、当業者に容易に実施されるであろう。
（詳細な説明）
本発明の実施は、特に示さない限り、当業者の範囲内の通常の薬学、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学を使用する。このような技術は参考文献の中で十分に説明されている。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏＩｓ．Ｉ−ＩＶ （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。
以上または以下において本明細書で引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、全体が参考として本明細書で援用される。
１．定義
本出願において使用されるすべての化学的および技術的用語は、特に示さない限り、当該技術分野で通常に使用される意味を有する。本出願において使用されるように、以下の用語または語句は特定の意味を有する。
本出願および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文で特に明記されない限り複数の言及を包含する。従って、例えば、「ポリペプチド」という言及は、このようなポリヌクレオチドの２種以上の混合物などを包含する。
「含む」という用語は、「含む」および「からなる」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみをからなってもよければ、あるいは追加のもの（例えばＸ＋Ｙ）を含んでもよい。
数値ｘに関する「約」という用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
本明細書で使用される「ノロウイルス」および「ノーウォーク様ウイルス」という用語は、プラス鎖一本鎖ＲＮＡの非エンベロープウイルスのカリシウイルス科のノロウイルス属のメンバーを意味する（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１，ｐｐ．８４１−８７４（Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００１））。ノロウイルスという用語には、ウイルスのすべての遺伝子群における株が含まれる。現在、ノロウイルス株は、少なくとも２０の遺伝的クラスターに分類される、４つの遺伝子群（ＧＩ〜ＧＩＶ）に分類される。特に、ノロウイルスという用語には、ノーウォークウイルス（ＮＶ）、ロードスデイルウイルス（ＬＶ）、メキシコウイルス（ＭＶ）、ハワイウイルス（ＨＶ）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）、デザートシールドウイルス（ＤＳＶ）、およびサウスハンプトンウイルス（ＳＶ）が含まれるが、これらに限定されない。多くのノロウイルス分離株が部分的または完全に配列決定されている。例えば、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｉａｈ．ｂｂｓｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｖｉｒｕｓ／Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ／ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｍ）、ｔｈｅ Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｐａ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｓｒｍｄ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｎｏｒｗａｌｋ／ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ．ｈｔｍ）およびｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照されたい。また、ノロウイルスという用語には、出願時には特徴付けされていない分離株も含まれる。
本明細書で使用される「サポウイルス」および「サッポロ様ウイルス」という用語は、プラス鎖一本鎖ＲＮＡの非エンベロープウイルスのカリシウイルス科のサポウイルス属のメンバーを意味する（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａ）。サポウイルスとうい用語には、ウイルスのすべての遺伝子群がにおける株が含まれる。現在、サポウイルス株は、それらのキャプシド（ＶＰ１）配列に基づき、５つの遺伝子群（ＧＩ〜ＧＶ）に分類される。特に、サポウイルスという用語には、サッポロウイルス、ロンドン／２９８４５ウイルス、マンチェスターウイルス、ヒューストン／８６ウイルス、ヒューストン／９０ウイルス、およびパークヴィルウイルスが含まれるが、これらに限定されない。多くのサポウイルス分離株が部分的または完全に配列決定されている。例えば、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｉａｈ．ｂｂｓｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｖｉｒｕｓ／Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ／ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｍ）およびｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照されたい。また、サポウイルスという用語には、出願時には特徴付けされていない分離株も含まれる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味し、生産物の最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などは、この定義に含まれる。全長タンパク質およびその断片は、この定義に含まれる。前記用語には、ポリペプチドの発現後修飾型、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などが含まれる。さらに、本発明において「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限りは、野生型の配列に対して欠失、付加および置換（事実上、一般的に保存的）などの修飾を含むタンパク質を意味する。これらの修飾は、部位特異的突然変異であるかのように意図的であるか、またはタンパク質を産生するか、ＰＣＲ増幅のためにエラーを産生する、宿主の突然変異によるように偶発的であってもよい。
「十分に精製された」とは、一般的に、物質が、それが存在する試料の大部分の割合を含むような物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）の分離を意味する。通常、試料においては、十分に精製された成分は、試料の５０％、好ましくは８０％〜８５％、さらに好ましくは９０〜９５％含まれる。対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの精製のための技術は当該技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよび密度による沈殿が含まれる。
ポリペプチドに関する「分離」とは、示された分子が、事実上、分子が検出されるか、同じ種類の他の生体高分子の実質的な非存在下に存在するすべての有機体から単離および分離されることを意味する。ポリヌクレオチドに関して「分離する」という用語は、事実上、通常に関連のある配列の全体または一部において欠失する核酸分子；または天然に存在するが、それとの関連において異種の配列を有する配列；または染色体から解離される分子である。
本明細書で使用される「標識」および「検出可能な標識」という用語は、検出することのできる分子を意味し、放射性同位元素、フルオレッサー、化学ルミネッサー、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）などが含まれるが、これらに限定されない。「フルオレッサー」という用語は、検出可能な範囲内で蛍光を示すことのできる物質またはその一部を意味する。本発明において使用することができる標識の具体例には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクラジマムエステル、ＮＡＤＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼが含まれる。
「相同性」とは、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分の間の同一性の割合を意味する。２個の核酸または２個のポリペプチド配列は、配列が、分子の限定された範囲にわたり、お互いに少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８０％〜８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは９５〜９８％の配列同一性を示す場合に、「実質的に相同性」である。本明細書で使用される、実質的な同一性は、特定の配列に対して完全な同一性を示す配列も意味する。
一般的に、「同一性」とは、それぞれ、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチドとヌクレオチド、またはアミノ酸とアミノ酸の正確な一致を意味する。同一性の割合は、配列を並べ、２個の配列間の一致する正確な数を数え、短い方の配列の長さで割り、結果に１００をかけることにより、２個の分子の間の配列情報の直接比較によって決定することができる。この解析で役立つように、ペプチド解析に関するＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１の特定の相同性アルゴリズムに適合する、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ Ｓｕｐｐｌ．１：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣなどの容易に入手可能なプログラムを使用することができる。ヌクレオチドの配列同一性を決定するためのプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手できる）において入手可能であり、これらのプログラムもＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは、製造者によって推奨される規定値パラメータを使用して容易に利用され、上記に関連してＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに開示されている。例えば、基準配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性の割合は、デフォルトスコアリングテーブル、および６個のヌクレオチド部位のギャップペナルティを使用したＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムにより決定することができる。
本発明との関連において、同一性の割合を確立する他の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州マウンテンビュー）によって配布された、エディンバラ大学に版権のあるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージの目的から、スコアリングテーブルのためにデフォルトパラメータが使用される、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップエクステンションペナルティ、および６のギャップ）。データから、生成された「適合」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性の割合または類似性の計算のための他の適切なプログラムは当該技術分野で一般的に公知であり、例えば、他の配列プログラムは、デフォルトパラメータとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータ：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；分類（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用することができる。これらのプログラムの詳細は容易に入手できる。
また、相同性は、相同性領域の間で安定した二重鎖を形成する条件下においてのヌクレオチドのハイブリダイゼーション、それに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼを使用した消化、および消化された断片のサイズの測定によって決定することができる。実質的に相同的であるＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムについて定義されたストリンジェントな条件下においてサザンハイブリダイゼーション実験において特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｕｐｒａ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｓｕｐｒａを参照されたい。
本明細書で使用される、核酸分子を表現するための「組換え」とは、その起源または操作によって、事実上関連するすべてのまたは一部のポリヌクレオチドに関連しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス性、半合成または合成の起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される、「組換え」という用語は、組換え型ポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般的に、以下に詳細に記載するように、対象となる遺伝子をクローニングし、形質転換生物内で発現させる。宿主生物は、発現条件下において外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
「形質転換」という用語は、挿入のために使用される方法と関係なく、外来性のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意味する。例えば、直接取り込み、形質導入またはｆ−接合が含まれる。外来性のポリヌクレオチドは、融合しないベクター、例えば、プラスミドとして維持されるか、宿主ゲノムに融合される。
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」および単細胞の存在として培養される微生物または高等真核細胞系を表わすその他の用語は、組換えベクターまたは他の移入されたＤＮＡの受容体として使用することのできる細胞を意味し、トランスフェクとされた最初の細胞の最初の子孫が含まれる。
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列（または「制御要素」）の制御下に置かれた場合に、転写され（ＤＮＡの場合）、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンによって決定することができる。コード配列には、ウイルスに由来するｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’に位置する。
典型的な「制御要素」には、転写プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（転写終結コドンの３’に位置する）、転写開始の最適化のための配列（コード配列の５’に位置する）、および翻訳転写配列が含まれるが、これらに限定されない。
「核酸」という用語にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、修飾された骨格を含むそれらの類似体（例えば、ホスホロチオエートなど）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などもが含まれる。本発明は、上述の配列に相補的な配列（アンチセンスまたはプローブ目的のもの）を含む核酸を含む。
「作動可能に連結」とは、記載された要素が通常の機能を果たすように配置された、要素の配列を意味する。従って、コード配列に作動可能に連結する特定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に、コード配列の発現を実現することができる。それが、コード配列の発現を誘導するように機能する限りは、プロモーターはコード配列に隣接している必要はない。従って、例えば、まだ翻訳されていない、介在性の転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在してもよく、プロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結」していると考えてもよい。
「〜によってコードされる」とは、ポリペプチド配列またはその一部が、核酸配列によってコードされるポリペプチドに由来する少なくとも３〜５個、さらに好ましくは少なくとも８〜１０個、さらに好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド配列のためにコードする核酸配列を意味する。
「発現カセット」または「発現構築物」とは、対象となる配列または遺伝子の発現を誘導することのできる構築体を意味する。発現カセットは一般的に、上述の通り、対象となる配列または遺伝子と作動可能に連結している制御要素を含み（転写を誘導するため）、しばしばポリアデニル化配列も含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書に開示される発現カセットはプラスミド構築物中に含まれていてもよい。発現カセットの成分に加え、プラスミド構築物は、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、複製のＭ１３オリジン）、少なくとも１個のマルチクローニングサイト、および複製の「哺乳動物」オリジン（例えば、ＳＶ４０または複製のアデノウイルスオリジン）を含んでいてもよい。
「精製されたポリヌクレオチド」とは、基本的に、例えば、天然に関連するポリヌクレオチドについてタンパク質の少なくとも約５０％未満、好ましくは約７０％未満、さらに好ましくは約９０％未満を含まない対象となるポリヌクレオチドまたはその断片を意味する。対象となるポリヌクレオチドを精製するための技術は当該技術分野で周知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含む細胞のカオトロピック剤による破砕、およびイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよび密度による沈殿によるポリヌクレオチドおよびタンパク質の分離が含まれる。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを意味するために使用される。外来性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入される場合に、細胞は「トランスフェクト」される。いくつかのトランスフェクション技術が当該技術分野で周知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ａｎｄ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｇｅｎｅ １３．：１９７を参照されたい。このような技術は、適切な宿主細胞に１種以上の外来性ＤＮＡ部分を導入するために使用することができる。この用語は遺伝材料の安定かつ一過性の取り込みの両方を意味し、ペプチドまたは抗体と結合するＤＮＡの取り込みが含まれる。
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に移入することができる（例えば、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、特に担体、およびリポソーム）。通常、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」とは、対象となる核酸の発現を誘導することができ、核酸配列を標的細胞に移入することができる、あらゆる核酸構築物を意味する。従って、この用語には、クローニングおよび発現ベヒクル、およびウイルス性ベクターが含まれる。
「ＡＤＨ ＩＩ」とは、酵母、特にサッカロミセス、特にサッカロミセス・セレビシエに由来するグルコール抑制性アルコールデヒドロゲナーゼＩＩを意味する。「ＡＤＨ２」とは、酵母遺伝子がコードするＡＤＨ ＩＩ、およびそれが関連する抑制配列を意味する。例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４−２６８２を参照されたい。
「ＵＡＳ」とは、上流活性化配列またはエンハンサー領域についての当業界で認識される用語であり、通常、プロモーターのＴＡＴＡボックスから上流に位置する、短い繰り返しＤＮＡ配列である。本発明において、特に対象となるものは、ＡＤＨ２ ＴＡＴＡボックスから上流に位置する２２塩基対の完全な逆方向反復である、ＡＤＨ２ ＵＡＳである。Ｓｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１８９４−１９０２を参照されたい。
「ＡＤＲ１」とは、ＡＤＨ ＩＩの発現に必要な酵母に由来するポジティブな調節性遺伝子を意味する。例えば、Ｄｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：３６０−３７０を参照されたい。ＡＤＲ １遺伝子によってコードされるタンパク質は、「ＡＤＲ Ｉ」として本明細書で言及される。
「断片」は、無傷の全長の配列および構造の一部のみからなる分子を意味する。ポリペプチドの断片には、天然のポリペプチドのＣ−末端欠失、Ｎ−末端欠失、および／または内部欠失が含まれる。一般的に、ポリペプチドの断片には、問題の断片が所望の生物学的応答を誘発する能力を維持しながら、全長分子の少なくとも約５〜１０個の連続したアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５個の連続したアミノ酸残基、最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０個の連続したアミノ酸残基が含まれ、または５アミノ酸および全長配列におけるアミノ酸数の間のあらゆる整数が含まれる。核酸の断片には、核酸の５’−欠失、３’−欠失、および／または内部欠失が含まれる。核酸の断片には、一般的に全長分子の少なくとも約５〜１０００個の連続したヌクレオチド塩基が含まれ、全長分子の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０または少なくとも５００個の連続したヌクレオチドが含まれ、または５ヌクレオチドおよび全長分子におけるヌクレオチドの間のあらゆる整数が含まれる。このような断片は、ハイブリダイゼーション、増幅、免疫原性断片または核酸免疫において有用である。
「免疫原性断片」とは、１つ以上のエピトープを含む免疫原の断片であり、そのために免疫応答を調節することができ、または一緒に投与される抗原のためのアジュバントとして作用し得る免疫原を意味する。このような断片は、当業界で周知である多くのあらゆるエピトープマッピング技術を使用して特定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、固相担体上の多くのペプチド（タンパク質分子の部分に対応するペプチド）を同時合成し、および担体にペプチドが結合し続ける間に抗体とペプチドとを反応させることにより決定することができる。このような技術は当該技術分野で公知であり、例えば、すべて全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に開示されている。同様に、立体構造エピトープは、例えばＸ−線結晶学および２−次元核磁気共鳴などによりアミノ酸の空間立体配置を決定することにより容易に特定される。例えば， ｓｕｐｒａのＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。タンパク質の抗原領域は、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手できるＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算するように、標準的免疫原性およびヒドロパシープロットを使用して特定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールの決定のためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法，Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８を、ヒドロパシープロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術，Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−ｌ３２を使用する。
本発明において免疫原性断片は、通常、少なくとも２アミノ酸長、さらに好ましくは約５アミノ酸長、最も好ましくは少なくとも約１０〜約１５アミノ酸長である。断片の長さに臨界的な上限はなく、ほとんどタンパク質配列、または２個以上のエピトープを含む融合タンパク質の全長である。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、一般的に、Ｔ細胞受容体および／または抗体によって認識される抗原上の部位を意味する。好ましくは、タンパク質抗原に由来するか、その一部である短いペプチドである。しかし、この用語は、糖ペプチドおよび炭水化物エピトープを有するペプチドを含むことも意図する。いくつかの異なるエピトープが、単一の抗原分子によって保有され得る。「エピトープ」という用語には、完全な生物を認識する応答を刺激するアミノ酸または炭水化物の修飾配列もが含まれる。選択されたエピトープが、感染症を引き起こす感染因子のエピトープである場合、有利である。
エピトープは、必要以上の実験を行うことなく、アミノ酸、およびペプチドまたはポリペプチドの対応するＤＮＡ配列の知識から、および特定のアミノ酸の特性（例えば、サイズ、電荷など）、および遺伝暗号表から生成することができる。例えば、Ｉｖａｎ Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８８；Ｋｅｎｄｒｅｗ， ｓｕｐｒａ；Ｊａｎｉｓ Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２、例えばｐｐ．７９−８１を参照されたい。タンパク質が応答を刺激するかどうかを決定するためのいくつかのガイドラインには、ペプチド長が含まれ、ＭＨＣクラスＩ複合体に適合するためには、好ましくはペプチドは約８または９アミノ酸長であり、クラスＩＩのＭＨＣクラスＩ複合体複合体に適合するためには約１３〜２５アミノ酸長である。この長さは、ＭＨＣ複合体に結合するためのペプチドについて最小である。細胞がペプチドを切断するかもしれないので、ペプチドのためにはこれらの長さよりも長いことが好ましい。ペプチドは、免疫応答を起こすのに十分に高い特異性を有する、種々のクラスＩまたはクラスＩＩの分子に結合することを可能にする、適切なアンカーモチーフ（ａｎｃｈｏｒ ｍｏｔｉｆ）を含んでもよい（Ｂｏｃｃｈｉａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｎｔｉｄｅｓ ｔｏ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｂｌｏｏｄ ８５：２６８０−２６８４；Ｅｎｇｌｅｈａｒｄ，ＶＨ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ＩＩ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１８１（１９９４）を参照）。これは、対象となるタンパク質の配列を、ＭＨＣ分子に関連するペプチドの公表された構造と比較することによって、必要以上の実験を行うことなく実施することができる。従って、当業者は、タンパク質の配列を、タンパク質データベースに記載された配列と比較することによって、対象となるエピトープを確認することができる。
種々のノロウイルスのキャプシドエピトープについては、例えば、参考として本明細書で援用される、Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００５／０１５２９１１号を参照されたい。特に、Ｈａｒｄｙらは、以下の配列、すなわちＷＴＲＧＳＨＮＬ、ＷＴＲＧＧＨＧＬ、ＷＴＲＧＱＨＱＬ、またはＷＬＰＡＰＩＤＫＬを含む１３３〜１３７残基のノーウォークウイルスキャプシドタンパク質、および３１９〜３２７残基のスノーマウンテンウイルスキャプシドタンパク質のエピトープを特定した。このようなキャプシドエピトープを含む免疫原性ポリペプチド、およびそれらをコードする核酸は、本発明の実施において使用することができる。
本明細書で使用される「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、一般的にＴ細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴を意味し、「Ｂ細胞エピトープ」とは、一般的にＢ細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴を意味する。
抗原または組成物に対する「免疫応答」とは、対象となる組成物中に存在する抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の被験体における発症である。本発明において「体液性免疫応答」とは抗体分子によって媒介される免疫応答を意味するが、「細胞性免疫」とはＴ−リンパ球および／または他の白血球細胞によって媒介されるものを意味する。細胞性免疫の１つの重要な側面は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答への関与である。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と関連して存在するペプチド抗原に対して特異性を有し細胞表面で発現する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊、またはこのような微生物により感染した細胞の溶解の誘発および促進に役立つ。細胞性免疫の他の側面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、機能を活性化し、細胞表面におけるＭＨＣ分子に関連するペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に焦点を合わせることを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」とは、サイトカイン、ケモカイン、および活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む、他の白血球細胞により産生されるような分子の産生も意味する。
細胞免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でのＭＨＣ分子との関連における抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作する。細胞媒介免疫応答は、表面で抗原を提示する細胞に向かうか、または近くにある。さらに、抗原特異的Ｔ−リンパ球は、免疫化された宿主のさらなる保護を許容するために生成され得る。
細胞媒介性免疫応答を刺激する特定の抗原の能力は、多くの検定、例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）検定、ＣＴＬ細胞毒細胞検定、または感作された被験体における抗原についてのＴ−リンパ球特異的検定などにより検出することができる。このような検定は当該技術分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照されたい。細胞媒介性免疫応答の最近の測定方法には、Ｔ細胞集団またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、四量体技術による）による細胞内サイトカインまたはサイトカインの分泌の測定が含まれる（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ Ｏ'Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７−１３７１，１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１，１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７に概説されている）。
従って、本明細書で使用されているように、免疫応答は抗体の産生を促進するものである（例えば、細菌性毒素、細胞に侵入し、毒素および病原体に結合することによって複製するウイルスなどの病原体を阻害する抗体を中和し、通常、細胞を感染および破壊から保護する）。対象となる抗原は、ＣＴＬの産生も誘発する。それ故、免疫応答は、以下の効果の１つ以上、すなわち、Ｂ細胞による抗体の産生；および／または抗原に直接、または対象となる組成物またはワクチン中に存在する抗原に向けられたサプレッサーＴ細胞および／またはメモリー／エフェクターＴ細胞の活性化を誘導するかもしれない。これらの応答は、免疫化された宿主を保護するために、感染性を中和し、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する。このような応答は、当該技術分野で周知の標準的な免疫検定および中和検定を使用して検出することができる（例えば、Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：２３１−２３５；Ｄｒｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９９９）１５（１７）：１５６３−１５７１）。哺乳動物の生来の免疫システムは、トール様受容体および免疫細胞上の同様の受容体分子の活性化により、病原体の分子構造を認識し、応答する。生来の免疫システムの活性化により、種々の非適合免疫応答細胞は、例えば、種々のサイトカイン、リンホカインおよびケモカインの産生を活性化する。生来の免疫応答によって活性化される細胞には、単球および形質細胞（ＭＤＣ、ＰＤＣ）の系統の未成熟および成熟樹状細胞、ならびにガンマ、デルタ、アルファおよびベータＴ細胞およびＢ細胞などが含まれる。従って、本発明は、生来的および順応的応答の両方に関与する免疫応答も意図する。
「免疫原性組成物」とは、該組成物の被験体への投与が、対象となる抗原分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の発現をもたらす、抗原分子を含む組成物である。
「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、上述のような免疫応答を誘発するアミノ酸配列を意味する。本明細書で使用される「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドには、前駆体および成熟形態、それらの類似体、またはそれらの免疫原性断片を含む、問題のタンパク質の全長配列が含まれる。
「核酸免疫」とは、ｉｎ ｖｉｖｏでの１種以上の抗原またはエピトープの発現のための、１種以上の選択された抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入を意味する。核酸分子は、注射、吸入、経口、鼻腔内、粘膜投与などによって、受容体被験体に直接導入することができ、宿主から取り出した細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入することができる。後者においては、形質転換細胞が、核酸分子によってコードされる抗原に対して免疫応答が上昇する被験体に再導入される。
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、対象となるＤＮＡまたはＲＮＡを宿主細胞内に確実に挿入するための方法またはシステムである。このような方法は、融合されていない移入されたＤＮＡの一過性の発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製および発現、または移入された遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みをもたらし得る。遺伝子送達発現ベクターには、細菌プラスミドベクター、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。免疫に使用する場合、このような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターとして言及される。
本明細書においては、「由来する」という用語は、分子のもとの起源を特定するために使用されるが、分子が、例えば化学的合成または組換え手段により得られるかによって、方法を限定することを意味するものではない。
通常、ウイルス性ポリペプチドは、上述の通り（ｉ）ウイルスのポリヌクレオチド（ウイルス性ポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされるか、（ｉｉ）ウイルスのポリペプチドに対する配列同一性を示す場合、ウイルス（ウイルス性ポリペプチド）の特定のポリペプチドに「由来する」。
指定された配列に「由来する」ポリヌクレオチドは、対応する少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１０〜１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続した配列を含む、すなわち、指定されたヌクレオチド配列の領域に対して同一または相補的であるポリヌクレオチド配列を意味する。生成されたポリヌクレオチドは、必ずしも対象となるヌクレオチド配列に物理的に由来するものではなく、ポリヌクレオチドが生成される領域内の塩基配列によってもたらされる情報に基づく化学的合成、複製、逆転写または転写が含まれるがこれらに限定されない、あらゆる方法によって生成することができる。それ自体、オリジナルのポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス配向性のいずれかを表わすことができる。
上に定義したような、ノロウイルスまたはサポウイルスポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、それぞれノロウイルスまたはサポウイルス（ノロウイルスまたはサポウイルスの種々の分離株を含み、制限はない）に由来する分子である。分子は、問題となる特定の分離株から物理的に由来する必要はなく、合成的または組換え的に産生されてもよい。
特に、ノロウイルス株のゲノムは、３種のオープンリーディングフレーム、すなわち、ポリタンパク質に転写されるＯＲＦ１、主要キャプシドタンパク質ＶＰ１に転写されるＯＲＦ２、およびマイナー構造タンパク質ＶＰ２に転写されるＯＲＦ３を含む。ＯＲＦ１によってコードされるノロウイルスポリタンパク質は、３Ｃ様プロテアーゼによる分解を起こし、少なくとも６種の異なる生成物、Ｎ−末端タンパク質（Ｎｔｅｒｍ）、２Ｃ様ヌクレオシドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）、ｐ２０またはｐ２２（遺伝群に依存）、ウイルスタンパク質ゲノム結合（ＶＰｇ）、３Ｃ様システインプロテアーゼ（Ｐｒｏ）、およびＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）を生成する。全体が参考として本明細書で援用される、Ｂｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０９５７−１０９７４を参照されたい。ポリタンパク質は、これらのポリペプチドを、ＮＨ２−Ｎｔｅｒｍ−ＮＴＰａｓｅ−ｐ２０／ｐ２２−ＶＰｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌ−ＣＯＯＨの順番で含む。ノロウイルスＭＤ１４５−１２株においては、ポリタンパク質内のポリペプチドドメインの境界は以下の通りである。アミノ酸残基１〜３３０においてＮｔｅｒｍ、アミノ酸残基３３１〜６９６においてＮＴＰａｓｅ、アミノ酸残基６９７〜８７５においてＰ２０、アミノ酸残８７６〜１００８においてＶＰｇ、アミノ酸残基１００９〜１１８９においてプロテアーゼ、アミノ酸残基１１９０〜１６９９においてポリメラーゼ。前述の番号付けは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２株のポリタンパク質アミノ酸配列（配列番号１４）に対応するが、ノロウイルスの他の遺伝子型および分離株から得られる配列において対応するアミノ酸位置は本発明に含まれることが意図されると理解される。ＯＲＦ１によってコードされるポリペプチド、または全長のポリタンパク質、ＶＰ１またはＶＰ２、ならびにそれらの変異体、それらの免疫原性断片、およびこれらのポリペプチドをコードする核酸、変異体または免疫原性断片のあらゆるものは、本発明の実施において使用することができる。
サポウイルス株のゲノムには、２または３個のオープンリーディングフレームが含まれる。２個のオープンリーディングフレームを有するサポウイルスの株においては、ＯＲＦ１は、非構造的および構造的タンパク質を含むポリタンパク質をコードする。キャプシドタンパク質ＶＰ１は、サポウイルスポリタンパク質の成分として、ＯＲＦ１によってコードされ、マイナー構造タンパク質ＶＰ１０はＯＲＦ２によってコードされる。３個のオープンリーディングフレームを有するサポウイルスの株においては、キャプシドタンパク質のコード領域に停止コドンが先行する。キャプシドタンパク質を含まないポリタンパク質はＯＲＦ１によってコードされ、キャプシドタンパク質ＶＰ１はＯＲＦ２によってコードされ、マイナー構造タンパク質ＶＰ１０はＯＲＦ３によってコードされる。
３Ｃ様プロテアーゼによる、サポウイルスＭＣ１０株のポリタンパク質（配列番号１９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２３７４２０）の切断は、少なくとも１０個の異なる生成物、すなわち、ｐ１１、ｐ２８、ｐ３５ （ＮＴＰａｓｅ）、ｐ３２、ｐｌ４（ＶＰｇ）、ｐ７０（Ｐｒｏ−Ｐｏｌ）、ｐ６０（ＶＰｌ）を生成する。全体が参考として本明細書で援用される、Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：７２８３−７２９０を参照されたい。ポリタンパク質は、ポリペプチドを、ＮＨ２−ｐｌ１−ｐ２８−ＮＴＰａｓｅ−ｐ３２−ＶＰｇ−ｐ７０（Ｐｒｏ−Ｐｏｌ）−ＶＰｌ−ＣＯＯＨの順番で含む。ポリタンパク質のｐ７０（Ｐｒｏ−Ｐｏｌ）領域は１０５６〜１７２０残基に存在し、ポリタンパク質のＶＰ１領域は１７２１〜２２７８残基に存在する（サポウイルスＭｃ１０株を基準に番号付け（配列番号１９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２３７４２０；Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：７２８３−７２９０およびＯｋａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ａｕｇｕｓｔ １ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎを参照）。前述の番号付けは、サポウイルスＭｃ１０株のポリタンパク質アミノ酸配列（配列番号１９）に対応するが、サポウイルスの他の遺伝子型および分離株から得られる配列において対応するアミノ酸位置は本発明に含まれることが意図されると理解される。ＯＲＦ１によってコードされるポリペプチド、または全長のポリタンパク質、ＶＰ１またはＶＰ１０、ならびにそれらの変異体、それらの免疫原性断片、およびこれらのポリペプチドをコードする核酸、変異体または免疫原性断片のいずれも、本発明の実施において使用することができる。
多数のノロウイルス分離株についての核酸およびタンパク質配列は公知である。代表的なノロウイルスの配列は図１Ａ〜１Ｃ、２Ａ〜２Ｄ、１４Ａ〜１４Ｂ、および１５Ａ〜１５Ｂ、および配列番号１〜９および配列番号１３〜１７に表わされる。ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、およびそれらがコードするノロウイルス分離株に由来するポリペプチドを含む、追加の代表的配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースに記載されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋエントリー：ノロウイルス遺伝群１、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ／２００１／ＵＳＡ株、受入番号ＡＹ５０２０１６；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｂｒａｄｄｏｃｋ Ｈｅｉｇｈｔｓ／１９９９／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１５；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｙｅｔｔｅ／１９９９／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１４；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ／１９９９／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１３；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｓａｎｄｕｓｋｙ／１９９９／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１２；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｃａｎｔｏｎ／１９９９／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１１；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｉｆｆｉｎ／１９９９／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１０；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｅｌ／２００２／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２００；ノロウイルス遺伝群１、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２００１／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２００８；ノロウイルス遺伝群１、Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−８４１／２００１／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２００７；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｈｉｒａｍ／２０００／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５Ｏ２００６；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｏｎｔｏｇａｎｙ／１９９９／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２００５；ノーウォークウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１９５９；ノロウイルスＨｕ／ＧＩ／Ｏｔｏｆｕｋｅ／１９７９／ＪＰゲノムＲＮＡ，完全ゲノム，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１８７５１４；ノロウイルスＨｕ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１３３／２００３／ＪＰ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ２１２３０６，ノロウイルスＳｙｄｎｅｙ ２２１２，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８１３２；ノーウォークウイルスＳＮ２０００ＪＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１９０４５７；ロードスデイルウイルス完全ゲノム，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８６５５７；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ、Ｇｉｆｕ’９６，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０４５６０３；ノーウォークウイルスＶｉｅｔｎａｍ ０２６株，完全ゲノム，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ５０４６７１；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＬ４／２００４／ＮＬ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ８８３０９６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｈｏｋｕｓｈｉｎ／０３／ＪＰ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢｌ９５２２７；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｋａｍｏ／０３／ＪＰ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１９５２２８；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｓｉｎｓｉｒｏ／９７／ＪＰ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢｌ９５２２６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｉｎａ／０２／ＪＰ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１９５２２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｎｅｕｓｔｒｅｌｉｔｚ２６０／２０００／ＤＥ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ７７２７３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｒｅｓｄｅｎｌ７４／ｐＵＳ−ＮｏｒＩＩ／ｌ９９７／ＧＥ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ７４１８１１；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ２Ｓ１６／２００２／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８７９８９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ４Ｓ７／２００２／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８７９８７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｗｉｔｎｅｙ／Ｂ７Ｓ２／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｂａｎｂｕｒｙ／Ｂ９Ｓ２３／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＣｈｉｐｐｉｎｇＮｏｒｔｏｎ／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２８；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｉｄｃｏｔ／Ｂ９Ｓ２／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ８Ｓ５／２００２／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２６；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ４／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２５； Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ５／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２４； Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ５Ｓ２３／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２３； Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ２／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２２； Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｈｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ６／２００３／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５８８０２１；ノーウォーク様ウイルス分離株Ｂｏ／ＴｈｉｒｓｋｌＯ／００／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹｌ２６４６８；ノーウォーク様ウイルス分離株Ｂｏ／Ｐｅｎｒｉｔｈ５５／００／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹｌ２６４７６；ノーウォーク様ウイルス分離株Ｂｏ／Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ２４／００／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ１２６４７５；ノーウォーク様ウイルス分離株Ｂｏ／Ｄｕｍｆｒｉｅｓ／９４／ＵＫ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ１２６４７４；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ２０３６／２００３／Ｉｒａｑ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６７５５５５；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ１９９８／２００３／Ｉｒａｑ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６７５５５４；ノロウイルスＮＬＶ／ＢＵＤＳ／２００２／ＵＳＡ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６６０５６８；ノロウイルスＮＬＶ／Ｐａｒｉｓ Ｉｓｌａｎｄ／２００３／ＵＳＡ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６５２９７９；スノーマウンテンウイルス，完全ゲノム，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ１３４７４８；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｆｏｒｔ Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ／５６０／１９９８／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４２６；Ｈｕ／ノロウイルス／ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／１９９９／ＪＰ（９９１２−０２Ｆ），ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０４４３６６；ノーウォーク様ウイルス１１ＭＳＵ−ＭＷ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２７４８２０；ノーウォーク様ウイルスＢ−１ＳＶＤ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２７４８１９；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ Ｈｉｌｌｓ／２００２／ＵＳＡ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０２３；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ４／２００２／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０２２；ノロウイルス遺伝子群２Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ２／２００２／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０２１；ノロウイルス遺伝群２、Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ１２００２／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０２０；ノロウイルス遺伝型２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ａｎｃｈｏｒａｇｅ／２００２／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１９；ノロウイルス遺伝型２Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｄｌ／２００２／ＣＡＮ２株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１８；ノロウイルス遺伝型２、Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｇｅｒｍａｎｔｏｎ／２００２／ＵＳＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５０２０１７；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｌａｎｇｅｎｌ０６１／２００２／ＤＥ，完全ゲノム，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ４８５６４２；マウスノロウイルス１ポリタンパク質，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２２８２３５；ノーウォークウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０６７５３６；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｍｅｘ７０７６／１９９９，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ５４２０９０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｎ ４５５／０１／ＤＥ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ５３９４４０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｈｅｒｚｂｅｒｇ ３８５／０１／ＤＥ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ５３９４３９；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｂｏｘｅｒ／２００１／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ５３８６７９；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ，完全ゲノム，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０８１７２３；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ，完全ゲノム，分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕ２０１，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０３９７８２；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ，完全ゲノム，分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕｌ８，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０３９７８１；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ，完全ゲノム，分離株：Ｓａｉｔａｍａ Ｕ２５，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０３９７８０；ノーウォークウイルス株：Ｕ２５ＧＩＩ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０６７５４３；ノーウォークウイルス株：Ｕ２０１ＧＩＩ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０６７５４２；ノーウォーク様ウイルス４１６／９７００３１５６／１９９６／ＬＡ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８０５５９；ノーウォーク様ウイルス４０８／９７００３０１２／１９９６／ＦＬ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８０５５８；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｂｕｒｗａｓｈ Ｌａｎｄｉｎｇ／３３１／１９９５／ＵＳＡ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４２５；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ Ｂｅａｃｈ／３２６／１９９５／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４２４；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｗｈｉｔｅ Ｒｉｖｅｒ／２９０／１９９４／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４２３；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ／３０６／１９９４／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４２２；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｐｏｒｔ Ｃａｎａｖｅｒａｌ／３０１／１９９４／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４２１；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｈｏｎｏｌｕｌｕ／３１４／１９９４／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４２０；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｒｉｃｈｍｏｎｄ／２８３／１９９４／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４１９；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｗｅｓｔｏｖｅｒ／３０２／１９９４／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４１８；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／ＵＫ３−１７／１２７００／１９９２／ＧＢ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４１７；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ／８１／１９８６／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４１６；スノーマウンテン株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ７００５９；デザートシールドウイルスＤＳＶ３９５，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ０４４６９；ノーウォークウイルス，完全ゲノム，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０９３７９７；ハワイカリシウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ０７６１１；サウサンプトンウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ０７４１８；ノーウォークウイルス（ＳＲＳＶ−ＫＹ−８９／８９／Ｊ），ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ２３８２８；ノーウォークウイルス（ＳＲＳＶ−ＳＭＡ／７６／ＵＳ），ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ２３８３１；キャンバーウェルウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ４６５００；ヒトカリシウイルスＭｅｌｋｓｈａｍ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８１８７９；ヒトカリシウイルスＭＸ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２２４９８；ミニレオウイルスＴＶ２４，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ０２０３０；およびノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／Ｇｗｙｎｅｄｄ／２７３／１９９４／ＵＳ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４１４４０９を参照されたい。これらの配列のすべては、参考とし

て本明細書で援用される（本出願の出願日によって加入するとして）。追加のノロウイルスの配列は、すべてが参考として本明細書で援用される、以下の特許公開公報、すなわちＷＯ０５／０３０８０６，ＷＯ００／７９２８０，ＪＰ２００２０２０３９９，ＵＳ２００３１２９５８８，ＵＳ６５７２８６２，ＷＯ９４／０５７００，およびＷＯ０５／０３２４５７に開示されている。また、ノロウイルスの配列の比較および遺伝的多様性および系統発生解析の考察については、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ３２２−３３０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５９８２−５９９０；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６４６９−６４７９；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５５４−５６８；およびＦａｎｋｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７８：１５７１−１５７８を参照されたい。
多くのサポウイルス分離株についての核酸およびタンパク質配列も公知である。代表的なサポウイルスの配列は配列番号１０〜１２で表わされる。サポウイルス分離株に由来するＯＲＦ１およびＯＲＦ２を含む追加の代表的配列、およびそれらがコードするポリペプチドは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースに収載されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋエントリー：サポウイルスＭｃ１０，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０１０６２４；サッポロウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ６５４２７；サポウイルスＭｃ１０，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２３７４２０；サポウイルスＳａＫａｅｏ−１５／Ｔｈａｉｌａｎｄ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６４６８５５；サッポロウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００６２６９；サポウイルスＣ１２，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００６５５４；サポウイルスＣ１２，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６０３４２５；サポウイルスＨｕ／Ｄｒｅｓｄｅｎ／ｐＪＧ−Ｓａｐ０１／ＤＥ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ６９４１８４；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／ｃｒｕｉｓｅ ｓｈｉｐ／２０００／ＵＳＡ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２８９８０４；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ａｒｇ３９， ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２８９８０３；ブタ腸管カリシウイルスＬＬ１４株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ４２５６７１；ブタ腸管カリシウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０００９４０；ヒトカリシウイルスＭｃ３７株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２３７４１５；ミンク腸管カリシウイルスＣａｎａｄａ １５１Ａ株，ＧｅｎＢａｒｉｋ受入番号ＡＹ１４４３３７；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ｈｏｕ７−１１８１，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４３５８１４；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ｍｅｘ １４９１７／２０００，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４３５８１３；ヒトカリシウイルスＳＬＶ／Ｍｅｘ３４０／１９９０，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４３５８１２；ブタ腸管カリシウイルス，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１８２７６０；サッポロウイルス−ロンドン／２９８４５，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ９５６４５；サッポロウイルス−マンチェスター，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８６５６０；サッポロウイルス−ヒューストン／８６，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ９５６４３；サッポロウイルス−ヒューストン／９０，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ９５６４４；およびヒトカリシウイルスＨｕＣＶ／Ｐｏｔｓｄａｍ／２０００／ＤＥＵ株，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２９４７３９；を参照されたい。これらの配列のすべては、参考として本明細書で援用される（本出願の出願日によって加入するとして）。また、サポウイルスの配列の比較および遺伝的多様性および系統発生解析の考察については、Ｓｃｈｕｆｆｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．；１４６（１１）：２１１５−２１３２；Ｚｉｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．５：２８１−２９０；Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４９：１３０９−１３２３を参照されたい。
本明細書で使用される、ノロウイルスと関連する「主要キャプシドタンパク質」または「主要キャプシドポリペプチド」または「ＶＰ１」という用語は、ノロウイルスのＯＲＦ２にコードされるポリペプチドに相同的または同一の配列を含むポリペプチドを意味し、少なくとも約８０〜１００％の配列同一性、例えば、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を含む、その範囲内のあらゆる割合の同一性を示す配列を含む。
本明細書で使用される、ノロウイルスと関連する「マイナー構造タンパク質」または「マイナー構造ポリペプチド」または「ＶＰ２」または「小さな塩基性タンパク質」という用語は、ノロウイルスのＯＲＦ３にコードされるポリペプチドに相同的または同一の配列を含むポリペプチドを意味し、少なくとも８０〜１００％の配列同一性、例えば、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を含む、その範囲内のあらゆる割合の同一性を示す配列を含む。
本明細書で使用される、サポウイルスと関連する「キャプシドタンパク質」または「キャプシドポリペプチド」または「ＶＰ１」という用語は、サポウイルスのキャプシドポリペプチドに相同的または同一の配列を含むポリペプチドを意味し、少なくとも約８０〜１００％の配列同一性、例えば、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を含む、その範囲内のあらゆる割合の同一性を示す配列を含む。キャプシドポリペプチドは、サポウイルスの異なる株においてＯＲＦ１またはＯＲＦ２のいずれかによってコードされ得る。ある株においては、サポウイルスは２個のオープンリーディングフレームを有し、キャプシドタンパク質はポリタンパク質の一部としてＯＲＦ１によってコードされ、マイナー構造タンパク質（ＶＰ１０）はＯＲＦ２によってコードされる。他の株においては、サポウイルスは３個のオープンリーディングフレームを有し、停止コドンが、ＯＲＦ２によってコードされるキャプシドタンパク質のコード領域に先行し、マイナー構造タンパク質（ＶＰ１０）はＯＲＦ３によってコードされる。
本明細書で使用される、サポウイルスと関連する「マイナー構造タンパク質」または「マイナー構造ポリペプチド」または「ＶＰ１０」という用語は、サポウイルスゲノム（株によりＯＲＦ２またはＯＲＦ３のいずれか）におけるキャプシドタンパク質のコード領域に続くオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドに相同的または同一の配列を含むポリペプチドを意味し、少なくとも約８０〜１００％の配列同一性、例えば、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を含む、その範囲内のあらゆる割合の同一性を示す配列を含む。
本明細書で使用される「ノロウイルスポリタンパク質」という用語は、ノロウイルスのＯＲＦ１をコードするポリタンパク質に相同的または同一の配列を含むポリタンパク質を意味し、少なくとも約８０〜１００％の配列同一性、例えば、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を含む、その範囲内のあらゆる割合の同一性を示す配列を含む。
本明細書で使用される「サポウイルスポリタンパク質」という用語は、サポウイルスのＯＲＦ１をコードするポリタンパク質に相同的または同一の配列を含むポリタンパク質を意味し、少なくとも約８０〜１００％の配列同一性、例えば、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を含む、その範囲内のあらゆる割合の同一性を示す配列を含む。
本明細書で使用される「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という用語は、さらに後述するいくつかのウイルスのいずれかに由来する、複製しないウイルスの殻を意味する。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムのすべてまたは一部、特にウイルスゲノムの複製および感染に関する要素を欠くため、複製されず感染しない。ＶＬＰは通常、例えば、キャプシド、外被、殻、表層、構造タンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２）、またはこれらのタンパク質に由来する、本明細書に開示されるタンパク質を含む粒子形成ポリペプチドなどの１種以上のウイルスタンパク質からなるが、これらに限定されない。適切な発現系内でキャプシドタンパク質の組換え的発現を自発的に形成し得る。特定のＶＬＰの産生方法は当該技術分野で公知であり、以下で詳細に考察する。ウイルスタンパク質の組換え的発現に続くＶＬＰの存在は、例えば、電子顕微鏡、生物物理学的特徴付けなどの当該技術分野で公知の従来の技術を使用して検出することができる。例えば、ＶＬＰは密度勾配遠心によって分離することができ、および／または特徴的な密度バンティングによって特定される。また、問題となるＶＬＰの産生のガラス化した水性試料において低温電子顕微鏡を使用することができ、適切な照射条件下において画像を記録することができる。
本明細書で使用される「モザイクＶＬＰ」という用語は、１種以上の型のウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含むＶＬＰを意味する。ＶＬＰはタンパク質との関連でキャプシド内および／またはキャプシド間に由来する。
特定のウイルスタンパク質に由来する「粒子形成ポリペプチド」とは、全長または全長に近いウイルスタンパク質、およびその断片、またはＶＬＰの形成に有利な条件下においてＶＬＰを形成する能力を有する内部欠失を有するウイルスタンパク質を意味する。従って、ポリペプチドは、全長配列、断片、切断配列、および部分配列、ならびに基準分子の類似体および前駆体形態を含んでもよい。そのため、この用語は、ポリペプチドがＶＬＰを形成する能力を保持する限り、配列に対する欠失、付加および置換を意味する。従って、外被タンパク質における変異はウイルス分離株間でしばしば起こるため、この用語には、特定のポリペプチドの天然の変異が含まれる。タンパク質がＶＬＰを形成する能力を保持する限り、この用語には、基準タンパク質において天然に存在しない欠失、付加および置換もが含まれる。好ましい置換は、天然において保存されているもの、すなわち、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。特に、アミノ酸は、一般的に４種のファミリー、すなわち（１）酸性アミノ酸−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性アミノ酸−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、しばしば芳香族アミノ酸として分類される。
「抗原」とは、１つ以上のエピトープ（直鎖状または立体配座的またはその両方）を含み、体液性および／または細胞性の抗原特異的応答をもたらす宿主の免疫システムを刺激する分子を意味する。この用語は、「免疫原」という用語と交換可能に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープには少なくとも約５個のアミノ酸が含まれるが、３〜４個のアミノ酸と同等であってもよい。ＣＴＬエピトープなどのＴ細胞エピトープには、少なくとも約７〜９個のアミノ酸が含まれ、ヘルパーＴ細胞エピトープには少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸が含まれる。通常、エピトープには、約７〜１５個、例えば、９、１０、１２または１５個のアミノ酸が含まれる。「抗原」という用語は、サブユニット抗原（すなわち、天然において抗原が関連する全体の生物から単離および分離される抗原）、ならびに、死滅、弱毒化または不活性化した細菌、ウイルス、真菌、寄生虫または他の微生物を示す。抗イディオタイプ抗体またはその断片、および抗原または抗原決定基を模倣することのできる合成ペプチドミモトープは、本明細書で使用される抗原の定義においても捉えられる。同様に、例えば遺伝子治療およびＤＮＡ免疫用途においてｉｎ ｖｉｖｏで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、本明細書において抗原の定義に含まれる。
「抗体」という用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物、ならびに、ハイブリッド抗体、変形抗体（ａｌｔｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、キメラ抗体、およびヒト化抗体、ならびにハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆｖ分子（非共有結合ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６を参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）；二量体および三量体抗体断片構築物：ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０−１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３− ３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；および１９９年９月２１日に公開された、英国特許出願第ＧＢ２，２７６，１６９号を参照）を含む調製物およびこのような分子から得られ、もとの抗体分子の特異的結合特性を保持している機能的断片が含まれる。
「ハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、ワトソン−クリックの塩基対形成により複合体を形成するのに十分に相補的であるヌクレオチド配列間の複合体の形成を意味する。プライマーが標的（鋳型）と「ハイブリダイズ」する場合、このような複合体（またはハイブリッド）は、例えばＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を開始するのに必要なプライミング機能をもたらすのに十分に安定している。
本明細書で使用される「生物学的試料」とは、被験体から分離された組織または体液の試料を意味し、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚の試料、皮膚の外分泌物、呼吸、腸管および尿生殖路、涙、唾液、乳、血液細胞、器官、生検およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養物の試料（培地中における細胞および組織の増殖から得られる馴化培地が含まれるが、これらに限定されない）、例えば組換え細胞および細胞成分が含まれるがこれらに限定されない。特に、ノロウイルスまたはサポウイルスは、これらのウイルスに感染した個体からの嘔吐物または下痢便などの生物学的試料から得ることができる。
「被験体」とは、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーおよび他の類人猿および猿種などの非ヒト霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；犬および猫などの家畜；マウス、ラットおよびモルモットなどのげっし動物を含む研究用動物；ニワトリ、七面鳥および他の家禽鳥、カモ、ガチョウを含む家畜、野生および狩猟鳥を含む鳥類含む脊椎動物亜門のあらゆるメンバーを意味するが、これらに限定されない。この用語は特定の年齢を示していない。従って、成体および新生の個体を網羅することが意図される。
「変異体」、「類似体」および「突然変異タンパク質」という用語は、ノロウイルスまたはサポウイルスに対する免疫応答を誘導することにおける抗原活性などの所望の活性を保持している、基準分子の生物学的活性誘導体を意味する。一般的に、「変異体」および「類似体」という用語は、修飾が生物学的活性を破壊せず、後述するように、基準分子と比較して「実質的に相同的」である限りは、野生型のポリペプチド配列および構造を有し、野生型分子と比較して１個以上のアミノ酸付加、置換および／または欠失を有する化合物（一般的に、天然にて保存）を意味する。一般的に、このような類似体のアミノ酸配列は、２つの配列を並べたときに、基準配列に対して高い度合いの配列相同性、例えば、５０％を超えるアミノ酸配列相同性、一般的には６０％〜７０％、特に８０％〜８５％、さらに少なくとも９０％〜９５％以上の相同性を有するであろう。多くの場合、類似体は同じ数のアミノ酸を有するが、本明細書で説明するように、置換を含んでいるであろう。「突然変異タンパク質」という用語には、さらに、アミノおよび／またはイミノ分子のみを含む化合物を含むが、これらに限定されない、１個以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチド、アミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸など）を含むポリペプチド、置換結合、および天然および非天然（例えば合成）、環化、分枝分子などの、当該技術分野で公知の他の修飾を有するポリペプチドが含まれる。この用語には、１個以上のＮ−置換グリシン残基（ペプトイド）および他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子（例えば、米国特許第５，８３１，００５号；第５，８７７，２７８号；および第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０００） ７：４６３−４７３；およびペプトイドの開示についてＳｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９３６７−９３７１を参照）。好ましくは、類似体または突然変異タンパク質は、野生型分子と少なくとも同じ抗原活性を有する。ポリペプチド類似体および突然変異タンパク質の産生方法は当該技術分野で公知であり、さらに後述する。
上で説明した通り、類似体は、一般的に天然において保存的である、すなわち、側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換を含む。特に、アミノ酸は、一般的に４種のファミリー、すなわち（１）酸性アミノ酸−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性アミノ酸−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、しばしば芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの分離置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との分離置換、スレオニンのセリンとの置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との同様の保存的置換が、生物学的活性に大きな影響を及ぼさないことが合理的に予想できる。例えば、分子の所望の機能が損なわれない限り、対象となるポリペプチドは、約５〜１０個までの保存的または非保存的アミノ酸置換、または約１２〜２５個の保存的または非保存的アミノ酸置換、または５〜２５個の間のあらゆる整数の保存的または非保存的アミノ酸置換が含まれてよい。当業者は、当該技術分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｅプロットを参照することにより、変化を許容し得る対象となる分子の領域を容易に決定することができる。
本明細書で使用される「マルチエピトープ融合抗原」または「マルチエピトープ融合タンパク質」という用語は、複数のノロウイルスおよび／またはサポウイルス抗原が、単一の連続したアミノ酸鎖（鎖は天然には発生しない）の一部であるポリペプチドを意味する。ノロウイルスおよびサポウイルス抗原はペプチド結合により直接結合していてもよければ、あるいはアミノ酸配列を介在して分離していてもよい。融合抗原は、ＯＲＦ１をコードする、ＯＲＦ２をコードする、および／またはＯＲＦ３にコードされるポリペプチド、またはそれらの断片、例えば、Ｎ−末端タンパク質、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＶＰ１、およびＶＰ２などのノロウイルスポリペプチドの配列；および／またはＮ−末端タンパク質、ｐ１１、ｐ２８、ＮＴＰａｓｅ、ｐ３２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＶＰ１、およびＶＰ１０などのサポウイルスポリペプチドの配列を含んでいてもよい。融合タンパク質は、ノロウイルスまたはサポウイルスに外来性の配列を含んでもよい。さらに、存在する配列は、複数の遺伝子型および／またはノロウイルスおよびサポウイルスの分離株に由来するものであってもよい。
本明細書で使用される「解毒」とは、問題となる毒素の完全な無毒および低残存毒素変異体の両方を意味する。必要であれば、毒性タンパク質抗原を解毒してもよく、例えば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒は当該技術分野で公知である。好ましくは、解毒されたタンパク質は、天然に発生する毒素対応物の０．０１％未満、さらに好ましくは０．００１％未満、さらに好ましくは天然に発生する毒素対応物の０．０００１％未満の毒素を残留する。毒性はマウスＣＨＯ細胞中で測定することができ、または好ましくはＹ１細胞中に誘導される形態学的変化の評価によって測定することができる。具体的にはＹ１細胞は、ＣＴまたはＬＴを含む溶液で処理した時に顕著に丸くなる、副腎腫瘍上皮細胞である（Ｙｓａｍｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９６６）２６：５２９−５３５）。ＣＴおよびＬＴの毒性は、この形態学的変化と関連がある。従って、変異体の毒素をＹ１細胞とインキュベートし、細胞の形態学的変化を評価する。
免疫原性組成物に関連する「治療有効量」とは、免疫学的応答、若しくは抗体産生またはノロウイルスまたはサポウイルス感染症の治療または予防を誘導する、免疫原（例えば、免疫原性ポリペプチド、融合タンパク質、ポリタンパク質、ＶＬＰ、または核酸コード抗原）の量を意味する。このような応答は一般的に、組成物に対する抗体媒介性および／または分泌性または細胞性免疫応答の被験体における発生をもたらす。通常、このような応答には、１つ以上の以下の効果、すなわち、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかに由来する抗体の産生；ＢおよびＴリンパ球の増殖；免疫細胞に対する、賦活化、増殖および分化の提供；ヘルパーＴ細胞、抑制Ｔ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγδＴ細胞集団の拡張が含まれるが、これらに限定されない。
本発明においてアジュバントの「有効量」とは、投与された抗原または抗原をコードする核酸に対して免疫応答を増強する量である。
本明細書で使用される「治療」とは、（ｉ）従来のワクチンにおけるように、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の軽減または解消、および（ｉｉｉ）問題となる病原体の実質的または完全な消失のいずれかを意味する。治療は、予防的（感染の前に）、または治療的（感染の後）効果がある。
ＩＩ．発明を実施する形態
本発明を詳細に説明する前に、特定の例示した分子、または処理パラメータは、それ自体、当然に変化し、限定されないことを理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態の説明の目的のみであり、限定されるものではない。さらに、本発明の実施は、特に示されない限り、すべてが当業者の範囲内である、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の通常の方法を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。本発明の実施においては、本明細書に開示されたのと同一または同等の多くの方法および材料を使用することができるが、好ましい材料および方法は本明細書に開示されている。
本発明には、ノロウイルスまたはサポウイルス感染症に対して被験体を免疫化する組成物および方法が含まれる。本発明は、キャプシドタンパク質をコードする核酸、および／またはノロウイルスおよび／またはサポウイルスの１種以上の株に由来する他の免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物；ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの１種以上の株に由来する免疫原性ポリペプチドを含む組成物；ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの１種以上の株に由来するＶＬＰを含む組成物；およびこのような免疫原性核酸、ポリペプチド、および／またはＶＬＰの混合物を含む組成物を提供する。キャプシドタンパク質をコードする核酸は、さらに、ＶＬＰの産生において使用することができる。このようなＶＬＰは、このようなＶＬＰまたはこのようなＶＬＰをコードする核酸が投与された被験体において、抗原の提示、および免疫応答の刺激のための媒体として有用である。本発明の実施において使用される免疫原性ポリペプチドには、ＯＲＦ１がコードするポリペプチド、ＯＲＦ２がコードするポリペプチド、ＯＲＦ３がコードするポリペプチド、マルチエピトープ融合抗原、および／またはＯＲＦ１がコードするポリタンパク質を含む、ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するポリペプチドが含まれる。さらに、免疫原性組成物は、１種以上のアジュバント、またはアジュバントをコードする核酸を含んでいてもよく、免疫原性ポリペプチドおよび／またはＶＬＰは混合されるか、アジュバントと共発現する。免疫原性組成物は、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原以外の追加の抗原、例えば、下痢性疾患を引き起こす病原体に対して免疫化するために使用することのできる抗原を含んでいてもよい。
本発明のさらなる理解のため、免疫原性組成物において使用するための核酸、ポリペプチド、およびＶＬＰの産生、およびこのような組成物をノロウイルスまたはサポウイルス感染症の治療または予防に使用する方法に関してさらに詳細な考察を以下に提供する。
Ａ．ポリペプチド
構造ポリペプチド、非構造ポリペプチド、およびポリタンパク質
本明細書に開示される免疫原性組成物は、ノロウイルスおよびサポウイルスの１種以上の遺伝型および／または分離株に由来する１種以上のポリペプチドを含んでいてもよい。本発明の実施において使用することのできるポリペプチドには、構造タンパク質、非構造タンパク質およびポリタンパク質が含まれる。このようなポリペプチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスに対する免疫応答を誘導することができる、全長タンパク質、またはそれらの免疫原性断片であることができる。
ノロウイルス株のゲノムには３個のオープンリーディングフレームが含まれる。約５，０００〜５５００ヌクレオチドを含むＯＲＦ１は２００ｋＤａのポリタンパク質に転写される。約１５５０〜１６５０ヌクレオチドを含むＯＲＦ２は６０ｋＤａの主要キャプシドタンパク質ＶＰ１に転写される。約１５５０〜１６５０ヌクレオチドを含むＯＲＦ３は、マイナー構造タンパク質ＶＰ２に転写される。
ノロウイルスポリタンパク質は、３Ｃ様プロテアーゼによる切断を行い、少なくとも６つの異なる生成物、Ｎ−末端タンパク質（Ｎｔｅｒｍ）、２Ｃ様ヌクレオシドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）、Ｐ２０またはＰ２２（遺伝群に依存する）、ウイルスタンパク質ゲノム結合（ＶＰｇ）、３Ｃ様システインプロテアーゼ（Ｐｒｏ）、およびＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）を生成する。全体が参考として本明細書で援用される、Ｂｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０９５７−１０９７４を参照されたい。ポリタンパク質は、３Ｃ様プロテアーゼによって、最初に、３個の断片、Ｎｔｅｒｍ、ＮＴＰａｓｅ、およびＰ２０ＶＰｇＰｒｏＰｏｌ複合体に切断される。さらに、タンパク質分解工程は、ＰｒｏＰｏｌ、Ｐ２０ＶＰｇＰｒｏ、Ｐｏｌ、Ｐ２０ＶＰｇ、ＶＰｇＰｒｏ、ｐ２０およびＰｒｏ断片を生成する。３Ｃ様システインプロテアーゼにより触媒される、ポリタンパク質成熟の完了により、すべての分離ポリペプチドが生成される。２００ｋＤａポリタンパク質は、これらのポリペプチドを、ＮＨ２−Ｎｔｅｒｍ−ＮＴＰａｓｅ−ｐ２０／ｐ２２−ＶＰｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌ−ＣＯＯＨの順番で含む。ノロウイルスポリタンパク質内のおおよそのドメイン境界、およびＯＲＦ１コード配列の対応するヌクレオチド位置を表１に示す。
Figure 2009516529
 ＊ ノロウイルスＭＤ１４５−１２株を基準に番号付け（配列番号１３、配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＫ５０３５４）。Ｂｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０９５７−１０９７４を参照。
サポウイルス株のゲノムには、２または３個のオープンリーディングフレームが含まれる。２個のオープンリーディングフレームを有するサポウイルスの株において、ＯＲＦ１は、非構造的および構造的タンパク質を含むポリタンパク質をコードする。キャプシドタンパク質ＶＰ１は、サポウイルスポリタンパク質の成分として、ＯＲＦ１によってコードされ、マイナー構造タンパク質Ｖ１０はＯＲＦ２によってコードされる。３個のオープンリーディングフレームを有するサポウイルスの株において、キャプシドタンパク質のコード領域に停止コドンが先行する。キャプシドタンパク質を含まないポリタンパク質はＯＲＦ１によってコードされ、キャプシドタンパク質ＶＰ１はＯＲＦ２によってコードされ、マイナー構造タンパク質ＶＰ１０はＯＲＦ３によってコードされる。
３Ｃ様プロテアーゼによる、サポウイルスＭｃ１０株のポリタンパク質（配列番号１９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２３７４２０）の切断は、少なくとも１０個の異なる生成物、すなわち、ｐ１１、ｐ２８、ｐ３５ （ＮＴＰａｓｅ）、ｐ３２、ｐｌ４（ＶＰｇ）、ｐ７０（Ｐｒｏ−Ｐｏｌ）、ｐ６０（ＶＰｌ）を生成する。全体が参考として本明細書で援用される、Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：７２８３−７２９０を参照されたい。初期のタンパク質分解工程は、ｐ６６（ｐ２８−ｐ３５）、ｐ４６（ｐ３２−ｐ１４）、およびｐ１２０（ｐ３２−ｐ１４−ｐ７０）断片を生成する。ポリタンパク質は、ポリペプチドを、ＮＨ２−ｐｌ１−ｐ２８−ＮＴＰａｓｅ−ｐ３２−ＶＰｇ−ｐ７０（Ｐｒｏ−Ｐｏｌ）−ＶＰｌ−ＣＯＯＨの順番で含む。ポリタンパク質のｐ７０（Ｐｒｏ−Ｐｏｌ）領域は１０５６〜１７２０残基に存在し、ポリタンパク質のＶＰ１領域は１７２１〜２２７８残基に存在する（サポウイルスＭｃ１０株を基準に番号付け（配列番号１９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２３７４２０；Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：７２８３−７２９０およびＯｋａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ａｕｇｕｓｔ １ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎを参照）。
ＶＰ１およびＶＰ２構造タンパク質の核酸およびアミノ酸配列を含む、多くのノロウイルス株および分離株の核酸およびアミノ酸配列、およびＮｔｅｒｍ、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０／ｐ２２、ＶＰｇ、Ｐｒｏ、およびＰｏｌ遺伝子およびポリペプチドを含む、ノロウイルスポリタンパク質の種々の領域を決定した。例えば、ノーウォークウイルスは、全体が参考文献として本明細書で援用される、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９５：５１−６１；およびＨａｒｄｙ ａｎｄ Ｅｓｔｅｓ（１９９６）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １２：２８７−２９０に開示されている。スノーマウンテンウイルスは、全体が参考文献として本明細書で援用される、Ｈａｒｄｙ （２００３）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ２６：７１−８２；Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ（１９９７）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １５：５−７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，５９８２−５９９０に開示されている。ハワイウイルスは、全体が参考文献として本明細書で援用される、Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７０：５３５−５４２に開示されている。
ＶＰ１およびＶＰ１０構造タンパク質の核酸およびアミノ酸配列を含む、多くのサポウイルス株および分離株の核酸およびアミノ酸配列、およびｐ１１、ｐ２８、ＮＴＰａｓｅ、ｐ３２、ＶＰｇ、ｐ７０（Ｐｒｏ−Ｐｏｌ）、ＶＰ１遺伝子およびポリペプチドを含む、サポウイルスポリタンパク質の種々の領域を決定した。例えば、サッポロウイルスは、全体が参考文献として本明細書で援用される、Ｎｕｍａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：１５３７−１５５２に開示されている。ロンドン／２９８４５ウイルス、ヒューストン／８６ウイルス、およびヒューストン／９０ウイルスは、全体が参考文献として本明細書で援用される、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：１８１３−１８２７に開示されている。パークヴィルウイルスは、全体が参考文献として本明細書で援用される、Ｎｏｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５２：１７３−１７８に開示されている。
免疫原性組成物におけるポリタンパク質は、ノロウイルスまたはサポウイルスゲノムのいずれかの領域によってコードされるてもよい。複数のポリペプチドが免疫原性組成物中に含まれる。このような組成物は、同一のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来するか、異なる株および分離株に由来し、種々のノロウイルスまたはサポウイルスの遺伝型のいずれかを有する分離株を含み、広範なノロウイルスおよびサポウイルス遺伝型の広い範囲に対する保護が増強される。免疫原性組成物は、ノロウイルス株に由来するポリペプチド、およびサポウイルス株に由来するポリペプチドの両方を含んでもよい。ノロウイルスおよびサポウイルスの複数のウイルス株が公知であり、これらの株のいずれかに由来するエピトープを含む複数のポリペプチドを免疫原性組成物中で使用することができる。
本発明の免疫原性組成物中で使用される抗原は、個々の分離されたポリペプチドとして組成物中に存在し得る。一般的に、本発明の組換え型タンパク質は、ＧＳＴ−融合タンパク質および／またはＨｉｓ標識された融合タンパク質として調製される。
マルチエピトープ融合タンパク質
本明細書に開示される免疫組成物には、マルチエピトープ融合タンパク質が含まれる。例えば、本願明細書に参考文献として組み入れられる、国際特許出願公開ＷＯ ９７／４４４６９，米国特許第６，６３２，６０１号，米国特許出願第６，６３０，２９８号，米国特許第６，５１４，７３１号および米国特許第６，７９７，８０９号；に開示されている。このような融合タンパク質には、１種以上の遺伝型、および／またはノロウイルスおよびサポウイルスの分離株の２種以上のウイルスポリペプチドに由来するマルチエピトープが含まれる。マルチエピトープ融合タンパク質は２つの主要な利点をもたらす。第一に、それ自身、不安定であるか発現量が不十分であるポリペプチドが、この問題を克服する適切なハイブリッドパラメータを加えることにより援助されえる；第二に、両方とも抗原的に有用である２種のポリペプチドを生産するには１回の発現および精製のみが必要なため、商業生産が簡単である。
マルチエピトープ融合タンパク質は、ノロウイルスまたはサポウイルスポリタンパク質の１種以上の種々のドメイン（前記表１および２に示す）、全長ポリタンパク質、ＶＰ１（本明細書においてキャプシドタンパク質とも呼ばれる）、ＶＰ２（本明細書においてノロウイルスマイナー構造タンパク質とも呼ばれる）、および／またはＶＰ１０（本明細書においてサポウイルスマイナー構造タンパク質とも呼ばれる）、または１種以上のノロウイルスおよび／またはサポウイルス分離株に由来する、それらの断片を含んでいてもよい。融合タンパク質内のポリペプチドは同じノロウイルスまたはサポウイルス分離株、または異なる株および分離株に由来するものであってもよく、種々のノロウイルスまたはサポウイルス遺伝型のいずれかを有する分離株を含み、広範なノロウイルスおよびサポウイルス遺伝型に対する防御力の向上をもたらす。ノロウイルスおよびサポウイルスの複数のウイルス株が公知であり、これらの株のいずれかに由来するエピトープが、融合タンパク質中で使用され得る。
生物の任意の種が、ある生物から別の生物へ変化し、ウイルスなどの所定の生物が多くの異なる株を有し得ることは周知である。例えば、上述の通り、ノロウイルスには、少なくとも４種の遺伝群（ＧＩ〜ＧＩＶ）が含まれ、サポウイルスには、少なくとも５種の遺伝群（ＧＩ〜ＧＶ）が含まれる。それぞれの株は、ノロウイルスまたはサポウイルスのすべての株に存在する相同的領域にあるが、ウイルス株毎にわずかに異なる、多くの抗原決定基を含む。従って、マルチエピトープ融合抗原には、ノロウイルスまたはサポウイルスの異なるウイルス株に由来する複数のポリペプチドが含まれ、それぞれは、特定の相同的領域を含むが、それぞれは異なった形態の抗原決定基を有する。一般的に、抗原決定基はアミノ酸配列に関して高い度合いの相同性を有し、相同性の度合いは、一般的に、並べたときに、３０％以上、好ましくは４０％以上である。融合タンパク質は、エピトープの複数のコピーを含んでいてもよく、融合タンパク質の１種以上のポリペプチドは同じエピトープの正確なコピーを含む配列を含む。さらに、融合抗原を含むワクチン組成物が使用される、特定の地理的地域における特定のウイルス固有のクレード（ｃｌａｄｅｓ ｅｎｄｅｍｉｃ）に基づいてポリペプチドを選択することができる。本発明の融合抗原が、広い状況においてノロウイルスおよびサポウイルス感染症の治療の有効な手段をもたらすことは明らかである。
マルチエピトープ融合抗原は、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原のアミノ酸配列またはその断片であり；Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは任意のＮ−末端アミノ酸配列であり；Ｂは任意のＣ−末端アミノ酸配列であり；ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である）で表わすことができる。
Ｘ部分が、その野生型の形態においてリーダーペプチド配列を有する場合、マルチエピトープ融合抗原に、それは含まれていても除外されていてもよい。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ−末端に位置する−Ｘ−部分の配列を除いて除去されている。すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドが保持されるが、Ｘ２・・・Ｘｎのリーダーペプチドは除外される。これは、すべてのリーダーペプチドの除去、および−Ａ−部分としてのＸ１のリーダーペプチドの使用と同等である。
（−Ｘ−Ｌ−）の各ｎの具体例については、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は存在していても存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであってもよい。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は通常は短く、例えば２０個以下（すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）のアミノ酸である。具体例には、クローニングを促進する短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（Ｇｌｙｎ、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）、およびヒスチジンタグ（Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が含まれる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＢａｍＨＩ制限サイトから、クローニングおよび操作を容易にするＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドが形成される、ＧＳＧＧＧＧであり、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドが、典型的なポリ−グリシンリンカーである。
−Ａ−は、任意のＮ−末端アミノ酸配列である。これは通常は短く、例えば、４０個以下のアミノ酸（すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）である。具体例には、直接的なタンパク質輸送に対するリーダー配列、またはクローニングまたは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上））が含まれる。他の適切なＮ−末端アミノ酸配列は当業者に明らかであろう。Ｘ１が、それ自身のＮ−末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ−末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８アミノ酸）である。
−Ｂ−は、任意のＣ−末端アミノ酸配列である。これは通常は短く、例えば、４０個以下のアミノ酸（すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）である。具体例には、直接的なタンパク質輸送に対する配列、クローニングまたは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、Ｈｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上））、またはタンパク質の安定性を向上させる配列が含まれる。他の適切なＣ−末端アミノ酸配列は当業者に明らかであろう。
マルチエピトープ融合抗原（個々の−Ｘ−部分）内の免疫原性組成物の個々の抗原は、１種以上の株に由来するか、１つ以上のＭ型に由来する。例えば、ｎ＝２である場合、Ｘ２はＸ１として同一の株または型に由来するか、異なる株または型に由来する。ｎ＝３である場合、株は、（ｉ）Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｉ）Ｘ１＝Ｘ２≠Ｘ３、（ｉｉｉ）Ｘ１≠Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｖ）Ｘ１≠Ｘ２≠Ｘ３、（ｖ）Ｘ１＝Ｘ３≠Ｘ２などであってもよい。
マルチエピトープ融合抗原を使用する場合、融合タンパク質内の個々の抗原（すなわち個々の−Ｘ−部分）は、１種以上の株に由来してもよい。例えば、ｎ＝２である場合、Ｘ２はＸ１として同一の株または型に由来するか、異なる株に由来する。ｎ＝３である場合、株は、（ｉ）Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｉ）Ｘ１＝Ｘ２≠Ｘ３、（ｉｉｉ）Ｘ１≠Ｘ２＝Ｘ３、（ｉｖ）Ｘ１≠Ｘ２≠Ｘ３、（ｖ）Ｘ１＝Ｘ３≠Ｘ２などであってもよい。
従って、本発明の特定の実施形態において、異なるノロウイルスおよび／またはサポウイルス株に由来する抗原決定基が存在してもよい。ノロウイルスおよびサポウイルス分離株に由来するポリペプチドを含む、本発明において使用される代表的なマルチエピトープ融合タンパク質を以下に開示する。しかし、ノロウイルスおよびサポウイルスゲノムに由来する他のエピトープを含むマルチエピトープ融合タンパク質、またはエピトープの異なる配列を含むマルチエピトープ融合タンパク質も、本発明の免疫原性組成物において使用されることが理解されるであろう。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの１種以上の分離株に由来する、１種以上のキャプシドおよび／またはマイナー構造ポリペプチドを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、１種以上のノロウイルス株に由来するＶＰ１ポリペプチドを含む（例えば、ＶＰ１ＮＶ−ＶＰ１ＳＭＶ，ＶＰ１ＮＶ−ＶＰ１ＳＭＶ−ＶＰ１ＨＶ，ＶＰ１ＮＶ−ＶＰ１ＳＭＶ−ＶＰ１ＨＶ−ＶＰ１ＬＶ，ＶＰ１ＳＭＶ−ＶＰ１ＬＶ−ＶＰ１ＭＶ，ＶＰ１ＮＶ−ＶＰ１ＳＭＶ−ＶＰ１ＨＶ−ＶＰ１ＬＶ−ＶＰ１ＭＶ−ＶＰ１ＤＳＶ−ＶＰ１ＳＶ）。
別の実施形態において、融合タンパク質は、１種以上のサポウイルス株に由来するＶＰ１ポリペプチドを含む（例えば、ＶＰｌＳａｐｐｏｒｏ−ＶＰｌＬｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰｌＬｏｎｄｏｎ／２９８４５−ＶＰ１Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ−ＶＰ１Ｓａｐｐｏｒｏ，ＶＰ１Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ−ＶＰ１Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ−ＶＰ１Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰ１Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ−ＶＰ１Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰ１Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６−ＶＰ１Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ−ＶＰ１Ｓａｐｐｏｒｏ）。
別の実施形態において、融合タンパク質は、ノロウイルスおよびサポウイルス株に由来するＶＰ１ポリペプチドを含む（例えば、ＶＰｌＮＶ−ＶＰ１ＳＭＶ−ＶＰｌＳａｐｐｏｒｏ−ＶＰｌＬｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰｌＰａｒｋｖｉｌｌｅ−ＶＰｌＨｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰｌＮＶ−ＶＰｌＳＭＶ−ＶＰｌＨＶ，ＶＰｌＭａｎｃｈｅｓｔｅｒ−ＶＰｌＮＶ−ＶＰｌＳＭＶ−ＶＰｌＳａｐｐｏｒｏ−ＶＰｌＨＶ，ＶＰ１ＬＶ，ＶＰｌＳＭＶ−ＶＰｌＨｏｕｓｔｏｎ／８６ＶＰ１ＬＶ−ＶＰ１ＭＶ，ＶＰ１ＮＶ−ＶＰ１ＳＭＶ−ＶＰ１ＨＶ−ＶＰ１Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰ１Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６，ＶＰ１Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５−ＶＰ１ＬＶ−ＶＰ１ＭＶ−ＶＰ１ＤＳＶ−ＶＰｌｓｖ）。
別の実施形態において、融合タンパク質は、１種以上のノロウイルスに由来するＶＰ２ポリペプチドを含む（例えば、ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ，ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ２ＨＶ，ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ２ＨＶ−ＶＰ２ＬＶ，ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ２ＬＶ−ＶＰ２ＭＶ，ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ２ＨＶ−ＶＰ２ＬＶ−ＶＰ２ＭＶ−ＶＰ２ＤＳＶ−ＶＰ２ｓｖ）。
別の実施形態において、融合タンパク質は、１種以上のサポウイルス株に由来するＶＰ１０ポリペプチドを含む（例えば、ＶＰｌ０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰｌ０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰｌ０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５−ＶＰ１０Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ，ＶＰ１０Ｍａｎｃｈｃｓｔｅｒ−ＶＰ１０Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰ１０Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６−ＶＰ１０ Ｍａｎｃｈｃｓｔｅｒ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ）。
別の実施形態において、融合タンパク質は、１種以上のノロウイルス株に由来するＶＰ２、および１種以上のサポウイルス株に由来するＶＰ１０ポリペプチドを含む（例えば、ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰ１０Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰｌ０ＨＶ，ＶＰ１０Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ−ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ２ＨＶ，ＶＰ２ＬＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６−ＶＰ２ＬＶ−ＶＰ２ＭＶ，ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ２ＨＶ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６，ＶＰ１０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５−ＶＰ２ＬＶ−ＶＰ２ＭＶ−ＶＰ２ＤＳＶ−ＶＰ２ＳＶ）。
別の実施形態において、融合タンパク質は、１種以上のノロウイルス株に由来するＶＰ１およびＶＰ２ポリペプチド、および１種以上のサポウイルス株に由来するＶＰ１およびＶＰ１０ポリペプチドを含む（例えば、ＶＰ１ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ１ＶＰｌ０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰｌＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰｌＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６，ＶＰｌＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰｌＶＰ２ＨＶ，ＶＰ１ＶＰ２ＮＶ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰｌ０Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰｌＨｏｕｓｔｏｎ／８６−ＶＰｌＶＰ２ＳＭＶ，ＶＰｌＮＶ−ＶＰｌＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰ２ＨＶ−ＶＰ１０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰｌＶＰ２ＮＶ−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰｌＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６−ＶＰｌＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰｌＶＰ２ＨＶ−ＶＰｌＶＰ２ＬＶ，ＶＰｌＶＰ２ＳＭＶ−ＶＰｌＶＰ２ＬＶ−ＶＰｌＶＰ２ＭＶ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／９０−ＶＰ１０Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６，ＶＰｌＶＰ２ＬＶ−ＶＰｌＶＰ２ＭＶ−ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５，ＶＰ１０Ｓａｐｐｏｒｏ−ＶＰ１０Ｌｏｎｄｏｎ／２９８４５−ＶＰｌＤＳＶ−ＶＰ２ＳＶ−ＶＰｌＶＰｌ０Ｈｏｕｓｔｏｎ／８６）。
融合タンパク質は、ノロウイルスの異なる分離株に由来する、任意の数のＶＰ１およびＶＰ２ポリペプチド、および／またはサポウイルスの異なる分離株に由来する、任意の数のＶＰ１およびＶＰ１０ポリペプチドを含む。例えば、融合タンパク質は、マルチエピトープ融合タンパク質中で任意の順序で存在する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個またはそれ以上のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ１０ポリペプチドを含む。融合タンパク質は、同一または異なる数のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ１０ポリペプチドを含む。
特定の実施形態において、融合タンパク質は、１種以上のノロウイルス分離株（例えば、Ｎｔｅｒｍ、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０、ｐ２２、ＶＰｇ、ＰｒｏおよびＰｏｌ）および／またはサポウイルス（例えば、ｐ１１、ｐ２８、ＮＴＰａｓｅ、ｐ３２、ＶＰｇ、Ｐｒｏ、ＰｏｌおよびＶＰ１）に由来する１つ以上のＯＲＦ１がコードする非構造ポリペプチドを含む。融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個またはそれ以上の非構造ポリペプチドを含んでもよい。これらの非構造ポリタンパク質は、天然のノロウイルスまたはサポウイルスポリタンパク質内に天然に存在する順番である必要はない。従って、例えば、Ｎｔｅｒｍポリペプチドは、融合タンパク質のＮ−末端および／またはＣ−末端であるかもしれない。ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの異なる分離株に由来する特定の非構造ポリペプチドの複数のコピーが融合タンパク質中に存在するかもしれない。特定の実施形態において、融合タンパク質は、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの１種以上の分離株に由来する、１種以上の構造タンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ１０）もさらに含む。
本明細書に開示されたすべての融合においては、ウイルス領域は、それらが天然に存在する順番である必要はない。さらに各領域は同一または異なるノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来し得る。上述の種々の融合タンパク質中に存在する、種々のノロウイルスおよびサポウイルスポリペプチドは、全長ポリペプチドまたはその一部のいずれかであってもよい。
特定の実施形態において、融合タンパク質を形成するノロウイルスおよびサポウイルスポリペプチドの部位は、活性化Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識される少なくとも１個のエピトープを含む。ノロウイルスおよびサポウイルス分離株に由来する、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０、Ｎｔｅｒｍ、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０、ｐ２２、ＶＰｇ、Ｐｒｏ、Ｐｏｌ、ｐ１１、ｐ２８、ｐ３５およびｐ３２は、種々の方法によって特定することができる。例えば、前記組み合わせのいずれかを含む個々のポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のモノクローナル抗体を使用して免疫親和性精製によって分離することができる。次いで、分離されたタンパク質配列は、精製タンパク質の、全タンパク質配列にわたる、タンパク質分解切断による短いペプチドのシリーズを調製することによってスクリーニングすることができる。例えば、１００量体ポリペプチドで開始し、各ポリペプチドを、ノロウイルスまたはサポウイルス活性化Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープの存在について試験することができ、次いで、進行的に小さくなり、重複する断片を特定された１００量体について試験し、対象となるエピトープのマッピングをすることができる。
ノロウイルスまたはサポウイルス活性化Ｔ細胞上のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープは、例えば、５１Ｃｒリリース検定（実施例４を参照）またはリンパ増殖検定（実施例６を参照）によって特定することができる。５１Ｃｒリリース検定においては、エピトープをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、この発現ベクターを標的細胞に形質転換することにより、対象となるエピトープを提示する標的細胞を構築することができる。ノロウイルス特異的またはサポウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、融合タンパク質中に認められる１種以上のノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドに由来する１種以上のエピトープを示す標的細胞を溶解するが、このようなエピトープを示さない細胞は溶解しないであろう。リンパ増殖検定においては、ノロウイルス活性化および／またはサポウイルス活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、融合タンパク質中に認められる１種以上のノロウイルスおよび／またはサポウイルスに由来する１種以上のエピトープと一緒に培養した場合に増殖するが、ノロウイルスまたはサポウイルスエピトープペプチドの非存在下では増殖しないであろう。
融合タンパク質中の有用なポリペプチドには、ポリタンパク質または構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ１０中の種々の領域のいずれかに由来するＴ細胞エピトープが含まれる。これに関連し、ノロウイルスキャプシドタンパク質は、ヒトＴ細胞エピトープを含むことが知られている（例えば、Ｎｉｃｏｌｌｉｅｒ−Ｊａｍｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：１０７９−１０８６を参照）。１種以上のＴ細胞を含むエピトープ（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）はワクチン効果を向上させる役割を果たし、複数のノロウイルスおよび／またはサポウイルスに対する保護レベルを向上させる。
例えば、ＶＰ１およびＶＰ２領域に由来するポリペプチドは、本発明の融合タンパク質において使用することができる。エピトープを含むＶＰ１および／またはＶＰ２の免疫原性断片は本発明の融合タンパク質において使用することができる。例えば、ＶＰ１ポリペプチドは、約５〜分子のほぼ全長、例えば、６、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００またはそれ以上、示された数の間のあらゆる整数の、ＶＰ１のアミノ酸を含む。同様に、ＶＰ２ポリペプチドの断片は、ＶＰ２ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、１７５または２００個、または示された数の間の任意の整数のＶＰ２ポリペプチドのアミノ酸を含んでもよい。
所望であれば、融合タンパク質、またはこれらのタンパク質の個々の成分は、他のアミノ酸配列、例えば、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列、タンパク質精製において有用なリガンド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびスタフィロコッカルタンパク質Ａを含んでいてもよい。

Ｂ．核酸
本発明において、ポリペプチド産生、ＶＬＰ産生および／または核酸免疫において使用するための核酸は、例えば、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２またはＯＲＦ３領域のいずれかを含むノロウイルスまたはサポウイルスゲノム分離株の種々の領域のいずれかから得ることができる。ノロウイルスおよびサポウイルスに由来する代表的な配列を本明細書に挙げる。従って、本発明において使用される核酸には、病原性ノロウイルスまたはサポウイルス遺伝型または分離株に由来する１種以上の配列に由来するものが含まれる。
ノロウイルスに由来する代表的配列は公知であり、図１Ａ〜１Ｃ、２Ａ〜２Ｄ、１４Ａ〜１４Ｂ、および１５Ａ〜１５Ｂ、および配列番号１〜９および配列番号１３〜１７に示す。追加の代表的なノロウイルスの配列は、ノーウォークウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８７６６１）、スノーマウンテンウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ７００５９）スノーマウンテンウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹｌ３４７４８）、ハワイウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ０７６１１）、および以下の特許公報、すなわちＷＯ０５／０３０８０６，ＷＯ００／７９２８０，ＪＰ２００２０２０３９９，ＵＳ２００３１２９５８８，ＵＳ６５７２８６２，ＷＯ９４／０５７００，およびＷＯ０５／０３２４５７である。また、異なるノロウイルス株の配列の比較については、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ３２２−３３０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５９８２−５９９０；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６４６９−６４７９；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５５４−５６８；およびＦａｎｋｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７８：１５７１−１５７８も参照されたい。
サポウイルスに由来する代表的配列も公知であり、配列番号１０〜１２、１８および１９に示す。追加の代表的なサポウイルスの配列は、サッポロウイルス−ロンドン／２９８４５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ９５６４５）、パークヴィルウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２９４７３９）、およびサッポロウイルス−ヒューストン／８６（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ９５６４３）である。異なるサポウイルス株の配列の比較については、Ｓｃｈｕｆｆｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ．； １４６（１１）：２１１５−２１３２；Ｚｉｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．５：２８１−２９０；Ｆａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４９：１３０９−１３２３を参照されたい。
ノロウイルスまたはサポウイルスに対する免疫応答を誘発するための核酸免疫において使用することのできる、これらの配列、それらの断片および変異体は、本発明の方法において使用される。従って、本発明には、少なくとも約８０〜１００％の配列同一性、例えば、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の配列同一性を示す前記配列の変異体が含まれる。本発明には、前記配列またはその変異体のいずれかに由来する、ノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドの免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドも含まれる。ポリヌクレオチドには、天然のポリペプチドのコード配列を含んでもよければ、あるいは非天然の人工的配列であってもよい。
ポリヌクレオチドは、完全なノロウイルスまたはサポウイルスゲノムに満たないものを含んでもよく、また、完全なウイルスゲノムＲＮＡの配列を含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチドには、ノロウイルスまたはサポウイルスゲノムのＯＲＦ１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３に由来する１種以上の配列が含まれる。ポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスの複数の遺伝型および／または分離株に由来する完全なウイルスゲノムＲＮＡまたは完全に満たないウイルスゲノムＲＮＡをも含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスの全長ポリタンパク質をコードするＯＲＦ１配列を含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスのＯＲＦ１配列の１つ以上の部分を含み、例えば、ポリヌクレオチドは、Ｎ−末端タンパク質、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＶＰ１、ＶＰ２などの１種以上のノロウイルスＯＲＦ１がコードするポリペプチド、あるいはＮ−末端タンパク質、ｐ１１、ｐ２８、ＮＴＰａｓｅ、ｐ３２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、およびＶＰ１などの１種以上のサポウイルスポリペプチド、あるいはそれらの断片をコードする配列を含んでもよい。
例えば、ポリヌクレオチドは、ａ）ＯＲＦ１の連続した５〜９９４ヌクレオチドを含む配列、ｂ）ＯＲＦ１の連続した９９５〜２０９２ヌクレオチドを含む配列、ｃ）ＯＲＦ１の連続した２０９３〜３６２９ヌクレオチドを含む配列、ｄ）ＯＲＦ１の連続した２６３０〜３０２８ヌクレオチドを含む配列、ｅ）ＯＲＦ１の連続した３０２９〜３２７１ヌクレオチドを含む配列、およびｆ）ＯＲＦ１の連続した３２７２〜５１０１ヌクレオチドを含む配列からなる群より選択される、ＯＲＦ１ヌクレオチド配列を含んでもよい。前記番号付けは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２株のＯＲＦ１ヌクレオチド配列（配列番号１３）に対するものであり、ノロウイルスおよびサポウイルスの他の遺伝型および分離株から得られるＯＲＦ１配列における、対応するヌクレオチド位置が本発明に包含されることが意図されることを理解すべきである。
別の例において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスポリタンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ａ）ＯＲＦ１をコードするポリタンパク質の連続した１〜３３０番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ｂ）ＯＲＦ１をコードするポリタンパク質の連続した３３１〜６９６番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ｃ）ＯＲＦ１をコードするポリタンパク質の連続した６９７〜８７５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ｄ）ＯＲＦ１をコードするポリタンパク質の連続した８７６〜１００８番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ｅ）ＯＲＦ１をコードするポリタンパク質の連続した１００９〜１１８９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ｆ）ＯＲＦ１をコードするポリタンパク質の連続した１０９０〜１６９９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される。前記番号付けは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２株のポリタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）に対するものであり、ノロウイルスおよびサポウイルスの他の遺伝型および分離株から得られるポリタンパク質アミノ酸配列における、対応するアミノ酸位置が本発明に包含されることが意図されることを理解すべきである。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスの１種以上のキャプシドタンパク質をコードする配列を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスの構造タンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０）をコードする１種以上の配列を含んでもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ａ）ノロウイルスＭＤ１４５−１２株（配列番号１３）に対応して番号付けされたノロウイルスのゲノム核酸の連続した５０８５〜６７０１ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ｂ）ノロウイルスＭＤ１４５−１２株（配列番号１３）に対応して番号付けされたノロウイルスのゲノム核酸の連続した６７０４〜７５０７ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ｃ）サポウイルスＭｃ１０株（配列番号１８）に対応して番号付けされたサポウイルスのゲノム核酸の連続した５１７４〜６８４７ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ｄ）サポウイルスＭｃ１０株（配列番号１８）に対応して番号付けされたサポウイルスのゲノム核酸の連続した６８５６〜７３５０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなる群より選択される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスおよびサポウイルスの複数の遺伝型および／または分離株に由来する少なくとも２種のキャプシドタンパク質をコードする配列を含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスの１種以上の分離株に由来するノロウイルスの１種以上のＯＲＦ２およびＯＲＦ３配列を含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスの主要キャプシドタンパク質（ＶＰ１）をコードするＯＲＦ２配列を含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ノロウイルスのマイナー構造タンパク質（ＶＰ２）をコードするＯＲＦ３配列を含む。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、主要キャプシドタンパク質をコードする配列、およびノロウイルスのマイナー構造タンパク質をコードする配列の両方を含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、サポウイルスの１種以上の分離株のキャプシドタンパク質をコードする、１種以上のサポウイルス配列を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、サポウイルスの１種以上の分離株のキャプシドタンパク質、およびノロウイルスの１種以上の分離株のＯＲＦ２および／またはＯＲＦ３配列の１種以上をコードする１種以上の配列を含む。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示するマルチエピトープ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。マルチエピトープ融合タンパク質は、ノロウイルスまたはサポウイルスの１種以上の遺伝型および／または分離株に由来する配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ１がコードする、ＯＲＦ２がコードする、および／またはＯＲＦ３がコードするポリペプチドまたはその断片、例えば、ノロウイルスポリペプチドの断片、例えば、Ｎ−末端タンパク質、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＶＰ１、およびＰＶ２；および／またはサポウイルスポリペプチドの配列、例えば、Ｎ−末端タンパク質、ｐ１１、ｐ２８、ＮＴＰａｓｅ、ｐ３２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＶＰ１、およびＶＰ１０を含む融合抗原をコードし得る。配列は、ノロウイルスおよびサポウイルスの複数の遺伝型および／または分離株に由来し得る。ポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスに対して外来性の配列を含む融合抗原もコードし得る。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学の技術を使用してオリゴヌクレオチドを連結し、全長の融合タンパク質ののコード配列を形成することにより、融合タンパク質の断片をコードする配列を含む複数のオリゴヌクレオチドから構築することができる。例えば、米国特許第６，６３２，６０１号および米国特許第６，６３０，２９８号を参照されたい。
特定の実施形態において、マルチエピトープ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ノロウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードするノロウイルスのＯＲＦ２配列、およびノロウイルスまたはサポウイルスの異なる分離株に由来するキャプシドタンパク質をコードする、少なくとも１種の他の配列を含む。特定の実施形態において、マルチエピトープ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ノロウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびノロウイルスゲノムの異なる領域に由来する少なくとも１種の他の配列、例えば、ノロウイルスまたはサポウイルスの同一または異なる分離株に由来するＯＲＦ１またはＯＲＦ３配列を含む。特定の実施形態において、マルチエピトープ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスのＯＲＦ１領域に由来する１種以上の配列を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、１種以上のノロウイルスのＯＲＦ１がコードするポリペプチド、例えば、Ｎ−末端タンパク質、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＶＰ１およびＶＰ２、または１種以上のサポウイルスポリペプチド、例えば、Ｎ−末端タンパク質、ｐ１１、ｐ２８、ＮＴＰａｓｅ、ｐ３２、ＶＰｇ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、およびＶＰ１：またはそれらの断片をコードする配列を含んでもよい。特定の実施形態において、マルチエピトープ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスのＯＲＦ１領域に由来する１種以上の配列、およびノロウイルスおよびサポウイルスの同一または異なる分離株のＯＲＦ２またはＯＲＦ３領域に由来する１種以上の配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、リンカー、シグナル配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびスタフィロコッカルタンパク質Ａなどのタンパク質の精製に有用なリガンドを含んでいもよい。
本発明の核酸は、多くの方法（例えば、化学合成、遺伝的またはｃＤＮＡライブラリー、生物自体からなど）により産生することができ、種々の形態（単一鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）で得ることができる。好ましくは、核酸は実質的に純粋な形態（すなわち、他の宿主細胞または宿主細胞の核酸を実質的に含まない）で調製される。
例えば、核酸は、ウイルスに感染した細胞からのｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラリーのスクリーニングにより、またはそれを含む、公知のベクター由来の遺伝子から誘導することにより得ることができる。例えば、対象となるポリヌクレオチドは、感染した個体に由来する糞便または嘔吐物試料中に存在するウイルスＲＮＡに由来するゲノムライブラリーから分離することができる。また、ノロウイルスまたはサポウイルス核酸は、感染したヒトまたは他の哺乳動物、またはＥｓｔｅｓ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，９４２，８６号；Ｇｕｎｔａｐｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊｐｎ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５７：２７６−２７８；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３０３５−３０４５；Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７８：１５７１−１５７８；およびＤｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９７１）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２３：３０７−３１２に開示されたように感染した個体から集められた糞便または嘔吐物試料から分離することができる。ウイルスは、胆汁酸を含む腸液の存在下にＬＬＣ−ＰＫ細胞中で増殖することができる（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：８７３３−８７３８）。ノロウイルスまたはサポウイルスゲノムＲＮＡまたはそれによりコードされるｃＤＮＡからポリヌクレオチドを増幅するために、ＰＣＲなどの増幅法を使用することができる。また、例えば自動合成機を使用して研究室内でポリヌクレオチドを合成することができる。所望の特定のアミノ酸配列に適切なコドンを使用してヌクレオチド配列を設計することができる。一般的に、配列が発現される意図される宿主についての好ましいコドンを選択する。対象となるポリヌクレオチドの完全配列は、標準的方法により調製された重複するオリゴヌクレオチドから構築することができ、完全コード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３を参照されたい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたは一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは単離され、他の成分、例えばタンパク質および脂質を含まない。
従って、部位特異的突然変異誘発法および適切な場合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当該技術分野で公知のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して、所望の配列または完全にまたは一部合成された配列を有するベクターから特定のヌクレオチド配列を得ることができる。例えば， ｓｕｐｒａのＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得るための１つの方法は、通常の自動化ポリヌクレオチド合成機中で産生される重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングし、適切なＤＮＡリガーゼを使用した連結反応、およびＰＣＲによる連結したヌクレオチド配列の増幅する方法である。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４０８４−４０８８を参照されたい。さらに、変化した、または向上した抗原結合能力を有し、および／または減少した免疫原性を有する分子を提供するために、オリゴヌクレオチド指向性合成（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ５４：７５−８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用したギャップのあるオリゴヌクレオチドの酵素的埋め込み（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３）を使用することができる。
Ｃ．免疫原性ポリペプチドの産生
本明細書に開示されるポリペプチドは、任意の適切な方法（例えば組換え的発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）により種々の形態（例えば、天然型、融合型、非グリコシル型、脂質化型）に産生することができる。このようなポリペプチドには、天然に存在したポリペプチド、組換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせによって産生されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドを産生する手段は当該技術分野で十分に理解されている。ポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態で産生される（すなわち、他の宿主細胞または非宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）。
ポリペプチドは、好都合には、ペプチドの分野において当業者に公知であるいくつかの技術のいずれかによって、化学的に合成される。一般的に、これらの方法は、成長するペプチド鎖への、１つ以上のアミノ酸の配列的付加を使用する。通常、最初のアミノ酸のアミノまたはカルボキシル基が適切な保護基によって保護される。次いで、保護された、または誘導体化されたアミノ酸は、不活性な固相担体に結合するか、アミド結合を形成することが可能な条件下において、適切に保護された相補性（アミノまたはカルボキシル）群を有する配列における次の（適切に保護された）アミノ酸を加えることによって溶液中で利用される。次いで、保護基は、新しく追加されたアミノ酸残基から除去され、次のアミノ酸が加えられる。適切な順番で所望のアミノ酸が結合する後、あらゆる残りの保護基（および固相合成技術を使用する場合にはあらゆる固相担体）は順番に、または同時に除去され、最終的なポリペプチドが得られる。この一般的手段の簡単な修飾によって、成長する鎖に同時に１個以上のアミノ酸を付加することが可能となる。例えば、保護されたトリペプチドを、適切な保護ジペプチドとカップリングし（不斉中心をラセミ化しない条件下において）、脱保護した後にペンタペプチドが形成される。例えば、固相ペプチド合成技術については、Ｊ．Ｍ． Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ １９８４）；およびＧ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０），ｐｐ．３−２５４を、古典的な溶液合成については、Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４）；およびＥ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１を参照されたい。
通常の保護基には、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｘ）；２，４−ジニトロフェニル；ベンジル（Ｂｚｌ）；ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニルなどが含まれる。通常の固相担体は、架橋ポリマー性担体である。これらには、ジビニルベンゼン架橋スチレン系ポリマー、例えば、ジビニルベンゼン−ヒドロキシメチルスチレンコポリマー、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレンコポリマーおよびジビニルベンゼンベンジドリルアミノポリスチレンコポリマーが含まれる。
本発明のポリペプチドは、同時複数ペプチド合成などによる他の方法によって化学的に調製することもできる。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８５）８２：５１３１−５１３５；米国特許第４，６３１，２１１号を参照されたい。
あるいは、前記免疫原性ポリペプチド、ポリタンパク質、およびマルチエピトープ融合タンパク質は組換え的に産生することができる。所望のタンパク質をコードする配列が、一端単離および合成されると、それらは適切なベクターまたは発現のためのレプリコンにクローニングすることができる。多くのクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は選択の問題である。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物および昆虫の発現系が当該技術分野で利用可能であり、これらのいずれの発現系も使用することができる（例えば、酵母および昆虫細胞における発現のための模本的な発現カセットの構築について、それぞれ実施例１および２を参照）。また、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細胞を含まない翻訳システム中で翻訳することができる。このような方法は当該技術分野で周知である。
クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよび形質転換することのできる宿主細胞の具体例には、バクテリオファージλ（大腸菌）、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９０（大腸菌以外のグラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌および枯草菌）、ｐＢＤ９（枯草菌）、ｐＩＪ６１（ストレプトミセス）、ｐＵＣ６（ストレプトミセス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス）、ＹＣｐ１９（サッカロミセス）およびウシパピローマウイルス（哺乳動物細胞）が含まれる。一般的に， ｓｕｐｒａのＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＶｏＩｓ．Ｉ＆ＩＩ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， ｓｕｐｒａを参照されたい。
例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に開示されるように、バキュロウイルス系などの昆虫細胞発現系を使用することができ、これは当業者に公知である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法はキットの形態で、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．（ＭａｘＢａｃキット）として市販されている。
免疫原性タンパク質を産生するために、植物発現系も使用することができる、一般的に、このようなシステムは、異種遺伝子を含む植物細胞をトランスフェクトするためにウイルス系ベクターを使用する。このようなシステムの開示については、例えば、Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）５：２０９−２２１；およびＨａｃｋｉａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）１３９：１−２２を参照されたい。
Ｔｏｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載される、ワクシニア系感染／トランスフェクション系などのウイルス系が本発明において使用されることがわかる。このシステムにおいては、細胞は、最初に、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組み換え体を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされる。Ｔ７プロモーターを有する鋳型のみを転写することにおいて、このポリメラーゼは十分に特異性を示す。感染に続き、細胞を、Ｔ７プロモーターによって促進される、対象となるＤＮＡでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組み換え体に由来する細胞質中で発現するポリメラーゼはトランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、宿主の転写機構によりタンパク質に転写される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルな一過性の細胞質内の生産をもたらす。
この発現構築物を含むベクターにより形質転換される宿主細胞内で、所望の免疫原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されるように、遺伝子を、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌の発現のため）、および任意にオペレータ（本明細書において、集団的に「制御」要素と呼ぶ）の制御下に配置することができる。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいても含んでいなくてもよい。本発明において、天然のシグナルペプチドまたは異種配列の両方を使用することができる。リーダー配列は、転写後処理によって、宿主により除去することができる。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；第４，４２５，４３７号；第４，３３８，３９７号を参照されたい。このような配列には、リーダー、ならびにミツバチメリチンシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。
宿主細胞の成長に関連し、タンパク質配列の発現の調節を可能にする、他の調節性配列も好ましい。このような調節性配列は当業者に公知であり、具体例には、調節性化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に対する応答における遺伝子の発現の開始または停止を引き起こすものが含まれる。調節性要素の他の型はベクター内にも存在する、例えばエンハンサー配列である。
制御配列および他の調節性配列は、ベクターへの挿入前にコード配列に連結してもよい。また、コード配列は、制御配列および適切な制限部位を既に含む発現ベクター内に直接クローニングすることができる。
場合によっては、適切な方向性を有する制御配列に結合することができるように、、すなわち適切なリーディングフレームを維持するようにコード配列を修飾する必要がある。変異体または免疫原性ポリペプチドの類似体を産生することも好ましい。タンパク質をコードする配列の一部の欠失により、配列の挿入により、および／または配列内の１つ以上のヌクレオチドの置換により、変異体または類似体を調製することができる。部位特異的突然変異誘発法などのヌクレオチドを修飾するための技術は当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＶｏＩｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ， ｓｕｐｒａ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｓｕｐｒａを参照されたい。
次いで、適切な宿主細胞を形質転換するために発現ベクターが使用される。多くの哺乳動物細胞系が当該技術分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）などが含まれるが、これらに限定されない、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系が含まれる。同様に、大腸菌、枯草菌、ストレプトコッカス種などの細菌宿主が、本発明の発現構築物において使用されることがわかる。本発明において有用な酵母宿主には、特に、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・マレトサ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリュイベロミセス・フラギリス、クリュイベロミセス・ラクティス、ピチア・ギレリモンディ、ピチアパストリス、シゾサッカロミセス・ポンベ、およびアルカン資化性酵母が含まれる。バキュロウイルス発現ベクターと使用される昆虫細胞には、特に、ネッタイシマカ、オートグラファカリフォルニア、カイコガ、キイロショウジョウバエ、ヨウトガ、およびイラクサギンウワバが含まれる。
発現系および選択した宿主に依存し、本発明のタンパク質は、対象となるタンパク質が発現する条件下において、前述の発現ベクターにより形質転換される、増殖する宿主細胞によって産生される。適切な増殖条件の選択は当業者の範囲内である。次いで、細胞を、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの免疫原性ポリペプチドを維持したままで細胞を溶解する、化学的、物理的または機械的手段を使用して破壊する。例えば、免疫原性ポリペプチドの漏出が起こる、界面活性剤または有機溶媒を使用することによって細胞壁または膜から成分を除去することにより、細胞内タンパク質を得ることもできる。このような方法は当業者に公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．，１９９０）に記載されている。
例えば、本発明において使用される細胞を破壊する方法には、音波処理または超音波処理；撹拌、液体または固体押出、：熱処理；凍結融解；乾燥；爆発的分解；浸透圧ショック；トリプシン、ノイラミニダーゼおよびライソザイムを含むプロテアーゼを含む溶解酵素での処理：アルカリ処理；および胆汁塩、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０およびＣＨＡＰＳなどの界面活性剤および溶媒の使用が含まれるが、これらに限定されない。細胞を破壊するために使用される特定の技術は、主として選択の問題であり、ポリペプチドが発現する細胞の型、培養条件および使用されるあらゆる前処理に依存するであろう。
細胞破壊の後、細胞の破片を、通常は遠心により除去し、細胞内に産生されたノロウイルスおよび／またはサポウイルスの免疫原性ポリペプチドを、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、親和性クロマトグラフィー、免疫沈降などが含まれるがこれらに限定されない標準的精製技術を使用してさらに精製する。
例えば、本発明の細胞内ノロウイルスおよび／またはサポウイルス免疫原性ポリペプチドを得るための方法は、特異的抗体を使用する免疫親和性クロマトグラフィーなどによる親和性精製を必要とする。適切な親和性樹脂の選択は当業者の範囲内である。親和性クロマトグラフィー後に、免疫原性ポリペプチドを、上述の技術のいずれかによるような、当該技術分野で周知の従来の技術を使用してさらに精製することができる。
複数のポリペプチド（例えば、ポリペプチドアジュバントと組み合わせて、１種以上のウイルス株またはウイルスポリペプチドから構造および／または非構造タンパク質）を同時に産生することが好ましい。２種以上の異なるポリペプチドの産生は、例えば、異なるポリペプチドをコードする構築物で宿主細胞を同時にトランスフェクトすることによって容易に実現することができる。同時トランスフェクションは、トランスまたはシスのいずれかによって、すなわち別個のベクターを使用するか、ポリペプチドをコードする単一のベクターを使用するかのいずれかによって実現することができる。単一のベクターを使用する場合、ポリペプチドの発現は、制御要素の単一のセットによって促進され、また、ポリペプチドをコードする配列は、個々の制御要素によって制御される個々の発現カセット内のベクター上に存在し得る。
本明細書に開示されるポリペプチドは、固相担体に結合させることができる。本発明の実施において使用することのできる固相担体には、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態において）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）：ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイターウェル）；ポリフッ化ビニリジン；ジアゾ化された紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどの基質が含まれる。
通常、固相担体は、最初に、成分が十分に担体に固定化するような、適切な結合条件下において、固相成分（例えば１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原）と反応する。時々、抗原の担体への固定化は、良好な結合特性を有するタンパク質への抗原の最初のカップリングによって増進される。適切なカップリングタンパク質には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オブアルブミンおよび当業者に周知である他のタンパク質などの高分子が含まれるが、これらに限定されない。抗原を担体に結合するために使用することのできる他の分子には、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが含まれる。このような分子、およびこれらの分子の抗原への結合法は当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）６：５６−６３；およびＡｎｊａｎｅｙｕｌｕ ａｎｄ Ｓｔａｒｏｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． （１９８７） ３０：１１７−１２４を参照されたい。
所望であれば、ポリペプチドを、従来の技術を使用して標識化することができる。適切な標識には、フルオロフォア、発色団、放射性原子（特に、３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子密度の高い試薬、酵素および特定の結合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は、通常、それらの活性によって検出される。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計によって定量可能な青色顔料へ変化させる能力によって検出される。「特定の結合パートナー」とは、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体のように、高い特異性でリガンド分子に結合することのできるタンパク質を意味する。他の特定の結合パートナーとして、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびタンパク質Ａ、および多数の受容体−リガンドの結合が当該技術分野で公知である。単一の標識または標識の組み合わせは、本発明の実施において使用される。
Ｄ．核酸免疫
免疫原性キャプシドポリペプチド、および／または他の免疫原性ウイルスポリペプチド（例えば構造および非構造タンパク質）、および／またはマルチエピトープ融合タンパク質、および／またはＶＬＰをコードする、本明細書に開示される核酸を使用した核酸免疫は、例えばノロウイルスおよび／またはサポウイルス感染症を治療または予防するため、被験体において免疫応答を誘発するために使用することができる。
適切な宿主細胞内でウイルスポリペプチドおよび／またはＶＬＰを産生することのできる発現カセットを産生するために、本明細書に開示される核酸を発現ベクターに挿入することができる。ＶＰ１をコードする構築物のＶＬＰを産生する能力は、経験的に検出することができる（例えば、電子顕微鏡によるＶＬＰの検出を記載する実施例１および２を参照）。
発現カセットは、通常、コード配列に作動可能に連結する制御要素を含み、被験種の中でのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現を可能にする。例えば、哺乳動物細胞発現のための標準的なプロモーターには、特に、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのＣＭＶプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモータが含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーターなどの他の非ウイルス性プロモーターも、哺乳動物発現のために使用されることがわかる。通常、翻訳停止コドンの３’に位置する、転写終結およびポリアデニル化配列も存在する。好ましくは、コード配列の５’に位置する転写キシの最適化のための配列も存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．， ｓｕｐｒａに記載のようなＳＶ４０、およびウシ成長ホルモンターミネータ配列に由来するものが含まれる。
哺乳動物の構築物の発現レベルを上昇させるために、エンハンサー要素も本明細書において使用される。具体例には、Ｄｉｊｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＰＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載のようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載のようなラウスサルコーマウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、およびＣＭＶイントロンＡ配列に含まれる要素などの、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載のような、ヒトＣＭＶに由来する要素が含まれる。
さらに、ベクターは、アジュバントをコードする配列を含むように構築することができる。特に適切なものは、細菌性ＡＤＰリボシル化毒素、例えば、ジフテリア毒素、百日咳毒素（ＰＴ）、コレラ毒素（ＣＴ），大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ１およびＬＴ２）、シュードモナスエンドトキシンＡ、ボツリヌスＣ２およびＣ３毒素、およびＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素の解毒変異体である。好ましい実施形態において、ベクターは、参考として本明細書で援用される、米国特許第６，８１８，２２２号に開示された、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２解毒か変異体などの、大腸菌熱不安定性毒素の解毒された変異体コード配列を含む。１種以上のアジュバントポリペプチドは、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスポリペプチドと共発現され得る。特定の実施形態において、アジュバントおよびウイルスポリペプチドは、１種以上のアジュバントポリペプチドおよび１種以上のウイルスポリペプチドを含む融合タンパク質の形態で共発現され得る。また、アジュバントおよびウイルスポリペプチドは別個のタンパク質として共発現され得る。
さらに、例えば、単一または１種以上のウイルス分離株に由来する対象となる複数の抗原／エピトープをコードする、抗原−コード遺伝子配列のキメラを含むベクターを構築することができる。特定の実施形態において、アジュバントまたは抗原をコードする配列が、ウイルスキャプシドコード配列に先行するか、または後に続き、キメラ転写単位は、アジュバント、および／または対象となる抗原およびキャプシドポリペプチドをコードする、単一のオープンリーディングフレームを有する。また、複数のシストロンのカセット（例えば、二シストロン性カセット）が構築され、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳなどを使用して単一のｍＲＮＡ由来の複数のアジュバントおよび／または抗原の発現を可能にする。最後に、アジュバントおよび／または抗原は、単一のプラスミドまたは他のベクター上で、別個のプロモーターから別個の転写物においてコードされ得る。
一旦完成すると、構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して核酸免疫などのために使用される。遺伝子送達方法は当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照されたい。遺伝子は脊椎動物の被験体に直接送達されるか、または被験体に由来する細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達され細胞が被験体に再び移植される。
多くのウイルスを基礎とするシステムが、遺伝子の哺乳動物細胞への移入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための好都合のプラットフォームをもたらす。当該技術分野で公知の技術を使用して、選択された配列がベクター中に挿入され、レトロウイルス粒子に包埋される。次いで、組換えウイルスが分離され、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで被験体の細胞に送達される。多くのレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；およびＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。
いくつかのアデノウイルスベクターが記載されている。宿主ゲノム内に統合するレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に残り、その結果挿入突然変異の危険性を最小化する（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。さらに、種々のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムが遺伝子送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該技術分野で周知の技術を使用して容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際特許出願公開第ＷＯ ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照されたい。
本発明のポリヌクレオチドの送達に有用な他のベクターシステムは、Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（参考として本明細書で援用される、１９９７年１０月１４日発行の米国特許第５，６７６，９５０）に記載された、経腸投与される組換えポックスウイルスである。
対象となる抗原をコードする核酸分子を送達するのに使用される、さらなるウイルスベクターには、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む、ウイルスのポックスファミリーに由来するものが含まれる。具体例として、ノロウイルスおよび／またはサポウイルス抗原を発現するワクシニアウイルス組み換え体が以下のように構築される。最初に、特定のノロウイルスまたはサポウイルス抗原をコードする配列をコードするＤＮＡが、ワクシニアプロモータ、および隣接するチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列などのワクシニアＤＮＡ配列に隣接するように、適切なベクターに挿入される。次いで、ワクシニアに同時に感染する細胞をトランスフェクトするために、このベクターが使用される。相同的組換えは、ワクシニアプロモータおよび対象となるコード配列をコードする遺伝子をウイルスゲノムに導入する役割を果たす。得られたＴＫ−組み換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、耐性のウイルスプラークを採取することによって選択することができる。
また、鶏痘およびカナリア痘ウイルスなどのアビポックスウイルスも遺伝子を送達するために使用することができる。哺乳動物病原体に由来する免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与した場合に感染防御免疫を授与することが知られている。アビポックス属のメンバーは、感受性のある鳥類においてのみ生産的に複製し、それ故哺乳動物細胞内では感染性がないため、ヒトおよび他の哺乳動物種においてはアビポックスベクターの使用が特に好ましい。組換えアビポックスウイルスの産生方法は当該技術分野で公知であり、ワクシニアウイルスの産生に関連して開示されたように、遺伝的組換えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ ８９／０３４２９；およびＷＯ９２／０３５４５を参照されたい。
Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に開示された、アデノウイルスキメラベクターなどの分子複合ベクターを、遺伝子送達のために使用することができる。
シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）、およびヴェネズエランエクインエンセファリティスウイルス（ＶＥＥ）、に由来するベクターなどが含まれるがこれらに限定されない、アルファウイルス属のメンバーは、本発明のポリヌクレオチドを送達するためのウイルスベクターとして使用されることがわかる。本発明の実施に有用なシンドビスウイルスに由来するベクターの開示については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９；および国際出願公開第ＷＯ９５／０７９９５，ＷＯ９６／１７０７２；ならびにいずれも参考として本明細書で援用される、１９９８年１２月１日発行の、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７２３号、および１９９８年８月４日発行の、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．，米国特許第５，７８９，２４５号を参照されたい。特に好ましくは、シンドビスウイルスおよびヴェネズエランエクインエンセファリティスウイルスに由来する配列を含むキメラアルファウイルスベクターである。例えば、参考として本明細書で援用される、Ｐｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０３９４−１０４０３および国際特許出願公開ＷＯ０２／０９９０３５，ＷＯ０２／０８０９８２，ＷＯ０１／８１６０９，およびＷＯ００／６１７７２を参照されたい。
宿主細胞内で対象となるコード配列（例えば、ＶＰ１／ＶＰ２発現カセット）の誘導性の一過性の発現をもたらすために、ワクシニア系感染／トランスフェクション系が好都合に使用される。このシステムにおいては、最初に、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組み換え体により細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで感染する。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを有する鋳型のみを転写する、強い特異性を示す。感染に続き、Ｔ７プロモーターによって刺激し、細胞を対象となるポリヌクレオチドでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組み換え体に由来する細胞質中で発現するポリメラーゼは、トランスフェクトしたＤＮＡをＲＮＡに転写し、宿主の翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡの高レベルな一過性の細胞質での産生、およびその翻訳産物をもたらす。例えば、Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照されたい。
ワクシニアまたはアビポックスウイルス組み換え体を使用した感染、または他のウイルスベクターを使用した遺伝子の送達のための他の手法として、宿主細胞内に導入された後に高レベル発現をもたらす増幅システムを使用することができる。特に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのためのコード領域に先行するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを設計することができる。この鋳型に由来するＲＮＡの翻訳は、さらなる鋳型を順番に転写するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを生成するであろう。同時に、発現がＴ７プロモーターの制御下であるｃＤＮＡがある。従って、増幅された鋳型ＲＮＡの翻訳から生成されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいくつかは、所望の遺伝子の転写を導くであろう。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは増幅を開始するために必要であるので、転写反応を準備するために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型と一緒に細胞中に導入され得る。ポリメラーゼはタンパク質として、またはＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上に導入することができる。Ｔ７システムのさらなる考察および細胞の形質転換のためのそれらの使用については、例えば、国際特許出願ＷＯ９４／２６９１１；Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０；Ｄｅｎｇ ａｎｄ Ｗｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ（１９９４）１４３：２４５−２４９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１２０１−１２０６；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１：２８６７−２８７２；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４） ２２：２１１４−２１２０；および米国特許第５，１３５，８５５号を参照されたい。
対象となる合成発現カセットは、ウイルスベクターなしでも送達することができる。例えば、合成発現カセットは、被験体またはそれに由来する細胞に送達する前に、リポソープ内にＤＮＡまたはＲＮＡとして封入することができる。脂質封入は、一般的に、核酸を安定して結合または封入し、残留することのできるリポソームを使用して実現される。脂質調製物に対する濃縮ＤＮＡの比は変化し得るが、一般的には１：１（ＤＮＡ（ｍｇ）：脂質（マイクロモル））の前後であるか、脂質が多い。核酸の送達のための担体としてのリポソームの使用の概説については、Ｈｕｇ ａｎｄ Ｓｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１．）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１， ｐｐ．５１２−５２７を参照されたい。
本発明において使用されるリポソーム調製物には、カチオン性（正に荷電）、アニオン性（負に荷電）および中性調製物が含まれ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）：および精製された転写因子（Ｄｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）を機能的形態で細胞内への送達を媒介することが示されている。
カチオン性リポソームは容易に入手できる。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームが、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．から商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎで入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８７）８４：７４１３−７４１６も参照）。他の入手可能な脂質には、（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が含まれる。他のカチオン性リポソームは、当該技術分野で周知の技術を使用して、容易に入手できる材料から調製することができる。例えば、ＤＯＴＡＰ （ｌ，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の開示について、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９０／１１０９２号を参照されたい。
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手でき、または容易に入手出来る材料を使用して容易に調製することができる。このような材料には、特にホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが含まれる。これらの材料は、適切な比率でＤＯＴＭＡおよび出発材料ＤＯＴＡＰと混合してもよい。これらの材料を使用するリポソームの産生方法は当該技術分野で周知である。
リポソームは、多層ベシクル（ＭＬＶ）、小さい単層ベシクル（ＳＵＶｓ）、または大きい単層ベシクル（ＬＵＶ）を含むことができる。当該技術分野で公知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；Ｅｎｏｃｈ ａｎｄ Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；およびＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照されたい。
ＤＮＡおよび／またはタンパク質抗原は、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１に開示されたのと同様の渦巻き形の脂質組成物中で送達することもできる。また、米国特許第４，６６３，１６１号および第４，８７１，４８８号も参照されたい。
対象となる発現カセットは、粒子状担体に封入、吸着または結合していてもよい。このような担体は免疫システムに対して、複数の選択された抗原のコピーを提示し、局所的なリンパ節内の抗原の移動、捕獲および滞留を促進する。粒子はマクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞によって取り込まれ、および／またはサイトカイン遊離の刺激などの他のメカニズムによる抗原提示を増強する。粒子状担体の具体例には、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもの、およびＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に由来する高分子が含まれる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ'Ｈａｇａｎ Ｄ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照されたい。
さらに、他の粒子システムおよびポリマーを、対象となる遺伝子送達のｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて使用することができる。例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、およびこれらの分子の複合体などのポリマーが、対象となる核酸を移動するのに有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストランが媒介するトランスフェクション、他の不溶性無機塩、例えばリン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどを使用したリン酸カルシウム沈殿または沈殿が本発明の方法で使用される。例えば、遺伝子導入に有用な送達システムの概説について、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照されたい。ペプトイド（参考として本明細書で援用される、１９９８年１１月３日発行の、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８３１，００５号）も、本発明の構築物の送達に使用することができる。
さらに、金およびタングステンなどの粒子状担体を使用した、微粒子銃送達システムは、本発明の合成発現カセットの送達に特に有用である。粒子は、一般的に減圧下で「遺伝子銃」から放出する銃の力を使用して、高速で送達するために、合成発現カセットでコーティングされる。このような技術、およびそれに有用な装置については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；第５，１００，７９２号；第５，１７９，０２２号；第５，３７１，０１５号；および５，４７８，７４４号を参照されたい。また、針のない注入システムを使用することができる（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１５０３−１５０９，１９９４；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇ．）。
本発明の合成発現カセットを有する組換えベクターは、脊椎動物被験体に送達するための組成物に産生される。これらの組成物は予防的（感染の予防）または治療的（感染後の疾患の治療）である。組成物は、投与された個体において免疫応答が起こるように、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原量が産生される、「治療有効量」の対象となる遺伝子を含む。正確な必要量は、治療される被験体；治療される被験体の年齢および健康状態；抗体を合成するための被験体の免疫システムの能力；所望の保護の程度；治療される病状の重症度；選択された特定の抗原および投与様式、他の因子によって変化するであろう。適切な有効量は当業者によって容易に決定することができる。従って、「治療有効量」は、通常の試験によって決定することのできる、相対的に広い範囲内にあるであろう。
組成物は、水、食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどの１種以上の「薬学的に許容される賦形剤または媒体を含む。さらに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質、界面活性剤などの補助的な物質がこのような媒体中に存在してもよい。ブピバカイン、カルジオトキシンおよびショ糖などがあるがこれらに限定されない、免疫または核酸の取り込みおよび／または発現の促進剤を組成物中に含ませるか、一緒に投与してもよい。
一旦、製剤化されると、本発明の組成物は直接被験体に投与することができ（例えば、上述の通り）、または上述のような方法を使用して、被験体に由来する細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達してもよい。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏでの送達、および形質転換細胞の被験体への再移植は当該技術分野で公知であり、例えば、デキストランが媒介するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、リポフェクタミンおよびＬＴ−１媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、（関連する抗原を有するまたは有さない）ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
上述のようなｉｎ ｖｉｖｏにおける合成発現カセット組成物の直接送達は、ＢｉｏｊｅｃｔＴＭなどの装置の必要のない通常のシリンジ、またはＡｃｃｅｌｌＴＭ遺伝子送達システム（ＰｏｗｄｅｒＭｅｄ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）などの遺伝子銃のいずれかを使用した注入により、一般的にウイルスベクターあり、またはなしで実現する。構築物は、皮下注射、表皮注射、皮内移植、筋肉注射、静脈注射、経粘膜注射（経鼻、直腸および膣内）、腹腔注射または経口投与のいずれかにより送達される（例えば注射）。表皮細胞へのＤＮＡの送達は、皮膚関連リンパ細胞へのアクセスをもたらし、受容者におけるＤＮＡの一時的な存在をもたらすので、この方法が特に好ましい。他の投与の他の方法には、経口摂取および肺投与、座薬、無針注射、経皮投与、局所投与および経皮投与が含まれる。投薬治療は、単一投与スケジュールまたは複数投与スケジュールであってもよい。
ｅｘ ｖｉｖｏ送達
一実施形態において、Ｔ細胞および関連する型の細胞（マクロファージ、単球、リンパ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞などの抗原提示細胞を含むがこれらに限定されない）を、本発明の発現カセットのｅｘ ｖｉｖｏ送達のために使用することができる。Ｔ細胞は、当業者に公知の種々の手段により、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から分離することができる。例えば、アクセサリーおよびＢ細胞の除去により、ＰＢＬ集団から「濃縮」することができる。特に、Ｔ細胞の濃縮は、抗−ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を使用した非Ｔ細胞の除去により実現することができる。同様に、他の抗体は、非Ｔ細胞の特定の集団を枯渇するために使用することができる。例えば、抗−Ｉｇ抗体分子は、Ｂ細胞を枯渇するために使用することができ、抗−ＭａｃＩ抗体分子は、マクロファージを枯渇するために使用することができる。
Ｔ細胞は、当業者に公知の技術によって、さらに多くの異なる亜集団に分けられる。２つの主要な亜集団は、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８の差別的な発現に基づいて分離される。例えば、上述のようなＴ細胞の濃縮に続き、ＣＤ４＋細胞はＣＤ４に特異的な抗体を使用して濃縮することができる（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照）。抗体は、磁気ビーズなどの固相担体に結合することができる。逆にＣＤ８＋細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体の使用を通じて濃縮することができ（ＣＤ４＋細胞の除去）、または固相担体と結合するＣＤ８抗体の使用により分離することができる。Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：８８に記載のような形質導入の前または後で、ノロウイルスまたはサポウイルスに感染した罹患体由来のＣＤ４リンパ球細胞をｅｘ ｖｉｖｏで広げることができる。
Ｔ細胞の精製に続き、当業者に公知の遺伝的修飾の種々の方法を、本明細書に開示されたように構築された非ウイルスまたはウイルス系遺伝子導入ベクターを使用して実施することができる。例えば、１つの手法は、ベクター産生細胞に由来する培養物の上清を含むベクターによる、精製したＴ細胞集団の形質導入を含む。第二の手法は、放射線照射したベクター産生細胞の単層の精製したＴ細胞との共培養を含む。第三の手法は、同様の共培養手法を含むが、精製したＴ細胞を種々のサイトカインで予め刺激し、放射線照射したベクター産生細胞との共培養の前に４８時間培養する。このような形質導入前の予備刺激は効果的な遺伝子導入を増強する（Ｎｏｌｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０６５）。増殖するためのこれらの培養物の刺激は、被験体への再注入のための細胞集団を増加させる。共培養に続き、ベクター産生細胞単層からＴ細胞を集め、広げ、液体窒素中で凍結させる。
本発明の１種以上の発現カセットを含む遺伝子伝達ベクター（分離したＴ細胞への送達のための適切な制御要素に関連する）は、公知の方法を使用して構築させることができる。
遺伝子伝達ベクターの構築において選択可能なマーカーを使用することができる。例えば、マーカーは、細胞傷害性物質に対して耐性の遺伝子伝達ベクターで哺乳動物細胞を形質導入するために使用することができる。細胞傷害性物質は、ネオマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、アクチノマイシン、ネトロプシン、ジスタマイシンＡ、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得るが、これらに限定されない。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩは、ネオマイシン類似体のゲネチシン（Ｇ４１８）に抵抗性を付与する。
選択するために、Ｔ細胞を、少なくとも１種の型の成長因子を含む培地中で維持することもできる。特定の型の細胞の成長を持続する、種々の成長因子が当該技術分野で知られている。このような成長因子の具体例は、リンパ球の成長および活性化を促進する、ｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などのサイトカインマイトジェンである。特定の型の細胞は、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）およびヒト成長ホルモンを含むホルモンなどの他の成長因子によって刺激される。特定の細胞集団についての適切な成長因子の選択は、当業者によって容易に実現される。
例えば、分化した前駆体および幹細胞などの白血球は種々の成長因子によって刺激される。特に、活性化ＴＨおよびマクロファージによって産生されたＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦは、多分化能性幹細胞、顆粒球−単球前駆体、好酸球前駆体、好塩基球前駆体、巨核球、および赤血球前駆体に分化する骨髄系幹細胞を刺激する。分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１およびＥＰＯなどの成長因子によって調節される。
次いで、多分化能性幹細胞は、リンパ球系幹細胞、骨髄間質細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞前駆体、胸腺細胞、ＴＨ細胞、ＴＣ細胞およびＢ細胞に分化する。この分化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−５などの成長因子によって調節される。
顆粒球−単球前駆体は、単球、マクロファージおよび好中球に分化する。このような分化は、成長因子ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−８によって調節される。好酸球前駆体は好酸球に分化する。この工程は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５によって調節される。
好塩基球前駆体の肥満細胞および好塩基球への分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＬ−９によって調節される。ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＩＬ−６に対する応答において、巨核球は血小板を産生する。赤血球前駆体細胞は、ＥＰＯに対する応答において赤血球に分化する。
従って、ＣＤ３−結合物質による活性化の間、Ｔ細胞は、マイトジェン、例えば、ＩＬ−２などのサイトカインと接触することができる。特に好ましい実施形態において、ＩＬ−２は、約５０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で、Ｔ細胞の集団に加えられる。ＣＤ３−結合物質との活性化は２〜４日間実施することができる。
一旦適切に活性化されると、ベクターのＴ細胞へのトランスフェクションを可能にする条件下において、Ｔ細胞を適切な遺伝子伝達ベクターと接触させることにより、Ｔ細胞を遺伝的に修飾する。Ｔ細胞集団の細胞密度が約０．１×１０６〜５×１０６、好ましくは０．５×１０６〜２×１０６である場合に、遺伝的修飾が実施される。多くの適切なウイルス性および非ウイルス性遺伝子伝達ベクターが、本明細書の使用について開示されている。
形質導入後、公知の技術を使用し、形質導入細胞を、非形質導入細胞から選択する。例えば、形質導入において使用される遺伝子伝達ベクターが、細胞傷害性物質に対する抵抗性を付与する選択可能なマーカーを含む場合、細胞は適切な細胞傷害性物質と接触することができ、その結果、非形質転換細胞は、形質導入された細胞からネガティブに選択することができる。選択可能なマーカーが細胞表面マーカーである場合、細胞は特定の細胞表面マーカーに特異的な接着剤と接触することができ、それによって、形質導入された細胞を、集団から離れてポジティブに選択することができる。選択工程は、蛍光活性化細胞解析分離装置（ＦＡＣＳ）技術を必要とし、ＦＡＣＳは集団から、特定の表面マーカーを含む細胞を選択するために使用され、または選択工程は、標的細胞捕獲および／またはバックグラウンドの除去のための回収可能な担体としての磁気反応性粒子の使用を必要とする。
特に、形質導入された細胞のポジティブな選択は、ＦＡＣＳ細胞分離装置（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ、Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ［米国カリフォルニア州サンノゼ］）を使用して実施することができ、選択可能な細胞表面マーカーを発現する、形質導入された細胞が分類され、集められる。形質導入に続き、特定の細胞表面マーカーに対する、蛍光標識した抗体分子を使用して細胞を染色する。各細胞における結合抗体の量は、細胞分離装置からの細胞を含む水滴の通過により測定することができる。染色された細胞を含む水滴の電磁電荷を伝えることによって、形質導入された細胞は他の細胞から分離することができる。次いで、ポジティブに選択された細胞を無菌の収集容器に集める。これらの細胞分類工程は、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ．ＴＭ．Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ，ｗｉｔｈ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ３−１１ ｔｏ ３−２８ ａｎｄ １０−１ ｔｏ １０−１７に詳述されている。
形質導入された細胞のポジティブな選択は、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく細胞の磁気分離を使用して実施することもできる。このような分離技術においては、ポジティブに選択される細胞は、最初に特異的結合物質（例えば、細胞表面マーカーと特異的に相互作用する抗体または試薬）と接触する。次いで、細胞は、特定の結合物質（陽性細胞に結合する）と結合する試薬と結合する回収可能な粒子（例えば、磁気反応性粒子）と接触する。次いで、細胞結合物質と粒子の複合体を、例えば磁場を使用して、非標識細胞から物理的に分離する。磁気反応性粒子を使用する場合、標識された細胞は磁場を使用して容器内に保持されるが、陰性細胞は除去される。これらおよび同様の分離工程は当業者に公知である。
選択された形質導入細胞中でのベクターの発現は、当業者に公知の種々の検定によって評価することができる。例えば、対象となる、挿入されたヌクレオチド配列の性質に依存し、ウェスタンブロットまたはノーザン解析を使用することができる。一旦、発現が確立され、形質導入されたＴ細胞が、選択された合成発現カセットの存在について試験されると、末梢血流を通じて罹患体に注入される準備が整う。本発明は、主要な哺乳動物細胞のｅｘ ｖｉｖｏ集団の遺伝的修飾のためのキットを含む。キットは、通常、少なくとも１種の選択可能なマーカー、および１種以上の容器に含む少なくとも１種の合成発現カセットをコードする遺伝子伝達ベクター、付属の試薬またはハードウェア、およびキットの取扱説明書を含む。
Ｅ．ウイルス様粒子の産生
ノロウイルスおよびサポウイルスのキャプシドタンパク質は、種々の真核細胞中で発現した場合に、非感染性のウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己構築する（本明細書に参考文献として組み入られる、Ｔａｕｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１５０：１４２５−１４３１；Ｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１３４５−１３５３；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１９０９−１９１４；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：１８５１−１８５８；Ｈａｎｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５０：２１−３６）。対象となる粒子形成ポリペプチド、例えば、ＶＬＰを形成することのできる、ノロウイルスまたはサポウイルスＶＰ１ポリペプチドまたはその変異体または断片が、適切な宿主細胞中で組換え的に発現する場合に、ＶＬＰは自発的に形成される。
ノロウイルスおよび／またはサポウイルスキャプシドをコードする配列を含む発現ベクターは、組換え技術を使用して都合よく産生される。後述するように、本発明のＶＰ１ポリペプチドをコードする発現ベクターは、対象となる他のポリペプチドをコードする配列、例えば、ＯＲＦ１−コード非構造タンパク質（ノロウイルスＮｔｅｒｍ、ＮＴＰａｓｅ、ｐ２０、ｐ２２、ＶＰｇ、Ｐｒｏ、およびＰｏｌ；およびサポウイルスｐ１１、ｐ２８、ＮＴＰａｓｅ、ｐ３２、ＶＰｇ、ＰｒｏおよびＰｏｌ）およびノロウイルスＶＰ２およびサポウイルスＶＰ１０などのマイナー構造タンパク質を含む。このような発現ベクターは、ＶＰ１を含むＶＬＰ、および対象となる、任意の追加のポリペプチドを産生することができる。
特定の実施形態において、発現ベクターは、ノロウイルスおよびサポウイルスの１種以上の遺伝型および／または分離株に由来する１種以上の構造タンパク質をコードする。例えば、ＶＬＰを産生することのできる発現ベクターは、ノロウイルスおよびサポウイルスの１種以上の分離株および／または遺伝型に由来する１種以上のＶＰ１キャプシドタンパク質を含むことができる。さらに、発現ベクターは、さらに、ノロウイルスおよびサポウイルスの１種以上の分離株および／または遺伝型に由来する、１種以上のマイナー構造タンパク質（例えば、ＶＰ２、ＶＰ１０）のコード配列を含んでもよい。
一旦、所望の粒子形成ポリペプチドのコード配列が分離または合成されると、適切なベクターまたは発現のためのレプリコンにクローニングすることができる。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、選択の問題である。一般的にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａまたはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａを参照されたい。次いで、ベクターは適切な宿主細胞に形質転換される。適切な組換え発現系には、当該技術分野で周知の細菌、バキュロウイルス／昆虫、ワクシニア、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、アルファウイルス（例えば、シンドビス、ヴェネズエランエクインエンセファリティス（ＶＥＥ））、哺乳動物、酵母、植物、およびアフリカツメガエル発現系が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞系、ワクシニア、シンドビス、昆虫および酵母システムである。
例えば、多くの哺乳動物細胞系が当業界で公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手できる不死化細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウスミエローマ（ＳＢ２０）、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）などが含まれるがこれらに限定されない。同様に、大腸菌、枯草菌、およびストレプトコッカス種などの細菌宿主は、本発明の発現構築物とともに使用される。本発明において有用な酵母宿主には、特に、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・マレトサ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリュイベロミセス・フラギリス、クリュイベロミセス・ラクティス、ピチア・ギレリモンディ、ピチアパストリス、シゾサッカロミセス・ポンベ、およびアルカン資化性酵母が含まれる。例えば、参考として本明細書で援用される、Ｓｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，１８３，９８５号を参照されたい。ノーウォークウイルスＶＰ１およびＶＰ２構造タンパク質の発現、およびサッカロミセス・セレビシエにおけるウイルス粒子の産生を開示する実施例１も参照されたい。バキュロウイルス発現ベクターにおいて使用される昆虫細胞には、特に、ネッタイシマカ，オートグラファカリフォルニア，カイコガ，キイロショウジョウバエ，ヨウトガ，およびイラクサギンウワバが含まれる。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照されたい。ノーウォークウイルスＶＰ１およびＶＰ２構造タンパク質の発現、およびＳＦ９細胞におけるウイルス粒子の産生を開示する実施例２も参照されたい。真菌の宿主には、例えば、アスペルギルス種が含まれる。植物宿主には、たばこ、大豆、ジャガイモの葉、塊茎組織およびトマトが含まれる。例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：１８５１−１８５８を参照されたい。
ウイルスベクターは、ワクシニアウィルスおよび鶏痘ウイルスを含む、ウイルスの水痘ファミリーに由来するものなどの、真核細胞内における粒子の産生のために使用することができる。さらに、ワクシニア系感染／トランスフェクション系は、Ｔｏｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載の通り、本発明において使用される。この系においては、細胞は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組み換え体によってｉｎ ｖｉｔｒｏで最初に感染する。Ｔ７プロモーターを有する鋳型のみを転写するという点において、このポリメラーゼは優れた特異性を示す。感染に続き、細胞は、Ｔ７ プロモーターによって促進される、対象となるＤＮＡを使用してトランスフェクトされる。ワクシニアウイルス組み換え体に由来する細胞質中で発現するポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いで、宿主の翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。また、Ｔ７は、「前駆体」システムにおいて、精製タンパク質または酵素として加えることができる（Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０）。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルで一過性の細胞質内の生産をもたらす。
発現系および選択された宿主に依存し、粒子形成ポリペプチドが発現し、ＶＬＰが形成されるような条件下において、発現ベクターによって形質転換される宿主細胞を成長させることによって、ＶＬＰは産生される。適切な成長条件の選択は当業者の範囲内である。
ＶＬＰが細胞内に形成される場合、化学的、物理的または機械的手段を使用して細胞を破壊し、ＶＬＰが実質的に無傷であることを維持して細胞を溶解する。このような方法は当業者に公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．，１９９０）に開示されている。
次いで、粒子を、密度勾配遠心分離、例えば、ショ糖勾配、ＰＥＧ沈殿、ペレッティングなど、ならびにイオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９−６９３６）によってその強度を維持するような方法を使用して分離（または実質的に精製）する。
さらなる実施形態においては、本発明は、１種以上のウイルス株に由来する抗原を含む、モザイクＶＬＰを産生するためのベクターおよび宿主細胞を提供する。少なくとも２種の型のウイルスに由来するキャプシドタンパク質を含むモザイクＶＬＰは、同じ宿主細胞内で、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの少なくとも２種の異なる遺伝型および／または分離株に由来するキャプシドタンパク質を共発現させることによって産生される。さらに、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの少なくとも２種の遺伝型および／または分離株に由来するキャプシドポリペプチドのコード配列は、１種以上の発現ベクターにクローニングすることができ、シスまたはトランスに共発現する。さらに、発現ベクターは、さらに、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスの１種以上の分離株および／または遺伝型に由来する、１種以上のマイナー構造タンパク質または非構造タンパク質のコード配列を含む。
モザイクＶＬＰは、ノロウイルスの複数の株（例えば、ＮＶ、ＳＭＶおよびＨＶ）に由来する１種以上のＶＰ１ポリペプチド、または、サポウイルスの複数の株（例えば、サッポロ、ロンドン／２９８４５、パークヴィル、ヒューストン／９０）に由来する１種以上のＶＰ１ポリペプチドを含んでもよい。また、モザイクＶＬＰはノロウイルスおよびサポウイルスキャプシドタンパク質の組み合わせを含んでもよく、このようなモザイクＶＬＰは、ノロウイルスの１種以上の株に由来するＶＰ１ポリペプチド、およびサポウイルスの１種以上の株に由来する１種以上のＶＰ１ポリペプチドを含んでいてもよい。
モザイクＶＬＰは、キャプシドタンパク質の発現およびＶＬＰの産生について上述のような、あらゆる適切な組換え発現系を使用して、複数のキャプシドタンパク質の共発現によって産生される。好ましい実施形態において、それぞれが異なるキャプシドタンパク質を発現する、２個のハプロイドが接合することによって産生されたサッカロミセス・セレビシエのディプロイド株において発現することができる。例えば、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤグルコースの抑制ハイブリッドプロモーターを含む、エピソームの発現ベクターｐＢＳ２４．１を使用した、複数のキャプシドポリペプチドの発現による、酵母内でのモザイクＶＬＰの産生を記載する、参考として本明細書で援用される、国際特許出願公開ＷＯ００／０９６９９を参照されたい。
単一のウイルス株およびモザイクＶＬＰに由来するキャプシドタンパク質を含む、本発明のＶＬＰは、被験体に投与された時に免疫応答を誘発する。前記で考察したように、ＶＬＰは、ＶＰ１ポリペプチドに加え、さらに種々の抗原（例えば、マイナー構造タンパク質および非構造タンパク質）を含むことができる。本発明の発現カセットを使用して産生される、精製ＶＬＰは、通常は、ワクチン組成物などの免疫原性組成物の形態で脊椎動物の被験体に投与することができる。免疫原性組成物が、例えば、ノロウイルス、サポウイルスに由来する他のタンパク質、またはこのような抗原をコードする他の生物または核酸を含む、コンビネーションワクチンも使用することができる。投与は、単独で製剤化された、または他の抗原と一緒に製剤化されたＶＬＰを使用して実施することができる。さらに、核酸免疫（後述）の発現カセットの送達および／または他のワクチンの送達の前、同時、または後にＶＬＰを投与することができる。また、ＶＬＰ投与部位は、投与される他の免疫原性組成物と同じまたは異なってもよい。遺伝子送達は、ＤＮＡを使用した免疫、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない、多くの方法によって実施することができる。
Ｆ．免疫原性組成物
本発明は、本明細書に開示される、１種以上の免疫原性核酸、ポリペプチド、ポリタンパク質、マルチエピトープ融合タンパク質および／またはＶＬＰを含む組成物をも提供する。異なるペプチド、ポリタンパク質およびマルチエピトープ融合タンパク質が、単一の製剤中で一緒に混合されてもよい。このような組み合わせでは、免疫原性組成物の抗原は、１種以上のポリペプチド、またはマルチエピトープポリペプチド、またはポリタンパク質中に存在してもよい。
免疫原性組成物は、同一または異なる賦形剤を使用して順番に送達される、ポリペプチドおよび核酸の混合物を含んでもよい。抗原は、例えば、予防的（すなわち、感染の予防）または治療的（すなわち感染症の治療）免疫原性組成物中で、個々に、または組み合わせて投与することができる。免疫原性組成物は、所望の効果を達成するために１回以上（例えば、初回投与に続き、１回以上の追加免疫）投与してもよい。同一の組成物を、１回以上の初回免疫または追加免疫工程において投与することができる。また、初回免疫および追加免疫のために、異なる組成物を使用することができる。
免疫原性組成物は一般的に、水、食塩水、グリセロール、エタノールなどの、１種以上の「薬学的に許容される賦形剤または媒体」を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助的な薬剤が、このような媒体中に存在してもよい。
免疫原性組成物は一般的に、上述の成分に加え、１種以上の「薬学的に許容される担体」を含む。これらには、組成物を投与された個体に対して有害な抗体の生産をもたらさない、あらゆる担体が含まれる。適切な担体は一般的に、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソーム）などの、大きく、緩徐に代謝した巨大分子である。このような担体は当業者に周知である。組成物は、水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含んでいてもよい。さらに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助的な物質が存在してもよい。薬学的に許容される成分の十分な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ ｅｄ．，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において利用可能である。
本発明の組成物においては、塩酸塩、臭化水素酸、リン酸塩、硫酸塩などの無機塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩などの有機酸などの薬学的に許容される塩も使用することができる。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オブアルブミン、破傷風トキソイドおよび当業者に周知の他のタンパク質である。本発明の組成物は、水、食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなどの液体または賦形剤を単独または組み合わせて、ならびに湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝材などの物質を含むこともできる。抗原は、リポソームおよびＰＬＧなどの粒子状担体に吸着されるか、取り込まれるか結合されていてもよい。
抗原は、免疫原性を向上させるために、担体タンパク質と結合することができる。これは、糖類または炭水化物抗原を使用する組成物において、特に有用である。Ｒａｍｓａｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ２８−３６；Ｂｕｔｔｅｒｙ ＆ Ｍｏｘｏｎ（２０００）ＪＲ Ｃｏｌｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｌｏｎｄ ３４：１６３−１６８；Ａｈｍａｄ ＆ Ｃｈａｐｎｉｃｋ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３：１１３−１３３，ｖｉｉ；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５６３−５６７；欧州特許出願公開第０ ４７７ ５０８号；米国特許第５，３０６，４９２号；ＷＯ９８／４２７２１；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ｅｄｓ．Ｃｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．）ＩＳＢＮ３８０５５４９３２６，特に、ｖｏｌ．１０：４８−１１４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８または０１２３４２３３５Ｘを参照されたい。
好ましい担体タンパク質は、ジフテリアまたは破傷風トキソイドなどの、細菌毒素またはトキソイドである。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが特に好ましい。他の担体タンパク質には、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質（ＥＰ−Ａ−０３７２５０１）、合成ペプチド（ＥＰ−Ａ−０３７８８８１およびＥＰ−Ａ−０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２およびＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８およびＥＰ−Ａ−０４７１１７７）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質（ＷＯ ００／５６３６０）、サイトカイン（ＷＯ９１／０１１４６）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ ００／６１７６１）、トランスフェリンなどの鉄取り込みタンパク質（ＷＯ ０１／７２３３７）などが含まれる。混合物が、セリグラフＡおよびＣに由来するカプセル状糖類を含む場合、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の比（ｗ／ｗ）は、１より大きいことが好ましい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）。種々の糖類を、同一または異なる型の担体タンパク質に結合することができる。必要な場合には適切なリンカーと一緒に、あらゆる適切な結合反応を使用することができる。
免疫原性組成物、好ましくは本発明のワクチンは、他の免疫調製剤と一緒に投与してもよい。例えば、本発明のワクチンにはアジュバントが含まれる。好ましいアジュバントには、後述する、以下の型のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
Ａ．鉱物含有組成物
本発明におけるアジュバントとして使用するのに適した、鉱物含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩が含まれる。本発明には、適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質）のいずれかの化合物である、塩酸塩（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５）ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍ．の８および９章を参照）、または種々の無機化合物（過剰のリン酸塩を含んでいてもよい、リン酸塩およびヒドロキシドアジュバントの混合物）が含まれ、塩への吸着が好ましい。鉱物含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化することもできる（ＷＯ００／２３１０５）。
アルミニウム塩は、本発明のワクチン中に、Ａｌ３＋の濃度が０．２〜１．０ｍｇ／投与量になるように含まれる。
一実施形態において、本発明において使用されるアルミニウム系アジュバントは、ｉｎ ｓｉｔｕで、抗原をリン酸緩衝剤中でミョウバンと混合し、次いで水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基と滴定および沈殿することにより形成されるような、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、またはミョウバンの誘導体である。
本発明のワクチン製剤において使用される、他のアルミニウム系アジュバントは、吸着力に優れ、約５００ｍ２／ｇの表面積を有する、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）である。また、水酸化アルミニウムアジュバントのいくつかまたはすべてのヒドロキシル基に変えてリン酸基を含む、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはヒドロキシリン酸アルミニウムが提供される。本明細書で提供される、好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、酸性、塩基性および中性において非晶質で可溶性である。
別の実施形態において、本発明のアジュバントはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムを含む。それのさらに特定の実施形態において、アジュバントは水酸化アルミニウムよりリン酸アルミニウムを多く含み、例えば、水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウムの重量で、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または９：１つ以上の比を有する。さらに特定の実施形態において、ワクチン中のアルミニウム塩は、０．４〜１．０ｍｇ／ワクチン投与量、または０．４〜０．８ｍｇ／ワクチン投与量、または０．５〜０．７ｍｇ／ワクチン投与量、または約０．６ｍｇ／ワクチン投与量で存在する。
一般的に、好ましいアルミニウム系アジュバント、または複数のアルミニウム系アジュバントの比、例えば、水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウムの比は、抗原が、所望のｐＨにおいてアジュバントと反対の電荷を有するように、分子間の静電気引力の最適化により選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）はライソザイムを吸着するが、ｐＨ７．４ではアルブミンを吸着しない。アルブミンを標的とする場合は、水酸化アルミニウムアジュバントが選択される（ｉｅｐ＝１１．４）。また、水酸化アルミニウムのリン酸塩との前処理は、等電点を低くし、塩基性抗原に好ましいアジュバントとなる。
Ｂ．油乳剤
本発明におけるアジュバントとして使用するのに適した油乳剤組成物には、ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子に製剤）などのスクアレン−水エマルジョンが含まれる。ＷＯ９０／１４８３７を参照されたい。また、Ｐｏｄｄａ，“Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｅｌｄｅｒｌｙ ａｄｕｌｔｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４−４２３７も参照されたい。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤＴＭインフルエンザウイルスの三価サブユニットワクチンにおいてアジュバントとして使用される。
組成物において使用するのに特に好ましいアジュバントはサブミクロンの水中油型エマルジョンである。本明細書で使用される、好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンは、種々の濃度のＭＴＰ−ＰＥを含んでもよいスクアレン／水エマルジョン例えば、４〜５ｗ／ｖ％のスクアレン、０．２５〜１．０ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％のＳｐａｎ８５ＴＭ（ソルビタントリオレエート）、および場合によりＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含んでいてもよいサブミクロン水中油型エマルジョン、例えば、「ＭＦ５９」として知られる、サブミクロンの水中油型エマルジョン（国際特許公開第ＷＯ９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号および第６，４５１，３２５号、およびＯｔｔ ｅｔ ａｌ．，“ＭＦ５９ −− Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，ＭＪ．ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７−２９６）である。ＭＦ５９は、４〜５ｗ／ｖ％のスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、および０．５ｗ／ｖ％のＳｐａｎ８５ＴＭを含み、場合により種々の濃度のＭＴＰ−ＰＥを含んでもよく、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ［米国マサチューセッツ州ニュートン］）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化される。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは約０〜５００μｇ／投与量、さらに好ましくは０〜２５０μｇ／投与量、最も好ましくは０〜１００μｇ／投与量の量で存在してもよい。本明細書で使用される「ＭＦ５９−０」という用語は、ＭＴＰ−ＰＥを欠く、前記サブミクロン水中油型エマルジョンを意味するが、ＭＦ−５９−ＭＴＰという用語は、ＭＴＰ−ＰＥを含む製剤を示す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、投与量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む。本明細書で使用される、他のサブミクロンの水中油型エマルジョン、ＭＦ６９は、４．３ｗ／ｖ％のスクアレン、０．２５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、および０．７５ｗ／ｖ％のＳｐａｎ８５ＴＭを含み、場合によりＭＴＰ−ＰＥを含んでもよい。さらに他のサブミクロンの水中油型エマルジョンは、ＳＡＦとしても知られるＭＦ７５であり、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルジョンに微粒子化されている。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰを含むＭＦ７５製剤を示し、例えば、投与量あたり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む。サブミクロンの水中油型エマルジョン、その産生方法、および組成物において使用されるムラミルペプチドなどの免疫増強剤は、国際特許公開第ＷＯ９０／１４８３７、および米国特許第６，２９９，８８４号および第６，４５１，３２５号に詳述されている。
Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＦＡ）およびＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント（ＩＦＡ）も、本発明においてアジュバントとして使用することができる。
Ｃ．サポニン製剤
サポニン製剤も、本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、広い範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根および花に形成される、ステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の異種の群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａモリーナの樹皮から分離したサポニンはアジュバントとして広く研究されてきた。サポニンは、スマイラックス・オルナータ（サルサパリラ），宿根カスミソウ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ），およびサポナリア・オフィシナリス（カスミソウ）から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント製剤には、ＱＳ２１などの精製された製剤、およびＩＳＣＯＭｓなどの脂質製剤が含まれる。
サポニン組成物は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製される。これらの技術を使用した、特定の精製画分が特定され、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが含まれる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法は米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン製剤は、コレステロールなどのステロールを含んでいてもよい（ＷＯ９６／３３７３９を参照）。
サポニンおよびコレステロールの組み合わせは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）と呼ばれるユニークな粒子を形成するために使用することができる。ＩＳＣＯＭには一般的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含まれる。公知のあらゆるサポニンはＩＳＣＯＭｓ中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭには、１種以上のＱｕｉｌ Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣが含まれる。ＩＳＣＯＭｓは、さらに、ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１およびＷＯ９６／３３７３９に開示されている。場合によりＩＳＣＯＭＳは追加の界面活性剤を欠いてもよい。ＷＯ００／０７６２１を参照されたい。
サポニン系アジュバントの開発の概説は、Ｂａｒｒ，ｅｔ ａｌ．，”ＩＳＣＯＭｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓａｐｏｎｉｎ ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１に開示されている。また、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．，“Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ＩＳＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８も参照されたい。
Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）
ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、本発明においてアジュバントとして使用することもできる。これらの構造は、一般的にウイルスに由来し、場合によりリン脂質と結合しているか製剤化された１種以上のタンパク質を含む。それらは、一般的に非病原性、非複製性であり、一般的にもとのウイルスゲノムのいずれかを含まない。ウイルスタンパク質は組換え的に産生されるか、全ウイルスから分離される。ビロゾームまたはＶＬＰにおいて使用するのに適したウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄病ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が含まれる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１、およびＮｉｉｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ”， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｐｉｌｌｏｍａｒｉｖｕｒｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｃｕｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏ， ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）−１６ Ｌｌ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ−１６ Ｌｌ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｒｉｓｕ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｗｈｅｎ Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ Ｍｕｔａｎｔ Ｒ１９２Ｇ ｏｒ ＣｐＧ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０にさらに考察されている。ビロゾームは、例えば、Ｇｌｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ”，Ｖａｃｃｉｎｅ （２００２）２０：Ｂ１０ -Ｂ１６にさらに考察されている。免疫増強再構築インフルエンザビロゾーム（ＩＲＩＶ）は、鼻腔内三価のＩＮＦＬＵＸＡＬＴＭ製品｛Ｍｉｓｃｈｌｅｒ ＆ Ｍｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０ Ｓｕｐｐｌ ５：Ｂ１７−２３｝およびＩＮＦＬＵＶＡＣ ＰＬＵＳＴＭ製品において、サブユニット抗原送達システムとして使用される。
Ｅ．細菌または微生物誘導体
本発明において使用するのに適したアジュバントには、以下の細菌または微生物誘導体が含まれる。
（１）腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体
このような誘導体には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは、４、５または６アシル化鎖を有する、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの、好ましい「小さい粒子」の形態は、ＥＰ０６８９４５４に開示されている。３ｄＭＰＬの、このような「小さい粒子」は、ろ過滅菌するために０．２２ミクロンの膜を通過するのに十分に小さい（ＥＰ０６８９４５４を参照）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体などの、モノホスホリルリピドＡの誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ９：２２７３−２２７８を参照されたい。
（２）リピドＡ誘導体
リピドＡ誘導体には、ＯＭ−１７４などの、大腸菌に由来するリピドＡの誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，“ＯＭ−１７４，ａ Ｎｅｗ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｗｉｔｈ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２４２−３１０ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋ， ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ＯＭ−１７４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
（３）免疫増強オリゴヌクレオチド
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した免疫増強オリゴヌクレオチドには、ＣｐＧモチーフ（メチル化されていないシトシンと、それに続くグアノシンがリン酸結合によって結合している配列）を含むヌクレオチド配列が含まれる。細菌の二重鎖ＲＮＡまたはパリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドが免疫増強作用を有する。
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含み、二重鎖または一本鎖であってもよい。場合によりグアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどの類似体と置換されてもよい。可能な類似体置換の具体例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７およびＷＯ９９／６２９２３を参照されたい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ，”ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ？”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，ｅｔ ａｌ．，”Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ＣｐＧ ＤＮＡ”，ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号および米国特許第６，４２９，１９９号にさらに考察されている。
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどのＴＬＲ９に配向し得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ ３）：６５４−６５８を参照されたい。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなどのＴｈ１免疫応答の誘導に特異的である可能性があり、また、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなどのＢ細胞応答にさらに特異的である可能性がある。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，“ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ，”Ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｚ ｏｎ ＣｐＧ”，ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５およびＷＯ０１／９５９３５に考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
好ましくは、上記のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が、レセプター認識のために接近できるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー」を形成するために、それらの３’末端で接合され得る。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｆｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ”，ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＧｐＧ ＤＮＡｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔ ｅｔ ａｌ．，”ＣｐＧ ｐｅｎｔａ−ａｎｄ ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ”ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１およびＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
（４）ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体
細菌のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用することができる。好ましくは、そのタンパク質は、大腸菌（すなわち、大腸菌熱不安定性腸毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。粘膜のアジュバントとしての無毒化され たＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、ＷＯ９５／１７２１１に記載され、そしてＷＯ９８／４２３７５に非経口のアジュバントとして記載されている。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇなどの解毒されたＬＴ変異体である。アジュバントとしてのＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、以下の参考文献、すなわち、Ｂｅｉｇｎｏｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ＬＴＲ７２ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｎａｈｎｃｅｓ ｔｈｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ Ｅｌｉｃｉｔ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅ Ｇａｍｍａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｆｔｅｒ Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｂａｒｅ Ｓｋｉｎ”，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ ｔｏｘｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＬＴ ａｎｄ ＣＴ ａｓ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａ，ｅｔ ａｌ．，“ＬＴＫ６３ ａｎｄ ＬＴＲ７２，ｔｗｏ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔ ａｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｎａｓａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ ＡＢ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｅｌｌｓ”Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴ−Ｋ６３ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）“Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）”Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（ｌ−３）：２６３−２７０に見出すことができる。アミノ酸置換の番号の参照は、好ましくはＤｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５−１１６７に示されたＡＤＰ−リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットの配列に基づく。
Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。適切な生体接着剤には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）または粘膜接着剤（例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が含まれる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。例えば、ＷＯ９９／２７９６０。
Ｇ．微粒子
微粒子もまた、本発明のアジュバントとして使用することができる。生分解性かつ非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）とポリ（ラクチド−Ｃｏ−グリコリド）から形成された微粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、さらに好ましくは、直径が約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径が約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、負電荷表面（例えば、ＳＤＳを有する）または正電荷表面（例えば、カチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を有するように処置される。
Ｈ．リポソーム
アジュバントとして使用するのに適切なリポソーム製剤の具体例は、米国特許第６，０９０，４０６号、第５，９１６，５８８号、およびＥＰ０６２６１６９に記載されている。
Ｉ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用のために適切なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる（ＷＯ９９／５２５４９）。このような製剤としては、オクトキシノール（ＷＯ０１／２１２０７）と組み合わせるポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤ならびに少なくとも１種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール（ＷＯ０１／２１１５２））と組み合わせるポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤がさらに含まれる。
好ましいポリオキシエチレンエステルは、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルからなる群より選択される。
Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｂｙ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（ｌ−３）：１０９−ｌ１５およびＰａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ Ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５−１９６に開示されている。
Ｋ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの具体例には、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ− ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
Ｌ．イミダゾキノリン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノリン化合物の具体例には、イミキモドおよびその類似体が含まれ、Ｓｔａｎｌｅｙ，“Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ （２００２）２７（７）：５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ，“Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ”，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８；および米国特許第４，６８９，３３８号、第５，３８９，６４０号、第５，２６８，３７６号、第４，９２９，６２４号、第５，２６６，５７５号、第５，３５２，７８４号、第５，４９４，９１６号、第５，４８２，９３６号、第５，３４６，９０５号、第５，３９５，９３７号、第５，２３８，９４４および第５，５２５，６１２号に詳述されている。
Ｍ．チオセミカルバゾン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適している、すべてのチオセミカルバゾン化合物、および化合物の製剤化方法、産生方法およびスクリーニング方法には、ＷＯ０４／６０３０８に開示されたものが含まれる。チオセミカルバゾン化合物は、ＴＮＦ−・などのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
Ｎ．トリプタンスリン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適している、すべてのトリプタンスリン化合物、および化合物の製剤化方法、産生方法およびスクリーニング方法には、ＷＯ０４／６４７５９に開示されたものが含まれる。トリプタンスリン化合物は、ＴＮＦ−・などのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
本発明はまた、上記の同定した１種以上のアジュバントの組み合わせの態様を含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用し得る。
（１）サポニンおよび水中油型乳剤（ＷＯ９９／１１２４１）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３を参照）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンと３ｄＭＰＬとの組み合わせ（欧州特許出願０８３５３１８，０７３５８９８および０７６１２３１を参照）；
（６）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびサブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズされるか、またはより大きな粒子サイズの乳剤を作製するようにボルテックスされるかのいずれかのｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ
（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、および以下：モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））からなる群、からの１種以上の細菌細胞壁成分を含有する、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；
（８）１種以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒素誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）、および
（９）１種以上の無機塩（例えばアルミニウム塩）および１種以上の免疫増強オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）および１種以上の解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素（例えばＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）。
Ｏ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが含まれる。
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射用ノロウイルスおよびサポウイルスワクチンの使用のために好ましいアジュバントである。細菌毒素および生体接着剤は、経鼻ワクチンなどの粘膜送達ワクチンの使用のために好ましいアジュバントである。
前記に引用したすべての特許、特許出願および学術論文の内容は、全体が参考として本明細書で援用される。
さらなる抗原
本発明の組成物は、ノロウイルスまたはサポウイルスタンパク質に由来しない、１種以上のさらなるポリペプチド抗原を含んでもよい。このような抗原には、細菌、ウイルスまたは寄生虫抗原が含まれる。
いくつかの実施形態において、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原は、小児用ワクチンにおいて有用である、１種以上の抗原と併用される。このような抗原は当該技術分野で公知であり、オルトミクソ・ウイルス（インフルエンザ）、肺炎ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびＭｕｍｐｓ）、麻疹ウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、および水痘帯状ペルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、化膿連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）、カタラリス菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌（破傷風）、コリネバクテリウム・ジフテリア（ジフテリア）、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）、緑膿菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）および大腸菌などの細菌またはウイルスに由来する抗原が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原は、老人または免疫障害を有する個体に応じて設計されるワクチンに有用な１種以上の抗原と併用される。このような抗原は当該技術分野で公知であり、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）、カタラリス菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、破傷風菌（破傷風）、コリネバクテリウム・ジフテリア（ジフテリア）、Ｂ型インフルエンザ（Ｈｉｂ）、緑膿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）、大便連鎖球菌、ピロリ菌、オルトミクソ・ウイルス科（インフルエンザ）、肺炎ウイルス属（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびＭｕｍｐｓ）、麻疹ウイルス属（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原は、下痢性疾患を引き起こす病原体に対して個体を保護するために設計されたワクチンにおいて有用である１種以上の抗原と併用される。このような抗原には、ロタウイルス、赤痢菌属、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、コレラ菌、およびカンピロバクター・ジェジュニ抗原が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ノーウォークウイルス、スノーマウンテンウイルス、および／またはハワイウイルスに由来する１種以上のノロウイルス抗原が、免疫原性組成物中でロタウイルス抗原と併用される。
本発明において使用される抗原には、以下に示す１種以上の抗原、または以下に示す病原体の１種以上に由来する抗原が含まれるがこれらに限定されない。
Ａ．細菌抗原
本発明において使用するのに適した細菌抗原には、細菌から分離、精製または由来する、タンパク質、多糖類、リポ多糖類および外膜ベシクルが含まれる。さらに、細菌抗原には、細菌溶解物および不活性化細菌製剤が含まれる。細菌抗原は、組換え的発現によって生成することもできる。細菌抗原には、好ましくは、そのライフサイクルの少なくとも１つの段階の間に、細菌の表面に露出するエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは、複数の血清型を超えて保存されている。細菌抗原には、以下に示す１種以上の細菌に由来する抗原、および以下に特定される特定の抗原の例が含まれる。
髄膜炎菌：髄膜炎抗原には、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、および／またはＢなどの髄膜炎菌血清群から精製した、または由来するタンパク質（参考文献１〜７において特定されたものなど）、糖類（多糖類、オリゴ糖類またはリポ多糖類を含む）、または外膜ベシクル（参考文献８、９、１、１１）が含まれる。髄膜炎タンパク質抗原は、アドヒージョン、オートトランスポーター、毒素、Ｆｅ取得タンパク質、およびタンパク質に関連する膜（好ましくは全体的な外膜タンパク質）から選択される。
肺炎連鎖球菌：肺炎連鎖球菌抗原には、肺炎球菌に由来する糖類（多糖類またはオリゴ糖類を含む）および／またはタンパク質が含まれる。糖類抗原は、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される。タンパク質抗原は、ＷＯ９８／１８９３１，ＷＯ９８／１８９３０，米国特許第６，６９９，７０３号，米国特許第６，８００，７４４号，ＷＯ９７／４３３０３，およびＷＯ９７／３７０２６において特定されたタンパク質から選択される。肺炎連鎖球菌タンパク質は、ポリヒスチジントリアドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸトランケート、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸトランケート、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメラタンパク質、肺炎球菌溶血素（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５またはＳｐ１３３から選択される。
化膿連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）：Ａ群ストレプトコッカス抗原には、ＷＯ０２／３４７７１またはＷＯ２００５／０３２５８２において特定されたタンパク質（ＧＡＳ４０を含む）、ＧＡＳ Ｍタンパク質の断片の融合物（ＷＯ０２／０９４８５１、およびＤａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：１９３−２００，およびＤａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ １４（１０）：９４４−９４８に開示されたものを含む）、フィブロネクチン結合タンパク質（Ｓｆｂ１）、ストレプトコッカス属ヘム関連タンパク質（Ｓｈｐ）、およびストレプトリジンＳ（ＳａｇＡ）が含まれる。
カタラリス菌：モラクセラ抗原には、ＷＯ０２／１８５９５およびＷＯ９９／５８５６２において特定された抗原、外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ−抗原、および／またはＬＰＳが含まれる。
百日咳菌：百日咳抗原には、百日咳菌に由来する、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）が含まれ、場合によりパータクチンおよび／または凝集原２および３抗原が含まれる。
黄色ブドウ球菌：黄色ブドウ球菌抗原には、ＳｔａｐｈＶＡＸＴＭなどの非毒性の組換え型緑膿菌エキソトキシンＡと結合していてもよい、黄色ブドウ球菌５および８型莢膜多糖類、または表面タンパク質、インバシン（ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞の取り込みを阻害する表面因子（皮膜、タンパク質Ａ）、カロテノイド、カタラーゼ生成物、タンパク質Ａ、コアグラーゼ、凝固因子、および／または真核細胞膜を溶解する膜障害毒素（任意に解毒されている）（ヘモリジン、ロイコトキシン、ロイコシジン）が含まれる。
表皮ブドウ球菌：表皮ブドウ球菌抗原には、粘液関連抗原（ＳＡＡ）が含まれる。
破傷風菌（破傷風）：破傷風菌抗原には、破傷風トキソイド（ＴＴ）が含まれ、本発明の組成物と併用して／結合し担体タンパク質として使用される。
ジフテリア菌（ジフテリア）：ジフテリア抗原には、好ましくはＣＲＭ１９７などの解毒されたジフテリア毒素が含まれる。ＡＤＰリボシル化を調節、阻害または関連することのできる追加の抗原は、本発明の組成物と組み合わせ／一緒に投与し／結合することが意図される。ジフテリアトキソイドは担体タンパク質として使用することができる。
Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）：Ｈｉｂ抗原には、Ｈｉｂ糖類抗原が含まれる。
緑膿菌：緑膿菌抗原には、エンドトキシンＡ、Ｗｚｚタンパク質、緑膿菌ＬＰＬ、特に、ＰＡＯ１（Ｏ５血清型）から分離したＬＰＳ、および／または外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）を含む外膜タンパク質が含まれる（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ｍａｙ；６９（５）：３５１０−３５１５）。
レジオネラ・ニューモフィラ。細菌抗原はレジオネラ・ニューモフィラに由来するものであってもよい。
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）：Ｂ群ストレプトコッカス抗原には、ＷＯ０２／３４７７１，ＷＯ０３／０９３３０６，ＷＯ０４／０４１１５７，またはＷＯ２００５／００２６１９において特定されたタンパク質または糖類抗原（タンパク質ＧＢＳ８０，ＧＢＳ１０４，ＧＢＳ２７６およびＧＢＳ３２２を含み、血清型Ｉａ，Ｉｂ，Ｉａ／ｃ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ，ＶＩＩおよびＶＩＩＩに由来する糖類抗原を含む）が含まれる。
淋菌：淋菌抗原には、ＰｏｒＢなどのＰｏｒ（またはポリン）タンパク質（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：６６０−６６９を参照）、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢなどのトランスフェリン結合タンパク質（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７１（１）：２７７-２８３を参照）、不透明タンパク質（例えば、Ｏｐａ）、還元修飾可能なタンパク質（Ｒｍｐ）、および外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物（Ｐｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）１８２：８４８−８５５を参照）が含まれる。例えば、ＷＯ９９／２４５７８，ＷＯ９９／３６５４４，ＷＯ９９／５７２８０，ＷＯ０２／０７９２４３も参照されたい。
クラミジア・トラコマチス：クラミジア・トラコマチス抗原には、血清型Ａ、Ｂ、ＢａおよびＣ（トラコーマの作用物質、失明の原因）、血清型Ｌ１、Ｌ２およびＬ３（性病性リンパ肉芽腫と関連がある）、および血清型Ｄ〜Ｋに由来する抗原が含まれる。クラミジア・トラコマチス抗原には、ＷＯ００／３７４９４，ＷＯ０３／０４９７６２，ＷＯ０３／０６８８１１，またはＷＯ０５／００２６１９において特定された抗原が含まれ、ＰｅｐＡ（ＣＴ０４５），ＬｃｒＥ（ＣＴ０８９），ＡｒｔＪ（ＣＴ３８１），ＤｎａＫ（ＣＴ３９６），ＣＴ３９８，ＯｍｐＨ−ｌｉｋｅ（ＣＴ２４２），Ｌ７／Ｌ１２（ＣＴ３１６），ＯｍｃＡ（ＣＴ４４４），ＡｔｏｓＳ（ＣＴ４６７），ＣＴ５４７，Ｅｎｏ（ＣＴ５８７），ＨｒｔＡ（ＣＴ８２３），およびＭｕｒＧ（ＣＴ７６１）が含まれる。
トレポネーマ・パリダム（梅毒）：梅毒抗原には、ＴｍｐＡ抗原が含まれる。
デュクレー菌（軟性下疳の原因）：デュクレー抗原には、外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）が含まれる。
大便連鎖球菌またはエンテロコッカス・フェシウム：抗原には、三糖類の繰り返し、または米国特許第６，７５６，３６１号において提供されるエンテロコッカスに由来する抗原が含まれる。
ピロリ菌：ピロリ菌抗原には、Ｃａｇ，Ｖａｃ，Ｎａｐ，ＨｏｐＸ，ＨｏｐＹおよび／またはウレアーゼ抗原が含まれる。
スタフィロコッカス・サプロフィチクス：抗原には、スタフィロコッカス・サプロフィチクス抗原の１６０ｋＤａ血球凝集素が含まれる。
エルシニア・エンテロコリチカ抗原にはＬＰＳが含まれる（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００２ Ａｕｇｕｓｔ；７０（８）：４４１４）。
大腸菌：大腸菌抗原は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性大腸菌（ＤＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、および／または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）に由来するものであってもよい。
炭疽菌（炭疽）：炭疽菌抗原は、解毒してもよく、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））から選択され、両方とも、防御抗原として知られる共通のＢ−成分を共有することができる。
ペスト菌（疫病）：疫病抗原には、Ｆ１莢膜抗原が含まれる（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００３ Ｊａｎ；７１（１））：３７４−３８３，ＬＰＳ（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９９９ Ｏｃｔ；６７（１０）：５３９５），Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ Ｖ ａｎｔｉｇｅｎ（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９９７ Ｎｏｖ；６５（１１）：４４７６−４４８２）。
ヒト結核菌：結核菌抗原には、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂの融合タンパク質（Ａｇ８５Ｂ）、および／またはカチオン性脂質ベシクル中に製剤化されてもよいＥＳＡＴ−６（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００４ Ｏｃｔｏｂｅｒ；７２（１０）：６１４８）、ヒト結核菌（Ｍｔｂ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ関連抗原（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４ Ａｕｇ ２４；１０１（３４）：１２６５２）、および／またはＭＰＴ５１抗原（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００４ Ｊｕｌｙ；７２（７）：３８２９）が含まれる。
リケッチア：抗原には、外膜タンパク質Ａおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）を含む外膜タンパク質（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００４ Ｎｏｖ １；１７０２（２）：１４５）、ＬＰＳ、および表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）（Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９８９ Ｊｕｎ；２ Ｓｕｐｐｌ：８１）が含まれる
リステリア・モノサイトゲネス：細菌抗原は、リステリア・モノサイトゲネスに由来するものであってもよい。
クラミジア・ニューモニエ：抗原には、ＷＰ０２／０２６０６において特定されるものが含まれる。
コレラ菌：抗原には、プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ、特にコレラ菌ＩＩのリポ多糖類、Ｏ１ Ｉｎａｂａ Ｏ−特異的多糖類、コレラＯ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００３ Ｏｃｔ；７１（１０）：５４９８−５０４）、および／または閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）が含まれる。
チフス菌（腸チフス）：抗原には、好ましくは複合体である莢膜多糖類が含まれる（Ｖｉ、すなわちｖａｘ−ＴｙＶｉ）。
ボレリア・ブルグドレフェリ（ライム病）：抗原には、リポタンパク質（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣおよびＯｓｐＤ）、ＯｓｐＥ関連タンパク質（Ｅｒｐｓ）などの他の表面タンパク質、デコリン結合タンパク質（例えばＤｂｐＡ）、およびＰ３９およびＰ１３関連抗原などの抗原的に変異するＶＩタンパク質（内在性膜タンパク質、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００１ Ｍａｙ；６９（５）：３３２３−３３３４）、ＶｌｓＥ抗原性変異タンパク質（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ Ｄｅｃ；３７（１２）：３９９７）が含まれる。
ポルフィロモナス・ジンジバリス：抗原には、ポルフィロモナス・ジンジバリス外膜タンパク質（ＯＭＰ）が含まれる。
クレブシエラ菌：抗原には、ＯＭＰ Ａを含むＯＭＰ、または破傷風トキソイドと結合していてもよい多糖類が含まれる。
本発明のさらなる細菌性抗原は、前記のいずれかの莢膜抗原、多糖類抗原またはタンパク質抗原であってもよい。さらなる細菌性抗原には、外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物も含まれる。さらに、抗原には、上述の細菌のいずれかの、生菌、弱毒化菌および／または精製したバージョンが含まれる。本発明の抗原は、グラム陰性またはグラム陽性細菌に由来するものであってもよい。本発明の抗原は、好気性または嫌気性細菌に由来するものであってもよい。
さらに、前記細菌に由来する多糖類（多糖類、ＬＰＳ、ＬＯＳまたはオリゴ糖類）はいずれも、他の物質または抗原、例えば担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）と結合してもよい。これらの結合は、米国特許第５，３６０，８９７号およびＣａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８４ Ｍａｙ；６２（５）：２７０−５に提供されるように、タンパク質上のアミノ基に対する、糖類のカルボニル部分の還元的アミノ化によって生じる、直接的結合である。また、糖類は、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６およびＣＲＣ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ， １９９３に提供されるように、スクシンアミドまたは他の結合による、リンカーを通して結合してもよい。
Ｂ．ウイルス抗原
本発明において使用するのに適したウイルス抗原には、不活性化（または死滅した）ウイルス、弱毒化ウイルス、ウイルス成分製剤、精製したサブユニット製剤、ウイルスおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）から分離、精製または由来するウイルスタンパク質が含まれる。ウイルス抗原は、細胞培養物または他の基質上で増殖したウイルスに由来するものであってもよい。また、ウイルス抗原は組換え的に発現したものであってもよい。ウイルス抗原には、好ましくは、ウイルスのライフサイクルの少なくとも１つの段階において、ウイルスの表面に露出するエピトープが含まれる。ウイルス抗原は、好ましくは複数の血清型または分離株を超えて保存されている。ウイルス抗原には、以下に示すウイルスの１種以上に由来する抗原、および以下に特定された特定の抗原例が含まれる。
オルトミクソ・ウイルス：ウイルス抗原は、インフルエンザＡ、ＢおよびＣなどのオルトミクソ・ウイルスに由来する。オルトミクソ・ウイルス抗原は、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、マトリクスタンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、１種以上のトランスクリプターゼ成分（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ）を含む、１種以上のウイルスタンパク質から選択される。好ましい抗原には、ＨＡおよびＮＡが含まれる。
インフルエンザ抗原は、大流行間期（年に一度の）のインフルエンザ株に由来するものであってもよい。また、他のインフルエンザ抗原は、世界的流行を引き起こす可能性のある株（すなわち、現在流行している株における血球凝集素と比べて新規な血球凝集素を有するインフルエンザ株、鳥類において病原性であり、ヒトの集団において水平感染する可能性を有するるインフルエンザ株、またはヒトに感染性であるインフルエンザ株）に由来するものであってもよい。
パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス抗原は、肺炎ウイルス属（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス属（ＰＩＶ）および麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス）などのパラミクソウイルス科のウイルスに由来するものであってもよい。
肺炎ウイルス属：抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウスの肺炎ウイルス、および七面鳥の鼻気管炎ウイルスなどの肺炎ウイルスに由来するものであってもよい。好ましくは、肺炎ウイルスはＲＳＶである。肺炎ウイルス抗原は、表面タンパク質融合タンパク質（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）および低分子の疎水性タンパク質（ＳＨ）、マトリクスタンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、ＰおよびＬおよび非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２を含む１種以上から選択されてもよい。好ましい肺炎ウイルス抗原には、Ｆ、ＧおよびＭが含まれる。例えば、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００４ Ｎｏｖ；８５（Ｐｔ １１）：３２２９を参照されたい。肺炎ウイルス抗原は、キメラウイルスとして産生されるか、由来するものであってもよい。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含んでもよい。
パラミクソウイルス：ウイルス抗原は、パラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルスおよびニューカッスル病ウイルスなどのパラミクソウイルスに由来するものであってもよい。好ましくは、パラミクソウイルスはＰＩＶまたはムンプスである。パラミクソウイルス抗原は、以下のタンパク質、すなわち、血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、融合タンパク質Ｆ１およびＦ２、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、高分子タンパク質（Ｌ）、およびマトリクスタンパク質（Ｍ）の１種以上から選択されてもよい。好ましいパラミクソウイルスタンパク質には、ＨＮ、Ｆ１およびＦ２が含まれる。パラミクソウイルス抗原は、キメラウイルスとして産生されるか、由来するものであってもよい。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含んでもよい。市販のムンプスワクチンには、一価の形態、または麻疹および風疹ワクチンとの併用（ＭＭＲ）のいずれかで、生きた、弱毒化されたムンプスウイルスが含まれる。
麻疹ウイルス：ウイルス抗原は、麻疹などの麻疹ウイルスに由来するものであってもよい。麻疹ウイルス抗原は、以下のタンパク質、すなわち、血球凝集素（Ｈ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合因子（Ｆ）、高分子タンパク質（Ｌ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼリンタンパク質（Ｐ）、およびマトリクス（Ｍ）の１種以上から選択されてもよい。市販の麻疹ワクチンには、通常、ムンプスおよび風疹との併用（ＭＭＲ）において生きた弱毒化された麻疹ウイルスが含まれる。
ピコルナ・ウイルス：ウイルス抗原は、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルスなどのピュルナ・ウイルスに由来するものであってもよい。ポリオウイルスなどのエンテロウイルスに由来する抗原が好ましい。
エンテロウイルス：ウイルス抗原は、ポリオウイルス１、２または３型、コクサッキーＡウイルス１〜２２および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）１〜９、１１〜２７および２９〜３４型、およびエンテロウイルス６８〜７１などのエンテロウイルスに由来するものであってもよい。好ましくは、エンテロウイルスはポリオウイルスである。エンテロウイルス抗原は、好ましくは、以下のキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４の１種以上から選択される。市販のポリオワクチンには、不活性化されたポリオワクチン（ＩＰＶ）および経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）が含まれる。
ヘパルナウイルス：ウイルス抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などの肝炎ウイルスに由来するものであってもよい。市販のＨＡＶワクチンには、不活性化されたＨＡＶワクチンが含まれる。
トガウイルス：ウイルス抗原は、ルビウイルス、アルファウイルスまたはアーテリウイルスなどのトガウイルスに由来するものであってもよい。ルベラウイルスなどのルビウイルスに由来する抗原が好ましい。トガウイルス抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ、ＮＳＰ−１、ＮＳＰＯ−２、ＮＳＰ−３またはＮＳＰ−４から選択されてもよい。トガウイルス抗原は、好ましくはＥ１、Ｅ２またはＥ３から選択される。市販のルベラワクチンには、通常、ムンプスおよび麻疹ワクチンとの併用（ＭＭＲ）において、生きた低温に適応したウイルスが含まれる。
フラビウイルス属：ウイルス抗原は、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、デング熱ウイルス（１、２、３または４型）、黄熱病、日本脳炎、西ナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポーワッサン脳炎などのフラビウイルスに由来するものであってもよい。フラビウイルス抗原は、ＰｒＭ、Ｍ、Ｃ、Ｅ、ＮＳ−１、ＮＳ−２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、およびＮＳ５から選択することができる。フラビウイルス抗原は、好ましくはＰｒＭ、ＭおよびＥから選択される。市販のＴＢＥワクチンには、不活性化されたウイルスワクチンが含まれる。
ペスチウイルス：ウイルス抗原は、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）またはボーダー病（ＢＤＶ）などのペスチウイルスに由来するものであってもよい。
ヘパドナウイルス：ウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスに由来してもよい。ヘパドナウイルス抗原は、表面抗原（Ｌ、ＭおよびＳ）、コア抗原（ＨＢｃ、ＨＢｅ）から選択される。市販のＨＢＶワクチンには、表面抗原Ｓタンパク質を含むサブユニットワクチンが含まれる。
Ｃ型肝炎ウイルス：ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルスに由来するものであってもよい。ＨＣＶ抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ３４５−コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域に由来するペプチドから選択される（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１）。
ラブドウイルス：ウイルス抗原は、リッサウイルス（ラビースウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルスに由来してもよい。ラブドウイルス抗原は、糖タンパク質（Ｇ）、ヌクレオタンパク質（Ｎ）、高分子タンパク質（Ｌ）、非構造タンパク質（ＮＳ）から選択される。市販のラビースウイルスワクチンには、ヒト二倍体細胞またはアカゲザル胎児の肺細胞で増殖した、死滅ウイルスが含まれる。
カルシウイルス：ウイルス抗原は、ノーウォークウイルス、およびハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルスなどのカルシウイルスに由来するものであってもよい。
コロナウイルス：ウイルス抗原は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、鳥類感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎（ＴＧＥＶ）に由来するものであってもよい。コロナウイルス抗原は、スパイク（Ｓ）、外被（Ｅ）、マトリクス（Ｍ）、ヌクレオキャプシド（Ｎ）および血球凝集素−エステラーゼ糖タンパク質（ＨＥ）から選択される。好ましくは、コロナウイルス抗原はＳＡＲＳウイルスに由来する。ＳＡＲＳウイルス抗原は、ＷＯ０４／９２３６０に開示されている。
レトロウイルス：ウイルス抗原は、腫瘍ウイルス、レンチウイルスまたはスプマウイルスなどのレトロウイルスに由来するものであってもよい。腫瘍ウイルス抗原は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２またはＨＴＬＶ−５に由来するものであってもよい。レンチウイルス抗原は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に由来するものであってもよい。レトロウイルス抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、およびｖｐｒから選択される。ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ ｖｐｕ、ミニタンパク質から選択される（好ましくはｐ５５ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖ ｄｅｌｅｔｅである）。ＨＩＶ抗原は、以下の種、すなわち、ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＦＬＡＶ、ＨＩＶＬＡ１、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４の１種以上に由来するものであってもよい。
レオウイルス：ウイルス抗原は、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルスまたはコルチウイルスなどのレオウイルスに由来するものであってもよい。レオウイルス抗原は、構造タンパク質λ１、λ２、λ３、μ１、μ２、δ１、δ２、またはδ３、または非構造タンパク質δＮＳ、μＮＳ、またはδ１ｓから選択される。好ましいレオウイルス抗原はロタウイルスに由来する。ロタウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４（または切断生成物ＶＰ５およびＶＰ８）、ＮＳＰ１、ＶＰ６、ＮＳＰ３、ＮＳＰ２、ＶＰ７、ＮＳＰ４、またはＮＳＰ５から選択される。好ましいロタウイルス抗原にはＶＰ４（または切断生成物ＶＰ５およびＶＰ８）、およびＶＰ７が含まれる。例えば、全体が参考として本明細書で援用されるＷＯ２００５／０２１０３３，ＷＯ２００３／０７２７１６，ＷＯ２００２／１１５４０，ＷＯ２００１／１２７９７，ＷＯ０１／０８４９５，ＷＯ００／２６３８０，ＷＯ０２／０３６１７２を参照されたい。
パルボウイルス：ウイルス抗原は、パルボウイルスＢ１９などのパルボウイルスに由来するものであってもよい。パルボウイルス抗原は、ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ＮＳ−１およびＮＳ−２から選択される。好ましくは、パルボウイルス抗原はキャプシドタンパク質である。
デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）：ウイルス抗原は、ＨＤＶ，特にＨＤＶに由来するδ−抗原に由来するものであってもよい（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照）。
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）：ウイルス抗原は、ＨＥＶに由来するものであってもよい。
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）：ウイルス抗原は、ＨＧＶに由来するものであってもよい。
ヒトヘルペスウイルス：ウイルス抗原は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などのヒトヘルペスウイルスに由来するものであってもよい。ヒトヘルペスウイルス抗原は、前初期タンパク質（α）、初期タンパク質（β）、および後期タンパク質（γ）から選択される。ＨＳＶ抗原は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２株に由来するものであってもよい。ＨＳＶ抗原は、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ、融合タンパク質（ｇＢ）または免疫回避タンパク質（ｇＣ、ｇＥまたはｇＩ）から選択される。ＶＺＶ抗原は、コア、ヌクレオキャプシド、テグメント、または外被タンパク質から選択される。生きた弱毒化ＶＺＶワクチンが市販されている。ＥＢＶ抗原は、初期抗原（ＥＡ）タンパク質、ウイルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）、および膜抗原の糖タンパク質（ＭＡ）から選択される。ＣＭＶ抗原は、キャプシドタンパク質、外被糖タンパク質（ｇＢおよびｇＨなど）およびテグメントタンパク質から選択される。
パポバウイルス：抗原は、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどのパポバウイルスに由来するものであってもよい。パピローマウイルスには、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３および６５が含まれる。好ましくは、ＨＰＶ抗原は血清型６、１１、１６または１８に由来する。ＨＰＶ抗原は、キャプシドタンパク質（Ｌ１）および（Ｌ２）、またはＥ１−Ｅ７、またはそれらの融合体から選択される。ＨＰＶ抗原は、好ましくはウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に配合される。ポリオーマウイルスには、ＢＫウイルスおよびＪＫウイルスが含まれる。ポリオーマウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３から選択される。
本発明の組成物と併用することが意図される、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌｏｔｋｉｎ ａｎｄ Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ ｅｄ．２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄ． ２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ． １９９１）に含まれる、抗原、組成物、方法および微生物が、さらに提供される。
Ｃ．真菌抗原
本発明において使用される真菌抗原は、以下に示す真菌の１種以上に由来してもよい。
真菌抗原は、エピデルモフィトン・フロッコースム、小胞子菌、犬小胞子菌、ミクロスポラム・ジストータム、ミクロスポラム・イクイナム、石こう状小胞子菌、ミクロスポラム・ナナム、渦状白癬菌、トリコフィトン・イクイナム、トリコフィトン・ガリナエ、トリコフィトン・ジプセウム、トリコフィトン・メグニニ、毛瘡白癬菌、トリコフィトン・キンケアナム、紅色白癬菌、トリコフィトン・ショエンレイニ、トリコフィトン・トンズランス、トリコフィトン・ヴェルルコサム、Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ ｖａｒ．ａｌｂｕｍ、ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ、ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ、紫色白癬菌、および／またはトリコフィトン・ファヴィフォルメを含む皮膚糸状菌に由来するものであってもよい。
菌類病原体は、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・フラバス、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・ニダランス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・シドウィ、アスペルギルス・フラバタス、アスペルギルス・グラウクス、ブラストシゾミセス・キャピタタス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・エノラーゼ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ステラトイデア、カンジダ・クセイ、カンジダ・パラクセイ、カンジダ・ルシタニアエ、カンジダ・シュードトロピカリス、カンジダ・ギリエルモンディー、クラドスポリウム・カリオニイ、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマチチジス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ゲオトリチュム・クラバタム、ヒストプラズマ・カプスラーツム、肺炎桿菌、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、ニューモシスティス・カリニ、ピチウム・インシディオサム、ピチロスポルム・オバール、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ボウラウディー、サッカロミセス・ポンベ、セドスポリウム・アピオスペラム、スポトロリクス・シェンキイ、トリコスポロン・ベイゲリ、トキソプラズマ原虫、ペニシリウム・マルネッフェイ、マラセジア種、フォンセセア種、ワンギエラ種、スポロトリックス種、バシジオボラス種、コニジオボラス種、リゾプス種、ムコール種、アブシジア種、モルチエレラ種、カニンガメラ種、サクセネア種、アルターナリア種、カルバラリア種、ヘルミントスポリウム種、フザリウム種、アスペルギルス種、ペニシリウム種、モノリニア種、リゾクトニア種、パエシロミセス種、ピトミセス種、およびクラドスポリウム種に由来するものであってもよい。
真菌抗原の産生方法は、当該技術分野で周知である（米国特許第６，３３３，１６４号を参照）。好ましい方法においては、細胞壁が実質的に除去されるかまたは少なくとも部分的に除去される真菌細胞から得ることのできる不溶性画分から可溶性画分を抽出および分離する方法は、生存する真菌細胞を得；細胞壁が実質的に除去されるかまたは少なくとも部分的に除去された真菌細胞を得；細胞壁が実質的に除去されるかまたは少なくとも部分的に除去された真菌細胞を破壊し；不溶性画分を得；および不溶性画分から可溶性画分を抽出および分離する工程を含むことを特徴とする。
Ｄ．ＳＴＤ抗原
本発明の組成物には、性感染症（ＳＴＤ）に由来する１種以上の抗原が含まれてもよい。このような抗原は、クラミジア、陰部ヘルペス、肝炎（ＨＣＶなど）、陰部疣贅、淋病、梅毒および／または軟性下疳などのＳＤＴの予防または治療のために提供される（ＷＯ００／１５２５５を参照）。抗原は１種以上のウイルス性または細菌性ＳＴＤに由来するものであってもよい。本発明において使用されるウイルス性ＳＴＤ抗原は、例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、および肝炎（ＨＣＶ）に由来するものであってもよい。本発明において使用される細菌性ＳＴＤ抗原は、例えば、淋菌、クラミジア・トラコマチス、トレポネーマ・パリダム、デュクレー菌、大腸菌、およびストレプトコッカス・アガラクティエに由来するものであってもよい。これらの病原体に由来する特異的抗原の具体例は、上に記載した。
Ｅ．呼吸器疾患抗原
本発明の組成物は、呼吸器疾患の原因となる病原体に由来する１種以上の抗原を含んでもよい。例えば、呼吸器疾患抗原は、オルトミクソ・ウイルス（インフルエンザ）、肺炎ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、麻疹ウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、ＶＺＶ、およびコロナウイルス（ＳＡＲＳ）などの呼吸器系ウイルスに由来するものであってもよい。呼吸器疾患抗原は、肺炎連鎖球菌、緑膿菌、百日咳菌、結核菌、肺炎マイコプラズマ、クラジミア肺炎菌、炭疽菌、およびカタラリス菌などの呼吸器疾患の原因となる細菌に由来するものであってもよい。これらの病原体に由来する特定の抗原の具体例は、上に記載した。
Ｆ．小児用ワクチン抗原
本発明の組成物は、小児被験体において使用するのに適した１種以上の抗原を含んでもよい。小児被験体は、通常、約３歳未満、または約２歳未満、または約１再未満である。小児用抗原は、６ヶ月、１、２または３年の間、複数回投与される。小児用抗原は、小児集団を標的にするウイルス、および／または小児集団が影響されやすいウイルスに由来するものであってもよい。小児用抗原には、オルトミクソ・ウイルス（インフルエンザ）、肺炎ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、麻疹ウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、および水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）の１種以上に由来する抗原が含まれる。小児用細菌抗原には、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、化膿連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）、カタラリス菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌（破傷風）、ジフテリア菌（ジフテリア）、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）、緑膿菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）および大腸菌の１種以上に由来する抗原が含まれる。これらの病原体に由来する特異的抗原の具体例は、上に記載した。
Ｇ．老人または免疫障害を有する個体における使用に適した抗原
本発明の組成物は、老人または免疫障害を有する個体における使用に適した抗原を含んでもよい。このような個体は、標的とする抗原に対する免疫応答を向上させるため、より高い濃度またはアジュバント製剤とともに、より頻繁にワクチン接種する必要がある。老人または免疫障害を有する個体における使用を標的する抗原には、以下の病原体、すなわち、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）、カタラリス菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、破傷風菌（破傷風）、ジフテリア菌（ジフテリア）、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）、緑膿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）、大便連鎖球菌、ピロリ菌、クラミジア・ニューモニエ、オルトミクソ・ウイルス（インフルエンザ）、肺炎ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、麻疹ウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の１種以上に由来する抗原が含まれる。これらの病原体に由来する特異的抗原の具体例は、上に記載した。
Ｈ．青年期ワクチンに使用するのに適した抗原
本発明の組成物は、青年期の被験体において使用するのに適した１種以上の抗原を含んでもよい。青年は、以前に投与した小児用抗原の追加免疫を必要とする。青年期に使用するのに適していると思われる小児用抗原は、上に記載した。さらに、性的活動の開始前に、保護的または治療的免疫を確実にするためにＳＴＤ病原体に由来する抗原を受け取ることを目標としてもよい。青年期に使用するのに適しているＳＴＤ抗原は、上に記載した。
Ｉ．抗原製剤
本発明の他の態様においては、吸着抗原を有する微粒子の産生方法が提供される。この方法は、（ａ）（ｉ）水、（ｉｉ）洗剤、（ｉｉｉ）有機溶媒、および（ｉｖ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択される生分解性ポリマーを含む混合物を分散することによってエマルジョンを供給することを含む。ポリマーは、通常、混合物中に、有機溶媒に対して約１％〜約３０％の濃度で存在し、洗剤は、通常、混合物中に、約０．００００１：１〜約０．１：１（さらに一般的には約０．０００１：１〜約０．１：１、約０．００１：１〜約０．１：１、または約０．００５：１〜約０．１：１）の洗剤：ポリマーの重量比で存在する；（ｂ）エマルジョンから有機溶媒を除去し；（ｃ）微粒子の表面に抗原を吸着する。特定の実施形態において、生分解性ポリマーは、有機溶媒に対して、約３％〜約１０％の濃度で存在する。
本明細書で使用される微粒子は、滅菌可能で無毒であり、生分解性である材料から産生される。このような材料には、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ＰＡＣＡおよびポリシアノアクリレートが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明において使用される微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（“ＰＬＡ”）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドまたはグリコール酸のコポリマー、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（“ＰＬＧ”または“ＰＬＧＡ”）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーに由来する。微粒子は、種々の分子量を有し、ＰＬＧなどのコポリマーの場合は種々のラクチド：グリコリド比を有する、種々のあらゆるポリマー性出発材料に由来し、それらの選択は、ともに投与される高分子の一部に依存し、選択の問題である。これらのパラメータは、以下でさらに詳細に考察する。
さらなる抗原は、外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物も含む。追加の製剤方法および抗原（特に、腫瘍抗原）は、米国特許出願第０９／５８１，７７２号に開示されている。
Ｊ．抗原参考資料
以下の参考資料は、本発明の組成物とともに有用な抗原を含む。
Figure 2009516529
Figure 2009516529
 前記に引用した特許、特許出願および学術論文のすべての内容は、本明細書に詳細に示されているかのように援用される。
本発明の免疫原性組成物は、種々の形態で調製することができる。例えば、組成物は、液体または懸濁液のいずれかの注射剤として調製することができる。溶液、または懸濁液に適した固体形態、注射前の液体媒体も調製することができる（例えば、凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として調製することができる。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤またはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（風味をつけてもよい）および／または速溶性投与形態として調製することができる。組成物は、経肺投与のために、例えば、微粉末またはスプレーを使用して吸入剤として調製することができる。組成物は、坐薬またはペッサリーとして調製することができる。組成物は、鼻、耳または眼投与、例えば、ドロップとして調製することができる。このような医薬組成物の調製は、一般の当業者の範囲内である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０を参照されたい。
組成物は、一緒にした組成物が罹患体への投与の直前に再構築されるように、キットの形態であってもよい。このようなキットは、本明細書に開示するような、１種以上のノロウイルスおよび／またはサポウイルス抗原、または液状におけるこのような抗原をコードする核酸、および任意の追加抗原およびアジュバントを含んでもよい。
ポリペプチド抗原または核酸分子を含む、本発明の免疫原性組成物は、好ましくはワクチン組成物である。このような組成物のｐＨは、好ましくは６〜８、好ましくは約７である。ｐＨは、緩衝剤の使用により維持することができる。組成物は、無菌および／または発熱物質フリーであり得る。組成物は、ヒトに関して等張性である。本発明のワクチンは、予防的または治療的のいずれかで使用することができるが、通常は予防的であり、動物（ペットおよび実験動物を含む）、特にヒトを治療するために使用することができる。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物には、免疫学的有効量の抗原および／または抗原をコードする核酸、および必要に応じて任意の他の成分が含まれる。「免疫学的有効量」とは、単一投与またはシリーズの一部としてのいずれかによる個体への投与量が治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康および身体状態、年齢、治療される個体の分類群（例えば、ヒト、非ヒト霊長類など）、抗体を産生する個体の免疫システムの能力、所望の保護の度合い、ワクチンの製剤、医学的状況の治療する医師の評価、および他の関連する因子に依存して変化する。この量が、所定の試験により決定することができる、相対的に広い範囲内に入ることが予想される。
Ｇ．投与
本発明の化合物は、一般的に罹患体に直接投与される。直接の送達は、非経口投与（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射、筋肉内注射、または組織の間質腔注射）、または粘膜投与、例えば、直腸投与、経口投与（例えば、錠剤、スプレー）、膣内投与、局所投与、経皮投与（例えば、ＷＯ９９／２７９６１を参照）または経皮投与（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４およびＷＯ０２／０６４１６２を参照）、経鼻投与（例えば、ＷＯ０３／０２８７６０を参照）、眼内投与、耳内投与、肺投与または他の粘膜投与によって実施することができる。免疫原性組成物は、直接の伝達により、皮膚表面に局所投与することもできる。局所投与は、任意の装置を使用しないで、または絆創膏または絆創膏様装置（例えば、米国特許第６，３４８，４５０号を参照）を使用して、露出した皮膚に免疫原性組成物を接触させることによって実施することができる。
好ましい投与様式は非経口投与、粘膜投与、または経粘膜および非経口免疫の組み合わせである。さらに好ましい投与様式は、１〜３週間あけて合計１〜２回のワクチン接種における、非経口投与、粘膜投与、または粘膜投与および非経口投与の組み合わせである。好ましくは投与経路には、経口送達、筋肉内送達および経口および筋肉内送達の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
ピロリ菌抗原などの抗原に対する、粘膜および全身性免疫応答が、粘膜への初回投与、それに次ぐ全身への追加免疫により増強することがすでに証明されている（Ｖａｊｄｙ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１０：８６−９４を参照）。好ましい実施形態において、ノロウイルスまたはサポウイルスによる感染症の治療方法は、治療を必要とする罹患体に、１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第一の免疫原性組成物を粘膜投与し、次いで、１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む治療有効量の第二の免疫原性組成物を非経口投与することを含む。
免疫原性組成物は、全身性および／または粘膜免疫を誘発するため、好ましくは全身性および／または粘膜免疫を誘発するために使用される。好ましくは、免疫応答は、血清ＩｇＧおよび／または腸管ＩｇＡ免疫応答の誘導によって特徴付けられる。
上述の通り、好ましくは１種以上の遺伝子送達ベクターおよび／またはポリペプチド抗原を、「初回」段階において送達し、次いで、１種以上の第２遺伝子送達ベクターおよび／またはポリペプチド抗原を、「追加免疫」段階において送達する、初回免疫−追加免疫方法が使用される。特定の実施形態において、本明細書に開示される１種以上の遺伝子送達ベクターおよび／またはポリペプチド抗原を使用した初回免疫および追加免疫に、１種以上のペプチドを含む組成物（例えば、ノロウイルスおよび／またはサポウイルス抗原を含むポリペプチド）を使用した、さらなる追加免疫が続く。
併用投与を含むあらゆる方法においては、種々の組成物はあらゆる順番で送達することができる。従って、複数の異なる組成物または分子の送達を含む実施形態において、核酸は、ポリペプチドの前にすべて送達される必要はない。例えば、初回免疫段階は１種以上のポリペプチドの送達を含み、追加免疫は１種以上の核酸および／または１種以上のポリペプチドの送達を含む。複数のポリペプチドの投与に、核酸の投与、または順序は問わないポリペプチドおよび核酸の投与が続く。従って、本明細書に開示される１種以上の遺伝子送達ベクター、および本明細書に開示される１種以上のポリペプチドは、いかなる順番でも、いかなる投与経路でも一緒に投与することができる。従って、本明細書に開示される、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのあらゆる組み合わせは、免疫応答を誘発するために使用することができる。
投与計画
単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールに従って投与を行うことができる。複数回投与は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用することができる。複数回投与スケジュールにおいては、種々の投与量が同一または異なる経路で、例えば、初回免疫が非経口投与で追加免疫が粘膜投与、初回投与が粘膜投与で追加免疫が非経口投与といったように、投与される。
好ましくは、投与計画は、中和特性を有する抗体を誘発する抗体応答の活性を増強する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和検定は、抗体を中和する試験に使用することができる（例えば、Ａｓａｎａｋａ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０２：１０３２７；Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ（２００４）ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２（１２）；ｅ４３２；およびＤｕｂｅｋｔｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６：４００を参照）。
血清中の抗体レベルと、ノロウイルスおよび／またはサポウイルスによって引き起こされる疾患からの防御との間には強い関係がある。例えば、複数抗原投与試験においては、血清中の抗体レベルは、高濃度のノーウォークウイルスを使用した繰り返し（２〜３回）の経口抗原投与後の防御と関連していた（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９０）１６１：１８）。他の研究においては、抗体が予め存在しない２３人の小児のうち１８人が、ヒトカルシウイルスにより胃腸炎を発症したが、予め抗体レベルが存在した１８人のうち１５人は病気にならなかった（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９８５））。さらに他の研究においては、ベースラインが１：１００未満のノーウォークに対する抗体力価を有するヒトの４７％が、ノーウォーク感染を発症し、ベースラインが１：１００を超える抗体力価を有するヒトの１３％に比較して、ノーウォーク感染を発症した（ｐ＜０．００１）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９８５）１５１：９９）。
Ｈ．免疫応答の効果を決定するための試験
治療処置の効果を評価する１つの方法には、本発明の組成物の投与後の感染を監視が含まれる。予防的治療の効果を評価する１つの方法は、組成物の投与後の本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答を監視することを含む。
本発明の免疫原性組成物の成分タンパク質の免疫原性を評価する他の方法は、タンパク質を組換え的に発現し、罹患体血清または粘膜分泌物を免疫ブロットによりスクリーニングすることである。タンパク質および罹患体血清の陽性反応は、罹患体が、問題となるタンパク質に対する免疫応答を予め上昇させており、すなわち、このタンパク質が免疫原であることを示す。この方法は、免疫優性タンパク質および／またはエピトープを特定するためにも使用される。
治療的処置の効果をチェックする他の方法には、本発明の組成物の投与後の感染症の観察が含まれる。予防的処置の効果をチェックする１つの方法は、組成物の投与後の、本発明の組成物中の抗原に対する、全身性（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの産生レベルの監視）および粘膜（例えば、ＩｇＡの産生レベルの監視）の両方の免疫応答を監視することを含む。通常、血清特異的抗体応答は、免疫後抗原投与前に決定されるが、粘膜特異的抗体応答は免疫後および抗原投与後に決定される。本発明の免疫原性組成物は、宿主、例えばヒトの投与前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルにおいて評価することができる。特に有用なマウスモデルには、腹腔内投与の後に腹腔内抗原投与または鼻腔内抗原投与が続くモデルが含まれる。
本発明の免疫原性組成物の効果は、モルモットまたはマウスまたはアカゲザルなどの感染動物モデルに、免疫原性組成物を使用して抗原投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで決定することもできる。免疫原性組成物は、抗原投与する株と同じ株に由来するものであってもなくてもよい。好ましくは、免疫原性組成物は抗原投与する株と同じ株に由来するものである。
ｉｎ ｖｉｖｏの効果を試験するモデルには、（ｉ）ヒトの株を使用したマウス感染モデル、（ｉｉ）マウスにおいて特に有毒である株などのマウス適合株を使用したマウスのモデルである、マウス疾患モデル、および（ｉｉｉ）ヒト分離株を使用した霊長類モデルが含まれるが、これらに限定されない。ＮＩＨおよび疾患対策センター（ＣＤＣ）によって支持されているヒト抗原投与モデルも利用することができる（例えば、Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：５４８−５５３ ａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５）７９：２９００を参照）。
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってもよい。免疫応答は、向上した、または増強した、または変化した免疫応答であってもよい。免疫応答は、全身性および粘膜免疫応答の一方または両方であってもよい。好ましくは、免疫応答は、増強した、全身性および／または粘膜応答である。
増強した、全身性および／または粘膜免疫は、ＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答の増強に反映される。好ましくは、増強した免疫応答には、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増加が含まれる。好ましくは、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答には、ＩｇＡの産生の増加が含まれる。
活性化ＴＨ２細胞は抗体産生を増加させ、従って、細胞外感染の値に対応している。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の１つ以上を分泌することができる。ＴＨ２の免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび将来の防御のためのメモリーＢ細胞の産生をもたらし得る。
ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答に関連するサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０など）の１種以上の１つ以上の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびメモリーＢ細胞の産生の増加が含まれる。好ましくは、増強したＴＨ２免疫応答には、ＩｇＧ１産生の増加が含まれる。
ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関連するサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦβなど）の１種以上の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の上昇、またはＩｇＧ２ａの産生の増加の１つ以上が含まれる。好ましくは、増強したＴＨ１免疫応答には、ＩｇＧ２ａ産生の増加が含まれる。
本発明の免疫原性組成物、特に本発明の１種以上の抗原を含む免疫原性組成物は、単独で、または他の抗原と一緒に、場合によりＴｈ１および／またはＴｈ２応答を誘発することのできる免疫調節剤と一緒に使用することができる。
本発明には、１種以上の免疫調節剤、例えばアルミニウム塩などの無機塩、およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物も含まれる。最も好ましくは、免疫原性組成物には、アルミニウム塩、およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの両方が含まれる。また、免疫原性組成物には、解毒されたＡＤＰリボシル化毒素などのＡＤＰリボシル化毒素、およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。好ましくは、１種以上の免疫調節剤にはアジュバントが含まれる。アジュバントは、さらに前記で考察したＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる群の１種以上から選択され得る。
本発明の免疫原性組成物は、感染に効果的に対応するために、好ましくは細胞媒介性免疫応答および液性免疫応答の両方を誘発する。こう免疫応答は、好ましくは、長く持続する（例えば、中和）抗体、および１種以上の感染性抗原に対して速やかに応答することのできる細胞媒介性免疫を誘発する。具体例として、罹患体の血液試料中の中和抗体の証拠は、その形成が、ＴＢＥ感染におけるウイルスの除去について決定的に重要であるので、防御のための代わりのパラメータとして考えられる（Ｋａｉｓｅｒ ａｎｄ Ｈｏｌｚｍａｎｎ（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２８；７８−８４）。
Ｉ．医薬品としての免疫原性組成物の使用
本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。この医薬品は、好ましくは哺乳動物において免疫応答を増強し（すなわち、免疫原性組成物）、さらに好ましくはワクチンである。本発明は、哺乳動物において免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における、本発明の組成物の使用を提供する。医薬品は、好ましくはワクチンである。好ましくは、ワクチンは、胃腸炎、好ましくは急性胃腸炎などの腸管感染症を予防および／または治療するために使用される。胃腸炎は、漿液性下痢および／または腸蠕動運動および／または運動性（嘔吐）の両方をもたらす、イオンおよび／または水の移動のアンバランスからもたらされるかもしれない。
本発明は、上述の組成物を使用した、免疫応答を誘導または増強する方法を提供する。免疫応答は好ましくは防御的であり、抗体および／または細胞媒介性免疫を含み得る（全身性および粘膜免疫を含む）。免疫応答には、追加応答が含まれる。
本発明は、本発明の組成物の有効量を投与する工程を含む、哺乳動物において免疫応答を増強させる方法も提供する。免疫応答は好ましくは防御的であり、好ましくは抗体および／または細胞媒介性免疫を含む。好ましくは、免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の一方または両方を含む、この方法は、追加応答を上昇し得る。
哺乳動物は好ましくはヒトである。免疫原性組成物の場合、好ましくはワクチンは予防的使用であり、ヒトは好ましくは小児（例えば、２〜４歳ぐらいの幼児または幼児、好ましくは入学前の小児、好ましくは、１歳または３歳以下（好ましくは１〜４歳））または１０代であり、ワクチンが治療的使用である場合、ヒトは好ましくは１０代または成人である。小児を意図するワクチンは、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与することもできる。好ましくは、ヒトは１０代である。さらに好ましくは、ヒトは、青年期前の１０代である。さらに好ましくは、ヒトは青年期前の女性または男性である。好ましくは、青年期前の男性または女性は約９〜１２歳である。好ましくは、青年期の男性または女性は約１５〜１９歳である。好ましくは、男性または女性は約２０〜４９歳である。好ましくは、男性または女性は４９歳を超える。好ましくは、ヒトは老人であり、好ましくは６０〜８０歳である。
本発明の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の他の標的となる群には、下記が含まれる。
移植された、または免疫障害を有する個体；
以下を含むが、それらに限定されない、米国、カナダおよびヨーロッパの成人および小児：
食品取扱業者；
病院および老人ホームの職員などであるが、これらに限定されない、医療従事者；
デイケアチルドレン；
クルーズ船旅行者を含む旅行者；
軍人；および
上述のような小児および／または老人の集団。
Ｊ．キット
本発明は、本発明の組成物の１種以上の容器を含むキットも提供する。組成物は、個々の抗原として、液状であるか、または凍結乾燥されている。組成物のための適切な容器には、例えば、瓶、小びん、注射器および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む種々の材料から製造することができる。容器は、無菌の点検口を有していてもよい（例えば、容器は静注バッグ、または皮下注射針によって穴をあけられるストッパーを有する小びんであってもよい）。
キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝材を含む、第二の容器もさらに含んでもよい。末端消費者に有用な他の材料を含んでもよい。緩衝剤、希釈剤などの薬学的に許容される製剤溶液、フィルター、針、および注射器または他の送達装置などを含んでもよい。キットは、アジュバントを含む第三の成分を含んでもよい。
キットは、免疫を誘導し、または感染症を治療する方法についての書面の説明を含む添付文書を含むこともできる。添付文書は、未承認の草案の能書であってもよく、または食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の取締機関により承認された能書であってもよい。
本発明は、本発明の免疫原性組成物をあらかじめ充填した送達装置も提供する。
Ｋ．ノロウイルスまたはサポウイルス特異的抗体の産生方法
本明細書に開示されるノロウイルスおよびサポウイルスポリペプチドは、それぞれ、ノロウイルスまたはサポウイルス抗原と特異的に結合する、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。ポリクローナル抗体は、ノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドを、マウス、ウサギ、ヤギ、またはウマなどの哺乳動物に投与することによって産生することができる。免疫した動物からの血清を集め、例えば、硫酸アンモニウムによる沈殿、次いでクロマトグラフィー、好ましくは親和性クロマトグラフィーにかけ、抗体を血漿から精製する。ポリクローナル血清の産生および加工の技術は当該技術分野で公知である。
ポリペプチド中に存在する、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的エピトープに対するモノクローナル抗体も、容易に産生することができる。ノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドで免疫化された、マウスなどの哺乳動物に由来する正常なＢ細胞を、例えば、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを生成することができる。ノロウイルスまたはサポウイルス特異的抗体を産生するハイブリドーマは、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを使用して特定し、半固体寒天中でのクローニングまたは限界希釈により分離することができる。ノロウイルスまたはサポウイルス特異的抗体を産生するクローンは、スクリーニングの他の期間に分離される。
ノロウイルスまたはサポウイルスエピトープに対するモノクローナルおよびポリクローナルのいずれかの抗体は、ノロウイルスまたはサポウイルスに感染したヒトに由来する血清試料などの試料中のノロウイルスまたはサポウイルス抗原の存在の検出に特に有用である。ノロウイルスまたはサポウイルス抗原についての免疫検定は、１種の抗体またはいくつかの抗体を利用する。ノロウイルスまたはサポウイルス抗原についての免疫検定は、例えば、ノロウイルスまたはサポウイルスに対するモノクローナル抗体、ノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ、異なるノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体、同一のノロウイルスまたはサポウイルス抗原に対するポリクローナル抗原、異なるノロウイルスまたはサポウイルス抗原に対するポリクロナール抗体、またはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の組み合わせを使用することができる。免疫検定プロトコールは、例えば、標識化抗体を使用した、例えば、競合、直接反応またはサンドイッチタイプの検定をベースとし得る。標識は、例えば、蛍光、化学発光または放射性物質であってもよい。
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、さらに、免疫親和性カラムによりノロウイルスまたはサポウイルス粒子または抗原を分離するために使用することができる。抗体が免疫選択的活性を保持するように、抗体は、例えば吸着によりまたは共有結合により固相担体に固定化することができる。抗体の抗原結合部位が接近しやすい状態であるように、スペーサー基があってもよい。次いで、固定化された抗体は、血液または血漿などの生物学的試料からのノロウイルスまたはサポウイルス粒子または抗原を結合するために使用することができる。結合するノロウイルスまたはサポウイルス粒子または抗原は、例えばｐＨの変化によりカラムマトリクスから回収される。
Ｌ．ノロウイルスおよびサポウイルス特異的Ｔ細胞
前述の、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで発現する免疫原性ポリペプチド、ポリタンパク質、マルチエピトープ融合タンパク質、またはＶＬＰによって活性化されるノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞は、好ましくはＶＰ１またはＶＰ２ポリペプチドまたは非構造ポリペプチドなどのノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドのエピトープを認識する。ノロウイルスまたはサポウイルスＴ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋であり得る。
ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合した精製するこれらのエピトープのいずれかを示すノロウイルスまたはサポウイルスに感染した細胞を死滅させることのできる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり得る。ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば５１Ｃｒ遊離検定によって検出することができる（実施例４を参照）。５１Ｃｒ遊離検定は、これらのエピトープの１種以上を示す標的細胞を溶解するノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を測定する。ＩＦＮ−γなどの抗ウイルス剤を発現する、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞も本明細書において意図され、免疫学的方法によって、好ましくは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０または非構造ポリペプチドなどであるがこれらに限定されない、ノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドの１種以上を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後の、ＩＦＮ−γまたは同様のサイトカインの細胞内染色によって検出することもできる（実施例５を参照）。
ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、リンパ増殖検定によって検出することができる（実施例６を参照）。リンパ増殖検定は、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０および／または非構造ペプチドエピトープに応じた、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能を測定する。
ノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞の活性化方法
ノロウイルスまたはサポウイルスポリヌクレオチドおよび／または免疫原性ポリペプチド、ポリタンパク質、および／またはマルチエピトープ融合タンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかにおいて、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞を活性化するために使用され得る。ノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞の活性化は、特に、ノロウイルスまたはサポウイルスに対するＣＴＬ応答を最適化するためのモデルシステム、およびノロウイルスまたはサポウイルス感染症に対する予防的または治療的処置を提供するために使用され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏの活性化のために、上述の通り、タンパク質は、好ましくはプラスミド、またはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターによってＴ細胞に供給される。
Ｔ細胞のポリクローナル集団は、血液、および好ましくは、ノロウイルスまたはサポウイルスに感染した哺乳動物のリンパ節、脾臓、または胸腺などの末梢リンパ器官に由来し得る。好ましい哺乳動物には、マウス、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトが含まれる。ノロウイルスまたはサポウイルスによる感染は、哺乳動物における、活性化されたノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞の増加をもたらす。次いで、哺乳動物に由来するノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞は、ノロウイルスまたはサポウイルス免疫原性ポリペプチド、ポリタンパク質および／またはマルチエピトープ融合タンパク質を加えることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激することができる。次いで、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞は、とりわけ、増殖、ＩＦＮ−γの産生、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０または非構造ポリペプチドエピトープを示す標的細胞を溶解する能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験をすることができる。
リンパ増殖検定において（実施例６を参照）、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ノロウイルスまたはサポウイルス免疫原性ポリペプチド、ポリタンパク質、および／またはマルチエピトープ融合タンパク質と一緒に培養した場合に増殖するが、このような免疫原性ポリペプチドの非存在下では増殖しない。従って、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０および非構造ポリペプチドに由来するような特定のノロウイルスまたはサポウイルスエピトープ、およびノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるこれらのエピトープの融合体は、リンパ増殖検定を使用して特定することができる。
同様に、上述の免疫原性ポリペプチドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した後のノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの検出は、ＩＦＮ−γを産生するためのＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するのに特に有効である、例えばＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０および非構造タンパク質、およびこれらのエピトープの融合体などがあるがこれらに限定されないエピトープを特定するために使用することができる（実施例５を参照）。
さらに、５１Ｃｒ遊離検定は、ノロウイルスまたはサポウイルスに対するＣＴＬ応答のレベルを決定するのに有用である。Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：４３９−４４９を参照されたい。例えば、ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ノロウイルスまたはサポウイルスに感染した哺乳動物の肝臓に由来してもよい。これらのＴ細胞は、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０および非構造ポリペプチドエピトープを示す標的細胞に対する５１Ｃｒ遊離検定において試験することができる。それぞれの標的細胞集団が、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０および非構造ポリペプチドの異なるエピトープを示すように、異なるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０および非構造ポリペプチドエピトープを発現する、いくつかの標的細胞集団が構築され得る。ノロウイルスまたはサポウイルス特異的ＣＤ８＋細胞は、これらの標的細胞集団のそれぞれについて検定することができる。５１Ｃｒ遊離検定の結果は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ１０および非構造ポリペプチドのどのエピトープが、ノロウイルスまたはサポウイルスに対する最も強いＣＴＬ応答の原因であるかを決定するために使用することができる。
上述のようなノロウイルスまたはサポウイルス免疫原性ポリペプチド、ポリタンパク質、マルチエピトープ融合タンパク質、および／またはＶＬＰ、および／またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞を活性化するためにマウス、ヒヒ、チンパンジーまたはヒトなどの哺乳動物に投与できる。投与は、上述のような遺伝子銃を使用した注射を含む、非経口、鼻腔内、筋肉内、皮下注射を含む、当該技術分野で公知のあらゆる手段であってもよい。
好ましくは、ノロウイルスまたはサポウイルスポリヌクレオチドの注射は、Ｔ細胞を活性化するために使用される。構築および修飾の容易さの現実的な利点に加え、ポリヌクレオチドの注入は、宿主内での免疫原性ポリペプチドの合成をもたらす。従って、これらの免疫原は、固有の翻訳後修飾、構造、および立体構造により宿主免疫システムに提示される。ポリヌクレオチドは、好ましくはヒトなどの大きな哺乳動物に０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内に注射される。
ノロウイルスまたはサポウイルス免疫原性ポリペプチド、ＶＬＰ、またはポリヌクレオチドを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と混合可能な方法で、特に、５１Ｃｒ遊離検定、リンパ増殖検定またはＩＦＮ−γについての細胞内染色により測定される際にノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞を活性化するのに効果的な量で投与される。タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ノロウイルスまたはサポウイルスに感染していない哺乳動物に投与されるか、ノロウイルスまたはサポウイルスに感染した哺乳動物に投与することができる。組成物中のポリヌクレオチドまたは融合タンパク質の特定の投与量は、組成物が投与される哺乳動物の種、年齢および健康状態、組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。本発明の組成物の有効量は、通常の実験のみで容易に決定することができる。上述のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルを、適切な投与量を特定するために使用することができる。後述する実施例において使用されるポリヌクレオチドの量は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するために使用することのできる一般的なガイダンスを提供する。一般的に、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇのノロウイルスまたはサポウイルスポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、ヒヒ、チンパンジーまたはヒトなどの大きな哺乳動物に投与される。所望であれば、組成物の投与の前、後または同時に、ともに刺激する分子またはアジュバントを投与してもよい。
ノロウイルスまたはサポウイルス特異的Ｔ細胞の活性化を含む、本発明の組成物の送達によって起こる哺乳動物の免疫応答は、投与量、投与経路または追加免疫計画を変えることによって増強することができる。本発明の組成物が単回投与されるか、または好ましくは複数投与計画で与えられ、ワクチン接種の初回のコースは１〜１０種の別個の投与を含み、次いで免疫応答を維持しおよび／または強化するために他の用量に与えられる時間間隔、例えば、２回目の投与のために１〜４ヶ月間、必要に応じて数ヶ月後に次の投与が必要となる。
ＩＩＩ．実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。実施例は説明の目的のためにのみ提供され、多少なりとも本発明の範囲を限定することを意図しない。
使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされたが、当然に、実験の誤差および偏差は許容されるべきである。
実施例１
酵母におけるノーウォークウイルスキャプシドタンパク質の発現
サッカロミセス・セレビシエにおけるノーウォークウイルス（ＮＶ）のＶＬＰの産生のための構築物を、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする配列を、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１にクローニングすることによって生成した。ｐＢＳ２４．１ベクターは、全体が参考として本明細書で援用される、１９８９年７月１９に出願された、米国特許出願第３８２，８０５号に一般的に詳述されている。ｐＢＳ２４．１ベクターは酵母における自己複製のための２μ配列、選択マーカーとしての酵母遺伝子ｌｅｕ２ｄおよびＵＲＡ３を含む。βラクタマーゼ遺伝子、およびプラスミド複製に必要な、複製のＣｏｌＥ１オリジンも、この発現ベクター内に存在する。発現の調節は、ハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（米国特許第６，１８３，９８５号に開示されている）およびα因子ターミネーターの制御下にある。
生成され、ＮＶキャプシドタンパク質の発現のために使用される構築物には、ｏｒｆ２の修飾されたポリヌクレオチド配列を含むＮＶ．ｏｒｆ２（配列番号１）、およびｏｒｆ２＋ｏｒｆ３の修飾されたポリヌクレオチド配列を含むＮＶ．ｏｒｆ２＋３（配列番号２）が含まれる。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８７６６１に由来するＤＮＡ配列に基づく、合成オリゴヌクレオチドを使用して、ｏｒｆ２（主要キャプシド遺伝子）およびｏｒｆ２＋３のコード配列を生成した。発現ベクター内へのＮＶ．ｏｒｆ２およびＮＶ．ｏｒｆ２＋３のクローニングを促進するため、ｏｒｆ２およびｏｒｆ３に多くのサイレント突然変異を導入した（図１）。
３’ＵＴＲ配列をコードする、全長ｏｒｆ２＋３は、以下のように４つのドメインに分けられる（図２）。
ドメイン１（５ｐ）は、５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、それに続くＡＣＡＡＡＡＣＡＡ配列、イニシエーターＡＴＧ、およびキャプシドタンパク質の最初の１５４アミノ酸をコードし、ユニークなＸｂａＩクローニング部位で終わる。
ドメイン２（ｍｉｄ）はＸｂａＩ部位からユニークなＡｓｅＩクローニング部位まで次の１７５アミノ酸をコードする。
ドメイン３（３ｐ）は、ＡｓｅＩからｏｒｆ２コード配列の末端の近くのユニークなＢｓｐｅ１部位までのｏｒｆ２の最後の２００アミノ酸をコードし、次いで２個の停止コドンおよびＳａｌＩクローニング部位をコードする。
ドメイン４（ｏｒｆ３）には、以下のもの、すなわち、ユニークなＢｓｐＥ１部位、停止コドン、フレームシフト／次いでｏｒｆ３（２１２アミノ酸）の翻訳を開始する再開始コドン、６６ｂｐの３’ＵＴＲ、および最後にＳａｌＩクローニング部位が含まれる。
上述のユニークなクローニング部位を攻撃して、各ドメインへのオリゴヌクレオチドを、５’および３’末端にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位を含むように設計した。次いで、各ドメインについてのオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理、アニーリングし、ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサブクローニングベクターに連結した（図３）。ＨＢ１０１コンピテント細胞（市販されている）への形質転換、ミニスクリーン解析および配列検証の後、正確な配列を有するクローンは以下のように特定され、増幅された。
ｐＵＣ１９．ＮＶ．５ｐ＃４
ｐＵＣ１９．ＮＶ．ｍｉｄ＃１１および＃１３
ｐＵＣ１９．ＮＶ．３ｐ＃２２
ｐＵＣ１９．ＮＶ．ｏｒｆ３＃３１
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片として全長ＮＶ．ｏｒｆ２を構築するため、連続した消化を実施した：ｐＵＣ１９．ＮＶ．５ｐ＃１３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し４７８塩基対の断片を分離した；ｐＵＣ１９．ＮＶ．ｍｉｄ＃１３をＸｂａＩおよびＰｃｉＩで消化し３９３塩基対の断片を分離した；ｐＵＣ１９．ＮＶ．ｍｉｄ＃１１をＰｃｉＩおよびＡｓｅＩで消化し１３３塩基対の断片を分離した；ｐＵＣ１９．ＮＶ．３ｐ＃２２をＡｓｅＩおよびＳａｌＩで消化し６０９塩基対の断片を分離した。４つすべての断片をゲル精製し、ｐＳＰ７２ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩベクターに連結し、ＮＶ．ｏｒｆ２のコード配列の１６１３塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ挿入物を得た（図３および図４）。
全長ＮＶ．ｏｒｆ２＋３コード配列を、ｐＵＣ１９．ＮＶ．３ｐ＃２２のＡｓｅＩおよびＢｓｐＥ１による消化物から得られる５９５塩基対のゲル精製した断片を有する、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ、ＸｂａＩ／ＰｃｉＩ、およびＰｃｉＩ／ＡｓｅＩ断片（前述）、およびｐＵＣ１９．Ｎｖ．ｏｒｆ３＃３１から得られる７１５塩基対のゲル精製したＢｓｐＥＩ／ＳａｌＩ断片をｐＳＰ７２ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩベクターに連結することによって構築した（図５）。ＨＢ１０１への形質転換およびミニスクリーン解析の後、全長サブクローンｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１およびｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１６を得た。それぞれのｐＳＰ７２サブクローンの制限酵素による消化後、１６１３塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ ＮＶ．ｏｒｆ２断片および２３１４塩基対のＮＶ．ｏｒｆ２＋３断片をゲル分離し精製した。各ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を、上述の要素を含む、ｐＢＳ２４．１ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクター内の１３６６塩基対のＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ酵母ハイブリッドプロモーターと連結した。ＨＢ１０１形質転換およびミニスクリーン解析の後、以下の酵母発現プラスミド、すなわちｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１およびｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２を特定し、増幅した（図６および７）。
酢酸リチウムプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＥａｓｙＣｏｍｐ）を使用して、サッカロミセス・セレビシエ ＡＤ３株［ｍａｔα、ｌｅｕ２Δ、ｔｒｐ１、ｕｒａ−５２、ｐｒｂ−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｐｒｃ１−４０７、ｃｉｒ○、ｔｒｐ＋、：：ＤＭ１５［ＧＡＰ／ＡＤＲ］を、発現プラスミドｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１およびｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２で形質転換した。形質転換後、単一のコロニーを得るために、Ｕｒａ−８％グルコースプレートにいくつかのＵｒａ−形質転換体の線をつけた。プラスミドのコピー数を増やすため、単一のコロニーをＬｅｕ−８％グルコースプレートにあてた。Ｌｅｕを含まない開始培養を３０℃で２４時間増殖させ、次いでＹＥＰＤ（酵母抽出物バクトペプトン２％グルコース）培地で１：２０に希釈した。細胞を３０℃で４８時間増殖し、培地内のグルコースを消費させ、次いで収集した。次いで、酵母細胞の一定量を、溶解緩衝剤（１０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中、ガラスビーズで溶解した。溶解物を４°マイクロフュージで遠心分離により除去した。市販されている、ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮノロウイルス免疫検定（ＳｃｉＭｅｄｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、除去したガラスビーズ溶解物中に組換えタンパク質を検出した（図８）。溶解物をショ糖勾配沈降にかけ、画分をノロウイルスキットを使用して検定し、サッカロミセス・セレビシエにおけるキャプシドタンパク質の発現が、組換えＮＶエンプティウイルス様粒子の自己構築をもたらすかどうかを検出した。電子顕微鏡の予備的結果は、ショ糖勾配のピーク画分におけるウイルス様粒子の形成を示した（図９）。
実施例２
昆虫細胞内でのノーウォークウイルスキャプシドタンパク質の発現
昆虫細胞系におけるＮＶキャプシドｏｒｆ２およびＮＶキャプシドｏｒｆ２＋３の発現について、ＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５バキュロウイルス発現ベクター中にクローニングすることのできるＮｈｅＩ／ＳａｌＩ断片を形成するために以下の操作を実施した。最初に、ｏｒｆ２およびｏｒｆ２＋３のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓａｌ断片の５’末端を修飾し、ＨｉｎｄＩＩ制限部位をＮｈｅＩ制限部位と置換した。これは、開始部位にＮｈｅＩ部位を含む６３塩基対の合成オリゴ、キャプシドタンパク質の１〜２１アミノ酸をコードする配列、および末端のＫｐｎＩ部位を使用して実施した。次いで、それぞれｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１およびｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１６を、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化し、次いでゲル電気泳動分離バンドを精製することにより、１５３４塩基対のＫｐｎＩ／ＳａｌＩ ＮＶ．ｏｒｆ２断片、および２２３５塩基対のＫｐｎＩ／ＳａｌＩ ＮＶ．ｏｒｆ２＋３断片を分離した。ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩオリゴおよびＫｐｎＩ／ＳａｌＩ断片を、ＰＣＥＴ９０６Ａシャトルベクター（ＭＬ Ｌａｂｓ）に連結した。連結混合物でコンピテントＨＢ１０１を形質転換し、ルリア−アンピシリンプレートにプレーティングした。ミニプレップ解析、所望のクローンの特定、および配列確認の後、プラスミドｐＣＥＴ９０６Ａ．ＴＰＡＬ．ｏｒｆ２＃２１およびｐＣＥＴ９０６Ａ．ＴＰＡＬ．ｏｒｆ２＋３＃３４を増幅した（図１０）。
ｐＣＥＴ９０６Ａ．ＴＰＡＬ．ｏｒｆ２＃２１およびｐＣＥＴ９０６Ａ．ＴＰＡＬ．ｏｒｆ２＋３＃３４をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで消化し、ＮＶ．ｏｒｆ２をコードする１６０２塩基対の断片、およびＮＶ．ｏｒｆ２＋３をコードする２３０３塩基対の断片をそれぞれゲル分離した。ｏｒｆ２およびｏｒｆ２＋３のＮｈｅＩ／ＳａｌＩ断片をＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５のＮｈｅＩ／ＳａｌＩ昆虫細胞発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、プラスミドＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５ＮＶ．ｏｒｆ２＃２およびＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２を得た（図１１）。
ＮＶ．ｏｒｆ２またはｏｒｆ２＋３をコードする配列を、既述の通り、ＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５トランスファーベクターを通じて、２μｇのトランスファーベクターを０．５μｇの直線化した野生型ウイルスでＳＦ９細胞に共トランスフェクトすることにより、オートグラフ・カリフォルニアバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）に組み換えた（Ｋｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。組換え型バキュロウイルスをプラーク精製（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）によって分離した。血清非含有培地中で２〜１０の感染の多様性（ｍｏｉ）で、１．５×１０６個ＳＦ９細胞／ｍＬの懸濁培養液を、関連するバキュロウイルスにより感染の４８時間後に回収した（Ｍａｉｏｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。市販されている。ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮノロウイルス免疫検定（ＳｃｉＭｅｄｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、培地中に組換えタンパク質を検出した（図１２）。ショ糖勾配沈降法（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６９２９−６９３６）により培地からＶＬＰを精製し、ピーク画分中のＶＬＰの存在を電子顕微鏡で確認した（図１３）。
実施例３
マルチエピトープ融合タンパク質の産生
ノロウイルスＭＤ１４５−１２（配列番号１３）に対して番号付けされた、アミノ酸約１〜６９６を含むＮｔｅｒｍ−ＮＴＰａｓｅ融合体をコードするポリヌクレオチドをノロウイルスから分離する。この構築物を、ノロウイルスＭＤ１４５−１２に対して番号付けした、ポリタンパク質のアミノ酸約１１９０〜１６９９をコードするポリメラーゼポリペプチドを含むポリヌクレオチドと融合させる。得られた融合タンパク質が、そのＣ末端にポリメラーゼにコードされるポリペプチドを含むように、ポリメラーゼオードポリヌクレオチド配列を、構築物のＮｔｅｒｍ−ＮＴＰａｓｅコード部分から下流に融合する。構築物を、プラスミド、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、および酵母ベクターにクローニングする。さらに、構築物を組換え発現ベクターに挿入し、宿主細胞を形質転換し、Ｎｔｅｒｍ−ＮＴＰａｓｅ−Ｐｏｌ融合タンパク質を産生するために使用する。
実施例４
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
５１Ｃｒ遊離検定。５１Ｃｒ遊離検定は、ノロウイルスまたはサポウイルスエピトープを示す標的細胞を溶解するＴ細胞の能力を測定するために使用される。免疫化された動物から脾臓細胞を保存する。これらの細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＩＬ−２の存在下、ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するＣＴＬエピトープ性プチチドで６日間刺激する。次いで、Ｗｅｉｓｓ（１９８０）Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：９９１２−９９１７に考察するように、５１Ｃｒ遊離検定により、クラスＩのＭＨＣ分子を発現するが、クラスＩＩの分子を発現しない、ペプチドで感作した標的細胞（Ｌ９２９）に対する標準的な細胞毒性活性について脾臓細胞を検定する。６０：１、２０：１および７：１の標的（Ｂ細胞）に対するエフェクター（Ｔ細胞）の比を試験する。それぞれの標的に対するエフェクターの比について特異的溶解の割合を計算する。
実施例５
ＩＦＮ−γを発現する、ノロウイルスおよびサポウイルスに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）についての細胞内染色。ノロウイルスおよび／またはサポウイルス抗原を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋細胞を特定するために、ＩＦＮ−γについての細胞内染色を使用する。個々に免疫した動物の脾臓細胞を、ＩＬ−２およびモネンシンの存在下、本明細書に記載される免疫原性組成物または非特異的ペプチドで６から１２時間ｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激する。次いで、表面ＣＤ８について、および細胞内ＩＦＮ−γについて細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析する。次いで、ＩＦＮ−γについても陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を計算する。
実施例６
ノロウイルスおよびサポウイルスに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖
リンパ増殖検定。保存した免疫動物由来の脾臓細胞は、磁気ビーズを使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を使い果たし、本明細書に記載する免疫原性組成物と一緒に、または培地のみで３通りに培養する。７２時間後、細胞をウェルあたり１μＣｉの３Ｈ−チミジンでパルスし、６〜８時間後に細胞を回収する。回収後、放射能の取り込みを測定する。平均ｃｐｍを計算する。
実施例７
実施例１で考察したような１０〜２５０μｇのＶＰ１およびＶＰ２をコードするプラスミドＤＮＡ、および実施例３で考察したようなＮｔｅｒｍ−ＮＴＰａｓｅ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで動物を免疫化する。ＤＮＡは、ＰＬＧ−結合ＤＮＡ（後述）、またはエレクトロポレーション（例えば、この送達技術について国際特許出願公開第ＷＯ／００４５８２３を参照）のいずれかを使用することによって送達される。免疫に、６週間後のＮｔｅｒｍ−ＮＴＰａｓｅ−ＰｏｌをコードするプラスミドＤＮＡ、およびＶＰ１およびＶＰ２をコードするプラスミドＤＮＡの追加免疫が続く。
ＰＬＧ送達ＤＮＡ。ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）ポリマーは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（米国）から得られる。ＰＬＧポリマーは、５０／５０のコポリマー比、および６５ｋＤａの分子量（製造者のデータ）を有するＲＧ５０５である。ＤＮＡが吸着したカチオン性微粒子は、基本的にＳｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：８１１−８１６に記載されている、修飾溶媒蒸発プロセスを使用して調製する。すなわち、微粒子を、１０ｍＬの５ｗ／ｖ％ポリマー溶液を、１ｍＬのＰＢＳを含む塩化メチレン中で、ＫＩＡホモジナイザーを使用して高速で乳化することによって調製する。次いで、最初のエマルジョンを、臭化セチルメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）（０．５ｗ／ｖ％）を含む５０ｍＬの蒸留水に加える。室温で６０００ｒｐｍで１２時間撹拌し、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成させ、塩化メチレンを蒸発させる。得られた微粒子を１０，０００ｇで遠心分離することにより蒸留水で２回洗浄し、凍結乾燥する。調製、洗浄および収集に次ぎ、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ溶液中で、４℃で６時間、１００ｍｇのカチオン性微粒子をインキュベートすることにより、ＤＮＡを微粒子に吸着させた。次いで、微粒子を遠心分離により分離し、ペレットをＴＥ緩衝液で洗浄し、微粒子を凍結乾燥した。
ＣＴＬ活性およびＩＦＮ−γの発現を、上の実施例で記載した通り、５１Ｃｒ遊離検定または細胞内染色により測定する。
実施例８
免疫経路、ならびにＶＰ１およびＶＰ２をコードするレプリコン粒子ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）
アルファウイルスレプリコン粒子、例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）をＰｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に開示されたようにして調製する。ノロウイルスのＶＰ１およびＶＰ２をコードする、５×１０６ＩＵ ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子を、筋肉注射（ＩＭ）、または皮下注射（Ｓ／Ｃ）で、尻尾の付け根（ＢｏＴ）および脚パッド（ＦＰ）に、または２／３のＤＮＡをＩＭ投与により、１／３をＢｏＴ経路の組み合わせにより動物に注射する。免疫に、ＶＰ１をコードするワクシニアウイルスの追加免疫が続く。ＩＦＮ−γの発現を、実施例５で記載した通り細胞内染色により測定する。
実施例９
アルファウイルスレプリコンによる初回免疫、それに続く種々の追加免疫計画
アルファウイルスレプリコン粒子、例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）は、Ｐｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載した通り調製する。前脛骨筋内への筋肉内注射により、ノロウイルスのＶＰ１およびＶＰ２をコードする、１．５×１０６ＩＵのレプリコン粒子、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）を動物に初回免疫し、６週目に、１０〜１００μｇのＶＰ１をコードするプラスミドＤＮＡ、ＶＰ１およびＶＰ２をコードする１０１０個のアデノウイルス粒子、ＶＰ１およびＶＰ２をコードする１．５×１０６ＩＵ ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）レプリコン粒子、またはＶＰ１をコードする１０７ｐｆｕのワクシニアウイルスで追加免疫化する。ＩＦＮ−γの発現を、実施例５で記載した通り細胞内染色により測定する。
実施例１０
ＶＰ１およびＶＰ２を発現するアルファウイルス
アルファウイルスレプリコン粒子、例えば、ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）およびＳＩＮＣＲ（ＬＰ）をＰｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−４６０３に記載の通り調製する。送達経路（２／３のＩＭおよび１／３のＳ／Ｃ）の組み合わせ、ならびにＳ／Ｃ単独により、ＶＰ１およびＶＰ２をコードする１×１０２〜１×１０６ＩＵ ＳＩＮＣＲ（ＤＣ＋）、または組み合わせ送達経路（２／３のＩＭおよび１／３のＳ／Ｃ）の組み合わせ、ならびにＳ／Ｃ単独により、ＶＰ１およびＶＰ２をコードする１×１０２〜１×１０６ＩＵ ＳＩＮＣＲ（ＬＰ）レプリコン粒子で動物を免疫する。免疫に次ぎ、６週目に、ＶＰ１をコードする１０７ｐｆｕのワクシニアウイルスで追加免疫化する。ＩＦＮ−γの発現を、実施例５で記載した通り細胞内染色により測定する。
実施例１１
ノロウイルス抗原およびアジュバントの組み合わせによる免疫
以下の実施例は、マウスモデルにおける、ＮＶ、ＳＭＶおよびＨＶ抗原の種々の組み合わせを使用した免疫を示す。ＮＶ、ＳＭＶおよびＨＶ抗原は、本明細書に記載の通り調製し、特徴付ける。ＣＤ１マウスを９個の群に分け、以下のように免疫化する。
Figure 2009516529
 ２週間間隔でマウスを免疫化する。最後の免疫の２週間後、すべてのマウスに対して適切な株で抗原投与する。粘膜免疫（例えば鼻腔内）を使用する場合、粘膜免疫原の肯定的な効果を試験するために、動物モデルに粘膜的に抗原投与する。
本明細書に記載したすべての刊行物は、参考として本明細書で援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修飾および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者にとって明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関連して本発明を説明したが、本発明は、これらの特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野における当業者に明らかである本発明を実施するための開示された様式の種々の修飾は、本発明によって保護されることが意図される。
図１Ａは、ｏｒｆ２ およびｏｒｆ３領域（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８７６６１、１９９７年３月２６日）を含めた、ノーウォークウイルスのヌクレオチド配列、および修飾されたｏｒｆ２ およびｏｒｆ３配列を含む配列番号２（ＮＶ．ｏｒｆ２＋３）のヌクレオチド配列を示す。配列番号２における配列修飾の位置は強調表示されている。 図１Ｂは、ｏｒｆ２ およびｏｒｆ３領域（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８７６６１、１９９７年３月２６日）を含めた、ノーウォークウイルスのヌクレオチド配列、および修飾されたｏｒｆ２ およびｏｒｆ３配列を含む配列番号２（ＮＶ．ｏｒｆ２＋３）のヌクレオチド配列を示す。配列番号２における配列修飾の位置は強調表示されている。 図１Ｃは、ｏｒｆ２ およびｏｒｆ３領域（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８７６６１、１９９７年３月２６日）を含めた、ノーウォークウイルスのヌクレオチド配列、および修飾されたｏｒｆ２ およびｏｒｆ３配列を含む配列番号２（ＮＶ．ｏｒｆ２＋３）のヌクレオチド配列を示す。配列番号２における配列修飾の位置は強調表示されている。 図２Ａ〜２Ｆは、配列番号２のヌクレオチド配列の翻訳を示す。図２Ａ〜２Ｄは、ｏｒｆ２によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示し、図２Ｅ〜２Ｆは、ｏｒｆ３によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示す。 図２Ａ〜２Ｆは、配列番号２のヌクレオチド配列の翻訳を示す。図２Ａ〜２Ｄは、ｏｒｆ２によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示し、図２Ｅ〜２Ｆは、ｏｒｆ３によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示す。 図２Ａ〜２Ｆは、配列番号２のヌクレオチド配列の翻訳を示す。図２Ａ〜２Ｄは、ｏｒｆ２によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示し、図２Ｅ〜２Ｆは、ｏｒｆ３によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示す。 図２Ａ〜２Ｆは、配列番号２のヌクレオチド配列の翻訳を示す。図２Ａ〜２Ｄは、ｏｒｆ２によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示し、図２Ｅ〜２Ｆは、ｏｒｆ３によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示す。 図２Ａ〜２Ｆは、配列番号２のヌクレオチド配列の翻訳を示す。図２Ａ〜２Ｄは、ｏｒｆ２によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示し、図２Ｅ〜２Ｆは、ｏｒｆ３によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示す。 図２Ａ〜２Ｆは、配列番号２のヌクレオチド配列の翻訳を示す。図２Ａ〜２Ｄは、ｏｒｆ２によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示し、図２Ｅ〜２Ｆは、ｏｒｆ３によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列を示す。 図３は、ＮＶ．ｏｒｆ２およびＮＶ．ｏｒｆ３構築物の構築のためのオリゴヌクレオチド断片の精製を例示する概略図を示す。配列番号２の配列は、実施例１に説明するように４つのドメインに分けられる。４つのドメインそれぞれのオリゴヌクレオチドは、５’および３’末端にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位を含むように設計され、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにより切断されたｐＵＣ１９サブクローニングベクターに連結される。記載の制限酵素を使用したさらなる消化により、図示のようなオリゴヌクレオチド断片が産生される。 図４は、オリゴヌクレオチド断片からのＮＶ．ｏｒｆ２構築物の構築を示す概略図を示す。全長ＮＶ．ｏｒｆ２構築物は、図示のような制限酵素による一連の消化から産生される４個のオリゴヌクレオチド断片から構築した。すべての４個の断片はゲル精製され、制限酵素ＨｉｎｄＩＩおよびＳａｌＩにより切断されたｐＳＰ７２ベクターに連結され、ＮＶ．ｏｒｆ２の配列をコードする１６１３塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ挿入物を生成した。 図５は、オリゴヌクレオチド断片からのＮＶ．ｏｒｆ２＋３構築物の構築を示す概略図を示す。全長ＮＶ．ｏｒｆ２構築物は、全長のＮＶ．ｏｒｆ２＋３は、図示のようなＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｌ、Ｘｂａｌ／Ｐｃｉｌ、およびＰｃｉｌ／Ａｓｅｌ断片を、ＡｓｅｌおよびＢｓｐＥｌによるｐＵＣ１９．ＮＶ．３ｐ ＃２２の消化で得られた、ゲル精製した５９５塩基対の断片、ならびにｐＵＣ１９．ＮＶ．ｏｒｆ３ ＃３１から得られたゲル精製した７１５塩基対のＢｓｐＥＩ／Ｓａｌ断片を、ｐＳＰ７２ Ｈｉｎｄｌｌｌ／Ｓａｌｌベクター内に連結することにより構築した（実施例１を参照）。 図６は、酵母において発現するためのｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１構築物を産生するための、ｐＢＳ２４．１ベクターへの全長ｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１のサブクローニングを例示する概略図である。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩによる消化により得られた１６１３塩基対のＮＶ．ｏｒｆ２断片を、ゲル分離し、精製した。実施例１に記載の通り、ｐＢＳ２４．１ ＢａｍＨＩ／Ｓａｌｌ酵母発現ベクター内に、１３６６塩基対のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ酵母ハイブリッドプロモーターとともに連結した。 図７は、酵母において発現するためのｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２構築物を産生するための、ｐＢＳ２４．１ベクターへの全長ｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１６のサブクローニングを例示する概略図である。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩによる消化により得られた２３１４塩基対のＮＶ．ｏｒｆ２＋３断片を、ゲル分離し、精製した。実施例１に記載の取り、ｐＢＳ２４．１ ＢａｍＨＩ／Ｓａｌｌ酵母発現ベクター内で、１３６６塩基対のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ酵母ハイブリッドプロモーターとともに連結した。 図８は、酵母における組換え型ノーウォークウイルス抗原の発現の結果を示す。発現プラスミドｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１およびｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２を、サッカロミセス・セレビシエＡＤ３株［ｍａｔα，ｌｅｕ２Δ，ｔｒｐｌ，ｕｒａ３−５２，ｐｒｂ−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｐｒｃｌ−４０７，ｃｉｒ°，ｔｒｐ＋，：：ＤＭ１５［ＧＡＰ／ＡＤＲ］内で発現させた。細胞溶解物をショ糖勾配沈降にかけ、集めた画分中の組換え型タンパク質を、ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮノロウイルス免疫検定（ＳｃｉＭｅｄｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して検出した。 図９は、酵母におけるｐｄ．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２の発現により産生された組換え型ノロウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。 図１０は、ＰＣＥＴ９０６Ａシャトルベクターへの全長のＮＶ．ｏｒｆ２およびＮＶ．ｏｒｆ２＋３のサブクローニングを例示する概略図を示す。１５３４塩基対のＫｐｎＩ／Ｓａｌｌ ＮＶ．ｏｒｆ２断片、および２２３５塩基対のＫｐｎｌ／Ｓａｌｌ ＮＶ．ｏｒｆ２＋３断片を、それぞれｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＃１およびｐＳＰ７２．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１６をＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化することにより分離した。ゲル精製したＫｐｎＩ／Ｓａｌｌ ＮＶ．ｏｒｆ２およびＫｐｎｌ／Ｓａｌｌ ＮＶ．ｏｒｆ２＋３断片を、始端のＮｈｅＩ部位、キャプシドタンパク質のアミノ酸１〜２１をコードする配列、および末端のＫｐｎＩ部位を含む６３塩基対の合成オリゴヌクレオチドと連結し、ＰＣＥＴ９０６Ａ Ｎｈｅｌ／Ｓａｌｌ ｖ．シャトルベクター（ＭＬ Ｌａｂｓ）にクローニングした。 図１１は、ＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５バキュロウイルス発現ベクターへの全長ＮＶ．ｏｒｆ２およびＮＶ．ｏｒｆ２＋３のサブクローニングを例示する概略図を示す。クローンｐＣＥＴ９０６Ａ．ＴＰＡＬ．ｏｒｆ２＃２１およびｐＣＥＴ９０６Ａ．ＴＰＡＬ．ｏｒｆ２＋３＃３４を、ＮｈｅｌおよびＳａｉｌで消化し、それぞれＮＶ．ｏｒｆ２をコードする１６０２塩基対断片、およびＮＶ．ｏｒｆ２＋３をコードする２３０３塩基対断片をゲル分離した。ｏｒｆ２およびｏｒｆ２＋３のＮｈｅＩ／ＳａｌＩ断片を、ＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５ Ｎｈｅｌ／Ｓａｌｌ昆虫細胞発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、プラスミドＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５．ＮＶ．ｏｒｆ２＃２およびＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２を生成した。 図１２は、バキュロウイルスで感染したＳＦ９昆虫細胞における組換え型ノーウォークウイルス抗原の発現の結果を示す。細胞溶解物をショ糖勾配沈降にかけ、集めた画分中の組換え型タンパク質を、ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮノロウイルス免疫検定（ＳｃｉＭｅｄｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して検出した。 図１３は、ＳＦ９昆虫細胞内におけるＰＢＬＵＥＢＡＣ４．５．ＮＶ．ｏｒｆ２＋３＃１２の発現により産生された組換え型ノロウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。 図１４Ａは、配列番号１（ＮＶ．ｏｒｆ２）のヌクレオチド配列を示す。 図１４Ｂは、配列番号１（ＮＶ．ｏｒｆ２）のヌクレオチド配列を示す。 図１５Ａは、配列番号２（ＮＶ．ｏｒｆ２＋３）のヌクレオチド配列を示す。 図１５Ｂは、配列番号２（ＮＶ．ｏｒｆ２＋３）のヌクレオチド配列を示す。 図１６Ａは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｂは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｃは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｄは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｅは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｆは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｇは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｈは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１６Ｉは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のポリタンパク質のＯＲＦ１コード配列およびポリタンパク質のドメイン境界を示す。 図１７Ａは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２の主要キャプシドタンパク質のＯＲＦ２コード配列を示す。 図１７Ｂは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２の主要キャプシドタンパク質のＯＲＦ２コード配列を示す。 図１７Ｃは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２の主要キャプシドタンパク質のＯＲＦ２コード配列を示す。 図１８Ａは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のマイナー構造タンパク質のＯＲＦ３コード配列を示す。 図１８Ｂは、ノロウイルスＭＤ１４５−１２のマイナー構造タンパク質のＯＲＦ３コード配列を示す。

Claims (57)

  1. ａ）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド；
    ｂ）配列番号２の配列を含むポリヌクレオチド；および
    ｃ）ノロウイルスまたはサポウイルス抗原をコードする配列、およびアジュバントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組換え型ポリヌクレオチド。
  2. 請求項１に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結するプロモーターもさらに含む、請求項１に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
  3. 前記プロモーターがハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターである、請求項２に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
  4. α因子ターミネーターもさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
  5. アジュバントをコードする配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
  6. 前記アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）の解毒された突然変異体である、請求項５に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
  7. 前記ポリヌクレオチドが、
    ａ）配列番号１を含むポリヌクレオチド；
    ｂ）ウイルス様粒子を産生することができる、配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を含むポリヌクレオチド；
    ｃ）配列番号２を含むポリヌクレオチド；
    ｄ）ウイルス様粒子を産生することができる、配列番号２と少なくとも９０％同一である配列を含むポリヌクレオチド；
    ｅ）配列番号３の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｆ）ノーウォークウイルスの主要キャプシドタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる、配列番号３の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｇ）配列番号４の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｈ）ノーウォークウイルスのマイナー構造タンパク質に対する免疫応答を誘発することができる、配列番号４の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｉ）配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｊ）ノロウイルスまたはサポウイルスに対する免疫応答を誘発することができる、配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である少なくとも１つの配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｋ）ノロウイルスまたはサポウイルスに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性断片をコードする配列を含む、ｊ）またはｋ）のポリヌクレオチドの断片
    からなる群より選択される、請求項６に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
  9. （ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド、および／またはノロウイルスもしくはサポウイルスの２種以上の株に由来する少なくとも２種のポリペプチド；ならびに
    （ｂ）薬学的に許容される賦形剤
    を含む、組成物。
  10. 請求項１に記載の組換え型ポリヌクレオチド、およびノロウイルスまたはサポウイルスに由来する少なくとも１種のポリペプチドを含む、請求項９に記載の組成物。
  11. ａ）配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
    ｂ）配列番号３〜１２、配列番号１４〜１７、および配列番号１９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチド；ならびに
    ｃ）ａ）またはｂ）のポリペプチドの免疫原性断片
    からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項９または１０に記載の組成物。
  12. ノロウイルスまたはサポウイルスの異なる分離株に由来する少なくとも２種のポリペプチドを含む、請求項９、１０または１１に記載の組成物。
  13. 少なくとも１種のポリペプチドが、ノーウォークウイルス（ＮＶ）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）、ハワイウイルス（ＨＶ）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスに由来する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. ＮＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチド、ＳＭＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチド、およびＨＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチドを含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. サポウイルスのキャプシドポリペプチドもさらに含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するＯＲＦ１配列を含むポリヌクレオチド、および／またはノロウイルスもしくはサポウイルスに由来するＯＲＦ１によってコードされるポリペプチド、またはそれらの断片もさらに含む、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. ノロウイルスまたはサポウイルスに由来するＯＲＦ２配列を含むポリヌクレオチド、ＮＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチド、ＳＭＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチド、および／またはＨＶ ＯＲＦ２にコードされるポリペプチドもさらに含む、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  18. ノロウイルスに由来するＯＲＦ３配列を含むポリヌクレオチド、および／またはノロウイルスに由来するＯＲＦ３によってコードされるポリペプチドもさらに含む、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. ａ）配列番号４、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列を含むポリペプチド；
    ｂ）ノロウイルスに対する免疫応答を誘発することができる、配列番号４、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチド；ならびに
    ｃ）ノロウイルスに対する免疫応答を誘発することができる、ａ）またはｂ）のポリペプチドの免疫原性断片
    からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. ノロウイルスまたはサポウイルスの２種以上の株に由来する少なくとも２種のキャプシドポリペプチドを含む、請求項９〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 少なくとも１種のキャプシドポリペプチドが、ノーウォークウイルス（ＮＶ）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）、ハワイウイルス（ＨＶ）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスに由来する、請求項２０に記載の組成物。
  22. １種以上のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来する少なくとも２種のポリペプチドを含むマルチエピトープ融合タンパク質もさらに含む、請求項９〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記融合タンパク質が、同一のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来するポリペプチドを含む、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記融合タンパク質が、異なるノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来する少なくとも２種のポリペプチドを含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記融合タンパク質が、ノロウイルスまたはサポウイルスのポリタンパク質中に天然に存在する順番でない配列を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. ウイルス様粒子（ＶＬＰ）もさらに含む、請求項９〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記ウイルス様粒子がノロウイルスまたはサポウイルスに由来する、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、ノロウイルスまたはサポウイルスの異なる株に由来する少なくとも２種の抗原を含む、請求項２７に記載の組成物。
  29. 少なくとも１種の抗原が、ノーウォークウイルス（ＮＶ）、スノーマウンテンウイルス（ＳＭＶ）、ハワイウイルス（ＨＶ）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスに由来する、請求項２８に記載の組成物。
  30. すべての病原性ノロウイルスのすべてまたは成分を含む、請求項９〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
  31. すべての病原性サポウイルスのすべてまたは成分を含む、請求項９〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
  32. アジュバントもさらに含む、請求項９〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. 前記アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＭＦ５９、およびミョウバンからなる群より選択される、請求項３３に記載の組成物。
  34. 微粒子もさらに含む、請求項９〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. 前記微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−Ｃｏ−グリコリド）微粒子である、請求項３４に記載の組成物。
  36. キトサンもさらに含む、請求項９〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
  37. ノロウイルス抗原でもサポウイルス抗原でもない抗原もさらに含む、請求項９〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 前記抗原がロタウイルス抗原である、請求項３７に記載の組成物。
  39. ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
    ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
    ｂ）キャプシドタンパク質が発現し、ＶＬＰに構築する条件下において、該形質転換した宿主細胞を培養する工程
    を含む、方法。
  40. 前記発現ベクターの１種以上が、２種以上のノロウイルスまたはサポウイルス分離株に由来するキャプシドタンパク質をコードする配列を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記宿主細胞を、ノロウイルスまたはサポウイルスに由来する構造タンパク質をコードする１種以上の配列で形質転換することもさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記発現ベクターが、ノロウイルスまたはサポウイルスに由来する１種以上のＯＲＦ１−および／またはＯＲＦ−３コード配列を含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. アジュバントをコードする配列を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することもさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２からなる群より選択される、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）の解毒された突然変異体である、請求項４３に記載の方法。
  45. ノロウイルスまたはサポウイルスの少なくとも２種のウイルス株に由来するキャプシドタンパク質を含むモザイクＶＬＰが構築する、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記宿主細胞が酵母または昆虫細胞である、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記発現ベクターがアルファウイルスベクターである、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 被験体における免疫応答を誘発する方法であって、請求項９〜３８のいずれか１項に記載の組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
  49. 前記組成物が局所、非経口または粘膜投与される、請求項４８に記載の方法。
  50. ａ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第一の免疫原性組成物を粘膜投与する工程；および
    ｂ）１種以上のノロウイルスまたはサポウイルス抗原を含む第二の免疫原性組成物を局所または非経口投与する工程
    を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記第一の免疫原性組成物および前記第二の免疫原性組成物が同一である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記第一の免疫原性組成物および前記第二の免疫原性組成物が異なる、請求項５０に記載の方法。
  53. 少なくとも１つの工程が２回以上実施される、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記粘膜投与が、鼻腔内、経口、直腸内または膣内投与である、請求項５０に記載の方法。
  55. 前記非経口投与が経皮投与である、請求項５０に記載の方法。
  56. ノロウイルスまたはサポウイルス感染症を治療するための治療有効量が前記被験体に投与される、請求項４８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 下痢性疾患を引き起こす病原体による感染症を治療するための治療有効量が前記被験体に投与される、請求項４８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
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