JPH0387662A - 生化学測定用プラスチックプレート及びその製造方法、並びにそれを用いる生化学測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生化学的測定用プラスチックプレート及びそ
の製造法、並びにこの生化学的測定用プラスチックブレ
ーｈを用いて被測定される物質を高精度に測定する方法
に関する。さらに詳しく述べれは、被測定物質の溶液濃
度を希薄にしても高精度に定量でき、医学診断に有用に
利用され得る生化学測定用プラスチックプレートに係る
ものである。

〔従来技術士３よび発明の解決しようとする課題］従来
から生化学測定用プラスチックプレー　トはイムノプレ
ートと称され、タンパク質やポリペブチラドの測定に広
く使用されている。これらのプレートは被測定物質こ物
理的なファンデル゛ノ〜ルスカによって結合し、このた
めにゾうスナックプレートに被測定物質を安定番、′強
（結合することが困難であった。そこでプレートの結合
力を改善するために、例えばポリスチレンプレートの表
面を・アミノ基やカルドキシル基で変性し、被測定物質
を安定に結合するようにしたプレートが用いられている
。しかしこのように改浮したプレー［・も１分に被測定
物質を結合することができなか・・）た。

その上、従来の生化学測定用プラスチックプレ−−で最
も困る問題は、測定において、例えはプラスチックプレ
ー−に結合した抗原に対しＣ１被測定物質の抗体を連続
的に稀釈しＣ接触しノニときに、稀釈倍数を大きくして
いくに−〕れで結合される抗体の濃度は低くなり、稀釈
のある限度範囲例えば約１５００倍までは被測定物質の
力価を−・応正確に検出できるが、しかし稀釈倍数を段
々大きくし、例えば約２００００倍以りにすると、再び
抗体の濃度の検出値が高くなり、あたかも抗体の力価が
大きくなるように検出され、実状に反するようになると
いうことである。これは従来のプラスチックプレートを
使って測定する場合、抗体の稀釈倍数ヒ吸光度との関係
を示す第２図Ｂ曲線にあられれており、稀釈倍数を大き
くするヒ、抗体が非特異的に反応するものと考え亀れる
。このような生化学測定用プラスチックプレートを用い
て臨床診断で非測定物質の血清か尿中の抗体、ホルモン
等の測定をする場合においで、小さい稀釈倍数の高濃度
範囲では使用できるが、大きい稀釈倍数の低濃度の被測
定物質（抗体）を測定するここは十分ではなかった。

このように従来の生化学測定用プラスチックプレートで
は、大きい稀釈倍数の抗体をプレートに結合した抗原に
作用させたときには非特異的に抗原に結合し、測定値が
不正確し、−なるという問題があった。また洗浄操作に
よって抗体が離脱してし。

まうため、プレートに抗原をもっと強く結合させること
ができないという問題があった。

本発明は前記従来技術の問題点に鑑みなされたもので、
抗原（又は抗体）がプラスチックプレートに強固に結合
して洗浄操作によっても抗原が離脱するとこがなく、か
つ被測定の抗体（又は抗原）のＭ釈倍数を太きくしてキ
ノ、その抗体（又は抗原）の濃度を高精度にｌＩｌ’ｌ
定し得る生化学測定用プラスチックプレート及びその製
造方法、並びにこのプラスチックプレートを用いる生化
学測定方法全提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

前記目的を達成するために、本発明に係る生化学測定用
プラスチックプレートは、プラスチ・・ノブプレートに
糖タンパク質が結合され、この糖タンパク質の糖鎖が酸
化されてアルデヒド基をイｉするように形成されたプレ
ートである６ また、本発明の生化学測定用プラスチックプレー　トの
製造方法は、プラスチックプレートに糖タンパク質を結
合し、この結合した糖タンパク質の糖鎖を酸化剤によっ
て酸化し・、アルデヒド基を形成させることによるプラ
スチックプレー１・の製造方法である。なお、前記糖タ
ンパク質はゼラチンまたはアラビアゴムであることが好
ましく、また前記糖鎖の１個に２分子のアルデヒド基を
形成することが望ましい。

また１本発明の生化学測定用プラスチックプレートを用
いる生化学測定方法は、前記生化学測定用プラスチック
プレートに結合された糖タンパク質の糖鎖のアルデヒド
基に、抗Ｒ（又は抗体）を結合し、その抗原（又は抗体
）に対して被測定される抗体（又は抗原）を結合させ、
その後、生化学的に被測定の抗体（又は抗原）を定量す
る方法である。

次に本発明を詳述する。

本発明のプラスチックプレートはそのプレート上に生成
する抗原−抗体の複合体を光学的に吸光度または輻射的
に吸収度を検出して測定する。しかし光学的に吸光度を
検出する場合を考慮して、プラスチックプレートが透光
性であることが好適である。その透光性プラスチックプ
レートとして、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ
アミド、ポリエステル、ポリアクリルアミド又はセルロ
ース等のプレートが挙げられ、中でもポリスチレンプレ
ートが好ましい。

そしてプラスチックプレートに糖タンパク貿の緩衝液の
溶液（糖タンパク質を緩衝液で溶かした溶液）を接触し
、又はプラスチックプレートを糖タンパク質の緩衝液の
溶液に浸漬して、プラスチックプレートに糖タンパク貿
を結合させる。

その糖タンパク質としては、何れの種類の糖タンパク質
を用いることもでき、例えばゼラチン、アラビアゴム、
卵白タンパク、γ−グロブリン、タカアミラーゼＡ、α
−酸性糖タンパク質等が挙げられるが、特にゼラチン、
アラビアゴムが好適である。

上記のようにしてプラスチックプレートに糖タンパク質
を結合した後、酸化剤により糖タンパク質の糖鎖を酸化
し、１つの糖鎖に２分子のアルデヒド基を形成させて生
化学測定用プラスチックプレートを製造する。その酸化
剤として、過ハロゲン酸又はそのアルカリ金属塩を用い
、例えば過ヨウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム等
が好ましい。

そして生化学測定用プラスチックプレートを用いる生化
学測定方法は次のようにして行なう。

先ずプラスチックプレートにアミノ基を持つ物質、例え
ば抗原の緩衝液の溶液を接触し、糖鎖のアルデヒド基と
抗原のアミノ基をペプチツド結合即ち共有結合させるこ
とにより、プレート表面に抗原を強固に結合させること
ができる。また糖鎖に対して酸化剤を使用せず、カルボ
ジイミド試薬やグルタルアルデヒド試薬等を用いること
により、すべての種類の抗原や抗体（抗体もある意味で
は抗原である）を結合させることができる。その糖鎖に
結合する抗原（又は抗体）はアミノ基を有する物質であ
り、分子量の大きい物質（５００００〜２０００００）
であるインシュリン、アビジン、イムノグロビン、トラ
ンスフェリン等、または分子量の小さい物質（数１００
程度）であるアドリアマイシンその他の薬剤等を結合さ
せることができる。これらの抗原（又は抗体）を結合し
た後に、未結合の抗原を（又は抗体）を緩衝液で洗浄し
て除去する。

次に、ｔＪＮ＃Ｉに結合された抗原（又は抗体）に対し
、予め抗ＪＭ（又は抗体）で処理しである被測定の抗体
（又は抗ｆｊｌ）を接触させ、抗原−抗体反応により複
合体を生成させる。その後一般に行なわれている方法で
標識を付与し、エンザイムイムノアッセイ、又はラジオ
イムノアッセイ等により標識を光学的、又は輻射的に検
出し、被測定の抗体（又は抗Ｍ）を定量的に測定する。

本発明の生化学測定用プラスチックプレートは、プレー
ト上の糖タンパク質の糖鎖と抗原（又は抗体）との結合
力が強く、プレートを洗浄しても抗原（又は抗体）が離
脱することがない。その上、被測定の抗体（又は抗原）
の稀釈倍数を大きくし濃度を稀薄にしても、非特異的反
応が制御され正確に免疫的に定量測定できる。本発明の
生化学測定プラスチックプレートを用いてアミノ基を有
する物質の全て、例えば各種薬剤、ホルモン、血清や尿
中のタンパク質、各種アミノ酸等を測定できる。

〔実施例〕

〔実施例１〕 本発明の生化学測定用プラスチックプレートの製造の一
例を第１図（製造方法の処理操作を示す模式図）により
具体的に述べる。なお第１図では透明なポリスチレン製
プラスチックプレー１−１には９にのウェルが設けられ
、その中の１このウェルを示す。

先ず第１図（ａ）に示すようにゼラチンの緩衝液の溶液
２　（ｆｉ度５Ｑμｇ／ｍＱ）の１００／ＪＩ２をウェ
ルに入れ、−・晩、４℃で放置し、図（ｂ）の如くゼラ
チンをウェルのプレート１−に結合させ、結合したゼラ
チン３を得た。その後、結合されないゼラチンを緩衝液
２００／ＡＱで３回洗浄して除いた。次に図（ｃ）の如
く、１００ｍモルの過ヨウ素酸ナトリウム４の１００μ
悲を加えて室温ト、３０分間反応させた。その反見・に
より第１図（ｄ）の如く、ゼラチン３の糖鎖を酸化し、
ゼラチンのｍｓの１個に対して２分子・のアルデヒド基
を持つ糖鎖５を形成した。その後、残留した過ヨウ素酸
ナトリウム４を排出し、緩衝液で洗浄した。上記的よう
な処理操作により生化学測定用プラスチックプレートを
製造した。

なお、ゼラチンの代わりにアラビアゴムを用いても、同
様にして生化学測定用プラスチックプレートが製造でき
た。

次にこのプラスチックプレー１へを用い゛Ｃ生化学測定
した。図ｃｅ＞の如く、ウェル中にアミノ基を持つ抗原
６の緩衝液の溶液（濃度１０μＫ　／　ｍＱ）を１００
μΩ入れ、室温、３時間で反応させ、図（ｆ）の如く、
糖鎖のアルデヒド基との抗原のアミノ基とを共イｆ結合
させ、アルデヒド基−アミノ基の結合抗′Ｊ！Ｘ７を得
た。その後、予め抗原で処理しである被測定の抗体をウ
ェル中に入れ、結合抗原７と被測定の抗体とを反応させ
、抗原−抗体の複合体にした。その複合体に通常行なわ
れているように標識（酵素、放射性物質、螢光物質等）
を付与し、エンザイムイムノアツセイ、ラジオアッセイ
等により吸光度または輻射線を検出し、被測定の抗体を
定量した。

また、図（ｅ）の処理において抗原６の代わりに、ウェ
ル中のアミノ基を持−つ抗体の緩衝液を入れ、アルデヒ
ド基−アミノ基結合の抗体にし、その後予め抗体で処理
しである被測定の抗原をウェルに入れ、抗体−抗原複合
体を生成し、前述と同様にしてエンザイムイムノアッセ
イ、ラジオアッセイ等により被測定の抗原を定量した。

（実施例２〕 実施例１により得られた生化学測定用ポリスチレンプレ
ートに、抗原として低分子のアドリアマイシン（Ａ　Ｄ
　Ｒ）を結合させた。その後、アドリアマイシンに対し
て被測定の抗体を緩衝液で稀釈して結合させた。このと
き抗体の濃度を稀釈倍数（から４８０００倍に変えて稀
釈した。次に抗ウサギ抗体にベルオキシターゼを結合さ
せである抗体を付着させて着色し、吸光度を検出し、吸
光度から被測定の抗体の濃度を定量した。その吸光度検
出の結果を第２図の曲線Ａに示す。なお、吸光度の検出
方法としては、波長λ、によっ℃発色色素の色の吸光度
を検出し、一方、波長λ、によってプレートの色の吸光
度を検出し・、波長λ、の吸光度値から波長λ２の吸光
度値を差引いた値を吸光度とした。この検出では波長λ
＋、　＝４−１５ｎｒｎ、波長λ、＝５５０ｎｍを用い
た。

この第２図の曲線Ａかられかるように、吸光度は抗体の
稀釈倍数３７５から７５０倍で小さくなり、１５００倍
以上ではＯになっ”Ｃ一定し、吸光度が再び上昇するこ
となく、従って吸光度を検出することにより被測定の抗
体の力価を高精度に定量できた。またアドリアマイシン
と糖鎖のアルデヒド基との結合は共有結合によるので強
固にプレートに結合でき、従来のプレートに比較して約
１００倍も効率良く結合できた。

〔比較例１〕 従来の測定用プラスチックプレート（アミノ基で変性し
たポリスチレンプレート）を用いてプレートにアドリア
マイシンを結合し、〔実施例２〕と同様にして被測定の
抗体を結合し、その吸光度を検出し、その結果を第２図
の曲線Ｂに示した６曲線Ｒかられかるように抗体を連続
的に稀釈して行なった過程で吸光度は小さくなるが、稀
釈し過ぎると、即ち稀釈倍数を２４０００倍にすると。

吸光度が再び大きくなり、あたかも反応性が上昇し、抗
体の力価が存在するような非特異的な反応が現れてくる
。従ってこの様な測定用プラスチックプレートは正確に
抗体を定量的に測定できないことが明らかである。

〔実施例３〕 本発明の生化学測定用プレートを用いて結合抑制免疫反
応を行なった。先ず抗原であるアドリアマイシンと被測
定の抗体とを混合反応した混合溶液を調整した。このと
き抗体を稀釈倍数７０倍及び１４０倍に稀釈し、それぞ
れの液にアドリアマイシンを加え濃度０．↓５６〜１０
．０μｇ　／　ｍ誌に変えて混合溶液を調整した。次に
生化学測定用ポリスチレンプレートに抗原のアドリアマ
イシンを結合し、プレートに前記の混合液を接触させ、
その後実施例２のようにして着色して吸光度を検出した
。

その吸光度検出の結果を第３図に示し、第３図の図（ａ
）は着色反応を１８０分、図（ｂ）は着色反応を一晩放
置した場合である。また図（ａ）の曲線Ｃ工は非測定抗
体の稀釈倍数７０倍、曲線Ｃ２は稀釈倍数１４０倍、図
（ｂ）の曲線Ｃ１は被測定抗体の稀釈倍数７０倍１曲線
Ｃ９は稀釈倍数１４０倍の場合の吸光度を示す。混合溶
液中のアドリアマイシンの濃度を高くすると、被測定液
中に含まれる反応性の抗体量が減少し、抗体の結合力が
低下する。このように本発明プレートを用いることによ
り結合抑制免疫反応によって抗体を精度良く定量できる
。

〔発明の効果〕

本発明は、透光性プラスチックプレートに糖タンパク質
を結合し、その糖鎖を酸化してアルデヒド基を形成して
生化学測定プラスチックプレートを製造するので、容易
に製造することができる。

またこの生化学測定プラスチックプレートを用いる測定
は次のような効果を有する。

（↓）生化学測定プラスチックプレートへの抗原又は抗
体の結合効果は、従来の生化学測定プラスチックプレー
トに比較して１０−１００倍大きく、強固に結合し得る
。

（２）アミノ基を持つ抗原は全て効率良く、生体内で自
然に起こっているような化学反応によってプレートに結
合させ得る。

（３）被測定の抗体（又は抗Ｍ）を大きく稀釈倍数にし
濃度を小さくして測定しても非特異的反応を抑制でき、
安定に高精度に定量測定でき、バックグラウンドを無く
することができる。

（４）Ｐｉ４定範囲の面においては、従来の生化学測定
プラスチックプＩノートに比較して１００−１０００倍
に測定感度を上昇できる。

また本発明は、上記したようにエンザイムイムノアッセ
イやラジオイムイムノアッセイによって血清中や尿中の
抗体、抗原、タンパク質、ホルモン、アミノ酸等を高精
度に測定でき、生化学や臨床診断に広く利用することが
できる。

【図面の簡単な説明】

第工図は本発明の生化学測定プラスチックプレートを製
造する方法の手順を示す模式図で、第１図（ａ）〜（ｆ
）は各操作を示している。第２図は抗体の稀釈倍数と吸
光度との関係を示す図で、曲線Ａは本発明１曲線Ｂは比
較例を示している。 第３図はアドリアマイシンと抗体との混合溶液中のアド
リアマイシン濃度と、吸光度との関係を示す図である。 １・・・ポリエチレン製プラスチックプレート、３・・
・ゼラチン、 ５・・・糖鎖、 ６・・・アミノ基を持つ抗原、 ７・・・結合抗原。 特許　出　願　人　学校法人東海大学 Ｌｕ１ 第 図 を凡作の鳥伏目数 第 図（ａ） ＡＤＲＪ度（ｐ９／ｍｆ）、　） 弔 図 （ｂ） ＡＤＲ濃度（μｇ／ｍ必）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）プラスチックプレートに糖タンパク質が結合され
   、この糖タンパク質の糖鎖が酸化されてアルデヒド基を
   有することを特徴とする生化学測定用プラスチックプレ
   ート。
2. （２）前記プラスチックプレートが透光性であることを
   特徴とする請求項（１）記載の生化学測定用プラスチッ
   クプレート。
3. （３）プラスチックプレートに糖タンパク質を結合し、
   この結合した糖タンパク質の糖鎖を酸化材によって酸化
   し、この糖鎖にアルデヒド基を形成されることを特徴と
   する生化学測定用プラスチックプレートの製造方法。
4. （４）前記糖鎖の１個の２分子のアルデヒド基を形成す
   ること特徴とする請求項（３）記載の生化学測定用プラ
   スチックプレートの製造方法。
5. （５）前記糖タンパク質がゼラチンまたはアラビアゴム
   から選ばれることを特徴とする請求項（３）記載の生化
   学測定用プラスチックプレートの製造方法。
6. （６）前記プラスチックプレートが透光性であることを
   特徴とする請求項（３）記載の生化学測定用プラスチッ
   クプレートの製造方法。
7. （７）前記プラスチックプレートがポリスチレン、ポリ
   カーボネート、ポリアミド、ポリエステル、ポリアクリ
   ルアミド及びセルロースの群から選ばれたプラスチック
   からなるプレートであることを特徴とする請求項（６）
   記載の生化学測定用プラスチックプレートの製造方法。
8. （８）前記プラスチックプレートがポリスチレンプレー
   トであることを特徴とする請求項（７）記載の生化学測
   定用プラスチックプレートの製造方法。
9. （９）前記酸化剤が過ハロゲン酸またはそのアルカリ金
   属塩から選ばれることを特徴とする請求項（３）記載の
   生化学測定用プラスチックプレートの製造方法。
10. （１０）前記生化学測定用プラスチックプレートに結合
    された糖タンパク質の糖鎖のアルデヒド基に抗原（又は
    抗体）を結合し、その抗原（又は抗体）に対し被測定さ
    れる抗体（又は抗原）を結合させ、生化学的に被測定の
    抗体（又は抗原）を定量することを特徴とする生化学測
    定方法。