CN116284384A - 孕酮重组单克隆抗体制备方法及应用 - Google Patents

孕酮重组单克隆抗体制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及孕酮重组单克隆抗体制备方法及应用。本发明利用筛选得到一种性能优异的孕酮重组兔单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。实验结果表明，本发明所述的孕酮重组兔单克隆抗体蛋白表达量大，特异性强，灵敏度高，可应用于孕早期自发性流产危险性评估及预测不良妊娠、确定排卵、评价黄体功能缺失等临床诊断，同时该抗体应用于检测血清中孕酮含量，准确度高、重复性好、稳定性强，具有良好的临床应用价值。

Description

孕酮重组单克隆抗体制备方法及应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及孕酮重组单克隆抗体制备方法及应用。
背景技术
孕酮(英文名称为:Progesterone)是一种甾体类激素，是一种涉及女性月经周期、妊娠和对胚胎有影响的类固醇，是类固醇生物合成过程中生成的第一个具有生物活性的化合物。主要由黄体及胎盘产生，血液中的孕酮多半与血浆蛋白结合。只有极少量以游离型存在，主要结合蛋白有类固醇结合蛋白、白蛋白、性激素结合蛋白，与白蛋白和类固醇结合蛋白结合占大部分，具有生物活性的游离型孕酮仅占总孕酮的2.5～3％。
孕酮参与女性月经周期，支援怀孕与胚胎形成，是生殖过程中关键的激素。一般情况下，孕酮含量在正常妊娠的第11周开始上升，到第35周达到峰值。异位妊娠病人血清中的孕酮含量低于正常妊娠，联合β-HCG检测可应用于异位妊娠的预测；孕酮检测还用于确认排卵、评价黄体功能缺失，检验诱导排卵过程的有效性等。目前认为，结合孕酮的检测是除了子宫内膜活检以外可以正确评价黄体功能的一种方法，甚至可以替代子宫内膜活检。
孕酮检测的临床意义对于孕期的女性尤为重要。但孕酮为类固醇类小分子物质，有抗原性无免疫原性，因此要获得高特异性孕酮抗体难度很大。在血液样本中通常存在很多与孕酮结构类似的类固醇类小分子物质，这些物质对孕酮的检测会形成干扰，同时小分子物质在检测过程中容易受空间位阻和基质效应的影响。在小分子类物质免疫检测中普遍存在灵敏度不高、线性范围窄、准确度不足的问题。故需要筛选特异性强，灵敏度高的单克隆抗体。
噬菌体展示技术是一项独特的基因重组表达技术，也一种简便、有效的筛选工具，将免疫后的的免疫器官中的整套编码抗体基因序列通过分子克隆技术整合到到载体上，形成抗体文库。噬菌体与抗原结合被选择，以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面，用酸性或碱性溶液洗脱冲洗载体后获得抗原结合的噬菌体，通过多轮的淘选可获得特异性抗体。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供孕酮重组单克隆抗体制备方法及应用。
本发明提供了孕酮单克隆抗体，其是将抗原免疫新西兰大白兔后经过噬菌体展示技术筛选得到，实验表明，与其它抗体相比，含有本发明所述的孕酮单克隆抗体的噬菌体亲和力高、特异性强。
进一步的，本发明所述的抗原由将EDC和NHS滴加到P-11-HS中制成活性中间体P-11-HS-NHS后与KLH蛋白交联制成。
本发明中，所述的孕酮单克隆抗体，
其重链的CDR区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:5、6或7所示序列中的至少一种；
其轻链的CDR区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:8、9或10所示序列中的至少一种。
进一步的，本发明所述的孕酮单克隆抗体，
其重链的三个CDR区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:5、6和7所示；
其轻链的三个CDR区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:8、9和10所示。
更进一步的，所述孕酮单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述孕酮单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述的孕酮单克隆抗体的重链的恒定区为兔IgG1亚型；所述的孕酮单克隆抗体的轻链的恒定区为兔K1型。
本发明利用噬菌体展示技术，经筛选获得了本发明所述的孕酮重组兔单抗，该单抗特异性强，检测灵敏度高，利用该抗体开发体外诊断试剂盒，灵敏度强，准确度高。
本发明提供了编码所述孕酮单克隆抗体的核酸。
进一步的，所述的核酸包括：
编码所述孕酮单克隆抗体的重链可变区的核酸，其具有如SEQ ID NO:3所示的序列；
编码所述孕酮单克隆抗体的轻链可变区的核酸，其具有如SEQ ID NO:4所示的序列。
更进一步的，编码所述孕酮单克隆抗体的重链可变区的核酸包括如下所示中的任意一种或多种：
与如SEQ ID NO:3所示的核酸具有至少80％同源性且与SEQ ID NO:3所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；
如SEQ ID NO:3所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；
与如SEQ ID NO:3所示的核酸互补或部分互补的核酸。
更进一步的，编码所述孕酮单克隆抗体的轻链可变区的核酸包括如下所示中的任意一种或多种：
与如SEQ ID NO:4所示的核酸具有至少80％同源性且与SEQ ID NO:4所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；
如SEQ ID NO:4所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；
与如SEQ ID NO:4所示的核酸互补或部分互补的核酸。
本发明提供了表达模块，其包括启动子、终止子和本发明所述的核酸。
进一步的，所述的表达模块还包括单个或多个本发明所述的核酸以串联、融合表达或其他可行方式进行组合形成的表达模块，本发明对此不做限定。
本发明还提供了的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、跨膜信号肽和同源重组位点，例如启动子的增强子，ITR序列、polyA、MIS信号肽等。
本发明提供了重组载体，其包括载体骨架和本发明所述的核酸。
进一步的，本发明所述的载体骨架的来源包括植物、动物、细菌、真菌、噬菌体、或病毒，本发明对此不做限定。所述的噬菌体载体包括噬菌粒和辅助载体，所述的噬菌粒包括但不限于pBluescript II-KS(+)、pcomb3XSS、pCANTAB5E或pKK233.3。所述的哺乳动物表达载体包括但不限于pcDNA 3.1，pIRES，pTT3，pCEP4，pATX1、或pCHO1.0。所述的细菌载体包括但不限于pET28a、pET16b、pET26b、pET28a、pET31b、pBAD、pBADHis、pTrc99a、pTrcHis、pACYCduet-1、pET duet-1、pCDFduet-1、pColdI、pColdII等。所述的真菌载体包括但不限于pYES2、pYES3、pYES6、pAUR23等。
本发明的一些实施例中，将编码所述孕酮单克隆抗体的核酸与载体骨架pCMV3进行整合，构建完成能够在宿主细胞内复制和表达的重组载体。
本发明所述重组的载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对病毒、微生物或哺乳动物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。具体实施例中，编码本发明提供的孕酮单克隆抗体的核酸可构建于各种表达载体中。
本发明提供了宿主细胞，其包括如下I)～III)所示中的至少一种：
I)、分泌如本发明所述的孕酮单克隆抗体；
II)、基因组整合如本发明所述的核酸；
III)、转染或转化如本发明所述的重组载体。
本发明中，所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。本发明一些实施例中，利用腺相关病毒对所述宿主进行转染。
本发明提供的宿主细胞，来源包括植物、动物、微生物或病毒，本发明对此不做限定。本发明使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞，这样转化的宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。
进一步的，在一些具体实施例中，本发明所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，具体的选自HEK-293、HEK293T、Hep G2、HELA、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH3T3、A204、A549、D-407、CHO、HCS-2、HT-29、U87、Sf9、或FD-CHOS中的至少一种。在一些具体实施例中，本发明所述的宿主细胞为HEK-293细胞，用于所述的孕酮单克隆抗体的表达，结果表明，本发明所述的孕酮单克隆抗体表达量大、纯度高，浓度大，可满足生产需求，在临床诊断试剂中有很好的应用前景。
本发明提供了孕酮单克隆抗体的制备方法，其为培养如本发明所述的宿主，获得孕酮单克隆抗体。
本发明提供了标记抗体，其包括标记物和：
本发明所述的孕酮单克隆抗体；
或本发明所述的制备方法制得的孕酮单克隆抗体的培养物。
进一步的，所述标记物包括化学标记物和生物标记物；所述化学标记为同位素和/或化学药物；所述生物标记包括生物素、亲和素或酶标记，所述酶标记优选辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
本发明提供了偶联物，其包括偶联介质和：
本发明所述的孕酮单克隆抗体；
或本发明所述的制备方法制得的孕酮单克隆抗体的培养物。
进一步的，所述偶联介质为固体介质或半固体介质。
更进一步的，所述偶联介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。
本发明提供了如下a)～f)所示中的任意一项在检测血清中孕酮水平的产品中的应用：
a)、本发明所述的孕酮单克隆抗体；
b)、发明所述的核酸；
c)、发明所述的重组载体；
d)、发明所述的宿主细胞；
e)、发明所述的制备方法制得的含有孕酮单克隆抗体的培养物；
f)、发明所述的标记抗体；
g)、发明所述的偶联物。
本发明提供了检测血清中孕酮水平的产品，其包括如下A)～D)所示中的任意一种：
A)、本发明所述的孕酮单克隆抗体；
B)、本发明所述的制备方法制得的含有孕酮单克隆抗体的培养物；
C)、本发明所述的标记抗体；
D)、本发明所述的偶联物。
进一步的，本发明所述的产品可以为试纸条，其上包被有本发明所述的孕酮单克隆抗体。
更进一步的，本发明所述的产品可以为试剂盒。所述的试剂盒还包括：包被缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液。
一些实施例中，所述试剂盒适用于孕酮的磁微粒化学发光。
本发明的一些具体实施例中，所述的孕酮重组兔单克隆抗体作为检测抗体应用于孕酮的检测，具有良好的准确度及灵敏度，并且重复性良好。
血清孕酮的检测方法，其为利用本发明所述的产品进行孕酮检测。
本发明提供的孕酮重组单克隆抗体适用于孕酮的免疫学检测。
本发明利用筛选得到一种性能优异的孕酮重组兔单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。实验结果表明，本发明所述的孕酮重组兔单克隆抗体蛋白表达量大，特异性强，灵敏度高，可应用于孕早期自发性流产危险性评估及预测不良妊娠、确定排卵、评价黄体功能缺失等临床诊断，同时该抗体应用于检测血清中孕酮含量，准确度高、重复性好、稳定性强，具有良好的临床应用价值。
附图说明
图1示免疫原制备；
图2为提取脾脏RNA琼脂糖凝胶电泳图；
图3为VL基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4为VH基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图5为scFv基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图6为抗体库重组率菌液PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
图7为重组抗体纯化SDS-PAGE电泳图；
图8为本发明抗体2与参比厂家临床检测相关性分析；
图9为本发明抗体6与参比厂家临床检测相关性分析；
图10为本发明抗体2测试结果与理论浓度之间的偏差；
图11为本发明抗体6测试结果与理论浓度之间的偏差。
具体实施方式
本发明提供了孕酮重组单克隆抗体制备方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols inMolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。
抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。
“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。
天然抗体噬菌体文库制备的一般流程是：提取免疫抗体细胞总RNA，常从免疫器官和/或外周血中获得。
抗体2的重链可变区的氨基酸序列为：QSLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGLSLSSNEIIWVRQAPGNGLEWVGGIDR SANTYYASWAKGRSTVTRNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGYDVAYAFNIWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)。
抗体2的轻链可变区的氨基酸序列为：ALVMTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASQSVYNNNNLSWYQQKPGQPPKLLI YSASILASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYSTAAAFG GGTKLEIK(SEQ ID NO:2)。
抗体2的重链可变区的核苷酸序列为：cagtcgctggaggagtccgggggaggcctggtcaagcctggaggatccctgacactcacctgcacagtctctggattatccctcagtagcaatgaaataatctgggtccgccaggctccagggaacgggctggaatgggtcggaggcattgataggagtgcgaacacatactacgcgagctgggcgaaaggccgatccaccgtcaccagaaacaccaacctgaacacggtgactctgaaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacttatttctgtgcgagaggtggttatgatgttgcttatgcttttaatatttggggcccaggcaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:3)。
抗体2的轻链可变区的核苷酸序列为：gcccttgtgatgacccagactccatcccctgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaactgccaggccagtcagagtgtttataataacaacaacttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaaactcctgatctattctgcatccattctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtctaggaggatatagtactgctgcggctttcggcggaggaaccaagctggagatcaaa(SEQ ID NO:4)。
重链可变区的CDR1氨基酸序列为：GLSLSSNE(SEQ ID NO:5)。
重链可变区的CDR2氨基酸序列为：IDRSANT(SEQ ID NO:6)。
重链可变区的CDR3氨基酸序列为：ARGGYDVAYAFNI(SEQ ID NO:7)。
轻链可变区的CDR1氨基酸序列为：QSVYNNNN(SEQ ID NO:8)。
轻链可变区的CDR2氨基酸序列为：SAS(SEQ ID NO:9)。
轻链可变区的CDR3氨基酸序列为：LGGYSTAAA(SEQ ID NO:10)。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明提供的噬菌体平台筛选准备工作：
1、免疫原制备如图1所示：
将EDC(1.53mg，0.153mL)和NHS(3.82mg，0.153mL)混匀，将混合液室温下缓慢滴加到P-11-HS(1.72mg，0.344mL)的DMSO溶液中，室温震荡反应用以形成活性中间体P-11-HS-NHS，再将该活性中间体室温下缓慢滴加到交联蛋白KLH(20mg，2mL)的溶液中，加完后室温震荡反应，反应结束后，将混合物在中性磷酸盐缓冲液中透析，结束后转移至4毫升玻璃瓶中并记录体积。
2、动物免疫：
用制备的抗原P-11-HS-KLH免疫新西兰大白兔3次以上，免疫间隔周期为30天。首次免疫剂量为0.5mg，将免疫抗原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后背部皮下多点注射免疫动物。二免及后续免疫抗原剂量减半，三次免疫十天后进行耳缘静脉取血，37℃静置放置1h，低温低速离心10min，收集抗血清进行滴度评价。
3、抗血清滴度检测
血清滴度是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的—个半定量指标，即在给定的条件下，结合—定量抗原的抗血清的稀释度。本发明检测方案如下：①将终浓度4μg/mL的鼠抗兔抗体加入到所需体积的0.05mol/L CB(pH＝9.6)包被缓冲液中，混合均匀后包被化学发光板；②使用无关蛋白37℃封闭2h，用于封闭暴漏位点；③将试验血清(444#、445#，它们是动物免疫中效价及抗血清较优势的兔子血清编号)从起始1/500倍比稀释，按照50μl/孔添加，同时设标杆厂家抗体作为阳性对照；④抗体结合至固相上，加入特异性酶标抗原，用于检测信号。测试结果如表1所示。效价达到1/32k及以上时，认为免疫效果较好，进行最后一次的加强免疫，三天后处死动物，保留脾脏备用。Trizol法常规提取脾组织总RNA(如图2所示)，反转录合成cDNA。
表1.抗血清滴度评价
Figure BDA0004176344620000091
Figure BDA0004176344620000101
实施例2scFv基因拼接及噬菌体筛选构建
scFv基因拼接：以实施例1获得的cDNA为模板，分别PCR扩增抗体的轻链可变区和重链可变区；PCR反应程序为：
表2.PCR扩增反应程序
Figure BDA0004176344620000102
PCR产物经1％琼脂糖凝胶回收，轻链可变区回收如图3，重链可变区回收如图4所示。将PCR扩增的轻链可变区与重链可变区使用overlap-PCR法拼接成为scFv，如图5所示。目的片段scFv与噬菌体粒载体经酶切连接后，电转化于电转感受态细胞TG1中，构建兔抗体基因文库，抗体基因文库重组率菌液PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图如图6所示。抗体基因文库经辅助噬菌体辅助制备噬菌体抗体文库，噬菌体抗体文库经3轮淘洗筛选后，挑取3轮出库单克隆菌株，并制备单克隆噬菌体抗体进行单克隆噬菌体ELISA评价，筛选部分优势克隆株构建抗体1～抗体6。其中部分序列和样品的诊断性能评估结果如表3。由结果可知，抗体2的效果最好，抗体6效果次之，挑选2株抗体进行后续实验。抗体2：其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
表3.重组抗体临床梯度评价
Figure BDA0004176344620000111
实施例4本发明重组单抗表达与抗体纯化
1、重组抗体表达
以阳性菌株scFv序列为模板，分别设计扩增VH和VL引物2对，并进行PCR扩增分别获得VH(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和VL(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)目的片段，本实验室前期构建重链表达载体Sig-RGFc-PCMV3和轻链表达载体Sig-RLFc-PCMV3经HindIII和BamHI双酶切，分别与相应的VH或VL进行同源重组，重组后的质粒转入感受态细胞后构建重轻链共表达载体。
将构建好的质粒摇菌培养，按照常规操作步骤提取足量质粒，包含重链及轻链。准备完毕后转染至细胞状态良好的HEK293细胞中，培养3天添加补料(补料为市售成品补料，添加体积为细胞培养上清的3.5％)，七天后细胞活率不低于65％，收获细胞上清。
2、抗体SPA纯化及SDS-PAGE鉴定柱平衡
本发明使用A蛋白填料纯化收集的细胞上清，首先，装填SPA柱5ml并设置流速8mL/min，用0.02mol/L PBS pH＝7.2～7.4作为平衡缓冲液冲洗层析柱,上样设置流速4mL/min，紫外峰图上升时开始收集流穿，平衡液平衡层析柱；设置流速8mL/min，用平衡缓冲液再次冲洗层析柱至紫外峰图下降至基线，停止收集流穿；使用0.2mol/L Gly+0.15mol/L NaClpH 2.7作为解离液，当紫外峰图开始上升时收集目的蛋白，紫外峰图下降至基线时停止收集，向收集管中添加1mol/L Tris pH 8.5中和至pH到7。收集的蛋白合并后SDS-PAGE检测，如图7所示。说明纯化浓缩后蛋白纯度高，浓度大，可用以诊断试剂应用。
实施例5本发明制备的孕酮重组兔单抗的试剂盒应用
本发明制备的孕酮重组兔单抗体作为磁珠包板抗体应用于试剂盒中，配合其他成分一起对样本中抗原进行测定。具体性能评估如下：
1、准确度测定：
采用现有的某主流商品化试剂盒定值86例临床样本进行检测，上样前临床样本需离心处理，去除样本状态的干扰。根据系统回算样本中孕酮浓度，与参比厂家进行相关性分析。根据检测结果可知，抗体2得到的线性方程为：y＝1.0147x+0.014，相关系数R2＝0.9932，结果见图8；抗体6得到的线性方程为：y＝0.9849x+0.757，相关系数为R2＝0.9902，结果见图9；根据以上结果判断，两株抗体临床准确的检测均满足体外诊断试剂需求。
2、精密性评估：
将临床高值、中值、低值样本使用同一批次试剂检测，每批测试各样本均重复测定20次，求平均值与标准差(SD)，计算变异系数CV％，用于评价批内精密度。3个水平的样本的批内变异系数(coefficient of variation，CV)均应不大于5.0％，结果见表4，说明试剂盒重复性良好，可用于诊断试剂盒开发。
表4.两株抗体精密性评估结果分析
Figure BDA0004176344620000121
3、灵敏度性能评价：
选择5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，连续检测4天。将检测得到的60个数据按照CLSI EP17-A的方法进行试剂盒空白限(LoB)和检出限(LoD)验证。本发明的两株抗体配制三批试剂盒后LoB值均小于0.05ng/mL，处于空白限内检测，说明抗体灵敏度较高，符合要求。
4、线性分析：
分别选择孕酮浓度接近预期线性范围上限130％左右的临床高值样本3份，与8份已知临床低值样本以不同比例混合，得到9个不同浓度的线性样本，并计算稀释后理论浓度值，最后计算测试结果与理论浓度之间的偏差。抗体2线性回归系数R2＝0.9969，结果见图10，抗体6线性回归稀释R2＝0.9967，结果见图11。稀释线性样本偏差小于15％，符合要求。
5、回收率性能评估：
选择高值样本3份，使用低值临床血清按照特定比例稀释高值样本，高值临床样本体积占比低于10％，制成回收样本。每个回收样本重复检测3次求均值，计算回收率。抗体2的样本回收率分别为97.33％、96.98％、97.87％，抗体6的样本回收率分别为103.82％、103.23％、102.5％，检测偏差均小于10％，两株抗体回收准确性均符合要求。
6、稳定性评估：
将试剂置于37℃条件下放置7天，并同时将同批次试剂置于2～8℃作为对照组，进行抗体稳定性能评估试验，具体结果如表5所示，经过热处理后的试剂的各项性能指标均能达到要求，并且测试结果未出现偏差。
表5.孕酮磁微粒检测试剂加速热稳定性结果
Figure BDA0004176344620000131
7.基质效应分析
挑选处于检测线性范围内的临床样本20份，样本状态正常，无溶血，不存在明显沉淀物，状态澄清。根据需要选取基质为混合血清、质控品基质等，且包含商品化质控品制备样本。制备样本的浓度范围应处于试剂盒正常线性范围内，一般情况下，应避免稀释至检出限附近，避免稀释误差。根据评估结果，两株抗体在混合血清、质控品基质中检测值均在其95％可信区间，符合要求。
由上述结果可知，抗体2稍优于抗体6，且抗体2已达到与目前市场主流厂家检测结果高度一致的水平，稳定性良好，灵敏度高，将其作为体外检测试剂盒中充当特异性抗体使用，根据上述评估结果，各项检测性能均达到试剂盒要求，对后期应用与临床诊断有重要作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (15)

1.孕酮单克隆抗体，其特征在于，
其重链的CDR区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:5、6或7所示序列中的至少一种；
其轻链的CDR区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:8、9或10所示序列中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的孕酮单克隆抗体，其特征在于，
其重链的三个CDR区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:5、6和7所示；
其轻链的三个CDR区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:8、9和10所示。
3.根据权利要求1所述的孕酮单克隆抗体，其特征在于，
其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的孕酮单克隆抗体，其特征在于，所述重链的恒定区为兔IgG1亚型；所述轻链的恒定区为兔K1型。
5.编码权利要求1～4任一项所述的孕酮单克隆抗体的核酸。
6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，
编码所述孕酮单克隆抗体的重链可变区的核酸如SEQ ID NO:3所示；
编码所述孕酮单克隆抗体的轻链可变区的核酸如SEQ ID NO:4所示。
7.重组载体，其特征在于，其包括载体骨架和权利要求5或6所述的核酸。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述载体骨架为pCMV3。
9.宿主细胞，其特征在于，包括如下I)～III)所示中的至少一种：
I)、分泌如权利要求1～4任一项所述的孕酮单克隆抗体；
II)、基因组整合如权利要求5或6所述的核酸；
III)、转染或转化如权利要求7或8所述的重组载体。
10.孕酮单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其为培养如权利要求9所述的宿主细胞，获得孕酮单克隆抗体。
11.标记抗体，其特征在于，包括标记物和：
权利要求1～4任一项所述的孕酮单克隆抗体；
或权利要求10所述的制备方法制得的孕酮单克隆抗体的培养物。
12.根据权利要求11所述的标记抗体，其特征在于，所述标记物包括化学标记物和生物标记物；所述的生物标记物包括生物素、亲和素或酶；所述的化学标记包括同位素和/或化学药物。
13.偶联物，其特征在于，其包括偶联介质和：
权利要求1～4任一项所述的孕酮单克隆抗体；
或权利要求10所述的制备方法制得的孕酮单克隆抗体的培养物。
14.如下a)～g)所示中的任意一项在制备检测血清中孕酮水平的产品中的应用：
a)、权利要求1～4任一项所述的孕酮单克隆抗体；
b)、权利要求5或6所述的核酸；
c)、权利要求7或8所述的重组载体；
d)、权利要求9所述的宿主细胞；
e)、权利要求10所述的制备方法制得的含有孕酮单克隆抗体的培养物；
f)、权利要求11或12所述的标记抗体；
g)、权利要求13所述的偶联物。
15.检测血清中孕酮水平的产品，其特征在于，包括如下A)～D)所示中的任意一种：
A)、权利要求1～4任一项所述的孕酮单克隆抗体；
B)、权利要求10所述的制备方法制得的含有孕酮单克隆抗体的培养物；
C)、权利要求11或12所述的标记抗体；
D)、权利要求13所述的偶联物。
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