KR101969121B1 - 시스테인 조작된 항체 - Google Patents

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는, 인간 면역글로불린 항체에 관한 것으로서, 본 발명의 항체는 경쇄의 카파 불변 영역 내의 특정 아미노산이 시스테인으로 치환됨으로써 시스테인의 자유 티올기(free thiol)를 통해 면역 진단을 위한 자석 비드, 플레이트 또는 형광 단백질에 부위 특이적으로 접합할 수 있는바, 면역 진단의 감도를 향상시킬 수 있고 백그라운드 신호 없이 표적 단백질의 정성·정량 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

시스테인 조작된 항체{CYSTEINE-ENGINEERED ANTIBODY}
본 발명은 시스테인 조작된 항체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 경쇄의 카파 불변 영역 내의 특정 아미노산이 시스테인으로 치환됨으로써 면역진단을 위한 플레이트, 자석 비드 또는 화학물질에 대한 접합능이 우수한 인간 면역글로불린 항체에 관한 것이다.
면역분석법(immunoassay)이란 시료의 분석과정에서 항체를 이용하는 기술을 의미하며, 이 경우 항체는 표지(labeling)하여 사용되거나 별도의 표지 없이 그대로 사용되기도 한다. 초기에는 연구자들이 주로 단백질의 검출이나 정량을 위하여 이 방법을 사용하였으나, 최근에는 항체기술의 발전으로 저분자화합물, 탄수화물, 지질 등의 분석 및 각종 미생물의 분석에도 활용하고 있다. 면역분석법은 그 검출 원리 및 방법에 따라 방사성동위원소를 사용하여 신호를 검출하는 방사면역분석시험법(RIA: radioimmunoassay), 효소에 의한 신호 증폭을 사용하는 효소면역측정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay, 혹은 EIA: enzyme immunoassay), 형광을 이용하여 검출하는 형광항체법(FA: fluorescence antibody technique), 화학발광을 사용하는 화학발광면역측정법(CLIA: chemiluminescence immunoassay) 등으로 나눌 수 있다.
항체를 이용한 면역진단은 진단용 자석 비드 등의 표면에 항체를 붙이거나 혹은 항체에 형광 단백질을 접합시킨 후, 항체에 붙은 표적 단백질의 양을 측정하여 특정 질병 및 감염 등의 정도를 측정하여 진단하게 된다. 기존의 항체 접합 방법으로서 진단용 항체를 그의 아미노산의 카르복실기나 아민기 등을 통해 비드, 플레이트 또는 형광 단백질에 접합시키는 방법이 이용되고 있다. 하지만, 이러한 방법은 항체 내에 존재하는 수 많은 카르복실기 및 아민기로 인해 항체와 비드, 플레이트 또는 형광 단백질의 접합이 무작위적으로 일어나며, 항체마다 접합의 개수가 일정하게 일어나지 않고 백그라운드 신호(background signal)를 유발하는 단점이 있다. 또한 이러한 무작위적인 접합은 항체가 표적 단백질에 붙는 중요 부위에서도 일어날 수 있어 실제 항체가 나타낼 수 있는 활성도를 감소시킬 뿐만 아니라 항체의 물성을 바꾸어 응집(aggregation) 등의 문제를 유발할 수 있다.
따라서, 전술한 무작위적인 항체의 접합으로 인한 표적 단백질의 감도 감소 및 백그라운드 증가 등의 문제를 해결할 수 있는 새로운 방법이 요구된다.
(1) 미국특허 제7,855,275호 (2) 미국 공개특허 제2011-0033378호 (3) 국제 공개특허 제WO2014-124316호 (4) 국제 공개특허 제WO2013-093809호
따라서, 본 발명의 목적은 표적 단백질을 인지하는 성능의 변화 없이, 면역진단을 위한 플레이트, 자석 비드 또는 화학물질 등에 효율적으로 접합할 수 있는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, 면역진단에 유용하게 사용될 수 있는 면역접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, 표적 단백질을 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는, 인간 면역글로불린 항체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 인간 면역글로불린 항체; 및 세포독성제(cytotoxic agent), 화학치료제(chemotherapeutic agent), 독소, 방사성핵종(radionuclide), DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid), 비천연 아미노산, 펩타이드, 효소, 형광성 태그(fluorescent tag), 바이오틴 및 말레이마이드(maleimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질이 접합된, 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 인간 면역글로불린 항체 및 이와 접합된 플레이트 또는 자석 비드(magnetic bead)를 포함하는, 표적 단백질을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 항체는 경쇄의 카파 불변 영역 내의 특정 아미노산이 시스테인으로 치환됨으로써 시스테인의 자유 티올기(free thiol)를 통해 면역 진단을 위한 자석 비드, 플레이트 또는 형광 단백질에 부위 특이적으로 접합할 수 있는 바, 면역 진단의 감도를 향상시킬 수 있고 백그라운드 신호 없이 표적 단백질의 정성·정량 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 종래 기술에 따른 항체의 자석 비드, 플레이트 또는 형광 단백질에 대한 접합을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 항체의 자석 비드, 플레이트 또는 형광 단백질에 대한 접합을 나타낸 모식도이다.
도 3은 인간 면역글로불린 G의 경쇄의 카파 불변 영역의 서열 및 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 항체의 말레이미드(maleimide)기를 갖는 바이오틴에 대한 접합능을 ELISA로 측정한 결과이다.
이하, 본 발명에 사용된 용어의 정의를 설명한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중-특이적 항체(예: 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다 [참고: Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861]. 항체는 쥣과(murine), 인간, 인간화, 키메라, 또는 기타 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 항체는 특이적 항원을 인식하고 이와 결합할 수 있는 면역계에 의해 생성된 단백질이다[참고: Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) ImmunoBiology , 5 th Ed., Garland Publishing, New York]. 표적 항원은 일반적으로, 다중 항체 상의 CDR에 의해 인식될 수 있는 수많은 결합 부위 (에피토프로 불리우기도 함)를 갖는다. 상이한 에피토프와 특이적으로 결합하는 각 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수도 있다. 본원에 기재된 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 모든 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 부류(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 면역글로불린은 모든 종으로부터 유래될 수 있으나, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 면역글로불린, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 유래된 면역글로불린 G(IgG), 가장 바람직하게는 인간으로부터 유래된 면역글로불린 G1(IgG1)일 수 있다.
상기 항체의 "단편"은 전장 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예로는 항체의 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 단편으로서, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-개체특이형(항-Id) 항체, CDR(상보성 결정 영역), 및 암 세포 항원, 바이러스성 항원 또는 미생물성 항원과 면역특이적으로 결합하는 상기 항체의 에피토프-결합성 단편; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 들 수 있다. 바람직하게는, Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv 단편을 들 수 있다. 상기 "Fab" 단편은 2개의 동일한 항원 결합 단편(각각은 단일 항원 결합 부위를 갖는다)을 의미하며, 항체를 파파인으로 분해하여 수득될 수 있다. Fab 단편은 또한, 경쇄의 불변 영역과, 중쇄의 제1 불변 영역(CH1)을 함유한다. F(ab') 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 수 개의 잔기를 부가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 또한, 상기 F(ab')2 단편은 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 단편으로서, 항체를 펩신 처리함으로써 수득될 수 있다. 상기 "Fv"는 완전한 항체 인식 및 항체 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편으로서, 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 결합된 이량체로 이루어진다.
모든 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2가지 명백한 별개 유형[카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭됨] 중의 하나로 지정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "불변 영역"은 가변 영역을 제외한 항체의 도메인들 전부를 의미한다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되고, 이들 중 몇몇은 서브클래스, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 모든 5종의 항체 클래스들에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역은 κ(카파) 및 λ(람다)로 지칭된다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242)에 기재된 바와 같이 EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본원에서 사용된 용어 "인간으로부터 유래된 불변 영역"은 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역, 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 의미한다. 이러한 불변 영역은 최신 기술에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 카바트 이.에이.(Kabat, E.A.)에 의해 기재되어 있다(문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242), 문헌(Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218) 및 문헌(Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788) 참조).
한편, 본원에서 사용된 용어 "파아지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드가 파아지, 예를 들어 섬유상 파아지 입자 표면의 외피 단백질에 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다. 파아지 디스플레이의 유용성 중 하나는, 무작위화된 단백질 변이체의 커다란 라이브러리가 표적 분자에 높은 친화도로 결합하는 서열로 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 것이다. 파아지 상에서의 펩티드 및 단백질 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합성을 갖는 폴리펩티드를 찾고자 수백만 종의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 이용되어 왔다.
"파아지미드"는 박테리아 복제 기점, 예를 들어 Co1E1, 및 박테리오 파아지의 유전자간 영역 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파아지미드는 섬유상 박테리오파아지 및 람다상 박테리오파아지 등을 비롯한 임의의 공지된 박테리오파아지에서 사용될 수 있다. 상기 플라스미드는 또한 일반적으로 항생제 내성에 대한 선별가능한 마커를 함유할 수 있다. 이들 벡터로 클로닝된 DNA 절편들은 플라스미드로서 전파될 수 있다.
용어 "표지"는 항체에 공유 부착될 수 있고, 리간드 친화도, 항체/항원 결합, 또는 이온성 복합체 형성을 조정하기 위해서 (i) 검출가능한 신호를 제공하거나, (ii) 2차 표지와 상호작용하여 1차 또는 2차 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호, 예를 들어 FRET(형광 공명 에너지 전달)를 변형시키거나; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호작용을 안정화하거나 이들과의 결합 친화도를 증가시키거나, (iv) 이동성, 예를 들어 전기영동 이동성, 또는 세포-투과도에 전하, 소수성, 형태 또는 다른 물리적 파라미터로 인한 영향을 주거나, 또는 (v) 포획 부분을 제공하는 기능을 할 수 있는 임의의 부분을 의미한다.
용어 "라이브러리(library)"는 이종의 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 상기 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 염기서열을 갖는 멤버들로 이루어진다. 라이브러리 멤버 사이의 염기서열 차이는 라이브러리 내에 존재하는 다양성의 원인이 된다. 상기 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물 형태일 수도 있고, 핵산의 라이브러리로 형질전환된, 유기체 또는 세포, 예를 들면 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수도 있다.
한편, 본 발명에 사용된 아미노산 치환과 관련된 약어, 예를 들면 'E15C'는 본원에 규정된 아미노산 서열에서 15번째 위치의 아미노산인 글루탐산(E)이 시스테인(C)으로 치환된 하나의 아미노산의 치환을 의미하며, 'E15C/Q16D'는 본원에 규정된 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산(E)이 시스테인(C)으로 치환되고, 16번째 위치의 글루타민(Q)이 아스파트산(D)으로 치환된 2개의 아미노산의 치환을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는, 인간 면역글로불린 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 야생형(wild-type) 또는 모(parental) 면역글로불린 항체의 1개의 아미노산이 시스테인 아미노산으로 치환된 시스테인 조작된 항체로서, 상기 치환되는 아미노산은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 카파 불변 영역에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나이다.
즉, 본 발명의 일 실시형태에 따른 시스테인 조작된 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산이 시스테인으로 치환된(E15C) 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 항체이다.
인간의 야생형 또는 모 면역글로불린 항체의 경쇄의 카파 불변 영역의 서열 및 구조는 도 3에 나타나 있다. 상기 인간 면역글로불린 항체의 경쇄의 카파 불변 영역에 관해서는 UniProtKB P01834을 참조한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따른 시스테인 조작된 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환된(Q16C) 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 항체이다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따른 시스테인 조작된 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환된(L17C) 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 항체이다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따른 시스테인 조작된 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 47번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환된(Q47C) 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 항체이다.
상기 항체들은 경쇄의 카파 불변 영역 내의 특정 아미노산이 시스테인으로 치환됨으로써, 시스테인의 자유 티올기를 통해 면역 진단을 위한 자석 비드, 플레이트 또는 화학물질과 이황화결합(disulfide bond)에 의해 부위 특이적으로 접합될 수 있다.
상기 본 발명의 일 실시형태에 따른 항체들, 즉 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 항체들은 표적 단백질에 대한 인지능의 변화없이 면역진단을 위한 플레이트, 자석 비드 또는 화학물질 등에 효율적으로 접합할 수 있다.
본원의 실시예에는 경쇄의 카파 불변 영역 내의 특정한 아미노산이 시스테인으로 치환된 온전한(intact) 항체만이 기술되어 있으나, 당업자라면 상기 아미노산이 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 한, 상기 항체의 단편도 온전한 항체와 동일한 특성을 가질 것임을 쉽게 인식할 것이다.
따라서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 항체의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv 단편 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
한편, 본 발명은 상기 치환된 시스테인과 바로 인접한 N-말단쪽 또는 C-말단쪽 중 어느 하나의 위치의 아미노산이 아스파트산 또는 글루탐산으로 추가로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 면역글로불린 항체를 추가로 제공한다.
바람직하게는, 상기 항체는 하기의 특징을 갖는 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 면역글로불린 항체일 수 있다: (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산이 시스테인으로 치환되고, 16번째 위치의 글루타민이 아스파트산으로 치환(E15C/Q16D); (b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산이 시스테인으로 치환되고, 16번째 위치의 글루타민이 글루탐산으로 치환(E15C/Q16E); (c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 아스파트산으로 치환(Q16C/L17D); (d) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 아스파트산으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환(Q16D/L17C); (e) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 글루탐산으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환(Q16E/L17C); (f) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환되고, 18번째 위치의 라이신이 아스파트산으로 치환(L17C/K18D); 및 (g) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 47번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, 48번째 위치의 세린이 아스파트산으로 치환(Q47C/S48D).
상기 항체는 치환된 시스테인 주위의 아미노산이 음전하를 띠는 아미노산으로 추가 치환됨으로써 개선된 접합 효율을 나타낸다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체에 세포독성제(cytotoxic agent), 화학치료제(chemotherapeutic agent), 독소, 방사성핵종(radionuclide), DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid), 비천연 아미노산, 펩타이드, 효소, 형광성 태그(fluorescent tag), 바이오틴 및 말레이마이드(maleimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질이 접합된, 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다.
상기 "면역접합체"는 본 발명에 따른 항체에 세포독성제를 포함하는 1개 이상의 이종 분자(들)이 접합된 접합체(conjugate)를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제하거나 방해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 세포독성제는 항-튜불린제, DNA 좁은 홈(minor groove) 결합제, 항-매이탄시노이드(anti-maytansinoid) 및 아우리스타틴(auristatin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 화학치료제는 탁솔, 파클리탁셀, 독소루비신, 메토트렉세이트, 돌라스타틴, 빈카 알칼로이드 및 두오카르마이신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 독소(toxin)는 아비린(abirin), 브루신(brucine), 시쿠톡신(cicutoxin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 보툴리즘 독소(botulism toxin), 쉬가 독소(shiga toxin), 엔도톡신, 테타누스 독소(tetanus toxin), 퍼투시스 독소(pertussis toxin), 안트락스 독소(anthrax toxin), 콜레라 독소, 팔카리놀(falcarinol), 알파 독소(alfa toxin), 젤다마이신(geldamycin), 젤로닌(gelonin), 로타우스트랄린(lotaustralin), 리신(ricin), 스트리키닌(strychinine) 및 테트라도톡신(tetradotoxin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방사성핵종은 크롬(51Cr), 코발트(57Co), 플루오르(18F), 가도릴늄(153Gd, 159Gd), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 류테리움(177Lu), 망간(54Mn), 몰디브데늄(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라스코디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 류테뮴(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 트리튬(3H), 제논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y) 및 아연(55Zn)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 시스테인 조작된 항체는 진단 검정, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 관심 항원의 발현 검출에 유용할 수 있다. 진단 용도를 위해서는, 항체가 검출가능한 부분으로 표지되는 것이 전형적이다. 일반적으로 하기 범주로 분류될 수 있는 다양한 표지를 이용할 수 있다:
(a) 방사선동위원소(방사선핵종), 예를 들어 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At 또는 213Bi. 방사선동위원소 표지된 항체는 수용체 표적화된 영상화 실험에 유용하다. 항체는 문헌[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사선동위원소 금속에 결합하거나 킬레이팅되거나 또는 다른 방식으로 복합체를 형성하며 항체의 유전자조작된 시스테인 티올과 반응성인 리간드 시약으로 표지될 수 있다. 금속 이온과 복합체를 형성할 수 있는 킬레이팅 리간드로는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA(마크로시클릭스(Macrocyclics), 미국 텍사스주 달라스 소재) 등이 있다. 방사선핵종은 본 발명의 항체-약물 접합체와의 복합체 형성을 통해 표적화될 수 있다[Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146].
영상화 실험을 위한 항체 표지로서 적합한 금속-킬레이트 복합체가 선행문헌에 개시되어 있다: US 5342606, US 5428155, US 5316757, US 5480990, US 5462725, US 5428139, US 5385893, US 5739294, US 5750660, US 5834456, (b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 등을 비롯한 플루오레세인 유형, TAMRA 등을 비롯한 로다민 유형, 댄실, 리쓰아민(Lissamine), 시아닌류, 피코에리트린류, 텍사스 레드(Texas Red) 및 이들의 유사체. 형광 표지는 예를 들어 문헌[Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 인비트로젠(Invitrogen)/모레큘라 프로브스(Molecular Probes)(미국 오레곤주 유진 소재) 및 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.) (미국 일리노이주 록크포드 소재)에서 시판하는 것을 포함한다.
(c) 각종 효소-기질 표지가 개시되어 있다(US 4275149). 효소는 일반적으로 발색성 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있고, 이것은 분광학적으로 측정될 수 있다. 효소 표지의 예로는 루시퍼라제(예, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제, US 4737456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소짐, 당류 옥시다제(예, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제(예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 문헌[O'Sullivan et al. (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166]에 기재되어 있다.
표지는 시스테인 유전자조작 항체에 간접 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체를 바이오틴과 접합시키고, 상기 언급한 표지의 3가지 광범위한 범주 중 임의의 것은 아비딘 또는 스트렙타비딘와 접합시킬 수도 있고, 또는 그 반대일 수도 있다. 바이오틴은 스트렙타비딘에 선택적으로 결합하기 때문에, 표지가 이러한 간접적인 방식으로 항체에 접합될 수 있다.
본 발명의 표지된 시스테인 조작된 항체는 생체의학적 영상화와 분자 영상화의 여러가지 방법 및 기술, 예를 들어: (i) MRI(자기 공명 영상화), (ii) MicroCT(전산화 단층촬영술), (iii) SPECT(단일 광자 사출 전산화 단층촬영술), (iv) PET(양전자 사출 단층촬영술)[Chen et ai (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49], (v) 생체발광, (vi) 형광, 및 (vii) 초음파에 의한 영상화 생물마커 및 프로브로서 유용하다.
한편, 본 발명은 전술한 인간 면역글로불린 항체 및 이와 접합된 플레이트 또는 자석 비드(magnetic bead)를 포함하는, 표적 단백질을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 시스테인 조작된 항체는 진단을 위한 단백질의 정량 및 정성적 측정시, 표적에 대한 인지 성능은 유지하면서 자석 비드 또는 플레이트 등에 부위 특이적으로 접합할 수 있어 기존의 무작위적인 접합방법과 달리 백그라운드 신호를 낮추고 진단용 항체의 표적 단백질의 인지에 대한 감도 증가에 기여할 수 있으며, 진단용 항체로서의 비특이적인 반응에 의한 위양성 및 위음성 반응을 제어할 수 있다.
도 1에서 보는 바와 같이, 종래의 인간 면역글로불린 항체는 면역 진단을 위한 플레이트, 자석 비드 또는 형광 단백질에 무작위적으로 접합되는데, 반해, 본 발명에 따른 인간 면역글로불린 항체는 치환된 시스테인의 자유 티올기를 통해 플레이트 또는 자석 비드에 부위 특이적으로 접합될 수 있는바(도 2 참조), 본 발명에 따른 인간 면역글로불린 항체를 포함하는 키트는 면역 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 파아지 디스플레이를 이용한 시스테인 조작된 항체의 라이브러리 제작
인간 면역글로불린1(IgG1) 항체의 카파 불변 영역(Uniprot ID:P01834)에서 시스테인으로 치환가능한 아미노산 서열을 선정하기 위해, 서울대학교 의과대학으로부터 입수한 인간 IgG1 항체의 카파 불변 영역(파아지 디스플레이된 카파 불변 영역; pComb3XSS 벡터로부터 카파 불변 영역을 확보한 후 문헌[phage display, A laboratory manual, Carlos F. Barbas III, Cold spring Harbor Laboratory Press]에 기재된 대로 파아지 디스플레이됨)의 구조를 분석한 후, 구조상 베타-가닥을 제외한 부분, 즉 나선 구조를 띠면서 가변 영역에 가까운 부분의 서열 중 RSA 스코어가 높은 아미노산 서열을 선정하였다. 상기 아미노산 위치로서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 103, 104, 105 및 106번째 아미노산 위치를 선정하였다.
상기 선정된 아미노산을 각각 20종의 아미노산으로 치환하였을 때의 항체 성능을 확인하기 위해, 각 아미노산 부위를 코딩하는 유전자가 NNK 뉴클레오타이드 서열(N은 임의의 뉴클레오타이드이고, K는 G 또는 T임)로 치환된 약 500bp의 카파 불변영역 유전자를 gBlocks® Gene Fragments (IDT corp.)를 통해 합성하였다. 상기 합성된 유전자들은 NNK 서열로 인해 20개의 아미노산이 모두 발현될 수 있는 염기서열을 갖는 유전자를 포함하고 있다.
상기 합성된 유전자 50ng을 50μL PCR 반응에서 서열번호 2 및 3의 정방향 및 역방향 프라이머 30pmol을 이용하여 94℃에서 5분 후, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분간 총 25 사이클을 수행하여 증폭하였다. 상기 증폭된 유전자 내에 포함된 HindIII 및 XhoI 제한효소 부위를 이용하여 상기 유전자를 아트라진 Fab 형태의 발현이 가능한 파아지미드 벡터(phagmid vector; 문헌[Phage display, A laboratory manual, Carlos F. Barbas III, Cold spring Harbor Laboratory Press] 참조; 서울대학교에서 입수)에 삽입하였다. 상기 파아지미드 벡터의 백본(backbone)은 pComb3XSS 벡터를 이용하였다. 상기 파아지미드 벡터를 파아지 생성이 가능한 ER2537 컴피턴트 세포에 형질전환하여 라이브러리를 각각 제작하였다.
실시예 2: ELISA 를 이용한 항원에 대한 인지능이 우수한 항체의 선별
실시예 1에서 제작된 각각의 라이브러리에서 생성되는 Fab 항체를 대상으로 항원으로서 아트라진을 이용하여 ELISA에 의해 항원에 대한 인지능이 우수한 항체를 선별하였다.
구체적으로, 항원으로서 아트라진이 코팅되지 않은 ELISA 웰을 BSA가 함유된 PBS 용액(100 mL PBS 당 3g BSA)과 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 블로킹시켰다. 또한, 항원으로서 아트라진이 250 ng씩 코팅된 ELISA 웰을, 파아지 디스플레이된 Fab 항체의 유전자를 함유하고 있는 대장균(E. coli)과 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 발현되는 항체의 HA 태그를 인지하는 HA 항체(Bethyl lab. Inc.)와 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, ABTS 용액(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산; Invitrogen. Inc.)을 이용하여 아트라진과의 반응성을 측정하였다. 이 중, 항원인 아트라진에 반응성을 유지하는 항체들을 선별한 후 서열번호 4의 시퀀싱 프라이머를 이용하여 항체의 카파 불변영역의 염기서열을 분석하였다. 상기 분석된 염기서열로부터 아미노산 서열을 얻은 후, 수득된 아미노산 서열에서 NNK 영역에서 변형된 아미노산을 종류별로 분석된 횟수를 표시하고, 이 중 시스테인으로 변형시에도 아트라진과의 반응성이 유지되는 영역을 선별하였다. 각 라이브러리 당 스크리닝된 93개의 항체 유전자 중 아트라진에 대해 반응성을 보이는 항체의 수(positive rate(%))를 계산하고, 분석된 아트라진 반응 항체 중 원래의 아트라진에 대한 모 클론(mother clone)과 동일한 서열분석 결과가 나온 항체의 비율(mother clone(%))을 계산하였고, RSA 스코어는 NetSuefP 프로그램을 이용하여 분석하였다(www.cbs.dtu.dk).
상기 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112014103564547-pat00001
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 카파 불변 영역에서 15번째, 16번째, 17번째, 45번째 또는 47번째 위치의 아미노산이 시스테인으로 치환된 항체들(E15C, Q16C, L17C, A45C, Q47C)이 항원(아트라진)에 대한 인지능의 변화를 나타내지 않았다.
상기 결과를 바탕으로, 15번째, 16번째, 17번째, 45번째 또는 47번째 위치의 아미노산이 치환된 항체를 선별하여, 이후 실험에 사용하였다.
실시예 3: 치환된 시스테인과 바로 인접한 N- 말단쪽 또는 C- 말단쪽 중 어느 하나의 위치의 아미노산이 아스파트산 또는 글루탐산으로 추가로 치환된 항체의 제조
실시예 2에서 제조된 항체에서, 치환된 시스테인과 바로 인접한 N-말단쪽 또는 C-말단쪽 중 어느 하나의 위치의 아미노산이 음전하를 띠는 아미노산, 즉 아스파트산 또는 글루탐산으로 추가로 치환된 항체를 제조하였다.
구체적으로, 치환된 시스테인과 인접한 N-말단쪽 또는 C-말단쪽 중 어느 하나의 위치의 아미노산이 아스파트산 또는 글루탐산인 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 바이오니어사(Bioneer)에 의뢰하여 합성하였다.
상기 합성된 유전자 50ng을 50μL PCR 반응에서 서열번호 2 및 3의 정방향 및 역방향 프라이머 30pmol을 이용하여 94℃에서 5분 후, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분간 총 25 사이클을 수행하여 증폭하였다. 상기 증폭된 유전자 내에 포함된 HindIII 및 XhoI 제한효소 부위를 이용하여 상기 유전자를 아트라진 Fab 형태의 발현이 가능한 파아지미드 벡터(phagmid vector; 문헌[Phage display, A laboratory manual, Carlos F. Barbas III, Cold spring Harbor Laboratory Press] 참조; 서울대학교에서 입수)에 삽입하였다. 상기 파아지미드 벡터의 백본(backbone)은 pComb3XSS 벡터를 이용하였다.
상기 제조된 항체의 카파 불변 영역의 서열을 분석한 결과, 첫 번째 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산이 시스테인으로 치환되고, 16번째 위치의 글루타민이 아스파트산으로 치환되어 있었고(E15C/Q16D), 두 번째 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산이 시스테인으로 치환되고, 16번째 위치의 글루타민이 글루탐산으로 치환되어 있었으며(E15C/Q16E), 세 번째 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 아스파트산으로 치환되어 있었고(Q16C/L17D), 네 번째 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 아스파트산으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환되어 있었으며(Q16D/L17C), 다섯 번째 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 글루탐산으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환되어 있었고(Q16E/L17C), 여섯 번째 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환되고, 18번째 위치의 라이신이 아스파트산으로 치환되어 있었으며(L17C/K18D), 일곱 번째 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 47번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, 48번째 위치의 세린이 아스파트산으로 치환되어 있었다(Q47C/S48D).
실험예 1: 항체의 접합능 측정
실시예 2에서 제조된 5종의 항체(E15C, Q16C, L17C, A45C, Q47C) 및 실시예 3에서 제조된 7종의 항체(E15C/Q16D, E15C/Q16E, Q16C/L17D, Q16D/L17C, Q16E/L17C, L17C/K18D, Q47C/S48D)의 면역접합체로서의 접합능을 확인하기 위해, 상기 항체를 인간 IgG1 형태로 발현시킨 후, 이를 아트라진이 코팅된 ELISA 플레이트와 반응시켜 ELISA에 의해 접합능을 측정하였다. 비교를 위해, 45번째 위치의 알라닌이 시스테인으로 치환된 종래 공지된 항체(A45C; 미국등록특허 제7,855,275호 참조) 및 조작되지 않은(야생형(wild-type)) 항체를 대조군으로 사용하였다. 각 웰을 아트라진 및 BSA 단백질 250ng씩 코팅한 후, BSA 단백질이 함유된 PBS 용액(100 mL PBS 용액 당 3g BSA)으로 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 코팅되지 않은 웰을 블로킹하였다. 아트라진이 코팅된 웰에 선별된 항체를 농도별로 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 발현되는 항체의 IgG의 Fc 영역을 인지하는 항체(Thermo Scientific Inc.)와 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 ABTS 용액(Invitrogen. Inc.)을 이용하여 신호를 측정하였다.
상기 ELISA 분석 결과를 하기 표 2, 3 및 도 4에 나타내었다.
실시예 2의 항체의 접합능
E15C L17C Q47C A45C 야생형 항체
항체 10nM to BSA 단백질 0.15 0.248 0.172 0.154 0.185
항체 1nM 0.2705 0.349 1.207 0.658 1.2325
항체 5nM 1.5335 1.2305 2.3175 1.9075 2.361
항체 10nM 2.3775 2.05 2.8875 2.675 2.513
실시예 3의 항체의 접합능
E15C/Q16D E15C/Q16E Q16C/L17D Q16D/L17C Q16E/L17C L17C/K18D Q47C/S48D
항체 10nM to BSA 단백질 0.14 0.142 0.147 0.134 0.136 0.156 0.183
항체 1nM 0.312 0.3675 0.289 0.377 0.44 0.419 1.2675
항체 5nM 1.4585 1.529 0.9485 1.397 1.4915 1.3635 2.4585
항체 10nM 2.4525 2.5215 1.915 2.139 2.3545 2.1805 2.535
상기 표 2, 표 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 실시예 2 및 3에서 제조된 시스테인 조작된 항체들은 시스테인 치환 및 추가적인 음전하를 띠는 아미노산으로의 치환에도 불구하고 항체 고유의 접합능이 유지되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 항체들은 항체 고유의 접합능을 유지하면서 시스테인 치환에 의해 부위특이적인 접합이 가능하므로, 항체를 이용한 면역진단시 표적을 효율적으로 인지할 수 있으며, 백그라운드 신호를 줄일 수 있다.
<110> SK Telecom Co. Ltd. <120> Cysteine-engineered antibody <130> FPD201409-0032 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PCR <400> 2 gaggaggacg aagctgtcta ctactgtggt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PCR <400> 3 gaggagggac tcgtccaacg tcacggcctc 30 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer <400> 4 aagacagcta tcgcgattgc ag 22

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하며, 항체의 접합능을 유지하면서 부위특이적인 접합이 가능한, 인간 면역글로불린 항체.
  2. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산, 16번째 위치의 글루타민, 17번째 위치의 류신 또는 47번째 위치의 글루타민 중 어느 하나의 아미노산이 시스테인으로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하며, 항체의 접합능을 유지하면서 부위특이적인 접합이 가능한, Fab, F(ab'), 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 면역글로불린 항체의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 면역글로불린 G(IgG)인 것을 특징으로 하는, 인간 면역글로불린 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 상기 치환된 시스테인과 바로 인접한 N-말단쪽 또는 C-말단쪽 중 어느 하나의 위치의 아미노산이 아스파트산 또는 글루탐산으로 추가로 치환된 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 면역글로불린 항체.
  5. 제4항에 있어서, 하기의 특징을 갖는 경쇄의 카파 불변 영역을 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 면역글로불린 항체:
    (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산이 시스테인으로 치환되고, 16번째 위치의 글루타민이 아스파트산으로 치환;
    (b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 15번째 위치의 글루탐산이 시스테인으로 치환되고, 16번째 위치의 글루타민이 글루탐산으로 치환;
    (c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 아스파트산으로 치환;
    (d) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 아스파트산으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환;
    (e) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 16번째 위치의 글루타민이 글루탐산으로 치환되고, 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환;
    (f) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 17번째 위치의 류신이 시스테인으로 치환되고, 18번째 위치의 라이신이 아스파트산으로 치환; 및
    (g) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 47번째 위치의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, 48번째 위치의 세린이 아스파트산으로 치환.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체가 경쇄의 카파 불변 영역에 자유 티올기(free thiol group)를 갖는 것을 특징으로 하는, 인간 면역글로불린 항체.
  7. 제1항에 따른 인간 면역글로불린 항체; 및 세포독성제(cytotoxic agent), 화학치료제(chemotherapeutic agent), 독소, 방사성핵종(radionuclide), DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid), 비천연 아미노산, 펩타이드, 효소, 형광성 태그(fluorescent tag), 바이오틴 및 말레이마이드(maleimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질이 접합된, 면역접합체(conjugate).
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포독성제가 항-튜불린제, DNA 좁은 홈(minor groove) 결합제, 항-매이탄시노이드(anti-maytansinoid) 및 아우리스타틴(auristatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 화학치료제가 탁솔, 파클리탁셀, 독소루비신, 메토트렉세이트, 돌라스타틴, 빈카 알칼로이드 및 두오카르마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  10. 제7항에 있어서, 상기 독소가 아비린(abirin), 브루신(brucine), 시쿠톡신(cicutoxin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 보툴리즘 독소(botulism toxin), 쉬가 독소(shiga toxin), 엔도톡신, 테타누스 독소(tetanus toxin), 퍼투시스 독소(pertussis toxin), 안트락스 독소(anthrax toxin), 콜레라 독소, 팔카리놀(falcarinol), 알파 독소(alfa toxin), 젤다마이신(geldamycin), 젤로닌(gelonin), 로타우스트랄린(lotaustralin), 리신(ricin), 스트리키닌(strychinine) 및 테트라도톡신(tetradotoxin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  11. 제7항에 있어서, 상기 방사성핵종이 크롬(51Cr), 코발트(57Co), 플루오르(18F), 가도릴늄(153Gd, 159Gd), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 류테리움(177Lu), 망간(54Mn), 몰디브데늄(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라스코디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 류테뮴(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 트리튬(3H), 제논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y) 및 아연(55Zn)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  12. 제1항에 따른 인간 면역글로불린 항체, 또는 제2항에 따른 인간 면역글로불린 항체의 항원 결합 단편; 및 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편과 접합된 플레이트 또는 자석 비드(magnetic bead)를 포함하며,
    상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편의 치환된 시스테인에서 부위 특이적으로 플레이트 또는 자석 비드에 접합하는 것인, 표적 단백질을 검출하기 위한 키트.
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