JP6807944B2 - Fc領域改変抗体を測定するためのイムノアッセイ法 - Google Patents
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Description
治療用抗体の薬物動態パラメーターならびにエフェクター機能を改善および最適化するために、分子構造の改変を親治療用抗体に導入して、変種抗体を作製する。これらの改変は、抗原認識ドメインにも、またFc領域にも限定されない。
- (実験動物の)他の血清/血漿成分に対する交差反応性を伴わずに、Fc領域改変抗体の量を測定すること、すなわち、このアッセイ法は高い特異性を有していること。
- Fc領域改変抗体の量を包括的に測定すること。すなわち、この方法は、Fc領域および実験動物の種とは関係なく応用可能であり;これは、分析物ならびに試料マトリックスにあてはまり;これにより、異なる種特異的Fc領域を含む、任意の実験動物マトリックス中の抗体Fc領域変種の検出が可能になる。
- Fc領域改変抗体の構造的完全性ならびにFc領域改変抗体の二価性を判定および確認すること。
- 高い感度で、かつ多くても100ng/mLという低い検出下限で、Fc領域改変抗体の量を測定すること。
- 標準化した材料を用いて、この方法を実施すること。
(a)抗体の抗原の複数のコピーが共有結合的にコンジュゲートされている非抗体ポリペプチドを、固体表面に固定化する段階、
(b)固定化した抗原を試料と共にインキュベーションして、固定化した抗原-抗体複合体を形成させる段階、
(c)固定化した抗原-抗体複合体を、検出可能な標識にコンジュゲートされている抗原と共にインキュベーションして、固定化した三元複合体を形成させる段階、
(d)固定化した三元複合体中の検出可能な標識の量を測定することによって、抗体の量を測定する段階。
(a)複数のジゴキシゲニン分子が共有結合的にコンジュゲートされている非抗体ポリペプチドを、固体表面に固定化する段階、
(b)複数のジゴキシゲニン分子が共有結合的にコンジュゲートされている固定化した非抗体ポリペプチドを、試料と共にインキュベーションして、固定化した抗原-抗体複合体を形成させる段階、
(c)固定化した抗原-抗体複合体を、検出可能な標識にコンジュゲートされているジゴキシゲニンと共にインキュベーションして、固定化した三元複合体を形成させる段階、
(d)固定化した三元複合体中の検出可能な標識の量を測定することによって、抗体の量を測定する段階。
ブリッジングアッセイ法の2つの主な原理は、当業者には公知であり、非内因性標的および非内因性標的結合抗体の例としてのハプテンジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン抗体を用いて以下に例示する。
この方式では、ジゴキシゲニン標識抗体が、一次検出試薬として使用される。しかし、これは干渉の原因となり得る:分析物それ自体としての抗ジゴキシゲニン抗体が、検出試薬のジゴキシゲニンとも相互作用して、分析物の最終的な検出を妨害し得る。
この方式では、分析物は、固相にコンジュゲートされている抗Fc領域抗体によって捕捉される。また、この方式でも、分析物は検出抗体のジゴキシゲニン標識と競合して、シグナル消滅をもたらすと考えられる。さらに、この方式を用いた場合、分析物の機能的完全性の証拠を得ることができなかった。またさらに、一方では捕捉抗体が種特異的であり、その一方で捕捉抗体が実験動物の内因性抗体と交差反応すると考えられるため、この方式は、種非依存性ではない。さらにまた、Fc領域改変は捕捉抗体の結合の減少をもたらし得るため、このアッセイ法は、Fc領域改変抗体変種の検出に包括的に応用できるとは考えられない。
「約」という用語は、その後に続く値が、まさにその値ではないが、その値の±10%、またはその値の±5%、またはその値の±2%、またはその値の±1%である範囲の中心点であることを意味する。その値が、百分率で与えられる相対値である場合、「約」という用語は同様に、その後に続く値が、まさにその値ではないが、その値の±10%、またはその値の±5%、またはその値の±2%、またはその値の±1%である範囲の中心点であり、その範囲の上限が100%という値を超えることはできないことを意味する。
など最大5個のアミノ酸の小さな反復単位で配列されている。この小さな反復単位は、2〜5回繰り返されて多量体単位を形成してもよい。多量体単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端に、最大6個の付加的な任意の天然アミノ酸を付加してもよい。他の合成ペプチドリンカーは、例えば、リンカー
中のセリンのように10〜20回の間の回数だけ繰り返された単一のアミノ酸から構成されており、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に、最大6個の付加的な任意の天然アミノ酸を含んでよい。ペプチドリンカーはすべて、核酸分子によってコードすることができ、したがって組換えによって発現させることができる。リンカーはそれら自体がペプチドであるため、抗融合性ペプチドが、2つのアミノ酸の間に形成されるペプチド結合を介してリンカーに連結される。
本明細書において報告される方法を用いると、非ヒト実験動物から得た血清試料中または血漿試料中のFc領域改変抗体の量を測定するための先行技術の方法の欠点を回避することができ、かつ検出方法のために必要とされるすべての特異性を満たすことができることが、現在判明している。
(a)抗体の抗原の複数のコピーが共有結合的にコンジュゲートされているビオチン標識ウシ血漿アルブミンを、好ましくは濃度50ng/mlで、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた固体表面に固定化する段階、
(a1)任意で洗浄段階、
(b)固定化した抗原を試料と共にインキュベーションして、固定化した抗原-抗体複合体を形成させる段階であって、好ましくは、抗体の濃度が0.55ng/ml〜35ng/mlであり、さらに好ましくは、試料が10%血清を含む、段階、
(b1)任意で洗浄段階、
(c)固定化した抗原-抗体複合体を、検出可能な標識にコンジュゲートされている抗原と共にインキュベーションして、固定化した三元複合体を形成させる段階であって、好ましくは、検出可能な標識がペルオキシダーゼであり、さらに好ましくは、ペルオキシダーゼが濃度300mU/mlで使用される、段階、
(c1)任意で洗浄段階、
(d)固定化した三元複合体中の検出可能な標識の量を測定することによって、抗体の量を測定する段階。
イムノアッセイ法
本明細書において報告される方法は、サンドイッチ方式の非競合的酵素結合免疫吸着測定法である。このアッセイ法設定は、10%マトリックス(血清)中の非生物学的に活性な抗体の検出を可能にする。
捕捉試薬
(1)非特異的吸着
この実施例では、捕捉試薬である、ジゴキシゲニンがコンジュゲートされたウシ血漿アルブミン(RPLA-DIG)を使用した。
特異的かつ方向付けられた吸着のための、次の2種類の異なる捕捉試薬を調製した:(i)BI-DIG化学量論比が定められいるもの:DIG-3-CME-UEEK-Bi(DIG=ジゴキシゲニン;3-CME=3-カルボキシメチルエーテル;UEEK=β-アラニン-グルタミン酸-グルタミン酸-リジン;BI=ビオチン;MW 約1.1kDa);以下、BI-DIGと示す)、(ii)BI-DIG化学量論比が定められていないもの: BI-RPLA-DIG(RPLA=ウシ血漿アルブミン;MW 約70kDa)。
アッセイ法設定
この実施例では、アッセイ法設定の様々な変形を比較する:(i)逐次的設定(捕捉試薬、分析物、および検出試薬の適用、各段階は1回の洗浄段階を挟んでいる)、(ii)分析物および検出試薬のプレインキュベーション、ならびに(iii)捕捉試薬、分析物、および検出試薬のプレインキュベーション。
以下の表から、モノクローナル抗ジゴキシゲニン抗体の濃度が50ng/mLの場合、コーティング濃度の上昇および付随する検出試薬の減少に伴って、S/Nが上昇することが理解できる。400ng/mLのBI-RPLA-DIGおよび31.3mU/mLのDIG-PODの場合に、最大値に達している。発色試薬はABTSであった。
以下の表のデータから、モノクローナル抗ジゴキシゲニン抗体の濃度が50ng/mLの場合に、捕捉試薬濃度の低下ならびに検出試薬濃度の低下に伴ってS/Nが上昇することが理解できる。濃度13.7ng/mLのBI-RPLA-DIGおよび濃度18.8mU/mLのDIG-PODの場合に、最大値に達している。発色試薬はABTSであった。
様々な発色試薬
異なる発色試薬ABTSおよびTMBについての次の表で影を付けた吸光度値ならびにHPPAの発光値は、それぞれ、検出限界を下回っており、定量することができない。逐次的設定のアッセイ法(本明細書において報告されるアッセイ法)では、TMBを用いた場合の検出限界が0.94ng/mLであり、その結果、ABTSと比べて感度が2倍高いこと理解できる。HPPAを用いた場合、検出限界は0.47ng/mLである(5U/mL DIG-PODと共に標準物質系列を用いる)。このアッセイ法変形は、TMBを用いるアッセイ法より感度が高いが、驚くべきことに、状況に左右されないアッセイ法の設定を与えるのに十分に再現可能な様式でアッセイシグナルを得ることはできなかった。
マトリックス範囲
様々なマトリックスにおいて、スパイクされた標準試料は、緩衝液のみを用いて作製された標準試料と比べて、得られるシグナルが減少していることが、以下の表から理解できる。緩衝液試料を基準とすると、スパイクされた標準物質は、様々な試料マトリックスから94%〜72%の回収率で回収される。変動は3%〜5%である。したがって、すべてのマトリックスの間に有意な差異はない。
アッセイ法特徴
図3において、STD A〜STD Gおよびブランク値を含む、本明細書において報告されるアッセイ法のための検量線を示している。検出範囲は、使用される抗ジゴキシゲニン抗体の重量に基づいて、5.5ng/mL〜35ng/mLである。以下の表は、各データを提供する。
選択性
以下の表から、アッセイ法が非常に優れた選択性を有していることを理解できる。様々な抗体について測定された吸光度値は、最も低濃度の標準試料よりはるかに低く、ほぼブランク試料レベルである。したがって、捕捉試薬およびトレーサー試薬は、濃度10μg/mLまで、互いに連結されていない。したがって、このアッセイ法は、抗ジコキシゲニン抗体に特異的である。
試料の定量
以下の表から、抗体のFc領域中の個々のアミノ酸残基を交換することによって薬物動態学的半減期が変わったことを理解できる(図4を参照されたい)。データは、16種類の異なるミニブタ血清における測定によって作成した。影を付けた値は定量限界を下回り、ivtは硝子体内適用を意味し、ivは静脈内適用を意味する。
ABTS 2,2'-アジノ-ジ-(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)
Ak 抗体
ALQ 定量限界を上回る
AP アッセイ用緩衝液(=ユニバーサルバッファー)
AS アミノ酸
Bi ビオチン
BLQ 定量限界を下回る
BSA ウシ血清アルブミン
CDR 相補性決定領域
CV 変動係数
Dig ジゴキシゲニン
ELISA 酵素結合免疫吸着測定法
F(ab')2 抗原結合断片(二価)
Fab 抗原結合断片(一価)
FC 結晶性断片
H ヒト
HPPA 3-(4-ヒドロキシフェニル)-プロピオン酸
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
Ig 免疫グロブリン
IgA サブクラスAの免疫グロブリン
IgD サブクラスDの免疫グロブリン
IgE サブクラスEの免疫グロブリン
IgG サブクラスGの免疫グロブリン
IgM サブクラスMの免疫グロブリン
M マウス
mAk モノクローナル抗体
MTP マイクロタイタープレート
OD 光学濃度
pAk ポリクローナル抗体
POD ペルオキシダーゼ
PP ポリプロピレン
PS ポリスチロール
Rb ウサギ
RFU 相対蛍光単位
RPLA ウシ血漿アルブミン
SA ストレプトアビジン
S:N シグナル・ノイズ比
SD 標準偏差
STD 標準物質
TMB 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン
XOSu X(ε-アミノカプロン酸)-O-スクシンイミド
Claims (11)
- 非ヒト実験動物から得られた血清試料中または血漿試料中の二価抗体の量を測定するための方法であって、該抗体が、SEQ ID NO: 01、02、または03の配列を有している対応する野生型Fc領域と比べてFc領域中に1つまたは複数の変異を含み、該方法が以下の順序で以下の段階を含む、方法:
(a)該抗体の抗原の複数のコピーが共有結合的にコンジュゲートされている非抗体ポリペプチドを、固体表面に固定化する段階、
(b)該抗体の該抗原の複数のコピーが共有結合的にコンジュゲートされている固定化した該非抗体ポリペプチドを、該試料と共にインキュベーションして、固定化した抗原-抗体複合体を形成させる段階、
(c)該固定化した抗原-抗体複合体を、検出可能な標識にコンジュゲートされている該抗体の抗原と共にインキュベーションして、固定化した三元複合体を形成させる段階、
(d)該固定化した三元複合体中の該検出可能な標識の量を測定することによって、該抗体の量を測定する段階。 - 前記非抗体ポリペプチドが血清タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記非抗体ポリペプチドがウシ血漿アルブミンである、請求項2に記載の方法。
- 前記抗体の前記抗原の1つまたは複数のコピーが、前記非抗体ポリペプチドに化学的にコンジュゲートされている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定化する段階において、前記非抗体ポリペプチドの濃度が約50ng/mLである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が酵素である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な標識がペルオキシダーゼである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項7に記載の方法。
- 前記検出可能な標識の濃度が約300mU/mLである、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定する段階が、前記固定化した三元複合体を3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンと共にインキュベーションすることによる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、抗ビオチン抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、抗テオフィリン抗体、抗ヘリカー(anti-helicar)抗体、および抗ブロモデオキシウリジン抗体からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
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