KR20160023725A - 시스테인으로 변형된 닭의 항체 및 이를 이용한 부위-특이적 접합 - Google Patents

시스테인으로 변형된 닭의 항체 및 이를 이용한 부위-특이적 접합 Download PDF

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Abstract

본 발명은 닭 항체에서 유래되면 특정 위치의 아미노산이 시스테인으로 변경된 프레임워크 단편, 상기 프레임워크 단편을 포함하는 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위, 또는 상기 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위를 포함하는 항체는 항체의 이황화 결합 형성을 유도하지 않거나 형성을 억제하면서 항체의 활성 및 반응성을 유지하며, 이러한 시스테인이 도입된 항체 또는 이의 항원 결합단편은 화학요법 약물, 효소, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 또는 검출 표지와 같은 접합 화합물를 용이하게 결합할 수 있어, 질병의 진단 또는 치료에 다양하게 적용될 수 있다.

Description

시스테인으로 변형된 닭의 항체 및 이를 이용한 부위-특이적 접합{CHICKEN ANTIBODY TRANSFORMED INTO CYSTEINE AND SITE-SPECIFIC CONJUGATION USING SAME}
본 발명은 시스테인 잔기로 변경된 조작된 닭의 항체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 질병의 치료적 또는 진단적 적용을 수반한 항체에 관한 것이다. 시스테인 변경된 항체는 화학요법 약물, 독소, 펩타이드 및 친화성 리간드, 예컨대 비오틴, 및 검출 표지, 예컨대 방사성동위원소 및 형광단과 접합시킬 수 있으며, 질병의 진단 또는 치료 용도로 이용될 수 있다.
항체는 진단용과 치료용으로 널리 사용되고 있다. 항체는 약물, 효소, dye, 펩타이드, aptamer, linker, toxin, isotope 등과의 화학적인 결합을 통하여 기능이 향상되거나 또는 새로운 기능이 추가될 수 있다. 이러한 물질과의 화학적 결합에는 항체 tyrosines 잔기의 OH 기, lysines잔기의 NH3 기 혹은 aspartic acid, glutamic acid의 carboxyl 기와 같은 기능적인 그룹 (functional group)이 이용된다 (문헌 [Goldenberg D. M. et al., J. Med. (1978) 298:1384-1386; Rainsbury R. M. et al., Lancet (1983) 2:934- 938; and Yamada H.et al., Biochemistry (1981) 20:4836-4842]).
하지만 이러한 기능적 그룹이 항원 결합부위에도 존재하므로, 항원 결합부위의 잔기가 화학적 결합에 관여할 경우, 항체의 항원과의 친화도에 영향을 줄 수 있다. 또한 시스테인을 이용한 결합반응은 항체분자의 사슬 (polypeptide) 내부 혹은 사슬간의 이황화결합의 환원을 전제로 하며, 이는 단백질 활성에 영향을 줄 수 있다 (문헌 [Stimmel J.B. et al., J. Biol. Chem. (2000) 273:30445-30450]). 또한, 단백질은 미스폴딩 또는 3차 구조의 손실에 의해 불활성 또는 비-특이적으로 될 수 있다 (문헌 [Zhang W. et al., Anal. Biochem. (2002) 311:1-9]).
부위 특이적 접합은 이것이 생물학적 활성의 완전한 보유를 촉진하고 첨가된 보결분자단의 가능한 수에 대한 제어를 허용하는, 결합 부위로부터 멀리 떨어진 부위의 화학적 변형을 가능하게 하므로 무작위 아미노 변형보다 바람직하다. 시스테인 조작된 항체는 새로 도입된 시스테인 잔기의 티올기에서 링커를 통해 티올-반응성 링커 시약 및 약물-링커 시약과 접합되어 항암 특성을 갖는 시스테인 조작된 항체 약물 접합체, 예를 들어 항-MUC16 (US 2008/0311134), 항-CD22 (US 2008/0050310), 항-ROBO4 (US 2008/0247951), 항-TENB2 (US 2009/0117100), 항-CD79B (US 2009/0028856; US 2009/0068202) 티오 ADC를 제조한다. 그러나 사람 혹은 기타 동물의 경우 항체 중쇄 및 경쇄 가변부위 유전자가 각각 1개 이상 존재하고, 그 결과 항체의 프레임워크(framework)는 각 항체마다 다양한 서열로 구성되므로, 항체의 각각에 대해서 시스테인 잔기를 도입하는 위치를 개별적으로 최적화해야 하는 문제점이 있다.
본 발명의 일 예는 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위에 존재하는 프레임워크(framework) 영역에 시스테인 잔기가 도입된 닭 항체의 프레임워크 단편, 상기 프레임워크 단편을 포함하는 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위, 또는 상기 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위를 포함하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예는 상기 닭 항체의 프레임워크 단편, 상기 프레임워크 단편을 포함하는 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위, 또는 상기 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위를 포함하는 닭의 항체에 존재하는 도입된 시스테인 잔기에, 화학요법 약물, 효소, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 또는 검출 표지와 같은 접합 화합물을 접합한 항체 또는 그의 항원결합 단편과 접합 화합물을 포함하는 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예는 항체 또는 그의 항원결합 단편과 접합 화합물을 포함하는 복합체를 이용하여, 질병의 진단 또는 치료를 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 닭 항체의 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위에서 프레임워크 영역에 존재하는 다양한 아미노산 잔기들 중 시스테인으로 변경하더라도 항체 활성 및 친화도가 유지되는 잔기를 선별하여, 특정 아미노산이 시스테인으로 변경된 닭 항체의 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위에서 프레임워크 단편, 상기 프레임워크를 포함하는 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위, 및 상기 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원결합 단편을 제공하였다.
바람직하게는 상기 도입된 시스테인의 위치는 항체 분자 간의 이황화 결합 형성을 유도하지 않아서 이량체가 형성되지 않거나, 소량만 형성되면서, 시스테인의 반응성을 유지하며, 이러한 시스테인이 도입된 항체 또는 이의 항원 결합단편은 화학요법 약물, 효소, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 또는 검출 표지와 같은 접합 화합물를 용이하게 결합할 수 있어, 질병의 진단 또는 치료에 다양하게 적용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 시스테인 변경된 프레임워크, 상기 프레임워크를 포함하는 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위, 및 상기 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원결합 단편은, 닭의 항체로부터 유래된 것이며, 닭의 항체는 사람 혹은 기타 동물 항체와 달리 항체 가변 영역 유전자가 중쇄 1개, 경쇄 1개만 존재하고, 그 결과 모든 항체가 동일한 프레임워크를 가지고 있어, 본 발명에 따른 시스테인 조작 프레임워크 또는 이를 포함하는 항체는 동일한 위치에서 시스테인이 위치하므로, 닭에서 생산하는 모든 항체에 동일하게 적용할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일구현예에 따른 항체는 닭의 항체에서 유래된 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위에서 프레임워크 영역에 존재하는 하나 이상의 다양한 아미노산 잔기들 중 시스테인으로 치환한 프레임워크를 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 예에 따른 항체는 상기 닭의 항체에서 유래된 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위에서 프레임워크 영역에 존재하는 하나 이상의 다양한 아미노산 잔기들 중 시스테인으로 치환하고, 추가로 상기 치환된 시스테인의 양옆에 위치하는 두 개의 아미노산 하나 이상의 아미노산이, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌 및 리신으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 전하띤 아미노산으로 추가로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서는 시스테인으로 치환된 프레임워크를 포함하는 변이항체의 제조를 항체 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자가 각 1개 만 존재하는 닭의 항체를 사용하여 수행함으로써, 항체 중쇄 및 경쇄 가변부위 유전자가 각각 다수로 존재하는 사람 혹은 기타 동물 항체와 달리, 시스틴 잔기를 도입하는 위치를 개별적으로 최적화 할 필요 없이 신속히 시스테인으로 변형된 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 닭의 항체에서 유래된 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위에서 프레임워크 영역에 존재하는 하나 이상의 다양한 아미노산 잔기들 중 시스테인으로 치환한 항체(Cys)는 하나의 아미노산뿐만 아니라 2개 이상의 아미노산을 시스테인으로 치환함으로써, 2개의 접합 화합물을 접합시키거나, 또는 서로 다른 종류의 2이상의 접합 화합물을 접합하여 여러 가지 기능을 갖는 복합체를 제조할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 변이 항체에 있어서, 상기 시스테인 치환뿐만 아니라, 치환된 시스테인의 바로 인접한 두 개의 아미노산중 적어도 한 개의 아미노산을 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌 및 리신으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 전하띤 아미노산으로 치환함으로써 반대편 전하를 띄고 있는 물질과의 공유 결합을 효과적으로 유도할 수 있고, 동일 국소 전하를 띤 시스테인 변형 항체간의 이황화 결합 형성을 억제하여 항체의 침전 (aggregation)을 억제할 수 있고, 음전하를 띈 아스파크르산, 글루탐산으로 치환한 경우 maleimide 결합 와해를 억제할 수 있는 장점이 있다 (문헌 [Shen B.Q. et al., Nat. Biotechnol. (2012) 30: 184-189]).
본 발명에 있어서, 시스템으로 치환가능한 아미노산 위치는 시스테인이 아닌 아미노산이며 상기 프레임워크내에 위치한 모든 아미노산을 치환활 수 있으나 시스테인으로 변경하더라도 항체 활성 및 친화도가 유지되는 잔기여야 한다.
상기 조건을 만족하는 치환 아미노산의 위치는 닭의 항체중 경쇄가변부위에 존재하는 프레임워크내에 위치하며, 서열번호 1의 프레임워크 1, 서열번호 2의 프레임워크 2, 서열번호 3의 프레임워크 3, 및 서열번호 4의 프레임워크 4를 포함하며, 이들 프레임워크 구조는 도 1a에 자세히 나타내 있다.
본 발명의 일예에서, 상기 변이 항체는 경쇄가변부위의 변이 프레임워크 단독, 중쇄가변부위의 변이 프레임워크 단독, 또는 경쇄가변부위의 변이 프레임워크 와 중쇄가변부위의 변이 프레임워크를 모두 포함하는 항체일 수 있다.
상기 닭의 항체중 경쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가
서열번호 1의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 3번, 4번, 5번, 12번, 16번 위치 (카바트 넘버로서 5번, 6번, 7번, 14번, 18번 위치에 상응함),
서열번호 2의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 31번, 40번 위치 (카바트 넘버로서 37번, 45번 위치에 상응함),
서열번호 3의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 52 번, 53 번, 56 번, 58 번, 59 번, 60 번, 61 번, 64 번, 65 번, 71 번, 78 번, 82 번(카바트 넘버로서 57번, 58 번, 61 번, 63 번, 64 번, 65 번, 66 번, 69 번, 70 번, 76 번, 83 번, 87 번에 상응함), 및
서열번호 4의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 98번, 및 102번 위치(카바트 넘버로서 102번, 및 106번)로 이루어지는 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 경쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환가능한 아미노산 위치를 표 1a에 나타냈다.
[표 1a] 경쇄 프레임워크
Figure pct00001
또한, 상기 조건을 만족하는 치환 아미노산의 위치는 닭의 항체중 중쇄가변부위에 존재하는 프레임워크내에 위치하며, 서열번호 5의 프레임워크 1, 서열번호 6의 프레임워크 2, 서열번호 7의 프레임워크 3, 및 서열번호 8의 프레임워크 4을 포함하며, 이들 프레임워크 구조는 도 1a에 자세히 나타내 있다.
상기 치환 아미노산의 위치는 닭의 항체중 중쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가 서열번호 5의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 1번, 3번, 5번, 6번, 7번, 11번, 12번, 13번, 16번, 18번, 19번, 24번, 25번(카바트 넘버로서 1번, 3번, 5번, 6번, 7번, 11번, 12번, 13번, 16번, 18번, 19번, 24번, 25번에 상응함),
서열번호 6의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 42번, 48번(카바트 넘버로서 42번, 48번에 상응함),
서열번호 7의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 70번, 73번, 75번, 76번, 78번, 87번, 88번, 89번, 91번, 93번(카바트 넘버로서 69번, 72번, 74번, 75번, 77번, 83번, 84번, 85번, 87번, 89번에 상응함), 및
서열번호 8의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 123번, 및 126번 위치(카바트 넘버로서 110번, 및 113번 위치에 상응함)로 이루어지는 군에서 선택된 1개이 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 중쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환가능한 아미노산 위치를 표 1b에 나타냈다.
[표 1b] 중쇄 프레임워크
Figure pct00002
또한, 상기 경쇄가변부위의 시스테인으로 치환가능한 아미노산의 바람직한 위치는 서열번호 1의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 3번, 4번 및 5번(카바트 넘버로서 5번, 6번 및 7번에 상응함)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 아미노산이다. 상기 중쇄가변부위의 시스테인으로 치환가능한 아미노산의 바람직한 위치는 서열번호 5의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 13번 및 16번 위치(카바트 넘버로서 13번 및 16번 위치에 상응함)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 아미노산일 수 있다.
본 발명의 일예에서, 상기 바림직한 위치의 아미노산이 시스테인으로 치환한 것과 함께, 치환위치의 양옆에 위치한 2개의 아미노산중 적어도 하나의 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌 및 리신으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 전하띤 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 예를 들면, 변이항체가 경쇄가변부위의 시스테인으로 치환가능한 아미노산의 바람직한 위치는 서열번호 1의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 3번, 4번 및 5번으로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 아미노산이며, 또는 상기 중쇄가변부위의 시스테인으로 치환가능한 아미노산의 바람직한 위치는 서열번호 5의 아미노산 서열중 순차적 아미노산 번호로서 13번 및 16번으로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 아미노산인 경우, 양옆에 위치한 아미노산이 전하띤 아미노산으로 치환된 프레임워크는 하기 표 3a 및 표 3b의 변이 서열을 포함할 수 있다.
[표 3a]
Figure pct00003
[표 3b]
Figure pct00004
따라서, 시스테인 치환과 더불어 인접 아미노산의 치환을 함께 포함하는 변이항체는, 서열번호 57 내지 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 변이 경쇄가변부위를 포함하거나, 서열번호 57 내지 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 변이 중쇄가변부위를 포함하거나, 상기 변이 경쇄가변부위와 변이 중쇄가변부위를 모두 포함하는 항체일 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 하기 용어 및 어구는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다. 본원에서의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다. 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라 항체일 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 유래된 것일 수도 있다. 항체는 전장 이뮤노글로불린 분자 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 표적 항원 (이러한 표적은 암세포, 또는 자가면역 질환과 관련이 있는 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않음) 또는 그의 일부와 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 분자의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스 중 어느 것일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종으로부터 유도될 수 있다.
본 명세서에서 "항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로는 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 미니바디 (문헌 [Olafsen T. et al. Protein Eng. Design ＆ Sel. (2004) 17:315-323]), Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 단일-쇄 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 시스테인 치환 항체가 1)시스테인 치환된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이 유발시키는 것; 2) 시스테인 치환된 항체를 발현시키는 것; 및 3) 시스테인 치환된 항체를 단리 및 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있다. 또한 시스테인 양옆에 위치하는 아미노산의 치환도 상기 시스테인 치환과 동일한 방법으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 변이 항체에 화학요법 약물, 효소, 펩타이드, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 또는 검출 표지와 같은 접합 화합물을 접합한 항체 또는 그의 항원결합 단편과 접합 화합물을 포함하는 복합체를 제공하는 것이다. 상기 접합 화합물의 종류에 따라, 상기 복합체는 질병의 진단 또는 치료에 다양하게 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 펩타이드와 화학적으로 결합한 항체는 그 수용체를 통하여 blood brain barrier을 효과적으로 통화과 할 수 있거나등 펩타이드의 친화도에 기여한 기능을 추가적으로 가질 수 있다 (문헌 [Chacko A.M et al., Expert Opin. Drug Deliv. (2013) 10: 907-26; 특허:EP2 233 156 B1]).
상기 접합 화합물은 리간드 친화도, 항체/항원 결합, 또는 이온 복합체 형성을 조정하기 위해 (i) 검출가능한 신호를 제공하거나, (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호를 변형시켜, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전달)를 생성시키거나; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호작용을 안정화하거나 이들과의 결합 친화도를 증가시키거나, (iv) 이동성, 예를 들어 전기영동 이동성, 또는 세포-투과도에 전하, 소수성, 형태 또는 다른 물리적 파라미터로 인한 영향을 주거나, 또는 (v) 포획 모이어티를 제공하는 기능을 할 수 있다.
표지된 시스테인 치환 항체는 예를 들어 특이적 세포, 조직, 또는 혈청에서 관심 항원의 발현을 검출하기 위한 진단 분석에서 유용할 수 있다. 진단 용도를 위해, 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 수많은 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다.
(a) 방사성동위원소 (방사성핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 89Zr, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 213Bi. 방사성동위원소 표지된 항체는 수용체 표적화된 영상화 실험에 유용하다. 방사성동위원소 금속에 결합하거나 킬레이트화되거나 또는 다른 방식으로 복합체화하며 항체의 조작된 시스테인 티올과 반응성인 리간드 시약으로 표지될 수 있다.
(b) 형광 표지, 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 등을 비롯한 플루오레세인 유형, TAMRA 등을 비롯한 로다민 유형; 단실; 리사민 (Lissamine); 시아닌; 피코에리트린; 텍사스 레드 (Texas Red) 및 이들의 유사체 등을 포함한다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 인비트로겐 (Invitrogen)/몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진 소재) 및 피어스 바이오테크놀로지, 인크. (Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드 소재)에서 시판하는 것을 포함한다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하거나 문헌에 개시되어 있다 (US 4275149). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 기재되어 있다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 통상의 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 시스테인 치환된 항체는 방사성핵종, 형광 염료, 생체발광-촉발 기질 모이어티, 화학발광-촉발 기질 모이어티, 효소, 및 진단, 약동학 및 치료적 적용을 이용하는 영상화 실험에서 다른 검출 표지를 갖는 시스테인 티올을 통해 표지될 수 있다. 일반적으로, 표지된 시스테인 조작된 항체, 즉 "바이오마커" 또는 "프로브"는 살아있는 유기체, 예를 들어 인간, 설치류, 또는 다른 작은 동물, 관류된 기관, 또는 조직 샘플에 주사, 관류, 또는 경구 섭취에 의해 투여된다. 프로브의 분포를 시간 경로에 걸쳐 검출하고, 영상으로 나타낸다.
본 발명에 따른 닭 항체의 프레임워크 단편, 상기 프레임워크 단편을 포함하는 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위, 또는 상기 중쇄가변부위 또는 경쇄가변부위를 포함하는 항체는 항체의 이황화 결합 형성을 유도하지 않거나 형성을 억제하면서 항체의 활성 및 반응성을 유지하며, 이러한 시스테인이 도입된 항체 또는 이의 항원 결합단편은 화학요법 약물, 효소, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 또는 검출 표지와 같은 접합 화합물를 용이하게 결합할 수 있어, 포유동물 세포 또는 관련된 질병의 진단 또는 치료에 다양하게 적용될 수 있다.
도 1a는 본 연구에 이용된 닭 항체의 야생형 (wild-type)과 생식계열의 염기서열을 비교하고 순차적 넘버링 방식 (상부 열), 카바트 넘버링 방식 (하부 열)을 보여준다.
도 1b는 흡광도 검출을 위한 고정된 PSA에서의 Cys 변이 항체 파지 결합과 항-파지 HRP 항체의 결합을 카툰 도면으로 보여준다.
도 1c 및 도 1d는 Cys 변이 항체 파지의 405 nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 경쇄 변이체는 상단에 있고, 중쇄 변이체는 하단에 있다.
도 1e는 X-선 결정 좌표에 의해 유래된 닭 항체 단편의 3차원 표현을 보여준다. 중쇄 및 경쇄의 조작된 5 종류 Cys 변이 잔기의 구조적 위치를 보여준다.
도 2는 티올 반응성을 가진 두 개의 시스테인 잔기가 포함되어 있는 항체 파지의 405 nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 양이온 아미노산이 추가된 Cys 변이 항체 파지의 405 nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 경쇄 변이체는 상단에 있고, 중쇄 변이체는 하단에 있다.
도 3c 및 도 3d는 음이온 아미노산이 추가된 Cys 변이 항체 파지의 405 nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 경쇄 변이체는 상단에 있고, 중쇄 변이체는 하단에 있다.
도 4a는접합을 위한 세포 배양으로부터 발현된 Cys 변이 sigle chain Fv(scFv) 형태 항체를 coomassie blue염색으로 보여준다.
도 4b는 접합을 위한 세포 배양으로부터 발현된 양이온 및 음이온 Cys 변이 scFv 형태 항체를 coomassie blue염색으로 보여준다.
도 5a는 접합을 위한 세포 배양으로부터 발현된 Cys 변이 full IgG 형태 항체를 coomassie blue염색으로 보여준다.
도 5b는 접합을 위한 세포 배양으로부터 발현된 양이온 및 음이온Cys 변이 full IgG 형태 항체를 coomassie blue염색으로 보여준다.
도 6는 Cys 변이 항체에 말레이미드 활성화된 PEG 접합방법을 카툰 도면으로 보여준다.
도 7a는 말레이미드 PEG가 접합된scFv를coomassie blue염색으로 보여준다.
도 7b는 말레이미드 PEG가 접합된scFv를 아이오딘 염색으로 보여준다.
도 7c는 말레이미드 PEG가 접합된scFv를 면역블롯 방법을 이용하여 보여준다.
도 8a는 말레이미드 PEG가 접합된full IgG를coomassie blue염색으로 보여준다.
도 8b는 말레이미드 PEG가 접합된 full IgG를 아이오딘 염색으로 보여준다.
도 8c는 말레이미드 PEG가 접합된full IgG를 면역블롯 방법을 이용하여 보여준다.
도 9a는 양이온 및 음이온 잔기가 첨가된 scFv에 말레이미드 PEG를 접합시킨 형태를 coomassie blue염색으로 보여준다.
도 9b는 양이온 및 음이온 잔기가 첨가된 scFv에 말레이미드 PEG를 접합시킨 형태를 아이오딘 염색으로 보여준다.
도 9c는 양이온 및 음이온 잔기가 첨가된 scFv에 말레이미드 PEG를 접합시킨 형태를 면역블롯 방법을 이용하여 보여준다.
도 10a는 양이온 및 음이온 잔기가 첨가된 full IgG에 말레이미드 PEG를 접합시킨 형태를 coomassie blue염색으로 보여준다.
도 10b는 양이온 및 음이온 잔기가 첨가된full IgG에 말레이미드 PEG를 접합시킨 형태를 아이오딘 염색으로 보여준다.
도 10c는 양이온 및 음이온 잔기가 첨가된full IgG에 말레이미드 PEG를 접합시킨 형태를 면역블롯 방법을 이용하여 보여준다.
도 11a는 Cys 변이 항체에 GMBS-코티닌 접합방법을 카툰 도면으로 보여준다.
도 11b는 흡광도 검출을 위한 고정된 PSA에서의 GMBS코티닌이 접합된 Cys 변이 항체에 항-코티닌 HRP 항체의 결합을 카툰 도면으로 보여준다.
도 12는 Ckappa가 융합된 Cys 변이 scFv에 GMBS-코티닌의 결합을 450 nm에서의 흡광도의 검출 보여준다. 항-코티닌 IgG - HRP로 인한 검출은 상단에 있고, 항-Ckappa IgG-HRP로 인한 검출은 하단에 있다.
도 13a는 코티닌-Cys 이 항체의 마우스 주입과 채혈시간을 도면으로 보여준다.
도 13b는 코티닌-Cys 변이 항체의 마우스 주입 전후 혈청에서의 코티닌-Cys 변이 항체의 유무를450 nm에서의 흡광도의 검출로 보여준다.
이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.
실시예 1: 한 개의 Cys 변이 항체의 제조
1-1. 변이 항체 파지의 제조
실시 예에서 이용한 항체는 PSA (prostate specific antigen)에 대한 닭 항체이며, 도1a에서 항 PSA 항체 (야생형)와 닭 생식계열 (chicken germ-line) 의 프레임워크 염기서열 ([문헌 [Andris-Widhopf J. et al., J Immunol. Methods (2000) 242: 159- 181])을 보여주고 있다. 카바트 넘버링은 http://www.bioinf.org.uk/abs/ 에서 제공하는 시스템을 이용하였다.
Cys 변이 항체 제조는 우선 문헌 [Chung J. et al., FASEB J. (2004) 18: 361-383] 방법에 따라 경쇄 도메인 프레임워크 (VL domain framework) 78개 잔기, 중쇄 도메인 프레임워크 (VH domain framework) 84개 잔기를 랜덤화 시키기 위하여 NNK(N:A/C/G/T, K:G/T)를 각 잔기에 삽입하는 PCR을 수행하였다. 이후 Barbas, C.F. (2001) Phage display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 에 기재된 방법에 따라, 확보한 scFv (single chain Fv) DNA를 phagemid 벡터 (vector)인 pcomb3X에 삽입하였고, 이를 대장균(E.coli) ER2738에 transformation 하였다. 이후 각 잔기마다 92개 콜로니를 선정하여 파지(phage)에 접합(display)된 scFv (single chain Fv)형태가 포함된 배양 상층액 (culture supernatant)을 확보하였다.
1-2. 변이 항체 선별 및 항원에 대한 친화도 측정
항체 파지가 포함된 배양상층액을 이용하여 도1b에 묘사된 방법과 같은 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA)를 수행하였다. 플레이트(microtiter plate)에 항원인 PSA를 코팅 한 후 파지가 포함된 배양 상층액을 첨가하였고, 1시간 정치(incubation)와 3번의 세척과정을 거친 후, HRP (horse radish peroxidase)가 접합된 anti-M13 항체를 첨가하였다. 1 시간 정치 후 3번의 세척과정을 거치고 H2O2가 첨가된 ABTS를 첨가하여 발색을 확인한 후 흡광도를 405 nm에서 측정하였다. 대조군으로는 야생형 파지를 사용하였다. 경쇄의 21 개, 중쇄의 27 개 잔기는 시스테인으로 치환된 후에도 야생형 항체와 유사한 친화도를 보였다 (도 1c 및 도 1d). 표 1a 및 표 1b에서는 Cys 변이체들의 순차적 넘버링과 카바트 넘버링, 각 변이체들의 야생형 염기서열을 보여주고 있다.
[표 1a] 경쇄 프레임워크
Figure pct00005
[표 1b] 중쇄 프레임워크
Figure pct00006
선별된 Cys 변이체들의 표면 접근용이성을 알아보기 위해 용매 접근 표면적 (Solvent Accessible Surface Area)을 X-선 결정 좌표에 의해 유래된 닭 항체 단편의 3차원 구조 (문헌 [Shih H.H. et al., J Biol. Chem. (2012) 287:44425-44434; PDB ID: 4GLR])를 통해 알아 보았고, 표 2a 및 표 2b에서 보여주고 있다. 그 중 5종의 염기 (LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, HF1-16)잔기의 구조적 위치를 도 1e에서 나타내고 있다.
[표 2a] 경쇄 용매접근성
Figure pct00007
[표 2b] 중쇄 용매 접근성
Figure pct00008
실시예 2: 두개의 Cys 변이 항체의 제조
순차적 넘버링에 따라 경쇄 (L3, L4, L5)와 중쇄 (H13, H16)의 잔기 중에서 경쇄 부분의 한가지 중쇄 부분의 한가지의 잔기를 시스테인으로 치환하고 조합하여 총 6가지 (L3H13, L3H16, L4H13, L4H16, L5H13, L5H16)의 두개의 반응성 시스테인이 첨가된 Cys 변이 항체 유전자를 PCR을 통해 제작하였다. 그 다음 실시 예 1과 같이 파지에 display된 scFv 형태로 발현시킨 후 효소결합 면역흡착 분석법으로 PSA 항원에 대한 친화도를 측정하였다 (도 2).
실시예 3: Cys 주위의 아미노산 잔기가 치환된 변이 항체
효율적인 접합을 위한 실시예 1-1에서 제조한 Cys 변이체 5종 (LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13 그리고 HF1-16)의 양쪽 아미노산을 양이온 아미노산 (아르기닌, 리신) 혹은 음이온 아미노산 (아스파르트산, 글루탐산)으로 치환하기 위하여 각 잔기에 해당 DNA 염기서열 (아르기닌; CGT, 리신; AAG, 아스파르트산; GAT, 글루탐산; GAA)을 PCR을 통하여 삽입하였다. 이후 확보한 scFv DNA를 phagemid vector인 pcomb3X에 삽입하였고, 이를 대장균(E. coli) ER2738에 형질전환시켰다. 그 다음 파지에 접합된 scFv형태로 SB 배양액에서 배양하였다. 양이온 및 음이온 잔기를 첨가한 Cys 변이체 염기서열은 표 3a 및 표 3b에 나타내었다.
항원의 친화도 측정은 플레이트(microtiter plate)에 항원인 PSA를 코팅한 후 파지가 포함된 배양 상층액을 첨가한 1 시간 이후, 3번의 세척과정을 거치고, HRP (horse radish peroxidase)가 접합된 anti-M13 항체를 첨가하였다. 1 시간 정치 후 3번의 세척과정을 거치고 H2O2가 첨가된 ABTS를 첨가하여 발색을 확인한 후 흡광도를 405 nm에서 측정하였다. 양이온 Cys 변이체 결과는 도 3a 및 도 3b에, 음이온 Cys 변이체 결과는 도 3c 및 도 3d에 나타내었다.
[표 3a]
Figure pct00009
[표 3b]
Figure pct00010
실시예 4: Cys 변이 scFv 항체
4-1. Cys 변이 scFv 항체 발현 및 정제
Cys 변이 scFv의 사람 Ckappa를 포함한 융합단백질을 제조하기 위하여 사람 Ckappa를 포함한 포유류 발현 벡터인 pCEP4 벡터에 클로닝 과정을 통해 삽입하고, 이를 HEK293F 세포에서 발현을 유도한 후 최종 배양액을 확보하였다. 배양액에서 scFv-Ckappa 융합단백질의 정제는 kappa select bead를 이용하여 정제하였다. 정제 후 단백질을 폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE gel)에 로딩 후 전기영동 하였고, coomassie 염색을 통하여 발현 및 정제를 확인하였다. 도 4a는 야생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, 그리고 HF1-16 scFv 단백질 발현, 정제 결과를 보여준다.
4-2. Cys 주위의 아미노산 잔기가 치환된 Cys 변이 scFv 항체 발현 및 정제
Cys 주위의 아미노산 잔기가 양이온 또는 음이온성 아미노산으로 변경된 Cys 변이 항체에서 항원에 대한 친화도가 유지되는 클론들을 실시 예 4-1과 같이 사람 Ckappa를 포함한 융합단백질로 HEK293F 세포에서 발현을 유도한 후, kappa select bead를 이용하여 정제하였다. 그 후 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 실시하였고, coomassie 염색을 통하여 발현 및 정제를 확인하였다. 도 4b는 야생형, HF1-13, R13CK, D13CE, E13CD, E13CE scFv-Ckappa 융합단백질의 발현 및 정제를 확인한 결과이다.
실시예 5: Cys 변이 full IgG 항체
5-1. Cys 변이 full 항체 발현 및 정제
닭-사람 키메릭 full IgG 형태의 단백질을 제조하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 Cys 변이 항체 가변영역의 경쇄와 중쇄 DNA를 PCR을 통하여 확보한 후 이를 IgG 발현용 벡터에 삽입하고, 이를 HEK293F 세포에서 발현 및 배양하였다. 그 후 protein A bead를 이용하여 full IgG 항체를 정제하였다. 정제한 단백질은 전기영동 한 후, Coomassie 염색을 통하여 발현 및 정제를 확인하였다. 도5a는 야생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, 그리고 HF1-16 full IgG 단백질의 발현 및 정제 결과를 나타내었다.
5-2. Cys 주위의 아미노산 잔기가 치환된 Cys 변이 full IgG 항체 발현 및 정제
실시예 3에서 제조된 Cys 주위의 아미노산 잔기가 치환된 Cys 변이 항체를 실시예 5-1과 같이 닭-사람 키메릭 full IgG 형태의 항체로 발현하기 위해 항체 유전자를 IgG 발현용 벡터에 삽입하고, HEK293F 세포에서 발현 및 배양하였다. 그 다음 배양액에서 protein A bead를 이용하여 full IgG 항체를 정제하였고 폴리아크릴아미드겔에 정제된 단백질을 로딩한 후 전기영동을 실시하였다. 그 후 겔을 coomassie blue 염색을 하여서 단백질의 발현과 정제를 확인하였다. 도 5b는 R13CK, E13CD, E13CE full IgG 단백질의 발현 및 정제결과이다.
실시예 6: PEG 접합된 변이항체
6-1. PEG 접합에 의한 Cys 변이 항체-PEG 제조 및 검정
문헌 [Junutula et al., (2008) nature biotechnology 925-32] 에 기재된 방법에 따라, 실시예 1에서 제조된 Cys 변이 항체의 10배 TCEP를 첨가하여 환원시킨 후, TCEP 제거 과정을 거치고, TCEP양 2배의 DHA를 첨가하여 부분적 산화를 시킨다. 그 후 항체 10배의 말레이미드 PEG를 첨가하고 4 ℃에서 12시간 이상 정치시켜 항체에 PEG 접합을 유도하였다. 도6는 말레이미드 PEG가 설프히드릴 항체에 접합되는 과정을 카툰 도면으로 설명하였다.
항체-PEG는 폴리아크릴아미드 겔에 로딩한 후 전기영동을 실시하였다. 그 다음 겔을 coomassie 혹은 아이오딘 (Iodine) 염색, 면역블롯 방법을 이용하여 항체에 PEG 접합여부를 확인하였다. Coomassie 염색은 coomassie brilliant blue R250으로 염색한 후 메탄올, 아세트산이 포함된 탈색용액으로 탈색시킨 후 해당 단백질을 확인하였다. 도 7a는 야생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, HF1-16 scFv, 도 8a는 야생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, HF1-16 full IgG의 결과를 보여준다.
아이오딘 염색은 폴리아크릴아미드겔을 증류수에 15분간 세척 시킨 후 5％ BlCl2에 15분간 정치시킨다. 그 다음 겔을 0.1 M 아이오딘에서 10 분간 염색하고, 증류수로 10분간 탈색하여 PEG만 검출시켜 확인하였다. 도 7b는 야생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, HF1-16 scFv, 도 8b는 여생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, HF1-16 full IgG의 결과를 보여준다.
면역블롯 방법을 이용한 확인은 폴리아크릴아미드겔로 단백질 크기 별로 분리한 다음 NC membrane에full IgG 는트랜스퍼하고, scFv-Ckappa 융합단백질과 full IgG 경쇄부분은 HRP가 접합된 항-Ckappa 항체를, full IgG의 중쇄부분은 HRP가 접합된 항-사람 Fc 항체를 사용하여 확인하였다. 도 7c는 야생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, HF1-16 scFv, 도 8c는 야생형, LF1-2, LF1-3, LF1-4, HF1-13, HF1-16 full IgG의 결과를 보여준다.
6-2. PEG 접합에 의한 Cys 주위의 아미노산 잔기가 치환된 Cys 변이 항체-PEG 제조 및 검정
양이온 혹은 음이온 잔기가 추가된 항체도 실시 예 6-1과 같이 TCEP를 사용하여 환원시킨 후 DHA를 첨가하여 부분적 산화를 시켰다. 그 다음 항체에 PEG를 첨가하여 항체에 PEG 접합을 유도하였고, 항체-PEG 접합 검정은 coomassie blue 염색, 아이오딘 염색, 면역블롯 방법을 수행하여 실시하였다.
도9a는 야생형, HF1-13, R13CK, D13CE, E13CD, E13CE scFv에 PEG가 접합된 결과를, 10a는야생형, HF1-13, R13CK, E13CE full IgG에 PEG가 접합된 결과를 coomassie blue 염색으로 보여준다.
도9b는 야생형, HF1-13, R13CK, D13CE, E13CD, E13CE scFv에 PEG가 접합된 결과를, 도 10b는HF1-13, R13CK, E13CE full IgG 결과를 아이오딘 염색으로 보여준다.
도9c는 야생형, HF1-13, R13CK, D13CE, E13CD, E13CE scFv에 PEG가 접합된 결과를, 도10c는HF1-13, R13CK, E13CE full IgG 결과를 면역블롯으로 보여준다.
실시예 7: 코티닌 접합에 의한 항체-코티닌 제조 및 검정
실시예 1에서 제조한 Cys 변이 항체의 10배 TCEP를 첨가하여 환원시킨 후, TCEP 제거 과정을 거치고, TCEP양 2배의 DHA를 첨가하여 부분적 산화를 시킨다. 그 후 항체 10배의 GMBS-코티닌을 첨가하고 4도에서 12시간 이상 정치시켜 항체에 코티닌 접합을 유도하였다. 도11a는 GMBS 코티닌이 설프히드릴 항체에 접합되는 과정을 카툰 도면으로 설명하였다.
항체-코티닌은 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)를 이용하여 검정하였다 (도 11b). PSA 항원을 플레이트에 코팅한 후, 항체-코티닌을 첨가하고 1시간 정치시켰다. 그 후 3번의 세척과정을 거치고, HRP가 접합된 항-코티닌 IgG 혹은 항-Ckappa IgG 항체를 첨가하였다. 1 시간 정치 후 3번의 세척과정을 거치고 TMB (3,3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine)을 첨가하여 발색을 확인한 후, 2M H2SO4를 이용하여 반응을 정지시키고 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. 도 12 결과에서 코티닌이 접합된 여부는 항-코티닌 IgG로 알 수 있고, 항-Ckappa IgG는 코티닌 결합과 관계없이 항체만을 측정하는 항체로 사용되었다.
실시예 8: 항체-코티닌의 마우스 주입 및 코티닌-항체 검정
6주령 Balb/c 마우스를 무작위로 3그룹 (HF1-13, E13CD, E13CE)으로 나눈 후 안와총에서 채혈을 실시하였다. 24시간 이후, 실시예 7에서 제조된 코티닌-scFv 항체 Ckappa 융합단백질 3종류 (HF1-13, E13CD, E13CE) 100 μg을 각 마우스에 정맥주사로 주입하였다. 코티닌-항체 주입 1시간 후에 마우스 안와총에서 채혈한 후 원심분리기로 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청에 코티닌-항체의 유무를 확인하기 위하여 혈청을 50배 희석하여 실시 예 9와 같이 효소결합 면역흡착 분석법을 실시하였다. 마우스를 이용한 모든 수행과정은 고통을 최소화하기 위하여 흡입마취를 시킨 후 실시하였다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Engineered chicken antibody and site-directed conjugation using the same <130> OPP20142056KR <150> US 61/842482 <151> 2013-07-03 <160> 88 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 1 in the light chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 1 Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys 20 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 2 in the light chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 2 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 3 in the light chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 3 Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 4 in the light chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 4 Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 1 in the heavy chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 5 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 2 in the heavy chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 6 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 3 in the heavy chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 7 Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln 1 5 10 15 Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework 4 in the heavy chain variable region of wild-type chicken antibody <400> 8 Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 9 Ala Leu Cys Arg Pro 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 10 Ala Leu Cys Lys Pro 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2CQ sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 11 Ala Arg Cys Gln Pro 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 12 Ala Arg Cys Arg Pro 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 13 Ala Arg Cys Lys Pro 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K2CQ sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 14 Ala Lys Cys Gln Pro 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K2CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 15 Ala Lys Cys Arg Pro 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K2CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 16 Ala Lys Cys Lys Pro 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 17 Ala Leu Cys Asp Pro 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 18 Ala Leu Cys Glu Pro 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2CQ sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 19 Ala Asp Cys Gln Pro 1 5 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 20 Ala Asp Cys Asp Pro 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 21 Ala Asp Cys Glu Pro 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2CQ sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 22 Ala Glu Cys Gln Pro 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 23 Ala Glu Cys Asp Pro 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 24 Ala Glu Cys Glu Pro 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T3CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 25 Leu Thr Cys Arg Ser 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T3CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 26 Leu Thr Cys Lys Ser 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R3CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 27 Leu Arg Cys Pro Ser 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R3CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 28 Leu Arg Cys Arg Ser 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R3CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 29 Leu Arg Cys Lys Ser 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K3CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 30 Leu Lys Cys Pro Ser 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K3CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 31 Leu Lys Cys Arg Ser 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K3CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 32 Leu Lys Cys Lys Ser 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T3CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 33 Leu Thr Cys Asp Ser 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T3CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 34 Leu Thr Cys Glu Ser 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 35 Leu Asp Cys Pro Ser 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 36 Leu Asp Cys Asp Ser 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 37 Leu Asp Cys Glu Ser 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E3CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 38 Leu Glu Cys Pro Ser 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E3CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 39 Leu Glu Cys Asp Ser 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E3CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 40 Leu Glu Cys Glu Ser 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q4CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 41 Thr Gln Cys Arg Ser 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q4CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 42 Thr Gln Cys Lys Ser 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R4CS sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 43 Thr Arg Cys Ser Ser 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R4CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 44 Thr Arg Cys Arg Ser 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R4CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 45 Thr Arg Cys Lys Ser 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K4CS sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 46 Thr Lys Cys Ser Ser 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K4CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 47 Thr Lys Cys Arg Ser 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K4CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 48 Thr Lys Cys Lys Ser 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q4CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 49 Thr Gln Cys Asp Ser 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q4CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 50 Thr Gln Cys Glu Ser 1 5 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4CS sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 51 Thr Asp Cys Ser Ser 1 5 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 52 Thr Asp Cys Asp Ser 1 5 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 53 Thr Asp Cys Glu Ser 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4CS sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 54 Thr Glu Cys Ser Ser 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 55 Thr Glu Cys Asp Ser 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 56 Thr Glu Cys Glu Ser 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q13CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 57 Leu Gln Cys Arg Gly 1 5 <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q13CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 58 Leu Gln Cys Lys Gly 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R13CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 59 Leu Arg Cys Pro Gly 1 5 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R13CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 60 Leu Arg Cys Arg Gly 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R13CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 61 Leu Arg Cys Lys Gly 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K13CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 62 Leu Lys Cys Pro Gly 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K13CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 63 Leu Lys Cys Arg Gly 1 5 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K13CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 64 Leu Lys Cys Lys Gly 1 5 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q13CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 65 Leu Gln Cys Asp Gly 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q13CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 66 Leu Gln Cys Glu Gly 1 5 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D13CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 67 Leu Asp Cys Pro Gly 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D13CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 68 Leu Asp Cys Asp Gly 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D13CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 69 Leu Asp Cys Glu Gly 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E13CP sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 70 Leu Glu Cys Pro Gly 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E13CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 71 Leu Glu Cys Asp Gly 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E13CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 72 Leu Glu Cys Glu Gly 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G16CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 73 Pro Gly Cys Arg Leu 1 5 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G16CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 74 Pro Gly Cys Lys Leu 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R16CA sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 75 Pro Arg Cys Ala Leu 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R16CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 76 Pro Arg Cys Arg Leu 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R16CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 77 Pro Arg Cys Lys Leu 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K16CA sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 78 Pro Lys Cys Ala Leu 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K16CR sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 79 Pro Lys Cys Arg Leu 1 5 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K16CK sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 80 Pro Lys Cys Lys Leu 1 5 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G16CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 81 Pro Gly Cys Asp Leu 1 5 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G16CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 82 Pro Gly Cys Glu Leu 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D16CA sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 83 Pro Asp Cys Ala Leu 1 5 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D16CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 84 Pro Asp Cys Asp Leu 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D16CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 85 Pro Asp Cys Glu Leu 1 5 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E16CA sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 86 Pro Glu Cys Ala Leu 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E16CD sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 87 Pro Glu Cys Asp Leu 1 5 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E16CE sequence of five amino acids including substituted amino acid(s) in the engineered chicken framework <400> 88 Pro Glu Cys Glu Leu 1 5

Claims (11)

  1. 닭 항체의 경쇄가변부위 또는 중쇄가변부위에 포함된 프레임워크에 존재하는 시스테인 이외의 아미노산중 하나이상이 시스테인으로 변이 프레임워크를 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치환된 시스테인의 양옆에 위치하는 두 개의 아미노산 하나 이상의 아미노산이, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌 및 리신으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 전하띤 아미노산으로 추가로 치환된 것인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 닭 항체의 경쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가
    서열번호 1의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 5번, 6번, 7번, 14번, 18번 위치,
    서열번호 2의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 37번, 45번 위치,
    서열번호 3의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 57번, 58 번, 61 번, 63 번, 64 번, 65 번, 66 번, 69 번, 70 번, 76 번, 83 번, 87 번, 및
    서열번호 4의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 102번, 및 106번 위치로 이루어지는 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산인, 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변이 프레임워크는 서열번호 9 내지 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 닭 항체의 중쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가
    서열번호 5의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 1번, 3번, 5번, 6번, 7번, 11번, 12번, 13번, 16번, 18번, 19번, 24번, 25번,
    서열번호 6의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 42번, 48번
    서열번호 7의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 69번, 72번, 74번, 75번, 77번, 83번, 84번, 85번, 87번, 89번, 및
    서열번호 8의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 110번, 및 113번 위치로 이루어지는 군에서 선택된 1개이 이상의 아미노산인, 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 변이 프레임워크는 서열번호 57 내지 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 항체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 닭 항체의 경쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가
    서열번호 1의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 5번, 6번, 7번, 14번, 18번 위치,
    서열번호 2의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 37번, 45번 위치,
    서열번호 3의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 57번, 58 번, 61 번, 63 번, 64 번, 65 번, 66 번, 69 번, 70 번, 76 번, 83 번, 87 번, 및
    서열번호 4의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 102번, 및 106번 위치로 이루어지는 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산이고
    상기 닭 항체의 중쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가
    서열번호 5의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 1번, 3번, 5번, 6번, 7번, 11번, 12번, 13번, 16번, 18번, 19번, 24번, 25번,
    서열번호 6의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 42번, 48번
    서열번호 7의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 69번, 72번, 74번, 75번, 77번, 83번, 84번, 85번, 87번, 89번, 및
    서열번호 8의 아미노산 서열중 110번, 및 113번 위치로 이루어지는 군에서 선택된 1개이 이상의 아미노산인, 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 닭 항체의 경쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가 서열번호 1의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 5번, 6번 및 7번위치로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 아미노산이고,
    상기 닭 항체의 중쇄가변부위에 존재하는 프레임워크에서 시스테인으로 치환되는 아미노산의 위치가 서열번호 5의 아미노산 서열중 카바트 넘버로서 13번 및 16번으로 이루어지는 군에서 선택된 하나이상의 아미노산인 항체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 경쇄가변부위의 변이 프레임워크는 서열번호 9 내지 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 중쇄가변부위의 변이 프레임워크는 서열번호 57 내지 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 시스테인 치환 항체가
    시스테인 치환된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이 유발시키는 것;
    시스테인 치환된 항체를 발현시키는 것; 및
    시스테인 치환된 항체를 단리 및 정제하는 것
    을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 항체.
  11. 제1항 또는 제2항에 따른 항체에, 약물, 효소, 앱타머(aptamer), 독소, 친화성 리간드, 및 검출 표지로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 접합 화합물을 결합한 복합체.
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