ES2264271T3 - Complejos novedosos que contienen avidina reticulada, procedimiento de preparacion y procedimiento analitico de utilizacion de los mismos. - Google Patents
Complejos novedosos que contienen avidina reticulada, procedimiento de preparacion y procedimiento analitico de utilizacion de los mismos.Info
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Abstract
Un complejo de biotina-avidina-biotina que comprende al menos dos sustancias biotiniladas que son idénticas o diferentes, y una avidina reticulada emparedada entre ellas, en el que la avidina reticulada es un monómero de avidina reticulada compuesto por una molécula de avidina o polímero de avidina de enlaces transversales compuesto por una pluralidad de moléculas de avidina que están unidas entre sí mediante reticulación intermolecular.
Description
Complejos novedosos que contienen avidina
reticulada, procedimiento de preparación y procedimiento analítico
de utilización de los mismos.
La presente invención se refiere a un complejo
novedoso que contiene una avidina reticulada, un procedimiento para
preparar el complejo novedoso y un procedimiento de análisis que
utiliza el complejo novedoso. El término "de análisis" o
"análisis", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye
una detección utilizada para determinar la presencia o ausencia de
un compuesto que va a ser analizado, y una determinación
cuantitativa de una cantidad de un compuesto que va a ser
analizado.
Un enzimoinmunoensayo es un ensayo ultrasensible
que utiliza una reacción antígeno-anticuerpo. Un
enzimoinmunoensayo típico es un enzimoinmunoaensayo heterogéneo,
como por ejemplo un procedimiento sándwich, en el que se utilizan
un anticuerpo inmovilizado en fase sólida y un anticuerpo marcado
con enzima, o un procedimiento competitivo en el que se utilizan el
anticuerpo de fase inmovilizada y un antígeno marcado con
enzima.
Un antígeno marcado con enzima o un anticuerpo
marcado con enzima utilizados en los ensayos expuestos se preparan
mediante varios procedimientos. Por ejemplo, en una etapa inicial se
desarrolló un procedimiento para preparar aleatoriamente un
polímero de enzimas y antígenos o anticuerpos añadiendo
glutaraldeido con una reactividad bivalente a una mezcla de las
enzimas y los antígenos o anticuerpos (Immunochemistry
[Inmunoquímica],1969, Vol. 6, p. 43-52). Más tarde
se intentó una mejora para aprovechar el hecho de que la peroxidasa
tiene un número pequeño de grupos de amino sobre la superficie de
la misma y presenta una fuerte resistencia a una sustancia actuante
químicamente reactiva. Más concretamente, se desarrolló un
procedimiento mejorado para sintetizar únicamente los anticuerpos
deseados marcados con enzima haciendo reaccionar el glutaraldeido
con la peroxidasa, retirando el exceso de grupos de aldehído, y
mezclar la peroxidasa con el aldehído introducido resultante con
los anticuerpos (J. Immunol. Methods, [R. Inmunol. Procedimientos]
1979, Vol. 30, p. 245-255). Así mismo se desarrolló
un procedimiento para producir anticuerpos marcados con enzimas en
cantidades elevadas en vista del hecho de que la peroxidasa tiene
cadenas de azúcares. (J. Histochem, Cytochem, [R. Histoquím.
Citoquím] 1947, Vol. 22, p.1084-1091).
Específicamente este procedimiento comprende oxidar cadenas de
azúcares con ácido peryódico para formar grupos de aldehído, ligar
grupos de amino de anticuerpos a aquellos para producir anticuerpos
marcados con enzimas.
Se elaboraron y utilizaron diversos agentes de
reticulación en reacciones de unión de anticuerpos y enzimas. De
estos agentes de reticuladas, se elaboró un agente reticulado
heterobifuncional con un grupo de succinimidas y un grupo de
maleimidas en ambos extremos (Eng. J. Biochem [R. ingl. Bioquímica],
1979, vol. 101, p. 395-399). Este agente puede
específicamente enlazar un grupo amino de una enzima con un grupo
SH en una región bisagra de un anticuerpo para producir un
anticuerpo marcado con enzima en cantidades elevadas.
Además de los procedimientos anteriores, en los
que un antígeno o un anticuerpo se une a una enzima con un de
reticulado, se han elaborado determinados procedimientos de
acoplamiento utilizando una reacción de
avidina-biotina para unir un antígeno o un
anticuerpo a una enzima (J. Histochem Cytochem. [R. Histoquím.
Citoquím.] 1979, Vol. 27, p. 1131-1139). En estos
procedimientos, se utilizó una combinación de dos agentes reactivos.
Más concretamente, por un lado, un agente biotilinante se utiliza
para preparar un antígeno o anticuerpo en el cual se introduce una
biotina, esto es, un antígeno biotinilado o un anticuerpo
biotinilado. Por otro lado, 1), se prepara un complejo de una
enzima y una avidina, esto es, una avidina con marcada con enzima,
mediante un procedimiento de unión química, o 2) se prepara un
complejo de una enzima y una avidina mediante una biotina, esto es,
una avidina con marcada con enzima mezclando una enzima biotinilada
y una avidina en una proporción apropiada.
El procedimiento de unión química 1) comprende
unir una enzima y una avidina con glutaraldeido o con un agente de
reticulado heterobifuncionales, (Inmuno Chemistry [Inmunoquímica]
1969 Vol. 6, p. 43-52) pudiéndose efectuar de esta
forma repitiendo un proceso de un procedimiento para preparar el
anticuerpo con marcado con enzima, excepto porque se combinan una
enzima y una avidina en lugar de la combinación de una enzima y un
anticuerpo.
La enzima biotinilada utilizada en el
procedimiento anterior 2) puede prepararse, por ejemplo, de acuerdo
con una técnica de manipulación genética, cuando se utiliza
luciferasa como enzima (Analitical Boichemistry [Bioquímica
Analítica] 1996, Vol. 243, p. 176-180) (and Chemical
Ligand Assay [y R. Ensayo sobre Ligantes Químicos] 1198, Vol. 21,
p. 85-362). Específicamente, cuando un gen que
contiene un gen de luciferasa y un gen aceptor de biotina ligado a
aquél se expresa en una célula anfitriona, una proteína fusionada
con el aceptor de la luciferasa-biotina es
sintetizada en la célula anfitriona. A continuación la biotina se
acopla con la proteína fusionada mediante una acción de la célula
anfitriona para producir una enzima biotinilada, esto es, una
proteína fusionada de aceptor de la
luciferasa-biotina en la cual se introduce la
biotina.
El procedimiento en el que se utilizan el
antígeno biotinilado o el anticuerpo biotinilado y la avidina
marcada con enzima resultantes comprende hacer reaccionar una
muestra conteniendo un compuesto (un antígeno) que va a ser
analizado, con un vehículo que porta sobre él los anticuerpos
inmovilizados; lavar la mezcla de reacción; hacer reaccionar con
ella el anticuerpo biotinilado; lavar la mezcla de reacción; hacer
reaccionar con ella la avidina marcada con enzima y medir una
cantidad de la enzima derivada de la avidina con la enzima marcada
unida al complejo del vehículo inmovilizado que porta los
anticuerpos y el compuesto que va a ser analizado, por medio de lo
cual puede determinarse la cantidad del antígeno (Am.J. Clin Pathol.
[R. Am. Patología Clínica] 1981, Vol. 75, p.
816-821).
El inmunoanálisis que utiliza la reacción de
avidina-biotina tiene ventajas porque, si se prepara
de antemano la avidina marcada con enzima, pueden utilizarse
diversos anticuerpos como marca después de la bionitilación, y
porque una enzima cuya actividad es seriamente dañada por un
tratamiento químico puede utilizarse en forma de avidina marcada
con enzima manteniendo al tiempo su actividad, si la enzima
biotinilada se expresa de acuerdo con la manipulación genética. Sin
embargo, el inmunoanálisis anterior tiene desventajas en el sentido
de que el número de etapas del proceso se incrementa y los datos
obtenidos en cada determinación muestran una reproductibilidad más
pobre.
Una tentativa para reducir las etapas reactivas
se llevó a cabo mezclando con anticipación un anticuerpo
biotinilado, avidina, y una enzima biotinilada utilizándolos en
forma de anticuerpo de enzima marcada, esto es, un complejo de
enzima biotinilada de anticuerpo-avidina
biotinilados. Sin embargo, la reactividad desciende de forma
considerable, o la estabilidad se reduce de manera perceptible, y
por consiguiente, no puede utilizarse como reactivo tal como es.
La reacción avidina-biotina se
aplica, además de al inmunensayo, a un análisis de ADN o de ARN
mediante una sonda de ADN (Methods in Enzymology [Procedimientos en
Inmunología] Vol. 184, p. 560-617), o en un análisis
de receptor-ligande. La aplicación de la reacción
de avidina-biotina en los análisis anteriores tiene
desventajas similares a las encontradas en los inmunoanálisis.
{En Reznik et al., (Nature
Biotechnology) [Biotecnología Natural] 1996 Vol. 14, páginas
1007-1011 [Nature Biotechnology (1996), Vol. 14,
pages 1007-1011], se describen ciertas
estreptavidinas reticuladas intersubunidades. El documento
CN-A-1142610 se refiere a un
determinado procedimiento para analizar interacciones no covalentes
entre compuestos biológicos que comprende el empleo de activos de
biotina e isótopos radioactivos para marcar componentes y la
adición de líquido seguido por avidina o seudoestreptavidina de
enlaces transversales de forma covalente sobre un soporte sólido.
En Liu et al, Analytical Chemistry [Química Analítica] (1995)
Vol. 67, No. 10, páginas 1679 a 1683, [Analytical Chemistry (1995)
Vol. 67, No. 10, pages 1679 to 1683], se describe un sensor
específico para benzonitrilo de microelectrodos de carbono vítreo de
nitrilasa modificada. El documento
US-A-4,282,287 divulga un
determinado proceso de múltiples capas para aplicar sobre una
superficie sólida, de forma alternada, en capas sucesivas, la
proteína, avidina y un material dilatador que contiene biotina. En
Wink et al., Analytical Chemistry [Química Analítica] (1998)
Vol. 70, No. 5, páginas 827 a 832 [Analytical Chemistry (1998) Vol.
70, No. 5, pages 827 to 832], se describe un aumento liposómico
específico de la sensibilidad en inmunoanálisis de proteínas y
péptidos en espectrometría de resonancia de plasmón de
superficie}.
De acuerdo con ello, el objeto de la presente
invención es poner remedio a las desventajas mencionadas de la
técnica anterior y proporcionar un análisis rápido, cómodo y preciso
con un número pequeño de etapas del procedimiento.
La presente invención se refiere a un complejo
de biotina-avidina-biotina que
comprende al menos dos sustancias biotiniladas las cuales son las
mismas o diferentes, y una avidina reticulada emparedada entre
ellas, en el que la avidina reticulada es un monómero de avidina
reticulaa compuesto por una molécula de avidina o un polímero de
avidina reticulada compuesto por moléculas de avidina plurales que
están unidas entre sí mediante reticulación intermolecular.
En el complejo de
biotina-avidina-biotina de la
presente invención, al menos una de las sustancias biotiniladas es
preferentemente un componente de unión biotinilado, y al menos una
de las sustancias biotiniladas es preferentemente una sustancia de
marcado biotinilada.
Así mismo, la presente invención se refiere a un
proceso para preparar el complejo de
biotina-avidina-biotina, que
comprende las etapas de:
- 1)
- tratar una avidina con un agente formador de reticulación para preparar una avidina reticulada,
- 2)
- biotinilar las mismas o diferentes sustancias que van a ser biotiniladas para preparar las mismas o diferentes sustancias biotiniladas, y
- 3)
- unir la avidina reticulada y las mismas o diferentes sustancias biotiniladas para formar el complejo biotinia-avidina-biotina.
Así mismo, la presente invención se refiere a un
procedimiento de análisis en el que se utiliza el actual complejo
biotina-avidina-biotina.
Así mismo, se describe en la presente memoria un
procedimiento de análisis caracterizado porque se utilizan 1) un
componente de unión biotinilado, 2) una avidina reticulada y 3) una
sustancia de marcado biotinilada.
Así mismo, se describe en la presente memoria un
procedimiento para analizar un compuesto que va a ser analizado
caracterizado porque 1) una muestra que contiene posiblemente el
compuesto que va a ser analizado, un componente de unión
biotinilado capaz de unirse específicamente al compuesto que va a
ser analizado, una avidina reticulada, y una sustancia de marcado
biotinilada son puestos en mutuo contacto en cualquier orden
secuencial para formar un complejo del compuesto que va a ser
analizado, el componente de unión biotinilado, la avidina
reticulada, y la sustancia de marcado biotinilada; y 2) analizar
una señal derivada de la sustancia de marcado del complejo.
Así mismo, se describe en la presente memoria un
equipo de análisis caracterizado por contener una avidina reticulada
y un agente biotinilador.
Así mismo, se describe en la presente memoria un
equipo de análisis caracterizado por contener
- 1)
- un componente de unión biotinilado,
- 2)
- una avidina reticulada, y
- 3)
- una sustancia de marcado biotinilada.
El término "de análisis" o "análisis"
tal como se utiliza en la presente memoria, se aplica a un análisis
de unión en el que se utilizan las propiedades de dos compuestos
uniéndose específicamente entre sí, correspondiendo uno de los dos
compuestos a un compuesto elegido como objetivo, que va a ser
analizado, y a continuación el compuesto elegido como objetivo es
analizado, utilizando un "componente de unión" capaz de unirse
específicamente al compuesto elegido como objetivo que va a ser
analizado. Como combinación de los dos compuestos que
específicamente se unen entre sí, puede mencionarse una combinación
de un antígeno y un anticuerpo, una combinación de un ADN y un ADN
o ARN complementario de aquél, una combinación de un ARN y un ADN o
ARN complementario de aquél, una combinación de una receptor y un
ligante del mismo, como por ejemplo una hormona, citocina,
neurotransmisor, o lectina, una combinación de una enzima y un
ligante de aquella, como por ejemplo un sustrato análogo de la
enzima, una coenzima, un factor regulador, o un inhibidor, una
combinación de un análogo de enzima y un sustrato para una enzima
que es origen del análogo de enzima y una combinación de un azúcar y
una lectina. El análogo de enzima es un compuesto que tiene una
alta afinidad con un substrato de la enzima original pero que no
muestra ninguna actividad catalítica.
La Figura 1 es un gráfico que muestra los
resultados obtenidos mediante la medición AFP de acuerdo con un
ELISA utilizando una estreptoavidina reticulada.
La Figura 2 es un gráfico que muestra los
resultados obtenidos por la medición AFP de acuerdo con un ELISA
utilizando una estreptoavidina no reticulada.
El complejo
biotinia-avidina-biotina de la
presente invención contiene dos o más sustancias biotiniladas que
son las mismas o diferentes entre sí, y una avidina reticulada
emparedada entre ellas. La avidina reticulada está unida a cada una
de las sustancias biotiniladas mediante una unión de una reacción de
biotina-avidina.
La avidina que puede utilizarse en la presente
invención es cualquier avidina que se una con la biotina, por
ejemplo, una avidina de la clara de huevo, una estreptoavidina, una
avidina preparada por una técnica de manipulación genética, esto
es, una avidina recombinante, o similares.
La avidina es una proteína compuesta de cuatro
idénticas subunidades. La subunidad tiene un emplazamiento de unión
con la biotina, y una molécula de avidina puede unirse con cuatro
moléculas de biotina. Las subunidades están unidas entre sí
mediante una unión covalente. Es sabido que, cuando la avidina es
calentada a una temperatura elevada, se escinde en cada
subunidad.
En la avidina reticulada, existe reticulación al
menos entre subunidades, esto es, reticulación intramolecular. La
avidina reticulada puede ser un monómero de avidina reticulada
compuesto por una molécula de avidina, y un polímero de avidina
reticulada compuesto por moléculas de avidina plurales que se unen
entre sí mediante reticulación intermoleculares.
La avidina reticulada puede ser preparada
mediante el tratamiento de la avidina con un agente de enlace
transversal. El agente de enlace transversal que puede utilizarse
es, por ejemplo, un agente de reticulación para unir dos grupos de
amino, como por ejemplo glutaral, disuccinimida,
dimetilpimelimidato, o dimetilsuberimidato, o un agente de
reticulación para unir un grupo de amino y un grupo de carboxilo,
por ejemplo, varias carbodiimidas, como por ejemplo
1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo)
carbodiimida.
La sustancia biotinilada usada en la presente
invención se prepara biotinilando cualquier sustancia que va a ser
biotinilada. La sustancia que va a ser biotinilada no está
concretamente limitada, en tanto en cuanto, pueda ser biotinilada y
la sustancia biotinilada resultante se una con la avidina reticulada
mediante la reacción biotina-avidina. La sustancia
que va a ser biotinilada puede ser cualquier sustancia de una
solución, por ejemplo, una sustancia de marcado utilizada para
marcar un anticuerpo o un antígeno en un inmunoensayo convencional,
o un componente de unión que puede ser biotinilado.
Como sustancia de marcado, puede mencionarse,
por ejemplo, una enzima, una sustancia fluorescente o una proteína
fluorescente de sustancia de unión, o una sustancia luminiscente, o
una proteína luminiscente de sustancia de unión, o un isótopo
radioactivo.
La enzima puede ser, por ejemplo, luciferasa,
fosfatasa alcalina, peroxidasa,
\beta-D-galactosidasa,
glucoquinasa, hexoquinasa, o
glucosa-6-fosfato de dehidrogenasa
(G6PDH).
La sustancia fluorescente puede ser por ejemplo,
fluoresceína, rodamina, dansilcloruro, fluoronitrobenzofurazano,
quelato de europio, o quelato de samario.
La proteína fluorescente de sustancia de unión
puede ser, por ejemplo, una proteína a la cual se unen y sobre la
cual se acumulan sustancias fluorescentes.
La sustancia luminiscente puede ser, por
ejemplo, un éster de acridinio, adamantil-dioxano, o
isolumina; y la proteína luminiscente de sustancia de unión puede
ser, por ejemplo, una proteína a la cual se han unido y sobre la
cual se han acumulado sustancias luminiscentes.
El isótopo radioactivo puede ser, por ejemplo,
^{32}P, ^{35}S, ^{125}I, o ^{3}H.
La enzima biotinilada que puede utilizarse en la
presente invención es, por ejemplo, una enzima biotinilada, como
por ejemplo luciferasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa, o
\beta-D-galactosidasa.
La enzima biotinilada puede ser preparada, por
ejemplo, mediante un procedimiento de modificación química o un
procedimiento de manipulación genética. El procedimiento de
modificación química comprende unir químicamente la biotina a un
grupo de aminoácidos de una enzima.
El procedimiento de manipulación genética
comprende expresar una proteína fusionada de una enzima y una
biotina y un aceptor de la biotina dentro de una célula anfitrión
para obtener una enzima biotinilada. El procedimiento de
manipulación genética es preferente para una enzima, como por
ejemplo una luciferasa, la cual es lábil a una modificación
química. El aceptor de la biotina consiste en una proteína que
contiene una secuencia de aminoácidos concreta a la cual se añade
la biotina dentro de una célula anfitrión. Un gen que contiene una
secuencia que codifica la proteína del aceptor pueden seleccionarse
de acuerdo con la aplicación de la misma.
Cuando un gen que contiene un gen de enzima
(como por ejemplo un gen de luciferasa) y un gen aceptor de la
biotina ligado a aquél se expresa en una célula anfitrión, una
proteína fusionada del aceptor de la enzima-biotina
es sintetizada en la célula anfitrión entonces la biotina se une a
la proteína fusionada por la acción de la célula anfitrión, y así
puede obtenerse una enzima biotinilada, esto es, una proteína
fusionada de aceptor de la enzima-biotina
biotinilada.
De las sustancias de marcado biotiniladas que
pueden utilizarse en la presente invención, las sustancias distintas
a la enzima biotinilada pueden prepararse de acuerdo con
procedimientos que en sí mismos son conocidos.
El componente de unión del componente de unión
biotinilado que puede utilizarse en la presente invención no está
particularmente limitado, en tanto en cuanto pueda ser biotinilado,
y pueda unirse específicamente con un compuesto que va a ser
analizado. Como componente de unión, pueden mencionarse, por
ejemplo, a) una proteína, como por ejemplo un anticuerpo que puede
ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, un
fragmento de anticuerpo [como por ejemplo, Fab, Fab',
F(ab')_{2'}, o Fv] un antígeno proteínico, un receptor, una
hormona proteínica, una citosina, una lectina, una enzima, o un
análogo enzimático; b) un ácido nucleico como por ejemplo un ADN o
un ARN; o c) un compuesto distinto de una proteína o de un ácido
nucleico, como por ejemplo un antígeno no proteínico, una hormona
no proteínica, un ligante con una enzima (como por ejemplo un
sustrato análogo a una enzima, una coenzima, un factor de
transcripción, o un inhibidor), un sustrato de una enzima original
de un análogo enzimático o un
azúcar.
azúcar.
El componente de unión biotinilado que puede
utilizarse en la presente invención y que contiene el componente de
unión proteínico (como por ejemplo un anticuerpo, un fragmento de
anticuerpo, un antígeno proteínico, un receptor, una hormona
proteínica, una citosina, una lectina, una enzima o un análogo
enzimático) puede prepararse introduciendo biotina dentro del
componente de unión de acuerdo con los procedimientos descritos en
conexión con la enzima biotinilada, esto es, el procedimiento de
modificación química o el procedimiento de manipulación
genética.
El componente de unión biotinilado que puede
utilizarse en la presente invención y que contiene el componente de
unión del ácido nucleico (como por ejemplo un ADN o un ARN) puede
prepararse introduciendo biotina dentro del componente de unión de
acuerdo con los procedimientos que son en sí mismos conocidos. Los
procedimientos conocidos, son, por ejemplo, un procedimiento en el
que una traslación de muesca o una primera enlongación se lleva a
cabo bajo la condición de que uno de los cuatros nucleótidos sea
sustituido por un nucleótido biotinilado, como por ejemplo un dUTP
o un UTP biotinilado, o un procedimiento en el que la síntesis del
ADN se lleve a cabo con la condición de que uno de los cuatro
nucleótidos sea sustituido por un nucleótido aminado, como por
ejemplo un amino-7-dUTP, y el ADN
modificado resultante sea sometido a reacción por un derivativo de
la biotina apropiado.
Cuando la dUTP biotinilada o la UTP biotinilada
que se utiliza en la traslación de muesca o en la primera
enlongación, como por ejemplo, es comercialmente disponible un
nucleótido que contiene la biotina unida al átomo de
carbono-5 del anillo de la pirimidina de la dUTP o
de la UTP mediante un enlace, y así puede ser utilizado.
El componente de unión biotinilado que puede
utilizarse en la presente invención y que contiene un compuesto
distinto de una proteína o de un ácido nucleico puede prepararse
introduciendo la biotina en el componente de unión de acuerdo con
procedimientos que son en sí mismos conocidos.
Una combinación de las sustancias biotiniladas
del complejo
biotina-avidina-biotina de la
presente invención no está particularmente limitada, siempre que el
complejo contenga al menos dos sustancias biotiniladas que pueden
ser las mismas o diferentes entre sí, y una avidina reticulada
emparedada entre ellas. La combinación puede ser, por ejemplo, una
combinación de un componente de unión biotinilado y una sustancia de
marcado biotinilada, una combinación de un componente de unión
biotinilado y el mismo o diferente componente de unión biotinilado,
o una combinación de una sustancia de marcado biotinilada y una
misma o diferente sustancia de marcado biotinilada. Es preferente
la combinación del componente de unión biotinilado y la sustancia de
marcado biotinilada.
Un componente de unión biotinilado preferente
que se utiliza en la presente invención contiene una biotina dentro
de una molécula, esto es, una molécula de biotina por molécula de
componente de unión. En una forma de realización preferente en la
presente invención, puede utilizarse un fragmento Fab' de anticuerpo
como componente de unión biotinilado. El fragmento Fab' de
anticuerpo biotinilado puede prepararse introduciendo
covalentemente una molécula de biotina dentro de un fragmento Fab'
de anticuerpo obtenido a partir de un anticuerpo (el cual puede se
un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal) que
específicamente se une a un compuesto que va a ser
analizado.
analizado.
El fragmento Fab' de anticuerpo debe prepararse
digiriendo un anticuerpo con pepsina, y reduciendo el fragmento
F(ab')_{2} de anticuerpo resultante con un agente reductor,
como por ejemplo \beta-mercaptoetanol o amina de
mercaptoetilo. Más concretamente, existe una unión
S-S que conecta dos cadenas gruesas en la región de
bisagra de una molécula del anticuerpo. La digestión con pepsina
tiene lugar corriente abajo de la unión S-S sobre
el extremo C, y así la unión S-S permanece en la
región extremo C del fragmento F(ab')_{2} de anticuerpo.
Cuando la unión S-S es reducida con un agente
reductor, dos moléculas de un fragmento Fab' de anticuerpo se
forman a partir de una molécula del fragmento F(ab')_{2}
de anticuerpo. El fragmento Fab' de anticuerpo resultante contiene
un grupo SH en la región extremo C, respectivamente.
El fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado que
tiene una molécula de biotina por molécula de fragmento Fab' de
anticuerpo puede prepararse haciendo reaccionar el fragmento Fab' de
anticuerpo resultante, que tiene un grupo SH, con un derivado de la
biotina que tiene un grupo maleimida.
El antígeno biotinilado que puede utilizarse en
la presente invención es preferentemente un producto preparado
introduciendo covalentemente una molécula de biotina en un antígeno.
El antígeno biotinilado puede prepararse de acuerdo con los
procedimientos descritos en conexión con la enzima biotinilada, esto
es, el procedimiento de modificación química o el procedimiento de
manipulación genética.
El complejo de
biotina-avidina-biotina de la
presente invención puede prepararse de acuerdo con, sin que ello
suponga limitación, por ejemplo, el proceso de preparación de la
presente invención. De acuerdo con el proceso de preparación de la
presente invención, la avidina reticulada, y los mismos o diferentes
productos biotinilados son preparados separadamente de antemano
concurrente o secuencialmente para formar el complejo de
biotina-avidina-biotina de la
presente invención.
El complejo de
biotina-avidina-biotina de la
presente invención puede utilizarse, por ejemplo, en el
procedimiento de análisis de la presente invención. En la presente
invención un producto biotinilado apropiado, concretamente un
componente de unión biotinilado, puede seleccionarse de acuerdo con
un compuesto que va a ser analizado. Por ejemplo, cuando un
antígeno es un compuesto que va a ser analizado, un anticuerpo
biotinilado o un fragmento de anticuerpo biotinilado puede
utilizarse introduciendo la biotina en un anticuerpo o en un
fragmento de anticuerpo que específicamente reaccione con el
antígeno. Cuando un anticuerpo es un compuesto que va a ser
analizado, puede utilizarse un antígeno biotinilado preparado
introduciendo biotina en un antígeno reconocido por el anticuerpo.
Cuando un ADN o un ARN es un compuesto que va a ser analizado, puede
utilizarse un ADN biotinilado o un ARN biotinilado preparado
introduciendo biotina en un ADN o ARN complementario en el ADN o
ARN que va a ser analizado. Cuando un receptor es un compuesto que
va a ser analizado, puede utilizarse un ligante biotinilado
preparado utilizando biotina en un ligante del receptor. Cuando un
ligante de un receptor es un compuesto que va a ser analizado,
puede utilizarse un receptor biotinilado preparado introduciendo
biotina en un receptor del ligante. Cuando una enzima es un
compuesto que va a ser analizado, puede utilizarse un ligante
biotinilado preparado utilizando biotina en un ligante de la enzima.
Cuando un ligante de una enzima es un compuesto que va a ser
analizado, puede utilizarse una enzima biotinilada preparada
utilizando biotina en una
enzima.
enzima.
La presente invención, esto es, el
procedimiento de análisis, y el equipo de análisis en el que puede
emplearse el presente complejo de
biotina-avidina-biotina de la
presente invención, se describirán con mayor detalle a continuación
en la presente memoria principalmente como formas de realización en
las que se utilice el fragmento Fab' de anticuerpo, como componente
de unión biotinilado, y la enzima biotinilada se utilice como
sustancia de marcado biotinilada.
Por ejemplo, el anticuerpo de enzima marcada
puede obtenerse mezclando, en una proporción adecuada, 1) el
fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado, 2) la avidina de enlaces
transversales, y 3) la enzima biotinilada, preparadas cada una de
antemano de acuerdo con el procedimiento anteriormente mencionado,
manteniendo al tiempo una actividad de la enzima y una actividad
del anticuerpo.
Así mismo, 1) el fragmento Fab' de anticuerpo
biotinilado, 2) la avidina reticulada, y 3) la enzima biotinilada
pueden utilizarse separadamente. Por ejemplo, después de hacerse
reaccionar el excipiente de anticuerpo-inmovilizado
y un compuesto (un antígeno) que va a ser analizado,
- a)
- los tres reactivos 1) a 3) anteriormente mencionados se añaden en orden secuencial según lo expuesto para desarrollar las reacciones en tres etapas,
- b)
- una mezcla preparada de antemano a partir del fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado y de la avidina reticulada se hace reaccionar entre ellos, y a continuación se hace reaccionar la enzima biotinilada para de esta forma desarrollar las reacciones en dos etapas, o
- c)
- se hace reaccionar el fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado, y a continuación se hace reaccionar una mezcla preparada de antemano a partir de la avidina reticulada y la enzima biotinilada, para desarrollar las reacciones en dos etapas.
El modo de empleo de los tres agentes expuestos,
esto es, si los reactivos se utilizan después de formarse de
antemano la mezcla de los mismos, o se utilizan separadamente, puede
ser adecuadamente seleccionado de acuerdo con un procedimiento de
medición utilizado.
El procedimiento de análisis de la presente
invención puede aplicarse en un inmunoensayo convencional, como por
ejemplo un procedimiento sándwich o un procedimiento competitivo,
sin ninguna modificación, excepto porque pueden utilizarse 1) el
fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado, 2) la avidina reticulada,
y 3) la enzima biotinilada.
Por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de
análisis de la presente invención en el que se utiliza el
anticuerpo marcado con enzima preparado mezclando, en las
proporciones adecuadas 1) el fragmento Fab' de anticuerpo
biotinilado, 2) la avidina reticulada, y 3) la enzima biotinilada en
el procedimiento sándwich, se inmoviliza sobre un vehículo
insoluble apropiado un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (un
primer anticuerpo) que hace reaccionar un compuesto que va a ser
analizado en un epítope diferente del reconocido por el fragmento
Fab' de anticuerpo biotinilado. A continuación, una superficie del
excipiente insoluble es revestida con un agente de bloqueo
apropiado, como por ejemplo albúmina de suero de bovino (BSA) o
gelatina, para impedir la unión no específica entre el vehículo
insoluble y una muestra. A continuación, la muestra es añadida a y
puesta en contacto con el primer anticuerpo durante un periodo de
tiempo predeterminado, por ejemplo, entre 5 minutos y 3 horas, a
una temperatura predeterminada, por ejemplo, de 4ºC a 40ºC,
preferentemente alrededor de la temperatura ambiente, para llevar a
cabo una reacción (una primera reacción). A continuación la mezcla
de los tres reactivos, esto es, el anticuerpo marcado con enzima,
es añadido y puesto en contacto con la mezcla reactiva durante un
periodo de tiempo predeterminado, por ejemplo, de 5 minutos a 3
horas, a una temperatura predeterminada, por ejemplo, de 4ºC a
40ºC, preferentemente alrededor de la temperatura ambiente, para
llevar a cabo una reacción (una segunda reacción). El conjunto es
lavado con un detergente apropiado, como por ejemplo una solución
salina fisiológica, que contenga un surfactante, y a continuación se
determina cuantitativamente una cantidad de los anticuerpos
marcados con enzima presentes en el excipiente insoluble. Una
cantidad de compuesto que va a ser analizado en la muestra puede
calcularse mediante las determinaciones resultantes.
En el procedimiento de análisis de la presente
invención, los tres reactivos pueden añadirse separadamente para
llevar a cabo las reacciones en dos o tres etapas según lo expuesto,
en vez de llevar a cabo las reacciones en una etapa añadiendo la
mezcla de los tres reactivos, esto es, el anticuerpo marcado con
enzima.
Las subunidades de la avidina reticulada
utilizadas en el procedimiento de análisis de la presente invención
están unidas covalentemente entre sí, por consiguiente, cuando el
anticuerpo marcado con enzima es preparado mezclando en la
proporción adecuada 1) el fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado,
2) la avidina reticulado y 3) la enzima biotinilada, la actividad
de la enzima y la actividad del anticuerpo pueden ser mantenidas de
forma estable. Por el contrario, la reactividad del anticuerpo
marcado con enzima convencional que contiene una avidina no
reticulada, esto es, un complejo de la enzima
biotinilada/avidina/anticuerpo biotinilado, se reduce en gran
medida como anticuerpo marcado con enzima. La razón de ello parece
ser que cuando las dos moléculas de biotina (un anticuerpo
biotinilado y la enzima biotinilada) se unen con una molécula de
avidina, se impone una fuerte tensión sobre la avidina, como en el
caso en el que se aplica una alta temperatura, y así las subunidades
se escinden entre sí.
Así mismo, cuando el fragmento Fab' de
anticuerpo biotinilado que contiene una molécula de biotina dentro
de una molécula de aquél, se utiliza junto con la enzima
biotinilada, la actividad de la enzima y la actividad del
anticuerpo pueden ser mantenidos de forma más estable. La razón de
ello parece ser que cuando un fragmento Fab' de anticuerpo, un
antígeno, o una enzima contienen varias moléculas de biotina, se
desarrollan reacciones de acoplamiento en cadena a través de las
avidinas, se forman moléculas de los anticuerpos marcados con enzima
y tienen lugar reacciones indeseables, como por ejemplo una
precipitación.
El equipo de análisis descrito en la presente
memoria contiene la avidina de enlaces transversales y el agente
biotinilador. El agente biotinilante que puede utilizarse es un
agente biotinilador convencional, como por ejemplo
N-biotinoílo-
N'-(6-maleimidahexagonoílo)-hidracida,
o N-hydroxisuccinimida
biotinoílo-\varepsilon-aminocaproato.
Un fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado y una enzima
biotinilada son preparados biotinilando, con agente biotinilador,
un fragmento Fab' de anticuerpo y una enzima dispuestos separados
del equipo de análisis pueden utilizarse en combinación con la
avidina reticulada como componente del equipo de análisis.
Además de la avidina reticulada y del agente
biotinilador, el kit de análisis puede así mismo contener la
sustancia de marcado biotinilada, como por ejemplo una enzima
biotinilada. El equipo de análisis, puede contener la avidina
reticulada, la sustancia de marcado biotinilada, y el agente
biotinilador como reactivo separado, respectivamente.
Alternativamente, el equipo puede contener estos elementos en forma
de mezcla de la avidina reticulada y de la sustancia de marcado
biotinilada, y en forma de componente único del agente
biotinilante.
El equipo de análisis puede contener, en lugar
del agente biotinilante, el fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado
y la sustancia de marcado biotinilada, como por ejemplo la enzima
biotinilada, como componentes de aquél. Más en concreto,
alternativamente, el equipo de análisis contiene 1) el fragmento
Fab' de anticuerpo biotinilado, 2) la avidina reticulada, y 3) la
sustancia de marcado biotinilada. El equipo de análisis puede
contener 1) el fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado, 2) la
avidina reticulada, y 3) la sustancia de marcado biotinilada, como
componentes separados, y como una mezcla de dos o más componentes.
Ejemplos del equipo de análisis que contiene la mezcla son un
equipo de análisis que contiene una mezcla del fragmento Fab' de
anticuerpo biotinilado, la avidina de enlaces transversales y la
sustancia de marcado biotinilada; un equipo de análisis que contiene
una mezcla del fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado, y la
avidina reticulada, y un componente único de la sustancia de
marcado biotinilada; y un equipo de análisis que contiene un
componente único del fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado, y
una mezcla de la avidina reticulada, y la sustancia de mercado
biotinilada.
El equipo de análisis puede utilizarse solo o,
si se desea, como combinación de los otros reactivos, dentro del
procedimiento de análisis de la presente invención.
Aunque la presente invención se describe
principalmente con respecto a la forma de realización en la que el
fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado se utiliza como componente
de unión biotinilado, y la enzima biotinilada se utiliza como
sustancia de marcado biotinilada, un antígeno biotinilado puede
utilizarse en lugar del fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado
para llevar a cabo la presente invención.
A continuación se describirá una forma de
realización de la presente invención en la que la enzima
biotinilada se utiliza como sustancia de marcado biotinilada.
Por ejemplo, en el procedimiento de análisis de
la presente invención en el que se utiliza el antígeno de enzima
marcada preparado mezclando en la proporción adecuada 1) un antígeno
biotinelado, 2) la avidina reticulada, y 3) la enzima biotinilada,
un antígeno puede ser analizado inmunológicamente, por ejemplo,
mediante un procedimiento competitivo. Más concretamente, un
anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (un primer anticuerpo) que
hace reaccionar un compuesto que va a ser analizado es inmovilizado
en un excipiente insoluble apropiado. A continuación, una
superficie del excipiente insoluble es revestida con un agente de
bloqueo apropiado, como por ejemplo albúmina de suero de bovino
(BSA) o gelatina, para evitar una unión no específica entre el
excipiente insoluble y una muestra. A continuación, la muestra y el
antígeno de enzima marcada, el cual es una mezcla de los tres
reactivos, son añadidos a y puestos en contacto con el excipiente
insoluble durante un periodo de tiempo predeterminado, por ejemplo,
de 5 minutos a 3 horas, a una temperatura predeterminada, por
ejemplo, de 4ºC a 40ºC, preferentemente alrededor de la temperatura
ambiente, para llevar a cabo la reacción. Cuando, el conjunto es
lavado con un detergente apropiado, como por ejemplo una solución
salina fisiológica que contenga un surfactante, se determina
cuantitativamente una cantidad de los antígenos marcados con enzima
presentes en el excipiente insoluble. Una cantidad del compuesto
que va a ser analizado en la muestra puede calcularse a partir de
las determinaciones resultantes.
En el procedimiento de análisis de la presente
invención, los tres agentes reactivos pueden añadirse separadamente
para llevar a cabo las reacciones en dos o tres etapas según lo
expuesto, en lugar de llevar a cabo las reacciones en una etapa
añadiendo la mezcla de los tres reactivos, esto es, el antígeno de
enzima marcada.
Así mismo, en lugar del fragmento Fab' de
anticuerpo biotinilado o del antígeno biotinilado, la presente
invención puede llevarse a cabo, utilizando otros componentes de
unión biotinilados, como por ejemplo un anticuerpo biotinilado, un
fragmento de anticuerpo biotinilado, un ADN biotinilado, un ARN
biotinilado, un receptor biotinilado, una enzima biotinilada, un
ligante biotinilado (incluyendo un ligante con receptor y un ligante
con una enzima), un análogo enzimático biotinilado, un producto
biotinilado introduciendo biotina en una sustancia de una enzima
original de un análogo enzimático, una lectina biotinilada, o un
azúcar biotinilado.
Así mismo, en lugar de la enzima biotinilada, la
presente invención puede llevarse a cabo utilizando otras
sustancias de marcado biotiniladas, como por ejemplo una sustancia
fluorescente biotinilada o una proteína de sustancia de unión
fluorescente biotinilada, una sustancia luminiscente biotinilada o
una proteína de sustancia de unión luminiscente biotinilada, o un
isótopo radioactivo biotinilado.
La presente invención se ilustrará de forma más
completa mediante, sin que ello suponga limitación, los siguientes
Ejemplos.
A partir de un antisuero obtenido de un conejo
inmunizado con una \alpha-fetoproteína (AFP)
humana, se obtuvo una fracción IgG de anticuerpo específica
mediante una columna de cromatografía de afinidad utilizando una
Sefarosa 4B de AFP-inmovilizada.
A la fracción IgG de anticuerpo específica
[solución tamponada (pH 4,5) de acetato 0,1 mol/l], se añadió un 2%
en peso de pepsina. La digestión se llevó a cabo en una estufa de
incubación hasta el día siguiente a 37ºC para obtener una fracción
F(ab')_{2} de fragmento de anticuerpo con un peso
molecular de 100,000 de una cromatografía en gel. La fracción
F(ab')_{2} fue dializada con una solución tamponada (pH
5,0) de acetato 50 mmol/l. A 5 mg (1 ml) de la fracción
F(ab')_{2} dializada, se añadieron 50 \mul de
2-mercaptoetilamina de 0,25 mol/l [solución
tamponada (pH 5,0) de acetato 50 mmol/1]. La reducción fue llevada a
cabo a 37ºC durante 90 minutos. La mezcla reactiva resultante fue
aplicada a una columna de Sephadex G-25 (1,5 x 13
cm) que había sido equilibrada con una solución tamponada (pH 7,0)
de fosfato 50 mmol/l conteniendo ácido etilenediaminetetraacético
(EDTA), de 1 mmol/l, y a continuación se mezcló una fracción eluída
de un fragmento Fab' de anticuerpo en un volumen vacío.
A la fracción del fragmento Fab' de anticuerpo,
se añadieron 0,4 mg de
N-biotinoílo-N'-(6-maleimidehexagonoílo)-hidracida
disueltos en 0,1 ml de dimetilformamida. La mezcla se dejó reposar
hasta la mañana siguiente a temperatura ambiente, y a continuación
se aplicó a una columna Sephadex G-25 (1,5 x 13 cm)
que había sido equilibrada con una solución salina fisiológica. Se
mezcló un fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado en un volumen
vacío.
A 1 mg de estreptoavidina purificada disuelta en
1 ml de solución tamponada (pH 7,0) de fosfato 0,1 mol/l, se
añadieron 20 \mul de una solución de glutaral al 1% [solución
tamponada (pH 7,0) de fosfato 0,1 mol/l]. El conjunto fue mezclado
y dejado reposar a 4ºC durante 16 horas. A la mezcla reactiva, se
añadieron 20 \mul de una solución de borohidruro de sodio de 4
mg/ml preparada con una solución tamponada (pH 7,0) de fosfato 0,1
mol/l. La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 4
horas para reducir el aldehído. La mezcla reactiva fue aplicada a
una columna Sephadex G-25 (1,5 x 15 cm) que había
sido equilibrada con una solución de NaCl de 0,3 mol/l. Se mezcló
estreptoavidina reticulada eluída en un volumen vacío.
Dentro de cada pocillo de una placa blanca de 96
pocillos, se vertieron 100 \mul de un anticuerpo monoclonal de
anti-AFP (Oriental Yeast Col., Ltd.) ajustado a 5
\mug/ml con una solución tamponada de (pH 9,5) de carbonato de 50
mmol/l. El revestimiento se llevó a cabo sacudiendo la mezcla a 37ºC
durante 2 horas, y a continuación los pocillos se lavaron con una
solución de lavado [solución tamponada (pH 7,5) de
tris-HCl de 20 mmol/l conteniendo Tween 20 al
0,1%]. La placa fue utilizada en el siguiente procedimiento.
El fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado (una
concentración final = 0,1 \mug/ml) preparada en el Ejemplo 1; 1),
la estreptoavidina reticulada (una concentración final = 1,2
\mug/ml) preparada en el Ejemplo 1; 2) y una proteína fundida de
aceptor de la luciferasa-biotina (Kikkoman Cor.)
(una concentración final = 0,07 \mug/ml) fueron mezclados en una
solución tamponada (pH 7,5) de HEPES de 50 mmol/l conteniendo un 5%
de glicerol, un 1% de albúmina de suero de bovino (BSA), y un EDTA
de 1 mmol/l, y el conjunto se dejó reposar a temperatura ambiente
durante 2 horas. La mezcla resultante se utilizó como anticuerpo
marcado con enzima en el siguiente procedimiento.
Dentro de cada pocillo revestido con los
anticuerpos, se vertieron 100 \mul de soluciones AFP estándar,
que habían sido diluidas en concentraciones predeterminadas (1
pg/ml, 10 pg/ml y 100 pg/ml) con una solución marcado con enzima
reactiva (la solución de lavado anteriormente mencionada conteniendo
0,15 mol/l de NaCl), y la reacción se llevó a cabo sacudiendo la
mezcla a 37ºC durante 1 hora. Después de lavar el pocillo con la
solución de lavado cuatro veces, se vertieron dentro de cada pocillo
100 \mul del anticuerpo marcado con enzima preparado en el
Ejemplo 1; 4) y la reacción se llevó a cabo sacudiendo la mezcla a
37ºC durante 1 hora. Después de lavar el pocillo con la solución de
lavado cuatro veces, la placa fue situada en un detector de
emisiones. Como sustancia, se añadieron 100 \mul de una solución
tamponada (pH 7,5) HEPES de 50 mmol/l conteniendo 0,2 mg/ml de
luceferina, 40 mmol/l de ATP, y 150 mmol/l de MgSO_{4}, y a
continuación se midió cada cantidad acumulativa de luminiscencia
durante 10 segundos.
Los resultados se muestran en la Figura 1. Como
se evidencia a partir de la Figura 1, la respuesta de la cantidad
de luminiscencia se obtuvo cuando la concentración de AFP era muy
baja.
De acuerdo con lo antes descrito, se encontró
que el fragmento Fab' de anticuerpo biotinilado puede ser unido de
manera estable a la enzima biotinilada, utilizando estreptoavidina
tratada con un agente reticulado.
Ejemplo Comparativo
1
Como Ejemplo comparativo, el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1 4) y Ejemplo 1 5) se repitió excepto en
que se utilizó avidina sin un tratamiento reticulado en lugar de
estreptoavidina reticulada preparada en el Ejemplo 1 2). Los
resultados se muestran en la Figura 2. Como se evidencia en la
Figura 2, se obtuvo escasa respuesta de luminiscencia en relación
con una cantidad de AFP. Se encontró que, cuando se utilizó la
estreptoavidina no reticulada, el fragmento Fab' de anticuerpo
biotinilado no podía encontrarse en la enzima biotinilada.
De acuerdo con la presente invención, un
compuesto que va a ser analizado puede ser rápida, cómoda y
precisamente analizado aprovechando al tiempo la reacción
avidina-biotina.
Claims (10)
1. Un complejo de
biotina-avidina-biotina que
comprende al menos dos sustancias biotiniladas que son idénticas o
diferentes, y una avidina reticulada emparedada entre ellas, en el
que la avidina reticulada es un monómero de avidina reticulada
compuesto por una molécula de avidina o polímero de avidina de
enlaces transversales compuesto por una pluralidad de moléculas de
avidina que están unidas entre sí mediante reticulación
intermolecular.
2. El complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con la reivindicación 1, en el que al menos una de dichas
sustancias biotiniladas es un componente de unión biotinilado y al
menos una de dichas sustancias biotinaladas es una sustancia de
marcado biotinilada.
3. El complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con la reivindicación 2, en el que dicho componente de unión es un
anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un antígeno, una ADN, un
ARN, un receptor, un ligado a un receptor, una enzima, un ligado a
una enzima, un análogo de enzima, un sustrato para una enzima que
es un origen de un análogo de enzima, una lectina o un azúcar.
4. El complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con la reivindicación 3, en el que dicho fragmento de anticuerpo es
Fab'.
5. El complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha
sustancia de marcado biotinilada es una enzima biotinilada, una
sustancia fluorescente biotinilada, una proteína unida a una
sustancia fluorescente biotinilada, una sustancia luminiscente
biotinilada, una proteína unida a una sustancia luminiscente
biotinilada o un isótopo radioactivo biotinilado.
6. El complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con la reivindicación 5, en el que dicha enzima biotinilada es una
proteína de fusión biotinilada de una enzima y de un aceptor de la
biotina.
7. El complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con la reivindicación 5, en el que dicha enzima biotinilada es una
luciferasa biotinilada.
8. El complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha
avidina reticulada es una avidina de clara de huevo reticulado, una
estreptoavidina reticulada o una avidina recombinante
reticulada.
9. Procedimiento para preparar el complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo las
etapas de:
- 1)
- tratar una avidina con un agente reticulante para preparar una avidina reticulada;
- 2)
- biotinilar las mismas o diferentes sustancias que van a ser biotiniladas para preparar las mismas o diferentes sustancias biotiniladas; y
- 3)
- unir dicha avidina reticulada y dichas mismas o diferentes sustancias biotiniladas para formar dicho complejo de biotina-avidina-biotina de acuerdo con la reivindicación 1.
10. Procedimiento de análisis, en el que se
utiliza el complejo de
biotina-avidina-biotina de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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