CN108351361A - 用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法 - Google Patents

用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法 Download PDF

Info

Publication number
CN108351361A
CN108351361A CN201680067452.9A CN201680067452A CN108351361A CN 108351361 A CN108351361 A CN 108351361A CN 201680067452 A CN201680067452 A CN 201680067452A CN 108351361 A CN108351361 A CN 108351361A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
antigen
immobilization
areas
detectable label
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201680067452.9A
Other languages
English (en)
Inventor
K-G·施图本拉赫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN108351361A publication Critical patent/CN108351361A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文报道了用于测定从非人实验动物获得的血清或血浆样品中二价抗体的量的方法，其中与具有SEQ ID NO:01,02,或03的序列的相应的野生型Fc区相比，该二价抗体在Fc区中包含一个或多个突变，其中所述方法包括以下步骤：a)将被所述抗体的多于一个拷贝的抗原共价缀合的非抗体多肽固定在固体表面上，b)将固定化的抗原与所述样品温育以形成固定化的抗原‑抗体复合物，c)将固定化的抗原‑抗体复合物与缀合至可检测标记的抗原一起温育以形成固定化的三元复合物，和d)通过确定固定化的三元复合物中可检测标记的量来确定抗体的量。

Description

用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法
本发明属于免疫测定领域。本文报道了使用系列ELISA测定血清样品中Fc区修饰的抗体的通用方法。
发明背景
为了改善和优化治疗性抗体的药物动力学参数以及效应功能，将分子结构的修饰引入亲本治疗性抗体以产生变体抗体。修饰不限于抗原识别结构域，而且还涉及Fc-区。
为了检测和评估Fc-区修饰的抗体变体，已经发现基于非生物活性抗体的模型系统。非生物活性抗体与实验动物中不存在的抗原结合,在所述实验动物中进行抗体的Fc区修饰的评估。检测的先决条件是所使用的非生物活性抗体不与实验动物的内源性蛋白质以及与测定系统的其他组分交叉反应。这可以例如通过使用结合人工抗原的抗体，例如抗半抗原抗体，例如抗洋地黄毒苷抗体实现。
为了评估药代动力学性质以及修饰概念的证据，需要具有合适灵敏度和特异性的检测方法。此外，检测方法应能够检测具有不同物种特异性Fc区，例如，人，食蟹猴，绵羊或小型猪Fc区，但不与实验动物的内源性免疫球蛋白相互作用的抗体。
在JP H01-223351中，报道了具有高特异性的抗体的测定，而不管用于生产包含固定化和标记的抗原的待测定抗体的动物的类型等的差异。
在WO 96/22533中报道了用于将半抗原固定在测试物品上的方法。
发明概述
如本文报道的方法特别适用于在Fc-区中包含一个或多个突变的抗体，其影响通常用于通用检测方法中的抗-Fc-区抗体的结合。
解决当前技术问题的ELISA的基本要求是分析物抗体必须以通用测定形式检测，而不依赖于Fc区修饰。这也应该适用于样品基质。测定应该尽可能的灵敏，以便允许测定低浓度的抗体样品。
已经发现使用非治疗性抗体作为替代物来评估与Fc-区变异相关的体内药代动力学性质允许非干扰性测定法建立。替代抗体具有针对非内源性靶标的结合特异性。在检测测定中使用非内源结合特异性来与捕获试剂和检测试剂相互作用。
因此，本文报道了用于体外测定从非人实验动物获得的血清样品中Fc-区修饰的抗体的量的顺序桥接ELISA。
利用本文所报道的测定设置(本文所报道的方法基于该测定设置)，可能
-确定没有与(实验动物的)其他血清/血浆组分交叉反应性的Fc-区修饰的抗体的量，即该测定具有高特异性，
-Fc-区修饰的抗体的通常确定量，即该方法可独立于Fc-区和实验动物的种类应用；这对于分析物以及样品基质都是有效的；这允许在任何实验动物基质中检测包含不同种类特异性Fc区的抗体Fc区变体，
-确定并确认Fc区修饰抗体的结构完整性以及Fc区修饰抗体的二价性，
-以高灵敏度并在至多100ng/mL的检测下限下测定Fc区修饰的抗体的量，
-使用标准化材料执行该方法。
本文报道的方法中使用的抗体是特异性结合非内源性靶标的替代抗体。这确保体内没有抗体发挥生物学效应，并且纯粹评估与Fc区突变/变异相关的药代动力学性质。
在一个实施方案中，本文报道的方法中使用的替代抗体结合半抗原。通常在生物分析测定例如ELISA中使用半抗原和抗半抗原抗体。
本文报道的一个方面是用于测定从非人实验动物获得的血清或血浆样品中二价抗体的量的方法，其中与相应的具有SEQ ID NO：01,02或03的序列的野生型Fc区相比，所述抗体包含Fc区中的一个或多个突变，其中所述方法包括按以下顺序的以下步骤：
a)将非抗体多肽固定化在固体表面上，所述抗体的多于一个拷贝的抗原共价缀合到所述非抗体多肽，
b)将固定化的抗原与样品温育以形成固定化的抗原-抗体复合物，
c)将固定化的抗原-抗体复合物与缀合至可检测标记的抗原一起温育以形成固定化的三元复合物，
d)通过确定固定化的三元复合物中可检测标记的量来确定抗体的量。
在一个实施方案中，二价抗体是二价抗半抗原抗体。
在一个实施方案中，二价抗半抗原抗体是二价抗洋地黄毒苷抗体。
本文报道的一个方面是用于确定从非人实验动物获得的血清或血浆样品中二价抗洋地黄毒苷抗体的量的方法，其中与相应的具有SEQ ID NO：01,02或03的序列的野生型Fc区相比，所述抗体包含Fc区中的一个或多个突变，其中所述方法包括按以下顺序的以下步骤：
a)将非抗体多肽固定在固体表面上，多于一个洋地黄毒苷分子共价缀合到所述非抗体多肽，
b)温育多于一个洋地黄毒苷分子共价缀合在其上的固定化的非抗体多肽与样品以形成固定化的抗原-抗体复合物，
c)将固定化的抗原-抗体复合物与缀合于可检测标记的洋地黄毒苷温育以形成固定化的三元复合物，
d)通过确定固定化三元复合物中可检测标记的量来确定抗体的量。
在一个实施方案中，非抗体蛋白质是血清蛋白质。在一个实施方案中，非抗体多肽是牛血浆白蛋白。
在一个实施方案中，抗体的一个或多个拷贝的抗原与非抗体多肽化学缀合。
在固定步骤的一个实施方案中，非抗体多肽的浓度为约50ng/mL。
在一个实施方案中，抗原通过特异性结合对与可检测标记缀合。在一个实施方案中，特异性结合对(第一组分/第二组分)选自链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素或抗体/抗原(参见例如Hermanson,G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques,AcademicPress,1996)或凝集素/多糖或类固醇/类固醇结合蛋白或激素/激素受体或酶/底物或IgG/蛋白A和/或G。
在一个实施方案中，可检测标记是酶。在一个实施方案中，可检测标记是过氧化物酶。在一个实施方案中，可检测标记是辣根过氧化物酶。在一个实施方案中，可检测标记的浓度是约300mU/mL。
在一个实施方案中，通过将固定化的三元复合物与3,3‘,5,5‘-四甲基联苯胺温育来进行测定。
如本文报道的一个方面是本文报道的方法(用途)用于测定具有突变的Fc区的抗体的药代动力学性质(体内半衰期)，与SEQ ID NO：01,02或03的野生型Fc区相比较，所述突变降低与Fc-受体(Fcγ受体，FcRn)的结合，其中本文报道的方法在将所述抗体施用于非人实验动物(食蟹猴，小鼠，大鼠，兔，小型猪，豚鼠)后至少两个不同时间点进行，并且其中从所述结果(在施用后至少两个时间点所述抗体的血浆/血清样品浓度)确定所述Fc区/抗体的体内半寿期。
在一个实施方案中，至少两个不同的时间点是2,3,4,5,6,7,8,9或10个时间点。在一个优选实施方案中，至少两个不同的时间点是5到10个时间点。在一个实施例中，时间点相隔0.5至300小时。在一个实施方案中，时间点选自0.5h，6h，12h，24h，48h，72h，168h，336h，504h和672h。
发明详述
桥接测定的两个主要原理是本领域技术人员已知的，其在下文中使用半抗原洋地黄毒苷和抗洋地黄毒苷抗体作为非内源靶标和非内源靶标结合抗体的例子。
1)使用抗独特型抗体和地高辛化抗体作为检测试剂进行捕获
在这种形式中，地高辛化抗体被用作主要检测试剂。但是这会导致干扰：抗洋地黄毒苷抗体作为分析物本身也会与检测试剂的洋地黄毒苷相互作用，从而阻止分析物的最终检测。
2)使用抗Fc区抗体进行捕获
在这种形式下，分析物被缀合到固相的抗Fc区抗体捕获。同样在这种形式下，分析物将与检测抗体的洋地黄毒苷标记竞争，导致信号猝灭。进一步采用这种形式，不能获得分析物功能完整性的证据。此外，这种形式不是物种独立的，因为一方面捕获抗体是物种特异性的，另一方面捕获抗体会与实验动物的内源性抗体交叉反应。此外，由于Fc区修饰可能导致捕获抗体结合的丧失，所以该测定法通常不适用于检测Fc-区修饰的抗体变体。
I.定义
术语“约”表示之后的下一个值不是精确值，而是范围的中心点，该范围是该值的+/-10％或该值的+/-5％或该值的+/-2％，或该值的+/-1％。如果该值是以百分比给出的相对值，则术语“约”还表示其后的下一个值不是精确的值，而是范围的中心点，该范围是该值的+/-10％或该值的+/-5％或该值的+/-2％，或该值的+/-1％，其中范围的上限不能超过100％的值。
术语“抗体”是指由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。抗体可以以多种形式存在，包括例如Fv，Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体(例如Huston,J.S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Bird,R.E.,et al.,Science242(1988)423-426；一般来说，Hood et al.,Immunology,Benjamin N.Y.,2nd edition(1984)；和Hunkapiller,T.and Hood,L.,Nature 323(1986)15-16)。
通常抗体包含两条所谓的轻链多肽(轻链)和两条所谓的重链多肽(重链)。每个重链和轻链多肽含有包含能够与抗原相互作用的结合区的可变结构域(可变区)(通常为多肽链的氨基末端部分)。每条重链和轻链多肽包含恒定区(通常为羧基末端部分)。重链恒定区介导抗体i)与带有Fcγ受体(FcγR)的细胞如吞噬细胞的结合，或ii)与带有也称为Brambell受体的新生儿Fc受体(FcRn)的细胞的结合。它也介导了对一些因子的结合，所述因子包括经典补体系统的因子，如组分(C1q)。
抗体轻链或重链的可变结构域又包含不同的区段，即四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。
根据本发明的术语“药物抗体”表示可以施用于个体以治疗疾病的抗体。在根据本发明进行的一个测定中，药物抗体和捕获抗体或药物抗体和示踪抗体分别包含“相同的”抗体分子，例如，用相同的表达载体重组产生并包含相同的氨基酸序列的抗体分子。药物抗体(治疗性单克隆抗体)被广泛用于治疗各种疾病，例如肿瘤疾病(例如血液和实体恶性肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤，乳腺癌和结直肠癌)，免疫性疾病，中枢神经疾病，血管疾病，或传染病。这样的抗体例如由Levene,A.P.,et al.,Journal of the Royal Society ofMedicine 98(2005)145-152描述。这样的抗体是例如抗CD20,CD22,HLA-DR,CD33,CD52,EGFR,G250,GD3,HER2,PSMA,CD56,VEGF,VEGF2,CEA，Levis Y抗原，IL-6受体或IGF-1受体的抗体。治疗性抗体也由Groner,B.,et al.,Curr.Mol.Meth.4(2004)539-547；Harris,M.,Lancet Oncol.5(2004)292-302描述。
如本文所用，术语“单克隆免疫球蛋白”是指从基本上均质的免疫球蛋白群体获得的免疫球蛋白，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，该群体包含的各免疫球蛋白是相同的。单克隆免疫球蛋白是高度特异性的，针对单个抗原性位点。此外，与包含针对不同抗原位点(决定簇或表位)的不同免疫球蛋白的多克隆免疫球蛋白制剂相反，每个单克隆免疫球蛋白针对抗原上的单个抗原位点。除了它们的特异性之外，单克隆免疫球蛋白的优点在于它们可以不被其他免疫球蛋白污染而合成。修饰语“单克隆”表示免疫球蛋白的特征是从基本上均质的免疫球蛋白群体获得的，不应被解释为需要通过任何特定方法产生免疫球蛋白。
术语“治疗性抗体”涉及旨在用于人的任何抗体制剂。优选地，这种治疗性抗体将是单克隆抗体。进一步优选的这种单克隆抗体将从大猿获得或者是人单克隆抗体或人源化抗体。优选地，它将是人单克隆抗体。还优选这种治疗性单克隆抗体是人源化单克隆抗体。
术语“靶抗原”涉及被其相应的治疗性抗体结合的生物分子。举例来说，针对HER2(＝ErbB2或p185neu)的治疗性抗体如或的靶抗原是HER2，针对CD52的治疗性抗体如的靶抗原是CD52，针对EGFR的治疗性抗体，如的靶抗原是EGFR，针对CD33的治疗性抗体如的靶抗原是CD33，针对Tag-72的治疗性抗体如的靶抗原是Tag-72，针对17-1A的治疗性抗体如的靶抗原是17-1A，针对CD20的治疗性抗体如或的靶抗原是CD20，针对CD25的治疗性抗体如的靶抗原是CD25。靶抗原可以是可溶的，即分泌或脱落的靶抗原或细胞膜结合的靶抗原。
本申请中使用的术语“缓冲的”表示溶液，其中通过缓冲物质使得由于酸性或碱性物质的添加或释放引起的pH变化是平缓的。任何导致这种效应的缓冲物质都可以使用。
优选使用药学上可接受的缓冲物质，例如，磷酸或其盐，乙酸或其盐，柠檬酸或其盐，吗啉，2-(N-吗啉代)乙磺酸或其盐，组氨酸或其盐，甘氨酸或其盐，或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。特别优选的是磷酸或其盐，或乙酸或其盐，或柠檬酸或其盐，或组氨酸或其盐。任选地，缓冲液可以包含另外的盐，例如，氯化钠，硫酸钠，氯化钾，硫酸钾，柠檬酸钠或柠檬酸钾。
示踪剂/或捕获抗体与其缀合配偶体的缀合可以通过不同的方法进行，例如被动吸附，化学结合或通过特异性结合对进行的结合。这里使用的术语“缀合配偶体”表示例如固相支持体，多肽，可检测标记，特异性结合对的成员。在一个实施方案中，捕获和/或示踪抗体与其缀合配偶体的缀合通过化学结合经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，抗体的氨基酸骨架的羧基-，巯基-，羟基和/或酚官能团，和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基团进行。在一个实施方案中，捕获和/或示踪抗体通过特异性结合对与其缀合配偶体缀合。捕获抗体优选与生物素缀合，并且通过固相支持体固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白进行固定至固相支持体。优选示踪抗体与洋地黄毒苷缀合并且通过针对洋地黄毒苷的抗体连接至可检测标记。捕获抗体在另一个实施方案中通过被动吸附与固相支持体缀合。通过被动吸附与固相支持体缀合的抗体包含通过不同抗体位点与固相支持体缀合的抗体的混合物。因此，与固相支持体缀合的捕获抗体是两种或更多种不同缀合物的混合物，其中缀合物在抗体位点(即抗体残基)不同，与固相支持体的缀合使用所述抗体残基实现。被动吸附例如由Butler，J.E.在“Solid Phases in Immunoassay”,page 205-225；Diamandis,E.P.and Christopoulos,T.K.(Editors):Immunoassays(1996)AcademicPress San Diego中描述。
显色剂(荧光或发光基团和染料)，酶，NMR活性基团或金属颗粒，半抗原，例如洋地黄毒苷是“可检测标记”的例子。可检测标记也可以是可光活化的交联基团，例如，叠氮基或氮杂环丙烯基团。可以通过电化学发光检测的金属螯合物也是优选的信号发射基团，特别优选钌螯合物，例如钌(双吡啶基)32+螯合物。合适的钌标记基团描述于例如EP 0580979，WO90/05301，WO 90/11511和WO 92/14138中。对于直接检测，标记基团可以选自任何已知的可检测标记基团，如染料，发光标记基团如化学发光基团，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷，或荧光染料，例如荧光素，香豆素，罗丹明，嗪，试卤灵，花青苷及其衍生物。标记基团的其他实例是发光金属络合物，例如钌或铕络合物，酶，例如用于ELISA或用于CEDIA(ClonedEnzyme Donor Immunoassay，例如EP-A-0061888)的酶，和放射性同位素。
间接检测系统包括例如检测试剂，例如检测抗体用bioaffine结合对的第一个配偶体标记。合适的结合对的实例是半抗原或抗原/抗体，生物素或生物素类似物如氨基生物素，亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，糖/凝集素，核酸或核酸类似物/互补核酸以及受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。优选的第一结合对成员包含半抗原，抗原和激素。特别优选的是半抗原如地高辛和生物素及其类似物。这种结合对的第二个配偶体，例如抗体，链霉抗生物素蛋白等通常被标记以允许直接检测，例如通过如上所述的标记进行标记。
抗体的“Fc区”不直接参与抗体抗原的结合，但表现出各种效应功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，将抗体(免疫球蛋白)分为以下类别：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。其中一些类别进一步分为亚类(同种型)，即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4中的IgG，或IgA1和IgA2中的IgA。根据抗体所属的免疫球蛋白类别，免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α(IgA)，δ(IgD)，ε(IgE)，γ(IgG)和μ(IgM)。本文报道的方法中使用的抗体优选属于IgG类别。“抗体的Fc区”是本领域技术人员熟知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶切割进行定义。本文报道的方法中的抗体含有人Fc区或来源于人源的Fc区作为Fc区。在另一个实施方案中，Fc-区是亚类IgG4的人抗体的Fc-区或亚类IgG1，IgG2或IgG3的人抗体的Fc-区。Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(缺失Fc-区碳水化合物)，Pro329，Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Ile253，Ser254，Lys288，Thr307，Gln311，Asn434或/和His435是如果改变则提供降低的Fcγ受体结合的残基(Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,et al.,FASEBJ.9(1995)115-119；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434)。可以在本文报道的方法中使用的示例性抗体是关于IgG4亚类或IgG1或IgG2亚类的Fcγ受体结合，其在L234，L235和/或D265中具有突变，和/或含有PVA236突变，具有突变S228P，L234A，L235A，L235E和/或PVA236(PVA236意指来自IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸代码给出)或IgG4的ELLG被PVA代替)，具有IgG4的突变S228P和IgG1的L234A和L235A。抗体的Fc区直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。不结合Fcγ受体和/或补体因子C1q的抗体不引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
如本文所用，术语“源自人源的Fc区”是指Fc区，其是亚类IgG4的人抗体的Fc区或亚类IgG1,IgG2，或IgG3的人抗体的Fc区，包括其突变形式。“抗体的Fc区”是本领域技术人员熟知的并基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义的术语。
本申请中使用的术语“接头”或“肽接头”表示天然和/或合成来源的肽接头。它们由线性氨基酸链组成，其中20种天然存在的氨基酸是单体构件。该链具有1至50个氨基酸的长度，优选1至28个氨基酸，特别优选3至25个氨基酸。接头可含有重复的氨基酸序列或天然存在的多肽的序列，例如具有铰链功能的多肽。接头具有确保缀合至抗CD4抗体的肽可以通过使肽正确折叠并适当呈现而发挥其生物学活性的功能。优选地，接头是指定为富含甘氨酸，谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成肽接头”。这些残基排列在例如在诸如GGGS(SEQ IDNO:04),GGGGS(SEQ ID NO:05),QQQQG(SEQ ID NO:06),或SSSSG(SEQ ID NO:07)的至多五个氨基酸的小重复单元中。这个小的重复单元可以重复两到五次以形成多聚单元。在多聚体单元的氨基和/或羧基末端多达六个额外的任意天然存在的氨基酸可以被添加。其他合成的肽接头由单个氨基酸组成，其重复10至20次，并且可以在氨基和/或羧基末端包含至多6个另外的任意天然存在的氨基酸，例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO:08)中的丝氨酸。所有的肽接头都可以由核酸分子编码，因此可以重组表达。由于接头本身是肽，抗融合肽通过两个氨基酸之间形成的肽键与接头连接。
本领域技术人员已知的可用于实施本发明的方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I to III(1997),Wileyand Sons；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生还是合成产生。小于约20个氨基酸残基的多肽可以被称为“肽”，而由两个或更多个多肽组成或包含一个多于100个氨基酸残基的多肽的分子可以被称为“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，例如碳水化合物基团，金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由表达多肽的细胞添加，并且可以随着细胞类型而变化。本文根据它们的氨基酸骨架结构或编码它们的核酸来定义多肽。添加如糖类基团通常没有指定，但仍然可以存在。
术语“样品”包括但不限于来自生物或以前生物的任何数量的物质。这样的生物包括但不限于人类，小鼠，猴子，大鼠，兔子和其他动物。在一个实施方案中，样品获自猴，特别是食蟹猴，或兔，或小鼠或大鼠。这样的物质包括但不限于在一个实施方案中来自个体的全血，血清或血浆，其是临床常规中最广泛使用的样品来源。
“固相”表示非流体物质，并且包括由材料制成的颗粒(包括微粒和珠)，所述材料为诸如聚合物，金属(顺磁性，铁磁性颗粒)，玻璃和陶瓷；凝胶物质如二氧化硅，氧化铝和聚合物凝胶；毛细管，其可以由聚合物，金属，玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；和比色皿，试管或其他光谱仪样品容器。测定的固相组分与测定可以接触的惰性固体表面的区别在于“固相支持体”在其表面上含有至少一个意欲与分子化学相互作用的部分。固相可以是固定组分，例如芯片，管，条，比色杯或微量滴定板，或者可以是非固定组分，例如珠子和微粒。微粒也可以用作均相测定形式的固相支持体。可以使用允许蛋白质和其他物质的非共价或共价连接的各种微粒。这种颗粒包括聚合物颗粒如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒如金纳米颗粒和金胶体；和陶瓷颗粒如二氧化硅，玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如Martin,C.R.,et al.,Analytical Chemistry-News&Features,May 1(1998)322A-327A，其通过引用并入本文。固相可以任选被完全包被或在某些区域被包被。在材料的表面上存在可见或在坐标中的任何点或区域的阵列。分别在每个点或区域上，可以固定具有或不具有材料表面的接头或间隔基的多肽。优选地，固定化的多肽是能够结合IgG的Fc区的根据本发明的受体。现有技术中广泛描述了根据本发明的免疫测定的固相(参见例如Butler，J.E.，Methods 22(2000)4-23)。
在本申请中可互换使用的术语“标准品”或“标准物质”表示分析方法的参考点，并且用于建立一个值，用于比较同一分析方法的其他结果。如本文所用，术语“阳性对照”表示标准物质，如果在分析方法中使用该标准物质，则将获得高于所定义的截断值或阈值的响应。截断值通常是在不含抗药物抗体的样品的分析中获得的平均值加上这些值的两倍，优选三倍标准差。
II.如本文报告的方法
现在已经发现，用本文报道的方法，测定从非人实验动物获得的血清或血浆样品中Fc-区修饰的抗体的量的现有技术方法的缺点可以被规避以及可以满足检测方法的所有需要的特异性。
已经发现使用基于非抗体的捕获和检测试剂是有利的。
已经发现，通过使用生物素化的RPLA-洋地黄毒苷缀合物，可以获得改善的信噪比例如，32.8，相比，直接生物素化洋地黄毒苷为9.5。基于RPLA的捕获试剂包含多于一个的生物素以及导致信号增加的洋地黄毒苷分子。使用双衍生的RPLA(例如生物素化和地高辛化的)，RPLA的定向固定化是可能的。
已经发现，与试剂预温育相比，连续的一系列步骤导致灵敏度提高(约2倍的改善)。当使用ABTS作为酶底物时，本文报道的方法具有1.56ng/mL(检测下限)至200ng/mL的可用确定范围。另外已经发现，分析物和检测试剂的预温育导致钩状效应。此外，特别是在高浓度的检测试剂(洋地黄毒苷化的过氧化物酶)下，预温育导致测定信号降低，在某些情况下甚至导致信号的完全抑制。
已经发现，为了避免亲合效应，对于一系列测定设置50ng/mL或更少的双衍生化RPLA的包被密度是有利的。
总之，与预温育设置相比，连续测定设置具有低干扰数量和高灵敏度的优点。
进一步发现，与使用ABTS作为显色底物相比，通过使用TMB作为显色底物，可以进一步提高测定的灵敏度(低至0.94ng/mL)。这导致从35ng/mL到0.55ng/mL的可用范围。
在不同基质中获得的标准曲线与变异系数至多5％相当。
通过分析血浆浓度高达100μg/mL的多种不同抗体已经发现，本文报道的测定显示无交叉反应性并选择性检测分析物(抗洋地黄毒苷抗体)。此外，不同动物的血浆没有显示干扰。
本文报道的方法中使用的捕获试剂不是抗体或衍生自抗体，因此不具有定向结合特异性。它具有双结构域呈递支架的功能性：一个结构域用于固定到固相，一个结构域是待测定的抗体的抗原。
用于本文报道的方法中的捕获试剂是待检测抗体的抗体与可检测标记的缀合物。缀合可以直接通过抗原和可检测标记上的官能团或通过接头进行。
通过使用如上所述的试剂，本文报道的方法需要更少的试剂。
在本文报道的方法中，分析物与捕获和检测试剂形成免疫复合物，而不需要第二检测试剂。此外，通过使用该测定形式，可以进行通用检测以及确定分析物的结构完整性。
在一个实施方案中，抗体是IgG类的抗体。
在一个实施方案中，抗体是抗半抗原抗体。在一个实施方案中，抗体选自抗生物素抗体，抗洋地黄毒苷抗体，抗茶碱抗体，抗helicar抗体和抗溴脱氧尿苷抗体。
在一个实施方案中，抗体是抗洋地黄毒苷抗体。
由于免疫测定使用分析物的CDR的结合特异性，与构架区无关，可以实现Fc-区和衍生抗体的物种。因此，本文报道的测定仅取决于抗体的结合特异性。因此，本文报道的测定法是关于衍生抗体的Fc区的物种和从中获得样品的实验动物的通用测定法。
在本文报道的检测方法中，抗体的抗原的识别独立于抗原的缀合状态，但取决于抗体与其抗原的结合强度。
在一个实施方案中，捕获试剂即抗原缀合至固相。在一个实施方案中，与固相的缀合是通过生物素化的牛血浆白蛋白(RPLA)。
牛血浆白蛋白(RPLA)是从牛血浆获得的66kDa蛋白质球状蛋白质。
对于新型治疗剂的药理学和毒理学评价，通常灵长类动物,狗或小型猪被用作非啮齿动物物种。
血样分析中潜在的错误来源在于样品基质。例如，基质中存在的蛋白质可以与捕获和示踪试剂非特异性相互作用。
本文报道的一个方面是用于测定从非人实验动物获得的血清或血浆样品中二价抗体的量的方法，由此与具有SEQ ID NO：01,02或03的序列的相应的野生型Fc区相比，所述抗体包含Fc区中的一个或多个突变，其中所述方法包括按以下顺序的以下步骤：
a)将生物素化的牛血浆白蛋白优选以50ng/ml的浓度固定在抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的固体表面上，所述抗体的多于一个拷贝的抗原共价缀合到所述牛血浆白蛋白，
a1)任选地洗涤步骤，
b)将固定的抗原与样品温育以形成固定化的抗原-抗体复合物，优选抗体具有0.55ng/ml至35ng/ml的浓度，进一步优选样品包含10％血清，
b1)任选地洗涤步骤，
c)将固定化的抗原-抗体复合物与缀合到可检测标记的抗原一起温育以形成固定化的三元复合物，优选地，可检测标记是过氧化物酶，更优选地，过氧化物酶以300mU/ml的浓度使用，
c1)任选地洗涤步骤，
d)通过确定固定化三元复合物中可检测标记的量来确定抗体的量。
多肽(即抗原)和抗体含有许多反应性部分，例如氨基(赖氨酸，α-氨基)，巯基(胱氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸)，羧酸基团(天冬氨酸，谷氨酸)和糖醇基团。这些可用于偶联至结合配偶体，像表面，蛋白质，聚合物(例如PEG，纤维素或聚苯乙烯)，酶或结合对的成员(参见例如Aslam M.and Dent,A.,Bioconjuation MacMillan Ref.Ltd.(1999)50-100)。
蛋白质最常见的反应性基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε-胺。一般来说，几乎所有的抗体都含有丰富的赖氨酸残基。赖氨酸胺/氨基在pH8.0以上是合理的良好亲核试剂(pKa＝9.18)，因此与各种试剂容易且干净地反应以形成稳定的键。
抗体中另一常见的反应性基团是来自含硫氨基酸胱氨酸和其还原产物半胱氨酸(或半胱氨酸)的巯基残基。半胱氨酸含有游离的巯基，其比胺更亲核，并且通常是蛋白质中反应性最强的官能团。硫醇在中性pH下通常是反应性的，因此可以在胺存在下选择性地与其他分子偶联。由于游离巯基是相对反应性的，具有这些基团的蛋白质通常以它们的氧化形式如二硫化物基团或二硫键存在。
除胱氨酸和半胱氨酸之外，一些蛋白质还具有氨基酸甲硫氨酸，其在硫醚键中含有硫。文献报道了使用几种硫醇化交联试剂如Traut's试剂(2-亚氨基硫烷)，(乙酰基硫代)乙酸琥珀酰亚胺酯(SATA)或6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-LC-SPDP)以提供经由反应性氨基引入多个巯基的有效途径。
反应性酯，特别是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯是用于修饰胺基团的最常用试剂。在含水环境中反应的最佳pH值为8.0至9.0。
异硫氰酸酯是胺修饰试剂并与蛋白质形成硫脲键。它们与蛋白质胺在水溶液中反应(最佳pH值为9.0-9.5)。
醛在温和的含水条件下与脂族和芳族胺，肼和酰肼反应形成亚胺中间体(席夫碱)。用温和的或强还原剂(如硼氢化钠或氰基硼氢化钠)选择性还原席夫碱，得到稳定的烷基胺键。
其他用于修饰胺的试剂是酸酐。例如，二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)是含有两个胺反应性酸酐基团的双官能螯合剂。它可以与蛋白质的N-末端和ε-胺基团反应形成酰胺键。酸酐环开放以产生多价金属螯合臂，其能够与配位络合物中的金属紧密结合。
例如，Hage,D.S.(Anal.Chem.71(1999)294R-304R)描述了不同免疫测定的原理。Lu,B.,et al.(Analyst 121(1996)29R-32R)报道了用于免疫测定的抗体的定向固定化。例如，由Wilchek,M.,and Bayer,E.A.,in Methods Enzymol.184(1990)467-469报道了抗生物素蛋白-生物素介导的免疫测定。
附图说明
图1标准免疫测定方案。
图2如本文报道的免疫测定方案。
图3测定标准曲线。
图4野生型抗体(菱形)和LALA-PG-AAA突变体(正方形)的药代动力学分析。
图5标准曲线。
提供以下实施例，附图和序列以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。应该理解，可以在不背离本发明精神的情况下对程序进行修改。
材料
实施例1
免疫测定
本文报道的方法是夹心形式的非竞争性酶联免疫吸附测定法。该测定设置允许检测10％基质(血清)中的非生物活性抗体。
用活化的生物素(生物素-(XOSu)-RPLA-洋地黄毒苷(XOSu)(BI-RPLA-DIG))包被链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(SA-MTP)。用加入每孔的100μL溶液(50ng/mL BI-RPLA-DIG)于室温摇动(500rpm)1小时进行包被。之后，每个孔洗涤3次，每次用300μL洗涤缓冲液。
对于分析标准样品，一式两份分析质量控制样品和样品。标准样品和质量控制样品在100％基质中制备，然后用测定缓冲液以1:10(v/v)稀释。使用也应用于实验动物的相同材料在100％基质中以1:1稀释系列制备标准样品，如下所示：使用单克隆鼠抗洋地黄毒苷抗体(mAb<Dig>M-19.11-IgG)以350ng/mL的浓度在100％基质中制备第一标准样品(STDA)。通过用100％基质稀释STD A，获得STD B等直到获得STD G(350ng/mL-5.5ng/mL)。第八个标准品是未加标准品的100％基质。标准样品和空白用测定缓冲液以1:10(v/v)稀释。每个样品和标准品以100μL的体积加入孔中。摇动(500rpm)下将板在室温温育1小时。此后，除去上清液并将孔用300μL每孔洗涤缓冲液洗涤三次。向每个孔中加入100μL检测溶液(洋地黄毒苷(XOSu)-过氧化物酶(DIG_POD)；300mU/mL)。此后，将平板在室温下摇动(500rpm)温育1小时。去除上清液后，每个孔每次用300μL缓冲液洗涤3次。通过添加100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液来引发显色反应。18分钟后，通过加入0.5mol/L磷酸终止反应，并在450nm处测定消光，在690nm测定参考值。
实施例2
捕获试剂
1)非特异性吸附
本实施例中使用捕获试剂洋地黄毒苷缀合的牛血浆白蛋白(RPLA-DIG)。
制备在100mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中含有1.5μg/mL RPLA-DIG的溶液。将聚苯乙烯多孔板的每个孔充满200μL该溶液并在摇动下温育1小时。此后，除去上清液，各孔用含有牛血清白蛋白的300μL/孔封闭缓冲液洗涤3次。除去上清液后，将各孔洗涤三次。
使用在100％测定缓冲液中的1:1稀释系列如下制备标准样品：使用单克隆鼠抗洋地黄毒苷抗体(mAb<Dig>M-19.11-IgG)在测定缓冲液中以100ng/mL浓度制备第一标准样品(STD A)。通过用测定缓冲液1：1(100％稀释)稀释STD A，从而获得STD B等等直到STD G。第八个标准是未加标准品的测定缓冲液。
一式两份确定了六个标准品系列(孔中温育时间一小时)。
为了检测，制备了包含辣根过氧化物酶缀合的兔多克隆抗Fc抗体(pAk<M-Fc>Rb-IgG-HRP)的溶液(50mU/mL)。将该检测溶液稀释至25mU/mL，12.5mU/mL，6.25mU/ml，3.13mU/mL和1.56mU/mL，从而获得具有不同检测试剂浓度的六种检测溶液。
从孔中取出上清液并三次洗涤后，将检测试剂加入孔中。因此，对于六个标准系列中的每一个系列，添加100μL各检测试剂稀释液。温育后，除去上清液并加入ABTS溶液。产生的有色反应产物在405nm处以参考波长490nm测定。
2)特异性吸附
制备用于特异性和定向吸附的两种不同的捕获试剂：i)具有定义的BI-DIG化学计量：DIG-3-CME-UEEK-Bi(DIG＝洋地黄毒苷；3-CME＝3-羧甲基醚；UEEK＝β-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-赖氨酸；BI＝生物素；MW约1.1kDa)；在下文中表示为BI-DIG)ii)具有未定义的BI-DIG化学计量：BI-RPLA-DIG(RPLA＝牛血浆白蛋白；MW约70kDa)。
作为标准样品，在本实施例中使用了抗ANG2抗体。
将捕获试剂各自与标准和温育的第一检测试剂(参见前面的实施例)温育过夜。温育在聚丙烯板中进行，其中不发生对表面的非特异性吸附。
为了检测，向过夜预温育的样品(mAb<ID-mAb<ANG2>>M.2.6.81-IgG(SPA)-Dig(XOSu)(DIG-IGG))加入洋地黄毒苷标记的抗独特型抗体。使用过氧化物酶缀合的多克隆抗洋地黄毒苷抗体(pAk<DIG>S-Fab-POD)产生信号。
捕获试剂BI-DIG以219.99ng/mL的浓度使用，捕获试剂BI-RPLA-DIG以14μg/mL的浓度使用。采用这种浓度，与其他试剂相比，在预温育过程中存在100倍摩尔过量的(BI-100)捕获试剂。在1:10(BI-10)和1：100稀释液(BI-1)中，获得摩尔比为1:10和1:1的溶液。类似地，第一检测试剂以30μg/mL(DIG-100)的浓度使用，导致捕获试剂与检测试剂的摩尔比为1:100。在1:10(DIG-10)和1:100稀释液(DIG-1)中获得1:10和1:1摩尔比的溶液。分析物的使用浓度为3μg/mL(STD-10)。1:10稀释度提供STD-1。
将预先产生的含有免疫复合物的溶液应用于链霉抗生物素蛋白包被的多孔板的孔，并且以160ng/mL的浓度加入针对分析物的Fc区的第二检测试剂(pAb<M-Fc>Rb-IGG-HRP；HRP＝辣根过氧化物酶)。在1小时的温育时间之后，加入底物溶液并用光度法测定所产生的有色反应产物。
在18.5分钟测定的BI-DIG缀合物的结果显示在下表中。
在18.5分钟测定的BI-RPLA-DIG缀合物的结果显示在下表中。
可以看出，只有在高浓度时，洋地黄毒苷化抗体才非特异性结合到平板上。进一步可以看出，两种捕获试剂的消光最大值处于相同的摩尔比。在BI-DIG的情况下，与BI-RPLA-DIG相比，捕获试剂的摩尔比偏移10倍。消光最大值的信噪比(S/N)的直接比较表明，对于Bi-RPLA-Dig，S/N是32.8(S/N＝1.754/0.054)，而对于BI-DIG是9.5(S/N＝0.399/0.042)。
实施例3
测定设置
在这个实施例中比较测定设置的不同的变体：i)顺序设置(应用捕获试剂，分析物和检测试剂，每个步骤通过一个洗涤步骤分开)，ii)分析物和检测试剂的预温育，以及iii)捕获试剂，分析物和检测试剂的预温育。
1)顺序设置
18.6分钟后用顺序设置得到的结果如下表所示。分析物浓度为50ng/mL时，已获得最大值36.3。
可以看出，随着BI-RPLA-DIG浓度的降低和DIG-POD浓度的增加，S/N增加。在300mU/mL的检测试剂和50ng/mL捕获试剂的浓度下，可以看到最大值为36.3。
在下表(对于300mU/mL的检测试剂浓度测定的)中，可以看出消光增加至50ng/mL的捕获浓度并且随后减少。高于此浓度发生亲和力效应，导致由于二价结合而信号降低。
从下表中的数据(在18.5分钟温育时间后检测)可以看出，动态范围没有差异，即没有由于DIG-POD组分造成的限制。当假设在空白信号两倍的信号以上时，可以进行良好的定量，可以看出灵敏度独立于DIG-POD浓度。因此，使用ABTS作为显色剂的顺序形式具有300mU/mL的BI-RPLA-DIG浓度和50ng/mL捕获试剂，检测范围为1.56ng/mL至200ng/mL。
使用TMB作为显色底物重复该反应。已经发现，当使用TMB代替ABTS时，测定可以在更短的时间内进行，即更快，并且可以获得更高的消光值。使用TMB的检测范围为0.78ng/mL至50ng/mL。这些值显示在下表中。
2)预温育分析物和检测试剂
从下表可以看出，在50ng/mL单克隆抗洋地黄毒苷抗体浓度下，S/N随着包被浓度的增加和伴随的检测试剂的减少而增加。在400ng/mL BI-RPLA-DIG和31.3mU/mL DIG-POD时，达到最大值。显色试剂是ABTS。
在以下系列中测试的全部三种DIG-POD浓度中，可以看到以400ng/mL的抗洋地黄毒苷抗体浓度开始的钩状效应。进一步可以看出，随着DIG-POD浓度的增加，饱和平台变得越来越宽，并且稍后达到钩状效应。可以看到POD浓度的明显限制。对于在400ng/mL的BI-RPLA-DIG浓度和30mU/mL的DIG-POD浓度下的该测定，该测定具有3.13ng/mL至150ng/mL的检测范围。由于有限的POD效应和较长的所需时间，另两种浓度不是合适的。
3)捕获试剂，分析物和检测试剂的预温育
从下表中的数据可以看出，在50ng/mL的单克隆抗洋地黄毒苷抗体浓度下，S/N随着捕获试剂浓度的降低以及检测试剂浓度降低而增加。在13.7ng/mL BI-RPLA-DIG和18.8mU/mL DIG-POD的浓度下达到最大值。显色试剂是ABTS。
从以下数据集可以看出，在10ng/mL的BI-RPLA-DIG浓度至16.6mU/mL的DIG-POD浓度下，发生了限制并且标准曲线未达到2的OD值。对于这种组合，在200ng/mL的分析物浓度下，钩状效应也是可见的。由于数据具有可比性，因此该标准是用于选择这一类别中的一种的试剂。在分析物浓度达到6400ng/mL时，检测不到钩状效应。1000ng/mL的BI-RPLA-DIG浓度和600mU/mL的DIG-POD浓度下的检测范围为3.13ng/mL到200ng/mL。使用100ng/mL BI-RPLA-DIG和100mU/mL DIG-POD，测定法具有相同的检测范围。
实施例4
不同显色试剂
下表中针对不同显色试剂ABTS和TMB以及HPPA发射值的消光值分别低于检测限，并且不能被定量。可以看出，顺序设置中的测定(本文报道的测定)具有使用0.94ng/mL的TMB的检测极限，因此与ABTS相比灵敏度是两倍。使用HPPA，检测限为0.47ng/mL(使用5U/mLDIG-POD的标准系列)。尽管该测定变体比使用TMB的测定更灵敏，但令人惊讶的是测定信号不能以足够可再现的方式获得以允许建立稳健的测定。
ABTS:
TMB:
HPPA:
实施例5
基质范围
从下表中可以看出，在不同的基质中，与仅用缓冲液制备的标准样品相比，加标标准样品所获得的信号减弱了。参考缓冲液样品，加标标准品从不同样品基质中回收了94％至72％。变化是3％到5％。因此，所有基质之间没有显著差异。
实施例6
测定特征
在图3中给出了本文报道的测定的标准曲线，其包含STD A至STD G和空白值。基于使用的抗洋地黄毒苷抗体的重量，检测范围为5.5ng/mL至35ng/mL。下表提供了各自的数据。
本文报道的测定法具有测定内精确度，标准差/变异系数为2％至6％。测定内回收率在100％至104％之间。
本文报道的测定法具有测定间精确度，其标准差/变异系数为5％至12％。测定间回收率在78％到117％之间。μL和LLQC样品的计算回收率在87％和121％之间，因此在25％的可接受范围内。
实施例7
选择性
从下表可以看出该测定具有非常好的选择性。对于不同抗体确定的消光值远低于空白样品水平下的最低标准样品。因此，在高达10μg/mL的浓度下，捕捉试剂和示踪试剂不能互相联系。因此，该测定对抗洋地黄毒苷抗体是特异性的。
如本文报道的测定显示在100％汇集的血浆(测定浓度10μg/mL)中直至100μg/mL抗体的浓度下没有钩状效应。下表提供了各自的测定值。在80％至120％回收率(AQL＝高于定量限；BQL＝低于定量限)的接受间隔内检测样品(如果适用，稀释后)。
本文报道的测定的稀释线性已经在8个小型猪个体血浆中的高达100μg/mL抗洋地黄毒苷抗体的血浆浓度中进行测试。在80％至120％的接受间隔(在81％至138％的区间内的所有45个稀释度)内检测到45个稀释样品中的41个。不同的血浆基质对分析物的回收没有显著影响。
实施例8
样品定量
从下表可以看出，通过交换抗体的Fc区中的单个氨基酸残基，药代动力学半衰期已经改变(参见图4)。数据是通过确定16个不同的小型猪血清产生的。阴影值低于定量限，ivt表示玻璃体内应用，iv表示静脉应用。
已经使用本文报道的测定法检测了三个Fc-区修饰的抗体。标准曲线如图5所示，相应的日期见下表。
文献
Carl Roth GmbH und Co.KG:Albumine für die Biochemie undMolekularbiologie.IKK 01/2009
Diamandis E.P.,Christopoulos T.K.(1991)The biotin-(strept)avidinsystem:principles and applications in biotechnology.Clinical Chemistry,37,625-636
European Medicines Agency(July 2011),Guideline on bioanalyticalmethod validation
Goebel-Stengel M,Stengel A,TachéY,Reeve JR(2011)The importance ofusing the optimal plastic ware and glassware in studies involvingpeptides.Analytical Biochemistry,414,38-46
Hoffmann-La Roche AG:Roche Lexikon–Medizin.5.Ed.Munich:Urban&Fischer,2003
Georg:Immunologie–Grundlage für Klinik undPraxis.1.Ed.Munich:Urban&Fischer,2006
Issaq HJ,Xiao Z,Veenstra TD(2007)Serum and Plasma Proteomics.ChemicalReviews,107(8),3601-3620
Luttmann et al.:Der Experimentator–Immunologie.3.Ed.Heidelberg:Spektrum Akademischer Verlag,2009
Mould D.R.,Green B.(2010)Pharmacokinetics and pharmacodynamics ofmonoclonal antibodies:concepts and lessons for drug development.BioDrugs,24(1),23-39
Raem,A.；Rauch,P.:Immunoassays.1.Ed.Munich:Spektrum AkademischerVerlag,2007
Simpson J.R.,Greening D.W:Serum/Plasma Proteomics.1vol.Totowa:HumanaPress Inc.,2011
Stubhan,Miriam:DasMinipig als Telemetriemodell fürpharmakologische Zwecke,Diss.Univ.Munich,2008
U.S.Department of Health and Human Services,Food and DrugAdministration,Center for Drug Evaluation and Research,Center for VeterinaryMedicine(May 2001),Guidance for Industry–Bioanalytical Method Validation
缩写
ABTS 2,2'-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)
Ak 抗体
ALQ 高于定量极限
AP 测定缓冲液(＝通用缓冲液)
AS 氨基酸
Bi 生物素
BLQ 低于定量极限
BSA 牛血清白蛋白
CDR 互补决定区
CV 变异系数
Dig 洋地黄毒苷
ELISA 酶联免疫吸附测定
F(ab')2 抗原结合片段(二价)
Fab 抗原结合片段(单价)
FC 可结晶的片段
H 人
HPPA 3-(4-羟基苯基)-丙酸
HRP 辣根过氧化物酶
Ig 免疫球蛋白
IgA 亚类A的免疫球蛋白
IgD 亚类D的免疫球蛋白
IgE 亚类E的免疫球蛋白
IgG 亚类G的免疫球蛋白
IgM 亚类M的免疫球蛋白
M 小鼠
mAk 单克隆抗体
MTP 微量滴定板
OD 光密度
pAk 多克隆抗体
POD 过氧化物酶
PP 聚丙烯
PS 聚苯乙烯
Rb 兔子
RFU 相对荧光单位
RPLA 牛血浆白蛋白
SA 链霉抗生物素蛋白
S:N 信噪比
SD 标准差
STD 标准
TMB 3,3',5,5'-四甲基联苯胺
XOSu X(ε-氨基己酸)-O-琥珀酰亚胺

Claims (11)

1.一种确定从非人实验动物获得的血清或血浆样品中二价抗体的量的方法，其中与相应的具有SEQ ID NO：01,02或03的序列的野生型Fc区相比，所述二价抗体包含Fc区中的一个或多个突变，其中所述方法包括按以下顺序的以下步骤：
a)将被所述抗体的多于一个拷贝的抗原共价缀合的非抗体多肽固定在固体表面上，
b)将被所述抗体的多于一个拷贝的抗原共价缀合的固定化的非抗体多肽与所述样品温育以形成固定化的抗原-抗体复合物，
c)将固定化的抗原-抗体复合物与缀合至可检测标记的所述抗体的抗原一起温育以形成固定化的三元复合物，
d)通过确定固定化的三元复合物中可检测标记的量来确定抗体的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非抗体蛋白质是血清蛋白质。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述非抗体多肽是牛血浆白蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗体的一个或多个拷贝的抗原与所述非抗体多肽化学缀合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在所述固定化步骤中，所述非抗体多肽的浓度为约50ng/mL。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是过氧化物酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述可检测标记是辣根过氧化物酶。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述可检测标记的浓度为约300mU/mL。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中通过将固定化的三元复合物与3,3‘,5,5‘-四甲基联苯胺温育进行所述确定。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述抗体选自抗生物素抗体，抗洋地黄毒苷抗体，抗茶碱抗体，抗helicar抗体和抗溴脱氧尿苷抗体。
CN201680067452.9A 2015-11-30 2016-11-29 用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法 Withdrawn CN108351361A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15197058.9 2015-11-30
EP15197058 2015-11-30
PCT/EP2016/079086 WO2017093226A1 (en) 2015-11-30 2016-11-29 Immunoassay for the determination of fc-region modified antibodies

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410287161.7A Division CN118150838A (zh) 2015-11-30 2016-11-29 用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108351361A true CN108351361A (zh) 2018-07-31

Family

ID=54770889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680067452.9A Withdrawn CN108351361A (zh) 2015-11-30 2016-11-29 用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11561229B2 (zh)
EP (1) EP3384293B1 (zh)
JP (1) JP6807944B2 (zh)
KR (1) KR102628570B1 (zh)
CN (1) CN108351361A (zh)
AU (1) AU2016363638B2 (zh)
BR (1) BR112018008789A2 (zh)
CA (1) CA3004199C (zh)
HK (1) HK1258302A1 (zh)
IL (1) IL259053A (zh)
MX (1) MX2018006030A (zh)
WO (1) WO2017093226A1 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01223351A (ja) * 1988-03-03 1989-09-06 Dainippon Pharmaceut Co Ltd 抗体の定量方法および定量用試薬
WO1996022533A1 (en) * 1995-01-18 1996-07-25 First Medical, Inc. Method for immobilizing haptens on a test article
US20040242848A1 (en) * 2003-04-21 2004-12-02 Owens S. Michael Mouse/human chimeric anti-phencyclidine antibody and uses thereof
WO2015101587A1 (en) * 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2095818B (en) 1981-03-27 1985-10-02 Exxon Research Engineering Co Staged adsorption/resorption heat pump
US5238808A (en) 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
WO1990005301A1 (en) 1988-11-03 1990-05-17 Igen, Inc. Electrochemiluminescent assays
US5068088A (en) 1988-11-03 1991-11-26 Igen, Inc. Method and apparatus for conducting electrochemiluminescent measurements
IL100866A (en) 1991-02-06 1995-10-31 Igen Inc Luminescence test method and device based on magnetic tiny particles, containing many magnets
CN101287989B (zh) 2005-02-02 2016-04-13 菲鹏生物股份有限公司 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法
RU2296332C1 (ru) * 2005-10-28 2007-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "ДИАМЕДИКА" Способ ранней диагностики факта потребления наркотических веществ в отсутствие клинических признаков состояния зависимости от наркотиков
AR080794A1 (es) * 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
AU2013285422B2 (en) 2012-07-04 2017-04-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked antigen-antibody conjugates
CA2873829A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the detection of a multispecific binder

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01223351A (ja) * 1988-03-03 1989-09-06 Dainippon Pharmaceut Co Ltd 抗体の定量方法および定量用試薬
WO1996022533A1 (en) * 1995-01-18 1996-07-25 First Medical, Inc. Method for immobilizing haptens on a test article
US20040242848A1 (en) * 2003-04-21 2004-12-02 Owens S. Michael Mouse/human chimeric anti-phencyclidine antibody and uses thereof
WO2015101587A1 (en) * 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘文泰主编: "《医学免疫学》", 28 February 2009, 中国中医药出版社 *
龚守良主编: "《实用基础医学实验技术》", 30 April 1991, 吉林科学技术出版色 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3004199A1 (en) 2017-06-08
HK1258302A1 (zh) 2019-11-08
US11561229B2 (en) 2023-01-24
KR20180082597A (ko) 2018-07-18
BR112018008789A2 (pt) 2018-10-30
AU2016363638A1 (en) 2018-05-24
AU2016363638B2 (en) 2022-04-21
EP3384293A1 (en) 2018-10-10
KR102628570B1 (ko) 2024-01-23
JP6807944B2 (ja) 2021-01-06
JP2018536881A (ja) 2018-12-13
IL259053A (en) 2018-07-31
US20180364251A1 (en) 2018-12-20
MX2018006030A (es) 2018-08-01
WO2017093226A1 (en) 2017-06-08
EP3384293B1 (en) 2020-07-08
CA3004199C (en) 2024-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays
JP6502441B2 (ja) 多重特異性結合物の結合パートナーを検出するための方法
CN111417856B (zh) 抑制靶干扰作用的抗药物抗体测定法
CN103399145B (zh) 区分测定
CN104714007B (zh) 单个靶实体的免疫化学检测
US7842456B2 (en) Reagents, kits and methods for immunodetection of epitopes on molecules
JPS6324155A (ja) 結合測定法に使用される開裂可能な標識
CN104471397B (zh) 用于检测多特异性结合物的方法
TW201030335A (en) Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
JP2020170001A (ja) エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の決定方法
CN108369227A (zh) 三步酸解离酶联免疫吸附(tadelis)测定法
JP2023099089A (ja) 干渉抑制薬物動態イムノアッセイ
CN108351361A (zh) 用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法
CN116621930B (zh) 检测基孔肯雅病毒的多肽、试剂盒和方法
CN118150838A (zh) 用于测定Fc区修饰的抗体的免疫测定法
JP7416485B2 (ja) スイッチング結合剤、その製造方法、及びそれを用いた薬学組成物、検査キット及び抗原と抗体との分析方法
KR101969121B1 (ko) 시스테인 조작된 항체
ES2264271T3 (es) Complejos novedosos que contienen avidina reticulada, procedimiento de preparacion y procedimiento analitico de utilizacion de los mismos.
KR20220054134A (ko) 스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1258302

Country of ref document: HK

WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20180731