CN117700533A - 猴痘病毒a29小鼠单克隆包被抗体及检测抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明为202310090089.4的分案申请，公开了一种猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体，包括：重链，其包含由或基本上由SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR‑H1，和由或基本上由SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR‑H2，和由或基本上由SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR‑H3，以及；轻链，其包含由或基本上由SEQ ID NO：4所示的轻链可变区CDR‑L1，和由或基本上由SEQ ID NO：5所示的轻链可变区CDR‑L2，和由或基本上由SEQ ID NO：6所示的轻链可变区CDR‑L3。还公开了猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体及相应的试剂盒。本发明开发出的包被抗体和检测抗体能够定性或定量检测样本中的猴痘病毒A29蛋白水平。
Description
本申请系申请号为202310090089.4、申请日为2023年2月9日，名称为猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体及检测抗体的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体及检测抗体，属于病毒检测技术领域。
背景技术
猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体对，主要包括抗猴痘病毒A29蛋白小鼠单克隆包被抗体，猴痘病毒A29蛋白小鼠单克隆检测抗体以及重组表达的猴痘A29蛋白标准品(40891-V08E)。单克隆抗体采用重组猴痘A29蛋白免疫动物，利用Beacon光导平台筛选，再通过蛋白A纯化和抗原亲和纯化技术制备获得。酶标抗体按照常规方法利用辣根过氧化物酶(HRP)标记。重组猴痘A29蛋白是经过HEK293瞬转表达获得。
猴痘病毒(Monkeypoxvirus，MPXV)是一种人畜共患的包膜双链DNA病毒，属于痘病毒科的正痘病毒属。正痘病毒属还包括天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒。猴痘病毒有刚果盆地分支和西非分支两大分支。痘病毒存在两种形式：成熟病毒粒子(MV)，以及在MV外包裹一层胞膜的形态(EV)。MV包括一个含有双链DNA的病毒核心组分、蛋白侧体以及外膜，外膜上含有20种病毒蛋白。MV非常稳定，被认为可以介导宿主之间的传播，而EV具有脆弱的外膜，介导同一宿主细胞间的传播。痘苗病毒(VACV)A27蛋白能与细胞表面上的硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate)作用，介导病毒跟细胞结合并催化细胞融合。A29蛋白与痘苗A27蛋白高度同源，是猴痘病毒细胞内成熟病毒(MV)表面包膜蛋白，用猴痘病毒制备的特异性单克隆抗体的抗原表位定位于A29蛋白上，因此A29蛋白是猴痘抗原及抗体检测的一个潜在靶点。
然而，由于目前社会对于猴痘病毒治病机制还在研究之中，以及基于猴痘病毒关键靶点抗原抗体的血清学和免疫学检测试剂的开发也十分稀缺，使得针对猴痘病毒的快速检测和及时发现猴痘感染病例面临严峻的挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体和检测抗体，能够定性或定量检测样本中的猴痘病毒A29蛋白水平。
本发明采用的技术方案为：
一种猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体，其特征在于所述抗体包括：
重链，其包含由或基本上由SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR-H1，和由或基本上由SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR-H2，和由或基本上由SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR-H3，以及；
轻链，其包含由或基本上由SEQ ID NO：4所示的轻链可变区CDR-L1，和由或基本上由SEQ ID NO：5所示的轻链可变区CDR-L2，和由或基本上由SEQ ID NO：6所示的轻链可变区CDR-L3。
优选的，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
上述的猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体在制备检测猴痘的试剂中的应用。
本发明还公开了一种检测猴痘的试剂盒，包含上述的猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体。
本发明公开的猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体包括：
重链，其包含由或基本上由SEQ ID NO：9所示的重链可变区CDR-H1，和由或基本上由SEQ ID NO：10所示的重链可变区CDR-H2，和由或基本上由SEQ ID NO：11所示的重链可变区CDR-H3，以及；
轻链，其包含由或基本上由SEQ ID NO：12所示的轻链可变区CDR-L1，和由或基本上由SEQ ID NO：13所示的轻链可变区CDR-L2，和由或基本上由SEQ ID NO：14所示的轻链可变区CDR-L3。
优选的，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
上述的猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体在制备检测猴痘的试剂中的应用。
本发明还公开了一种检测猴痘的试剂盒，包含上述的猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体。
优选的，还包括上述的猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体。
本发明结合Beacon光导平台，通过单B细胞筛选出猴痘A29免疫的小鼠单克隆抗体，开发出的包被抗体和检测抗体能够定性或定量检测样本中的猴痘病毒A29蛋白水平。该抗体对的开发可以有效缓解猴痘病毒免疫学检测试剂的短缺，具有广阔的市场应用前景和较大的经济和社会效益。
附图说明
图1猴痘病毒A29蛋白标准曲线。
图2小鼠单克隆包被抗体WB图，其中猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体1:1000稀释，Lane A:10ng猴痘病毒A29重组蛋白(Cat#40891-V08E)，山羊抗鼠二抗/HRP 1:10000稀释。
图3小鼠单克隆检测抗体WB图，其中猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体1:1000稀释，Lane A:10ng猴痘病毒A29重组蛋白(Cat#40891-V08E)，Lane B:10ng痘苗A27L重组蛋白，山羊抗鼠二抗/HRP 1:10000稀释。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1小鼠免疫
免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫剂量50μg，首次免疫将免疫原与等体积的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射；间隔2周取相同剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射。于三次免疫后一周取血，通过间接ELISA方法，测定血清结合效价。以小鼠血清1:16000倍稀释时OD450-blank大于1.0为效价合格标准。ELISA效价不合格小鼠继续免疫，直到效价合格为止，建议最多免疫五次；挑选小鼠进行加强免疫，于加强免疫3天后取小鼠脾脏进行Beacon分选。
实施例2Beacon单B细胞筛选
取免疫后小鼠的脾、骨髓、淋巴结等免疫组织，研磨至单细胞悬液，
裂解红细胞，加入小鼠CD138抗体磁珠进行孵育，正选获得CD138+浆细胞。分离后的浆细胞按程序加入芯片中，通过光电定位(OEP)技术将细胞导入到纳升级小室(NanoPen)当中。将包被了抗原的微球和荧光二抗导入到芯片通道中，通过多轮拍照筛选分泌特异性抗体的阳性细胞。分析数据，确定阳性细胞所在NanoPen位置，通过OEP的方式将细胞从NanoPen中导出至含有细胞裂解液的96孔板中。
实施例3单个B细胞可变区扩增和载体构建
将Beacon导出的单细胞裂解后，在裂解液中加入oligo-d(T)、dNTP等反转录体系，通过两步反转录法制备cDNA。以cDNA为模板，通过巢式PCR，采用多轮渐进的扩增方式，将上一轮PCR产物作为下一轮基因扩增的模板，逐步扩增出抗体重轻链可变区基因。将重轻链可变区片段加入膜结合液，充分混匀后加到纯化柱中，Nuclease-Free Water洗脱，获得纯化后的重轻链可变区基因片段。将基因可变区片段插入带有恒定区序列的表达载体，连接产物转化感受态细胞，37℃过夜培养。将获得的单克隆扩增后测序，获得抗体重轻链序列。测序正确的载体提取质粒，传递小试表达。
实施例4单克隆抗体表达和纯化
表达质粒转染HEK293细胞，利用摇瓶或生物反应器进行细胞培养，收集细胞培养上清，利用常规蛋白A亲和层析柱进行纯化，获得的抗体通过SDS-PAGE电泳和间接ELISA法鉴定抗体纯度和特异性后分装，于-20℃低温保存备用。
实施例5蛋白免疫印迹
待检测蛋白样品等体积加入2×loading buffer，蛋白样品浓度>1mg/mL，20μL/孔。设置恒压100V，直至溴酚蓝跑的胶板底部。将膜放在甲醇中，放置2分钟，110V恒压转移1小时。5％脱脂牛奶4℃封闭过夜。一抗用5％脱脂牛奶按1:1000比例稀释，将稀释好的一抗加入相应的抗体孵育盒中，室温孵育2小时。使用脱色摇床洗脱膜3次，每次5分钟。加入稀释好的二抗(HRP标记的山羊抗鼠二抗)，室温反应2小时。使用脱色摇床洗脱膜3次，每次5分钟。采用化学发光成像系统，进行显色。其中图2显示的是一抗为猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体时，检测包被抗体的亲和力结果，图3显示的是一抗为猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体时，检测检测抗体的亲和力结果。
实施例6猴痘A29蛋白ELISA检测
取出包被好的酶标板及冻干的标准品，其中酶标板事先采用猴痘病毒A29小鼠单克隆包被抗体包被，加1mL样品稀释液将标准品溶解。室温下放置20分钟。将标准品从1500pg/mL起，做2倍的倍比稀释，共7个浓度梯度，将稀释液各取100μL加入96孔酶标板中。取待测样本，100μL/孔加入反应孔中，室温下孵育2小时；洗涤液洗板3次，200μL/孔，拍干酶标板。将HRP标记的猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体用样品稀释液稀释至1μg/mL，加入反应孔中，100μL/孔，室温下孵育1小时，洗涤液洗板3次，200μL/孔，拍干酶标板。加入200μL新鲜配制的底物显色液，室温反应20分钟，然后加入50μL终止液终止，酶标仪450nm波长下读取吸光值。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，采用线性回归，绘制标准曲线(图1)，根据测得的样品OD值可计算获得样品中的猴痘病毒A29蛋白的含量。如果是稀释后的样品，将计算出来的结果乘以稀释倍数就能得到样品中的A29浓度。检测的线性范围是23.44-1500pg/mL，最低检测浓度为2.65pg/mL。最低检测浓度的计算方法是零孔OD450吸光值加上三倍标准差所对应的A29浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体，其特征在于所述抗体包括：
重链，其包含由SEQ ID NO：9组成的重链可变区CDR-H1，和由SEQ ID NO：10组成的重链可变区CDR-H2，和由SEQ ID NO：11组成的重链可变区CDR-H3，以及；
轻链，其包含由SEQ ID NO：12组成的轻链可变区CDR-L1，和由SEQ ID NO：13组成的轻链可变区CDR-L2，和由SEQ ID NO：14组成的轻链可变区CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体，其特征在于：
所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
3.权利要求1或2所述的猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体在制备检测猴痘的试剂中的应用。
4.一种检测猴痘的试剂盒，其特征在于包含权利要求1或2所述的猴痘病毒A29小鼠单克隆检测抗体。
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