JPS59146589A - 生物学的活性質の固定化法 - Google Patents
生物学的活性質の固定化法Info
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- JPS59146589A JPS59146589A JP2099583A JP2099583A JPS59146589A JP S59146589 A JPS59146589 A JP S59146589A JP 2099583 A JP2099583 A JP 2099583A JP 2099583 A JP2099583 A JP 2099583A JP S59146589 A JPS59146589 A JP S59146589A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的に活性な物質の画定化方法に関する。
・
酵素、抗原、抗体などの生物学的に活性な物′質を固相
担体に固定化する方□法は数多く知られている。その中
でも簡便で経済的なのはアミン基を有する相体にグルタ
ルアルデヒドを結合剤に用いて固定化する方□法である
。この方法が適用できるためには、生物学的活性物質が
アミン基を有することが必要であるが、酵素、抗原、抗
体などの生物学的活性物質の大部分はアミン基を有する
ので、グルノルアルデヒドによって担体に固定化するこ
とが可能である。
担体に固定化する方□法は数多く知られている。その中
でも簡便で経済的なのはアミン基を有する相体にグルタ
ルアルデヒドを結合剤に用いて固定化する方□法である
。この方法が適用できるためには、生物学的活性物質が
アミン基を有することが必要であるが、酵素、抗原、抗
体などの生物学的活性物質の大部分はアミン基を有する
ので、グルノルアルデヒドによって担体に固定化するこ
とが可能である。
しＡ〒し、本発明者らは上記グルタルアルデヒド法によ
る生物学的活性物質の固定化法を詳細に検討した結果、
クルクルアルデヒドによシ固定化し：だ生物学的活性物
質固定化物には、実用上好ま、シくない性質のあること
が明かになった。
る生物学的活性物質の固定化法を詳細に検討した結果、
クルクルアルデヒドによシ固定化し：だ生物学的活性物
質固定化物には、実用上好ま、シくない性質のあること
が明かになった。
すなわちクルクルアルデヒドを結合剤に用いて生物学的
活性物質を固定化した固相には、亨らに蛋白、質が吸着
しやすい。甘たクルクルアルデヒドを結合剤に用いて生
物学的活性物質を固定化した固相に血漿または血清が接
触すると補体が活性化される。これらの性質は生物学的
活性物質固定化物とくに免疫学的活性物質固定化物を医
学的診断ないし治療に利用する場合に好ましくない。た
とえば放射免疫測定、酵素免疫測定、螢光免疫測定など
の標識免疫測定においては、結合した標識免疫活性物質
と遊離の標識免疫活性物質との分離を容易にする目的で
、結合のパートナ−となる生物学的活性物質を固相担体
に固定化して免疫活性物質と反応させるが、、その際に
検体中の螢白質または標識免疫活性物質が固相に非特異
的に吸着すると測定の精度を）ｊ１゛、ぐする。、号、
／ｒ、免疫学的活性物質を固定化Ｉ−た微お′１４イ状
ＩＰ体と検体溶液を反応させて、凝集のス 有六により被１ｔｌｌ定物質を検知する方法は免疫血Ｒ
″ｒ学的検査てＬ２ばしば用いらねるが、検体中の成力
の非！Ｉ、！ｌ１１′カ的吸法（ｌこより非特異的凝集
が起こることは検査の妨げになる。−また、近年免疫活
性物質−や酵素などの固定化物と血液ない［７血漿とる
・体外て接触させて血中の有害成分を除去したのち、血
散在いし血漿を体内に戻すこと（でより血液を／１１化
する方法が難病に対する新しい治療法とし２でｌ主１−
１されている。しかし、この場合生物学重粘１牛物質固
定化物と血液ないし、血漿が接触し／こときに血中の袖
体力冑占性化されると被治療者がショックを起こす危険
かある。
活性物質を固定化した固相には、亨らに蛋白、質が吸着
しやすい。甘たクルクルアルデヒドを結合剤に用いて生
物学的活性物質を固定化した固相に血漿または血清が接
触すると補体が活性化される。これらの性質は生物学的
活性物質固定化物とくに免疫学的活性物質固定化物を医
学的診断ないし治療に利用する場合に好ましくない。た
とえば放射免疫測定、酵素免疫測定、螢光免疫測定など
の標識免疫測定においては、結合した標識免疫活性物質
と遊離の標識免疫活性物質との分離を容易にする目的で
、結合のパートナ−となる生物学的活性物質を固相担体
に固定化して免疫活性物質と反応させるが、、その際に
検体中の螢白質または標識免疫活性物質が固相に非特異
的に吸着すると測定の精度を）ｊ１゛、ぐする。、号、
／ｒ、免疫学的活性物質を固定化Ｉ−た微お′１４イ状
ＩＰ体と検体溶液を反応させて、凝集のス 有六により被１ｔｌｌ定物質を検知する方法は免疫血Ｒ
″ｒ学的検査てＬ２ばしば用いらねるが、検体中の成力
の非！Ｉ、！ｌ１１′カ的吸法（ｌこより非特異的凝集
が起こることは検査の妨げになる。−また、近年免疫活
性物質−や酵素などの固定化物と血液ない［７血漿とる
・体外て接触させて血中の有害成分を除去したのち、血
散在いし血漿を体内に戻すこと（でより血液を／１１化
する方法が難病に対する新しい治療法とし２でｌ主１−
１されている。しかし、この場合生物学重粘１牛物質固
定化物と血液ないし、血漿が接触し／こときに血中の袖
体力冑占性化されると被治療者がショックを起こす危険
かある。
上１己の事情を考察して、本発明者らはグルタルアルプ
゛ヒト法の利点は保持しつつ、欠点を克服した生物学的
ン占性物質の固定化法を検討ｌ−だ結果、体発明に到達
した。
゛ヒト法の利点は保持しつつ、欠点を克服した生物学的
ン占性物質の固定化法を検討ｌ−だ結果、体発明に到達
した。
すなわち、本発明は了ミノ基を有する生物学的に活性な
物質をアミノ児を治するＪ−［（体に固定化する方法に
おいて、多糖類の酸化生成物イ）−結合剤に用いること
一５ヨ１．￥徴とする生物ツ′的活性物質の固定化方法
を提供するもの−Ｃある。
物質をアミノ児を治するＪ−［（体に固定化する方法に
おいて、多糖類の酸化生成物イ）−結合剤に用いること
一５ヨ１．￥徴とする生物ツ′的活性物質の固定化方法
を提供するもの−Ｃある。
本発明方法に用いる多（’ｉ；−ｉ類は酸化剤Ｋ 上る
酸化生成物が水溶性であれは、中１４Ｆ−１酸・１４ｇ
、塩基性のいずれてもさし二ｐか才ない。好適な多れ
１１類の例を挙（・つれは、ブキストンノ、〕−ギスト
ランイＩＹｊ酸ヅトリウム、１−７ミノー２−シ＋−ロ
Ｗンプロ！ピルデギ〜（）・ラン、澱粉、ｊキストリン
、ヒトロギシエチルヒルロース、ヒｌ−’ Ｅｌ キノ
ソロピルセルロース、カルボギンノチルセ・し１−Ｉ−
スおよびそのす１． ＩＪウム塩、アラヒアゴｌ１、−
ｆルキン酸およびそのすトリウム塩、へ、バリン′、二
ｊントロイ子ン（１，１ｊｆｆｉ酸およびぞのナトリウ
ムｆｎ（、ヒアル［ｌン酸なとである。
酸化生成物が水溶性であれは、中１４Ｆ−１酸・１４ｇ
、塩基性のいずれてもさし二ｐか才ない。好適な多れ
１１類の例を挙（・つれは、ブキストンノ、〕−ギスト
ランイＩＹｊ酸ヅトリウム、１−７ミノー２−シ＋−ロ
Ｗンプロ！ピルデギ〜（）・ラン、澱粉、ｊキストリン
、ヒトロギシエチルヒルロース、ヒｌ−’ Ｅｌ キノ
ソロピルセルロース、カルボギンノチルセ・し１−Ｉ−
スおよびそのす１． ＩＪウム塩、アラヒアゴｌ１、−
ｆルキン酸およびそのすトリウム塩、へ、バリン′、二
ｊントロイ子ン（１，１ｊｆｆｉ酸およびぞのナトリウ
ムｆｎ（、ヒアル［ｌン酸なとである。
多糖類を酸化させるだめの酸化剤と［〜ては、具体的に
は、クロム酸、四階酸鉛、ｌハヨウ（・、酸、ヨートシ
・／化合物（たとえは、西′１酸田−１・／ル・−・、
７・十ンＣ，１１，ｉ （０ＣＯＣＩＩ３）２）、酸素
（ｌｌＩｌ′ｌ酸−１・・ルトを触媒として）、ペルオ
キソ硫酸−銀（＋） Ｉ：：；、・１１．１：！＝化銅
（１）、水酸化銅（■１）、タリウム（＋）塩、でメ１
菖ンｊ、（Ｉｌｌ） Ｊｌ＋”１．￥、酸・聞硫酸セリ
ウｌ、（八′）、ヒ、スマス酸Ｊ：ｉ１’Ｈ１過酸化Ｌ
ノケル、−ヒセノ／・酸、陽極酸化等が当へけら１１．
る。７時に過ヨウ素凸ジ、四四′１酸３合がｌｔＩ′ｉ
Ｌ ＜用いＩミ１オ′Ｌる。、過ヨウタ（・、酸１．
づ、遊部の過田つ素酸含−用いても、過１つふすトリウ
ム、過ヨウ素酸カリウムなとの塩類を用いてもよい。
は、クロム酸、四階酸鉛、ｌハヨウ（・、酸、ヨートシ
・／化合物（たとえは、西′１酸田−１・／ル・−・、
７・十ンＣ，１１，ｉ （０ＣＯＣＩＩ３）２）、酸素
（ｌｌＩｌ′ｌ酸−１・・ルトを触媒として）、ペルオ
キソ硫酸−銀（＋） Ｉ：：；、・１１．１：！＝化銅
（１）、水酸化銅（■１）、タリウム（＋）塩、でメ１
菖ンｊ、（Ｉｌｌ） Ｊｌ＋”１．￥、酸・聞硫酸セリ
ウｌ、（八′）、ヒ、スマス酸Ｊ：ｉ１’Ｈ１過酸化Ｌ
ノケル、−ヒセノ／・酸、陽極酸化等が当へけら１１．
る。７時に過ヨウ素凸ジ、四四′１酸３合がｌｔＩ′ｉ
Ｌ ＜用いＩミ１オ′Ｌる。、過ヨウタ（・、酸１．
づ、遊部の過田つ素酸含−用いても、過１つふすトリウ
ム、過ヨウ素酸カリウムなとの塩類を用いてもよい。
多糖類の酸化反応（でおける多糖類と酸化剤との什込比
ｋｍ、中、量で１：２から２００ ： １の範囲か好適
である。才だ反応温度は０〜４０℃、１）−Ｉｆｌｒ、
２〜１０が好適である。
ｋｍ、中、量で１：２から２００ ： １の範囲か好適
である。才だ反応温度は０〜４０℃、１）−Ｉｆｌｒ、
２〜１０が好適である。
ＪＵ体（」つ′ミノ基を有する１１体であればよく、と
くに限定り１Ｌないが、成形の便から（は有機高分子重
合体がとくに好ましい。相体の形体は球、円柱、円板、
試験管、円筒、繊維、膜、粒子、網、マイクＩ」トレイ
、婚ｉ旋なと目的に合致すれ口：とのようなものでもよ
い。相体の１ｊ利と１〜で好外し５いイ」機高分子重合
体の若干例を挙げれば、スヂレンの単独祉たは共Ｘｌｒ
合体の一〕′ミノ化物、アクリル酸１／ζはメタクリル
酸のクリノ／１し：Ｉ−ステルの単独才たは共重合体の
アミン化物、アクリロニ） ＩＪルの単独−づ、大（づ
共重合体の水素化物、アクリルアミドの単独−３ト／こ
（・１共Ｎト−合体のホフマン分力Ｉイ生成物、アクリ
ル酸またはメタクリル酸の単独１Ｌ／こ口、共重合体の
ヒドラノドなとである。中でも親水性重合体が好捷し７
く、例えｄ′＋ｌａ体に生物学的活性物質を固定化する
Ｑ′こ当っては、相体、生物学的活性物質、）、−よひ
多糖の過ヨウ素酸酸化′物の５音を同時に混合して反応
させてもよいが、生物学的活性物質の活性低下を避ける
ためには、」ず翅「）＼を多糖の一過ヨウ素酸酸化物で
処理した後、生物学的活性物質と接触でせて固定化する
のがよい。
くに限定り１Ｌないが、成形の便から（は有機高分子重
合体がとくに好ましい。相体の形体は球、円柱、円板、
試験管、円筒、繊維、膜、粒子、網、マイクＩ」トレイ
、婚ｉ旋なと目的に合致すれ口：とのようなものでもよ
い。相体の１ｊ利と１〜で好外し５いイ」機高分子重合
体の若干例を挙げれば、スヂレンの単独祉たは共Ｘｌｒ
合体の一〕′ミノ化物、アクリル酸１／ζはメタクリル
酸のクリノ／１し：Ｉ−ステルの単独才たは共重合体の
アミン化物、アクリロニ） ＩＪルの単独−づ、大（づ
共重合体の水素化物、アクリルアミドの単独−３ト／こ
（・１共Ｎト−合体のホフマン分力Ｉイ生成物、アクリ
ル酸またはメタクリル酸の単独１Ｌ／こ口、共重合体の
ヒドラノドなとである。中でも親水性重合体が好捷し７
く、例えｄ′＋ｌａ体に生物学的活性物質を固定化する
Ｑ′こ当っては、相体、生物学的活性物質、）、−よひ
多糖の過ヨウ素酸酸化′物の５音を同時に混合して反応
させてもよいが、生物学的活性物質の活性低下を避ける
ためには、」ず翅「）＼を多糖の一過ヨウ素酸酸化物で
処理した後、生物学的活性物質と接触でせて固定化する
のがよい。
固定化の対象となる生物学的活性物質の例を挙げれば、
アスパラギナーゼ・ウレアーゼなどの酵素類、ヒト絨毛
性コーナト用・ロピン・卵胞刺激ホルモン・甲状腺刺激
ホルモン塩とのホルモンとそれに対する抗体、トレボネ
ーマ・＜リグム・Ａ型剤たはＢ型肝炎ウィルス・風疹ウ
ィルス・トキソプラズマ・マイコプラズマ・溶連菌など
の病原体の抗原およびそれに対する抗体、ａ−フェトプ
ロティン・癌肝抗原などの癌関連抗原とそれに対する抗
体、リボ核酸およびデオギ／リボ核酸とそれに対する抗
体、１ｇＧ・ＩｇＭＩｇＡ・ＩｇＤ・ＩｇＥなどの免疫
グロブリンとそれに対する抗体、熱凝集ＩｇＯ，ＩＪウ
マチ因子、Ｃ反応性蛋白とその抗体、ＯＩｇ−ＯＩｒ・
ＣＩ’５−０２・０３・Ｃ４・０５・Ｃ６・Ｃ７・Ｃ８
・０９などの補体とそれに対する抗体、各種アレルゲン
、プロティンＡ１コングルチニ＃、イムノコングルチニ
ン、コンカナバリンなどのコングルテン、各種組織適合
抗原およびそれに対する抗体などである。
アスパラギナーゼ・ウレアーゼなどの酵素類、ヒト絨毛
性コーナト用・ロピン・卵胞刺激ホルモン・甲状腺刺激
ホルモン塩とのホルモンとそれに対する抗体、トレボネ
ーマ・＜リグム・Ａ型剤たはＢ型肝炎ウィルス・風疹ウ
ィルス・トキソプラズマ・マイコプラズマ・溶連菌など
の病原体の抗原およびそれに対する抗体、ａ−フェトプ
ロティン・癌肝抗原などの癌関連抗原とそれに対する抗
体、リボ核酸およびデオギ／リボ核酸とそれに対する抗
体、１ｇＧ・ＩｇＭＩｇＡ・ＩｇＤ・ＩｇＥなどの免疫
グロブリンとそれに対する抗体、熱凝集ＩｇＯ，ＩＪウ
マチ因子、Ｃ反応性蛋白とその抗体、ＯＩｇ−ＯＩｒ・
ＣＩ’５−０２・０３・Ｃ４・０５・Ｃ６・Ｃ７・Ｃ８
・０９などの補体とそれに対する抗体、各種アレルゲン
、プロティンＡ１コングルチニ＃、イムノコングルチニ
ン、コンカナバリンなどのコングルテン、各種組織適合
抗原およびそれに対する抗体などである。
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
〔実施例１〕
（螢光コロイドの調製）
メチルメククリンート、グリ７シルメタクリレート、メ
タクリル酸、スルポブロピ症メククリレートナトリウム
暮、エチレングリコールジメタクリレニトを、ｉＯ：２
０：１５：５；１０のモル比で混合し、０．’１２５％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳｊ水溶液にこれらモノ
マーの合計重量が１０％となるように加え、窒素雰囲気
下で檄しく攪拌し、モノマーを乳化させた。重合は、’
１ｍＭの過硫酸アンモニウムを開始剤として６０℃で約
１１５時間おこなった。次に反応゛液中の未反応のモノ
マーを四塩化炭素で抽出し除去した。得られた直径約０
１５μｍのコロイド微粒子は、ｏ、ｏ ２５ｓ硫酸水溶
液中で３０℃で１時間加水分解した後、水酸化ナトリウ
ムで中和し、洗浄しブζ。洗浄は１７５００’ｒｐｍで
２０分間遠心することでおこなった。洗浄後、コロイド
粒子をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に分散し、
Ｉ）’Ｍ Ｓ Ｏ中で１２係のアンモニアによりアミノ
化した。
タクリル酸、スルポブロピ症メククリレートナトリウム
暮、エチレングリコールジメタクリレニトを、ｉＯ：２
０：１５：５；１０のモル比で混合し、０．’１２５％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳｊ水溶液にこれらモノ
マーの合計重量が１０％となるように加え、窒素雰囲気
下で檄しく攪拌し、モノマーを乳化させた。重合は、’
１ｍＭの過硫酸アンモニウムを開始剤として６０℃で約
１１５時間おこなった。次に反応゛液中の未反応のモノ
マーを四塩化炭素で抽出し除去した。得られた直径約０
１５μｍのコロイド微粒子は、ｏ、ｏ ２５ｓ硫酸水溶
液中で３０℃で１時間加水分解した後、水酸化ナトリウ
ムで中和し、洗浄しブζ。洗浄は１７５００’ｒｐｍで
２０分間遠心することでおこなった。洗浄後、コロイド
粒子をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に分散し、
Ｉ）’Ｍ Ｓ Ｏ中で１２係のアンモニアによりアミノ
化した。
反応は６５℃で６４５時間おこない、充分洗浄してアン
モニアを除去した。
モニアを除去した。
別にアラビアゴムが４ ｒｎｇ ７ ｍｅ ；過ヨウ素
酸すトリウムが５ ｍｇ ／ ｍｅの濃度になるように
水に溶かしヶ（ｐｌ（は６，０になった）、２５℃で１
時間攪拌した。この反応液にアミン化コロイド粒子が１
％になるように分散し１．ｐＨを１０に調節して、６０
℃で６時間攪拌した。反応後、過剰のアラビアゴム酸化
物を遠心による洗浄操作で除いた後、コ１」イド粒子を
０．１．１となるようにＤ Ｍ、 Ｓ Ｏに分散さぜ、
ｏ、２ｒｎｇｉｍｌノジクｏｏトリアジニルアミノフル
オレセインと４０℃で１時間反応させた。得られた螢光
コロイド粒子はｐＨＩ ０．０の０．１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ３ＮａＯＨ緩衝溶液で洗浄した後、０．’１％となる
ように同緩衝溶液中に分１１りし保存した。
酸すトリウムが５ ｍｇ ／ ｍｅの濃度になるように
水に溶かしヶ（ｐｌ（は６，０になった）、２５℃で１
時間攪拌した。この反応液にアミン化コロイド粒子が１
％になるように分散し１．ｐＨを１０に調節して、６０
℃で６時間攪拌した。反応後、過剰のアラビアゴム酸化
物を遠心による洗浄操作で除いた後、コ１」イド粒子を
０．１．１となるようにＤ Ｍ、 Ｓ Ｏに分散さぜ、
ｏ、２ｒｎｇｉｍｌノジクｏｏトリアジニルアミノフル
オレセインと４０℃で１時間反応させた。得られた螢光
コロイド粒子はｐＨＩ ０．０の０．１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ３ＮａＯＨ緩衝溶液で洗浄した後、０．’１％となる
ように同緩衝溶液中に分１１りし保存した。
（抗Ｉ Ｏ（）抗体の螢光コロイド粒子への固定化）ヤ
ギで作製した抗ＨＧＧ（ヒトＩｇＧ）抗体Ｉｇ（）分画
（へ４ｉ Ｉｅｓ ） ２４０ μｇ ／ｍｌ溶液５０
’ＯμＡと０．１％結合性物質固定化用螢光コロイド粒
子５０′ＤμＬとを混合し、４℃で２日間反応さぜだ。
ギで作製した抗ＨＧＧ（ヒトＩｇＧ）抗体Ｉｇ（）分画
（へ４ｉ Ｉｅｓ ） ２４０ μｇ ／ｍｌ溶液５０
’ＯμＡと０．１％結合性物質固定化用螢光コロイド粒
子５０′ＤμＬとを混合し、４℃で２日間反応さぜだ。
反応□後ンアン水素化ホウ素ナトリウムを１．５ Ｉｎ
ｇフ 加えて、２５℃で１時間反応させ、シラ輿塩基を還元し
た。
ｇフ 加えて、２５℃で１時間反応させ、シラ輿塩基を還元し
た。
得られた抗Ｉ−Ｉ Ｇ Ｇ抗体結合コロイド粒子をｐＨ
８，０の０．１ Ｍ トリス塩酸緩衝液で洗浄し、１係
のウシ血清アルブミン（ＢＳ）＼）を含む同緩衝液中に
保存した。
８，０の０．１ Ｍ トリス塩酸緩衝液で洗浄し、１係
のウシ血清アルブミン（ＢＳ）＼）を含む同緩衝液中に
保存した。
以」二のようにして調製した抗１−１． Ｇ Ｇ抗体固
定化コロイド粒子は４週間たった後も分散していた。一
方、グルタルアルテヒトを用いてアミン化コロイドに同
様に抗ＨＧ Ｇ抗体を固定化したところ、約１週間でコ
ロイドの凝集がおこり、使用が困難となっていた。
定化コロイド粒子は４週間たった後も分散していた。一
方、グルタルアルテヒトを用いてアミン化コロイドに同
様に抗ＨＧ Ｇ抗体を固定化したところ、約１週間でコ
ロイドの凝集がおこり、使用が困難となっていた。
（固相・用粒子の調製）
固相と・して使用した粒子は特開昭５６−１４１５’５
９に記載の方法により、クリシジルメタクリレート、２
−オキシエチルノタクリレ−ト、およびトリエチレング
リコールジメタクリレート で混合し重合した粒子をアミン化し、加水分解すること
により調製した。平均粒径４．３μｍの親水性粒子であ
る。
９に記載の方法により、クリシジルメタクリレート、２
−オキシエチルノタクリレ−ト、およびトリエチレング
リコールジメタクリレート で混合し重合した粒子をアミン化し、加水分解すること
により調製した。平均粒径４．３μｍの親水性粒子であ
る。
（固相用粒子への抗Ｉ−Ｉ Ｇ Ｇ抗体の固定化）抗Ｉ
Ｉ Ｏ Ｇ抗血’（Ｙｔ （ Ｍｉ Ｉｅｓ ）をＰｒ
ｏｔｃ′ｉｎ Ａ −Ｓｅｐｈ；＋ｒｏｓｃ （Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）のカラムクＯ’？トクラフイーにより
ＩｇＧ分画に精製した。
Ｉ Ｏ Ｇ抗血’（Ｙｔ （ Ｍｉ Ｉｅｓ ）をＰｒ
ｏｔｃ′ｉｎ Ａ −Ｓｅｐｈ；＋ｒｏｓｃ （Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）のカラムクＯ’？トクラフイーにより
ＩｇＧ分画に精製した。
調製した抗Ｈ Ｇ Ｇ抗血清のＩｇＣ．分画１０’ｌ＋
グ／ｍｌを含むｐ １−Ｉ ７， ２の０１５モル生理
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に濃度が１係になるように特
開５６−Ｉ４１５５９記載の方法に準じてグルタルアル
テヒドで活性化した固相用アミン化粒子を分散さぜ２５
℃て２時間反応させた。３０００１“ｐ１〕１の遠心操
作で粒子を沈降させることで粒子のｉ浄をおこない、０
１％のウシ血清アルブミン（ Ｕ Ｓ Ａと略記する。
グ／ｍｌを含むｐ １−Ｉ ７， ２の０１５モル生理
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に濃度が１係になるように特
開５６−Ｉ４１５５９記載の方法に準じてグルタルアル
テヒドで活性化した固相用アミン化粒子を分散さぜ２５
℃て２時間反応させた。３０００１“ｐ１〕１の遠心操
作で粒子を沈降させることで粒子のｉ浄をおこない、０
１％のウシ血清アルブミン（ Ｕ Ｓ Ａと略記する。
）中に分散し、抗Ｉ−ＩＧ（）抗体固定化同相粒子を調
製した。
製した。
（ Ｈ Ｇ Ｇの測定）
ＨＧＧ （Ｍｉｌｅｓ）の１ ０ μｇ ／ｍｌ〜１
ｎｇ ／ ｍ１２寸での１０倍稀釈系列（各９ｏμｔ）
を作製し、ガラス試験管内で１％の抗Ｉ−Ｉ Ｇ Ｇ抗
体固定化固相微粒子分散液１ ０ ０ ｐｔと振盪．し
ながら２５℃で１時間反応させて、３ ０ ０ ０ ｒ
ｐｍで遠沈、再分散させる操作により、固相微粒子をト
リス緩衝液て６回洗浄し、Ｈ Ｇ Ｇが抗Ｈ． Ｇ Ｇ
抗体を介して結合している同相を得た。
ｎｇ ／ ｍ１２寸での１０倍稀釈系列（各９ｏμｔ）
を作製し、ガラス試験管内で１％の抗Ｉ−Ｉ Ｇ Ｇ抗
体固定化固相微粒子分散液１ ０ ０ ｐｔと振盪．し
ながら２５℃で１時間反応させて、３ ０ ０ ０ ｒ
ｐｍで遠沈、再分散させる操作により、固相微粒子をト
リス緩衝液て６回洗浄し、Ｈ Ｇ Ｇが抗Ｈ． Ｇ Ｇ
抗体を介して結合している同相を得た。
抗１−Ｉ Ｃｘ Ｇ抗体固定化螢光コロイド粒子０．
０ ２％分散液１０μｔとこの固相粒子１％分散液１０
０μｌとを試験管内で混合し、２５℃で１時間反応さぜ
、固相をｉ ｌ）ス緩衝液で充分洗浄した。洗浄後、固
イ目粒子を２ ｍｌのトリス緩衝液に分散し、４ ５
０ ｎｍの光で励起して５ ３ ０ ｎｍの螢光強度を
測定した。螢光光度計は日立６５０−４０を使用した。
０ ２％分散液１０μｔとこの固相粒子１％分散液１０
０μｌとを試験管内で混合し、２５℃で１時間反応さぜ
、固相をｉ ｌ）ス緩衝液で充分洗浄した。洗浄後、固
イ目粒子を２ ｍｌのトリス緩衝液に分散し、４ ５
０ ｎｍの光で励起して５ ３ ０ ｎｍの螢光強度を
測定した。螢光光度計は日立６５０−４０を使用した。
ＨＧＧ １ ０ ｐｇ／ｍｌ〜１ ｎｇ ／ｍｅ ｉ
ｆ（７）範囲におけるＩ−Ｉ Ｃ． Ｇ濃度と螢光強度
との関係を第１図に示した。
ｆ（７）範囲におけるＩ−Ｉ Ｃ． Ｇ濃度と螢光強度
との関係を第１図に示した。
Ｊ実施例２〕
（ウノ血？ｉ’＋アルブミン固定化粒子の調製）肋間昭
５ ６−１ ４．、１ ５ ５ ９に記載した方法によ
り調製し／こ平均直径ろ．０μ〃１のアミノ化親水性粒
子を蒸留水に１％の心変て分散させた。別にアルギン酸
す［・リウムを１１）含む水溶液に過ヨウ素酸す［・リ
ウムを１ ｍｙ ／ ｍｅの濃度で添加し、２５℃で１
時間攪拌してアルギン酸ナトリウムを酸化した。次いで
アミン化親水性粒子分散液２容とアルギン酸ナトリウム
酸化反応液１容と混合肱水酸化すｌ・リウムでｐ Ｉ−
ＩをＩＯＫ調節し、６０℃で６０分間攪拌した。次に粒
子をＰ １３ Ｓで洗浄し、ＰＢＳ中に５％の（農度で
分散さぜ／こ。
５ ６−１ ４．、１ ５ ５ ９に記載した方法によ
り調製し／こ平均直径ろ．０μ〃１のアミノ化親水性粒
子を蒸留水に１％の心変て分散させた。別にアルギン酸
す［・リウムを１１）含む水溶液に過ヨウ素酸す［・リ
ウムを１ ｍｙ ／ ｍｅの濃度で添加し、２５℃で１
時間攪拌してアルギン酸ナトリウムを酸化した。次いで
アミン化親水性粒子分散液２容とアルギン酸ナトリウム
酸化反応液１容と混合肱水酸化すｌ・リウムでｐ Ｉ−
ＩをＩＯＫ調節し、６０℃で６０分間攪拌した。次に粒
子をＰ １３ Ｓで洗浄し、ＰＢＳ中に５％の（農度で
分散さぜ／こ。
上記粒子分散液（５％）と等容のＢＳＡの１１・・ｇ
／ ｍｅ ＰＢ Ｓ溶液を混合１ ６０℃てろ０分攪拌
し２て、Ｕ Ｓ Ａを粒子に固定化した。ＢＳＡ固定化
粒子をｉ） Ｂ Ｓで洗浄後、と１〜血清アルフ゛ミン
１％を添加したＰＢＳに粒子含量か１２５％にｈ：るよ
う分散させた。
／ ｍｅ ＰＢ Ｓ溶液を混合１ ６０℃てろ０分攪拌
し２て、Ｕ Ｓ Ａを粒子に固定化した。ＢＳＡ固定化
粒子をｉ） Ｂ Ｓで洗浄後、と１〜血清アルフ゛ミン
１％を添加したＰＢＳに粒子含量か１２５％にｈ：るよ
う分散させた。
（ウシ血清アルブミン固定化粒子の活性測定）抗ＢＳＡ
抗血清（ウサギ） （ ２． ５ ｙｎｑ／’ｍｌ ）
を１多ヒト血清アルブミン添加ＰＢＳで１０倍に希釈し
、それをＵ字型マイクロプレート上でさらに２昏倍に希
釈した系列をつくり、各ウェルに２５μｔずつ入れだ。
抗血清（ウサギ） （ ２． ５ ｙｎｑ／’ｍｌ ）
を１多ヒト血清アルブミン添加ＰＢＳで１０倍に希釈し
、それをＵ字型マイクロプレート上でさらに２昏倍に希
釈した系列をつくり、各ウェルに２５μｔずつ入れだ。
ろＯ分静置後各ウェルにＢＳＡ固定化粒子分散敢２５μ
Ｌを加えてふり１ぜ、２時間静置した。コントロール実
験として抗ＢＳＡ抗血清の代りに健常ウザキ血清を使用
して同じ操作を行った。
Ｌを加えてふり１ぜ、２時間静置した。コントロール実
験として抗ＢＳＡ抗血清の代りに健常ウザキ血清を使用
して同じ操作を行った。
２時間静置後の沈降像を観察した結果は表１の通りであ
った。
った。
以 下 余 白
比較のためアルギン酸ナト）ノウムの酸化物の代シにグ
ルタルアルデヒドを使用して、同様にＢＳＡを固定化し
た粒子で表１ど同じ実験を行ったところ、抗血清および
コン１〜ロール血清のいずれの場合においても、沈降像
はどの希釈倍率においても十士を示しだ。
ルタルアルデヒドを使用して、同様にＢＳＡを固定化し
た粒子で表１ど同じ実験を行ったところ、抗血清および
コン１〜ロール血清のいずれの場合においても、沈降像
はどの希釈倍率においても十士を示しだ。
〔実施例６〕
蒸留水にテギストランＴ７０ち゛よび過ヨウ素酸すｌ−
’Ｊウムの両者を、０１ツ度がそれぞれ１ｏｙｑｙ／
ｍｅおよび２ｒＲｇ ／ ｍｅになるＪ二うに溶解し、
２５℃で１時間攪拌した。この反応液に実施例１で用い
た平均粒子４６μＩｎの固相用アミン化粒子を１％の諾
朋で分散さぜ、少量・の水酸化すトリウムと炭酸水床す
トリウムでｐ ｒ−１を９．６に調節し、２５℃で１時
間攪拌した。反応後、粒子をｐ ｌ−ｌ９乙の緩衝溶液
（水酸化すトリウム＋炭酸水累すｌ−ＩＪウム）で洗浄
し、同じ緩衝溶液に１ｇを溶解した溶液にボリマーバ度
が１％になるように分散させ、２５℃でろ時間攪拌して
、粒子にＩｇＧを固定化した。比較のため、テギスＩ−
ランの過ヨウ素酸による酸化物の代りにグルタルアルデ
ヒドを用いて同様にＴｇＧを固相用アミノ化粒子に固定
化した。工ｇＧ固定化粒子は１係シつ′／水水素化ボウ
ナナトリウム溶液ｐＦＩ４．０）に分散して（ｊｊＮ度
１％）、２５℃で６０分攪拌した後、トリス−塩酸緩衝
溶液（ｆ）Ｈ２Ｓ）で洗浄し、Ｐ■３Ｓ中に１係の濃度
で分散させて冷蔵庫中で保存した。粒子に固定化された
ＩｇＧの量は塩酸で加水分解後アミノ酸分析を行うこと
に」：り宇部した。
’Ｊウムの両者を、０１ツ度がそれぞれ１ｏｙｑｙ／
ｍｅおよび２ｒＲｇ ／ ｍｅになるＪ二うに溶解し、
２５℃で１時間攪拌した。この反応液に実施例１で用い
た平均粒子４６μＩｎの固相用アミン化粒子を１％の諾
朋で分散さぜ、少量・の水酸化すトリウムと炭酸水床す
トリウムでｐ ｒ−１を９．６に調節し、２５℃で１時
間攪拌した。反応後、粒子をｐ ｌ−ｌ９乙の緩衝溶液
（水酸化すトリウム＋炭酸水累すｌ−ＩＪウム）で洗浄
し、同じ緩衝溶液に１ｇを溶解した溶液にボリマーバ度
が１％になるように分散させ、２５℃でろ時間攪拌して
、粒子にＩｇＧを固定化した。比較のため、テギスＩ−
ランの過ヨウ素酸による酸化物の代りにグルタルアルデ
ヒドを用いて同様にＴｇＧを固相用アミノ化粒子に固定
化した。工ｇＧ固定化粒子は１係シつ′／水水素化ボウ
ナナトリウム溶液ｐＦＩ４．０）に分散して（ｊｊＮ度
１％）、２５℃で６０分攪拌した後、トリス−塩酸緩衝
溶液（ｆ）Ｈ２Ｓ）で洗浄し、Ｐ■３Ｓ中に１係の濃度
で分散させて冷蔵庫中で保存した。粒子に固定化された
ＩｇＧの量は塩酸で加水分解後アミノ酸分析を行うこと
に」：り宇部した。
とのＩｇＧ固定化粒子による補体活性化の有無は次のよ
うにして試験した。すなわち、１％粒子分散液七等容の
新１鮮ヒト血清とを混合し、３７℃で１５分放置した。
うにして試験した。すなわち、１％粒子分散液七等容の
新１鮮ヒト血清とを混合し、３７℃で１５分放置した。
次にＰ Ｂ Ｓで粒子を洗浄後ＰＢＳに１係の濃度で再
び分散し、スライドガラス上で、Ｐ］３Ｓにより１．０
０倍に希釈した抗補体、抗血清（ウサギ）と混合し、凝
集の有（１＋’ｉを肉眼で判定した。その結果を表２に
捷とめて示しだ。
び分散し、スライドガラス上で、Ｐ］３Ｓにより１．０
０倍に希釈した抗補体、抗血清（ウサギ）と混合し、凝
集の有（１＋’ｉを肉眼で判定した。その結果を表２に
捷とめて示しだ。
表 ２
（表中＋は凝集を、−は非凝築を、士は中間の状態を示
す。） たたし、凝集の判定に当ってはコントロールとして常に
健常ウサギ血清を使用した。表２から明らかなように、
グルタルアルデヒドを結合剤としてＩｇＧを固定化した
場合には、活性化された補体成分が同相に結合している
が、デキストラノ酸化物を結合剤に用いた場合には、補
体成分の同相への結合は皆無ないし僅少でを）る。
す。） たたし、凝集の判定に当ってはコントロールとして常に
健常ウサギ血清を使用した。表２から明らかなように、
グルタルアルデヒドを結合剤としてＩｇＧを固定化した
場合には、活性化された補体成分が同相に結合している
が、デキストラノ酸化物を結合剤に用いた場合には、補
体成分の同相への結合は皆無ないし僅少でを）る。
第１図は実施例１のＩ−Ｉ Ｇ Ｇ １ｉｌｌｌ定結果
を示す図である。 特許出願人 東 し 株 式 会 社 −第１図 郵 諸 七 １（ｏ ｏ ６度 ｎｙ／ｍｌ！ ４６０
を示す図である。 特許出願人 東 し 株 式 会 社 −第１図 郵 諸 七 １（ｏ ｏ ６度 ｎｙ／ｍｌ！ ４６０
Claims (1)
- （１） アミン基を有する生物学的に活性な物質をア
ミン基を有する担体に固定化するにあたって、多糖類の
酸化生成物を結合剤に用いることを、特、徴とする生物
学的活性物質の固定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2099583A JPS59146589A (ja) | 1983-02-10 | 1983-02-10 | 生物学的活性質の固定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2099583A JPS59146589A (ja) | 1983-02-10 | 1983-02-10 | 生物学的活性質の固定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59146589A true JPS59146589A (ja) | 1984-08-22 |
| JPH0431669B2 JPH0431669B2 (ja) | 1992-05-27 |
Family
ID=12042698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2099583A Granted JPS59146589A (ja) | 1983-02-10 | 1983-02-10 | 生物学的活性質の固定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59146589A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0387662A (ja) * | 1989-08-31 | 1991-04-12 | Tokai Univ | 生化学測定用プラスチックプレート及びその製造方法、並びにそれを用いる生化学測定方法 |
| CN102732500A (zh) * | 2012-07-04 | 2012-10-17 | 浙江农林大学 | 氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5456895A (en) * | 1977-09-19 | 1979-05-08 | Hoffmann La Roche | Novel latex polymer and method of producing same |
-
1983
- 1983-02-10 JP JP2099583A patent/JPS59146589A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5456895A (en) * | 1977-09-19 | 1979-05-08 | Hoffmann La Roche | Novel latex polymer and method of producing same |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0387662A (ja) * | 1989-08-31 | 1991-04-12 | Tokai Univ | 生化学測定用プラスチックプレート及びその製造方法、並びにそれを用いる生化学測定方法 |
| CN102732500A (zh) * | 2012-07-04 | 2012-10-17 | 浙江农林大学 | 氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0431669B2 (ja) | 1992-05-27 |
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