CN117551622A - 检测HIV-1 p24抗原的杂交瘤细胞及单抗和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测HIV‑1p24抗原的杂交瘤细胞及单抗和应用，杂交瘤细胞保藏编号为GDMCC No：63838，保藏日期为2023年09月26日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，该杂交瘤细胞能够分泌单克隆抗体GC4，用于HIV‑1p24抗原的检测，具有特异性好和灵敏度高的优点，因此可作为检测HIV‑1p24抗原的检测试剂。

Description

检测HIV-1 p24抗原的杂交瘤细胞及单抗和应用
技术领域
本发明涉及检测领域，具体涉及检测HIV-1 p24抗原的杂交瘤细胞，还涉及由该杂交瘤细胞分泌的单抗和在制备检测试剂中的应用。
背景技术
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的以T细胞功能缺陷为主的一种混合免疫缺陷病，是一种病死率很高的严重传染病。自1981年美国发现第一例HIV感染患者以来，迄今已有30多年，发病率急剧上升。目前全球大约有3600多万人感染HIV，由于该病尚无有效的治愈方法和预防性疫苗，每年新增的感染人数约为200万。目前我国HIV感染者已有100多万，主要是HIV-1型感染，每年新增人数呈逐年上升的趋势。根据中国疾病预防控制中心公布的《2021全国法定传染病疫情情况》统计分析，2021年全年全国艾滋病新发病例数为60154例，发病率为4.2669/10万，报告死亡病例数为19623人，死亡率为1.3919/10万。最近几年HIV感染呈现逐步上升的趋势，因此我国的艾滋病防控工作十分艰巨。而对HIV感染者早期及时诊断和治疗是控制HIV传播的最有效的途径，及时准确的早期诊断能让感染者及早接受治疗，避免向健康人群进一步传播。
HIV诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，建立敏感实用的检测方法对于监测、诊断或血液筛查，控制艾滋病的流行显得尤为重要。目前HIV检测方法较多，总体可分为抗体检测和病毒检测两大类，病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、抗原检测和病毒核酸检测等。抗体通常是在感染后3-8周能够被检测出来，检测HIV抗体的血清学诊断是发展最早、最便宜和最简单的HIV感染分析方法。虽然抗体检测具有明显的优点，但也存在对窗口期感染不能有效检出的缺点，原因是HIV感染窗口期机体还来不及产生相应的抗体，导致检测的假阴性。而此时HIV抗原已存在于血液中，能很好的弥补抗体检测带来的漏检，缩短检测窗口期。
HIV抗原能够在个体感染后先于血清转化2-18天检测到，其中HIV-1 p24蛋白是这些抗原物质最出众的一个靶抗原。p24抗原是病毒颗粒的主要核心蛋白，是病毒颗粒在成熟过程中由蛋白酶裂解HIV-1Gag蛋白而生成。p24蛋白序列高度保守，且性质稳定，在HIV-1感染早期就可以在血清中检测到，因此通过检测血清转化期HIV-1 p24抗原有着很大的优势，可作为早期辅助诊断HIV-1感染的一种方法，能够将检测窗口期缩短至感染后2-3周。目前临床普遍采用的第四代HIV诊断试剂就是在HIV抗体检测的基础上增加了HIV-1 p24抗原检测，第四代HIV检测方法同时检测HIV p24抗原和抗体，因此能够大大提高检测的灵敏度，同时可以缩短诊断“窗口期”。但是在临床诊断中，HIV第四代诊断试剂，特别是国产试剂，较容易出现假阳性的结果，其主要原因可能是第四代诊断试剂均采用在固相载体上同时包被抗p24的单克隆抗体和HIV抗原，而载体的表面积是固定不变的，因此在制备试剂的过程中，吸附到载体上的抗原和抗体的量均受到了限制，导致检测的过程中出现了相互干扰的现象。同时基于ELISA、电化学发光等方法开发的第四代HIV抗原抗体检测试剂，还存在成本较高，需要特殊的仪器设备和专业技术人员来操作，故不适合作为一线医疗机构或者家庭自测的HIV初筛检测。因此尝试开发一种更经济、更快速，且灵敏准确的HIV-1 p24抗原检测方法就十分重要，对艾滋病的防控意义重大。为了灵敏特异的检出HIV-1 p24抗原，就需要优质的HIV-1 p24单克隆抗体，但目前市面上还缺乏优质的p24单克隆抗体，这对HIV-1 p24抗原的免疫快速诊断试剂开发带来一定困难。因此，开发优质的HIV-1 p24单克隆抗体具有重要的市场价值和临床意义。
胶体金免疫层析法是一种经济快速，应用场景广泛的检测方法。因其操作便捷、不需要特殊设备和场地，是目前最适合在基层医疗机构和家庭自测中推广使用的方法。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在一定缺陷，如对样本的敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等。因此，提高抗单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重要手段。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用杂交瘤单克隆抗体制备技术，获取特异分泌HIV-1p24单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并从中筛选到高特异、高灵敏的HIV-1 p24抗体对。基于筛选的HIV-1 p24单克隆抗体对，采用胶体金标记技术与免疫层技术相结合的方式，研发高灵敏HIV-1 p24抗原检测试纸条，从而达到早期诊断HIV感染的目的。该发明试纸基于双抗体夹心法，将特异性的HIV-1 p24单克隆抗体包被固定在NC膜上作为检测线T，羊抗鼠IgG包被固定在NC膜上作为质控线C，胶体金标记的HIV-1 p24单克隆抗体作为检测试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，形成抗原抗体-胶体金复合物，该复合物再移动至NC膜固定有捕获抗体的区域，复合物又与固定的抗体发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，形成肉眼可见的红色条带，从而判定是否是HIV-1 p24阳性，结合HIV抗体检测，判断是否是HIV早期感染。整个检测过程只需要5-10分钟，且结果判读方便准确。该HIV-1 p24抗原检测试纸能有效的检出HIV早期感染，且操作简单、成本低廉、结果判读方便准确，故适合在各级医疗机构推广应用，特别适合献血员初筛检测，床旁快速检测以及家庭自测使用。因此，本发明的目的之一在于提供一种检测HIV-1 p24抗原的杂交瘤细胞GC4；本发明的目的之二在于提供所述杂交瘤细胞GC4分泌的单克隆抗体GC4；本发明的目的之三在于提供所述单克隆抗体GC4在制备检测HIV-1 p24抗原的检测试纸中的应用；本发明的目的之四在于提供含有所述单克隆抗体GC4的检测试纸。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、检测HIV-1 p24抗原的杂交瘤细胞GC4，所述杂交瘤细胞GC4保藏编号为GDMCCNo：63838，保藏日期为2023年09月26日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。
2、所述杂交瘤细胞GC4分泌的单克隆抗体GC4。
3、所述单克隆抗体GC4在制备检测HIV-1 p24抗原的检测试剂中的应用。
本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法、免疫荧光层析法、酶联免疫法或化学发光法。
4、含有所述单克隆抗体GC4的检测试剂。
本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法。
本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测T线和质控C线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测T线包被抗体GC4，所述胶体金垫上结合抗体HB3，所述抗体HB3由杂交瘤细胞HB3分泌。
本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测T线和质控C线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测T线包被抗体GC4，所述胶体金垫上标记抗体HB3，所述抗体HB3由杂交瘤细胞HB3分泌。
优选的，所述质控C线上包被l.5mg/mL羊抗鼠IgG；所述T线上的单抗包被浓度为1.25mg/mL；所述胶体金标记的抗体按1mL胶体金结合30μg的抗体。
优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。
优选的，所述质控C线包被羊抗鼠IgG本发明优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。
本发明优选的，所述质控C线包被羊抗鼠IgG。
本发明的有益效果在于：本发明公开了检测HIV-1 p24抗原的杂交瘤细胞GC4，还公开了由该杂交瘤细胞GC4分泌的单克隆抗体，分泌的抗体能够与保藏编号为GDMCC No：63839的杂交瘤细胞株分泌的HB3抗体配对，用于检测HIV-1 p24抗原具有特异性好和灵敏度高的优点，因此可以制备检测HIV-1 p24抗原的试剂，也可以与配对抗体开发检测HIV-1p24抗原的试剂条，为HIV-1 p24抗原的检测提供了新的工具。
本发明受国家自然科学基金项目资助，项目名称：基于量子点标记技术对艾滋病早期感染快速诊断的研究，项目编号：81960391
生物材料保藏
本发明的BABL/C小鼠杂交瘤细HIV-1 p24抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株HB3保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为GDMCC No：63839，保藏日期为2023年09月26日，分类命名为BABL/C小鼠杂交瘤细胞。
本发明的BABL/C小鼠杂交瘤细HIV-1 p24抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株GC4保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为GDMCC No：63838，保藏日期为2023年09月26日，分类命名为BABL/C小鼠杂交瘤细胞。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，对HIV-1 p24配对抗体(GC4/HB3)胶体金试纸条进行灵敏度评价结果图。
图2是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，对70份HIV-1阴性血清做了特异性检测实验的结果图。
图3为免疫胶体金试纸的组装结构示意图(1、样品垫；2、被衬底板；3、胶体金垫；4、T线；5、C线；6、纤维素膜；7、吸收垫)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为GDMCC No：63838；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为GDMCC No：63839。
本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为GDMCC No：63838；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为GDMCC No：63839。
本发明还提供了如上所述的单克隆抗体和如上所述的单克隆抗体对在检测HIV-1p24抗原中的用途。
再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对。其中，所述单克隆抗体对为如上所述的单克隆抗体对。
其中，所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为GDMCC No：63838；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为GDMCC No：63839。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例中，所用的试剂均为商购获得。
实施例1、HIV-1P24抗原的制备
根据NCBI提供的HIV-1(B亚型)的基因序列号，设计针对原核表达载体pQE30的p24全长表达引物(见表1)。采用分子克隆技术，将HIV-1核心蛋白p24全长基因序列克隆入pQE30表达载体，融合表达，并对诱导表达条件如细菌密度，诱导温度，诱导时间，IPGT浓度等进行优化。采用亲和层析方法纯化表达抗原，获得抗原性最佳的重组蛋白，并用ELISA、Western Blot分析比较其抗原性。引物合成、测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，具体所用引物序列如表1所示。
表1、所用引物序列
名称 引物序列 引入酶切位点
PF1 5’-AGTGGATCCCCCATAGTGCAGAACCTC-3’ BamH I
PR2 5’-CCGGGTACCTTAGAAAACTCTTGCTTTATG-3’ Kpn I
以HIV-1全基因组质粒pHIV-1为模板，PF1和PR2所示序列为引物进行PCR反应，PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃补充延伸5min。收集扩增产物，然后用BamH I和Kpn I消化后回收目的片段，然后通过T4 DNA连接酶连入BamH I和Kpn I限制性内切酶消化的表达载体pQE30上，4℃过夜连接后，连接产物转化入大肠杆菌(E.coli)JM109的感受态细胞中，涂布在加有Amp(50mg/mL)的LB平板上进行重组转化的白色菌落筛选。质粒提取及酶切鉴定后送于上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。将测序正确的质粒转化入大肠杆菌(E.coli)SG13009的感受态细胞中，在含有50μg/mL的Km抗生素的平板上进行筛选并进行质粒的酶切鉴定。
将转入有pQE30-p24的SG13009接入到含接种到含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)和氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)的20ml液体LB培养基中，37℃，150rpm摇床培养1.5-2.5h。待OD600达到0.6-0.8之间时加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃，150rpm，摇床诱导培养过夜，后4℃，6,000×g离心15min收集细菌。向收集的细胞中加入1/20培养体积的NTA-0缓冲液和终浓度1mM的PMSF溶液，此步骤须冰浴。加入TritonX-100，使其终浓度为0.05％，充分混匀，冰浴10min。冰浴状态下超声破碎细胞，4℃，12,000×g离心30min，取上清液。上清液为粗提物，取少量上清液进行SDS-PAGE电泳检测，其余上清液加入50％(w/v)甘油，混匀后于-20℃保存备用。
从上清液中提纯HIV-1 p24抗原，融合蛋白的N端含有His-Tag，因此采用Ni-NTA偶联的NTA树脂进行亲和层析纯化。将粗提物加入层析柱中，控制流速，为增加纯化效率，可进行反复上样，收集流出液，用于SDS-PAGE。而后层析柱用含不同咪唑梯度(10mM，50mM，100mM，150mM，200mM，500mM)的NTA洗脱液洗脱蛋白，分部收集洗脱液。当洗脱液中的咪唑浓度在150mM时，蛋白洗脱量最大。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的蛋白纯度后用透析液(20mM Hepes、pH7.5、1mM DTT、200mM KCl和50％甘油)对纯化蛋白进行透析，将纯化的蛋白分装，-80℃保存。
实施例2、HIV-1 p24抗原单克隆抗体的制备及鉴定
1、BALB/c小鼠的免疫
将6-8W+的BALB/c雌性小鼠按p24抗原注射剂量分为三组进行免疫，即100μg/只、200μg/只、300μg/只(即实施例1得到的HIV-1 p24抗原)，共免疫3次。初次免疫前取眼血作为阴性对照，初次免疫时加等体积福氏完全佐剂充分乳化后进行皮下多点注射；以后隔一周进行一次免疫，以相同剂量重组抗原加等体积福氏不完全佐剂皮下多点注射。最后一次免疫结束后10天左右用间接ELISA测定小鼠血清的抗体效价；融合前三天对抗体效价最高的(1:105以上)小鼠尾静脉注射加强免疫(50μg)，加强免疫三天后进行细胞融合。
2、细胞融合
A、饲养细胞制备：细胞融合前一天，按照以下方法制备饲养层细胞：
(1)将8W+健康雄性BALB/c小鼠，拉颈处死后，于75％乙醇浸泡2-3min；
(2)移至超净台内，以仰卧位固定在解剖板上，剥开腹部皮肤，暴露腹膜。
(3)用止血钳轻轻拉起腹膜，将10mL预温的1640培养基用注射器注入腹腔，用棉球轻揉腹腔1-2min，吸出细胞悬液，放入离心管中；
(4)离心：1000rpm，5min，弃上清；
(5)用10mL含血清HAT培养基将细胞混匀，细胞计数，调整细胞密度于2×105/mL；
(6)将此细胞悬液按100μL/孔加入96孔细胞培养板，则细胞密度为2×104/孔；
(7)置37℃，5％ CO2孵箱培养，供次日融合实验用。
B、骨髓瘤细胞SP2/0的制备
(1)融合前5-7天复苏骨髓瘤细胞SP2/0；
(2)融合前收获对数生长期SP2/0细胞，1000rpm离心5min，用1640培养基洗涤3次，弃上清；
(3)用1640培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，进行细胞计数，要求细胞活力>95％，并调整细胞密度待用。
C、脾细胞的制备
(1)将3天前经过冲击免疫的BALB/c小鼠摘除眼球放血，收集眼血作为阳性对照。断颈处死，于75％乙醇浸泡2min；
(2)移至超净台内，剪开腹部皮肤和腹膜，取出脾脏，用1640培养基冲洗已剔除覆着的脂肪和结缔组织的脾脏；
(3)将脾脏置于200目的筛网上，用注射器芯轻轻地研磨，并用培养液冲洗，收集脾细胞悬液，离心1000rpm，5min，弃上清；
(4)用1640培养基重悬细胞，1000rpm，5min离心，洗涤2次，弃上清；
(5)用10mL不完全培养基重悬；取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，要求细胞活力>95％，并计数脾细胞，剩余细胞调整细胞密度待用。
D、细胞融合及培养
(1)将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1比例放于50mL离心管中混匀，1000rpm离心5min，弃上清，用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散；
(2)一边轻摇离心管，一边用1mL吸管滴加50℃预温的50％ PEG 4000 1mL，于1min内完成；
(3)加37℃预热的1640培养基1mL，在1min内完成；
(4)加37℃预热的1640培养基10mL，在5min内完成；
(5)800rpm离心8min；用100mL HAT培养基重悬细胞沉淀；
(6)按100μL/孔将细胞悬液转移到接种了饲养细胞的细胞培养板中，同时留2孔加未经融合的SP2/0细胞作对照。所有培养板置于37℃、5％ CO2孵箱中培养；
(7)融合6天后，采用半量换液的方式更换HAT培养液。以后每3-5天半量换液一次；2周后，HT培养基半量换液，3-4周后，换完全培养基维持培养。
E、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
(1)融合后的细胞生长到培养孔底面积的1/4时(培养约12-15天左右)，取上清用间接ELISA法检测特异性反应和交叉反应，对杂交瘤细胞进行筛选。重组蛋白HIV-1 p24为包被抗原，包被浓度5μg/mL常规包被ELISA板。往包被ELISA板中加100μL/孔的细胞培养上清液，用PBS1:50稀释的免疫鼠血清为阳性对照，SP2/0细胞孔培养上清为阴性对照。细胞上清与包被ELISA板37℃孵育30min，充分洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，弃二抗。充分洗板后每孔加TMB 100μL显色15min，再加入1NH2SO4 50μL/孔终止反应，测定OD450值。
(3)ELISA筛选获得21株分泌HIV-1 p24单抗的细胞株；上述21株HIV-1 p24单抗的细胞株所分泌的单克隆抗体均对重组HIV-1 p24抗原具有阳性反应。选择其中阳性反应最强的8株细胞进一步亚克隆培养，其余细胞株直接扩大培养，冻存和少量生产腹水。
F、有限稀释法进行克隆化培养
(1)克隆化的前一天按照上述方式制备饲养层细胞；用HT培养液按100μL/孔接种于96孔培养板中；
(2)用移液器将待克隆的细胞吹打混匀，用含20％血清的HT选择培养液稀释至1个细胞/孔的密度；加到已有饲养细胞的细胞板，置5％CO2、37℃的培养箱中进行培养；
(3)培养至第3天时，在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔；培养1周左右，吸取100μL已变黄的细胞培养液上清，用上述ELISA法进行检测；
(4)一般需进行2-3次亚克隆，直到最后一次所有仅一个细胞集落生长的培养孔上清ELISA检测结果均为阳性为止；
(5)将阳性孔杂交瘤细胞转入24孔培养板中扩大培养，待细胞数目足够多时，ELISA检测杂交瘤培养上清，检测仍为阳性的细胞株进一步扩大培养，并冻存。
3、单克隆抗体的制备
A、腹水的制备
(1)向10周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只；
(2)一周后，腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/mL杂交瘤细胞；
(3)5天后观察，当小鼠腹部明显膨胀时，用12号注射针头收集腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡；
(4)将腹水以7500rpm，离心10min；取上清分装后-80℃冰箱保存。
B、单克隆抗体的纯化(protein A亲和层析)
(1)平衡：加入10倍柱体积的Equilibration Buffer平衡protein A柱子；
(2)上样：将腹水上样，使腹水缓慢流过凝胶床；如有必要，可将收集的流出液再次上柱；
(3)淋洗：加入10倍柱体积的Equilibration Buffer，按4-5mL/管收集穿透液直至OD280<0.1；
(4)洗脱：用5倍柱体积的Elution Buffer(50mM glycine，0.5M NaCl，pH 2.3)洗脱，收集洗脱液的试管按500μL/管加入中和缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.7)，按1.5mL/管收集洗脱液直至OD280<0.1；
(5)用5倍柱体积的Equilibration Buffer洗柱及平衡柱子。
C、单克隆抗体配对筛选
将所获得的21株纯化单抗两两组合，共得到(21×21)对组合，每对组合中的两个抗体分别包被硝酸纤维素膜和标记胶体金，制备胶体金试纸条，通过对HIV-1 p24重组抗原检测进行灵敏性筛选，对gp41和gp36进行特异性筛选，最后筛选出只针对HIV-1 p24高特异性高灵敏性的配对单抗。
D、单克隆抗体的金标及膜制备
制备胶体金颗粒：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒。具体方法为：用超纯水将氯金酸配制成0.01％水溶液，取100mL与1.2mL 1％的柠檬酸三钠水溶液混合，加热至持续沸腾5min。冷却后用超纯水恢复至原体积，制成颗粒直径约为30nm的胶体金颗粒。
确定胶体金标记的抗体最适稳定量：采用经典MEY法确定标记1mL胶体金所需要的抗体用量为30μg。
硝酸纤维素膜(NC)的包被：C线：l.5mg/mL羊抗鼠IgG(0.0l M pH 7.2的PBS缓冲液稀释)；T线：1.25mg/mL纯化单抗(0.0l M pH 7.2的PBS缓冲液稀释)。用BIODOT公司XYZ3050工作系统以30mm/s速度喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，37℃烘干。
E、免疫胶体金试纸的组装
将包被了C线5和T线4的硝酸纤维素膜6，吸收垫7，胶体金垫3以及样品垫1依次粘附于不吸水的PVC被衬底板2上，如图3组装成免疫胶体金试纸。
F、单克隆抗体的配对筛选
21株单克隆抗体，一共获得21×21(441)组配对单克隆抗体，组合成441种胶体金试纸条。配对筛选时以健康人血清作为阴性样本，重组HIV-1 p24抗原200ng/mL阳性样本，对每一种试纸条进行测试。将针对重组HIV-1 p24抗原呈阳性反应，而对健康人血清呈阴性反应的7株，8对配对单克隆抗体筛选出来作为候选的配对单抗。对于候选的8对配对单抗，进一步筛选检测重组HIV-1 p24抗原、HIV-1早期感染患者血清、HIV阴性血清、HBV、HCV、TP阳性血清、HIV-2感染血清。选择对重组HIV-1 p24抗原检测灵敏度达到0.1ng/mL水平，对HIV-1早期感染患者血清反应最强，而对其他样本没有交叉反应的配对单克隆抗体作为制备双抗体夹心法检测试剂盒的配对单克隆抗体。实验最终得到第一单克隆抗体GC4包被在T线上单抗，第二单克隆抗体HB3与胶体金结合。
G、配对抗体优化
(1)包被抗体GC4的浓度
将筛选出来的包被抗体GC4，稀释至1.0mg/mL；1.25mg/mL；1.5mg/mL，2.0mg/mL，包被至NC膜，烘干备用。
(2)标记抗体HB3的标记条件和胶体金抗体偶联溶液的浓度
将筛选出来的标记抗体HB3，进一步细化标记条件。选出最好的标记条件后，重新制备胶体金抗体偶联溶液，将溶液调节至不同浓度涂布胶体金垫。
(3)制备好的胶体金垫与不同浓度的膜两两交叉配对，找到最佳的包被和胶体金垫浓度配比。实验结果如表2所示：
表2、HB3不同标记条件与GC4不同包被条件配对筛选
配对结果显示，包被浓度高于1.5mg/mL会有假阳出现。标记条件K值为5时最好，A值10和12在相同的检测浓度下，T线显色强度没有明显差异，因此选择最小标记用量K5A10。进一步比较包被浓度在1mg/mL，1.25mg/mL在相同标记条件下，不同胶体金垫尺寸的检测灵敏度差异以及特异性。包被浓度与胶体金垫不同尺寸的配对结果如表3所示。
表3、GC4不同包被条件与HB3不同金垫宽度配对筛选
在胶体金垫尺寸超过12mm，灵敏度会增强，但反应时间会延长，且有假阳性结果，因此不予选用。该配对抗体最低的检测灵敏度是100pg/mL，因此选择包被浓度最低，胶体金浓度用量合适，可以达到最低检测灵敏度为100pg/mL的配对，该配对为GC4包被浓度1.25mg/mL，HB3胶体金垫50d尺寸10mm左右，最终用量根据必须达到检测灵敏度100pg/mL决定。
H、单克隆抗体亚类的鉴定
利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(Sigma公司)对各株单抗进行亚类鉴定，具体试验方法如下：
(1)分别用1:1000倍PBS稀释的羊抗鼠IgG(IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)包被酶标板，100μL/孔，37℃放置1h。
(2)弃去酶标板中液体，用PBST洗涤3次。
(3)按100μL/孔加入PBS稀释后的纯化单克隆抗体(抗体浓度2-5μg/ml)，室温孵育1h；PBST洗涤3次。
(4)加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，室温孵育30min。
(5)充分洗板后每孔加100μL TMB，显色15min，再加入1N H2SO4 50μL/孔终止反应，测定OD450值。单克隆抗体亚类的鉴定结果如表4所示。
表4、单克隆抗体亚类
抗体 GC4 HB3
抗体亚类 IgG1 IgG1
I、配对抗体灵敏度评价：
本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体GC4和第二单克隆抗体HB3，对重组HIV-1 p24抗原检测灵敏度达100pg/mL；对HIV-1早期感染(p24高浓度)血清50倍稀释后仍然能够检出(图1和表5)。
表5、灵敏度评价结果
膜包被抗体(第一单克隆抗体) GC4
胶体金标记抗体(第二单克隆抗体) HB3
HIV-1 p24 1μg/mL ++++
HIV-1 p24 500ng/mL +++
HIV-1 p24 200ng/mL +++
HIV-1 p24 100ng/mL ++
HIV-1 p24 50ng/mL ++
HIV-1 p24 10ng/mL +
HIV-1 p24 1ng/mL +
HIV-1 p24 0.1ng/mL ±
HIV阴性血清 -
HIV-1早期感染血清 ++++
HIV-1早期感染血清(2倍稀释) ++++
HIV-1早期感染血清(5倍稀释) +++
HIV-1早期感染血清(10倍稀释) ++
HIV-1早期感染血清(20倍稀释) ++
HIV-1早期感染血清(40倍稀释) +
HIV-1早期感染血清(50倍稀释) ±
HIV-1早期感染血清(100倍稀释) -
HIV阴性血清 -
J、配对抗体特异性评价
本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体GC4和第二单克隆抗体HB3，对16份健康人血清、16份HBV阳性血清、14份HCV阳性血清、15份TP阳性血清、9份HIV-2阳性血清(排除HIV-1感染)，共70份血清样本做了特异性检测实验。检测结果如图2及表6所示。
表6、特异性评价结果
对单克隆抗体GC4-HB3检测70份非HIV-1 p24阳性的血清标本均为阴性结果，与HBV、HCV、TP阳性样本均没有交叉反应，与HIV-2血清样本均无反应，显示了良好的特异性。
将产GC4单克隆抗体的BABL/C小鼠杂交瘤细胞HIV-1 p24抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株GC4进行保藏，保藏编号为GDMCC No：63838，保藏日期为2023年09月26日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，分类命名为BABL/C小鼠杂交瘤细胞；将产HB3单克隆抗体的BABL/C小鼠杂交瘤细胞HIV-1 p24抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株HB3进行保藏，保藏编号为GDMCC No：63839，保藏日期为2023年09月26日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，分类命名为BABL/C小鼠杂交瘤细胞。
由此得出，本发明筛选到了一对单克隆抗体，能够通过免疫胶体金试纸，对重组HIV-1p24抗原检测灵敏度达100pg/mL，对HIV-1 p24阳性血清样本稀释50倍可检出，对70份HIV-1阴性的血清样本不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.检测HIV-1p24抗原的杂交瘤细胞GC4，其特征在于：所述杂交瘤细胞GC4保藏编号为GDMCC No：63838，保藏日期为2023年09月26日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞GC4分泌的单克隆抗体GC4。
3.权利要求2所述单克隆抗体GC4在制备检测HIV-1p24抗原的检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测试剂的检测原理为胶体金法、免疫荧光层析法、酶联免疫法或化学发光法。
5.含有权利要求2所述单克隆抗体GC4的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于：所述检测试剂的检测原理为胶体金法。
7.根据权利要求6所述的检测试剂，其特征在于：所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测T线和质控C线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测T线包被抗体GC4，所述胶体金垫上标记抗体HB3，所述抗体HB3由杂交瘤细胞HB3分泌。
8.根据权利要求7所述的检测试剂，其特征在于：所述质控C线上包被1.5mg/mL羊抗鼠IgG；所述T线上的单抗包被浓度为1.25mg/mL；所述胶体金标记的抗体按1mL胶体金结合30μg的抗体。
9.根据权利要求7所述的检测试剂，其特征在于：所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。
10.根据权利要求9所述的检测试剂，其特征在于：所述质控C线包被羊抗鼠IgG。
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