CN105713087A - 人乳头瘤病毒58型单克隆抗体及其应用 - Google Patents
人乳头瘤病毒58型单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了人乳头瘤病毒58型(HPV58)特异性的单克隆抗体。本发明提供的特异性单克隆抗体与其它型别HPV无明显交叉反应,用于检测具有高特异性、高敏感性的优点,可以准确检测疫苗种中HPV58型有生物活性疫苗的含量,在临床检测和疫苗生产过程中将会得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域,具体而言,本发明涉及人乳头瘤病毒58型杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体以及编码它们的序列,和它们进行诊断、预防和治疗的应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是无包膜的双链小DNA病毒,主要侵及人的上皮组织,进而诱发各种良、恶性增生病变。高危型HPV感染与多种恶性肿瘤的发生相关,低危型的HPV感染则引起肛门和生殖疣。HPV感染的流行范围广,所引发的相关致死性的恶性肿瘤和多种性传播疾病对人类健康具有严重的危害性,开发安全有效的预防或治疗性疫苗具有重大意义。
HPV病毒颗粒直径为55~60nm,核衣壳呈20面体对称,由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体及次要衣壳蛋白L2组成。大量研究证实,HPVL1蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPVL1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-L1keParticle,VLP)。重组HPVL1-VLP疫苗已经成功上市并用于预防HPV感染及由此导致的宫颈癌、尖锐湿疣等疾病,并充分证明了L1-VLP具有与野生同型病毒相同的抗原性和免疫原性,其结构与天然HPV高度相似,保留了天然病毒的绝大多数中和表位,可诱导高滴度的中和抗体。
国家食品药品监督管理局(CFDA)在《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》中指出:“在生产工艺的各个环节和步骤中的产品均应建立相应的监控标准,以便后续工艺的进行,保证产品的质量、工艺的稳定性”,同时要求“在半成品和成品阶段的质量控制至少包括鉴别试验”
在HPV疫苗研发过程中,需要开展四个方面的测定,即型别鉴定实验、抗原含量检测和体外效力测定。其方法均可以采用双抗体夹心法ELISA。因此,在疫苗研究中,单克隆抗体是疫苗抗原质控的重要工具,尤其是具有特异性和中和活性的抗体在疫苗研发中具有不可替代的作用。
目前国外已上市的人乳头瘤病毒疫苗主要有三种,分别是:2006年首次上市的由16、18、6和11型人乳头瘤病毒L1重组蛋白构成的四价疫苗(Gardasil),2007年首次上市的由16和18型乳头瘤病毒L1重组蛋白构成的二价疫苗(Cervarix),以及2014年12月首次上市的由6、11、16、18、31、33、45、52和58型人乳头瘤病毒L1重组蛋白构成的九价疫苗(Gardasil9)。本发明提供了最多可针对九价范围内HPV58的特异性和中和活性的单克隆抗体,利用其中的两株制备的ELISA检测试剂盒,可以特异性地用于快速鉴别并定量HPV58L1蛋白,可以广泛应用于临床检测和目前疫苗厂家生产疫苗过程中的质检,对女性的健康发展和公共卫生防控将具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供能够识别HPV58的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测HPV58的双抗体夹心ELISA试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供单克隆抗体的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供HPV的抗原检测试剂盒的制备方法。
本发明实验目的是通过如下技术方案实现:
本发明提供的单克隆抗体,其是以HPV58L1五聚体蛋白作为免疫原,制备获得。具体地说是HPV58L1五聚体蛋白作为免疫原免疫小鼠,采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗HPV58L1的杂交瘤细胞株,由各细胞株分泌得到单克隆抗体。
在一个优选的实施方案中识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体,由杂交瘤细胞株2F7产生,其保藏编号:CGMCCNo.11295;分类命名:杂交瘤细胞;保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期:2015年10月30日。
本发明公开的单克隆抗体2F7,包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链可变区,并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和CDRL3,其中:
CDRL1包括SEQIDNO:1;
CDRL2包括SEQIDNO:2;
CDRL3包括SEQIDNO:3。
抗体重链可变区具有选自CDRH1、CDRH2或/和CDRH3,其中:
CDRH1包括SEQIDNO:4;
CDRH2包括SEQIDNO:5;
CDRH3包括SEQIDNO:6。
在一个优选的实施方案中人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段,包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQIDNO:7和至少1个抗体重链可变区包括SEQIDNO:8。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种分离的核酸,该核酸编码本发明抗体的至少一个轻链可变区SEQIDNO:7和重链可变区SEQIDNO:8。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种核酸的表达载体,该载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种表达载体的宿主细胞。
在一个优选的实施方案中本发明提供另一种人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体,其特征在于该单克隆抗体由杂交瘤细胞株2G7产生,其保藏编号:CGMCCNo.11296;分类命名:杂交瘤细胞;保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期:2015年10月30日。
由杂交瘤细胞株2G7产生的单克隆抗体,包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链可变区,并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和CDRL3,其中:
CDRL1包括SEQIDNO:9;
CDRL2包括SEQIDNO:10;
CDRL3包括SEQIDNO:11。
由杂交瘤细胞株2G7产生的单克隆抗体的重链可变区具有选自CDRH1、CDRH2或/和CDRH3,其中:
CDRH1包括SEQIDNO:12;
CDRH2包括SEQIDNO:13;
CDRH3包括SEQIDNO:14。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段,其特征在于其中包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQIDNO:15和至少1个抗体重链可变区包括SEQIDNO:16。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种分离的核酸,其编码本发明抗体的至少一个轻链可变区SEQIDNO:15和重链可变区SEQIDNO:16。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种核酸的表达载体,其载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
在一个优选的实施方案中本发明提供一种包括表达载体的宿主细胞。
另一方面本发明提供一种检测HPV58L1的试剂盒,包括本发明公开的单克隆抗体或抗原结合片段。
本发明公开的检测HPV58L1的试剂盒,还包括可检测的标记:放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质和/或酶。
另一方面本发明提供一种检测一种特异性检测人乳头瘤病毒58型L1蛋白的组合物,该组合物包含本发明的单克隆抗体或抗原结合片段。
人乳头瘤病毒58型的单克隆抗体可按如下方法制备:
1)利用的人乳头瘤病毒58型L1蛋白的五聚体作为免疫原,纯化后免疫Balb/c小鼠,并采血,用间接ELISA方法检测血清效价,选择血清效价高的Balb/c小鼠进行加强免疫,并从该小鼠体内制备得到免疫脾细胞;
2)制备骨髓瘤细胞(SP2/0)悬浮液并注射Balb/c小鼠,待小鼠长出实体瘤后制备骨髓瘤细胞,将骨髓瘤细胞与步骤1)所述的免疫脾细胞进行融合,制备出杂交瘤细脆,检测筛选效价高的杂交瘤细胞株并进行克隆扩大培养;
3)将步骤2)所述的建株后的杂交瘤细胞扩大培养,收集上清液后腹腔注射小鼠,收集小鼠腹水,纯化后经特异性鉴定和中和活性检测即得到人乳头瘤病毒58型的单克隆抗体。
人乳头瘤病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的制备方法:
以具备中和活性的特异性单克隆抗体2G7作为捕获抗体包被酶标板,以具备中和活性的特异性单克隆抗体2F7经过辣根过氧化物酶标记后作为检测抗体,以重组人乳头瘤病毒-58型VLP蛋白作为标准品配制标准曲线对照。该试剂盒还包括浓缩洗涤液,样品稀释液干粉,酶标抗体稀释液干粉,底物液A,底物液B和终止液等。其中所述的浓缩洗涤液,底物液A,底物液B,终止液的组分及配比如下:
浓缩洗涤液:Nacl8.18g,Na2HP04·12H2O3.58g,KCL0.2g,KH2PO40.25g,加双蒸水至1000mL;
底物液A:3,3’,5’,5-四甲基联苯二胺200mg,无水乙醇100mL,加双蒸水至1000mL;
底物液B:Na2HPO414.6g,柠檬酸9.3g,0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL,加双蒸水至1000mL,调节pH至5.0~5.4;
终止液:1mol/L硫酸溶液。
另一方面本发明提供一种试剂盒在制备预防或检测人乳头瘤病毒58型L1感染的检测组合物中的应用。
另一方面本发明提供一种组合物在制备预防或检测人乳头瘤病毒58型L1感染的检测组合物中的应用。
本发明获得的单克隆抗体具有良好的特异性,实验表明,与HPV其它八个型别均没有交叉反应,在目前已经上市的疫苗产品,九价是最多型别的产品,间接ELISA表明这些抗体同时具有较高的效价,因此本发明获得的单克隆抗体可用于二价、三价或四价,目前最新上市的九价疫苗以及包括HPV58型别的疫苗或组合物中关于HPV58蛋白的特异检测。
本发明采用双抗夹心法,利用两个单克隆抗体对HPV58进行特异检测和定量,既能检测HPV58的五聚体,也能检测HPV58VLP,从而,本发明提供一种用于HPV58特异检测和定量的试剂盒,其检测限:0.03ug/ml,线性范围:10-0.1ug/ml,用于检测具有高特异性、高敏感性的优点,可以准确检测样品中具有生物活性的HPV58的水平,在临床检测和疫苗厂家生产疫苗过程中的质检将会得到广泛应用。
附图说明
附图1:SDS-PAGE分析检测结果,检测显示,经纯化的各亚型单克隆抗体的纯度均达到95%以上。
附图2:ELISA双抗体夹心法检测HPV58L1VLP标准曲线,纵坐标为OD450.的对数值,横坐标为HPV58L1VLP浓度的对数值。
具体实施方法
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中未注明来源的试剂均为本领域常规试剂或市售可得的试剂。
实施例1、杂交瘤细胞系的建立
1、动物免疫
1)抗原制备:利用大肠杆菌表达系统,制备HPV58型的L1蛋白的五聚体蛋白,透射电镜观察(100,000倍),结果显示,视野中可见直径为10nm左右的五聚体,将五聚体蛋白稀释至10μg/ml。
2)基础免疫:将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化,分点皮下注射,每只Balb/c小鼠每次注射量为10μg。
3)加强免疫:加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天,经腹腔注射含15ug抗原的生理盐水溶液。
2、杂交瘤细胞的制备
按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养,融合后10~15天,取上清采用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下:用200ng/孔的HPV58VLP包板,用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照,无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照,每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG100μl,最后测定450nmOD值。凡OD450值大于阴性对照2倍以上者,即可初步判定为阳性克隆。
3、杂交瘤细胞系的建立
将步骤2获得的阳性克隆继续克隆化,将上述杂交瘤细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代,培养到10代后,杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代,获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
实施例2抗HPV58的单克隆抗体的制备
选择成年BALB/c小鼠,腹腔接种降植烷,每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞,每只小鼠1×106-2×106个。间隔5天后,待腹部明显膨大,以手触摸时,皮肤有紧张感,即可用16号针头采集腹水。
将腹水离心(13000r/min30分钟),除去细胞成分和其他的沉淀物,收集上清。用ProteinG~SepharoseCL-4B进行纯化,上柱液为20mM的PBS缓冲液,柱层析洗脱液为:pH2.7,20mM的甘氨酸缓冲液,得到抗HPV58的单克隆抗体。SDS-PAGE检测显示,经纯化的单克隆抗体的纯度均达到95%以上,具体见附图1。
实施例3:抗体的亚型鉴定
采用间接ELISA法,使用抗小鼠各种IgG亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗体的IgG亚型。
结果表明,15株克隆,2F7克隆为IgG2b,其余均为IgG1,结果见表1。
表1ELISA鉴定抗体亚型(OD450值*)
*:所有数值均为复孔的平均值
实施例4:ELISA检测抗体与HPV58VLP反应性
通过间接法ELISA验证纯化抗体能否可以方便、快速的检测HPV58,并且通过使用不同浓度的抗体,可以初步判断抗体的亲和力。
将HPV58VLP以200ng/孔包被于96孔板,然后以1ug/ml、0.2ug/ml和0.04ug/ml的抗体使用浓度添加到各个孔里,通过ELISA检测各个单克隆纯化抗体与HPV58VLP的结合强度。结果表明,15株抗体,均能与HPV58VLP结合,其中,1D2、2E11、2F11、2F7、2F9和2G7在0.005ug/ml时信号值大于1,可以初步判定为强结合。结果见表2。
表2ELISA检测抗体与HPV58VLP结合强度
*:所有数值均为复孔的平均值
实施例5:抗体的特异性鉴定
HPV-16L1VLP、HPV-18L1VLP和HPV-58L1VLP通过碱变性和热变性处理,使之二级或三级结构破坏,一级结构保存。再与单克隆抗体进行反应,采用间接法ELISA对其进行检测。通过本实验,不仅可以鉴定抗体对HPV-16L1VLP、HPV-18L1VLP和HPV-58L1VLP三种VLP的识别情况,还能鉴定该抗体是否是构象型识别抗体。若蛋白质变性后与单抗反应的OD450值明显降低,则证明该单抗为构象型识别抗体。
实验步骤:VLP变性蛋白处理:0.2M碳酸钠,0.01MDTT,pH10.6室温孵育30分钟后煮沸5分钟。包被:将VLP蛋白稀释至2μg/ml。以100μl/孔加至96孔酶标板,4℃包被过夜。封闭:将包被好酶标板甩干。以300μl/孔封闭液(2%BSA)加至板内,室温放置1-2小时。样品稀释:用样品稀释液将抗体样品分别稀释至0.3μg/ml,混匀,100μl/孔加至酶标板内,室温放置1h。加二抗:将封闭后酶标板甩干,HRP标记羊抗鼠二抗以1:4000浓度,100μl/孔加至酶标板内,室温放置1h。显色:每孔300μl洗板5次,甩干。用卫生纸擦拭底部。以100μl/孔加入显色液,室温避光显色10分钟。终止:以100μl/孔加入终止液,终止反应。读数:将酶标板放入酶标仪中,OD450进行读数和数据分析。
抗体的特异性检测结果如表3所示。结果表明,克隆1A4与HPV18VLP有交叉反应,克隆2F12与HPV16VLP有交叉反应,其它13株克隆均为HPV58VLP特异的克隆。所有克隆识别变性HPV58VLP的数值均小于0.2,为阴性结果,而这些克隆识别未变性HPV58VLP的数值均为阳性,并且大于识别变性HPV58VLP的数值至少2倍,表明这些单抗均为构象型识别单抗。
表3抗体的特异性ELISA检测(OD450.数值*)
*所有数值均为复孔的平均值L:未变性蛋白D:变性处理蛋白
实施例6:抗体的中和活性检测
通过假病毒-细胞中和模型,检测各株抗体的中和活性能力。
先将各亚型抗体用PBS稀释成200ug/ml,然后将抗体进行4倍比梯度稀释,取50ul各浓度抗体与50ul合适浓度的HPV58假病毒在96孔板中4℃孵育一小时,以假病毒和PBS的混合液为对照。然后将各混合液分别加入预先铺有293FT细胞的96孔板中在细胞培养箱中培养72小时。之后收集细胞,用流式细胞术检测荧光,计算荧光抑制率,荧光抑制率=(1-实验组/对照组)×100%。将荧光抑制率大于50%和90%分别作为该单抗对HPV58假病毒的中和滴度。表4结果表明,所有克隆均有一定的抑制反应,本发明的这些单抗均有中和活性。
表4各亚型抗体的抑制率滴度
实施例7:抗体2F7和抗体2G7的亲和力鉴定
使用BIACORE3000(GE)生物传感器分析了抗原抗体结合及解离的动力学,计算了单克隆抗体2F7和2G7与HPV58VLP的结合常数Ka,解离常数Kd和亲和力KD,以反映该抗体与HPV58VLP的结合程度的强弱。
用pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液将HPV58VLP稀释至40μg/ml,按照制造商的说明书(BIACORE3000生物传感器,美国GE公司),将HPV58VLP偶联制芯片上,设置偶联水平为4000RU。
用PBS缓冲液分别稀释抗体至0.3125,0.625,1.25,2.5,5,10和20nmol/L。检测时,先抗体进样60秒,然后结合60秒,解离500秒,最后用10mM的pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液再生芯片。按照制造商的说明书进行抗原抗体结合的动力学分析,并且数据用Biacore3000Evaluation软件进行分析。抗体2F7、2G7与HPV58VLP的亲和力检测结果如表5所示。结果表明2F7、2G7抗体为特异性的,仅与HPV58VLP结合,与其它8种HPVVLP均不结合。
表5抗体2F7和抗体2G7的亲和力鉴定
aN/A:NotApplicable,表示不结合。
实施例8:克隆2F7和克隆2G7的可变区序列测定
将获得的2F7和2G7单克隆细胞分别提取mRNA,反转录为cDNA,使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增,将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定,并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。将获得的序列进行比对后未显示有相同序列,说明所获得的序列为特异的序列。
序列见序列表。
利用上述鉴定的序列,通过已知的抗体工程技术,可以制备各种基因工程抗体,例如嵌合抗体,人源化抗体,单链抗体,双抗体等,并保留其所源自的单克隆抗体的生物学特性。
实施例9:HPV58检测试剂盒的组装
以具备中和活性的特异性单克隆抗体2G7作为捕获抗体包被酶标板,以具备中和活性的特异性单克隆抗体2F7经过辣根过氧化物酶标记后作为检测抗体,以重组人乳头瘤病毒-58型VLP蛋白作为标准品配制标准曲线对照。
包被抗体2F7用pH9.60.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液稀释成10μg/mL,在酶标板的每孔加100μL,4℃下包被过夜,倾去包被液,用PBST洗涤2次,拍干,然后在每孔中加入200μL3%的小牛血清白蛋白(BSA),放入37℃恒温箱中封闭2小时后,用PBS洗涤1次,加入10%的蔗糖水溶液,室温保护1小时,拍干后经干燥后装铝箔袋抽真空后4℃保存。
用辣根过氧化物酶标记2G7的抗体,得2G7-HRP并保存。向酶标板中分别加入VLP样品100μL/孔,37℃孵育1.5小时,经洗板后再加入2G7-HRP(0.5ug/ml)100μL/,37℃孵育1小时,经洗涤拍干后加入显色剂进行显色,37℃温育10min,加入终止液50μL/孔,用酶标仪450nm波长进行读数。
该试剂盒还包括浓缩洗涤液,样品稀释液干粉,酶标抗体稀释液干粉,底物液A,底物液B和终止液等。其中所述的浓缩洗涤液,底物液A,底物液B,终止液的组分及配比如下:
浓缩洗涤液:Nacl8.18g,Na2HP04·12H2O3.58g,KCL0.2g,KH2PO40.25g,加双蒸水至1000mL;
底物液A:3,3’,5’,5-四甲基联苯二胺200mg,无水乙醇100mL,加双蒸水至1000mL;
底物液B:Na2HPO414.6g,柠檬酸9.3g,0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL,加双蒸水至1000mL,调节pH至5.0~5.4;
终止液:1mol/L硫酸溶液。
实施例10:HPV58检测试剂盒的线性与重复性检测
应用ELISA双抗体夹心法,克隆2F7和克隆2G7抗体做配对实验,确定以克隆2F7为包被抗体,用HRP标记克隆2G7作为检测抗体,确定了ELISA检测方法,试剂盒检测线性范围如表6。附图见图2,线性范围为0.1ug/ml-10ug/ml。
表6试剂盒线性范围检测
*所有数值均为复孔的平均值
将抗原依次按照10ug/ml、3ug/ml、1ug/ml、0.3ug/ml、0.1ug/ml进行稀释,按照上述ELASA实验操作步骤进行批间和批内重复性实验。每份样品批内和批间实验都重复检测10次,并计算标准偏差及变异系数。平均标准偏差为0.256,平均变异系数5.513%,说明本发明建立的双抗夹心ELASA抗原检测方法具有良好的重复性。
实施例11:HPV58检测试剂盒特异性试验
用上述建立的方法进行HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52和HPV58VLP的样品检测,VLP变性蛋白处理:0.2M碳酸钠,0.01MDTT,pH10.6室温孵育30分钟后煮沸5分钟。96孔板每孔检测30ug/mlVLP100ul。结果见表8,结果表明,该试剂盒检测未变性HPV58VLP信号良好,不识别变性的HPV58VLP,并且与其它型别HPVVLP无交叉。
以上结果表明,试剂盒可以用于特异的检测具有生物活性的HPV58VLP,因此,可以广泛应用于HPV58疫苗研发。
表7ELISA法检测HPV58VLP特异性评价结果(OD450)
*:所有数值均为复孔的平均值
实施例12:HPV58检测试剂盒的测定程序
1、配制样品
1)洗液配制:取出浓缩洗液,加入蒸馏水,定容至1L充分混匀备用;
2)样品稀释液配制:用1中所得洗液稀释样稀干粉至50ml,充分混匀备用;
3)酶标抗体稀释液配制:用1中所得洗液稀释酶稀干粉至50ml,充分混匀备用;
4)用配制好的样稀稀释标准品,设置稀释梯度。浓度分别为30ug/ml、10ug/ml、3ug/ml、1ug/ml、0.3ug/ml、0.1ug/ml、0.03ug/ml,备用。
5)用配制好的酶稀稀释酶标抗体,取适量酶标抗体1300倍稀释,备用。
2、测定步骤
1)加样:将配制好的标准品及待测样品加入包被板内,100ul/well,同时设置复孔及阴性对照孔。(阴性对照空为样品稀释液)盖上封板膜放入37℃温箱孵育45min。
2)加酶标抗体:将酶标板从37℃温箱取出,弃去孔内液体,加入洗液300ul/well,洗板5次。最后一次弃去孔内液体后在卫生纸上拍干。加入配制好的酶标抗体溶液100ul/well,盖上盖板膜放入37℃温箱孵育45min。
3)显色:将酶标板从37℃温箱取出,弃去孔内液体,加入洗液300ul/well,洗板10次。最后一次弃去孔内液体后在卫生纸上拍干。取所需体积的显色底物A液与显色底物B液按照1:1的比例混匀,100ul/well加入酶标板中,室温避光显色5分钟。
4)终止反应:取所需体积终止液加入酶标板中,50ul/well。
5)读值:将酶标板放入酶标仪中,OD450nm进行读数。
6)结果判定:Cutoff值=2.1×NC均值,高于此数值的样品检测结果判定为阳性。
实施例13:HPV58检测试剂盒的应用
取标准品HPV58VLP蛋白进行梯度稀释,采用本发明制备的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒对稀释后的样品HPV58、HPV58、HPV58的L110μg/ml五聚体抗原进行检测,借以评价该试剂盒的初步应用效果。结果显示,本发明所建立的ELISA方法可以检测到HPV58五聚体蛋白,并具有特异性。
表8ELISA法检测HPV58五聚体特异性评价结果(OD450)
SEQUENCELISTING
<110>北京康乐卫士生物技术股份有限公司
<120>人乳头瘤病毒58型单克隆抗体及其应用
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Arg
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ValIleTrpSerGlyGlySerThrAspTyrAsnAlaAlaPheIleSer
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<213>人工序列
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GlyGlyLeuArgTyrProLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrVal
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ThrValSerSer
115
Claims (19)
1.一种识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体,其特征在于该单克隆抗体由杂交瘤细胞株2F7产生,其CGMCC保藏号为11295。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于所述抗体包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链可变区,并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和CDRL3,其中:
CDRL1包括SEQIDNO:1;
CDRL2包括SEQIDNO:2;
CDRL3包括SEQIDNO:3。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体,其特征在于其中所述抗体重链可变区具有选自CDRH1、CDRH2或/和CDRH3,其中:
CDRH1包括SEQIDNO:4;
CDRH2包括SEQIDNO:5;
CDRH3包括SEQIDNO:6。
4.一种识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段,其特征在于其中包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQIDNO:7和至少1个抗体重链可变区包括SEQIDNO:8。
5.一种分离的核酸,其特征在于所述核酸编码本发明抗体的至少一个轻链可变区SEQIDNO:7和重链可变区SEQIDNO:8。
6.一种包括权利要求5所述核酸的表达载体,其特征在于载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
7.一种包括权利要求6表达载体的宿主细胞。
8.一种识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体,其特征在于该单克隆抗体由杂交瘤细胞株2G7产生,其CGMCC保藏号为11296。
9.如权利要求8所述的单克隆抗体,其特征在于所述抗体包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链可变区,并且其中所述抗体轻链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2或/和CDRL3,其中:
CDRL1包括SEQIDNO:9;
CDRL2包括SEQIDNO:10;
CDRL3包括SEQIDNO:11。
10.如权利要求9所述的单克隆抗体,其特征在于其中所述抗体重链可变区具有选自CDRH1、CDRH2或/和CDRH3,其中:
CDRH1包括SEQIDNO:12;
CDRH2包括SEQIDNO:13;
CDRH3包括SEQIDNO:14。
11.一种识别人乳头瘤病毒58型L1蛋白的单克隆抗体或抗原结合片段,其特征在于其中包含至少1个抗体轻链可变区包括SEQIDNO:15和至少1个抗体重链可变区包括SEQIDNO:16。
12.一种分离的核酸,其特征在于所述核酸编码本发明抗体的至少一个轻链可变区SEQIDNO:15和重链可变区SEQIDNO:16。
13.一种包括权利要求12所述核酸的表达载体,其特征在于载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。
14.一种包括权利要求13表达载体的宿主细胞。
15.一种检测HPV58L1的试剂盒,其包括任一权利要求1-4和/或任一权利要求8-11所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
16.如权利要求15所述的检测HPV58L1的试剂盒,还包括可检测的标记:放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质和/或酶。
17.一种特异性检测人乳头瘤病毒58型L1蛋白的组合物,其特征在于该组合物包含任一权利要求1-4和/或任一权利要求8-11所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
18.如权利要求15或16所述试剂盒在制备预防或检测人乳头瘤病毒58型L1感染的检测组合物中的应用。
19.如权利要求17所述组合物在制备预防或检测人乳头瘤病毒58型L1感染的检测组合物中的应用。
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