CN103243115A - 一种诺如病毒多表位抗原基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种诺如病毒多表位抗原基因，该基因的碱基序列如SEQIDNO：7所示。具体地，该诺如病毒多表位抗原基因是由两个基因片段合成构建而成。本发明诺如病毒多表位抗原基因与原核表达载体连接并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后，可表达相应的目的蛋白，能够为诺如病毒检测试剂的开发提供材料，拓宽了诺如病毒检测的平台。

Description

一种诺如病毒多表位抗原基因

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，尤其涉及一种诺如病毒多表位抗原基因。

背景技术

诺如病毒首先由美国学者Kapikin于1972年采用免疫电镜方法，从1968年发生在美国俄亥俄州诺瓦克地区的一所学校暴发的胃肠炎病人粪便标本中检出，并以发现地名称将其命名为诺瓦克样病毒( Norwalk-like virus, NLVs)。2002年国际病毒学命名委员会将其正式命名为诺如病毒(Norovirus，NoV)。

诺如病毒是全球范围内引起人类急性胃肠炎的最重要的病原之一，可导致严重的公共卫生问题，不仅因为它的影响范围广，而且因为高度变异，具有传染性和抵抗力的新变异的重组株的出现，而导致全球的流行。我国各地区监测数据表明，诺如病毒已是引起急性胃肠炎暴发或散发的主要病原之一，GII/4型变异株是流行优势株；而发达国家42%~90%的非菌性腹泻爆发与诺如病毒有关，因而开展对诺如病毒的研究，特别是诺如病毒疫苗和快速诊断方法的研制是迫切需要的。

诺如病毒直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称，基因组为单股正链RNA，全长约7.3～7.7kb，GC含量48%，包括3个开放式阅读框 (open reading frames,ORF)、3’端非编码区以及poly A区。其中ORF2编码的衣壳蛋白为NoV抗原主要决定簇，同时负责与受体结合，近年来已成为NoV研究的热点。根据诺如病毒RNA多聚酶区和衣壳区的核苷酸序列，可将诺如病毒分为5个基因组: GI，GII，GIII，GIV，GV。另外，根据ORF2全基因序列，GI可分为14个基因型，GII可分为17个基因型。

目前对诺如病毒的研究，大多采用ORF2所编码的衣壳蛋白，制备单克隆抗体，再通过ELISA等方法进行检测，该方法无法同时确定多个型别的样品；由于诺如病毒变异性强，基因型多，而利用单一抗原制备的抗体只能检测到其同源病毒株及与其非常相近的病毒株，这限制了其在检测中的应用。表位生物学是目前研究的一个新方向，在HIV、HCV、疟原虫等病原生物多表位基因的表达研究已经取得突破性进展。目前，对诺如病毒多表位抗原基因的研究还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种诺如病毒多表位抗原基因，能够为诺如病毒检测试剂的开发提供材料，拓宽了诺如病毒检测的平台。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种诺如病毒多表位抗原基因，该基因的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

具体地，该诺如病毒多表位抗原基因是由两个基因片段（为了方便阐述，本申请人将该诺如病毒多表位抗原基因命名为novme，并将两个基因片段根据其在诺如病毒多表位抗原基因中所处的前后位置分别命名为前段基因A、后段基因B）合成构建而成。

本发明的有益效果在于：提供一种诺如病毒多表位抗原基因，该基因与原核表达载体连接并转化相应菌株后，可表达相应的目的蛋白，能够为诺如病毒检测试剂的开发提供材料，拓宽了诺如病毒检测的平台。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1是本发明中重组表达质粒pET-novme的构建流程图。

图2是本发明中重组表达质粒pET-novme的双酶切鉴定图。

图3是本发明中重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳图。

图4是本发明中重组蛋白表达产物的Western blotting分析图。

具体实施方式

本发明提供一种诺如病毒多表位抗原基因，其碱基序列如SEQ ID NO：7所示，该诺如病毒多表位抗原基因是由两个基因片段合成构建而成的，为了方便阐述，本申请人将该诺如病毒多表位抗原基因命名为novme，并将两个基因片段根据其在诺如病毒多表位抗原基因中所处的前后位置分别命名为前段基因A、后段基因B，且该诺如病毒多表位抗原基因（novme）的具体构建过程如下所述。

实施例一 诺如病毒多表位抗原基因（novme）的构建

1、novme前段基因A的氨基酸序列的确定

从已报道诺如病毒各表位中筛选出3条B细胞表位，该3条B细胞表位分别记载于如下文献中：牛诺如病毒基因型1和基因型2抗原性不同但与人诺如病毒表位有交叉反应，临床微生物学杂志，2006，44:992-998（Oliver SL, Batten CA, Deng Y, et al. Genotype 1 and genotype 2 bovine noroviruses are antigenically distinct but share a cross-reactive epitope with human noroviruses[J]. Journal of clinical Microbiology, 2006, 44: 992-998）；诺如病毒单克隆抗体特异性研究，临床微生物学杂志，2003，41:2367-2371（Yoda T, Suzuki Y, Terano Y, et al. Precise characterization of norovirus (Norwalk-like virus)-specific monoclonal antibodies with broad reactivity[J]. Journal of clinical Microbiology , 2003, 41: 2367-2371）；人诺如病毒1型和牛诺如病毒3型衣壳蛋白线性表位的交叉反应研究，病毒学，2006，356:179-187（Carrie, Ian NC, Sarah LK, et al.  Characterization of a cross-reactive linear epitope in human genogroupⅠand bovine genogroupⅢ norovirus capsid proteins[J]. Virology, 2006, 356: 179-187）。为了方便阐述及区别，申请人将这3条B细胞表位分别命名为B细胞表位-Ⅰ、B细胞表位-Ⅱ、及B细胞表位-Ⅲ ；其中，B细胞表位-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，B细胞表位-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，B细胞表位- Ⅲ的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；之后采用甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸为接头将B细胞表位-Ⅰ、B细胞表位-Ⅱ及B细胞表位- Ⅲ依次串联起来以获取novme前段基因A的氨基酸序列（具体如SEQ ID NO：4所示），而采用甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸为接头是为了维持各细胞表位独立的空间构象。

2、 novme前段基因A核苷酸序列的确定

依据以上novme前段基因A的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，前面加保护碱基CG、BamHI酶切位点GGATCC和起始密码子ATG，后面加HindⅢ酶切位点AAGCTT和保护碱基GGG，从而获得novme前段基因A核苷酸序列（如SEQ ID NO：5所示）。

3、novme前段基因A的合成、克隆与测序鉴定

将以上novme前段基因A核苷酸序列交由宝生物工程（大连）有限公司一次性合成，并与pMD19-T simple载体（购自宝生物工程（大连）有限公司）连接，经菌落PCR、酶切和序列测定证实合成的基因片段（即novme前段基因A）与原始设计序列完全一致。

4、 novme后段基因B的确定

依据NCBI中已报导诺如病毒的ORF2序列信息，并运用表位预测服务器ABCpred、ProPred-I和Propred进行表位预测，以预测各段基因所含的B细胞表位、CTL细胞表位和Th细胞表位，得知含B细胞表位3条、CTL细胞表位3条及Th细胞表位2条的基因片段，并在该基因片段前面加保护碱基CCC、HindⅢ酶切位点AAGCTT，后面加XhoI酶切位点CTCGAG和保护碱基CCG，交由宝生物工程（大连）有限公司合成以获得novme后段基因B（该novme后段基因B的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示）。

5、重组表达质粒pET-novme的构建

将novme前段基因A用BamHI、HindIII双酶切，电泳后回收；将novme后段基因B用HindIII、XhoI双酶切，电泳后回收；将pET-32a表达质粒（购自北京天恩泽生物技术有限公司）用BamHI、XhoI双酶切，电泳后回收；在T4 DNA Ligase 和T4 DNA Ligase 10×buffer连接体系中，取电泳回收后的novme前段基因A、novme后段基因B及pET-32a表达质粒且三者摩尔比为1:1:1，并于16℃下连接3h，之后将产物转化TOP10感受态细胞，挑取单菌落提取质粒，酶切鉴定，并将其中阳性菌株进行测序鉴定，测序鉴定结果表明，novme基因全长438bp，其核苷酸序列及相应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

实施例二 含复合基因的重组表达载体的工程菌的诱导表达

将鉴定好的重组表达质粒pET-novme转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自天根生化科技(北京)有限公司）感受态细胞，并将pET-32a表达质粒同样转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞；接种转化有重组表达质粒pET-novme的单菌落（命名为pET-novme/BL21）及转化有pET-32a表达质粒的单菌落（命名为pET-32a/BL21）于5mL LB液体培养基（5mL含5μL 100mg/mL的氨苄青霉素）中，37℃、150rpm振荡培养过夜，次日以1:100的比例接种于100mL 上述LB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6左右，取1mL作未诱导对照，并在剩余液体培养基中加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度为1mM，30℃、150rpm振荡培养6h；振荡培养6h结束后于室温、转速为5000g条件下离心10min并弃上清液、收集菌体，将收集到的菌体置于-20℃下保存。取所保存的菌体进行SDS-PAGE分析，分析结果见图3，结果显示复合基因（即novme）在原核表达后得到分子量约34KD的融合表达产物，表达量占全菌总蛋白的35%，而只含空载体质粒对照菌并无此条带（图3中的“1”是空载体质粒对照菌所做的SDS-PAGE），并且融合表达产物多存在于破壁后的上清中。

其中，LB液体培养基为常规培养基，其配方为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L。

实施例三 融合蛋白His-NOVME的亲和层析纯化

取20mL实施例二诱导表达后所获得的培养物，于室温、转速为5000g条件下离心10min并收集菌体，弃去上清，在沉淀中加入1mL冰浴结合液（20mM/L 1MTris-HCl pH7.9；10mM/L 1M咪唑；500mM/L 5M NaCl），再加25μL PMSF（10mg/mL）溶液，冰上超声5min，超声条件为脉冲超声的工作时间3s和间歇时间2s；超声结束后于温度4℃、转速13000g条件下离心10min，收集上清液过Ni柱，4℃过夜；之后用2mL同上所述结合液洗柱一次，用1mL新鲜配制的300mM洗脱液（20mM/L 1MTris-HCl pH7.9；300mM/L 1M咪唑；500mM/L 5M NaCl）洗柱，收集并保存穿透液（含His即组氨酸标记蛋白），从而除去其他杂蛋白。

实施例四 复合基因表达产物的Western blotting分析

对复合基因表达产物进行Western blotting分析，具体地：取实施例二中置于-20℃下保存的菌体依次进行SDS-PAGE分析、转印，转印后的PVDF膜用TBS（即Tris-HCl缓冲盐溶液）从下向上浸湿后，转至含Western blot膜封闭液（购自天根生化科技（北京）有限公司）的平皿中，并将平皿置于室温50rpm振摇1h，之后与一抗（即将抗组氨酸抗体用PBS溶液按1:500体积比稀释）4℃孵育过夜；接着用TBST溶液于室温洗膜3次，每次10min；与二抗（即将羊抗鼠IgG-HRP用PBS溶液按1:500体积比稀释）室温孵育1h；用TBST溶液于室温洗膜3次，每次10min；用现配的HRP-DAB底物显色液显色，加双蒸水终止反应。Western blotting分析图如图4所示，通过图4表明多表位基因所表达的产物能被抗组氨酸抗体所特异识别。

综上，本发明采用化学合成基因、限制性内切酶酶切和连接酶连接基因片段相结合的方法，并分为前端基因A、后段基因B两段分别进行合成以构建诺如病毒多表位抗原基因，且有利于抗原表位独立呈现；通过novme与原核表达载体连接并转化相应菌株后，可表达novme编码的蛋白NOVME，该目的蛋白的末端带有His标签，有利于目的蛋白的分离纯化，可为诺如病毒检测试剂的开发提供材料。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  集美大学

 

<120>  一种诺如病毒多表位抗原基因

 

<130>  专利说明书

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  9

<212>  PRT

<213>  Norovirus

 

<400>  1

 

Pro Thr Ala Gly Ala Gln Ile Ala Ala

1               5                   

 

 

<210>  2

<211>  11

<212>  PRT

<213>  Norovirus

 

<400>  2

 

Gln Gln Asn Ile Ile Asp Pro Trp Ile Met Asn

1               5                   10     

 

 

<210>  3

<211>  6

<212>  PRT

<213>  Norovirus

 

<400>  3

 

Leu Glu Asp Val Arg Asn

1               5      

 

 

<210>  4

<211>  34

<212>  PRT

<213>  Norovirus

 

<400>  4

 

Pro Thr Ala Gly Ala Gln Ile Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gln Gln Asn

1               5                   10                  15     

 

 

Ile Ile Asp Pro Trp Ile Met Asn Gly Gly Gly Ser Leu Glu Asp Val

            20                  25                  30         

 

 

Arg Asn

       

 

 

<210>  5

<211>  125

<212>  DNA

<213>  Norovirus

 

<400>  5

cgggatccat gccgaccgcg ggcgcgcaga ttgcggcggg cggcggcagc cagcagaaca     60

 

ttattgatcc gtggattatg aacggcggcg gcagcctgga agatgtgcgc aacttaaagc    120

 

ttggg                                                                125

 

 

<210>  6

<211>  343

<212>  DNA

<213>  Norovirus

 

<400>  6

cccaagcttt ccagaatgta caatggttat gcaggtggtt ttgaagtgca ggtaatcctc     60

 

gcggggaacg cgttcaccgc cgggaaaatc atatttgcag cagtcccacc aaatttccca    120

 

actgaaggtt tgagccccag ccaggtcact atgttccccc acataatagt agatgtcagg    180

 

caattggaac ctgtgttgat tcccttaccc gatgttagaa ataatttcta ccattataat    240

 

caatcaaatg accccactat taaattgata gcaatgttgt acacaccact tagggctaat    300

 

aatgccgggg atgatgtctt cacagtctct tgaactcgag cgg                      343

 

 

<210>  7

<211>  438

<212>  DNA

<213>  Norovirus

 

<400>  7

atgccgaccg cgggcgcgca gattgcggcg ggcggcggca gccagcagaa cattattgat     60

 

ccgtggatta tgaacggcgg cggcagcctg gaagatgtgc gcaacttaaa gctttccaga    120

 

atgtacaatg gttatgcagg tggttttgaa gtgcaggtaa tcctcgcggg gaacgcgttc    180

 

accgccggga aaatcatatt tgcagcagtc ccaccaaatt tcccaactga aggtttgagc    240

 

cccagccagg tcactatgtt cccccacata atagtagatg tcaggcaatt ggaacctgtg    300

 

ttgattccct tacccgatgt tagaaataat ttctaccatt ataatcaatc aaatgacccc    360

 

actattaaat tgatagcaat gttgtacaca ccacttaggg ctaataatgc cggggatgat    420

 

gtcttcacag tctcttga                                                  438

 

 

<210>  8

<211>  145

<212>  PRT

<213>  Norovirus

 

<400>  8

 

Met Pro Thr Ala Gly Ala Gln Ile Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gln Gln

1               5                   10                  15     

 

 

Asn Ile Ile Asp Pro Trp Ile Met Asn Gly Gly Gly Ser Leu Glu Asp

            20                  25                  30         

 

 

Val Arg Asn Leu Lys Leu Ser Arg Met Tyr Asn Gly Tyr Ala Gly Gly

        35                  40                  45             

 

 

Phe Glu Val Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Ile Ile Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe Pro Thr Glu Gly Leu Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Pro Ser Gln Val Thr Met Phe Pro His Ile Ile Val Asp Val Arg Gln

                85                  90                  95     

 

 

Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp Val Arg Asn Asn Phe Tyr

            100                 105                 110        

 

 

His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile Lys Leu Ile Ala Met Leu

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly Asp Asp Val Phe Thr Val

    130                 135                 140                

 

 

Ser

145

 

 

Claims (1)

1.一种诺如病毒多表位抗原基因，其特征在于：该基因的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。

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