JPH07507388A - 生物流体中のリガンドの量を測定する方法及びその様な方法を実施する為のキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　生物流体中のりカントの量を測定する方法及びその様な方法を実施 する為のキット本発明は生物流体中の試料中のりガント（蛋白質と特異的に結合 する物質）の量を測定する方法に間する。この方法では、＊ｉｌｌ定リガシリガ ントしている生物流体が溶解されたりガント誘導体の存在下で培養される。その 溶解されたリガント誘導体は、被測定リガンドとりガント誘導体とが標識された 特異的バインダーに対し競争しりカント誘導体が不溶形に変換されるように、被 測定リガントとりカント誘導体の両方に結合する標識された特異的なバインダー の化学量論量未満を有する液相中で不溶形に変換することが出来る。モして液相 に残っている検定システムの成分から検定システムの不溶成分を分離した後に、 生物流体中の被測定リガントの量が、リガント誘導体に結合する標識された特異 的バインダーの量から計算される。本発明はまたそのような方法を実施する為の キットにも関する。

本発明は、特に−価のりカント、即ち一価の抗原又はハブテンを表わしているリ ガントの測定の為の述べられた種類の方法に間するものである。その−価のりカ ントとは特異的なバインダーパートナ−によって免疫的に結合されるための結合 場所を一つしか有さないものである。

そして本発明は、好ましくは特にそのようなリガントの遊離のものの割合を測定 する方法に関する。即ちリガント、例えばホルモンは一部は生理学的結合タンパ ク質に結合した杉で、そして一部は非結合、即ち遊離形で生物流体中に存在して いるということである。そして本発明の方法の目的はこの遊離の割合を定量的に 測定することである。しかしながら本発明に従う方法は、生理学的結合タンパク 質に一部が結合していないリガンドの測定にも使用することが出来、モして又特 定の場合に於ては、多価のリガンド、即ち特異的な結合パートナ−に対する一つ を越える結合場所を有しているリガンドの測定の為にも有利なものでありえる０ 例えばこれらのリガンドに対する異なる抗体の回収が困難である時のリガントの 測定にも使用できる。

本発明に従う方法は、標識された抗体（標識された特異的バインダー旧が使用さ れ、イミュノメトリックアッセイとも呼ばれている免疫検定法の一つである。そ のような方法は競争的方法と呼ばれているタイプに属している。被測定リガンド の全量がサンドイッチ中に結合されている典型的なサンドイッチ方法とは対照的 に、標識された結合パートナ−のある割合が被測定リガンドに結合され、そして 別の割合が競争するこのリガントの誘導体に結合されている０種々の形式のイミ ュノメトリックアッセイについての更に別の記載はＥＰ−８−８９８０６の紹介 に見出され、ここては、ＥＰ−８−１０３６０５と同じ様に、リガントの遊離し たものの割合の測定の為のイミュノメトリックアッセイのやり方が記載され、こ の方法はいわゆるアナログトレーサー検定法としてＥＰ−８−２６１０３に記載 されている。

リガンド、特に例えば甲状腺ホルモンなとの一価のりガントの遊離形の割合を測 定する為の本発明に従う種類のイミュノメトリソク方法においては、被測定リガ ンド及び既知の量のりガント誘導体が、本発明の基づいている上に記載した基本 的な方法に従い標識化された抗体の過剰に対し競争させられる。標識された抗体 は本質的に完全に遊離のりガント及びリガンド誘導体に結合されており、そして 二つの結合パートナ−にわたる標識された抗体の分配は試料中のりカントの測定 される濃度を反映している。リガントの測定されるべき１度についての情報及び 被測定リガントとりカント誘導体上の標識化抗体の分布についての情報を得る為 に、リガント誘導体と標識化された抗体の反応生成物が残りの検定溶液から分離 される為に固定されるのが好ましく、これはＥＰ−Ｐ−１０３ｆ３０５に１にう と、標識化抗体と共に培養する前又は後にリガント誘導体を不溶形に変換するこ とによって実施される。

実施するのに今日まで一般に採用されている手順は、最初から固体の基体に結合 されて固定されている形態のリガント誘導体形を使用することであった。

このｎｃｏ方法の具体例はＥ　ＰＡ　−３０３２８４及びＥ　Ｐ　−Ａ　−３２ ４５４０である５ ＥＰ−Ａ−１４９６３１に記載されているタイプの方法型では、検定方法の慣用 の成分のほかにリガント誘導体に対する外来のバインダーが使用される。リガン ド誘導体に対するこの外来のバインダーは、リガント誘導体に対し特異的な別の 抗体であり得る。その機能はりカント誘導体に対しある種の縁上な形成すべきも のである。ＥＰ−Ａ−１４９６３１に議論された方法に於て、りカント誘導体は 化学的に修飾されたリガンドであって、ハブテン性を有しており、従って一価の ものであるから、ＥＰ−Ａ　−１４９６３１に従う方法では、外来のバインダー は固定物とは結合せず、測定中に複合体が形成され、その複合体はリガント誘導 体と標識化された抗体からなっている。

ＥＰ−Ａ−１０６６１５に従う遊離の物質の測定の為の別の方法に於て、被測定 リガンドと特異的なバインダーに対するある抗体とに同時ここ結合する特異的な バインダーが使用され、そしてリガントの結合とその追加的な抗体の結合は、こ れら二つの間に競争が存在するように互に影響しあうへきである。そして抗体の 結合の程度から測定されるべき遊離のりカントの濃度を導き出すことが可能であ る。

ＥＰ−８−８９８０６又はＥＰ−８−１０３６０５又はＥＰ−Ａ−３０３２８４ 又はＥＰ−Ａ−３２４５４０に従う方法において、もし標識化された抗体に対し て、測定されるべき遊離のりガントと競争する固定されたリガント誘導体が使用 されるならば、実施に於て問題点くマトリックス効果）がしばしば生しる。そし てこの問題点は、固定されたりカント誘導体と標識化された抗体の間の反応が、 拡散工程が重要な役割を果す、モして固相の成る種のランダムな性質によってか なり決定されてしまう固相の表面に於て起きる反応であるということ実の為であ る。実際に、これらのマトリックス効果は、固定されたリガント誘導体を有して いる固体基体の個々の製造ハツチ全てがそれらの性質につき注意深く試験されな けれはならないことを意味し、しばしば廃棄物として分けなければならない没に 立たない基体が高いパーセントで出来てしまい、このことは製造工程のコストを かなり増加させ、従って最終的な検定法のコストを増加させることを意味してい る。

ＥＰ−Ａ−１０５７１４はさらに、例えばＴＳＨなとの多価のりガントが二つの 異なる抗体との反応によって完全に結合している典型的なイミュノメトリックサ ントイッチ法においては、１α相反応として実際のサンドイッチ形成を実施し、 そして次にサンドイッチ抗体の一つに対する結合パートナ−を有している同相を 加えることで反応系から形成サンドイッチを抽出することによって、必要な培養 時間を短くすることが出来ることを開示する。この方法は特定の結合パートナ− に対し少なくとも二つの結合場所を有しているリガンドの合計濃度の測定にのみ 適し・ている。

特許請求の範囲第１項の特徴前の部分に従って、生物流体の試料中のりガントの 量を測定する為の迅速かつ信頼性の有る方法を提供することが本発明の目的であ り、好ましくは一価の抗原又はハプテンの測定の為のこの種の方法を提供するこ とてあり、特に好ましくはそれらの遊離しているものの割合を測定する為の方法 を提供することである。その方法は迅速に、信頼性を持って、そして高い精度で 実施でき、そして上記の対応する慣用方法のコストあたりの効率に思影響を与え ているマトリックス問題が回避される方法である。

この目的は本発明の特許請求の範囲の特徴的な部分に述べられた構成の採用によ って、特許請求の範囲の特徴前の部分に従う方法で達成される。

この種の方法の有利でかつ好ましい具体例、及びその方法を実現するのに役立て られるキットが従属請求項に記載されている。

本発明に従う方法で採用される手順では、測定されるべき遊離のリガントの及び リガント誘導体の標識化抗体との競争反応が、タンパク質物貿の存在下で液相で 実施される。そのタンパク質は同相に結合されており、実際の免疫反応よりも遅 く非共有タンパク結合をもたらす反応中でコンジュゲートとして使用されるリガ ンド誘導体の基体タンパク質部分と特異的に結合する。このようにしてリガンド 誘導体と標識化抗体からなる免疫複合体を液体反発混合物から抽出する。

本発明に従う方法では、反応の最後には、リガント誘導体に結合する標識化抗体 は、リガント誘導体、その基体タンパク質部分、及び固定化タンパク質材料を通 じて、サンドイッチ構造の一部として固体基体に結合される。

従って慣用のサンドインチ法と対照的に、結合しているものは予定量で使用され るリガンド誘導体であり、被測定リガントではない０例えば甲状腺ホルモンのよ うな一価の抗体又はハブテン等の様な、−価のリガントの場合には、サンドイッ チ構造を造ることは通常可能ではない。

サンドイッチ構造を造ることは、リガントと基体タンパク質のコンジュゲートの 形態の、可溶リガント誘導体を使用することによって本発明の方法では許される 。遊離リガントにより結合されている標識された抗体部分は同相には固定されず 溶液中に残り、従って被測定リガントの量についての情報を提供するという点か ら、測定されるべき遊離リガンドの存在は、述べられたサンドイッチ構造の合成 の撹乱として明らかである。

本出頓に於ては、そして例えばＥＰ−Ａ−３０３２８４に於ては、リガント又は その化学的にｔ！飾された形態が、タンパク賀基体分子に共有結合されている、 リガンド誘導体とは、リガントのコンシュケートとして定義される。

立体的にかさばる基体タンパク質と、リガンドのコンジュゲートであるリガンド 誘導体とを使用することによって、リガント誘導体は、同時に、最初に記載した 先行技術の意味に於て「差別的に結合するリガンド誘導体」である、この誘導体 は生理的結合タンパク質と比較して、結合能力をかなり減少しており、従って被 測定リガンドの遊離割合のトラブルのない測定を可能としている。

本発明に従う方法に使用される標識化された抗体は、被測定リガンドとりガント 誘導体に間して測定リガンドの量を反映する程度に抗体が両方に結合するような 親和性を有するモノクローナル抗体であるのが好ましく、そして異なる親和性は 二つの結合パートナ−の比較的大きな濃度差の影響を補償することが出来るもの であり得る。

遊離のチロキシン（ＦＴ４）の測定の場合には例えば１０１０リツトル１モルの オーダーの会合定数を有しているモノクローナル抗体が適している。

規財としてリガンド誘導体は正常な患者からの試料で期待される測定リガンドの 量に基づいて０．５〜２０倍のモル量のオーダーで使用される０ｗ１ヒ抗体は、 試料中で期待される被測定リガントの量とリガンド誘導体のわかっている添加量 との合計に対する化学量論量未満で使用される。

本発明に従う方法は以下に詳細に記載されるが、血清中の遊離チロキシン（ＦＴ ４）の測定の為の被覆試験管試験法の形の好ましい具体例を実施例として用いる 。この方法に於て、決められた一定の量の７４−１ｇＧコンジュゲート（Ｌ−１ ｇに）と試料からの遊離の７４（Ｌ）とが、溶液中で一定量の標識化抗−Ｔ４抗 体（トレーサーＡｋ−）に対して競争する。

試験管壁土に抗１３Ｇ抗体（抗−１ｇＧ）が固定されており、これはＴ４−１ｇ Ｇコンジュゲートと結合し、従って、リガンド誘導体とトレーサーからなる免疫 複合体の一部としての、試料中に存在する遊離のＴ４のフラクションによって結 合されないトレーサ一部分とも結合していることになり、そのトレーサ一部分は Ｔ４−１ｇＧコンシュケートに結合する為にもはや利用できない、従って測定は サンドイッチ形成によってＴ４誘導体の一定量のイミュノメトリック測定がＦＴ ４Ｊ度に依存して、撹乱することに基づいている。

標識化抗体は、例えば最初に議論した先行技術の刊行物中で詳細にリストされて いる、既知のラベル又はラベル系の１丁章のもので標識出来る。特に、知られて いる放射性同位元素で、特に、ヨウ素同位元素で標識することが出来、検定法は そのときは放射性免疫検定法である。

しかし標識化成分は別の知られている標識であることもでき、例えば酵素又は螢 光性の又は好ましくは化学発光性の標識であることも出来る。

以下に詳細に図面を弁開しながら好ましい具体例について本発明に従う方法を説 明する。

図１は、試験の原理の図解を示し 図２は、本発明に従う方法の好ましい具体例中のりガント誘導体として使用され るＴ４−１８Ｇコンジユゲートの製造の為の反応混合物のＨＰＬＣゲルクロマト グラフィの溶出プロフィールを示すものであり、以下に記載された実施例中で使 用される天然の７４−１ｇＧコンジュゲートは１１分て溶出されている。

図３は、ＦＴ４の測定の為の本発明に従う方法の典型的な標準曲線を示し、そし て 図４は、本発明に従う方法の結果とＦＴ４に対する市販の検定法の結果との比較 を示す（ヘニングベルリンからのＤＹＮＯ試験Ｆ、Ｔ４）。

図１に示された一般に有効な計画に従って好ましい具体例として記載された方法 に於て、測定されるリガント、Ｔ４ウサギＩｇＧコンジュゲート溶液、及び標識 化抗Ｔ４抗体を含有している溶１αを含有している血清試料が、連続してすばや くヤギの抗ウサギ抗体で被覆した試験管中にピペットで入れられた。標識化抗Ｔ ４抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、Ｔ４−＋ｇＧコンジュゲートの 基体タンパク質部分とも試験管の被膜とも交差反応はしない。

この様にして試料からのＦＴ４は均質な液相反応中で、標識化抗−Ｔ４抗体の形 態の標識化特異的バインダーに対して、リガント誘導体としてのＴ４ウサギＩｇ Ｇコンジュゲートと競争する。よりゆっくりではあるが同時にＴ４ウサギＩｇＧ コンジュゲートは固定されたヤギ抗ウサギ抗体に結合し、そして血清試料のＦＴ ４含量に反比例して、コンジュゲートに結合した標識化抗Ｔ４抗体と結合する。

２時間項ａ後、試験管を洗浄し試験管に残っている標識化抗体をその標識に基づ いて測定する。

液相中の決定的な競争反応は液−固相反応よりも実質的により迅速に行われるの で、本発明に従うこの方法は最初に固定されたＴ４コンジュゲートが用いられる 対応する方法の基本的な反応速度論的な問題を有さない。

リガンド誘導体として使用されるＴ４ウサギＩｇＧコンジュゲートの製造に於て 、本発明に従う方法の記載されたタイプのものについては、標識化抗体による１ ４部分に間して、そしてサンドイッチの形成による固定の為のＩｇＧ祁分に間し ての両方について上記コンジュゲートの免疫学的な認識を確実にすることが必要 である。

この要求は、例えば以下の実施例におけるように、もし基体タンパク質が有意義 に変性されない穏やかな方法によって又は天然の非変性タンパク質部分を有する コンジュゲートの単離が可能な方法によってリガンド誘導体として使用されるＴ ４ウサギＩｇＧコンジュゲートが得られるならばこの要求は満たされる。

実施例 （ａ）Ｔ４ウサキＩｇＧコンシュゲートの調製５０μ）のアセトニトリル中の３ ４μｇの７４−Ｎ）Ｉｓ活性エステル（ヘニングヘルリン製）を０．５１のリン 酸緩衝液ｐＨ８，０中のｌｅｇのウサギ１ｇＧ（シグマ製）と共に室温で９０分 間培養する。　Ｔ４−ＮＨ５活性エステルと反応した天然のウサギ１８ＧはＨＰ ＬＣゲルクロマトグラフィによって単離され、従って７４−１ｇＧ集合体、未反 応Ｔ４−ＮＨ５活性エステル、及び他の反応生成物から分離される。溶出プロフ ィールの例を図２に示す−７４１ｇＧ負荷量はクロマトグラフィの間３２５及び ２８０ｎｍにおける吸収の測定を通じて、カラムの流れを連続的に測定している マルチチャンネルＵｖ吸収検出機によって決定される。

測定に於て測定当たりのＴ４ウサギＩｇＧコンジュゲートの量は、正常な患者中 の試料中のＦＴ４のモル量（２０ｐｍｏｌ／Ｉ）の最大で２０倍である。

（ｂ）標識化抗Ｔ４抗体の調製 標識化特異的バインダーとしてそれ自体は知られた方法で得られるモノクローナ ル抗Ｔ４抗体が化学発光標識としてアクリジニウムエステルと既知の反応によっ て標識化される。試験方法に於てＴ４ウサキＩｇＧコンジュゲートに対して及び ＦＴ４に対して化学量論的な量以下で標識化抗体は使用される。抗体の発光標識 化は以下の様にして実施される。

１０μｍのアセトニトリル中の１０μｍのアクリジニウムエステル（ヘキストレ ーリング社ｔｇ＞を９θμｍの燐酸緩市ｌαｐＨ８，０中で２０分間１００μｇ のモノクローナル抗Ｔ４抗体（ヘニングヘルリン社％１）と共に培養する。標識 化抗体を次にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィによって生成する。約１１ ０．０ＯＯＲＬＵ　（ヘルソルト社からのオートクリニルマットで測定）の標識 化抗体を測定当たり使用する。

（Ｃ）タンパク材料で被覆されている試験管の調製適当なポリスチレン試験管を 室温で２４時閏２．５μｇのヤギＴ４’７サキＩｇＧ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥ Ｓｉｌ　）１０．５ｍ１（７）　Ｏ，ＩＭ　Ｎａ）ＩＣＯ３，１１Ｎ　８　、０ で被覆することにより試験で使用される試験管を調製した。これに続いて傾斜、 水での洗浄、及びその後の結晶化が抑制されているソルビトールシロップ３ｘ３ 　ｍ　（にａｒｉｓｏｎ）、０．５！ＢＳＡ、及υ０．００５！ＮａＮ、での２ 時間被覆を行う、傾斜を再度実施し、試験管をその後の使用の為の貯蔵用に凍結 乾燥する。

（ｄ）検定手順 試験は（ａ）〜（ｃ）で製造した成分を用いて以下の様に実施する。

試験管当たり次のものを連続して迅速にピペットでとる。５０μｍの血清試料又 は標準、Ｔ４−１ｇＧコンジュゲート溶液、標識化抗体を含有している２００μ ｍの溶Ｉα。最後の２　ツ（１）　溶ｉｆｆ　＋、ｔ　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、 　ｐ）１７．４．１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、Ｏ，Ｉ＄ゼラチン及び０．０５％Ｎａ Ｎ３を含有している。試験管をｌ　７０　ｒ　ｐｍでＬＬながら２時間培養する 。最後に試験管をそれぞれ４×１１の洗浄溶液でＫ　７１し、そして発光社中て 測定する９図３及び４に説明される次の結果が得られる。

図３は記載された方法の平均標準曲線であり、この曲線は試験の検定間の変化を 測定することから生じるものである。

図４は本発明に従う試験と既知の市販試験（ヘニングヘルリン社からのＤＹＮＯ 試験ＦＴ４）の間の１８９人の患者の血清で得られた相関を示している。コンピ ュータープログラムを用いた評価は０．９６の係数を与えた。最適適合のライン は以下の様に計算された（本発明に従うＦＴ４試験　四ｏｆ／ｌ）　＝０．８Ｘ 　（Ｄ’Ｔ’ＮＯ試験ＦＴ４　ｐｍｏ１／Ｉ）÷１．１ｐｉｏｌ／Ｉ（ｅ）検定 法についてのある種の検定パラメーターの影響についての更に別の試験 （ｅｌ）種々の７４−１ｇＧ負荷水準において使用されるＴ４ウサギＩｇＧコン ジュゲートの量の変化の影響４つの異なるＴ４−　ｌ　ｇにコンジュゲートを合 成し、精製し、モしてＴ４負荷量を３２５ｎｍ及び２８０ｎｍの吸収を測定する ことによって決定した。下の表１は本発明に従うＦＴ４試験中で、トレーサーの 結合を達成する為に非常に少量のコンジュゲートしか要求されないことを示して いる。

表１ ｅ２）本発明に従うＦＴ４試験中で使用され抗ウサギｌ、ｇＧが被覆されている 試験管の安定性についての試験貯蔵による試験管の品質の変化を’２５１［１化 ウサギ１３Ｇ及び同量の非標識ウサギＩｇＧの過剰量で希釈されている１２５Ｉ 標識化ウサギＩｇＧとの培養によって試験した。下の表２は未希釈１２５■標識 化ウサギＩｇＧの結合に基づいた非標識ウサギ１８Ｇの存在下で見出される結合 、及びこの結合の５０の測定の分散係数を示している。

表２ この結果は高温の貯蔵温度ですら試験管が非常ζこ高０安定性を有することを示 している。これらの安定性ｔよ、Ｔ４・ＩｇＧコンジュゲートの形態の固定され たＴ４誘導体カイ壁土に存在する慣用の試験管のものよりもかなり良好である。

新たに製造された試験管のデータと比較して、これらの公知の試験管中では３７ ℃で１週間だけの貯蔵ｊ＆も力）なりの変化が起きる。これと対照的に本発明し こ従う方１去で使用された試験管は３７℃で数週、間安定である。

甲 図２ ０、　７０．　２０．　５０．　１１０−ＦＴ４　（ｐｍｏｌハ） 図４

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．生物流体試料中のリガンド（Ｌ）の量を測定する方法において、 被測定リガンド（Ｌ）を含有している該生物流体が、液相に於て、不溶形に変換 することが出来る溶解されたリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の存在下で、被測定 リガンド（Ｌ）及びリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）が標識化された特異的バイン ダー（Ａｋ■）について競争するようにそしてリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）が 不溶形に変換されるように、被測定リガンド（Ｌ）及びリガンド誘導体（Ｌ−Ｉ ｇＧ）の両方に結合する標識化された特異的バインダー（Ａｋ■）の化学量論量 未満とともに培養され、 そして、液相中に残っている検定系の成分から検定系不溶成分を分離した後に、 該生物流体中の被測定リガンド（Ｌ）の量が、リガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）に 対し結合されている標識化された特異的バインダー（Ａｋ■）の量から計算され る方法に於て、 リガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）として基体タンパク質とリガンドとのコンジュゲ ートが使用され、 該反応が該コンジュゲートのリガンド部分及び特異的バインダー（Ａｋ■）の間 の結合に影響を与えることなしにリカンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の基体タンパク 質部分に特異的に結合するタンパク質物質（抗１ｇＧ）で壁が被覆されている試 験管内で実施されることを特徴とする方法。
2. ２．リガンド（Ｌ）が一価の抗原又はハブチンであることを特徴とする請求項１ に記載の方法。
3. ３．リガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の基体タンパク質部分が免疫グロブリンであ ることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．タンパク質材科（抗ＩｇＧ）が、リガンド誘導体（Ｌ−ｌｇＧ）の基体タン パク質部分に対する抗イディオタイプ免疫グロブリン又は抗イディオタイプポリ 又はモノクローナル抗体によって形成され、そしてリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ ）の基体タンパク質部分とタンパク質材科（抗１ｇＧ）との間の結合が、リガン ド（Ｌ）又はリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）のリガンド部分と標識化特異的バイ ンダー（ＡＫ■）の間の結合よりもゆっくりと行われる請求項１、２、又は３の いずれか１に記載の方法。
5. ５．次の培養段階の順序で実施されることを特徴としている請求項１〜４のいず れか１に記載の方法。 （ａ）リガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の基体タンパク質部分と特異的に結合する タンパク質材料（抗１ｇｃ）の過剰量で試験管壁が被覆されている試験管を準備 し、（ｂ）未知の量の被測定リガンド（Ｌ）を含有している生物流体又はリカン ド（し）の標準溶液を添加し、（ｃ）リガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の既知の量 を含有している溶液又は分散液を添加し、そして （ｄ）既知の量の標識化された特異的バインダー（Ａｋ■）を含有している溶液 又は分散液を添加することを特徴とし、 そして適当な培養期間の後、液相を試験管から除去し、試験管を洗浄し、そして 次に調べている試料中の被測定リガンド（Ｌ）の量の割合を、標準試料の結果を 参照して、試験管壁に結合された標識化された特異的バインダー（Ａｋ■）の量 から決定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
6. ６．生物流体中の被測定リガンド（Ｌ）が部分的に遊離型で、そしてまた部分的 に生理学的結合タンパク質と結合した形で存在し、この方法が遊離型の割合の排 他的な測定法であり、そしてりかンド誘導体が生理学的結合タンバク質と比較し てかなり減少した結合能力しか有さないものであることを特徴とする請求項１〜 ５のいずれか１に記載の方法。
7. ７．この方法がチロキシン（ＦＴ４）の遊離割合を測定する方法であって、リガ ンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）がチロキシン−ＩｇＧコンジュゲートであり、試験管 壁に結合したタンパク質材科（抗ＩｇＧ）がリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）のＩ ｇＧ部分に対する抗イディオタイブ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃａｌ）なＩ ｇＧであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. ８．リガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）がチロキシン−ウサギＩｇＧコンジュゲート であり抗イディオタイブＩｇＧ（抗−ＩｇＧ）がヤギ抗ウサギＩｇＧ又はヤギ抗 ウサギ抗体である請求項７に記載の方法。
9. ９．使用されるリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の合計量を完全に結合するのに少 なくとも十分なタンパク質材料（抗ＩｇＧ）の量で試験管壁が被覆されており、 使用されるリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の量が普通の患者で期待される被測定 リガンド（Ｌ）の量に基づくモル量の０．５〜２０倍のオーダーの量であり、試 料中に存在する該バインダーの量と特定の親和性を表わしている、被測定リガン ド（Ｌ）及びリガンド誘導体（Ｌ−ＩｇＧ）の合計量の特定のフラクションのみ が標識化された特異的バインダー（Ａｋ■）と反応するような、化学量論量以下 の量で標識化された特異的バインダー（Ａｋ■）が使用されることを特徴とする 請求項１〜８のいずれか１に記載の方法。
10. １０．リガンド・免疫グロブリンコンジュゲートの形態のリガンド誘導体の既知 の量、標識化された抗リガンド抗体の既知の量、及びもし要求されるならば、リ かンドの標準溶液及び適当な緩衝液及び希釈溶液、並びに該リガンド誘導体の免 疫グロブリン部分に対する抗イディオタイブ免疫グロブリンの過剰で壁が被覆さ れている試験管を含有していることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１に記 載の方法を実施する為のキット。
11. １１．リガンド誘導体、標識化抗体、もし要求されるならばリガンド標準試料、 及び被覆された凍結乾燥形の試験管を含有することを特徴とする請求項１０に記 載のキット。