CN112661843B

CN112661843B - Aldosterone重组兔单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN112661843B
Application number: CN202011576204.1A
Authority: CN
Inventors: 田晓平; 张学东; 李桂林; 赵巧辉; 付光宇; 吴学炜; 杨增利
Original assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112661843A

Abstract

本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及Aldosterone重组兔单克隆抗体及其应用。本发明利用噬菌体展示技术，筛选获得了本发明所述的Aldosterone重组兔单抗，其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。该单抗特异性强，检测灵敏度高，解决了醛固酮在样本中含量低、检测难度大的问题。经鉴定，利用该单抗进行重复多次检测，稳定性良好，准确性高。

Description

Aldosterone重组兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及Aldosterone重组兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

醛固酮(Aldosterone)含量检测主要用于筛查原发性Aldosterone增多症(原醛症)引起的继发性高血压患者，该类患者占总高血压患者的5%～15%。与原发性高血压患者相比，原醛症患者心、脑等靶器官损害更为严重，故早期诊断至关重要。目前，检测血清或血浆中肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AⅡ)和Aldosterone三个临床指标是原发性和继发性高血压分型诊断、治疗及研究的重要指标。另外，大量临床研究表明，Aldosterone升高是慢性心率衰竭发生发展的重要致病机制，它可以促进储钠排钾、激活交感神经，并促进心肌和血管壁外纤维化。

Aldosterone与血浆中白蛋白结合能力很差，与血浆皮质类固醇结合球蛋白相结合很少，大部分以游离形式存在，更新速度较快。每100 ml外周血中约含有8 ngAldosterone，含量微小，却能表现较为强大的生理功能。Aldosterone在血液中的含量甚微，给临床的定量检测带来巨大挑战，目前临床多通过抗原抗体反应的免疫分析方法检测血清中的Aldosterone。

1985年，美国Missouri大学的Smith G P建立了噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)。噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体。噬菌体展示技术不仅是一个高效筛选体系，也是一个体外成熟过程，通过抗体基因库技术和噬菌体展示技术有可能获得亲和力和特异性得到改善的单克隆重组抗体。利用噬菌体展示技术提高Aldosterone抗体的性能，解决Aldosterone的检测问题，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供Aldosterone重组兔单克隆抗体及其应用，该重组抗体能快速、灵敏的检测患者血清中醛固酮的浓度。

本发明提供的Aldosterone重组兔单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述重链的恒定区为兔的 IgG1；所述轻链的恒定区为κ型。

本发明利用噬菌体展示技术，筛选获得了本发明所述的Aldosterone重组兔单抗，该单抗特异性强，检测灵敏度高，解决了醛固酮在样本中含量低、检测难度大的问题。经鉴定，利用该单抗进行重复多次检测，稳定性良好，准确性高。

本发明还提供了编码所述的单克隆抗体的核苷酸。

本发明提供了编码所述单克隆抗体重链的核苷酸序列。

本发明提供了编码所述单克隆抗体轻链的核苷酸序列。

本发明提供了编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。

其中，编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示或为SEQID NO:3的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明提供了编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

其中，编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或为SEQID NO:4的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸具有与SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，包括编码所述的单克隆抗体的核苷酸。

本发明所述的表达载体中，骨架载体为pCHO 1.0。

本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。

在一个实施例中，所述宿主细胞是哺乳动物CHO-S细胞。

本发明所述的Aldosterone重组兔单克隆抗体的制备方法，包括：培养所述的宿主细胞、诱导Aldosterone重组兔单克隆抗体的表达。

本发明还提供了经化学标记或生物标记的所述的Aldosterone重组兔单克隆抗体。

所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；

所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。

所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、PAP、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。

本发明所述Aldosterone重组兔单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。

本发明所述Aldosterone重组兔单克隆抗体和/或所述的偶联物在制备检测Aldosterone水平的产品中的应用。

实验表明，本发明提供的Aldosterone重组兔单克隆抗体能够作为检测抗体应用于醛固酮的检测，且具有良好的灵敏度。本发明提供的Aldosterone重组兔单克隆抗体适用于醛固酮的免疫学检测。一些实施例中，所述醛固酮的检测采用磁微粒化学发光法。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括本发明所述的Aldosterone重组兔单克隆抗体或所述的偶联物。

一些实施例中，所述试剂盒适用于醛固酮的磁微粒化学发光。

检测醛固酮的试剂盒中，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液。

本发明还提供了一种醛固酮的检测方法，其包括磁微粒化学发光和板式化学发光。

本发明利用噬菌体展示技术，筛选获得了本发明所述的Aldosterone重组兔单抗，其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。该单抗特异性强，检测灵敏度高，解决了醛固酮在样本中含量低、检测难度大的问题。经鉴定，利用该单抗进行重复多次检测，稳定性良好，准确性高。

附图说明

图1为提取脾脏RNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2为VL基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3为VH基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4为scFv基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图5为抗体库重组率菌液PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；

图6为重组抗体纯化SDS-PAGE电泳图；

图7为本发明抗体与参比厂家抗体相关性分析；

图8为测试结果与理论浓度之间的偏差。

实施方式

本发明提供了Aldosterone重组兔单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology（Ausubel）。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ（IgG1，IgG2，IgG3，IgG4），δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”（大约25kDa或大约214个氨基酸）包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ（大约330个氨基酸）。

“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：1、重组免疫原免疫动物：

用制备的抗原Aldosterone-BSA免疫新西兰大白兔4次。免疫周期为30天，背部皮下多点注射，第一次取2 mg免疫抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化充分后免疫，后三次取1mg免疫抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化充分后免疫。第三次免疫后于第10天耳缘静脉取血，37℃静置放置1h后于6000r/min离心10min，收集上清(抗血清)进行ELISA检测免疫效果(见实施例2)。

0044.准备检测板，将RaIgGFc抗体加入0. 05 mol/L CB（pH 9.6）包被缓冲液，包被浓度4 μg/ml。试验血清从1:200开始倍比稀释，50 μl/孔，同时设未免疫的兔血清对照，37℃温箱温育30 min；PBST洗涤5次，拍干，加入工作浓度的Aldosterone酶结合物，50 μl／孔，37℃温箱温育30 min；PBST洗涤5次，拍干，加入发光底物A、B液，各50 μl／孔，避光反应5min，测定信号值。测试结果如表1所示。效价达到10⁵后进行最后一次的加强免疫，三天后处死动物，提取脾脏细胞，Trizol法常规提取脾组织总RNA（如图1所示），反转录合成cDNA。

0045.表1

实施例2：scFv基因拼接及噬菌体筛选构建

scFv基因拼接：

PCR分别扩增抗体的轻链可变区和重链可变区，PCR反应程序为：

表2

PCR产物经1%琼脂糖凝胶回收，如图2和图3所示。将扩增的轻链可变区与重链可变区使用overlap-PCR法拼接成为scFv，产物经1％琼脂糖凝胶回收存放于-20℃保存，如图4所示。0046.2、噬菌体单链抗体库的构建与筛选：

噬菌粒载体pcomb3XSS和经过纯化回收的ScFv片段用SfiI进行酶切，构建重组质粒，重组质粒电转化 TG1感受态细胞构建兔源免疫单链抗体库（抗体库重组率菌液PCR鉴定如图5），并制备初级噬菌体单链抗体库；初级噬菌体单链抗体库进行富集筛选3轮，得到亲和力高、特异性强的特异性噬菌体单链抗体库；挑取梯度较好的单克隆（如：AL148）制备单克隆噬菌体上清，采用Phage-ELISA法鉴定阳性克隆子得到阳性序列。

0047.经过建库筛选出多个可变区序列，其中部分序列和样品的诊断性能评估结果如表3：

抗体1：其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

0048.抗体2：其重链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。0049.表3

由结果可知，抗体1的效果优于抗体2，以此进行后续实验。

0050.稳转细胞株的构建

通过Overlap-PCR分别连接重链恒定区（核酸序列SEQ ID NO:7，氨基酸序列SEQID NO:8）和可变区（SEQ ID NO:1）以及轻链恒定区（核酸序列SEQ ID NO:9，氨基酸序列SEQID NO:10）和可变区（SEQ ID NO:2），得到重组抗体基因。重链抗体基因和轻链抗体基因分别经XmaJI/BstZ17I和EcoRV/PacI双酶切后连接表达载体pCHO 1.0。重组后的质粒转入感受态DH5α细胞后，挑选阳性克隆测序并进行质粒提取。提取的质粒进行RruI酶线性化处理后转染CHO细胞。

0051.转染48h后ELISA检测抗体有表达后向培养基中加入200nM MTX和20ug/mlPuromycin进行阳性细胞株的筛选，细胞活率恢复后，继续提高筛选浓度（1000MTX和50 μg/ml Puromycin），待细胞活率恢复，稳定细胞株pool构建完成。而后，稳定细胞株pool经96孔板-24孔板-6孔板-SF125摇瓶，筛选出能够稳定高表达的单克隆抗体细胞株。

0052.重组抗体表达

复苏稳定高表达的单克隆细胞株，按照5×10⁵cells/ml密度传2代后，待细胞活率不低于95%时开始Fed-batch评估，隔天加补料，待细胞活率将至70%以下收获即获得目的蛋白上清。

0053.抗体SPA纯化及SDS-PAGE鉴定柱平衡

设置流速6.4mL/min，换用平衡缓冲液0.02 mol/L PBS pH7.4冲洗层析柱，设置流速3.8mL/min，进行样品上样纯化，取10μL流穿管中的样品加入到200μL的G250染液中检测变蓝时将流穿管放入到250mL锥形瓶中开始收集流穿，再平衡：设置流速6.4mL/min，用平衡缓冲液0.02mol/L PBS pH7.4再次冲洗层析柱至无蛋白流穿；解离：解离管架上摆放好10个4mL离心管，每管加200μL的1 mol/LTris pH8.5，设置恒流泵设置流速6.4mL/min，用解离缓冲液0.2mol/L Gly+0.15 mol/LNaCl pH2.7解离目的蛋白，等流穿管取样10μL加入到200μL的G250染液中检测变蓝时开始进行手动收集，每管收集4mL，等流穿管取样10μL加入到200μL的G250染液中检测无色时停止收集。收集的蛋白合并后SDS-PAGE检测，如图6所示。说明纯化后的抗体纯度高、浓度大。

0054.实施例4：本发明制备的Aldosterone重组兔单抗的试剂盒应用

本发明制备的Aldosterone重组兔单抗体作为磁珠羊抗兔复合物结合抗体应用于试剂盒中，配合其他成分一起对样本中抗原进行测定。

0055.具体性能评估如下：

1、准确度测定：

采用市面上现有的某主流商品化试剂盒定值的38例临床样本进行检测，根据系统回算样本中醛固酮浓度，与参比厂家进行相关性分析，结果见图7。

0056.根据检测结果可知，得到的线性方程为：y=1.0593x-31.946，相关系数R²=0.9532，表明本发明提供的Aldosterone重组兔单抗检测醛固酮临床样本准确度较高。

0057.2、灵敏度性能评价：

选择5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，共做4天，得到60个数据，按照EP17的方法进行数据检验和结果分析，3批试剂盒临床0值样本的LoB分别为：0.43pg/ml、0.71pg/ml、0.55pg/ml，均为空白限内检测，说明灵敏度较高。

0058.3、回收率性能评估：

选择高值样本3份，按照1：9的比例分别加入到3份低值/基质样本中，制成回收样本，加入高值样本的体积不得超过总体积的10%。每个回收样本重复检测3次求均值，计算回收率。第1批3个回收样本的回收率分别为97.3%，92.4%，95.7%，第2批3个回收样本的回收率分别为104.4%，106.4%，105.7 %，第3批3个回收样本的回收率分别为105.4%，105.0 %，105.6 %，其偏差均小于10%，回收准确性符合要求。

0059.4、线性分析：

分别选择Aldosterone浓度接近预期线性范围上限130%左右的临床高值样本，1份浓度接近于0的临床低值样本或临床上可能得到的最低值以不同比例混合，得到9个不同浓度的线性样本，最后计算测试结果与理论浓度之间的偏差（图8）。结果显示：线性回归系数r＞0.99，线性样本偏差小于10%。

0060.5、精密性评估：本研究所进行的精密度评价为批内精密度。将高、中、低浓度的三水平样本用同一批试剂进行，每批测试各样本均重复测定20次，求均值、SD，计算变异系数CV%。3个水平的样本的批内变异系数(coefficient of variation，CV)均小于 5％，结果见表4，说明试剂盒重复性良好。

0061.表4 AldosteroneOSTERONES的精密度结果

6、稳定性评估：

将试剂置于37℃条件下保存7天后并进行相关性能评估试验，具体结果如表 5 所示，经过热处理后的试剂的各项性能指标均能达到要求，并且测试结果未出现偏差。

0062.表5 AldosteroneOSTERONES试剂加速热稳定性结果

由上述结果可知，本发明制备的重组单抗已达到与目前市场主流厂家检测结果高度一致的水平，且表现出高灵敏度，稳定性优良等优点，将其作为检测抗体应用于试剂盒中，根据评估各项检测性能均达到试剂盒要求，对后期应用与临床诊断有重要作用。

0063.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司

<120> Aldosterone重组兔单克隆抗体及其应用

<130> MP2006837

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Leu Gln Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Gly Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Asp Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Thr Thr Asn Gly Gly Thr His Tyr Ala Ser

50 55 60

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Pro Ser Pro Thr Thr Val

65 70 75 80

Thr Leu Arg Val Pro Ser Leu Thr Glu Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Leu Asp Thr His Ser Gly Gly Tyr Asn Phe Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys

65 70 75 80

Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Ile Tyr Thr Gly Gly

85 90 95

Asp Trp Asp Gly Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile

100 105 110

<210> 3

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgctgcagc agctggagca gtccggggga ggcctggtca agcctggagg aaccctgaca 60

ctcacctgca cagcctctgg attctccttc actagtggct atgacattgc ctgggtccgc 120

caggctccag ggaaggggct ggagtggatc ggctacattt acactactaa tggcggcact 180

cactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca acccctcgcc gaccacggtg 240

actctgcgag tgcccagtct gacagaggcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagat 300

cttgataccc atagtggtgg ctataatttt gacttgtggg gcccaggcac cctggtcacc 360

atctcctca 369

<210> 4

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccaagtgc tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcaattgcc aggccagtga gagcatttac agtgctttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggcagcctc ccaagctcct gatctaccag gcatccaatc tggcatctgg tgtctcatcg 180

cggttcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt 240

gacgatgctg ccacttacta ctgtcaaggc actatttata ctggtggtga ttgggacggt 300

cctttcggcg gagggaccga gctggagatc 330

<210> 5

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Ser Ser Ser Gly Phe Thr Val Asn Arg Tyr Tyr

20 25 30

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ala Ile Tyr Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Ser Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Ile

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asp

85 90 95

Pro Gly Gly Ser Arg Leu Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ser Ile

1 5 10 15

Ser Cys His Ser Ser Gln Ser Val Ala Ser Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser

35 40 45

Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Tyr Tyr Asp Gly Asn Trp Tyr Gly Ala

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val

100 105

<210> 7

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtcaaccta aggctccgtc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60

tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa ggctacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180

ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240

aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300

agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360

ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420

gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480

cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540

accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600

aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660

gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720

ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780

gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840

ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900

tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960

ccgggtaaat aa 972

<210> 8

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn

35 40 45

Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys

65 70 75 80

Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala

85 90 95

Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly

100 105 110

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

115 120 125

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

130 135 140

Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val

145 150 155 160

Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile

165 170 175

Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly

180 185 190

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

195 200 205

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val

210 215 220

Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser

225 230 235 240

Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu

245 250 255

Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val

275 280 285

Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met

290 295 300

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser

305 310 315 320

Pro Gly Lys

<210> 9

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggatccag ttgcacctac tgtcctcatc ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact 60

ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120

gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180

gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240

cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat 300

aggggtgact gttaa 315

<210> 10

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp

1 5 10 15

Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr

20 25 30

Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr

35 40 45

Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr

50 55 60

Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser

65 70 75 80

His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val

85 90 95

Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

100

Claims

1.Aldosterone重组兔单克隆抗体，其特征在于，

其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，还包括恒定区，所述重链的恒定区为兔的IgG1亚型；所述轻链的恒定区为κ型。

3.编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核苷酸。

4.一种表达载体，包括编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核苷酸。

5.转化或转染权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1或2所述的Aldosterone重组兔单克隆抗体的制备方法，包括：培养权利要求5所述的宿主细胞、诱导Aldosterone重组兔单克隆抗体的表达。

7.经化学标记或生物标记的权利要求1或2所述的Aldosterone重组兔单克隆抗体。

8.权利要求1、2或7所述Aldosterone重组兔单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

9.权利要求1、2或7所述Aldosterone重组兔单克隆抗体和/或权利要求8所述的偶联物在制备检测Aldosterone水平的产品中的应用。

10.一种试剂盒，其特征在于，权利要求1、2或7所述Aldosterone重组兔单克隆抗体或权利要求8所述的偶联物。