CN115991744A

CN115991744A - 人鼻病毒的通用亲和表位多肽、抗体及其用途

Info

Publication number: CN115991744A
Application number: CN202210860685.1A
Authority: CN
Inventors: 程通; 朱瑞; 杨宏伟; 徐龙发; 林雨; 周振弘; 叶祥忠; 夏宁邵
Original assignee: Xiamen University; Beijing WanTai Biological Pharmacy Enterprise Co Ltd
Current assignee: Xiamen University; Beijing WanTai Biological Pharmacy Enterprise Co Ltd
Priority date: 2021-07-26
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2023-04-21
Also published as: WO2023005805A1; EP4378951A1

Abstract

本发明属于免疫生物学领域，涉及一种表位多肽、如人鼻病毒的通用亲和表位多肽及其用途，还涉及一种可与上述表位多肽结合的抗体及其用途。本发明还涉及所述亲和表位多肽或所述抗体在制备治疗和/或预防和/或诊断人鼻病毒和/或鉴定人鼻病毒滴度和/或鉴定人鼻病毒中和抗体效价的药物或方法中的用途。本发明的亲和表位多肽和抗体可用于治疗和/或预防和/或诊断人鼻病毒和/或鉴定人鼻病毒滴度和/或鉴定人鼻病毒中和抗体效价的药物或方法中。

Description

人鼻病毒的通用亲和表位多肽、抗体及其用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是人鼻病毒的预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及可用于预防或治疗人鼻病毒感染的多肽，包含此类多肽以及载体蛋白的重组蛋白，以及此类多肽和重组蛋白的用途。本发明还涉及针对此类多肽的抗体，及其用于检测、预防和/或治疗人鼻病毒感染和/或由所述感染引起的疾病的用途。

背景技术

人鼻病毒(Human Rhinovirus，以下简称为HRV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)。HRV是目前感染人类病毒中血清型最多的一种。根据病毒的遗传学特征，HRV可以分为A、B和C三大组。根据国际病毒分类委员会(ICTV)最新发布的病毒分类报告(2019年版)，HRV-A包括HRV-A1、1B、2、7～13等80种血清型；HRV-B包括HRV-B3～6、14、17、26～27等30种血清型；HRV-C包括HRV-C1～51、54～57，共55种血清型。

HRV感染后患者通常表现为自限性的普通感冒症状，平均病程为一周左右。但近年来发现，HRV感染也可以引发细支气管炎、肺炎等下呼吸道感染，并与儿童急性喘息、哮喘恶化、持续咳嗽、呼吸困难以及成人慢性阻塞性肺病等严重的呼吸道疾病密切相关。此外，HRV还可与其他呼吸道病毒如冠状病毒产生合并感染，增加患者的疾病负担和重症风险(Li等人，2018.J Infect.76(3)：311-13；David等人，2020.JAMA.323(20)：2085-86)。除了混合病毒感染外，HRV还可合并细菌感染，导致中耳炎、鼻窦炎和咽炎等一系列疾病的发生(Chistopher等人，2017.Front Microbiol.8：2412)。HRV可感染各个年龄段人群，婴幼儿、老年人及免疫低下人群更易感染且病情相对严重。HRV感染后可获得一定的免疫力，但维持时间较短，且不同型别病毒之间几乎无交叉保护。

HRV病毒颗粒无包膜，外形近似圆形，直径约为27～30nm，其病毒结构主要包括外围的衣壳和内部的核酸。HRV病毒衣壳呈立体正二十面体对称，由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4按照一定的规律排列组成。其中VP1～3暴露于病毒衣壳的表面，VP4埋藏于病毒衣壳的内侧并与内部的核酸紧密相连。不同型别HRV的基因组结构相似，均为单股正义链RNA，全长约7200bp。HRV整个病毒基因组只包含一个开放阅读框(ORF)，5’端和3’端分别为非编码区(UTR)。病毒唯一的ORF可编码一个长度大约为2200个氨基酸的多聚蛋白，随后该蛋白被病毒编码的蛋白酶水解成3种前体蛋白P1、P2和P3。P1可进一步裂解为4个衣壳蛋白(VP4、VP2、VP1、VP3)，P2可裂解为3个非结构蛋白(2A、2B、2C)，P3可裂解为4个非结构蛋白(3A、3B、3C、3D)。2C蛋白是小RNA病毒中最保守的非结构蛋白之一，具有ATP酶活性，参与宿主细胞膜蛋白质的重排和病毒复制复合体的形成，以及参与了病毒逃避宿主先天免疫的过程(Oberste等人，2004.J Gen Virol.85：1597；Du等人，2015.Sci Rep.5：14302；Kevin等人，2020.PNAS.117(44):27598-607)。

HRV型别众多，不同血清型之间极少产生交叉免疫反应性，这给HRV感染的防治带来了极大困难。发现广谱亲和表位、获得具有广谱结合能力的抗体，并基于此开发针对HRV的通用检测方法以及有效的预防和治疗性药物(例如抗体、疫苗等)具有重大意义。

发明内容

本申请的发明人经过大量的研究，鉴定了人鼻病毒中的通用亲和表位多肽，所述表位多肽能诱导对至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型的人鼻病毒具有特异性结合活性的抗体，基于此，本申请还提供了包含此类表位多肽和载体蛋白的重组蛋白、针对所述表位多肽或重组蛋白的抗体、产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。

分离的多肽或其变体

因此在一方面，本申请提供了一种分离的多肽或其变体，所述多肽由人鼻病毒(HRV)2C蛋白的至少13个连续氨基酸残基组成，且包含所述蛋白的第151-163位氨基酸残基，并且，所述变体与其所源自的多肽相异仅在于1个或几个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，或7个)氨基酸残基的置换，且保留了其所源自的多肽的生物学功能(例如，诱导对至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型的HRV具有特异性结合活性的抗体)。

在某些实施方案中，所述多肽由HRV 2C蛋白的不多于100个(例如，不多于95个，不多于90个，不多于85个，不多于80个，不多于75个，不多于70个，不多于65个，不多于60个，不多于55个，不多于50个，不多于45个，不多于40个，不多于35个，或不多于30个)的连续氨基酸残基组成。

在某些实施方案中，所述多肽由HRV 2C蛋白的13～30个(例如13～25个，13～21个，13～17个，13～15个)连续氨基酸残基组成。

在某些实施方案中，所述变体在相应于HRV 2C蛋白的第156和/或159位的氨基酸位置中包含置换(例如保守置换)。

保守置换在本领域是公知的，包括但不限于如下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸,亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。

在某些实施方案中，所述多肽或其变体包含如YSLPPX₁PKX₂FDGY(SEQ ID NO:52)所示的结构；

其中，X₁选自：(i)氨基酸残基D，A，S，N和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；

X₂选自：(i)氨基酸残基Y，H和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基。

在某些实施方案中，所述HRV 2C蛋白具有如SEQ ID NO:9所示的序列或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述HRV 2C蛋白的第151-163位氨基酸残基如SEQ ID NOs:1、30-34任一项所示。

在某些实施方案中，所述多肽包含所述HRV 2C蛋白的第151-163位氨基酸残基、第149-165位氨基酸残基、第147-167位氨基酸残基、或第145-169位氨基酸残基，或由其组成。

在某些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NOs:1、30-37任一项所示的序列或由其组成。

特别地，可以将本发明的多肽或其变体与载体蛋白融合，以增强多肽或其变体的免疫原性，使得多肽或其变体能够被机体的免疫系统识别，并诱发机体的免疫应答。

因此，在另一方面，本申请提供了一种重组蛋白，其包含如上所述的分离的多肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段。

在某些实施方案中，所述多肽或其变体任选地通过连接体(例如刚性或柔性连接体，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)与载体蛋白相连接。

在某些实施方案中，所述载体蛋白选自CRM197蛋白或其片段、HBcAg或其片段、WHcAg或其片段、钥孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、卵清蛋白。

在某些实施方案中，所述载体蛋白是HBcAg或其片段，并且用所述多肽或其变体替换HBcAg的第79-80位氨基酸。在某些实施方案中，所述多肽或其变体与HBcAg或其片段通过连接体连接。在某些实施方案中，所述HBcAg的片段包含HBcAg的aa 1-149或由HBcAg的aa1-149组成，例如包含SEQ ID NO:4所示的序列。在某些实施方案中，所述重组蛋白具有如SEQ ID NO：5、44-51任一项所示的氨基酸序列。

在另一方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其包含编码如上所述的多肽或其变体或重组蛋白的核苷酸序列。

在另一方面，本申请提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。

在另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或如上所述的载体。

此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。

在另一方面，本申请提供了制备如上所述的多肽或其变体或者如上所述的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养如上所述的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述多肽或其变体或者重组蛋白。

可以理解，所述的多肽或其变体或者如上所述的重组蛋白可以通过上述方法制备得到，也可以通过人工化学合成的方式得到，或者，由本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。

在另一方面，本申请提供了病毒样颗粒(VLP)，在其表面上展示如上所述的分离的多肽或其变体。

在某些实施方案中，所述病毒样颗粒包含融合蛋白或由融合蛋白构成，所述融合蛋白包含如上所述的多肽或其变体，以及载体蛋白。在某些实施方案中，所述多肽或其变体与载体蛋白通过连接体连接。

在某些实施方案中，所述载体蛋白为HBcAg蛋白或其片段(例如，HBcAg的aa 1-149)。在某些实施方案中，用所述多肽或其变体替换HBcAg的第79-80位氨基酸。在某些实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：5、44-51任一项所示的氨基酸序列。

在另一方面，本申请提供了组合物，其包含如上所述的多肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或VLP。

在某些实施方案中，所述组合物是药物组合物或免疫原性组合物(例如疫苗)。

在某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含佐剂。用于共同施用或包含在根据本发明的免疫原性组合物中佐剂优选地应该是在人体中潜在安全、良好耐受和有效的佐剂。这样的佐剂是本领域技术人员熟知的。

在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种所述多肽或其变体，且这些多肽或其变体可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。

在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种所述重组蛋白。

在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种所述VLP。

如上所述的药物组合物或免疫原性组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的免疫原性组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

如上所述的药物组合物或免疫原性组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。

如上所述的药物组合物或免疫原性组合物应以足以诱导针对HRV的免疫应答的量施用。可根据待治疗或预防的特定疾病或病症、严重程度、对象的年龄以及特定对象的其他个人属性(例如，对象健康的一般状态和对象免疫系统的稳健性)来确定免疫原的合适的量。有效剂量的确定还通过动物模型研究引导，随后进行人体临床试验，并且通过显著降低对象中目标疾病症状或病症的发生或严重性的施用方案来指导。

在另一方面，本申请提供了如上所述的多肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或VLP在制备用于在受试者中诱导针对HRV的免疫应答和/或用于预防和/或治疗受试者的HRV感染或与HRV感染相关的疾病(例如呼吸道感染，例如肺炎、哮喘)的制剂中的用途。

在某些实施方案中，所述制剂是疫苗。

在另一方面，本申请提供了用于在受试者中诱导针对HRV的免疫应答和/或用于预防和/或治疗受试者的HRV感染或与HRV感染相关的疾病(例如呼吸道感染，例如肺炎、哮喘)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的如上所述的多肽或其变体、重组蛋白、VLP或组合物。在某些实施方案中，所述受试者是人。

对于预防性应用，如上所述的多肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或VLP或组合物在任何症状之前，例如在感染之前提供。预防性施用用于预防或改善任何后续感染，以在暴露或怀疑暴露于病毒之后或在实际开始感染之后减弱感染和/或相关疾病症状的预期严重性、持续时间或程度。因此，在一些实施方案中，待治疗的对象是患有HRV感染或有发生HRV感染风险的对象，例如由于暴露于或可能暴露于HRV。

对于治疗应用，如上所述的多肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或VLP或组合物在疾病或感染的症状发作时或之后，例如在HRV感染的症状发生之后或在诊断出HRV感染之后提供。

抗体及其结合片段

在一方面，本申请还提供了单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合如上所述的多肽或其变体、重组蛋白或VLP。

在某些实施方案中，所述单克隆抗体能够特异性结合HRV 2C蛋白的第151-163位氨基酸残基。

在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、鼠源抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体(例如，人鼠嵌合抗体)或双特异或多特异抗体。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：

(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:29，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或，

(b)下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：

(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在某些实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的CDR根据IMGT编号系统定义。

在某些实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。

在某些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

(a)如下3个重链CDRs：序列为SEQ ID NO：27的VH CDR1，序列为SEQ ID NO：28的VHCDR2，序列为SEQ ID NO：29的VH CDR3；和/或，如下3个轻链CDRs：序列为SEQ ID NO：24的VLCDR1，序列为SEQ ID NO：25的VL CDR2，序列为SEQ ID NO：26的VL CDR3；

或，

(b)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ IDNO:19所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。

在某些实施方案中，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。

在某些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：23所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：23所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：23所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：19所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：19所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：19所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:23所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:19所示的序列的VL。

在某些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段是人源化的。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。

在某些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于鼠或人免疫球蛋白的恒定区。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。

在另一方面，本申请提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其由杂交瘤细胞株9A5所产生，或是衍生自杂交瘤细胞株9A5，其中，杂交瘤细胞株9A5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO.C2021141。

在某些实施方案中，如上所述的抗体或其抗原结合片段特异性识别至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型的HRV。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15、HRV-C23中的一种或多种。

在某些实施方案中，病毒HRV-A1B的代表性毒株为B632(其GenBank登录号为D00239)。在某些实施方案中，病毒HRV-A2的代表性毒株为HGP(其GenBank登录号为AB079139)。在某些实施方案中，病毒HRV-A9的代表性毒株为211(其GenBank登录号为AB079146)。在某些实施方案中，病毒HRV-A16的代表性毒株为11757(其GenBank登录号为AB079152)。在某些实施方案中，病毒HRV-A21的代表性毒株为47(其GenBank登录号为AB079157)。在某些实施方案中，病毒HRV-A23的代表性毒株为5124(其GenBank登录号为AB079159)。在某些实施方案中，病毒HRV-A29的代表性毒株为5582(其GenBank登录号为AB079165)。在某些实施方案中，病毒HRV-A34的代表性毒株为137-3(其GenBank登录号为AB079170)。在某些实施方案中，病毒HRV-A36的代表性毒株为324H(其GenBank登录号为AB079172)。在某些实施方案中，病毒HRV-A40的代表性毒株为1794(其GenBank登录号为FJ445129)。在某些实施方案中，病毒HRV-A43的代表性毒株为58750(其GenBank登录号为FJ445131)。在某些实施方案中，病毒HRV-A49的代表性毒株为8213(其GenBank登录号为AB079185)。在某些实施方案中，病毒HRV-A54的代表性毒株为F01-3774(其GenBank登录号为AB079190)。在某些实施方案中，病毒HRV-A59的代表性毒株为611-CV35(其GenBank登录号为AB079195)。在某些实施方案中，病毒HRV-A77的代表性毒株为130-63(其GenBank登录号为FJ445154)。在某些实施方案中，病毒HRV-A78的代表性毒株为2030-65(其GenBank登录号为FJ445183)。在某些实施方案中，病毒HRV-A89的代表性毒株为41467(其GenBank登录号为M16248)。在某些实施方案中，病毒HRV-B5的代表性毒株为Norman(其GenBank登录号为AB079142)。在某些实施方案中，病毒HRV-B6的代表性毒株为Thompson(其GenBank登录号为AB079143)。在某些实施方案中，病毒HRV-B14的代表性毒株为1059(其GenBank登录号为EU870450)。在某些实施方案中，病毒HRV-B17的代表性毒株为33342(其GenBank登录号为EF173420)。在某些实施方案中，病毒HRV-C11的代表性毒株为SC1065(其GenBank登录号为KY369877)。在某些实施方案中，病毒HRV-C15的代表性毒株为W10(其GenBank登录号为GU219984)。在某些实施方案中，病毒HRV-C23的代表性毒株为8713-MY-10(其GenBank登录号为KJ675506)。

在另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

在另一方面，本申请提供了载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。

在另一方面，本申请提供了宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或如上所述的载体。

在另一方面，本申请提供了杂交瘤细胞株9A5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO.C2021141。

在另一方面，本申请提供了制备如上所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞或杂交瘤细胞，和从培养的宿主细胞或杂交瘤细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

在另一方面，本申请提供了缀合物，其包含如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记。

在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

在另一方面，本申请提供了试剂盒，其包括如上所述的抗体或其抗原结合片段或缀合物。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含如上所述的缀合物。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如鼠或人)的抗体是特异的。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如鼠或人的免疫球蛋白)抗体，例如抗IgG抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗鼠IgG抗体或抗人IgG抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

在另一方面，本申请还提供了用于检测HRV在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段或如上所述的缀合物。

在某些实施方案中，所述方法用于治疗目的，诊断目的，或者非治疗非诊断目的。例如，本发明方法可应用于受试者，以诊断，预防或治疗受试者中人鼻病毒所致的疾病。此外，本发明方法可应用于体外样品(例如细胞培养物，病毒培养物等等)，以确定鼻病毒在样品中的存在或其水平，或者鼻病毒中和抗体的存在或其效价。

在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

在某些实施方案中，所述HRV包含至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型。在某些实施方案中，所述HRV包含HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15、HRV-C23中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的缀合物。

在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在HRV或被HRV感染的细胞。

在另一方面，本申请提供了如上所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测HRV在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了HRV。

在某些实施方案中，所述检测试剂通过如上所述的方法来检测HRV在样品中的存在或其水平。

在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的体液样品(例如，呼吸道分泌物、全血、血浆、血清、唾液排泄物或尿液)。

在另一方面，本申请提供了用于检测HRV中和抗体的中和活性或筛选HRV中和抗体的方法，其包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段或如上所述的缀合物。

在某些实施方案中，所述方法包括：(i)将包含待测抗体的待测样品与HRV孵育；(ii)将步骤(i)的产物与细胞孵育；(iii)将所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物与步骤(ii)的细胞产物(例如经膜通透处理)孵育；(iv)测定由所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物标记的细胞数量，并由此确定待测抗体对HRV的中和活性。

在另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在另一方面，本申请提供了如上所述的抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或杂交瘤细胞用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者的HRV感染或与HRV感染相关的疾病(例如呼吸道感染，例如肺炎、哮喘)。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用。

在另一方面，本申请提供了用于预防和/或治疗受试者(例如人)的HRV感染或与HRV感染相关的疾病的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段或如上所述的药物组合物。

本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过静脉注射或推注给予。

有益效果

本发明提供了针对不同HRV型别的广谱亲和表位，以及针对此类表位的抗体。本发明的表位肽能诱导对至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型的人鼻病毒的特异性免疫应答；本发明的抗体对不同HRV型别具有广谱结合能力，可用于检测、预防和/或治疗人鼻病毒感染和/或由所述感染引起的疾病(例如呼吸道感染)。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，当提及HRV非结构蛋白2C的氨基酸位置时，参考HRV-C15病毒株(W10)的非结构蛋白2C的氨基酸序列(SEQ ID NO：9所示的序列)来进行描述。例如，表述“HRV非结构蛋白2C的第151-163位氨基酸残基(aa 151-163)”是指，SEQ ID NO：9所示的多肽的第151-163位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HRV非结构蛋白2C的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同型别HRV)，而不影响其生物学功能。例如，在鼻病毒的不同病毒株(例如，HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15或HRV-C23)中，非结构蛋白2C的氨基酸序列可天然存在差异(突变或变异)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HRV非结构蛋白2C”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：9所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述鼻病毒非结构蛋白2C的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：9的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“鼻病毒非结构蛋白2C的aa 151-163”包括，SEQ ID NO：9的第151-163位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

另外，根据HRV-C15病毒株的完整基因组(GU219984)可知，HRV非结构蛋白2C的aa151-163(例如，SEQ ID NO:1所示的序列)对应于由鼻病毒基因组翻译的氨基酸序列的aa1238-1250。因此，在本发明中，表述“HRV非结构蛋白2C的aa 151-163”与表述“由HRV基因组翻译的氨基酸序列的aa 1238-1250”具有等同含义，且可互换使用。

如本文中所使用的，术语“HBcAg”是指，乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：AAO63517.1)。当提及HBcAg的氨基酸位置时，参考SEQ ID NO：4所示的序列来进行描述。例如，表述“HBcAg的第1-149位氨基酸残基(aa 1-149)”是指，SEQ ID NO：4所示的多肽的第1-149位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBcAg的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBcAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBcAg”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：4所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBcAg的序列片段时，其不仅包括SEQ IDNO：4的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBcAg的第1-149位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：4的第1-149位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

如本文中所使用的，术语“WHcAg”是指，土拨鼠肝炎病毒核心蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：ADE19018.1)。

如本文中所使用的，术语“CRM197(Cross-Reacting Materials 197)”是指，白喉毒素(DT)的一种无毒突变体，其与野生型白喉毒素相比，差异在于第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Rappuoli，G.Ratti et al.,Nucleic AcidsResearch.1984.12：4063-4070)。白喉毒素是本领域技术人员熟知的(参见例如，Choe S,Bennett M,Fujii G,et al.，Nature.1992.357:216-222)，其氨基酸序列可见于例如GenBank登录号AAV70486.1。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的。两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的数目的函数(即，百分比同一性＝同一重叠位置的数目/位置的总数×100％)。在某些实施方案中，两个序列长度相同。

两个序列之间的百分比同一性的测定还可使用数学算法来实现。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是Karlin和Altschul的算法，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268，如同Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中改进的。将这样的算法整合至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。

如本文中所用，术语“变体”，在多肽的情境中(包括多肽)也指包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加改变的氨基酸序列的多肽或肽。如本文中所用，术语“变体”还指已被修饰(即，通过将任何类型的分子共价连接至多肽或肽)的多肽或肽。例如，但非限制性地，多肽可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白质等。衍生多肽或肽可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来产生，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，变体具有与其所源自的多肽或肽相似、相同或改善的功能。

如本文中所用，术语“片段”是指这样的肽或多肽，所述肽或多肽包含另一个多肽的氨基酸序列的至少3个连续氨基酸残基、至少4个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少6个连续氨基酸残基、至少7个连续氨基酸残基、至少8个连续氨基酸残基、至少9个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸、至少11个连续氨基酸残基、至少连续12个氨基酸残基、至少连续13个氨基酸残基、至少连续14个氨基酸残基、至少连续15个氨基酸残基、至少16个连续氨基酸残基、至少连续20个氨基酸残基、至少连续25个氨基酸残基、至少连续30个氨基酸残基或更多的氨基酸序列。在具体的实施方案中，多肽的片段保持多肽的至少一种功能。

如本文中所使用的，术语“表位”是指能够被识别并且被特定抗体特异性结合的抗原的部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸或通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成，分别称为线性表位或构象表位。从连续氨基酸形成的表位典型地在蛋白变性时保留，而由三级折叠形成的表位典型地在蛋白变性时丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。

如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如，HPV L1蛋白(可以将表位肽插入在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间，参见Slupetzky,K.等,J Gen Virol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等,J Virol,2003,77:8386-8393)，HBV核心抗原(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Koletzki,D.,et al.Biol Chem,1999,380:325-333)，土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Sabine

J.Virol.1998,72(6):4997)，CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用接头以促进二者各自的折叠。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987 and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过IMGT编号系统确定。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。

如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。

如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)₂片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。

如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。

如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。

如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)₂，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。

上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。在某些实施方案中，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地，人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人源(例如兔)抗体，受体框架可以天然存在的人框架，或与其相比具有约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的抗体。

本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据免疫动物(例如鼠)所产生的单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从来自免疫动物的目标杂交瘤或特异性B细胞中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含人免疫球蛋白序列。

为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将免疫动物(例如鼠)的免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。

为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将免疫动物(例如鼠)的CDR区移植入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in AntibodyEngineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。所述人源框架序列可以来自于例如胚系抗体基因(germline antibody gene)。术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germline sequence)”，由重链胚系基因所编码的氨基酸序列称为重链胚系序列，由轻链胚系基因所编码的氨基酸序列称为轻链胚系序列。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如，

)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，HRV感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者(例如人)患有HRV感染或与HRV感染相关的疾病，或者，具有患有上述疾病的风险。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HRV感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HRV感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。

附图说明

图1显示了多肽2C01(图1A)、2C02(图1B)和2C03(图1C)在117株病毒中的序列保守性分析结果。

图2显示了融合蛋白C149-2C(aa 12-20)、C149-2C(aa 151-163)C149-2C(aa 186-193)、C149-2C(aa 149-165)、C149-2C(aa 147-167)和C149-2C(aa 145-169)的SDS-PAGE电泳结果。

图3为C149-2C(aa 12-20)、C149-2C(aa 151-163)C149-2C(aa 186-193)、C149-2C(aa 149-165)、C149-2C(aa 147-167)和C149-2C(aa 145-169)重组蛋白组装的类病毒颗粒的电镜图。

图4显示了ELISA检测筛选到的单克隆抗体9A5与多肽2C01、2C02和2C03之间的结合亲和力的OD(450/620)的强度矩形图。

图5显示了ELISA检测筛选到的单克隆抗体9A5-HRP与C149-2C(aa 151-163)、C149-2C(aa 12-20)和C149-2C(aa 186-193)蛋白之间的结合亲和力的OD(450/620)的强度矩形图。

图6为单抗9A5对感染鼻病毒的H1-Hela细胞的免疫荧光图。

图7显示了单抗9A5通过ELISPOT检测被病毒感染的H1-Hela细胞的斑点数。

序列信息

本申请涉及的序列的描述提供于下表中。

表1：序列信息

注：R＝A or G；K＝G or T

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国武汉，武汉大学)进行保藏的生物材料：

杂交瘤细胞株9A5，其具有保藏号CCTCC No.C2021141，且保藏时间为2021年5月28日，保藏地址为武汉市武昌珞珈山(邮编430072)。

具体实施方案

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应被视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：人鼻病毒高保守多肽的设计

本实施例对不同血清型的人鼻病毒蛋白2C氨基酸序列采用Clustal软件进行同源性分析。使用的毒株序列包括HRV-A1B、HRV-A2、HRV-B14、HRV-C15等共117株病毒，所述毒株具体信息如表2所示。经同源性分析，挑选3个位于人鼻病毒蛋白2C的高度保守的肽段：即多肽2C01(aa 151-163)：YSLPPDPKYFDGY(SEQ ID NO:1)；多肽2C02(aa 12-20)：CNAAKGLEW(SEQ ID NO:2)；和多肽2C03(aa 186-193)：FCQMVSTT(SEQ ID NO:3)。这三个肽段的氨基酸序列(其肽段长度分别为13、9和8个氨基酸)在117株病毒中均具有较高的保守性和同源性，所述三个多肽的序列保守性分析结果如图1所示。

表2.氨基酸序列比对中选取的病毒株信息

上述117株病毒的人鼻病毒非结构蛋白2C的aa 151-163分别提供于表3(SEQ IDNOs：1、30-34)。

表3.117株病毒的非结构蛋白2C的aa 151-163的氨基酸序列

实施例2：人鼻病毒高保守多肽抗血清的制备

根据实施例1中筛选到的三个肽段的氨基酸序列，设计合成了3个多肽(由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成)，编号为：2C01(下文中也称为2C(aa 151-163)，SEQ IDNO:1)、2C02(下文中也称为2C(aa 12-20)，SEQ ID NO:2)和2C03(下文中也称为2C(aa 186-193)，SEQ ID NO:3)。将合成的多肽对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种多肽平行免疫5只小鼠(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只小鼠，初免混合弗氏完全佐剂(购自Sigma，货号：F5881)，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂(购自Sigma，货号：F5881)，共加强三针，在第三针加强后的第14天采血。

实施例3：人鼻病毒高保守多肽变体抗血清的制备

本实例在117株人鼻病毒非结构蛋白2C的aa 151-163氨基酸序列的基础上进行分析，补充设计并合成了5种位点突变与3种序列延长的多肽变体肽段(由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成)：即多肽变体2C04(aa 151-163，Y159H)：YSLPPDPKHFDGY(SEQ ID NO：30)；多肽变体2C05(aa151-163，D156A)：YSLPPAPKYFDGY(SEQ ID NO：31)；多肽变体2C06(aa151-163，D156S)：YSLPPSPKYFDGY(SEQ ID NO：32)；多肽变体2C07(aa151-163，D156N&Y159H)：YSLPPNPKHFDGY(SEQ ID NO：33)；多肽变体2C08(aa151-163，D156N)：YSLPPNPKYFDGY(SEQ ID NO：34)；多肽变体2C09(aa149-165)：QVYSLPPDPKYFDGYDQ(SEQ IDNO：35)；多肽变体2C10(aa147-167)：EAQVYSLPPDPKYFDGYDQQQ(SEQ ID NO：36)；多肽变体2C11(aa145-169)：TQEAQVYSLPPDPKYFDGYDQQQVV(SEQ ID NO：37)。将合成的8种多肽变体对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种多肽平行免疫5只小鼠(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只小鼠，初免混合弗氏完全佐剂(购自Sigma，货号：F5881)，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂(购自Sigma，货号：F5881)，共加强三针，在第三针加强后的第14天采血。

实施例4：鉴定人鼻病毒高保守多肽抗血清与人鼻病毒的结合活性

将实施例2和实施例3获得的多肽抗血清对人鼻病毒A、B和C组的不同代表性毒株采用间接免疫荧光法进行检测。所述人鼻病毒代表性毒株分别来源于：A组1B型(HRV-A1B)、A组2型(HRV-A2)、A组9型(HRV-A9)、A组16型(HRV-A16)、A组21型(HRV-A21)、A组23型(HRV-A23)、A组29型(HRV-A29)、A组34型(HRV-A34)、A组36型(HRV-A36)、A组40型(HRV-A40)、A组43型(HRV-A43)、A组49型(HRV-A49)、A组54型(HRV-A54)、A组59型(HRV-A59)、A组77型(HRV-A77)、A组78型(HRV-A78)、A组89型(HRV-A89)、B组5型(HRV-B5)、B组6型(HRV-B6)、B组14型(HRV-B14)、B组17型(HRV-B17)、C组11型(HRV-C11)、C组15型(HRV-C15)和C组23型(HRV-C23)。上述24种代表性人鼻病毒的GenBank登录号如表4所示，其中，HRV-C11、HRV-C15和HRV-C23为本实验室通过感染性克隆的构建和病毒拯救所得，其余均购自ATCC。

表4病毒GenBank登录号

免疫荧光方法步骤如下：

将培养在含10％FBS(购自ABW)的DMEM(购自GIBCO)培养基中的H1-Hela细胞(购自ATCC)以1×10⁵个/孔的密度铺于24孔细胞培养板中；待细胞贴壁后，每孔感染10³TCID₅₀的人鼻病毒；20h后吸弃细胞培养上清，每孔加入500μL的固定液(含有4％多聚甲醛的PBS溶液)进行固定，室温避光静置30min；30min后吸弃固定液，每孔加入500μL的0.3％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置10min；10min后吸弃通透液，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入适量封闭液(含有2％BSA的PBS溶液)封闭，放置于37℃中反应1h；1h后吸弃封闭液，加入以1：100稀释的多肽免疫抗血清，放置于37℃中反应1h；1h后吸弃血清，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入以1：500稀释的FITC偶联的羊抗鼠抗体，放置于37℃中反应30min；30min后吸弃抗体，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入DAPI染液，以1：2000稀释，室温避光静置5min；5min后吸弃DAPI染液，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；封片后在荧光显微镜下进行结果观察。结果示于表5中。

表5.多肽抗血清对感染鼻病毒的H1-Hela细胞的免疫荧光结合活性

注：+，阳性；-,阴性

表5的结果显示，针对多肽2C01及多肽变体2C04～2C11的抗血清均能够交叉结合24种代表性人鼻病毒感染的H1-Hela细胞，显示出阳性的绿色荧光；而针对多肽2C02或2C03的抗血清不能交叉结合24种代表性人鼻病毒感染的H1-Hela细胞，未显示出绿色荧光。这一结果表明：(1)抗多肽2C01(即多肽2C(aa151-163))及其多肽变体(即2C04(aa 151-163，Y159H)、2C05(aa151-163，D156A)、多肽变体2C06(aa151-163，D156S)、多肽变体2C07(aa151-163，D156N&Y159H)、多肽变体2C08(aa151-163，D156N)、多肽变体2C09(aa149-165)、多肽变体2C10(aa147-167)、多肽变体2C11(aa145-169))的免疫血清能够特异性交叉结合不同亚型的人鼻病毒；多肽2C01及其多肽变体可能含有通用亲和表位；(2)抗多肽2C02或2C03的免疫血清无法特异性交叉结合不同亚型的人鼻病毒；多肽2C02和2C03不含通用亲和表位。这些结果还表明，并非所有的保守性肽段都包含通用亲和表位。相反地，在很多情况下，保守性肽段(例如2C02和2C03)不能用作通用亲和表位，无法诱发通用亲和抗体的产生。

实施例5：多肽2C01的抗血清用于检测人鼻病毒的感染和滴度

在稀释度足够的情况下，鼻病毒感染细胞后通过酶联免疫斑点法可以使被感染细胞带有能够被Elispot仪检测的信号，带有信号的阳性细胞数即被感染细胞数可以认为是在该次感染实验中使用了多少感染单位的鼻病毒，从而可以以梯度稀释斑点计数方法检测鼻病毒的滴度。本实施例中选择了实施例4中的3种代表性鼻病毒(HRV-A2、HRV-B14、HRV-C15)，进行感染滴度的测定。具体步骤如下：

将H1-Hela细胞铺于96孔细胞培养板中，1×10⁴个/孔，培养基为含2％FBS的DMEM培养基。33℃培养10h。取病毒培养原液一份，用无血清DMEM培养基5倍连续稀释5个梯度，最终使每100μL培养基中分别含有100μL、20μL、4μL、0.8μL、0.16μL、0.032μL 6个浓度梯度的病毒稀释液。将各梯度的病毒稀释液取100μL加入预铺于96孔细胞培养板中的H1-Hela细胞中，每个梯度采取3孔重复。将96孔板放入33℃培养。培养14～24小时后，酶联免疫斑点法检测：

(1)吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.5％甲醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；

(2)1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；

(3)0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；

(4)在每个孔中加入100μL实施例2制备的多肽2C01的抗血清，多肽抗血清用酶稀(成分为20mM PBS+0.5％酪蛋白+2％明胶+0.1％防腐剂的缓冲液，下同)稀释3000倍使用，放置于37℃中反应1h。

(5)1h后吸弃血清，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；

(6)在每个孔中加入100μL以1：5000稀释的HRP偶联的羊抗鼠抗体，放置于37℃中反应30min；

(7)30min后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL TMB显色液，放置在37℃中显色15min。

(8)15min后吸弃板中的显色液终止显色。

(9)启动斑点检测仪器ELISPOT(型号：Series3B)，将进行显色反应后的细胞培养板放在仪器的取样板上，用仪器检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。ELISPOT的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。

同步设置未进行感染实验的H1-Hela细胞作为实验对照组。

鼻病毒效价计算方法：感染效价(IU/mL)＝检测孔被感染细胞数/检测孔病毒原液用量(mL)。其中，检测孔被感染细胞数＝检测孔平均显色细胞数-阴性孔平均显色细胞数。上述公式中“检测孔被感染细胞数”和“检测孔病毒原液用量”选择被感染细胞数最接近于50且不低于50的检测孔的被感染细胞数与其对应的鼻病毒原液的用量。结果如表6所示，病毒原液用量对应的为被感染细胞的数量(为3孔平均值)，代入上述公式即可计算获得病毒的效价。

表6.鼻病毒的感染用量与对应孔被感染细胞数的关系

根据上述结果可知，HRV-A2、HRV-B14和HRV-C15三种代表性鼻病毒的病毒效价分别为9.375×10⁴(IU/mL)、8.625×10⁴(IU/mL)和7.875×10⁴(IU/mL)。本实施例结果表明，人鼻病毒通用亲和多肽2C01的抗血清能够测定出不同代表性鼻病毒的感染滴度。

实施例6：人鼻病毒的病毒抗血清的制备

免疫原的准备：准备3板10cm细胞培养皿并接种上H1-Hela细胞，当培养皿中的H1-Hela细胞达到80％汇合率，将培养基换成无血清DMEM培养基，分别接种HRV-A2、HRV-B14或HRV-C15病毒，接种的病毒剂量均为10⁵TCID₅₀，轻微摇晃均匀放置于33℃培养。当细胞出现完全病变时，收集细胞与上清，于-80℃超低温冰箱中反复冻融3次。在4℃低温下25000g离心10min去除细胞碎片；将离心后的病毒上清保存于-80℃备用。

小鼠的基础免疫：对6～8周龄BALB/c雌鼠使用上述免疫原进行多点注射，包括背部皮下注射、腹股沟皮下注射、足垫注射、四肢肌肉注射等，注射剂量为500μL/只/次。每种病毒平行免疫5只小鼠(编号为鼠1到鼠5)。初免混合弗氏完全佐剂,以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂，共加强两针，在第三针免疫后的第14天采集200μL眼框静脉血以备滴度测定。

实施例7：多肽2C01的抗血清用于检测人鼻病毒中和抗体效价

本实施例中将亲和多肽2C01的抗血清用于酶联免疫斑点法，检测人鼻病毒中和抗体效价。该方法具有高效、准确的优点，同时更有利于提高工作效率，更适合于对不同亚型的鼻病毒进行高通量检测。具体方法描述如下：

1.将H1-Hela细胞铺于96孔细胞培养板中(1×10⁴/孔)。

2. 10h后将待检测的样品(单克隆抗体样品、血清样品、腹水样品、细胞培养上清液样品、细胞裂解液样品等)用无血清DMEM进行梯度稀释(以原液起点，进行2倍比稀释，稀释8个梯度，每个梯度采取3孔重复)。

3.各孔取50μL待测样品与50μL稀释于无血清DMEM的鼻病毒(10⁴TCID₅₀)混合。37℃混合孵育2h。

4.吸取预铺有H1-Hela细胞的96孔细胞培养板中的培养液，加入孵育后的混合液，33℃培养14～24h后进行酶联免疫斑点反应。

5.吸去各孔中的培养基，每孔加入100μL固定液(含有0.5％甲醛的PBS溶液)，室温避光静置1h。

6.吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置30min。

7.吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。

8.在每个孔中加入100μL实施例2制备的多肽2C01的抗血清，多肽抗血清用酶稀稀释3000倍使用，放置于37℃中反应1h。

9. 1h后吸弃血清，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；

10.在每个孔中加入100μL以1：5000稀释的HRP偶联的羊抗鼠抗体，放置于37℃中反应30min；

11. 30min后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL TMB显色液，放置在37℃中显色15min。

10. 15min后吸弃板中的显色液终止显色。

11.启动斑点检测仪器ELISPOT，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。详细操作步骤见ELISPOT仪器的操作说明书。

同时设置未进行感染实验的H1-Hela细胞作为阴性孔，只进行病毒感染的H1-Hela细胞为阳性孔，每个96孔板各设置5个孔。

以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该样品的中和效价。各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))×100％。样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/3。

在本实施例中，随机挑选了6份实施例6制备的小鼠免疫多抗血清，用于人鼻病毒的中和抗体检测。中和抗体检测结果(如表7所示)显示，多肽2C01的抗血清能够用于检测人鼻病毒中和抗体的效价；小鼠免疫多抗血清能够中和HRV-A2、HRV-B14或HRV-C15病毒。

表7.小鼠免疫多抗血清中和抗体滴度的检测结果

实施例8：人鼻病毒通用亲和表位多肽与HBcAg蛋白的融合表达

1.pTO-T7-C149表达载体的构建

本领域人员知悉，HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部MIR(mayor immunodominant region，aa 78-83)的融合不会改变其颗粒的多聚特性、抗原活性和免疫原性，且可使外源表位暴露于颗粒表面(参考文献Fu et al.,(2009).Comparativeimmunogenicity evaluations of influenza A virus M2 peptide as recombinantvirus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys.Vaccine 27(9)：1440-1447；Jin et al.,(2007).Protective immune responses against foot-and-mouth disease virus by vaccination with a DNA vaccine expressing virus-likeparticles.Viral Immunol 20(3)：429-440；和Yin et al.,(2010).Hepatitis B viruscore protein as an epitope vaccine carrier:a review.Sheng Wu Gong Cheng XueBao 26(4)：431-438.)。

利用HBcAg的1-149aa在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本发明人将该149个aa插入大肠杆菌表达载体pTO-T7(此载体的制备步骤见参考文献罗文新，张军，杨海杰等，一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J]。生物工程学报，2000，16(5)：578-581)(也可以使用其它本领域常用的大肠杆菌表达载体)中，并以连接子(SEQ IDNO：8)替代HBcAg B细胞优势表位区段的第79、80两个氨基酸(其对应氨基酸为PA)，并在265nt－270nt处引入GGATCC，274nt－279nt处引入GAATTC(相对pTO-T7-C149)以引入两个限制性内切酶识别位点(BamHI和EcoRI)构建了突变型HBc表达质粒pTO-T7-C149。外源蛋白在C149第93个氨基酸处插入。

对人鼻病毒(W10(HRV-C15))非结构蛋白2C(aa 151-163)(2C01,SEQ ID NO:1)、2C(aa 12-20)(2C02,SEQ ID NO:2)和2C(aa 186-193)(2C03,SEQ ID NO:3)区段进行引物设计(引物序列如表8所示)，分别插入HBcAg蛋白中得到的融合蛋白分别称为C149-2C(aa151-163)或C149-2C01(SEQ ID NO:5)、C149-2C(aa 12-20)或C149-2C02(SEQ ID NO:6)、C149-2C(aa 186-193)或C149-2C03(SEQ ID NO:7)。其中，人鼻病毒(W10(HRV-C15))非结构蛋白2C的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

表8：融合蛋白所用克隆引物序列

对合成2C区段的上下游引物通过互搭，获得具有BamH I和EcoR I粘性末端的片段(克隆构建的具体方法步骤参照参考文献，Xu L,et al.2014.Protection against LethalEnterovirus 71Challenge in Mice by a Recombinant Vaccine Candidate Containinga Broadly Cross-Neutralizing Epitope within the VP2 EF Loop.Theranostics 4:498-513.)。各取1μL的上下游引物，同时加入48μL的ddH₂O中，混合后于94℃中反应4min，然后置于70℃反应10min，缓慢地降到室温。同时以BamH I和EcoR I双酶切载体pTO-T7-C149，回收载体后与互搭好的片段连接。连接物转化大肠杆菌ER2566(购自NEB)，进行表达鉴定及质粒酶切鉴定(同时以pTO-T7-C149为空白对照)，鉴定正确的质粒即插入所需的目的片段，分别命名为C149-2C(aa 151-163)或C149-2C01(SEQ ID NO:5)、C149-2C(aa 12-20)或C149-2C02(SEQ ID NO:6)、C149-2C(aa 186-193)或C149-2C03(SEQ ID NO:7)。

将上述表达质粒的ER2566菌以及含pTO-T7-C149空质粒的ER2566菌，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按1：1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有硫酸卡那霉素)中，培养至OD600约0.8时，加入IPTG 500μL，30℃诱导6h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用10mL/瓶的TB8.0缓冲液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件：工作时间：3min/瓶；脉冲：打2sec，停4sec；输出功率：55％。12000rpm离心10min，保留上清。经SDS-PAGE鉴定，所有融合蛋白均为上清表达(SDS-PAGE结果如图2所示)。

由于表达上清中含有很多杂蛋白，本发明人采用以下方式进行纯化并促进蛋白自发组装形成颗粒：将超声离心后得到上清至于65℃水浴中热变性30min，12000rpm离心10min，收集上清。将上清与饱和硫酸铵溶液等体积混合，冰水浴静置30min，12000rpm离心10min，保留沉淀。然后将纯化后的蛋白在PBS缓冲液下促进蛋白自发组装形成颗粒，再进行电镜观察，组装成功的颗粒呈均匀的空心球体，电镜观察结果如图3所示。

将经过纯化并组装的融合蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫5只小鼠(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只，初免混合弗氏完全佐剂，以后每隔两周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂，共加强三针，在第三针加强后的第14天采血。

实施例9：融合蛋白C149-2C01、C149-2C02、C149-2C03免疫血清与人鼻病毒的结合活性

将实施例8获得的C149-2C01、C149-2C02和C149-2C03融合蛋白抗血清分别对不同代表性的鼻病毒采用免疫荧光进行检测。免疫荧光方法步骤参照实施例4，实验结果如表9所示。

表9.C149-2C01、C149-2C02、C149-2C03免疫血清与感染鼻病毒的H1-Hela细胞的免疫荧光结合活性

注：+，阳性；-,阴性

结果证明C149-2C01融合蛋白多肽抗血清能够交叉结合HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15和HRV-C23的24种代表性鼻病毒；感染的H1-Hela细胞显示出绿色荧光，而未感染鼻病毒的H1-Hela细胞对照则没有任何反应；而C149-2C02和C149-2C03融合蛋白抗血清无法特异性交叉结合不同亚型的人鼻病毒。这一结果表明，载体蛋白能够以类病毒颗粒的形式来呈递本发明的表位多肽。基于上述实验结果，选择2C01多肽及其融合蛋白C149-2C01用于进行下一步实验。

实施例10：人鼻病毒通用亲和表位多肽延长变体与HBcAg蛋白的融合表达

依据实施例8中描述的方法，对人鼻病毒(W10(HRV-C15))非结构蛋白2C01的延长变体：2C(aa149-165)(2C09,SEQ ID NO：35)、2C(2C10,aa147-167)(SEQ ID NO：36)、2C(2C11,aa145-169)(SEQ ID NO：37)区段进行引物设计(引物序列如表10所示)，分别插入HBcAg蛋白中得到的融合蛋白分别称为C149-2C(aa149-165)或C149-2C09(SEQ ID NO:49)；C149-2C(aa147-167)或C149-2C10(SEQ ID NO:50)；C149-2C(aa145-169)或C149-2C11(SEQID NO:51)。

此外，通过相同方法获得插入多肽2C04(SEQ ID NO:30)、2C05(SEQ ID NO:31)、2C06(SEQ ID NO:32)、2C07(SEQ ID NO:33)或2C08(SEQ ID NO:34)的融合蛋白C149-2C04(SEQ ID NO:44)、C149-2C05(SEQ ID NO:45)、C149-2C06(SEQ ID NO:46)、C149-2C07(SEQID NO:47)、C149-2C08(SEQ ID NO:48)。

表10：延长变体融合蛋白所用克隆引物序列

对合成的2C延长变体区段的上下游引物通过互搭，依据实例8中融合蛋白表达的方法进行C149-2C延长变体融合蛋白的表达与鉴定，最后获得的融合蛋白表达上清，经过SDS-PAGE鉴定，所有延长变体融合蛋白均为上清表达(SDS-PAGE结果如图2所示)。

采用实例8中描述的方法对获得的融合蛋白进行纯化，然后将纯化后的蛋白在PBS缓冲液下促进蛋白自发组装形成颗粒，再进行电镜观察，组装成功的颗粒呈均匀的空心球体，电镜观察结果如图3所示。

实施例11：融合蛋白C149-2C(aa 149-165)、C149-2C(aa 147-167)、C149-2C(aa145-169)免疫血清与人鼻病毒的结合活性

将获得的延长变体融合蛋白C149-2C(aa 149-165)、C149-2C(aa 147-167)、C149-2C(aa 145-169)抗血清分别对不同代表性的鼻病毒采用免疫荧光进行检测。免疫荧光方法步骤参照实施例4，实验结果如表11所示。

表11.C149-2C(aa 149-165)、C149-2C(aa 147-167)、C149-2C(aa 145-169)免疫血清与感染鼻病毒的H1-Hela细胞的免疫荧光结合活性

注：+，阳性；-,阴性

结果证明C149-2C(aa 149-165)、C149-2C(aa 147-167)、C149-2C(aa 145-169)融合蛋白多肽抗血清均能够交叉结合HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15和HRV-C23的24种代表性鼻病毒；感染的H1-Hela细胞显示出绿色荧光，而未感染鼻病毒的H1-Hela细胞对照则没有任何反应。这一结果表明，不仅C149-2C01载体蛋白能够以类病毒颗粒的形式来呈递本发明的表位多肽，同时沿着其原区段的延长区段C149-2C(aa 149-165)、C149-2C(aa 147-167)、C149-2C(aa 145-169)也均能以类病毒颗粒的形式来呈递本发明的变体延长表位多肽。

实施例12：融合蛋白C149-2C01免疫血清用于检测人鼻病毒的感染和滴度

将实施例8获得的的C149-2C01融合蛋白抗血清以梯度稀释斑点计数方法检测鼻病毒(HRV-A2、HRV-B14和HRV-C15)的滴度。具体步骤见实施例5，实验结果示于下面的表12中。

表12.鼻病毒的感染用量与对应孔被感染细胞数的关系

根据上述结果可知，HRV-A2、HRV-B14和HRV-C15三种代表性鼻病毒的病毒效价分别为7.375×10⁴(IU/mL)、8.875×10⁴(IU/mL)和1.538×10⁵(IU/mL)。本实施例结果表明，针对融合蛋白C149-2C01的抗血清能够测定出不同代表性鼻病毒的感染滴度。

实施例13：融合蛋白C149-2C01免疫血清用于检测人鼻病毒中和抗体效价

利用酶联免疫斑点法，本实施例中我们将实施例8获得的C149-2C01融合蛋白抗血清用于检测人鼻病毒中和抗体效价。具体方法参考实施例7。

本实施例中随机挑选了6份实施例6制备的小鼠免疫多抗血清，用于人鼻病毒的中和抗体检测。中和抗体检测结果如表13所示，结果表明C149-2C01免疫血清能够用于检测人鼻病毒中和抗体的效价；小鼠免疫多抗血清能够中和HRV-A2、HRV-B14或HRV-C15病毒。

表13.小鼠免疫多抗血清中和抗体滴度的检测结果

实施例14：抗人鼻病毒通用亲和表位多肽的单克隆抗体的制备

(1)小鼠免疫

1.免疫原的准备：使用实施例8制备的融合蛋白C149-2C01作为免疫原，初次免疫时使用弗氏完全佐剂，后续加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前72h的最后一次免疫加强时不加佐剂。

2.小鼠的基础免疫：对6～8周龄BALB/c雌鼠使用上述步骤1制备的免疫原进行多点注射，包括背部皮下注射、腹股沟皮下注射、足垫注射、四肢肌肉注射等，注射剂量为500μL/只/次。每隔2周加强免疫一次，每次免疫前采集100～200μL眼框静脉血以备滴度测定。当小鼠血清滴度达到平台期后，停止免疫，休息两个月后进行细胞融合实验。

3.细胞融合前72h的加强免疫对激发抗体应答十分重要，需在融合前72h对小鼠免疫加强。直接用100μL 0.5mg/mL的重组蛋白(C149-2C01)对小鼠进行脾脏免疫。脾脏免疫前，需先用乙醚麻醉小鼠，剖开腹腔外皮取出脾脏，沿脾脏纵向注射100μL抗原，迅速手术缝合腹皮切口。

(2)融合杂交瘤细胞的制备和筛选

1.小鼠巨噬细胞的制备：(i)将一只6周龄左右的BALB/c小鼠处死，自来水冲洗后，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，腹部朝上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，并用大镊子向上下方向撕拉开皮肤，充分暴露腹部。(ⅱ)用无菌镊子提起腹膜，换一把剪刀将腹膜中央处剪一小口，用1mL吸管通过小口向腹腔内注入适量培养液，用吸管小心在腹腔内搅动，最后吸出培养液于离心管中。(ⅲ)将腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，使终浓度为2×10⁵/mL。(ⅳ)将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，也可直接与融合细胞混合后添加到96孔细胞培养板中。

2.小鼠胸腺细胞的制备：(ⅰ)将一只13天龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，腹部朝上。(ⅱ)用镊子提起小鼠腹部皮肤，将腹部和胸部的外皮剪开。(ⅲ)用另一把干净的剪刀剪开胸腔，用镊子取出乳白色的胸腺。将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液。

3.小鼠骨髓瘤细胞的制备：(ⅰ)小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)易培养，融合率高，是目前最理想的融合细胞，但要注意该细胞在过度稀释(密度低于3×10⁵/mL)和pH碱性(pH>7.3)条件时会生长不良。(ⅱ)用20％FBS RPMI-1640培养液培养骨髓瘤细胞(购自ATCC)。当细胞数在10⁴～10⁶/mL时，细胞呈对数生长，此时细胞浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布。一般在细胞处于对数生长中期时(约1～5×10⁵/mL)，可按1：5～1：10的比例进行稀释传代。选处于生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞供融合用。融合骨髓瘤细胞的活细胞数应达95％以上。(ⅲ)融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次(1000rpm，5min)。用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。(ⅳ)一般从融合前5天开始复苏小鼠骨髓瘤细胞，每次融合约需6瓶35cm² Sp2/0细胞。

4.免疫脾细胞的制备：(ⅰ)取上述步骤(1)制备的待融合的BALB/c小鼠，摘除眼球放血致其死亡，收集血液制成抗血清，可作为抗体检测的阳性对照。自来水冲洗小鼠并浸泡于75％乙醇溶液中5min，随即放入超净台内解剖板上，右侧卧位。(ⅱ)打开腹腔取出脾脏，用剪刀将其剪成小块放于200目细胞筛网上，再用研磨棒(注射器内芯)挤压研磨。用吹管滴加RPMI-1640培养液。(ⅲ)补加适量的RPM-1640培养液，静置3～5min，取2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中。上述过程反复2～3次。(ⅳ)用RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm离心10min)。(ⅴ)用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数。

5.使用PEG促融剂融合制备杂交瘤细胞：(ⅰ)融合前先将1mL的PEG-1500、10mL的RPMI-1640无血清培养基和200mL完全培养基平衡至37℃。(ⅱ)将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50mL离心管内(1×10⁸脾细胞和1×10⁷骨髓瘤细胞，约10：1)，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。(ⅲ)吸取0.8mL PEG加入离心管内，在60s内加完，边加边轻轻搅拌。随即加入10mL预温至37℃的RPM-1640完全培养液，温和搅拌。最后补加RPMI-1640培养液至40mL，1000rpm离心5min。(ⅳ)弃上清，取少量HT培养液将细胞吹散，之后将准备好的HT培养液加入。将细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO₂培养箱中培养。(ⅴ)12h后，配置HAT完全培养基，每个孔中滴加100μL。5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清进行50％～100％的换液。9～14天后，吸取上清进行检测。

6.杂交瘤的筛选：使用间接ELISA筛选，包被重组抗原100ng/孔，加入细胞上清50μL检测，并挑选出阳性克隆孔。

7.杂交瘤细胞的克隆化：在筛选出的含阳性上清的培养孔中通常是二个以上的杂交瘤集落。其中有的集落可能不分泌抗体或分泌非实验所要的抗体，只有其中某一个集落才是分泌特异抗体的杂交瘤细胞。因此，须利用克隆培养方法把它们分开，选出所需的杂交瘤细胞。最常用的克隆培养方法是有限稀释法。先把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。一般杂交瘤单克隆阳性细胞株需要重复克隆2～3次，直到100％阳性后才算是稳定克隆株。得到了稳定的杂交瘤细胞株9A5，其保藏编号为CCTCC No.C2021141，保藏日期为2021年5月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉市武昌珞珈山(邮编430072)。

(3)单抗腹水的诱导

1.取BALB/c小鼠2～3只，腹腔注入0.5mL液体石蜡油。

2.1周后，处理对数生长期的杂交瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清液。用无血清培养液悬浮杂交瘤细胞，并将细胞数调至(1～2)×10⁶/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。

3.7～10天，小鼠腹部明显膨大后，引颈处死小鼠。将小鼠用自来水冲洗，浸泡于75％乙醇中5min。使小鼠腹部朝上，用注射针头将小鼠四肢固定于解剖台板。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠背部方向剪开，用大镊子撕开皮肤，充分暴露腹部。用无菌眼科镊子提起腹膜，在腹膜中央处剪一小口，然后用1mL吸管通过小口吸出腹腔内全部腹水。将所有腹水混合放入离心管中，3000rpm离心20min，之后收集上清。

(4)单抗腹水的纯化：将腹水用辛酸-饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化(购自美国GE公司)，获得纯化的单克隆抗体9A5。

(5)抗体亚型的鉴定：将融合蛋白抗原用20mM PB 7.4稀释100倍，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2h，用PBST洗板1次，用相关封闭液(20mM PB 7.4含150mM NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃封闭过夜。取稀释500倍的单抗100μL加入酶标板，37℃孵育1h。PBST洗板5次，分别加入标记HRP的抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的羊抗鼠二抗。37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入TMB显色液显色15min，终止液终止，酶标仪(TECAN sunrise)读值。结果显示单抗9A5为IgG2a亚型。

(6)单抗的HRP标记：操作均在避光条件下进行：(ⅰ)称取2mg HRP干粉溶于0.1mLddH₂O中。(ⅱ)称取2mg 9A5抗体，溶于0.1mL的ddH₂O中。取0.1mL的NaIO₄溶液与0.1mL的HRP缓慢混合，4℃下静置30min。(ⅲ)加入2μL乙二醇，室温避光静置30min。(ⅳ)加入等量体积即(0.2+0.2+0.05)mL CB缓冲液(pH9.6，50mM)，使溶液的pH值在碱性条件下。(ⅴ)将离心管中的反应液移至含抗体的透析袋中，4℃CB缓冲液透析4h，换液1次。(ⅵ)0.4mg NaBH₄溶于20μL的ddH₂O中并加进透析袋，4℃静置2h，每30min摇动1次。(ⅶ)加入等体积50％的饱和硫酸铵(SAS)溶液，4℃沉淀1h，12000rpm离心10min，弃上清(注意将SAS倒扣干净，以免残留的SAS影响抗体)。最后加入500μL的缓冲液(50％甘油和10％NBS)重悬沉淀，-20℃保存。

(7)Anti-C149-2C01小鼠单克隆抗体(9A5)的性质分析

1.将实施例2的合成多肽(2C01、2C02、2C03)分别以1μg/孔的浓度包被于96孔ELISA板中，洗板1次后，用封闭液(20mM PB7.4含150mM NaCL，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，37℃封闭2h后甩干备用。

2.将抗体9A5以2μg/mL的浓度稀释(稀释液为配方同封闭液)，每孔加入100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入以1：5000稀释的HRP偶联的羊抗鼠抗体，放置于37℃中反应30min。PBST洗板5次，入显色液显色15min，加入终止液终止，放置于酶标仪上读值。

3.将实施例8制备的融合蛋白(C149-2C01、C149-2C02、C149-2C03)分别以200ng/孔的浓度包被于96孔ELISA板中，洗板1次后，用封闭液封闭非特异性结合位点，37℃封闭2h后甩干备用。

4.将上述步骤(6)得到的抗体酶标记物以1：1000稀释(稀释液配方同封闭液)后，每孔加入100μL，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色15min，加入终止液终止，放置于酶标仪上读值。

结果示于图4和图5。图4结的结果显示，9A5抗体能够与2C01多肽结合且具有良好的活性。图5的结果显示，9A5-HRP酶标抗体能够与C149-2C01重组蛋白结合且具有良好的活性。接下来的实施例选用9A5或9A5-HRP完成。

实施例15：单克隆抗体9A5与人鼻病毒的结合活性

将实施例14制备的单克隆抗体9A5对不同代表性的鼻病毒采用免疫荧光法进行检测。免疫荧光方法步骤参照实施例4，实验结果如图6所示。结果表明9A5能够交叉结合HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15和HRV-C23的24种鼻病毒感染的H1-Hela细胞，显示出绿色荧光，而未感染鼻病毒的H1-Hela细胞对照则没有任何反应，说明单克隆抗体9A5能够特异性交叉结合不同亚型的鼻病毒。这些结果表明，9A5是通用亲和抗体，并且2C01含有通用亲和表位。

实施例16：单克隆抗体9A5用于检测人鼻病毒的感染和滴度

将实施例14制备的单克隆抗体9A5以梯度稀释斑点计数方法检测鼻病毒的滴度。本实施例中我们选择了实施例4中的10种代表性鼻病毒，进行感染滴度的测定。具体步骤见实施例5，实验结果示于表14和图7中。

表14.鼻病毒的感染用量与对应孔被感染细胞数的关系

根据表14和图7的结果可知，HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A16、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B14和HRV-C15的10种代表性鼻病毒的病毒效价分别为8.75×10⁴(IU/mL)、1.513×10⁵(IU/mL)、7.75×10⁴(IU/mL)、6.75×10⁴(IU/mL)、8.25×10⁴(IU/mL)、9.5×10⁴(IU/mL)、2.875×10⁴(IU/mL)、6.375×10⁴(IU/mL)、2.5×10⁴(IU/mL)和8.25×10⁴(IU/mL)。本实施例结果表明，单抗9A5能够测定出不同代表性鼻病毒的感染滴度。

实施例17：单克隆抗体9A5用于检测人鼻病毒中和抗体效价

利用酶联免疫斑点法，本实施例中我们将实施例14制备的单克隆抗体9A5用于检测人鼻病毒中和抗体效价。具体方法参考实施例7。

本实施例中随机挑选了6份实施例5制备的小鼠免疫多抗血清，用于人鼻病毒的中和抗体检测，检测结果如表15所示。结果表明，单克隆抗体9A5能够用于检测人鼻病毒中和抗体效价；小鼠免疫多抗血清能够中和HRV-A2、HRV-B14或HRV-C15病毒。

表15.小鼠免疫多抗血清中和抗体滴度的检测结果

实施例18：单克隆抗体9A5的轻链及重链可变区的序列测定

半贴壁培养10⁷个9A5鼠源杂交瘤细胞，吹管吹起贴壁细胞使之悬浮，将其转移到新的4mL离心管中，并1500rpm离心3min。收集沉淀的细胞，重悬于100μL无菌PBS缓冲液中，并转移到一新的1.5mL离心管中，加入800μL Trizol(购自Roche，Germany)，轻轻颠倒混匀，静置10min。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，静置10min，4℃12000rpm离心15min，转移上层液体至一新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min。4℃12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70μL DEPC H₂O中，加入1μL反转录引物Oligo(dT)_(12-18)(购自Promega)和1μL dNTP，置于72℃水浴10min，立即放到冰浴中5min，加入20μL 5×反转录缓冲液，2μL AMV(10U/μL购自Promega)，1μL Rnasin(40U/μL,购自Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。

轻链基因的分离使用上述cDNA为模板，以MVkF-G1(SEQ ID NO:16)为上游引物，以MVkR-M13(SEQ ID NO:17)为下游引物，进行PCR扩增，获得一条大小约500bp的DNA片段，PCR条件为：95℃3min，23个循环的(95℃15s，56℃30s，72℃30s)，72℃5min。回收后进行测序。序列经blast比对后确定为9A5的轻链序列，其中可变区的编码基因如SEQ ID NO：18所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。

重链基因的分离使用上述cDNA为模板，以MVhF-C1(SEQ ID NO:20)为上游引物，以MVhR-M13(SEQ ID NO:21)为下游引物，进行PCR扩增，获得一条大小约为500bp的DNA片段，PCR条件为：95℃3min，23个循环的(95℃15s，56℃30s，72℃30s)，72℃5min。回收后进行测序。序列经blast比对后确定为9A5的重链序列，其中可变区的编码基因如SEQ ID NO：22所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。

此外，基于IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/analysis)确定了单抗9A5的轻链及重链的CDR序列(SEQ ID NOs:24-29)。

尽管上文中详细描述了本发明的某些具体实施方案，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对其中的细节进行各种修改和替换而不偏离本发明的精神和主旨，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的范围仅由所附的权利要求及其任何等同方案限定。

Claims

1.一种分离的多肽或其变体，所述多肽由人鼻病毒(HRV)2C蛋白的至少13个连续氨基酸残基组成，且包含所述蛋白的第151-163位氨基酸残基，并且，所述变体与其所源自的多肽相异仅在于1个或几个(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，或7个)氨基酸残基的置换，且保留了其所源自的多肽的生物学功能(例如，诱导对至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型的HRV具有特异性结合活性的抗体)；

例如，所述多肽由HRV 2C蛋白的不多于100个(例如，不多于95个，不多于90个，不多于85个，不多于80个，不多于75个，不多于70个，不多于65个，不多于60个，不多于55个，不多于50个，不多于45个，不多于40个，不多于35个，或不多于30个)的连续氨基酸残基组成；

例如，所述多肽由HRV 2C蛋白的13～30个(例如13～25个，13～21个，13～17个，13～15个)连续氨基酸残基组成；

例如，所述变体在相应于HRV 2C蛋白的第156和/或159位的氨基酸位置中包含置换(例如保守置换)；

例如，所述多肽或其变体包含如YSLPPX₁PKX₂FDGY(SEQ ID NO:52)所示的结构；

X₂选自：(i)氨基酸残基Y，H和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；

例如，所述HRV 2C蛋白具有如SEQ ID NO:9所示的序列或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

例如，所述HRV 2C蛋白的第151-163位氨基酸残基如SEQ ID NOs:1、30-34任一项所示；

例如，所述多肽包含SEQ ID NOs:1、30-37任一项所示的序列或由其组成。

2.一种重组蛋白，其包含权利要求1的分离的多肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段；

例如，所述多肽或其变体任选地通过连接体(例如刚性或柔性连接体，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)与载体蛋白相连接；

例如，所述载体蛋白选自CRM197蛋白或其片段、HBcAg或其片段、WHcAg或其片段、钥孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、卵清蛋白。

3.权利要求2的重组蛋白，其中，所述载体蛋白是HBcAg或其片段，并且用所述多肽或其变体替换HBcAg的第79-80位氨基酸；

任选地，所述多肽或其变体与HBcAg或其片段通过连接体连接；

例如，所述HBcAg的片段包含HBcAg的aa 1-149或由HBcAg的aa 1-149组成；

例如，所述重组蛋白具有如SEQ ID NO：5、44-51任一项所示的氨基酸序列。

4.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1的多肽或其变体，或权利要求2或3的重组蛋白的核苷酸序列。

5.一种载体，其包含权利要求4的分离的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其包含权利要求4的分离的核酸分子或权利要求5的载体。

7.制备权利要求1的多肽或其变体或者权利要求2或3的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求6的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述多肽或其变体或者重组蛋白。

8.病毒样颗粒(VLP)，在其表面上展示权利要求1所述的分离的多肽或其变体；

例如，所述病毒样颗粒包含融合蛋白或由融合蛋白构成，所述融合蛋白包含权利要求1所述的多肽或其变体，以及载体蛋白；任选地，所述多肽或其变体与载体蛋白通过连接体连接；

例如，所述载体蛋白为HBcAg蛋白或其片段(例如，HBcAg的aa 1-149)；例如，用所述多肽或其变体替换HBcAg的第79-80位氨基酸；

例如，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：5、44-51任一项所示的氨基酸序列。

9.组合物，其包含权利要求1的多肽或其变体、权利要求2或3的重组蛋白、权利要求4的分离的核酸分子、权利要求5的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求8所述的VLP；

例如，所述组合物是药物组合物或免疫原性组合物(例如疫苗)；

例如，所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)；

例如，所述组合物包含一种或多种所述多肽或其变体，且这些多肽或其变体可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的；

例如，所述组合物包含一种或多种所述重组蛋白；

例如，所述组合物包含一种或多种所述VLP。

10.权利要求1的多肽或其变体、权利要求2或3的重组蛋白、权利要求4的分离的核酸分子、权利要求5的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求8所述的VLP在制备用于在受试者中诱导针对HRV的免疫应答和/或用于预防和/或治疗受试者的HRV感染或与HRV感染相关的疾病(例如呼吸道感染)的制剂中的用途；

例如，所述制剂是疫苗。

11.单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合权利要求1所述的多肽或其变体、权利要求2或3的重组蛋白或权利要求8所述的VLP；

例如，所述单克隆抗体能够特异性结合HRV 2C蛋白的第151-163位氨基酸残基；

例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、鼠源抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体(例如，人鼠嵌合抗体)或双特异或多特异抗体。

12.权利要求11的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)下述3个互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：

和/或，

(b)下述3个互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：

(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，(i)-(vi)任一项中所述的CDR根据IMGT编号系统定义；

优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。

13.权利要求11或12所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

或，

(b)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR；

优选地，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。

14.权利要求11-13任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：23所示的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：19所示的序列；

(vi)与SEQ ID NO：19所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:23所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:19所示的序列的VL。

15.权利要求11-13任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化的；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列的轻链框架区序列。

16.权利要求11-15任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含来源于鼠或人免疫球蛋白的恒定区；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。

17.一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其由杂交瘤细胞株9A5所产生，或是衍生自杂交瘤细胞株9A5，其中，杂交瘤细胞株9A5保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO.C2021141。

18.权利要求11-17任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型的HRV；

例如，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15、HRV-C23中的一种或多种。

19.分离的核酸分子，其编码权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

20.载体，其包含权利要求19所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。

21.宿主细胞，其包含权利要求19所述的分离的核酸分子或权利要求20所述的载体。

22.杂交瘤细胞株9A5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO.C2021141。

23.制备权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求21所述的宿主细胞或权利要求22的杂交瘤细胞，和从培养的宿主细胞或杂交瘤细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

24.缀合物，其包含权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记；

例如，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

25.试剂盒，其包括权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求24所述的缀合物；

例如，所述试剂盒包含权利要求24所述的缀合物；

例如，所述试剂盒包含权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

26.用于检测HRV在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求24所述的缀合物；

例如，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；

例如，所述HRV包含至少2个(例如2个，5个，10个，15个，20个，24个)亚型；例如，所述HRV包含HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A16、HRV-A21、HRV-A23、HRV-A29、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A40、HRV-A43、HRV-A49、HRV-A54、HRV-A59、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A89、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-C11、HRV-C15、HRV-C23中的一种或多种；

例如，所述方法包括使用权利要求24所述的缀合物；

例如，所述方法包括使用权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。

27.权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测HRV在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了HRV；

优选地，所述检测试剂通过权利要求26所述的方法来检测HRV在样品中的存在或其水平；

优选地，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的体液样品(例如，呼吸道分泌物、全血、血浆、血清、唾液排泄物或尿液)。

28.用于检测HRV中和抗体的中和活性或筛选HRV中和抗体的方法，其包括使用权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求24所述的缀合物；

例如，所述方法包括：(i)将包含待测抗体的待测样品与HRV孵育；(ii)将步骤(i)的产物与细胞孵育；(iii)将所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物与步骤(ii)的细胞产物(例如经膜通透处理)孵育；(iv)测定由所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物标记的细胞数量，并由此确定待测抗体对HRV的中和活性。

29.药物组合物，其包含权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

30.权利要求11-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求19所述的分离的核酸分子、权利要求20所述的载体、权利要求21所述的宿主细胞或权利要求22所述的杂交瘤细胞用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者的HRV感染或与HRV感染相关的疾病(例如呼吸道感染)；

优选地，所述受试者是哺乳动物，例如人；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂联合使用。