CN105452293B - 转化为半胱氨酸的鸡抗体和使用其的位点特异性缀合 - Google Patents

转化为半胱氨酸的鸡抗体和使用其的位点特异性缀合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从鸡抗体获得的构架片段，其中在特定位置的氨基酸被半胱氨酸取代，包括该构架片段的重链可变区或轻链可变区，或包括重链可变区或轻链可变区的抗体在维持抗体的活性和反应性时不诱导或阻止形成抗体分子之间的二硫键。引入半胱氨酸的抗体或其抗原结合片段容易地与缀合化合物如化学治疗药物、酶、适体、毒素、亲和配体或检测标记结合，从而应用于诊断或治疗疾病的各个领域。

Description

转化为半胱氨酸的鸡抗体和使用其的位点特异性缀合
技术领域
本发明涉及用半胱氨酸残基修饰的改造的鸡抗体，更具体地涉及具有治疗或诊断疾病应用的抗体。半胱氨酸修饰的抗体可以与化学治疗药物、毒素、肽、亲和配体(如生物素)、和检测标记(如放射性同位素和荧光团)缀合，并且用于诊断或治疗疾病。
背景技术
抗体广泛用于诊断和治疗。抗体可以通过与药物、酶、染料、肽、适体、接头、毒素、同位素等化学结合而具有改善功能或可以具有新的功能。在与这些物质的化学结合中，涉及到官能团如抗体的酪氨酸残基的OH基团、赖氨酸残基的NH3基团，或天冬氨酸或谷氨酸的羧基基团(文献[Goldenberg D.M.等人,J.Med.(医学杂志)(1978)298:1384-1386；Rainsbury R.M.等人,Lancet(柳叶刀)(1983)2:934–938；以及Yamada H.等人,Biochemistry(生物化学)(1981)20:4836-4842])。
然而，这些官能团也存在于抗原结合位点中。因此，如果在化学结合中涉及抗原结合位点中的残基，可能会影响抗体对抗原的亲和力。另外，在使用半胱氨酸的结合反应中，抗体分子链(多肽)内或链之间的二硫键的还原是先决条件，其可以影响蛋白的活性(文献[Stimmel J.B.等人,J.Biol.Chem.(2000)273:30445-30450])。另外，蛋白可以由于三级结构的错折叠或损失而变得无活性或非特异性(文献[Zhang W.等人,Anal.Biochem.(分析生物化学)(2002)311:1-9])。
位点特异性缀合优于随机的氨基修饰，因为其能够在远离结合位点的位点进行化学修饰，促进生物学活性的完整保留和允许控制添加的辅基的可能数目。半胱氨酸改造的抗体已通过接头在新引入的半胱氨酸硫醇上缀合硫醇反应性接头试剂和药物接头试剂，以制备半胱氨酸改造的具有抗癌性能的抗体药物缀合物，例如，抗MUC16(US 2008/0311134)，抗CD22(US 2008/0050310)，抗ROBO4(US 2008/0247951)，抗TENB2(US 2009/0117100)，抗CD79B(US2009/0028856；US 2009/0068202)Thio ADC。然而，人或其他动物中存在一个或多个抗体重链和轻链可变区基因，并且因此，每个不同的抗体具有不同的构架序列。因此，存在的问题是，应当针对相应的抗体优化半胱氨酸引入位点。
发明内容
技术问题
本发明的一方面提供了鸡抗体的构架片段，其中半胱氨酸残基被引入到重链可变区或轻链可变区中存在的构架区中，包括该构架片段的重链可变区或轻链可变区，或包括该重链可变区或轻链可变区的抗体。
本发明的另一方面提供了包括抗体或其抗原结合片段的缀合物和缀合化合物，所述缀合物通过使例如化学治疗药物、酶、适体、毒素、亲和配体、或检测标记的缀合化合物与鸡抗体的构架片段、包括该构架片段的重链可变区或轻链可变区或包括该重链可变区或轻链可变区的鸡抗体中存在的引入的半胱氨酸残基缀合来制备。
又另一方面提供了包括抗体或其抗原结合片段的缀合物和缀合化合物在诊断或治疗疾病中的用途。
技术方案
本发明人已经从鸡抗体的重链可变区和轻链可变区的构架区中存在的多种氨基酸残基选择了尽管被半胱氨酸取代也能够维持抗体活性和亲和力的残基，并且还提供了鸡抗体的重链可变区和轻链可变区中的构架片段、包括该构架的重链可变区或轻链可变区、以及包括重链可变区或轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中所述构架片段的特定氨基酸被半胱氨酸修饰。
优选地，引入半胱氨酸的位点不诱导在抗体分子之间形成二硫键，使得不形成二聚体，或形成少量的二聚体。因此，维持了半胱氨酸的反应性。引入半胱氨酸的抗体或其抗原结合片段容易地与缀合化合物(如化学治疗药物、酶、适体、毒素、亲和配体或检测标记)结合，从而应用于诊断或治疗疾病的各个领域。
另外，根据本发明的半胱氨酸修饰的构架，包括该构架的重链可变区或轻链可变区以及包括重链可变区或轻链可变区的抗体或其抗原结合片段源自鸡抗体，并且鸡抗体具有一个重链可变区基因和一个轻链可变区基因，与人或其他动物的抗体不同。为此，所有抗体具有相同的构架。因此，在根据本发明的半胱氨酸修饰的构架或包括该构架的抗体中，半胱氨酸位于同样的位置，并且因此同样地应用于鸡中产生的所有抗体。
以下将更加详细地描述本发明。
根据本发明的实施方式的抗体是包括构架的抗体，其中源自鸡抗体的重链可变区和轻链可变区的构架区中存在的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸取代。
根据本发明的另一个实施方式的抗体是包括构架的抗体，其中源自鸡抗体的重链可变区和轻链可变区的构架区中存在的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸取代，并且作为取代的半胱氨酸两侧的侧翼的两个氨基酸中的一个或多个额外地被选自由天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸组成的组中的一个或多个带电荷的氨基酸取代。
在本发明中，制备包括具有取代的半胱氨酸的构架的修饰的抗体通过使用具有一个重链可变区基因和一个轻链可变区基因的鸡抗体进行，因此在不分别优化半胱氨酸残基的引入位点的情况下可以迅速地制备半胱氨酸修饰的抗体，与人或其他动物的具有多种重链和轻链可变区基因的抗体不同。
在本发明中，抗体(半胱氨酸)，其中源自鸡抗体的重链可变区和轻链可变区的构架区中存在的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸取代，具有的优点是，两个或更多个氨基酸以及一个氨基酸被半胱氨酸取代，因此，两个缀合化合物缀合在其上，或两个或更多个不同的缀合化合物缀合在其上以制备具有多种功能的缀合物。
另外，根据本发明的修饰的抗体还具有的优点是，除了半胱氨酸取代外，作为被取代的半胱氨酸两侧的侧翼的两个氨基酸中的至少一个氨基酸被选自由天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸组成的组中的一个或多个带电荷的氨基酸取代，从而有效地诱导与具有相反电荷的物质的共价键，并且抑制在具有相同局部电荷的半胱氨酸修饰的抗体之间形成二硫键以防止抗体聚集，并且用带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸取代氨基酸抑制了马来酰亚胺键的断裂(文献[Shen B.Q.等人,Nat.Biotechnol.(国家生物技术)(2012)30:184-189])。
在本发明中，在可用半胱氨酸取代的位置的氨基酸是除半胱氨酸之外的氨基酸。位于构架内的任何氨基酸均可被取代，只要其即使被半胱氨酸取代也能够维持抗体活性和亲和力。
满足上述条件的待取代的氨基酸位于鸡抗体的轻链可变区中存在的构架内，包括SEQ ID NO:1的构架1、SEQ ID NO:2的构架2、SEQ ID NO:3的构架3、SEQ ID NO:4的构架4，并且这些构架的结构如图1a详细地示出。
在本发明的实施方式中，修饰的抗体可以是仅包括轻链可变区的修饰的构架、仅包括重链可变区的修饰的构架或包括轻链可变区的修饰的构架和重链可变区的修饰的构架两者的抗体。
在鸡抗体的轻链可变区中存在的构架中，待被半胱氨酸取代的氨基酸位于选自由以下组成的组中的一个或多个位置：顺序编号的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的位置3、4、5、12、和16(与按照Kabat编号的位置5、6、7、14和18对应)，
顺序编号的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的位置31和40(与按照Kabat编号的位置37和45对应)，
顺序编号的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的位置52、53、56、58、59、60、61、64、65、71、78和82(与按照Kabat编号的位置57、58、61、63、64、65、66、69、70、76、83和87对应)，以及
顺序编号的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的位置98和102(与按照Kabat编号的位置102和106对应)。
在轻链可变区中存在的构架内，可被半胱氨酸取代的氨基酸的位置如表1a所示。
[表1a]轻链构架
Figure GDA0002707298150000041
Figure GDA0002707298150000051
满足上述条件的待取代的氨基酸位于鸡抗体的重链可变区中存在的构架内，包括SEQ ID NO:5的构架1、SEQ ID NO:6的构架2、SEQ ID NO:7的构架3、SEQ ID NO:8的构架4，并且这些构架的结构如图1a详细地示出。
在鸡抗体的重链可变区中存在的构架内，待被半胱氨酸取代的氨基酸位于选自由以下组成的组中的一个或多个位置：顺序编号的SEQ ID NO:5的氨基酸序列的位置1、3、5、6、7、11、12、13、16、18、19、24和25(与按照Kabat编号的位置1、3、5、6、7、11、12、13、16、18、19、24和25对应)，
顺序编号的SEQ ID NO:6的氨基酸序列的位置42和48(与按照Kabat编号的位置42和48对应)，
顺序编号的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的位置70、73、75、76、78、87、88、89、91和93(与按照Kabat编号的位置69、72、74、75、77、83、84、85、87和89对应)，以及
顺序编号的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的位置123和126(与按照Kabat编号的位置110和113对应)。
在重链可变区中存在的构架内，可被半胱氨酸取代的氨基酸的位置如表1b所示。
[表1b]重链构架
Figure GDA0002707298150000052
Figure GDA0002707298150000061
另外，在轻链可变区中，待被半胱氨酸取代的氨基酸可以优选地位于选自由顺序编号的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的位置3、4、和5(与按照Kabat编号的位置5、6、和7对应)组成的组中的一个或多个位置。在重链可变区中，待被半胱氨酸取代的氨基酸可以优选地位于选自由顺序编号的SEQ ID NO:5的氨基酸序列的位置13和16(与按照Kabat编号的位置13和16对应)组成的组中的一个或多个位置。
在本发明的实施方式中，除了在优选的氨基酸位置的半胱氨酸取代之外，作为取代的半胱氨酸两侧的侧翼的两个氨基酸中的至少一个可以被选自由天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸组成的组中的一个或多个带电荷的氨基酸取代。相对于修饰的抗体，例如，当在轻链可变区中的待被半胱氨酸取代的氨基酸优选地位于选自由顺序编号的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的位置3、4和5组成的组中的一个或多个位置，或在重链可变区中的待被半胱氨酸取代的氨基酸优选地位于选自由顺序编号的SEQ ID NO:5的氨基酸序列的位置13和16组成的组中的一个或多个位置时，作为取代的半胱氨酸两侧的侧翼的氨基酸被带电荷的氨基酸取代的构架可以包括表3a和表3b的修饰的序列。
[表3a]
Figure GDA0002707298150000071
[表3b]
Figure GDA0002707298150000072
Figure GDA0002707298150000081
因此，包括邻近的氨基酸取代以及半胱氨酸取代的修饰的抗体可以是包括具有选自由SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:88的氨基酸序列组成的组中的一个或多个氨基酸序列的修饰的轻链可变区、具有选自由SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:88的氨基酸序列组成的组中的一个或多个氨基酸序列的修饰的重链可变区或所述修饰的轻链可变区和所述修饰的重链可变区两者的抗体。
除非另有说明，本文使用的术语和短语旨在表示以下含义。如本文所用，术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并具体地，涵盖表现出所需的生物学活性的单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。抗体可为鼠的、人的、人源化的、嵌合的抗体，或源自其他物种。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合靶抗原(这样的靶包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞)的抗原结合位点的分子或其部分。本文公开的免疫球蛋白可以为任意类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)，亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或型的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可源自任意物种。
如本文所用，术语“抗体片段”包括全长抗体的一部分，一般包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双价小分子抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(文献[Olafsen等人(2004)ProteinEng.Design&Sel.(蛋白质工程、设计&选择)17(2004):315-323])，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体，CDR(互补决定区)，和免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任一种的表位结合片段，单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在本发明中，可以通过以下方法制备半胱氨酸取代的抗体，所述方法包括：(1)诱导编码半胱氨酸取代的抗体的核酸序列突变；2)表达半胱氨酸取代的抗体；并且3)分离并提纯半胱氨酸取代的抗体。另外，取代作为半胱氨酸两侧的侧翼的氨基酸也可以与半胱氨酸取代的相同的方式进行。
在本发明的另一个具体实施方式中，提供了一种包括根据本发明的修饰的抗体或其抗原结合片段的缀合物和缀合化合物，所述缀合物通过使缀合化合物(如化学治疗药物、酶、肽、适体、毒素、亲和配体或检测标记)与修饰的抗体缀合来制备。根据缀合化合物的类型，缀合物可以不同地应用于诊断或治疗疾病。
在本发明的又另一种实施方式中，与肽化学结合的抗体可以进一步具有促进肽亲和力的功能，如经由其受体有效穿透血脑屏障(文献[Chacko A.M等人,Expert Opin.DrugDeliv.(药物递送的专家意见)(2013)10:907-26；专利EP2233 156B1])。
缀合化合物可以发挥以下作用：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体结合的亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率，例如电泳迁移率，或细胞渗透性，或(v)提供捕获部分，以便调节配体亲和力、抗体/抗原结合或离子络合。
标记的半胱氨酸取代的抗体可用于诊断测定，例如用于检测目的抗原在特定细胞、组织或血清中的表达。对于诊断应用，一般将使用可检测部分标记抗体。可使用大量标记，其可以一般被分为以下类别：
(a)放射性同位素(放射性核素)，例如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、89Zr、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。放射性同位素标记的抗体用于受体靶向的成像实验。可使用结合、螯合或络合放射性同位素金属的配体试剂标记抗体，其中所述试剂与改造的抗体的半胱氨酸的硫醇基反应。
(b)荧光标记，例如稀土螯合物(铕螯合物)，荧光素类型包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素等；罗丹明类型包括TAMRA等；丹酰；丽丝胺；青色素；藻红蛋白；德克萨斯红；及其类似物。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,OR，美国)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL，美国)商业获得的那些。
(c)多种酶-底物标记是文献(US 4275149)中可得或公开的。酶一般催化显色底物的化学改变，所述化学改变可以使用多种技术测量。例如，酶可以催化底物中的颜色变化，这可通过分光光度计测量。可选地，酶可改变底物的荧光或化学发光。上文描述了定量荧光变化的技术。酶标记的实例包括荧光素酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶等。用于使酶与抗体缀合的技术可以通过一般方法进行。
在又一种实施方式中，半胱氨酸取代的抗体可通过半胱氨酸硫醇被放射性核素、荧光染料、生物发光触发底物部分、化学发光触发底物部分、酶和其他用于具有诊断、药效动力学和治疗应用的成像实验的检测标记。大体上，标记的半胱氨酸改造抗体，即“生物标记物”或“探针”通过注射、灌注或口服摄取给予活的生物体，例如人、啮齿类或其他小型动物，被灌注的器官或组织样品。在一段时间内检测探针的分布并通过图像呈现。
有益效果
根据本发明的鸡抗体的构架片段，包括该构架片段的重链可变区或轻链可变区，或包括重链可变区或轻链可变区的抗体在维持抗体的活性和反应性的同时不诱导或阻止形成抗体分子之间的二硫键。引入半胱氨酸的抗体或其抗原结合片段容易地与缀合化合物(如化学治疗药物、酶、适体、毒素、亲和配体或检测标记)结合，从而应用于诊断或治疗哺乳动物细胞或相关疾病的各种领域。
附图说明
图1a示出了用于本实验使用的鸡抗体的野生型和种系的碱基序列的顺序编号方案(上行)与Kabat编号方案(下行)的比较；
图1b示出了用于吸光度检测的结合在与抗噬菌体HRP抗体结合的固定化PSA上的半胱氨酸修饰的抗体噬菌体的卡通图；
图1c和图1d示出了使用半胱氨酸修饰的抗体噬菌体在405nm下的吸光度检测的结合测量值(上：修饰的轻链；下：修饰的重链)；
图1e示出了由X射线晶体坐标得到的鸡抗体片段的三维视图，其中示出了重链和轻链的5种改造的半胱氨酸残基的结构位置；
图2示出了使用包括具有硫醇反应性的两个半胱氨酸残基的抗体噬菌体在405nm下的吸光度检测的结合测量值；
图3a和图3b示出了使用被阳离子氨基酸取代的半胱氨酸修饰的抗体噬菌体在405nm下的吸光度检测的结合测量值(上：修饰的轻链；下：修饰的重链)；
图3c和图3d示出了使用被阴离子氨基酸取代的半胱氨酸修饰的抗体噬菌体在405nm下的吸光度检测的结合测量值(上：修饰的轻链；下：修饰的重链)；
图4a示出了从用于缀合的细胞培养物中表达的半胱氨酸修饰的单链Fv(scFv)型抗体的考马斯蓝染色；
图4b示出了从用于缀合的细胞培养物中表达的阳离子或阴离子半胱氨酸修饰的scFv型抗体的考马斯蓝染色；
图5a示出了从用于缀合的细胞培养物中表达的半胱氨酸修饰的全IgG类抗体的考马斯蓝染色；
图5b示出了从用于缀合的细胞培养物中表达的阳离子或阴离子半胱氨酸修饰的全IgG类别抗体的考马斯蓝染色；
图6示出马来酰亚胺激活的PEG与半胱氨酸修饰的抗体的缀合的卡通图。
图7a示出了马来酰亚胺PEG缀合的scFv的考马斯蓝染色；
图7b示出了马来酰亚胺PEG缀合的scFv的碘染色；
图7c示出了马来酰亚胺PEG缀合的scFv的免疫印迹；
图8a示出了马来酰亚胺PEG缀合的全IgG的考马斯蓝染色；
图8b示出了马来酰亚胺PEG缀合的全IgG的碘染色；
图8c示出了马来酰亚胺PEG缀合的全IgG的免疫印迹；
图9a示出了用阳离子或阴离子残基取代的马来酰亚胺PEG缀合的scFv的考马斯蓝染色；
图9b示出了用阳离子或阴离子残基取代的马来酰亚胺PEG缀合的scFv的碘染色；
图9c示出了用阳离子或阴离子残基取代的马来酰亚胺PEG缀合的scFv的免疫印迹；
图10a示出了用阳离子或阴离子残基取代的马来酰亚胺PEG缀合的全IgG的考马斯蓝染色；
图10b示出了用阳离子或阴离子残基取代的马来酰亚胺PEG缀合的全IgG的碘染色；
图10c示出了用阳离子或阴离子残基取代的马来酰亚胺PEG缀合的全IgG的免疫印迹；
图11a示出了GMBS可替宁与半胱氨酸修饰的抗体缀合的卡通图；
图11b示出了用于吸光度检测的结合在与抗可替宁HRP抗体结合的固定化PSA上的GMBS可替宁缀合的半胱氨酸修饰的抗体的卡通图；
图12示出了GMBS可替宁与Ckappa融合的半胱氨酸修饰的scFv的结合物在450nm下的吸光度的检测(上：用抗可替宁IgG-HRP检测；下：用CkappaIgG-HRP检测)；
图13a示出了将可替宁-半胱氨酸注入小鼠的时间和血液采集时间；并且
图13b示出了检测在将可替宁-半胱氨酸修饰的抗体注入小鼠体内之前和之后在450nm下的吸光度以检查血清中存在或不存在可替宁半胱氨酸修饰的抗体。
具体实施方式
将结合本发明的具体实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于以下实施例，并且对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以对本发明作出各种修改和变化。因此，应当按照可能与本发明的精神和范围一致的方式宽泛地解释所附权利要求书。
实施例1：具有一个半胱氨酸修饰的抗体的制备
1-1.修饰的抗体噬菌体的制备
实施例中使用的抗体是抗PSA(前列腺特异性抗原)的鸡抗体，并且图1a示出了抗PSA抗体(野生型)和鸡种系的构架的碱基序列([文献[Andris-Widhopf J.等人,JImmunol.Methods(免疫方法杂志)(2000)242:159–181])。可在http://www.bioinf.org.uk/abs/获得Kabat编号系统。
为了制备半胱氨酸修饰的抗体，首先根据文献[Chung J.等人,FASEB J.(美国实验生物学会联合会会志)(2004)18:361-383]，进行PCR，从而将NNK(N:A/C/G/T,K:G/T)插入到78轻链域构架(VL域构架)残基和84重链域构架(VH域构架)残基中，以便使相应的残基随机化。随后，根据Barbas,C.F.(2001)Phage display:a laboratory manual.(噬菌体表达实验室手册)Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室，纽约：冷泉港实验室出版社)所描述的方法，将获得的scFv(单链抗体Fv)DNA插入到转化为大肠杆菌ER2738的噬菌粒载体pComb3X中。然后，根据每个残基选择92个菌落以获得含有噬菌体展示的scFv(单链Fv)的培养上清液。
1-2.修饰的抗体的选择和它们对抗原的亲和力的测量
如图1b示出的方法，使用含有噬菌体抗体的培养上清液进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。用抗原PSA涂覆微量滴定板，并且向其中添加含有噬菌体的培养上清液，随后培养1小时。在清洗3次后，向该微量滴定板添加HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗M13抗体。在培养1小时并且清洗三次后，添加加入了H2O2的ABTS以检测显色。然后，测定405nm下的吸光度。作为对照组，使用野生型噬菌体。甚至在半胱氨酸取代21个轻链残基和27个重链残基之后，它们显示出与野生型抗体相似的亲和力(图1c和1d)。在表1a和1b中，给出了半胱氨酸修饰的抗体的顺序编号和Kabat编号，以及每个修饰的抗体的野生型的碱基序列。
[表1a]轻链构架
Figure GDA0002707298150000131
Figure GDA0002707298150000141
[表1b]重链构架
Figure GDA0002707298150000142
为了检测选择的半胱氨酸修饰的抗体的溶剂可及性，由X射线晶体坐标得到的鸡抗体片段的三维结构检测溶剂可及表面积(文献[Shih H.H.等人,JBiol.Chem.(生物化学杂志)(2012)287:44425-44434；PDB ID:4GLR])，如表2a和2b所示。其中，5种碱性(LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13、HF1-16)残基的结构位置如图1e所示。
[表2a]轻链的溶剂可及性
Figure GDA0002707298150000151
[表2b]重链的溶剂可及性
Figure GDA0002707298150000161
实施例2：具有两个半胱氨酸修饰的抗体的制备
从根据顺序编号的轻链(L3、L4、L5)和重链(H13、H16)的残基开始，轻链和重链的每个残基被半胱氨酸以组合方式取代，并且通过PCR制备具有两个反应性半胱氨酸的总共6种类型(L3H13、L3H16、L4H13、L4H16、L5H13、L5H16)的半胱氨酸修饰的抗体基因。接下来，半胱氨酸修饰的抗体基因以如实施例1的噬菌体展示的scFv的形式表达，然后通过酶联免疫吸附测定测量它们对PSA抗原的亲和力(图2)。
实施例3：与半胱氨酸相邻的氨基酸残基被取代的修饰的抗体
为了取代作为实施例1-1中制备的5种半胱氨酸修饰的抗体(LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16)两侧的侧翼的氨基酸用于通过阳离子氨基酸(精氨酸，赖氨酸)或阴离子氨基酸(天冬氨酸，谷氨酸)进行高效缀合，通过PCR插入与相应的残基对应的DNA碱基序列(精氨酸：CGT，赖氨酸：AAG，天冬氨酸：GAT，谷氨酸：GAA)。将因此获得的scFv DNA分别插入到噬菌粒载体pcomb3X中，然后转化到大肠杆菌ER2738中。接下来，在SB培养基中以噬菌体展示的scFv形式培养抗体。在表3a和3b中给出了用阳离子或阴离子残基取代的半胱氨酸修饰的抗体的碱基序列。
为了测量抗原的亲和力，用抗原PSA涂覆微量滴定板，然后添加包含噬菌体的培养上清液。在培养1小时并且清洗三次之后，向其中添加HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗M13抗体。在培养1小时并清洗三次之后，添加加入了H2O2的ABTS以检测显色。然后，测量405nm下的吸光度。图3a和图3b示出了阳离子半胱氨酸修饰的抗体的结果，并且图3c和图3d示出了阴离子半胱氨酸修饰的抗体的结果。
[表3a]
Figure GDA0002707298150000171
Figure GDA0002707298150000181
[表3b]
Figure GDA0002707298150000182
实施例4：半胱氨酸修饰的scFv抗体
4-1.半胱氨酸修饰的scFv抗体的表达和提纯
为了制备半胱氨酸修饰的scFv和人Ckappa的融合蛋白，通过克隆将半胱氨酸修饰的scFv插入到含有人Ckappa的哺乳动物表达载体pCEP4中，并且在HEK293F细胞中诱导其表达以获得最终的培养液。使用卡帕选择珠(kappa select beads)完成从培养液提纯scFv-Ckappa融合蛋白。在提纯后，该蛋白被装载在聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE凝胶)上，随后进行电泳。通过考马斯蓝染色证实其表达和提纯。图4a示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16 scFv蛋白的表达和提纯的检测结果。
4-2.与半胱氨酸相邻的氨基酸残基被取代的半胱氨酸修饰的scFv抗体的表达和 提纯
从用阳离子氨基酸或阴离子氨基酸取代与半胱氨酸相邻的氨基酸残基的半胱氨酸修饰的抗体开始，维持抗原亲和力的克隆经过选择并且其具有人Ckappa的融合蛋白按照实施例4-1在HEK293F细胞中表达，并且使用卡帕选择珠提纯。此后，在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并且通过考马斯蓝染色证实它们的表达和提纯。图4b示出了野生型、HF1-13、R13CK、D13CE、E13CD和E13CE scFv-Ckappa融合蛋白的表达和提纯的检测结果。
实施例5：半胱氨酸修饰的全IgG抗体
5-1.半胱氨酸修饰的全抗体的表达和提纯
为了制备鸡-人嵌合的全IgG蛋白，通过PCR获得实施例1中制备的半胱氨酸修饰的抗体的可变区的轻链和重链DNA并且将其插入到IgG表达载体中，随后在HEK293F细胞中表达并培养。此后，使用蛋白A珠对全IgG抗体进行提纯。对提纯的蛋白进行电泳，并且通过考马斯蓝染色证实它们的表达和提纯。图5a示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16全IgG蛋白的表达和提纯的检测结果。
5-2.与半胱氨酸相邻的氨基酸残基被取代的半胱氨酸修饰的全IgG抗体的表达和 提纯
为了表达如实施例5-1的鸡-人嵌合的全IgG抗体形式的、在实施例3中制备的与半胱氨酸相邻的氨基酸残基被取代的半胱氨酸修饰的抗体，将抗体基因插入到IgG表达载体中，并且在HEK293F细胞中表达并培养。接下来，使用蛋白A珠从培养液提纯全IgG抗体。将提纯的蛋白装载在聚丙烯酰胺凝胶上，随后进行电泳。通过考马斯蓝染色证实它们的表达和提纯。图5b示出了R13CK、E13CD和E13CE全IgG蛋白的表达和提纯的检测结果。
实施例6：PEG缀合的修饰的抗体
6-1.通过PEG缀合制备PEG半胱氨酸修饰的抗体及其测定
根据文献[Junutula等人,(2008)nature biotechnology(自然生命科学杂志)925-32]描述的方法，通过加入10倍的TCEP来还原实施例1中制备的半胱氨酸修饰的抗体，然后去除TCEP。对于部分氧化，加入相当于2倍的TCEP的量的DHA。然后，加入相当于10倍抗体的量的马来酰亚胺PEG，并且在4℃下培养12小时以诱导抗体与PEG的缀合。图6示出马来酰亚胺PEG与巯基抗体缀合的卡通图。
将抗体PEG装载在聚丙烯酰胺凝胶上，然后进行电泳。然后，凝胶经过考马斯或碘染色和免疫印迹以检测PEG与抗体的缀合。为了考马斯染色，用考马斯亮蓝R250对凝胶进行染色，并且用含有甲醇和乙酸的脱色溶液进行脱色以识别相应的蛋白。图7a示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16 scFv的结果，并且图8a示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16全IgG的结果。
为了碘染色，用蒸馏水清洗聚丙烯酰胺凝胶15分钟，然后在5％BlCl2中保留15分钟。然后，用0.1M碘对凝胶染色10分钟，并且用蒸馏水脱色10分钟以仅检测PEG。图7b示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16 scFv的结果，并且图8b示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16全IgG的结果。
对于免疫印迹，根据蛋白大小分离聚丙烯酰胺凝胶，然后将全IgG转移到NC膜上，使用HRP缀合的抗Ckappa抗体检测scFv-Ckappa融合蛋白和全IgG轻链区，并且使用HRP缀合的抗人Fc抗体来检测全IgG重链区。图7c示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16scFv的结果，并且图8c示出了野生型、LF1-2、LF1-3、LF1-4、HF1-13和HF1-16全IgG的结果。
6-2.通过PEG缀合制备与半胱氨酸相邻的氨基酸残基被取代的PEG半胱氨酸修饰 的抗体及其测定
如实施例6-1，使用TCEP来还原阳离子或阴离子残基被取代的抗体，并且通过添加DHA进行部分氧化。然后，向抗体中加入PEG以诱导PEG与抗体的缀合。为了检测PEG与抗体的缀合，进行考马斯蓝染色、碘染色和免疫印迹。
图9a示出了检测PEG与野生型、HF1-13、R13CK、D13CE、E13CD或E13CE scFv的缀合的考马斯蓝染色的结果，并且图10a示出了检测PEG与野生型、HF1-13、R13CK或E13CE全IgG的缀合的考马斯蓝染色的结果。
图9b示出了检测PEG与野生型、HF1-13、R13CK、D13CE、E13CD或E13CE scFv的缀合的碘染色的结果，并且图10b示出了PEG与HF1-13、R13CK或E13CE全IgG的缀合的碘染色的结果。
图9c示出了检测PEG与野生型、HF1-13、R13CK、D13CE、E13CD或E13CE scFv的缀合的免疫印迹的结果，并且图10c示出了PEG与HF1-13、R13CK或E13CE全IgG的缀合的免疫印迹的结果。
实施例7：通过可替宁缀合制备抗体-可替宁及其测定
通过添加10倍的TCEP来还原实施例1中制备的半胱氨酸修饰的抗体，然后去除TCEP。对于部分氧化，加入相当于2倍的TCEP的量的DHA。此后，添加相当于10倍的抗体的量的GMBS可替宁，并且在4℃下培养12小时以诱导抗体与可替宁缀合。图11a示出了GMBS可替宁与巯基抗体缀合的卡通图。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定抗体可替宁(图11b)。用PSA抗原涂覆平板，然后向其中添加抗体可替宁，随后培养1小时。在清洗三次之后，加入HRP缀合的抗可替宁IgG或抗Ckappa IgG抗体。在培养1小时并清洗三次后，加入TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)以检测显色，然后使用2M H2SO4来终止反应。测量450nm下的吸光度。在图12的结果中，通过抗可替宁IgG证实可替宁缀合，并且抗Ckappa IgG用于仅检测与可替宁缀合无关的抗体。
实施例8：将抗体可替宁注入小鼠体内以及可替宁抗体的测定
将6周龄的Balb/c小鼠随机分为3组(HF1-13、E13CD、E13CE)，然后进行眶后血液采集。在24小时后，将实施例7制备的3种类型的可替宁scFv抗体Ckappa融合蛋白各100μg静脉注入小鼠体内。在可替宁抗体注射1小时后，进行眶后血液采集，使用离心机分离血清。分离的血清稀释50倍以便检测血清中存在或不存在可替宁抗体，并且按照实施例9进行酶联免疫吸附测定。使用小鼠的所有程序在吸入麻醉剂后进行以使疼痛最小化。
Figure IDA0000922669840000011
Figure IDA0000922669840000021
Figure IDA0000922669840000031
Figure IDA0000922669840000041
Figure IDA0000922669840000051
Figure IDA0000922669840000061
Figure IDA0000922669840000071
Figure IDA0000922669840000081
Figure IDA0000922669840000091
Figure IDA0000922669840000101
Figure IDA0000922669840000111
Figure IDA0000922669840000121
Figure IDA0000922669840000131
Figure IDA0000922669840000141
Figure IDA0000922669840000151
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Figure IDA0000922669840000171
Figure IDA0000922669840000181
Figure IDA0000922669840000191
Figure IDA0000922669840000201
Figure IDA0000922669840000211
Figure IDA0000922669840000221
Figure IDA0000922669840000231

Claims (3)

1.一种修饰的鸡抗体，包含修饰的构架，所述修饰的构架包括取代除了在鸡抗体的轻链可变区或重链可变区的野生型构架中的半胱氨酸之外的至少一个氨基酸的至少一个半胱氨酸，所述轻链可变区包括SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 4的构架，所述重链可变区包括SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO: 8的构架，
其中，所述轻链可变区的修饰的构架包括选自SEQ ID NO: 36-37、39-40、52、53的氨基酸序列中的任一个，或者所述重链可变区的修饰的构架包括选自SEQ ID NO: 69、71-72、84-85、87的氨基酸序列中的任一个。
2.根据权利要求1所述的修饰的鸡抗体，其中，包括取代的半胱氨酸的所述修饰的鸡抗体通过以下方法制备，所述方法包括：
将突变引入编码含有取代的半胱氨酸的所述修饰的鸡抗体的核酸序列；
表达所述修饰的鸡抗体；并且
分离并且提纯所述修饰的鸡抗体。
3.一种通过使根据权利要求1所述的修饰的鸡抗体与一种或多种缀合化合物缀合制备的抗体复合体，所述缀合化合物选自由药物、酶、适体、毒素、亲和配体和检测标记所组成的组。
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