JPS633261B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも下記、式〔〕
〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕
（ただし、式中、〔Ｃ〕は不溶性担体、〔Ｂ〕は抗
体またはレセプター、〔Ａ〕は〔Ｂ〕に対して特
異的に結合する抗体、〔Ｃ〓〓Ａ〕における結合
はスペーサーを介してもよい結合、〔Ａ〓〓Ｂ〕
における結合は免疫結合を示す）で表わされる生
体成分測定用化合物を含有してなる系を、少なく
とも〔Ｂ〕に特異的に結合するリガンドを含有す
る液体、および該リガンド−酵素標識化合物結合
体を作用せしめ、次いで必要に応じてその固相と
液相とを分離回収し、その存在する酵素標識化合
物を測定してなる測定法および測定用キツトに関
する。 従来より、血液、唾液、尿などの体液中に微量
に存在する成分の定性、定量においては、免疫学
的手法またはそれに類似する種々の手法が汎用さ
れており、またこれらの微量の成分としては天然
由来の生理活性物質であつたり、または服用され
た薬物であつたり、さらにそれらの代謝物が挙ら
れ、さらにその免疫学的手法としては、例えば体
液中微量成分としての抗原はこれに対して特異的
に結合する抗体をそのまま、または固定化抗体に
作用せしめ、さらに抗原−標識化合物結合体を使
用して免疫反応を行なわせ、その後抗原−標識化
合物と該抗体との結合体と未反応の抗原−標識化
合物とを分離（通常Ｂ−Ｆ分離という）せしめ、
これに基いて存在する抗原を測定してなるもので
あり、上記の標識化合物として酵素を使用する際
はエンチーモ・イミユノアツセイ
（Enzymoimmuno−assay）として分類され、ま
たラジオアイソトープを使用する際はラジオ・イ
ミユノアツセイ（Rad−ioimmunoassay）、螢光
物質を使用する際は螢光免疫測定法
（Fluoroimmunoassay）、その他遊離基の電子ス
ピン共鳴の特性を利用するスピン・イミユノアツ
セイ（Spin immunoassay）などその標識化合物
の特性を利用してなる種々の方法に大別されるも
ので、さらに上記の固定化抗体を用いる場合にお
いてはそのＢ−Ｆ分離が容易に行なえるとの利点
を有しており、また抗体をそのまま使用する場合
には十分にＢ−Ｆ分離し得ないことがあり、この
場合にはその抗体に対して特異的に結合する抗体
（通常第二抗体という）を使用して良好に行なわ
せしめているものであり、さらにその標識化合物
の特性がその抗原−標識化合物と抗体との結合の
際に変化する点を直接測定してなるＢ−Ｆ分離を
必要としない方法も行なわれているものである。
しかし上記の種々の方法において、抗体を不溶性
担体に結合せしめた固定化抗体を使用する場合、
その抗体活性は固定化の際にその活性が失活また
は劣化するもので、そのためにこの固定化抗体の
抗体活性は常に異なつたものとなり、かつ一定の
抗体活性を有する固定化抗体を得ることはできな
いので、その結果、この固定化抗体を用いてなる
測定においては誤差を生じるという避けられない
欠点があり、また高価な抗体が失活または劣化す
るためコストの高い測定法になるものであつた。
また第二抗体を用いる測定法では一旦抗体を作用
せしめた後に第二抗体を作用せしめるため、その
反応時間は長時間を要する欠点があつた。さら
に、例えば1α・25−（OH）2−コレカルシフロー
ル、インスリン、その他のホルモンなどの生理的
活性物質やその他の種々の薬物においては、近年
レセプター・ラジオ・アツセイ（Receptor
radio assay）として、このレセプターを上記の
抗体の代りに用いて、同様に反応を行なわせて測
定してなる手法が行なわれているが、しかしこの
手法においても同様に上記の如くの欠点を有して
いるものであつた。以上の如く、生体成分たる液
体中における抗体に対して特異的に結合する抗原
や、レセプターに対して特異的に結合する生理的
活性物質や薬物などの種々のリガンドを測定する
に、なお満足のいく良好な方法はなかつた。 本発明者らは、体液たる液体中の種々の微量の
成分たるリガンドのエンチーモ・イミユノアツセ
イに関して種々研究した結果、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
上記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物が、その〔Ｂ〕たる抗体またはレセプター
の活性を損することなく定量的に結合せしめ得た
ものであり、かつそのため測定すべき対応する特
異的に結合するリガンドに対し極めて精度よく反
応し得る極めて有用な化合物であることを見い出
し、またその測定においても正確に測定し得る方
法であり、かつその測定時間も著しく短縮し得る
ことを見い出し、さらにこの式〔〕で表わされ
る生体成分測定用化合物を安定化剤とともに凍結
乾燥することによつて得られる組成物が長期間安
定にその活性を有している良好なものであること
を見い出し、さらにまたこの生体成分測定用化合
物を含有する組成物を用いることにより良好な酵
素免疫的測定を行ないえることを見い出した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、少なくとも、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
前記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物を含有してなる系を、少なくとも〔Ｂ〕に
特異的に結合するリガンドを含有する液体、およ
び該リガンド−酵素標識化合物結合体を作用せし
め、次いで必要に応じてその固相と液相とを分
離、回収し、その存在する酵素標識化合物を測定
することを特徴とする測定法、さらにまた、少な
くとも、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
前記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物、および〔Ｂ〕に特異的に結合するリガン
ド−酵素標識化合物結合体からなる測定用キツト
であつて、本発明は〔Ｂ〕たる抗体またはレセプ
ターを正確かつ劣化することなく結合し得たもの
であり、そのため高価な抗体またはレセプターを
有効に利用し得る利点を有し、また〔Ｂ〕に対し
て特異的に結合する〔Ａ〕の使用量も従来の二抗
体法に比べ少ない使用量にて測定を可能にせしめ
た利点を有し、さらに測定における工程を短縮せ
しめ、かつ短時間にて測定可能であるとの利点を
有し、さらにまたそのＢ−Ｆ分離も極めて簡単と
なる利点を有し、さらに全体的に、測定における
コストを著しく安価にせしめた極めて作用なもの
である。 次に本発明を実施するに当つて、下記、式
〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
上記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物（以下単に、生体成分測定用化合物〔〕
という）を得るものであるが、この生体成分測定
用化合物〔〕の各要件について例示すれば次の
通りである。まず生体成分測定用化合物〔〕に
おける〔Ｃ〕の不溶性担体としては、通常免疫反
応における固相用の担体や結合型固定化酵素にお
ける担体である蛋白質の固定化用担体などが挙ら
れ、〔Ｂ〕たる抗体またはレセプターに対して特
異的に結合する抗体たる〔Ａ〕で表わされる化合
物を結合し得るものであればよく、一般に官能基
または活性化し得る基、例えばアミノ基、イミノ
基、アミド基、水酸基、カルボニル基、カルボキ
シル基、チオール基、アルデヒド基、シアノ基、
イソシアノ基、アジド基、ハロゲン基などや50〜
1000Å程度の吸着能を有する多孔性構造やイオン
交換基を有する水不溶性化合物が挙られ、またこ
れらの不溶性担体は天然高分子物質であつてもよ
く、合成高分子物質であつてもよく、半合成天然
高分子物質であつてもよく、好ましくは例えばセ
ルロース、デキストラン、デキストリン、アガロ
ース、セフアデツクス（商品名）、セフアロース
（商品名）、アミノ化セルロースなどの多糖類、ア
ルブミン、赤血球、微生物菌体、生体細胞などの
蛋白質類などの天然または半合成天然高分子物
質、アクリルアミド、アクリロニトリル、アクリ
ル酸、メタアクリル酸、アクリル酸エステル、メ
タアクリル酸エステル、ビニルアルコール、ビニ
ルクロライド、ビニルアセテート、ジビニルベン
ゼン、スチレンなどのホモまたはコポリマー、特
にポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、
スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、エチレ
ン−マレイン酸コポリマー、アクリルアミド−ア
クリル酸コポリマーや６・６−ナイロン、６−ナ
イロンなどのポリアミド、さらにポリエステルな
どの合成高分子物質や、またガラス、ケイ素樹脂
などのシラン化合物またはそのアミノ化シラン化
合物、アルミナ、ベントナイトなどの無機性物質
や種々のイオン交換樹脂が挙られ、また合成ポリ
マーにおいてはラテツクス粒子状、多孔質性の膜
状または球状など、またガラスなどの無機性物質
においては多孔質性の球状などの形状になすこと
が好ましい。さらに、これらの不溶性担体は、後
述の〔Ａ〕で表わされる化合物を結合せしめるも
のであるため、その担体中の官能基や活性化し得
る基は反応性誘導体となして直接〔Ａ〕で表わさ
れる化合物と結合せしめるか、スペーサーを介し
て間接的に〔Ａ〕で表わされる化合物と結合せし
めるもので、この担体にスペーサーを導入するに
当つては、通常多官能性化合物、例えばε−アミ
ノカプロン酸、ε−アミノペプタン酸、ヘキサメ
チレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、グル
タル酸、アジピン酸、グルタルアルデヒド、ビス
ジアゾベンジジン、ヘキサメチレンジイソシアナ
ート、トルエンジイソシアナート、アジリール−
カルボン酸誘導体（特願昭52−125502号）、３−
（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）−カルボン
酸誘導体（特願昭53−35900号）、３−（ピリジン
ル−Ｎ−オキサイド−2′−イルジチオ）−カルボ
ン酸誘導体（特願昭53−35900号）（以下ジチオ化
合物という）、Ｎ・N′−エチレンビスマレイミド
などの官能基を２以上有するもの、の一種または
２種以上を用いて担体中の官能基と反応せしめれ
ばよく、またその反応においては担体中の官能基
と多官能化合物の官能基とをもつて反応せしめる
もので、その反応に当つては公知の反応性の組合
せを選択組合せればよく、例えば担体中の官能基
たるアミノ基に対しては、グルタルアルデヒド、
ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエンジイ
ソシアナートやグルタル酸、アジピン酸の酸アジ
ド、酸クロライド、活性エステルなどのそのカル
ボキシル基の反応性誘導体などの遊離アミノ基に
反応し得る多官能性化合物との組合せ、またその
アミノ基自体を希塩酸と亜硝酸ナトリウムにてジ
アゾニウム基となし、またはそのアミノ基にイソ
チオシアナートを反応せしめてイソシアナート基
となし、これらの活性化せしめた基に対してのε
−アミノカプロン酸、ε−アミノペプタン酸、ヘ
キサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン
などのアミノ基を有する多官能性化合物との組合
せ、さらにこの多官能性化合物の反応によつて結
合されたスペーサーの末端に有するアルデヒド
基、アミノ基、カルボキシル基はさらにこれを担
体中の官能基として同様にそれに対する多官能性
化合物を反応せしめてスペーサーを導入してもよ
く、また担体中のカルボキシル基に対しては、こ
のカルボキシル基を公知のカルボキシル基の反応
性誘導体、例えば酸アジド、酸クロライド、活性
エステル、酸イミダゾリド、イソシアナートな
ど、を形成せしめ、これに対しての、ヘキサメチ
レンジアミン、ドデカメチレンジアミン、ヘキサ
メチレンジイソシアナートなどのカルボキシル基
の反応性誘導体と反応し得る多官能性化合物との
組合せ、また担体中の水酸基に対しては臭化シア
ンにて一旦活性化せしめ、これに対してのヘキサ
メチレンジアミン、ドデカメチレンジアミンなど
の多官能性化合物とを組合せ、さらに担体中のチ
オール基に対しては、アジリール−カルボン酸誘
導体、３−（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）
−カルボン酸誘導体、３−（ピリジンル−Ｎ−オ
キサイド−2′−イルジチオ）−カルボン酸誘導体
などのジチオ化合物などのチオール基と反応し得
る多官能性化合物との組合せなど、さらにカルボ
ジイミド試薬やウツトワード試薬などを用いてス
ペーサーを導入せしめてもよく、これらのスペー
サー導入に当つては種々の組合せが利用し得、導
入されるスペーサーの分子長としては、何んら限
定されるものではないが通常炭素数換算１〜30分
子長、好ましくは６〜15分子長程度である。ま
た、このスペーサー導入に当つては、必ずしも担
体にまず導入せしめねばならないとの必要性はな
く、あらかじめこの多官能性化合物と〔Ａ〕で表
わされる化合物とを、両者の官能基の反応を介し
て結合せしめ、次いでこれを担体中の官能基と反
応せしめてスペーサーを介して担体と〔Ａ〕で表
わされる化合物とを結合せしめてもよいものであ
る。さらに担体またはスペーサーを導入せしめた
担体は、〔Ａ〕で表わされる化合物と結合せしめ
るために、その官能基を反応性誘導体として活性
化せしめるものであつて、この活性化に当つては
公知の種々の方法が用いられ、また上述のスペー
サー導入の際と同様な方法が用いられるもので、
再述すれば、例えばアミノ基のジアゾニウム、チ
オイソシアナート形成、カルボキシル基の酸アジ
ド、酸クロライド、酸無水物、酸イミダゾリド、
種々の活性エステル、イソシアナート、イミデー
ト形成、水酸基の臭化シアン活性化、カルボニル
基のカルボキシアルキロオキシム形成、シアノ基
のイミデート、アミン形成、アミド基のイミノク
ロライド、イミノエーテル、アシルアミド形成な
どの種々の活性化が挙られ、これらの活性化せし
めたその反応性誘導体が〔Ａ〕で表わされる化合
物との結合に際して使用されるものである。さら
にまた、これらの担体またはスペーサーを導入せ
しめたものは公知化合物のみならず新規なもので
あつても〔Ａ〕で表わされる化合物と結合し得る
ものであればすべて使用し得るもので、例えば
６・６−ナイロン、６−ナイロンなどのポリアミ
ドの不溶性担体（好ましくはビース状物）をγ−
アミノプロピルトリエトキシシランにて100℃、
３時間加熱反応せしめ、これを取、水洗、乾燥
せしめてこのポリアミドの一部にγ−アミノプロ
ピル基を導入せしめたγ−アミノプロピル化ポリ
アミド、ポリアクリロニトリルまたはポリアクリ
ロニトリル系ポリマーの糸状、膜状またはビーズ
状物をジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒ
ドロフランなどの媒体中水素化リチウムアルミニ
ウムにて１〜48時間加熱還流せしめて、そのニト
リル基の一部を還元せしめてアミノ基となしたア
ミノ化ポリアクリロニトリルまたはポリアクリロ
ニトリル系ポリマー（特願昭53−18001号）、ポリ
アミドのビース状物をベンゼン、トルエン、ピリ
ジンなどの媒体中三塩化リン、五塩化リンなどの
塩素化剤を、ポリアミド10ｇ当り１〜２ｇ程度加
えて５〜10時間室温下撹拌反応せしめて、そのア
ミド基の一部をイミノクロライド化せしめ、次い
でこれにコハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ス
ベリン酸、フマル酸などのジカルボン酸のモノア
ルカリ金属塩を水性媒体化一夜撹拌反応せしめて
そのアミド基をアシルアミドとなし、次いでこの
アシル導入のカルボキシル基を公知の活性化を用
いてその活性エステル、酸アジド、酸ハロゲンな
どの反応性誘導体となしたカルボキシル基の反応
性誘導体を導入したポリアミド、さらに２−ベン
ゾリル基、２−ピリジール−Ｎ−オキサイド基を
有するジチオ−セフアロース化合物のビース状物
（特願昭53−49958号）などの新規な水不溶性担体
またはそのスペーサー導入担体が挙られる。な
お、本発明に用いられる、この不溶性担体とスペ
ーサーを導入した不溶性担体との明確な区別は付
け難いもので、スペーサーを導入した不溶性担体
を単に新規な担体とする場合も想定し得るもので
あるが、本発明においては当然スペーサーを導入
せしめた担体として包含されるものであり、また
上記以外の担体、スペーサー、その他その結合手
段等を用いてなる担体またはスペーサー導入担体
も、本発明に使用し得るものであれば、当然本発
明の担体またはスペーサー導入担体として包含さ
れるものである。 また本発明に使用される下記、式〔〕 〔Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｂ〕は前記と同一である）で
表わされる化合物（以下〔Ｂ〕化合物〔〕とい
う）は、抗体またはレセプターであり、抗体とは
抗原やハプテンと特異的に結合する免疫成分であ
り、レセプターとは生理的活性物質や薬物と特異
的に結合する受容体成分であり、これらは公知の
方法によつて得られるものである。抗体の製造、
採取としては、これに対して特異的に結合するリ
ガンドである抗原やハプテンを用いて行なわれる
ものであつて、例えば抗原を用いる場合は、ラツ
ト、ウサギ、牛、馬、羊、山羊などの哺乳動物、
通常ラツトやウサギなどの小型哺乳動物に抗原溶
液を、必要に応じてアジユバントを併用して、１
〜２週間間隔にて、５〜10回程度皮下注射して感
作せしめ、その後その動物の血液の全部または一
部を採取し、これを遠心分離して血清を得て、使
用した抗原と特異的に結合する抗体成分を含有す
る血清を得るもので、これは、さらに必要に応じ
て加温処理して非動化せしめるか、またはさらに
塩析、透析やシリカゲル、活性炭、リン酸カルシ
ウムゲル、セフアデツクスG100、セフアデツク
スG200、セフアデツクスLH20、ジエチルアミノ
エチルセルロース、セフアロース6B、セフアロ
ース4Bやポリアクリルアミドなどを用いるクロ
マトグラフイーやゲル過、ポリアクリルアミド
電気泳動や対応する抗原、ハプテンを固定化して
得られる担体を用いるアフイニテイークロマトグ
ラフイーなどを行なつて抗体成分中の免疫グロブ
リンたるIgG、IgM、IgAなどを得ればよく、ま
たハプテンを用いる場合は、ハプテンはそれ自体
抗体を形成する能力はないが、蛋白質やその他の
高分子物質と結合することにより抗原となるもの
で、それによつて得られた抗体に対しては免疫反
応を行なうものであり、一般にこのハプテンは蛋
白質や高分子物質と結合せしめ、またハプテン分
子中に蛋白質や高分子物質と結合し得る官能基を
有していないときは、ハプテンに官能基を導入せ
しめ、この導入した官能基に基いて結合せしめる
もので、これを、上記の抗原の場合と同様にして
哺乳動物に投与して感作せしめ、その血液より抗
体成分を得、必要に応じて精製すればよい。これ
らの抗体の製造、採取の方法は、すでに多種の文
献に詳しく記載されているものであつて、これら
の公知の方法に基いて製造、採取すればよい。ま
たこれらの文献を例示すれば、ザ・ジヤーナル・
オブ・フイジオロジー、155、302〜310（1961）、
蛋白質核酸酵素11（13）1472〜1474、1587〜1602
（1966）、ステロイド19(2)181〜192（1972）、実験と
応用、アフイニテイークロマトグラフイー169〜
172（1976）などが挙られる。また、この抗体に特
異的に結合するリガンドである抗原やハプテンと
しては、生体内の液体たる血液、唾液、尿中に微
量に存在する天然由来の生理的活性物質や抗生物
質、催眠剤、鎮痛剤、筋弛緩剤、精神療法剤、解
熱剤、抗ヒスタミン剤、交感神経系薬剤、副交感
神経系薬剤、心筋興奮剤、血管拡張剤、血管収縮
剤、抗しゆよう剤、ホルモン剤などの服用された
薬物、微生物由来の成分、さらにそれらの代謝物
などであつて、その分子量、構造、作用などによ
れば極めて多種にわたつているものであり、例え
ばインスリン、カルチトニン、成長ホルモン、プ
ロラクチン、ACTH、パラチロイドホルモン、
グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレ
オザイシン、コレスチキニン、アンギオテンシ
ン、FSH、オキシトシン、バゾプレシン、サイ
ロキシン、トリヨードサイドニン、プロスタグラ
ンジン、1α・25−（OH）2−コレカルシフエロー
ル、アイソザイム、ペニシリン、セフアロスポリ
ン、クロラムフエニコール、モルフイン、ヘロイ
ン、コデイン、ジヒドロコデイン、ニコチン、ピ
ルカルピン、アトロピン、エフエドリン、エピネ
フイリン、Ｌ−ドーパー、アンフエタミン、ノル
エピレナミン、アロプレノール、イソプレノー
ル、フエノバルビタール、バルビタール、ペント
バルビタール、ジアゼパム、オキサゼパム、ニト
ラゼパム、テストステロン、アンドロステロン、
メチルテストステロン、エストラジオール、エス
トロン、エストリオール、プロゲステロン、プレ
グネノロン、コルチゾン、プレゾニゾロン、アル
ドステロン、クロルブロマジン、フエノチアゾー
ル、ジフエニルヒダントイン、微生物由来のポリ
サツカライド、リポ蛋白、トキシン、DNAなど
が挙られるもので、これらは何んら限定されるも
のではなく、生体内に存在する、または生体内に
投与されるすべてのものがその対象となるもので
ある。またレセプターの採取としては、上記の
種々の生理的活性物質や投与される薬物などのリ
ガンドの作用、効果発揮のためのリガンドの受容
器が各々対応する生体内部位、例えばペプタイド
ホルモンなどのリガンドに対しては特に細胞膜表
面部位に存在するものであり、また低分子物質の
ハプテンなどのリガンドに対しては細胞内部位に
存在しており、例えば1α・25−（OH）2−コレカ
ルシフエロールをリガンドとする場合は腎臓、イ
ンスリンをリガンドとする場合は肝臓や脂肪細
胞、成長ホルモンをリガンドとする場合は肝臓、
その他ホルモンをリガンドとする場合は各ホルモ
ンの作用部位を用いて、これらの各レセプターを
有するその組織を用いてそのレセプターを抽出、
採取するものであり、一般に哺乳動物の組織を一
旦ホモゲナイズし、その活性画分を得、さらにこ
れをアフイニテイークロマトグラフイー、シヨ糖
密度包配遠沈法、各種カラムクロマトグラフイ
ー、ゲル過、電気泳動法を用いてその活性画分
を精製、回収すればよい。このレセプターは各リ
ガンドに対して特異的に結合し得るものであつ
て、その分子量は通常２万〜50万程度、沈降定数
も3S〜9S程度のものであり、このレセプターは
対応するリガンドに対して多種存在するものであ
る。このレセプターに対するリガンドとしては、
上記抗体に対する抗原、ハプテンと同様に、種々
のペプタイドホルモン、ステロイドホルモン、そ
の他のエピレナミン、ノルエピレナミンなどの
種々の生理的活性物質、薬物が挙られるものであ
る。またこれらに関する文献としては、エンドク
リノロジ−101(4)1034〜1043（1977）、ザ・ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー249
(4)1251〜1257（1974）を参照されたい。 さらに、本発明で用いられる〔Ａ〕で表わされ
る化合物（以下〔Ａ〕化合物という）としては、
〔Ｂ〕化合物〔〕に対して特異的に結合する抗
体であつて、上記の通り、〔Ｂ〕化合物〔〕は
抗体またはレセプターを示すものであるから、こ
の抗体またはレセプターをもつて、別種の哺乳動
物に投与してそれに対する抗体を得ればよく、一
般に〔Ａ〕化合物を得るに当つては、この〔Ｂ〕
化合物〔〕の抗体またはレセプターを、前記の
抗原の場合の抗原と同様に扱つて、別種の哺乳動
物に感作せしめ、その血液より血清を得、さらに
これを精製すればよく、また〔Ｂ〕化合物〔〕
の製造において抗原、ハプテンを用いてラツトや
ウサギを使用した場合にはその〔Ｂ〕化合物
〔〕はラツトやウサギの免疫成分たる免疫グロ
ブリンが得られるものであつて、この免疫グロブ
リンを別種の動物、例えばラツトの免疫グロブリ
ンに対してはウサギ、モルモツト、羊、山羊、
馬、牛など、ウサギの免疫グロブリンに対しては
羊、山羊、馬、牛などを用いてそれに対する抗
体、即ち抗ラツト免疫グロブリン血清、抗ウサギ
免疫グロブリン血清やその血清からの免疫グロブ
リンを得ればよく、また市販されているラツトや
ウサギなどの哺乳動物の免疫グロブリンを用いて
同様にして得られたそれらの抗免疫グロブリン成
分（第二抗体）を用いることが簡便である。さら
にレセプターに対して特異的に結合する〔Ａ〕化
合物としては、上記の免疫グロブリンの代りにこ
のレセプターを同様に用いて適宜選択した動物に
感作せしめ、その血清を採取してレセプターに対
する抗体を得ればよい。なお、〔Ｂ〕化合物〔〕
について、この〔Ｂ〕化合物〔〕をもつて、そ
れに対して特異的に結合する抗体たる〔Ａ〕化合
物を得るに当つては、その〔Ｂ〕化合物〔〕は
血清の状態にて用いることは別異の蛋白質等を混
入しているため、アフイニテイークロマトグラフ
イーや他の種々のクロマトグラフイー、ゲル
過、電気泳動などにて単一の成分まで純化して使
用するものである。また、この〔Ａ〕化合物は
〔Ｃ〕の不溶性担体と適宜スペーサーを介して結
合せしめるものであるが、前記の通り、この
〔Ａ〕化合物はあらかじめ前述の多官能性化合物
にてスペーサーを導入せしめたものであつてもよ
い。 次いで、この〔Ｃ〕の不溶性担体と〔Ａ〕化合
物とを、適宜スペーサーを介して、結合せしめ
て、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ａ〕および〔Ｃ〓〓Ａ〕
における結合は前記と同一である）で表わされる
化合物（以下、化合物〔〕という）を得るので
あるが、この結合に際して、〔Ｃ〕の不溶性担体
や〔Ａ〕化合物中の官能基やそれらに導入された
スペーサー中の官能基は両者が結合し得るに良好
な活性化された基に適宜行なえばよく、例えばカ
ルボキシル基は酸アミド、酸クロライド、活性エ
ステル、酸イミダゾリド、イソシアナートなどに
活性化せしめればよく、またアミノ基はイソシア
ナート、ジアゾニウムなどに活性化せしめるかグ
ルタルアルデヒドにてアルデヒド基末端となして
もよく、水酸基は臭酸シアンにて活性化せしめ、
アミド基はイミノクロル、イミノエーテル、活性
化したカルボキシル基を有するアシルアミドにて
活性化せしめ、シアノ基は還元してアミノ基とす
るか、イミノエーテルなどに活性化せしめればよ
く、またこれらの活性化せしめる官能基は〔Ｃ〕
の不溶性担体中の官能基を対象とすることが好ま
しい。このように〔Ｃ〕の不溶性担体中の官能基
を主に活性化せしめることより、〔Ａ〕化合物中
のアミノ基と容易に結合せしめ得るもので、さら
に〔Ａ〕化合物中のアミノ基はジチオ化合物また
はアジリール−カルボン酸誘導体と反応せしめて
得られるチオール基と反応する官能基を導入せし
めて〔Ｃ〕の不溶性担体中のチオール基と容易に
結合せしめ得てもよく、要は両者の官能基を必要
に応じて活性化せしめて結合せしめればよいもの
であり、これらの結合し得る官能基または活性化
された基を例示すれば次の如くである。
体またはレセプター、〔Ａ〕は〔Ｂ〕に対して特
異的に結合する抗体、〔Ｃ〓〓Ａ〕における結合
はスペーサーを介してもよい結合、〔Ａ〓〓Ｂ〕
における結合は免疫結合を示す）で表わされる生
体成分測定用化合物を含有してなる系を、少なく
とも〔Ｂ〕に特異的に結合するリガンドを含有す
る液体、および該リガンド−酵素標識化合物結合
体を作用せしめ、次いで必要に応じてその固相と
液相とを分離回収し、その存在する酵素標識化合
物を測定してなる測定法および測定用キツトに関
する。 従来より、血液、唾液、尿などの体液中に微量
に存在する成分の定性、定量においては、免疫学
的手法またはそれに類似する種々の手法が汎用さ
れており、またこれらの微量の成分としては天然
由来の生理活性物質であつたり、または服用され
た薬物であつたり、さらにそれらの代謝物が挙ら
れ、さらにその免疫学的手法としては、例えば体
液中微量成分としての抗原はこれに対して特異的
に結合する抗体をそのまま、または固定化抗体に
作用せしめ、さらに抗原−標識化合物結合体を使
用して免疫反応を行なわせ、その後抗原−標識化
合物と該抗体との結合体と未反応の抗原−標識化
合物とを分離（通常Ｂ−Ｆ分離という）せしめ、
これに基いて存在する抗原を測定してなるもので
あり、上記の標識化合物として酵素を使用する際
はエンチーモ・イミユノアツセイ
（Enzymoimmuno−assay）として分類され、ま
たラジオアイソトープを使用する際はラジオ・イ
ミユノアツセイ（Rad−ioimmunoassay）、螢光
物質を使用する際は螢光免疫測定法
（Fluoroimmunoassay）、その他遊離基の電子ス
ピン共鳴の特性を利用するスピン・イミユノアツ
セイ（Spin immunoassay）などその標識化合物
の特性を利用してなる種々の方法に大別されるも
ので、さらに上記の固定化抗体を用いる場合にお
いてはそのＢ−Ｆ分離が容易に行なえるとの利点
を有しており、また抗体をそのまま使用する場合
には十分にＢ−Ｆ分離し得ないことがあり、この
場合にはその抗体に対して特異的に結合する抗体
（通常第二抗体という）を使用して良好に行なわ
せしめているものであり、さらにその標識化合物
の特性がその抗原−標識化合物と抗体との結合の
際に変化する点を直接測定してなるＢ−Ｆ分離を
必要としない方法も行なわれているものである。
しかし上記の種々の方法において、抗体を不溶性
担体に結合せしめた固定化抗体を使用する場合、
その抗体活性は固定化の際にその活性が失活また
は劣化するもので、そのためにこの固定化抗体の
抗体活性は常に異なつたものとなり、かつ一定の
抗体活性を有する固定化抗体を得ることはできな
いので、その結果、この固定化抗体を用いてなる
測定においては誤差を生じるという避けられない
欠点があり、また高価な抗体が失活または劣化す
るためコストの高い測定法になるものであつた。
また第二抗体を用いる測定法では一旦抗体を作用
せしめた後に第二抗体を作用せしめるため、その
反応時間は長時間を要する欠点があつた。さら
に、例えば1α・25−（OH）2−コレカルシフロー
ル、インスリン、その他のホルモンなどの生理的
活性物質やその他の種々の薬物においては、近年
レセプター・ラジオ・アツセイ（Receptor
radio assay）として、このレセプターを上記の
抗体の代りに用いて、同様に反応を行なわせて測
定してなる手法が行なわれているが、しかしこの
手法においても同様に上記の如くの欠点を有して
いるものであつた。以上の如く、生体成分たる液
体中における抗体に対して特異的に結合する抗原
や、レセプターに対して特異的に結合する生理的
活性物質や薬物などの種々のリガンドを測定する
に、なお満足のいく良好な方法はなかつた。 本発明者らは、体液たる液体中の種々の微量の
成分たるリガンドのエンチーモ・イミユノアツセ
イに関して種々研究した結果、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
上記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物が、その〔Ｂ〕たる抗体またはレセプター
の活性を損することなく定量的に結合せしめ得た
ものであり、かつそのため測定すべき対応する特
異的に結合するリガンドに対し極めて精度よく反
応し得る極めて有用な化合物であることを見い出
し、またその測定においても正確に測定し得る方
法であり、かつその測定時間も著しく短縮し得る
ことを見い出し、さらにこの式〔〕で表わされ
る生体成分測定用化合物を安定化剤とともに凍結
乾燥することによつて得られる組成物が長期間安
定にその活性を有している良好なものであること
を見い出し、さらにまたこの生体成分測定用化合
物を含有する組成物を用いることにより良好な酵
素免疫的測定を行ないえることを見い出した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、少なくとも、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
前記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物を含有してなる系を、少なくとも〔Ｂ〕に
特異的に結合するリガンドを含有する液体、およ
び該リガンド−酵素標識化合物結合体を作用せし
め、次いで必要に応じてその固相と液相とを分
離、回収し、その存在する酵素標識化合物を測定
することを特徴とする測定法、さらにまた、少な
くとも、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
前記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物、および〔Ｂ〕に特異的に結合するリガン
ド−酵素標識化合物結合体からなる測定用キツト
であつて、本発明は〔Ｂ〕たる抗体またはレセプ
ターを正確かつ劣化することなく結合し得たもの
であり、そのため高価な抗体またはレセプターを
有効に利用し得る利点を有し、また〔Ｂ〕に対し
て特異的に結合する〔Ａ〕の使用量も従来の二抗
体法に比べ少ない使用量にて測定を可能にせしめ
た利点を有し、さらに測定における工程を短縮せ
しめ、かつ短時間にて測定可能であるとの利点を
有し、さらにまたそのＢ−Ｆ分離も極めて簡単と
なる利点を有し、さらに全体的に、測定における
コストを著しく安価にせしめた極めて作用なもの
である。 次に本発明を実施するに当つて、下記、式
〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ｂ〕、〔Ａ〕、〔Ｃ〓〓Ａ
〕
における結合および〔Ａ〓〓Ｂ〕における結合は
上記と同一である）で表わされる生体成分測定用
化合物（以下単に、生体成分測定用化合物〔〕
という）を得るものであるが、この生体成分測定
用化合物〔〕の各要件について例示すれば次の
通りである。まず生体成分測定用化合物〔〕に
おける〔Ｃ〕の不溶性担体としては、通常免疫反
応における固相用の担体や結合型固定化酵素にお
ける担体である蛋白質の固定化用担体などが挙ら
れ、〔Ｂ〕たる抗体またはレセプターに対して特
異的に結合する抗体たる〔Ａ〕で表わされる化合
物を結合し得るものであればよく、一般に官能基
または活性化し得る基、例えばアミノ基、イミノ
基、アミド基、水酸基、カルボニル基、カルボキ
シル基、チオール基、アルデヒド基、シアノ基、
イソシアノ基、アジド基、ハロゲン基などや50〜
1000Å程度の吸着能を有する多孔性構造やイオン
交換基を有する水不溶性化合物が挙られ、またこ
れらの不溶性担体は天然高分子物質であつてもよ
く、合成高分子物質であつてもよく、半合成天然
高分子物質であつてもよく、好ましくは例えばセ
ルロース、デキストラン、デキストリン、アガロ
ース、セフアデツクス（商品名）、セフアロース
（商品名）、アミノ化セルロースなどの多糖類、ア
ルブミン、赤血球、微生物菌体、生体細胞などの
蛋白質類などの天然または半合成天然高分子物
質、アクリルアミド、アクリロニトリル、アクリ
ル酸、メタアクリル酸、アクリル酸エステル、メ
タアクリル酸エステル、ビニルアルコール、ビニ
ルクロライド、ビニルアセテート、ジビニルベン
ゼン、スチレンなどのホモまたはコポリマー、特
にポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、
スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、エチレ
ン−マレイン酸コポリマー、アクリルアミド−ア
クリル酸コポリマーや６・６−ナイロン、６−ナ
イロンなどのポリアミド、さらにポリエステルな
どの合成高分子物質や、またガラス、ケイ素樹脂
などのシラン化合物またはそのアミノ化シラン化
合物、アルミナ、ベントナイトなどの無機性物質
や種々のイオン交換樹脂が挙られ、また合成ポリ
マーにおいてはラテツクス粒子状、多孔質性の膜
状または球状など、またガラスなどの無機性物質
においては多孔質性の球状などの形状になすこと
が好ましい。さらに、これらの不溶性担体は、後
述の〔Ａ〕で表わされる化合物を結合せしめるも
のであるため、その担体中の官能基や活性化し得
る基は反応性誘導体となして直接〔Ａ〕で表わさ
れる化合物と結合せしめるか、スペーサーを介し
て間接的に〔Ａ〕で表わされる化合物と結合せし
めるもので、この担体にスペーサーを導入するに
当つては、通常多官能性化合物、例えばε−アミ
ノカプロン酸、ε−アミノペプタン酸、ヘキサメ
チレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、グル
タル酸、アジピン酸、グルタルアルデヒド、ビス
ジアゾベンジジン、ヘキサメチレンジイソシアナ
ート、トルエンジイソシアナート、アジリール−
カルボン酸誘導体（特願昭52−125502号）、３−
（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）−カルボン
酸誘導体（特願昭53−35900号）、３−（ピリジン
ル−Ｎ−オキサイド−2′−イルジチオ）−カルボ
ン酸誘導体（特願昭53−35900号）（以下ジチオ化
合物という）、Ｎ・N′−エチレンビスマレイミド
などの官能基を２以上有するもの、の一種または
２種以上を用いて担体中の官能基と反応せしめれ
ばよく、またその反応においては担体中の官能基
と多官能化合物の官能基とをもつて反応せしめる
もので、その反応に当つては公知の反応性の組合
せを選択組合せればよく、例えば担体中の官能基
たるアミノ基に対しては、グルタルアルデヒド、
ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエンジイ
ソシアナートやグルタル酸、アジピン酸の酸アジ
ド、酸クロライド、活性エステルなどのそのカル
ボキシル基の反応性誘導体などの遊離アミノ基に
反応し得る多官能性化合物との組合せ、またその
アミノ基自体を希塩酸と亜硝酸ナトリウムにてジ
アゾニウム基となし、またはそのアミノ基にイソ
チオシアナートを反応せしめてイソシアナート基
となし、これらの活性化せしめた基に対してのε
−アミノカプロン酸、ε−アミノペプタン酸、ヘ
キサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン
などのアミノ基を有する多官能性化合物との組合
せ、さらにこの多官能性化合物の反応によつて結
合されたスペーサーの末端に有するアルデヒド
基、アミノ基、カルボキシル基はさらにこれを担
体中の官能基として同様にそれに対する多官能性
化合物を反応せしめてスペーサーを導入してもよ
く、また担体中のカルボキシル基に対しては、こ
のカルボキシル基を公知のカルボキシル基の反応
性誘導体、例えば酸アジド、酸クロライド、活性
エステル、酸イミダゾリド、イソシアナートな
ど、を形成せしめ、これに対しての、ヘキサメチ
レンジアミン、ドデカメチレンジアミン、ヘキサ
メチレンジイソシアナートなどのカルボキシル基
の反応性誘導体と反応し得る多官能性化合物との
組合せ、また担体中の水酸基に対しては臭化シア
ンにて一旦活性化せしめ、これに対してのヘキサ
メチレンジアミン、ドデカメチレンジアミンなど
の多官能性化合物とを組合せ、さらに担体中のチ
オール基に対しては、アジリール−カルボン酸誘
導体、３−（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）
−カルボン酸誘導体、３−（ピリジンル−Ｎ−オ
キサイド−2′−イルジチオ）−カルボン酸誘導体
などのジチオ化合物などのチオール基と反応し得
る多官能性化合物との組合せなど、さらにカルボ
ジイミド試薬やウツトワード試薬などを用いてス
ペーサーを導入せしめてもよく、これらのスペー
サー導入に当つては種々の組合せが利用し得、導
入されるスペーサーの分子長としては、何んら限
定されるものではないが通常炭素数換算１〜30分
子長、好ましくは６〜15分子長程度である。ま
た、このスペーサー導入に当つては、必ずしも担
体にまず導入せしめねばならないとの必要性はな
く、あらかじめこの多官能性化合物と〔Ａ〕で表
わされる化合物とを、両者の官能基の反応を介し
て結合せしめ、次いでこれを担体中の官能基と反
応せしめてスペーサーを介して担体と〔Ａ〕で表
わされる化合物とを結合せしめてもよいものであ
る。さらに担体またはスペーサーを導入せしめた
担体は、〔Ａ〕で表わされる化合物と結合せしめ
るために、その官能基を反応性誘導体として活性
化せしめるものであつて、この活性化に当つては
公知の種々の方法が用いられ、また上述のスペー
サー導入の際と同様な方法が用いられるもので、
再述すれば、例えばアミノ基のジアゾニウム、チ
オイソシアナート形成、カルボキシル基の酸アジ
ド、酸クロライド、酸無水物、酸イミダゾリド、
種々の活性エステル、イソシアナート、イミデー
ト形成、水酸基の臭化シアン活性化、カルボニル
基のカルボキシアルキロオキシム形成、シアノ基
のイミデート、アミン形成、アミド基のイミノク
ロライド、イミノエーテル、アシルアミド形成な
どの種々の活性化が挙られ、これらの活性化せし
めたその反応性誘導体が〔Ａ〕で表わされる化合
物との結合に際して使用されるものである。さら
にまた、これらの担体またはスペーサーを導入せ
しめたものは公知化合物のみならず新規なもので
あつても〔Ａ〕で表わされる化合物と結合し得る
ものであればすべて使用し得るもので、例えば
６・６−ナイロン、６−ナイロンなどのポリアミ
ドの不溶性担体（好ましくはビース状物）をγ−
アミノプロピルトリエトキシシランにて100℃、
３時間加熱反応せしめ、これを取、水洗、乾燥
せしめてこのポリアミドの一部にγ−アミノプロ
ピル基を導入せしめたγ−アミノプロピル化ポリ
アミド、ポリアクリロニトリルまたはポリアクリ
ロニトリル系ポリマーの糸状、膜状またはビーズ
状物をジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒ
ドロフランなどの媒体中水素化リチウムアルミニ
ウムにて１〜48時間加熱還流せしめて、そのニト
リル基の一部を還元せしめてアミノ基となしたア
ミノ化ポリアクリロニトリルまたはポリアクリロ
ニトリル系ポリマー（特願昭53−18001号）、ポリ
アミドのビース状物をベンゼン、トルエン、ピリ
ジンなどの媒体中三塩化リン、五塩化リンなどの
塩素化剤を、ポリアミド10ｇ当り１〜２ｇ程度加
えて５〜10時間室温下撹拌反応せしめて、そのア
ミド基の一部をイミノクロライド化せしめ、次い
でこれにコハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ス
ベリン酸、フマル酸などのジカルボン酸のモノア
ルカリ金属塩を水性媒体化一夜撹拌反応せしめて
そのアミド基をアシルアミドとなし、次いでこの
アシル導入のカルボキシル基を公知の活性化を用
いてその活性エステル、酸アジド、酸ハロゲンな
どの反応性誘導体となしたカルボキシル基の反応
性誘導体を導入したポリアミド、さらに２−ベン
ゾリル基、２−ピリジール−Ｎ−オキサイド基を
有するジチオ−セフアロース化合物のビース状物
（特願昭53−49958号）などの新規な水不溶性担体
またはそのスペーサー導入担体が挙られる。な
お、本発明に用いられる、この不溶性担体とスペ
ーサーを導入した不溶性担体との明確な区別は付
け難いもので、スペーサーを導入した不溶性担体
を単に新規な担体とする場合も想定し得るもので
あるが、本発明においては当然スペーサーを導入
せしめた担体として包含されるものであり、また
上記以外の担体、スペーサー、その他その結合手
段等を用いてなる担体またはスペーサー導入担体
も、本発明に使用し得るものであれば、当然本発
明の担体またはスペーサー導入担体として包含さ
れるものである。 また本発明に使用される下記、式〔〕 〔Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｂ〕は前記と同一である）で
表わされる化合物（以下〔Ｂ〕化合物〔〕とい
う）は、抗体またはレセプターであり、抗体とは
抗原やハプテンと特異的に結合する免疫成分であ
り、レセプターとは生理的活性物質や薬物と特異
的に結合する受容体成分であり、これらは公知の
方法によつて得られるものである。抗体の製造、
採取としては、これに対して特異的に結合するリ
ガンドである抗原やハプテンを用いて行なわれる
ものであつて、例えば抗原を用いる場合は、ラツ
ト、ウサギ、牛、馬、羊、山羊などの哺乳動物、
通常ラツトやウサギなどの小型哺乳動物に抗原溶
液を、必要に応じてアジユバントを併用して、１
〜２週間間隔にて、５〜10回程度皮下注射して感
作せしめ、その後その動物の血液の全部または一
部を採取し、これを遠心分離して血清を得て、使
用した抗原と特異的に結合する抗体成分を含有す
る血清を得るもので、これは、さらに必要に応じ
て加温処理して非動化せしめるか、またはさらに
塩析、透析やシリカゲル、活性炭、リン酸カルシ
ウムゲル、セフアデツクスG100、セフアデツク
スG200、セフアデツクスLH20、ジエチルアミノ
エチルセルロース、セフアロース6B、セフアロ
ース4Bやポリアクリルアミドなどを用いるクロ
マトグラフイーやゲル過、ポリアクリルアミド
電気泳動や対応する抗原、ハプテンを固定化して
得られる担体を用いるアフイニテイークロマトグ
ラフイーなどを行なつて抗体成分中の免疫グロブ
リンたるIgG、IgM、IgAなどを得ればよく、ま
たハプテンを用いる場合は、ハプテンはそれ自体
抗体を形成する能力はないが、蛋白質やその他の
高分子物質と結合することにより抗原となるもの
で、それによつて得られた抗体に対しては免疫反
応を行なうものであり、一般にこのハプテンは蛋
白質や高分子物質と結合せしめ、またハプテン分
子中に蛋白質や高分子物質と結合し得る官能基を
有していないときは、ハプテンに官能基を導入せ
しめ、この導入した官能基に基いて結合せしめる
もので、これを、上記の抗原の場合と同様にして
哺乳動物に投与して感作せしめ、その血液より抗
体成分を得、必要に応じて精製すればよい。これ
らの抗体の製造、採取の方法は、すでに多種の文
献に詳しく記載されているものであつて、これら
の公知の方法に基いて製造、採取すればよい。ま
たこれらの文献を例示すれば、ザ・ジヤーナル・
オブ・フイジオロジー、155、302〜310（1961）、
蛋白質核酸酵素11（13）1472〜1474、1587〜1602
（1966）、ステロイド19(2)181〜192（1972）、実験と
応用、アフイニテイークロマトグラフイー169〜
172（1976）などが挙られる。また、この抗体に特
異的に結合するリガンドである抗原やハプテンと
しては、生体内の液体たる血液、唾液、尿中に微
量に存在する天然由来の生理的活性物質や抗生物
質、催眠剤、鎮痛剤、筋弛緩剤、精神療法剤、解
熱剤、抗ヒスタミン剤、交感神経系薬剤、副交感
神経系薬剤、心筋興奮剤、血管拡張剤、血管収縮
剤、抗しゆよう剤、ホルモン剤などの服用された
薬物、微生物由来の成分、さらにそれらの代謝物
などであつて、その分子量、構造、作用などによ
れば極めて多種にわたつているものであり、例え
ばインスリン、カルチトニン、成長ホルモン、プ
ロラクチン、ACTH、パラチロイドホルモン、
グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレ
オザイシン、コレスチキニン、アンギオテンシ
ン、FSH、オキシトシン、バゾプレシン、サイ
ロキシン、トリヨードサイドニン、プロスタグラ
ンジン、1α・25−（OH）2−コレカルシフエロー
ル、アイソザイム、ペニシリン、セフアロスポリ
ン、クロラムフエニコール、モルフイン、ヘロイ
ン、コデイン、ジヒドロコデイン、ニコチン、ピ
ルカルピン、アトロピン、エフエドリン、エピネ
フイリン、Ｌ−ドーパー、アンフエタミン、ノル
エピレナミン、アロプレノール、イソプレノー
ル、フエノバルビタール、バルビタール、ペント
バルビタール、ジアゼパム、オキサゼパム、ニト
ラゼパム、テストステロン、アンドロステロン、
メチルテストステロン、エストラジオール、エス
トロン、エストリオール、プロゲステロン、プレ
グネノロン、コルチゾン、プレゾニゾロン、アル
ドステロン、クロルブロマジン、フエノチアゾー
ル、ジフエニルヒダントイン、微生物由来のポリ
サツカライド、リポ蛋白、トキシン、DNAなど
が挙られるもので、これらは何んら限定されるも
のではなく、生体内に存在する、または生体内に
投与されるすべてのものがその対象となるもので
ある。またレセプターの採取としては、上記の
種々の生理的活性物質や投与される薬物などのリ
ガンドの作用、効果発揮のためのリガンドの受容
器が各々対応する生体内部位、例えばペプタイド
ホルモンなどのリガンドに対しては特に細胞膜表
面部位に存在するものであり、また低分子物質の
ハプテンなどのリガンドに対しては細胞内部位に
存在しており、例えば1α・25−（OH）2−コレカ
ルシフエロールをリガンドとする場合は腎臓、イ
ンスリンをリガンドとする場合は肝臓や脂肪細
胞、成長ホルモンをリガンドとする場合は肝臓、
その他ホルモンをリガンドとする場合は各ホルモ
ンの作用部位を用いて、これらの各レセプターを
有するその組織を用いてそのレセプターを抽出、
採取するものであり、一般に哺乳動物の組織を一
旦ホモゲナイズし、その活性画分を得、さらにこ
れをアフイニテイークロマトグラフイー、シヨ糖
密度包配遠沈法、各種カラムクロマトグラフイ
ー、ゲル過、電気泳動法を用いてその活性画分
を精製、回収すればよい。このレセプターは各リ
ガンドに対して特異的に結合し得るものであつ
て、その分子量は通常２万〜50万程度、沈降定数
も3S〜9S程度のものであり、このレセプターは
対応するリガンドに対して多種存在するものであ
る。このレセプターに対するリガンドとしては、
上記抗体に対する抗原、ハプテンと同様に、種々
のペプタイドホルモン、ステロイドホルモン、そ
の他のエピレナミン、ノルエピレナミンなどの
種々の生理的活性物質、薬物が挙られるものであ
る。またこれらに関する文献としては、エンドク
リノロジ−101(4)1034〜1043（1977）、ザ・ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー249
(4)1251〜1257（1974）を参照されたい。 さらに、本発明で用いられる〔Ａ〕で表わされ
る化合物（以下〔Ａ〕化合物という）としては、
〔Ｂ〕化合物〔〕に対して特異的に結合する抗
体であつて、上記の通り、〔Ｂ〕化合物〔〕は
抗体またはレセプターを示すものであるから、こ
の抗体またはレセプターをもつて、別種の哺乳動
物に投与してそれに対する抗体を得ればよく、一
般に〔Ａ〕化合物を得るに当つては、この〔Ｂ〕
化合物〔〕の抗体またはレセプターを、前記の
抗原の場合の抗原と同様に扱つて、別種の哺乳動
物に感作せしめ、その血液より血清を得、さらに
これを精製すればよく、また〔Ｂ〕化合物〔〕
の製造において抗原、ハプテンを用いてラツトや
ウサギを使用した場合にはその〔Ｂ〕化合物
〔〕はラツトやウサギの免疫成分たる免疫グロ
ブリンが得られるものであつて、この免疫グロブ
リンを別種の動物、例えばラツトの免疫グロブリ
ンに対してはウサギ、モルモツト、羊、山羊、
馬、牛など、ウサギの免疫グロブリンに対しては
羊、山羊、馬、牛などを用いてそれに対する抗
体、即ち抗ラツト免疫グロブリン血清、抗ウサギ
免疫グロブリン血清やその血清からの免疫グロブ
リンを得ればよく、また市販されているラツトや
ウサギなどの哺乳動物の免疫グロブリンを用いて
同様にして得られたそれらの抗免疫グロブリン成
分（第二抗体）を用いることが簡便である。さら
にレセプターに対して特異的に結合する〔Ａ〕化
合物としては、上記の免疫グロブリンの代りにこ
のレセプターを同様に用いて適宜選択した動物に
感作せしめ、その血清を採取してレセプターに対
する抗体を得ればよい。なお、〔Ｂ〕化合物〔〕
について、この〔Ｂ〕化合物〔〕をもつて、そ
れに対して特異的に結合する抗体たる〔Ａ〕化合
物を得るに当つては、その〔Ｂ〕化合物〔〕は
血清の状態にて用いることは別異の蛋白質等を混
入しているため、アフイニテイークロマトグラフ
イーや他の種々のクロマトグラフイー、ゲル
過、電気泳動などにて単一の成分まで純化して使
用するものである。また、この〔Ａ〕化合物は
〔Ｃ〕の不溶性担体と適宜スペーサーを介して結
合せしめるものであるが、前記の通り、この
〔Ａ〕化合物はあらかじめ前述の多官能性化合物
にてスペーサーを導入せしめたものであつてもよ
い。 次いで、この〔Ｃ〕の不溶性担体と〔Ａ〕化合
物とを、適宜スペーサーを介して、結合せしめ
て、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕、〔Ａ〕および〔Ｃ〓〓Ａ〕
における結合は前記と同一である）で表わされる
化合物（以下、化合物〔〕という）を得るので
あるが、この結合に際して、〔Ｃ〕の不溶性担体
や〔Ａ〕化合物中の官能基やそれらに導入された
スペーサー中の官能基は両者が結合し得るに良好
な活性化された基に適宜行なえばよく、例えばカ
ルボキシル基は酸アミド、酸クロライド、活性エ
ステル、酸イミダゾリド、イソシアナートなどに
活性化せしめればよく、またアミノ基はイソシア
ナート、ジアゾニウムなどに活性化せしめるかグ
ルタルアルデヒドにてアルデヒド基末端となして
もよく、水酸基は臭酸シアンにて活性化せしめ、
アミド基はイミノクロル、イミノエーテル、活性
化したカルボキシル基を有するアシルアミドにて
活性化せしめ、シアノ基は還元してアミノ基とす
るか、イミノエーテルなどに活性化せしめればよ
く、またこれらの活性化せしめる官能基は〔Ｃ〕
の不溶性担体中の官能基を対象とすることが好ま
しい。このように〔Ｃ〕の不溶性担体中の官能基
を主に活性化せしめることより、〔Ａ〕化合物中
のアミノ基と容易に結合せしめ得るもので、さら
に〔Ａ〕化合物中のアミノ基はジチオ化合物また
はアジリール−カルボン酸誘導体と反応せしめて
得られるチオール基と反応する官能基を導入せし
めて〔Ｃ〕の不溶性担体中のチオール基と容易に
結合せしめ得てもよく、要は両者の官能基を必要
に応じて活性化せしめて結合せしめればよいもの
であり、これらの結合し得る官能基または活性化
された基を例示すれば次の如くである。
【表】
【表】
これらは例示であつて、さらに適宜官能基を組
合せて反応せしめるもので、さらにまた例えば
〔Ｃ〕の不溶性担体の官能基であるアミノ基にグ
ルタルアルデヒドを反応せしめてアルデヒドをそ
の末端反応基となしさらにこれにヘキサメチレン
ジアミンを反応せしめてアミノ末端となし、この
アミノ基をそのままカルボジイミド試薬、ウツド
ワード試薬とともに〔Ａ〕化合物のカルボキシル
基と結合せしめるか、またはそのアミノ基を活性
化せしめて〔Ａ〕化合物のアミノ基と結合せしめ
るなどの二種以上の多官能性化合物を用いてスペ
ーサーを導入してもよく、またその際の末端の官
能基を適宜変更してもよい。またこの結合に際し
ては、通常水、アセトン水溶液、エタノール水溶
液、ジメチルスルホキサイド水溶液、リン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液
などの水性媒体下行なわれるもので、またはアセ
トン、エタノール、ジオキサン、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、メチレンクロ
ライド、クロロホルムなどの媒体を用いてもよ
く、また反応温度としては通常室温下ないし冷却
下にて行なえばよい。また多孔性の不溶性担体を
用いる場合には、〔Ａ〕化合物を媒体中吸着せし
めて両者を結合せしめればよいものであるが、し
かしこの吸着による結合は後日の種々の反応に際
してその結合の一部が解離するため、この結合は
吸着後さらに反応しうる多官能性化合物にて両者
を結合せしめてもよい。このようにして得られた
化合物〔〕は、〔Ｃ〕の不溶性担体と結合した
化合物であるため不溶物として存在するものであ
り、通常の固液分離手段、例えば過や遠心分離
などの手段を用いて不溶性の化合物〔〕を分
離、採取し、洗浄すればよい。 次いで、さらにこの化合物〔〕は〔Ｂ〕化合
物〔〕と結合せしめて、目的物たる生体成分測
定用化合物〔〕を得るものであるが、この際に
おける反応は化合物〔〕に結合せしめられた
〔Ａ〕化合物の、〔Ｂ〕化合物〔〕に対して特異
的に結合する部位をもつて、その〔Ａ〕化合物を
特異的に結合する〔Ｂ〕化合物〔〕と、その免
疫的結合により行なわせしめるもので、この際の
媒体としては通常水性媒体、好ましくは緩衝能を
有する水性媒体、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩
衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを用い、
また温度条件としては通常室温下であり、反応時
間は通常一中夜程度にて行なわれる。またこの生
体成分測定用化合物〔〕における〔Ａ〕化合物
と〔Ｂ〕化合物〔〕についての組合せは、〔Ａ〕
化合物を製造するために適宜選択使用した哺乳動
物に感作させた〔Ｂ〕化合物〔〕を使用する
か、または〔Ｂ〕化合物〔〕を得るに使用した
哺乳動物のIgG成分を用いて得られた〔Ａ〕化合
物と、その〔Ｂ〕化合物〔〕との組合せであつ
て、またこの反応の場合には〔Ｂ〕化合物〔〕
は完全に免疫グロブリンとして精製したものでは
なく、その成分を有している血清を使用してもよ
い。さらに化合物〔〕と〔Ｂ〕化合物〔〕の
使用割合としては、目的物たる生体成分測定用化
合物〔〕として必要な〔Ｂ〕化合物〔〕のリ
ガンドに対する活性を有しているものであればよ
く、またこの〔Ｂ〕化合物〔〕の量としては測
定における液体中のリガンドの量、または希釈さ
れた液体中のリガンドの量に対応するものである
から、対応するリガンドの量に対して適宜変更す
ればよく、特に限定されるものではないが、通常
生体成分測定用化合物〔〕１mg当り0.01〜5ng
程度の〔Ｂ〕化合物〔〕を結合せしめればよい
ものであり、その際あらかじめ化合物〔〕の一
定量を分取し、この量に対し適宜の〔Ｂ〕化合物
〔〕を分取、使用すればよく、また生体成分測
定用化合物〔〕に充分な量の〔Ｂ〕化合物
〔〕を結合せしめるには、当然過剰の量の〔Ｂ〕
化合物〔〕を用いればよく、これらの結合に際
しては免疫反応であるため〔Ｂ〕化合物〔〕の
活性の劣化または失活を生ぜせしめないため、例
えばその後の液相中の残存〔Ｂ〕化合物〔〕の
活性を測定すれば容易に化合物〔〕と〔Ｂ〕化
合物〔〕の結合割合が導き出されるものであ
る。このように生体成分測定用化合物〔〕を得
るに当つての化合物〔〕と〔Ｂ〕化合物〔〕
の使用割合は適宜なし得るもので、何んら限定す
べきものでなく、通常化合物〔〕における結合
された〔Ａ〕化合物の活性な量に対しての〔Ｂ〕
化合物〔〕の量を、同量またはそれ以下の量に
て使用すればよく、このようにして正確な〔Ｂ〕
化合物〔〕の量を結合せしめるものである。こ
のようにして得られた生体成分測定用化合物
〔〕は、さらに通常の固液分離手段を用いて分
離、採取し、洗浄すればよい。 この得られた生体成分測定用化合物〔〕は、
その構造上、〔Ａ〕化合物と〔Ｂ〕化合物〔〕
とは免疫学的反応によつて結合せしめられている
ため、生体成分測定用化合物〔〕における
〔Ｂ〕化合物〔〕は定量的に結合せしめたもの
で、またその活性はそれに対して特異的に結合す
るリガンドに対し、何んら劣化したものでない優
れたものであり、よつてこの生体成分測定用化合
物〔〕の〔Ｂ〕化合物〔〕の量は極めて良好
な精度を示すものである。 さらに、この生体成分測定用化合物〔〕は、
安定化剤を用いることにより、長期間安定な凍結
乾燥組成物として得られるものであるが、この際
安定化剤として使用される化合物としては、好ま
しくは、例えばアルブミン、カゼイン、グリセリ
ン、ピロリン酸などが挙られ、さらにエチレング
リコール、塩化カルシウム、塩化マグネシウムな
ども安定化の効果を示すものであり、蛋白質、多
価アルコール、水溶性塩類、リン酸化合物などが
挙られ、これらの使用量としては蛋白質の場合好
ましくは0.5〜２％程度、多価アルコールの場合
は１〜20％程度、塩類やリン酸化合物の場合は５
％程度であり、特にアルブミン、カゼインの0.5
〜２％、グリセリンの１％、ピロリン酸の５％添
加においては、無添加の凍結乾燥組成物に比べ、
凍結乾燥後３ケ月後にてもほとんどその活性を劣
化せしめないものである。また凍結乾燥に当つて
は、0.1Mリン酸緩衝液などの水性媒体に生体成
分測定用化合物〔〕および安定化剤を加え、次
いでこれを公知の凍結乾燥の手段、例えば0.001
〜0.5ｍHg、−40〜−60℃程度にて実施すればよ
い。 さらに本発明において、この生体成分測定用化
合物〔〕またはその凍結乾燥組成物を用いて測
定を行なうものであるが、測定に際しては少なく
とも生体成分測定用化合物〔〕およびこの生体
成分測定用化合物〔〕における〔Ｂ〕化合物
〔〕に特異的に結合するリガンド−酵素標識化
合物結合物を使用して、実施するものである。こ
の実施に当り、まず生体成分測定用化合物〔〕
を含有する系、例えばその水性媒体溶液中に、測
定すべきリガンド含有液体およびリガンド含有−
酵素標識化合物結合物を加えて水性媒体中インキ
ユベイトするもので、例えばPH6.5〜８、好まし
くは７〜7.4程度の緩衝液にて５〜40℃、好まし
くは35〜37℃程度にて30分ないし一日程度インキ
ユベイトせしめ、次いでリガンド−酵素標識化合
物結合物と生体成分測定用化合物〔〕との結合
物たる固相と、未反応のリガンド−酵素標識化合
物結合物を有する液相とを分離する。分離に当つ
ては、通常の固液分離手段を用いればよく、この
ようにして分離した固相または液相より、その酵
素標識化合物の量をその標識化合物の特性に応じ
た測定手段に基いて求め、この標識化合物の量、
即ち添加した標識化合物の量、Ｂの量、Ｆの量に
基いて測定すべき液体中のリガンドの含量が算
出、測定されるものである。またリガンド含有液
体としては上述の通り、生体の血液、尿、唾液な
どに含有されるリガンド成分を有するもので、こ
れらリガンドは液体中に種々の量にて含有されて
いるものであり、例えば正常な場合のインスリン
は６〜20μU／ml、ACTHは15〜70pg／ml、プロ
ラクチンは２〜15ng／ml、などで、血中と尿中
の場合にても異なつているもので、これらのリガ
ンドの含有量に応じて調整すればよく、高濃度に
存在する場合は、測定の際に用いる水性媒体にて
希釈使用してもよい。さらに標識化合物として
は、エンチーモ・イミユノアツセイにおける酵素
が例示、汎用されるものである。またその酵素と
しては公知の種々のものが使用し得るもので、例
えばアルカリフオスフアターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アミラー
ゼ、マルターゼ、ペクチナーゼなどの加水分解酵
素、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ウレアー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナー
ゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、アルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、アルドラーゼなどの酸化還元酵素、トラ
ンスフエラーゼ類、その他リアーゼ類、イソメラ
ーゼ類、リガーゼ類の酵素が適宜使用されうる。
さらにラジオアイソトープとしては通常放射性同
位元素として使用されているものならばよく、通
常ヨード125が汎用されているものである。 さらにこれらの標識化合物を適宜選択して、こ
の標識化合物を測定するものであるが、酵素を標
識化合物とする場合は、当然その酵素の基質を含
有する溶液を用いて、その基質の減少、または基
質の酵素作用による生成物の増加を測定すればよ
く、これらの測定はその酵素の基質に対する作用
機序に基いて適宜良好な各成分をもつて測定すれ
ばよく、一般に酸化酵素の場合は消費される酵素
を酸素電極にて測定するか、生成される過酸化水
素を過酸化水素電極にて、またはペルオキシダー
ゼと４−アミノアンチピリン、フエノールもしく
はジメチルアニリンなどの呈色剤ととも呈色せし
めて比色にて測定すればよく、さらに加水分解酵
素の場合も消費される基質の量や、生成される成
分を適宜測定すればよく、またこの際基質に螢光
性分子を導入し、酵素加水分解にてその螢光性分
子を遊離せしめる手段、例えば４−メチルウンベ
リフエリル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質として
β−ガラクトシダーゼからなる標識化合物を作用
せしめて４−メチルウンベリフエロンを生成せし
め、これを励起波長360ｍμ、螢光波長450ｍμに
て螢光せしめ、測定すればよい。 従つてまた、この方法、キツトを実施するに当
り、試験用セツトとして使用するのが好ましく、
少なくとも生体成分測定用化合物〔〕およびリ
ガンド−酵素標識化合物結合物の一定量、例えば
後述実施例における１ビーズ当り0.5〜5ngの
〔Ｂ〕化合物〔〕を結合した生体成分測定用化
合物〔〕のビーズ当り、その〔Ｂ〕化合物
〔〕の等量以上のリガンドを有するリガンド−
酵素標識化合物結合物を用いればよく、さらにこ
れに水性媒体を添付すればよい。また、この試験
セツトは、別の成分、例えば標識化合物としての
酵素に対する酵素活性測定用試薬を含んでもよ
い。さらにこれらのセツトは全量１ml程度の液量
となる程度が好ましい。 このようにして測定することにより、本発明の
生体成分測定用化合物〔〕が〔Ｂ〕化合物
〔〕を何んら劣化せしめることなく、かつ定量
的に結合せしめられているものであるため、液体
中の〔Ｂ〕化合物に対して特異的に結合するリガ
ンドおよびリガンド−酵素標識化合物結合物を極
めて精度よく結合するものであつて、よつてその
測定結果も極めて良好なものであり、かつ短時間
にて行なえる有用な方法およびキツトである。 次に実施例を挙げて具体的に詳記するが、本発
明は何んらこれらに限定されるものではない。 実施例 １ インスリンの生体成分測定 Ａ：インスリン抗体 市販のインスリン（ウシインスリン、シグマ
社製）３mgを0.15M NaCl含有リン酸緩衝液
（以下、PBSという）（PH7.2）0.5mlに溶解し、
これにFreund adjubantを加えてホモゲナイズ
して、その１mlを得、これを２週間に１回の割
にてモルモツトに皮下注射し、８回投与して感
作した後採血し、これを3000rpm、15分間遠心
分離して、インスリンの抗体を含有する血清を
得た。この血清は、次の如くの精製法にて免疫
グロブリン成分たるインスリンのIgG成分を得
る。 精製法１：上記の血清50mlに、等量のPBSを
加え、さらに飽和硫安水溶液を加えて50％飽
和にせしめてその沈澱物を得、次いでこの沈
澱物をPBSに加えて100mlとなし、これに20
％飽和になるように硫安を加えて生じる沈澱
物を去し、さらに35％飽和になるように硫
安を追加し、これを遠心分離（8000rpm、15
分間）して、そのIgG画分を得（収率70％）、
さらにこのLgG画分をPBS10mlに溶解し、
これをセフアデツクスG100（商品名）を充填
したカラム（径２×70cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて展開せし
めて、脱塩されたその素通り区分を得、さら
にその活性画分をDEAEセルロースを充填し
たカラム（径１×30cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）にて展開せし
めて、その素通り区分を集めて、インスリン
のIgG画分を得た（収率59％、抗体含量1.7
％）。 精製法２：シアノブロマイドで活性化したセフ
アロース4B（商品名）２ｇに、ヘキサメチレ
ンジアミンの10％水溶液（PH11）２mlを加え
て撹拌下60分間反応せしめ、次いで洗浄した
後これに５％グルタルアルデヒド水溶液（PH
８）２mlを加えて反応せしめ、さらにPBS
で洗浄し、次いでこれにインスリン100mgを
加えて、〔（セフアロース4B）−NH−（CH2）
６−Ｎ＝CH−（CH2）3−CH＝（インスリン）〕
で略示されるセフアロース4Bの水酸基とイ
ンスリンのアミノ基とによるインスリン固定
化セフアロース4Bを得た。次いでこのイン
スリン固定化セフアロース4Bに、上記のイ
ンスリンのIgG画分を加えて一夜撹拌してイ
ンスリン固定化セフアロース4Bのインスリ
ンと、その抗体成分たるIgGとを結合せし
め、これをPBSで十分洗浄後0.1Mグリシ
ン・HCl緩衝液（PH2.5）にて溶出してアフ
イニテイークロマトグラフイーを行なつて、
その活性画分を得た（収率37％、抗体純度66
％）。 Ｂ：モルモツトのIgGに対する抗体 モルモツトのIgG3mgを用いて、上記と同様
にして、上記のモルモツトの代りにウサギを用
いて感作、採血して、その血清を得る。 さらにこの血清は、上記と同様にして得られ
たモルモツトIgG固定化セフアロース4Bを用い
てアフイニテイークロマトグラフイーを行な
い、0.1Mグリシン・HCl緩衝液（PH2.5）にて
溶出して、ウサギのモルモツトのインスリン
IgGに対する抗体として得た（収率37％、純度
72％）。 なお、このモルモツトのIgGに対する抗体を
得るに当つては、モルモツトとは別種の動物を
用いて感作等せしめればよいものであつて、そ
の際ウサギに限定されるものでなく、牛や馬な
どを用いてもよく、この場合には牛または馬の
モルモツトのIgGの抗体が得られるものであ
る。 Ｃ：インスリン用の生体成分測定用化合物〔〕 ６・６ナイロンビーズ（径５mm）500粒を５
塩化リン４ｇとピリジン４ｇを含むベンゼン60
ml中で２日間撹拌した後４回ベンゼンにて洗浄
してイミノクロライド化した６・６ナイロンビ
ースを得、これに１ｇのヘキサメチレンジアミ
ンを含む炭酸緩衝液（PH11）50mlを加えて室温
下24時間撹拌反応せしめ、１％重ソウ100mlで
４回洗浄し、さらにこれに２％グルタルアルデ
ヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH８）50mlを加
えて１時間室温で反応せしめて0.1Mリン酸緩
衝液（PH８）で洗浄し、さらに同様にして再度
ヘキサメチレンジアミンおよびグルタルアルデ
ヒドの順にて処理して、該ナイロンビーズにス
ペーサーを導入せしめた。次いで、このスペー
サーを導入したナイロンビーズ150粒に、上記
Ｂ項に記載した通りのウサギのモルモツトのイ
ンスリンIgGに対する抗体（抗IgG）155γを
PBS（PH8.0）中に加えて５℃、一夜反応せしめ
て、〔（該ナイロン）−（抗IgG）〕にて略示され
る結合物を得（450〜590ng抗IgG／１ビーズ）、
次いで、これに上記のＡ項に記載した通りのモ
ルモツトのインスリンの抗体を含有する血清の
10000倍希釈液（0.1％NaN3、0.15M NaCl、
0.25％BSA、５ｍMEDTA含有0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2）よりなる希釈液）15ml（350ngの
抗インスリIgGを含む）を加えて５℃、一夜撹
拌して〔（該ナイロン）−（抗IgG）−（インスリ
ンの抗体）〕にて略示されるインスリン測定用
の生体成分測定用化合物〔〕を得た。本品
は、後述のインスリン−β−ガラクトシダーゼ
結合物によるインスリン−標識化合物結合物を
使用してそのインスリンの抗体活性を測定した
結果、１ビーズ当り2.0±0.11ngのインスリン
抗体活性を有していた。（本品の理論的インス
リン抗体活性値は2.25ngである。 Ｄ：インスリン測定用の生体成分測定用化合物
〔〕の測定に使用するインスリン−標識化合
物結合物たるインスリン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物、インスリン60mgを、0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.5）４mlに溶解し、これに３−（ベン
ゾチアゾール−2′−イルジチオ）プロピオン
酸・スクシンイミドエステル8.5ng含有ジメチ
ルホルムアミド0.4mlを加えて室温下１時間反
応せしめ、反応後PH5.0となして沈澱物を回収
し、さらにこの沈澱物を0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.5）40mlに溶解し（インスリンとして1.0
mg／ml含有）、このうち100μを分取し、これ
にβ−ガラクトシダーゼ10mgを加えて１時間反
応せしめ、その後この反応液をセフアデツクス
G100を充填したカラム（径1.5×120cm）にて
PBSにて溶出せしめ、その65〜73mlの画分を
集めて、〔（インスリン）−CO−（CH2）2−Ｓ（β
−ガラクトシダーゼ）〕で略示されるインスリ
ンのアミノ基とβ−ガラクトシダーゼのチオー
ル基とによるインスリン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物を含有する溶出区分（インスリン
2.4γ／ml、かつβ−ガラクトシダーゼ１分子当
り１分子のインスリンの結合物であり、かつイ
ンスリン抗体に対しインスリン結合物の95％の
活性を有している）を得た。 なお、上記で使用された３−（ベンゾチアゾ
ール−2′−イルジチオ）プロピオン酸・スクシ
ンイミドエステルは次の如くして得られたもの
である（特願昭53−85900号参照）。 ２・2′−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
13.2ｇをベンゼン400mlに加え、さらにβ−メ
ルカプトプロピオン酸６ｇを加えて、70℃、３
時間加熱撹拌し、その後この反応液を氷水浴に
て冷却して析出せしめて13.8ｇの粗結晶を得、
さらにこれをベンゼンにて再結晶化して12ｇの
３−（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）プ
ロピオン酸の結晶を得た（本品のm.p.は162〜
164℃、ベンゼン：酢酸エチル＝１：２による
リシカゲル薄層クロマトグラフイーにてのRf
値は0.33である）。次いでこの３−（ベンゾチア
ゾール−2′−イルジチオ）プロピオン酸３ｇを
酢酸エチル20mlに溶解し、これにＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド１ｇおよびジシクロヘキシル
カルボジイミド1.7ｇを加えて３時間、室温に
て撹拌反応して、生成するジシクロヘキシル尿
素を別した後その酢酸エチル層を回収し、さ
らにこれをPH7.5のリン酸緩衝液で洗浄して未
反応の遊離酸を除去し、さらにこの酢酸エチル
層に芒硝を加えて脱水した後乾固し、さらにこ
れを熱石油エーテルに溶解した後冷却して３−
（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）プロピ
オン酸・スクシンイミドエステル2.4ｇを得た
（本品のm.p.は114〜115℃、ベンゼン：酢酸エ
チル＝３：１によるシリカゲル薄層クロマトグ
ラフイーにてのRf値は0.53である）。 Ｅ：インスリンの測定 (i) 測定用キツト ●生体成分測定用化合物〔〕を含有する
系：上述のインスリン測定用の〔（該ナイ
ロン）−（抗IgG）−（インスリン抗体）〕で
略示される１ビーズ当り2.0±0.11ngのイ
ンスリン抗体を有する生体成分測定用化合
物〔〕１粒を含有する1.0ml容容器。 ●リガンド−酵素標識化合物結合物を含有す
る系：上記の〔（インスリン）−CO−
（CH2）−Ｓ−（β−ガラクトシダーゼ）〕で
略示されるインスリン−β−ガラクトシダ
ーゼ結合物／PBS溶液50μ（インスリン
として1ng／ml）を有する容器。 ●β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体：０
−ニトロフエニール−β−Ｄ−ガラクトシ
ド５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％
NaN3、0.1％BSA、20ｍＭメルカプトエ
タノール、10％メタノール含有）（PH6.7）
200μからなるβ−ガラクトシダーゼ活
性測定用媒体、および0.2Mグリシン緩衝
液（PH10.4）2.5mlからなる該媒体反応停
止液。 ●反応媒体：脱インスリンの牛血清100μ。 ●反応用洗浄液：0.1％NaN3、0.15M
NaCl、0.25％BSA、５ｍMEDAT含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）。 上記各系を組合せて１テスト用のインスリ
ン測定用キツトとなす。 (ii) 測定方法 上記の組合せキツトを用いて、次の如くし
て、インスリンの測定を行なつた。 まず、インスリンの0.2ng／ml、0.4ng／
ml、0.8ng／ml、1.6ng／ml、3.2ng／ml、
6.4ng／ml、12.5ng／ml、25ng／mlの各濃度
のインスリンを含有する液体を調整して、イ
ンスリン含有液体試料となし、また反応媒体
としては脱インスリンの牛血清100μを用
いた。このインスリン含有液体100μを、
上記の生体成分測定用化合物〔〕１粒を含
有する1.0ml容容器に上記インスリン−β−
ガラクトシダーゼ結合物／PBS溶液50μを
含有する容器の内容物とともに注入して、５
℃、一夜インキユベイトせしめ、その後これ
を別して固相と液相とを分別し、この固相
を反応用洗浄液にて洗浄した後さらにこの固
相の固形物に上記のβ−ガラクトシダーゼ活
性測定用媒体を加えて44℃で２時間反応せし
めた後、これに上記の該媒体反応停止液を加
えた後、その発色を420nｍの波長にてその
吸光度を測定して、その生体成分測定用化合
物〔〕に対するインスリンとインスリンβ
−ガラクトシダーゼ結合物の競合反応によ
る、その生体成分測定用化合物〔〕に結合
したインスリンβ−ガラクトシダーゼ結合物
のβ−ガラクトシダーゼの活性とインスリン
液体中のインスリン量との関係を測定した。 その結果、第１図に示す通り、本発明のイ
ンスリン測定用の生体成分測定用化合物
〔〕は、極めて良好な定量曲線を示すもの
であつた。 実施例 ２ グルカゴンの生体成分測定 Ａ：グルカゴン抗体 グルカゴン（ブタグルカゴン）を用いてなる
ウサギのグルカゴン抗体を含有する市販の抗血
清を用いた。 Ｂ：ウサギのIgGに対する抗体 ウサギのIgG4mgを上記実施例１のＢ項の方
法に準じて、山羊に感作せしめて、その抗血清
を得、さらにそのアフイニテイークロマトグラ
フイーを行なつて山羊のウサギのIgGに対する
抗体として得た（収率36％、純度68％）。 Ｃ：グルカゴン用の生体成分測定用化合物〔〕 ６・６ナイロンビース（径５mm）100粒を五
塩化リン１ｇを含むベンゼン100ml中で２日間
撹拌反応せしめた後ベンゼンにて４回洗浄し、
次いでこの50粒を用いて、これにアジピン酸１
ｇ含有50ml0.1M炭酸緩衝液（PH11）を加えて
室温下24時間撹拌反応し、別した後洗浄し、
さらにこれに250mgＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、500mgジシクロヘキシルカルボジイミド
を含有するテトラヒドロフラン50mlを加えて５
時間室温にて反応せしめて、スクシンイミド活
性エステル化せしめ、これを洗浄後500mgヘキ
サメチレンジアミン含有0.1M炭酸緩衝液（PH
11）を加えて室温下３時間撹拌反応し、その後
１％重ソウ100mlにて４回洗浄し、さらにこれ
に２％グルタルアルデヒド含有0.1Mリン酸緩
衝液（PH８）50mlを加えて室温、１時間反応せ
しめた後0.1Mリン酸緩衝液にて洗浄して、該
ナイロンビーズのアミド基を活性化した部位に
アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、グルタ
ルアルデヒドの順にて処理されたスペーサー導
入ナイロンビーズを得た。次いでこのスペーサ
ー導入ナイロビーズ100粒に、上記Ｂ項にて得
られた山羊のウサギのグルカゴンIgGに対する
抗体（抗IgG）5.6γ（ウサギのグルカゴンIgG相
当量としては10γ）をPBS（P48.0）中にて５
℃、一夜反応せしめて、〔（該ナイロン）−（抗
IgG）〕にて略示される結合物を得（41〜50ng
抗IgG／１ビーズ）、次いでこれに上記Ａ項に
記載した市販品たるグルカゴンの抗体を含有す
る血清の80000倍希釈液（0.1％NaN3、0.15M
NaCl、0.25％BSA、５ｍMEDTA含有0.01M
リン酸緩衝液（PH7.2）よりなる希釈液）５ml
（4.8ngグルカゴン抗体／ml）を加えて５℃、一
夜撹拌して、〔（該ナイロン）−抗IgG）−（グル
カゴンの抗体）〕にて略示されるグルカゴン測
定用の生体成分測定用化合物〔〕を得た。本
品は、後述のグルカゴン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物によるグルカゴン−標識化合物結合物
を使用して、そのグルカゴンの抗体活性を測定
した結果、１ビーズ当り0.21±0.01ngのグルカ
ゴン抗体活性を有していた（本品の理論的グル
カゴン抗体活性は0.24ngである）。 Ｄ：グルカゴン測定用の生体成分測定用化合物
〔〕の測定に使用するグルカゴン−標識化合
物たるグルカゴン−β−ガラクトダーゼ 「医学のあゆみ」第103巻第25頁（1977年）
に記載の方法に準じて、25mgのグルカゴンを２
mgのＳ−アセチルメルカプトサクシニツクアン
ハイドライドにて40分間反応せしめてメルカプ
トサクシニル化せしめ、さらにこれを0.5Mヒ
ドロキシアミンにて20℃、30分間処理して脱ア
セチル化した後0.1Mリン酸緩衝液（PH８）に
飽和させたＮ・N′−０−フエニルジマレイミ
ド２mlを反応せしめて、マレイミド化せしめた
グルカゴンを得、次いでこれをセフアデツクス
G25を充填したカラム（径１×60cm）にチヤー
ジして0.1Mリン酸緩衝液（PH８）にて溶出せ
しめてその活性画分を得（1.4mgグルカゴン／
ml）、その内その10μを分取し、これに2.8mg
のβ−ガラクトシダーゼ溶解リン酸緩衝液（PH
８）１mlを加えて、30℃、30分間反応せしめ、
この反応液をセフアデツクスG100によるクロ
マトグラフイーを行なつて、チオール基を導入
したグルカゴンのチオール基とβ−ガラクトシ
ダーゼのチオール基とによるグルカゴン−β−
ガラクトシダーゼ結合物を含有する溶出区分
（グルカゴン1.4μｇ／ml、β−ガラクトシダー
ゼ253μｇ／ml、かつβ−ガラクトシダーゼ１
分子当り１分子のグルカゴン結合物である）。 Ｅ：グルカゴンの測定 (i) 測定用キツト ●生体成分測定用化合物〔〕を含有する
系：上記のグルカゴン測定用の〔（該ナイ
ロン）−（抗IgG）−（グルカゴン抗体）〕で
略示される１ビーズ当り0.21±0.01ngのグ
ルカゴン抗体を有する生体成分測定用化合
物〔〕１粒を含有する1.0ml容容器。 ●リガンド−酵素標識化合物結合物を含有す
る系：上記のグルカゴン−β−ガラクトシ
ダーゼ結合物／PBS溶液50μ（グルカゴ
ンとして0.5ng／ml）を有する容器。 ●β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体：前
記実施例１に記載の該媒体と同一媒体を使
用。 ●反応媒体：脱グルカゴンの牛血清100μ。 ●反応用洗浄液：前記実施例１に記載の該洗
浄液と同一洗浄液を使用。 上記の各系を組合せて１テスト用のグルカ
ゴン測定用キツトとなす。 (ii) 測定方法 上記の組合せキツトを用いて、次の如くし
て、グルカゴンの測定を行なつた。 まずグルカゴンを含有する液体として、
1.0ml当り0.1ng〜6.4ng含有液を調整した。
このグルカゴン含有液体100μ（液体100μ
当り0.01〜0.64ngのグルカゴン含有）、反
応媒体100μを、上記のグルカゴン測定用
生体成分測定用化合物〔〕１粒を含有する
1.0ml容容器に、上記グルカゴン−β−ガラ
クトシダーゼ結合物／PBS溶液50μを含有
する容器の内容物とともに注入して、５℃、
一夜反応せしめ、その後これを別して固相
と液相とを分別し、この固相を反応用洗浄液
にて洗浄した後、さらにこの固相の固形物
に、β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体を
加えて44℃、２時間反応せしめ、次いでこれ
にその反応停止液を加えた後、その発色を
420nｍの波長にてその吸光度を測定して、
その生体成分測定用化合物〔〕に対するグ
ルカゴンとグルカゴン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物とによる競合反応より、その生体成
分測定用化合物〔〕に結合したグルカゴン
−β−ガラクトシダーゼ結合物のβ−ガラク
トシダーゼ活性とグルカゴン液体中のグルカ
ゴン量との関係を測定した。 その結果、第２図に示す通りであつて、本
発明のグルカゴン測定用の生体成分測定用化
合物〔〕は極めて良好な定量曲線を示すも
のであつた。 実施例 ３ 1α・25（OH）2−コレカルシフエロールの生体
成分測定 Ａ：1α・25（OH）2−コレカルシフエロールレセ
プター ４週間ビタミンＤ欠餌を与えてクル病とした
ニワトリ（白色レグホン）の小腸３ｇを、
0.25Mシユクロース、0.025M Ｋ Cl.0.005M
MgCl2を含有する0.5Mトリス−Ｈ Cl緩衝液
（PH7.5）にて洗浄し、次いで同一緩衝液30mlを
加えてポツタ型ホモゲナイザーにてホモゲナイ
ズして、これを800G、10分間遠心分離してそ
の沈澱物を得る。またその上清液は、8000G、
さらに100000Gにて遠心分離してその上清液を
回収し、この上清液は後述の1α・25（OH）2−
コレカルシフエロールの測定に際して、その反
応媒体として使用する。次いでこの800Gによ
る沈澱物を0.1％トリトンＸ−100含有の上記緩
衝液に加えて、これを800G、10分間遠心分離
してその沈澱物を得、さらにこれを1.75Mシユ
クロース、0.025M Ｋ Cl、0.005MgCl2含有
0.05MトリスＨ Cl緩衝液（PH7.5）15mlに加
えてホモゲナイズした後65000G、１時間遠心
分離して、その沈渣を得、次いで
0.006MEDTA含有0.025M NaCl溶液（PH8.0）
35mlにて２回、0.025M NaCl含有0.01Mトリス
−Ｈ Cl緩衝液（PH8.0）にて１回洗浄し、さ
らに1.75Mシユクロース、0.025M Ｋ Cl、
0.005MgCl2含有0.05Mトリス−HCl緩衝液（PH
7.5）15mlを加えて撹拌し、これを65000G、１
時間遠心分離して、1α・25（OH）2−コレカル
シフユロールレセプターを含有する沈澱物を得
た。 Ｂ：ニワトリの1α・25（OH）2−コレカルシフエ
ロールレセプターに対する抗体 上記の如くして得られた1α・25（OH）2−コ
レカルシフエロールレセプター４mgを用いて、
上記実施例１のＢ項記載の如くして、ウサギを
用いて２週間毎、６回投与して感作せしめ、さ
らに採血、精製して、ウサギのニワトリ1α・
25（OH）2−コレカルシフエロールレセプター
に対する抗体として得た（収率33％、純度28
％）。 Ｃ：1α・25（OH）2−コレカルシフエロール用の
生体成分測定用化合物〔〕 シアノブロマイドにて活性化したセフアロー
ス4B5ｇ（湿重量）に、５％ヘキサメチレンジ
アミン水溶液10mlを加えて撹拌下60分間反応せ
しめ、次いで洗浄した後これに２％グルタルア
ルデヒド水溶液10mlを加えて室温下60分間反応
せしめた後洗浄しさらにこれを２％ε−アミノ
カプロン酸水溶液10mlを加えて室温下60分間反
応せしめる。洗浄した後これをＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド1.1ｇおよびジシクロヘキシル
カルボジイミド2.1ｇ含有テトラヒドロフラン
20mlを加えて、〔（セフアロース4B）−NH
（CH2）6−Ｎ＝CN−（CH2）3−CH＝Ｎ−CH2
（CH2）4−COOH〕で略示されるその末端カル
ボキシル基をスクシンイミドエステル化した、
スペーサー導入セフアロース4Bを得、このセ
フアロース4B1ｇを分取して0.1Mリン酸緩衝
液にて充分洗浄した後、上記Ｂ項に記載した通
りのウサギのニワトリ1α・25（OH）2−コレカ
ルシフエロールレセプターに対する抗体を上記
実施例１のＡ項における精製法１に準じて精製
した該レセプターに対する抗体（純度28％）
4.0mgを0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.0）５mlに溶解して加え、５℃、24時間反
応せしめて、〔（該セフアロース4B）−（該レセ
プターに対する抗体）〕にて略示される結合物
を得、次いでこれに、上記Ａ項に記載した
1α・25（OH）2−コレカルシフエロールレセプ
ターの沈渣２mgを0.005M MgCl2、0.15M
NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）５mlに
分散した溶液を加えて、５℃、一夜撹拌して、
〔（該セフアロース4B）−（該レセプターに対す
る抗体）−（1α・25（OH）2−コレカルシフエロ
ールレセプター）〕で略示される1α・25（OH）2
−コレカルシフエロール測定用の生体成分測定
用化合物〔〕を得た。本品はトリチウム標識
化合物を用いて、本品10mg当り2.08〜2.42ngの
1α・25（OH）2−コレカルシフエロールレセプ
ター活性を有していた（本品の理論活性は
2.60ngである）。 また1α・25（OH）2−コレカルシフエロール
測定用の生体成分測定用化合物〔〕の測定に
使用する酵素標識化合物は、1α−25（OH）2−
コレカルシフエロール−酵素結合体を調製して
用いればよい。さらにこれらの各試料を、前記
実施例に準じて同様に行なうことにより1α・
25（OH）2−コレカルシフエロールの測定をな
し得る。 実施例 ４ １−34h−PTHの生体成分測定 Ａ：１−34h−PTH抗体 Ser−Val−Ser−Glu−Ilu−Gln−Leu−Met
−His−Asn−Leu−Gly−Lys−His−Leu−
Asp−Ser−Met−Glu−Arg−Val−Glu−Trp
−Leu−Arg−Lys−Lys−Leu−Gln−Asp−
Val−His−Asn−Phe−NH2で表わされるア
ミノ基末端からなるアミノ酸配列を有する１−
34h−PTH（ヒト−パラチロイドホルモン）３
mgを0.5％BSA含有0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）
21mlに溶解し、その２mlづつに２mlのFreund
Adjuvantを加えて充分に混和し、これをウサ
ギに、２週間毎12回皮下注射して充分に感作せ
しめ、その２週間後に採血し、これを
3000rpm.15分間遠心分離してその血清を得、
これを60℃、30分間処理してウサギの１−34h
−PTH抗体を含有する血清を得た。 Ｂ：ウサギのIgGに対する抗体 ウサギのIgG4mgを用いて、これを馬に皮下
注射して、以下同様にして、感作せしめて採血
し、遠心分離し、精製して、馬のウサギ１−
34h−PTH抗体に対する抗体として得、次いで
実施例１の方法に準じてアフイニテーフロスト
グラフイーで精製した。（収率36％、純度67％） Ｃ：１−34h−PTH用の生体成分測定用化合物
〔〕 ６・６−ナイロン（５mm径）100粒に、ジメ
チル硫酸50mlを加えて100℃、４分間処理、冷
却後エタノール100mlにて５回洗浄し、これに、
0.5Mヘキサメチレンジアミン含有0.1Mホウ酸
緩衝液（PH9.5）50mlを加えて、室温下２時間
反応後0.5M NaCl、次いで水にて洗浄し、さ
らにこれに３％グルタルアルデヒド含有0.1M
ホウ酸緩衝液（PH8.5）50mlを加えて５℃、40
分間撹拌反応せしめて、スペーサー導入該ナイ
ロンを得、そのナイロンビース50粒を分取し、
これに上記の馬のウサギ１−34h−PTH抗体に
対する抗体（馬抗体）（馬抗体45％含有IgG画
分）25γを加えて20℃、２時間、PBS（PH7.2）
中にて反応せしめて、〔（該ナイロン）−（馬抗
体）〕で略示される結合物を得、さらにこれに、
上記のウサギ１−34h−PTHの抗体を含有する
血清の75000倍希釈液2.5mlを加えて反応せし
め、〔（該ナイロン）−（馬抗体）−（ウサギ１−
34h−PTH抗体）〕で略示される１−34h−
PTH測定用の生体成分測定用化合物〔〕を
得た。本品は、後述の１−34h−PTH− 125Iに
よるインスリン−放射性物質結合物を使用して
その１−34h−PTHの抗体活性を測定した結
果、１ビース当り0.55±0.020ngの抗体活性を
有していた（本品の理論的１−34h−PTH抗体
活性値は0.63ngである）。 また１−34h−PTH測定用の生体成分測定用
化合物〔〕の活性測定に使用する１−34h−
PTH−酵素結合物は、前記実施例に準じて調
製して用いればよい。さらにこれらの各試料
を、前記実施例に準じて同様に行なうことによ
り１−34h−PTHの測定をなし得る。 実施例 ５ α−フエトプロテインの生体成分測定 Ａ：α−フエトプロテイン抗体 ラツトより抽出したα−フエトプロテインを
抗原として、ウサギを用いて、上記と同様にし
て、感作せしめ、次いで採血し、そのウサギの
α−フエトプロテイン抗体を含有する血清を得
た。 Ｂ ウサギのIgGに対する抗体 ウサギのIgG4mgを用いて、山羊に皮下注射
し、以下同様にして感作、採血、精製して、山
羊のウサギのα−フエトプロテイン抗体に対す
る抗体として得た（収率38％、純度74％）。 Ｃ α−フエトプロテイン用の生体成分測定用化
合物〔〕 ダイヤイオンHP−20（商品名：三菱化成工
業社製）３ｇに、濃硝酸47％含有濃硫酸５mlを
加えて、０℃、40分間反応せしめ、次いでこれ
に冷水100mlを加えて反応を停止し、さらに水
洗し、これに６％Na2S2O4含有2M水酸化カリ
ウム溶液10mlを加えて70℃、２時間還元せしめ
てアミノ化スチレン基を有する該HP−20を
得、次いでこのアミノ化スチレン基を有する該
HP−20、１ｇを分取し、２％グルタルアルデ
ヒド水溶液（PH８）を用いて反応せしめた後こ
れに上記の山羊のウサギのα−フエトプロテイ
ン抗体に対する抗体（山羊抗体）170γを加え
て結合せしめて、〔（該HP−20）−（山羊抗体）〕
で略示される結合物を得、さらにこれに上記の
α−フエトプロテイン抗体の40000希釈液５ml
を加えて反応せしめて、〔（該HP−20）−（山羊
抗体）−（α−フエトプロテイン抗体）〕で略示
されるα−フエトプロテイン測定用の生体成分
測定用化合物〔〕を得た。本品の抗体活性は
1.5±0.05ng／20mgであつた（理論的抗体活性
は1.8ng／20mgである）。 また前記実施例に準じてα−フエトプロテイ
ン−酵素標識化合物結合体を調製し、さらにこ
れらの各試料を前記実施例に準じて同様に行な
うことにより、α−フエトプロテインを定量し
得る。 実施例 ６ テストステロンの生体成分測定 アミノプロピルトリエトキシシラン処理したガ
ラースビース（径５mm）（アミノプロピルトリエ
トキシシラン２ｇ、ガラスビーズ50粒、アセトン
溶媒100ml、45℃、24時間反応）50粒に、２％グ
ルタルアルデヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）20mlを加えて室温下１時間反応せしめ、次
いで0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）にて充分洗浄
し、これに、山羊のウサギIgGに対する抗体（山
羊抗体）25γを加えて５℃、１夜反応せしめて、
〔（該ガラスビーズ）−（山羊抗体）〕で略示される
結合物を得、次いで洗浄後、これに、Stevoid16、
415〜428（1970）に記載の方法に準じて得られた
テストステロン−３−山羊血清アルブミン４mgを
用いて得られたテストステロンのウサギ抗体たる
血清の5000倍希釈液５ml（20ng／ml）を加えて、
５℃、一夜反応せしめて、〔（該ガラスビース）−
（山羊抗体）−（テストステロンのウサギ抗体）〕に
て略示されるテストステロン測定用の生体成分測
定用化合物〔〕を得た。本品は、その１ビーズ
当り、1.5±0.12ngのテストステロン抗体活性を
有していた（理論的活性は1.8ng／ビーズであ
る）。 本品は、テストステロン測定用の生体成分測定
用化合物として使用されるものであり、テストス
テロン−酵素標識化合物結合体とともに用いて、
前記と同様に行なうことによりテストステロンを
定量し得るものである。 実施例 ７ プロゲステロンの生体成分測定 セフアデツクスＧ−50（商品名：フアルマシア
社製）５ｇ（湿重量）に、30ｍＭ過ヨウ素酸ナト
リウム10mlを加えて室温下30分間撹拌反応せし
め、さらにこれに2Mエチレングリコールを加え
て30分間撹拌し、次いでこれを取後0.01M炭酸
緩衝液（PH9.5）にて洗浄し、得られた該セフア
デツクス１ｇを分取し、これに、ウサギIgGに対
する山羊抗体（山羊抗体）170γ（抗体として49γ
含有）を加えて５℃、一夜反応せしめて、〔（該セ
フアデツクス）−（山羊抗体）〕で略示される結合
物を得（20mg当り、465〜544ngを含有）、さらに
これに、Ｊ・Biol.Chem.228、７（1957）に記載
の方法に準じて得られた11α−ヒドロキシ−４−
プレグネン−3.20−ジオン−11−ヘミスクシニル
−牛血清アルブミン３mgを用いて得られたプロゲ
ステロンのウサギ抗体たる血清の10000倍希釈液
５mlを加えて、５℃、一夜反応せしめて、〔（該セ
フアデツクス）−（山羊抗体）−（プロゲステロンの
ウサギ抗体）〕で略示されるプロゲステロン測定
用の生体成分測定用化合物〔〕を得た。本品は
50mg当り、0.86±0.03ngのプロゲステロン抗体活
性を有していた（理論的抗体活性としては
1.1ng／mgである）。さらにこれとともに、プロゲ
ステロンの酵素標識化合物結合体を用い、前記と
同様に行なうことによりプロゲステロンを定量し
得るものである。 実施例 ８ インスリンの生体成分測定 実施例１、Ｃ項のスペーサー導入６・６ナイロ
ンビーズの代りに、６・６ナイロン（径５mm）
100粒を五塩化リン１ｇ含有ベンゼン100ml中で２
日間撹拌反応してベンゼンにて洗浄し、この50粒
にアジピン酸１ｇ含有50ml0.1M炭酸緩衝液（PH
11）を加えて室温下１日撹拌反応せしめ、洗浄後
さらにこれに250mgＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、500mgジシクロヘキシルカルボジイミド含有
テトラヒドロフラン50mlを加えて室温下５時間反
応せしめ、次いでこれに500mgのヘキサメチレン
ジアミン含有0.1M炭酸緩衝液（PH11）を加えて
室温下３時間反応せしめ、その後１％重ソウ100
mlにて洗浄後これに２％グルタルアルデヒド含有
0.1Mリン酸緩衝液（PH８）50mlを加えて室温、
１時間反応せしめて洗浄して、該ナイロンビーズ
をアジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、グルタ
ルアルデヒドの順にて処理してスペーサー導入ナ
イロンビーズを用いて、以下実施例１、Ｃ項と同
様に行なつて、インスリン測定用の生体成分測定
用化合物〔〕を得た。本品の１ビース当りのイ
ンスリン抗体活性は2.1±0.08ngであつた。 本品はインスリンの測定において、充分な活性
を有しているものであつた。 実施例 ９ インスリンの生体成分測定 実施例１、Ｃ項のスペーサー導入ナイロンビー
ズの代りに、下記のスペーサー導入担体を用い、
その他は、実施例１、Ｃ項と同様に行なつたもの
であつて、その結果、インスリンの測定用の生体
成分測定用化合物〔〕は良好な抗体活性を有す
るものであつた。 (i) ポリアクリロニトリル系ポリマー 500ml容三つ口フラスコを約35℃の恒温水浴
にひたし、約15分間窒素で置換せしめ、次い
で、フラスコ内に120mlの蒸留水を加え、さら
にアルキルスルホン酸ナトリウム２ｇ、アクリ
ロニトリル80ｇ、過硫酸ナトリウム0.1ｇ、亜
硫酸水系ナトリウム0.033ｇを加え、約３時間
撹拌せしめて乳濁液を得、次いでこれを約500
mlの水に注ぎ、撹拌下塩を加えて凝固せしめて
生成物を析出し、これを別、水洗し、通風乾
燥してポリアクリロニトリル（0.5％、30℃に
おけるジメチルホルムアミドでの対数粘度は約
10.5である）を得た。次いでこのポリアクリロ
ニトリル10ｇをジメチルホルムアミド150mlに
溶解し、これを、20％ジメチルホルムアミド含
有水浴中に、糸状に成形して、多孔質構造を有
するフイラメント状のポリアクリロニトリルを
得た。同様に、ポリアクリロニトリル10ｇを20
％ジメチルホルムアミド含有水浴中に、アトマ
イザーカツプを用いて滴下して、多孔質構造を
有する粒状のポリアクリロニトリルを得た。 次いで、水素化リチウムアルミニウム2.5ｇ
を三つ口フラスコに加え、乾燥エーテル100ml
を添加・撹拌し、これに上記の多孔質構造を有
する粒状のポリアクリロニトリル２ｇを加えて
50℃にて16時間加熱還流し、反応後氷冷下、水
を滴下して未反応の水素化リチウムアルミニウ
ムを分解せしめ、さらに1N HClを滴下して、
その分解物を溶解せしめ、次いでこれを別し
て、アミノ化された該ポリアクリロニトリルを
回収し、次いで1N HCl、水、1N Na OH、
水、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）の順で洗浄し
て遊離アミノ基およびニトリル基を有する多孔
質構造の粒状物を得た。 同様に、上記の多孔質構造を有する粒状のポ
リアクリロニトリルの代りに、多孔質構造を有
するフライメント状のボリアクリロニトリルを
用いて行なつた結果、遊離アミノ基およびニト
リル基を有する多孔質構造のフイラメント状物
を得た。 このようにして得られた遊離アミノ基および
ニトリル基を有する多孔質構造物を、12.5％グ
ルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH8.5）に
加えて０℃、20分間反応せしめ、次いでこれを
取し、ホウ酸緩衝液にて洗浄後、さらにこれ
を７−ADCA（７−アミノデスアセトキシセフ
アロスポラン酸）／0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）に加えて30℃、60分間振盪して反応せし
め、その後その上清中に残存する７−ADCA
の量を液体クロマトグラフイーにより求めて、
該遊離アミノ基およびニトリル基を有する多孔
質構造物１ｇ当り７−ADCA33〜35μMを結合
し得るアミノ基を有している性質の構造物であ
つた。 また、上記のグルタルアルデヒド処理後、
0.2Mヘキサメチレンジアミン（PH9.5）を室温
下２時間処理しさらにグルタルアルデヒドを反
応せしめた後、７−ADCAを同様反応せしめ
て求めた結果７−ADCAの結合量は42〜
46μM／ｇであつた。 本発明において、このアミノ化したポリアク
リロニトリルをその担体として用い、そのスペ
ーサー導入担体としてはこのアミノ化ポリアク
リロニトリルを上記の７−ADCAの結合の際
と同様にしてグルタルアルデヒド処理物、また
はグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジアミ
ン、グルタルアルデヒドにての処理物を使用す
るものである。 (ii) ６・６ナイロンビーズ系ポリマー ６・６−ナイロンビース100ｇをγ−アミノ
プロピルトリエトキシシラン100ml中に分散し
て、100℃、３時間加熱処理した後該ビースを
取し、水洗して乾燥してアミノプロピル化し
た該ビーズを得た。本化合物を、無水コハク酸
20ｇ／150mlジメチルホルムアミド中に加え、
一夜放置反応せしめ、取し、ジメチルホルム
アミドにて洗浄し、これをジシクロヘキシルカ
ルボジイミド20.6ｇおよびＮ−ヒドロキシスク
シンイミド11.5ｇ／ジメチルホルムアミド150
mlにて一夜反応せしめてジメチルホルムアミド
にて洗浄し、さらにこのビーズを0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.2）（0.1％NaN3、0.25％BSA、５
ｍMEDTA、0.15M NaCl含有）で３回洗浄し
て、スペーサー導入該ナイロンビーズを得た。 さらに、このスペーサー導入該ナイロンビー
ズに、ウサギのモルモツトIgGに対する抗体
（ウサギ抗体）を加えて５℃、17時間反応せし
めて充分洗浄して、〔（該ナイロンビーズ）−（ウ
サギ抗体）〕にて略示される結合物を得、さら
にこれにモルモツトのインスリン抗体を含有す
る血積希釈液を加えて、同様に反応せしめて
〔（該ナイロンビーズ）−（ウサギ抗体）−（モルモ
ツトのインスリン抗体）〕で略示されるインス
リン測定用の生体成分測定用化合物を得た。 実施例 10 実施例１で得られたインスリン測定用の生体成
分測定用化合物〔〕（No.１と略す）、実施例２で
得られたグルカゴン測定用の生体成分測定用化合
物〔〕（No.２と略す）、実施例４で得られた１−
34h−PTH測定用の生体成分測定用化合物〔〕
（No.３と略す）、実施例５で得られたα−フエトプ
ロテイン測定用の生体成分測定用化合物〔〕
（No.４と略す）の各々の化合物を、安定化剤を含
むPBSに浸漬したのち、凍結乾燥して各化合物
の凍結乾燥物を得た。またこの凍結乾燥物の活性
は、各々の凍結乾燥前の活性値を100％とした相
対活性を示すもので、さらに活性測定は、前記実
施例に記載した通りの手段である。該当リガンド
−標識化合物結合物を用いて、これを５℃、一夜
インキユベイトせしめた後Ｂ・Ｆ分離して、その
固相上の標識化合物の量を求めたものである。対
照として、その凍結乾燥は無添加条件の場合を挙
げたものである。その結果、第１表に示す通り、
本発明の添加物を用いることにより、極めて安定
化した凍結乾燥物が得られた。特に、アルブミ
ン、カゼインなどの蛋白質0.5〜２％の添加、グ
リセリン１〜３％の添加、ピロリン酸５％の添加
における安定化剤を用いることにより良好な効果
を有しているものであつた。
合せて反応せしめるもので、さらにまた例えば
〔Ｃ〕の不溶性担体の官能基であるアミノ基にグ
ルタルアルデヒドを反応せしめてアルデヒドをそ
の末端反応基となしさらにこれにヘキサメチレン
ジアミンを反応せしめてアミノ末端となし、この
アミノ基をそのままカルボジイミド試薬、ウツド
ワード試薬とともに〔Ａ〕化合物のカルボキシル
基と結合せしめるか、またはそのアミノ基を活性
化せしめて〔Ａ〕化合物のアミノ基と結合せしめ
るなどの二種以上の多官能性化合物を用いてスペ
ーサーを導入してもよく、またその際の末端の官
能基を適宜変更してもよい。またこの結合に際し
ては、通常水、アセトン水溶液、エタノール水溶
液、ジメチルスルホキサイド水溶液、リン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液
などの水性媒体下行なわれるもので、またはアセ
トン、エタノール、ジオキサン、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキサイド、メチレンクロ
ライド、クロロホルムなどの媒体を用いてもよ
く、また反応温度としては通常室温下ないし冷却
下にて行なえばよい。また多孔性の不溶性担体を
用いる場合には、〔Ａ〕化合物を媒体中吸着せし
めて両者を結合せしめればよいものであるが、し
かしこの吸着による結合は後日の種々の反応に際
してその結合の一部が解離するため、この結合は
吸着後さらに反応しうる多官能性化合物にて両者
を結合せしめてもよい。このようにして得られた
化合物〔〕は、〔Ｃ〕の不溶性担体と結合した
化合物であるため不溶物として存在するものであ
り、通常の固液分離手段、例えば過や遠心分離
などの手段を用いて不溶性の化合物〔〕を分
離、採取し、洗浄すればよい。 次いで、さらにこの化合物〔〕は〔Ｂ〕化合
物〔〕と結合せしめて、目的物たる生体成分測
定用化合物〔〕を得るものであるが、この際に
おける反応は化合物〔〕に結合せしめられた
〔Ａ〕化合物の、〔Ｂ〕化合物〔〕に対して特異
的に結合する部位をもつて、その〔Ａ〕化合物を
特異的に結合する〔Ｂ〕化合物〔〕と、その免
疫的結合により行なわせしめるもので、この際の
媒体としては通常水性媒体、好ましくは緩衝能を
有する水性媒体、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩
衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを用い、
また温度条件としては通常室温下であり、反応時
間は通常一中夜程度にて行なわれる。またこの生
体成分測定用化合物〔〕における〔Ａ〕化合物
と〔Ｂ〕化合物〔〕についての組合せは、〔Ａ〕
化合物を製造するために適宜選択使用した哺乳動
物に感作させた〔Ｂ〕化合物〔〕を使用する
か、または〔Ｂ〕化合物〔〕を得るに使用した
哺乳動物のIgG成分を用いて得られた〔Ａ〕化合
物と、その〔Ｂ〕化合物〔〕との組合せであつ
て、またこの反応の場合には〔Ｂ〕化合物〔〕
は完全に免疫グロブリンとして精製したものでは
なく、その成分を有している血清を使用してもよ
い。さらに化合物〔〕と〔Ｂ〕化合物〔〕の
使用割合としては、目的物たる生体成分測定用化
合物〔〕として必要な〔Ｂ〕化合物〔〕のリ
ガンドに対する活性を有しているものであればよ
く、またこの〔Ｂ〕化合物〔〕の量としては測
定における液体中のリガンドの量、または希釈さ
れた液体中のリガンドの量に対応するものである
から、対応するリガンドの量に対して適宜変更す
ればよく、特に限定されるものではないが、通常
生体成分測定用化合物〔〕１mg当り0.01〜5ng
程度の〔Ｂ〕化合物〔〕を結合せしめればよい
ものであり、その際あらかじめ化合物〔〕の一
定量を分取し、この量に対し適宜の〔Ｂ〕化合物
〔〕を分取、使用すればよく、また生体成分測
定用化合物〔〕に充分な量の〔Ｂ〕化合物
〔〕を結合せしめるには、当然過剰の量の〔Ｂ〕
化合物〔〕を用いればよく、これらの結合に際
しては免疫反応であるため〔Ｂ〕化合物〔〕の
活性の劣化または失活を生ぜせしめないため、例
えばその後の液相中の残存〔Ｂ〕化合物〔〕の
活性を測定すれば容易に化合物〔〕と〔Ｂ〕化
合物〔〕の結合割合が導き出されるものであ
る。このように生体成分測定用化合物〔〕を得
るに当つての化合物〔〕と〔Ｂ〕化合物〔〕
の使用割合は適宜なし得るもので、何んら限定す
べきものでなく、通常化合物〔〕における結合
された〔Ａ〕化合物の活性な量に対しての〔Ｂ〕
化合物〔〕の量を、同量またはそれ以下の量に
て使用すればよく、このようにして正確な〔Ｂ〕
化合物〔〕の量を結合せしめるものである。こ
のようにして得られた生体成分測定用化合物
〔〕は、さらに通常の固液分離手段を用いて分
離、採取し、洗浄すればよい。 この得られた生体成分測定用化合物〔〕は、
その構造上、〔Ａ〕化合物と〔Ｂ〕化合物〔〕
とは免疫学的反応によつて結合せしめられている
ため、生体成分測定用化合物〔〕における
〔Ｂ〕化合物〔〕は定量的に結合せしめたもの
で、またその活性はそれに対して特異的に結合す
るリガンドに対し、何んら劣化したものでない優
れたものであり、よつてこの生体成分測定用化合
物〔〕の〔Ｂ〕化合物〔〕の量は極めて良好
な精度を示すものである。 さらに、この生体成分測定用化合物〔〕は、
安定化剤を用いることにより、長期間安定な凍結
乾燥組成物として得られるものであるが、この際
安定化剤として使用される化合物としては、好ま
しくは、例えばアルブミン、カゼイン、グリセリ
ン、ピロリン酸などが挙られ、さらにエチレング
リコール、塩化カルシウム、塩化マグネシウムな
ども安定化の効果を示すものであり、蛋白質、多
価アルコール、水溶性塩類、リン酸化合物などが
挙られ、これらの使用量としては蛋白質の場合好
ましくは0.5〜２％程度、多価アルコールの場合
は１〜20％程度、塩類やリン酸化合物の場合は５
％程度であり、特にアルブミン、カゼインの0.5
〜２％、グリセリンの１％、ピロリン酸の５％添
加においては、無添加の凍結乾燥組成物に比べ、
凍結乾燥後３ケ月後にてもほとんどその活性を劣
化せしめないものである。また凍結乾燥に当つて
は、0.1Mリン酸緩衝液などの水性媒体に生体成
分測定用化合物〔〕および安定化剤を加え、次
いでこれを公知の凍結乾燥の手段、例えば0.001
〜0.5ｍHg、−40〜−60℃程度にて実施すればよ
い。 さらに本発明において、この生体成分測定用化
合物〔〕またはその凍結乾燥組成物を用いて測
定を行なうものであるが、測定に際しては少なく
とも生体成分測定用化合物〔〕およびこの生体
成分測定用化合物〔〕における〔Ｂ〕化合物
〔〕に特異的に結合するリガンド−酵素標識化
合物結合物を使用して、実施するものである。こ
の実施に当り、まず生体成分測定用化合物〔〕
を含有する系、例えばその水性媒体溶液中に、測
定すべきリガンド含有液体およびリガンド含有−
酵素標識化合物結合物を加えて水性媒体中インキ
ユベイトするもので、例えばPH6.5〜８、好まし
くは７〜7.4程度の緩衝液にて５〜40℃、好まし
くは35〜37℃程度にて30分ないし一日程度インキ
ユベイトせしめ、次いでリガンド−酵素標識化合
物結合物と生体成分測定用化合物〔〕との結合
物たる固相と、未反応のリガンド−酵素標識化合
物結合物を有する液相とを分離する。分離に当つ
ては、通常の固液分離手段を用いればよく、この
ようにして分離した固相または液相より、その酵
素標識化合物の量をその標識化合物の特性に応じ
た測定手段に基いて求め、この標識化合物の量、
即ち添加した標識化合物の量、Ｂの量、Ｆの量に
基いて測定すべき液体中のリガンドの含量が算
出、測定されるものである。またリガンド含有液
体としては上述の通り、生体の血液、尿、唾液な
どに含有されるリガンド成分を有するもので、こ
れらリガンドは液体中に種々の量にて含有されて
いるものであり、例えば正常な場合のインスリン
は６〜20μU／ml、ACTHは15〜70pg／ml、プロ
ラクチンは２〜15ng／ml、などで、血中と尿中
の場合にても異なつているもので、これらのリガ
ンドの含有量に応じて調整すればよく、高濃度に
存在する場合は、測定の際に用いる水性媒体にて
希釈使用してもよい。さらに標識化合物として
は、エンチーモ・イミユノアツセイにおける酵素
が例示、汎用されるものである。またその酵素と
しては公知の種々のものが使用し得るもので、例
えばアルカリフオスフアターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アミラー
ゼ、マルターゼ、ペクチナーゼなどの加水分解酵
素、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ウレアー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナー
ゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、アルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、アルドラーゼなどの酸化還元酵素、トラ
ンスフエラーゼ類、その他リアーゼ類、イソメラ
ーゼ類、リガーゼ類の酵素が適宜使用されうる。
さらにラジオアイソトープとしては通常放射性同
位元素として使用されているものならばよく、通
常ヨード125が汎用されているものである。 さらにこれらの標識化合物を適宜選択して、こ
の標識化合物を測定するものであるが、酵素を標
識化合物とする場合は、当然その酵素の基質を含
有する溶液を用いて、その基質の減少、または基
質の酵素作用による生成物の増加を測定すればよ
く、これらの測定はその酵素の基質に対する作用
機序に基いて適宜良好な各成分をもつて測定すれ
ばよく、一般に酸化酵素の場合は消費される酵素
を酸素電極にて測定するか、生成される過酸化水
素を過酸化水素電極にて、またはペルオキシダー
ゼと４−アミノアンチピリン、フエノールもしく
はジメチルアニリンなどの呈色剤ととも呈色せし
めて比色にて測定すればよく、さらに加水分解酵
素の場合も消費される基質の量や、生成される成
分を適宜測定すればよく、またこの際基質に螢光
性分子を導入し、酵素加水分解にてその螢光性分
子を遊離せしめる手段、例えば４−メチルウンベ
リフエリル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質として
β−ガラクトシダーゼからなる標識化合物を作用
せしめて４−メチルウンベリフエロンを生成せし
め、これを励起波長360ｍμ、螢光波長450ｍμに
て螢光せしめ、測定すればよい。 従つてまた、この方法、キツトを実施するに当
り、試験用セツトとして使用するのが好ましく、
少なくとも生体成分測定用化合物〔〕およびリ
ガンド−酵素標識化合物結合物の一定量、例えば
後述実施例における１ビーズ当り0.5〜5ngの
〔Ｂ〕化合物〔〕を結合した生体成分測定用化
合物〔〕のビーズ当り、その〔Ｂ〕化合物
〔〕の等量以上のリガンドを有するリガンド−
酵素標識化合物結合物を用いればよく、さらにこ
れに水性媒体を添付すればよい。また、この試験
セツトは、別の成分、例えば標識化合物としての
酵素に対する酵素活性測定用試薬を含んでもよ
い。さらにこれらのセツトは全量１ml程度の液量
となる程度が好ましい。 このようにして測定することにより、本発明の
生体成分測定用化合物〔〕が〔Ｂ〕化合物
〔〕を何んら劣化せしめることなく、かつ定量
的に結合せしめられているものであるため、液体
中の〔Ｂ〕化合物に対して特異的に結合するリガ
ンドおよびリガンド−酵素標識化合物結合物を極
めて精度よく結合するものであつて、よつてその
測定結果も極めて良好なものであり、かつ短時間
にて行なえる有用な方法およびキツトである。 次に実施例を挙げて具体的に詳記するが、本発
明は何んらこれらに限定されるものではない。 実施例 １ インスリンの生体成分測定 Ａ：インスリン抗体 市販のインスリン（ウシインスリン、シグマ
社製）３mgを0.15M NaCl含有リン酸緩衝液
（以下、PBSという）（PH7.2）0.5mlに溶解し、
これにFreund adjubantを加えてホモゲナイズ
して、その１mlを得、これを２週間に１回の割
にてモルモツトに皮下注射し、８回投与して感
作した後採血し、これを3000rpm、15分間遠心
分離して、インスリンの抗体を含有する血清を
得た。この血清は、次の如くの精製法にて免疫
グロブリン成分たるインスリンのIgG成分を得
る。 精製法１：上記の血清50mlに、等量のPBSを
加え、さらに飽和硫安水溶液を加えて50％飽
和にせしめてその沈澱物を得、次いでこの沈
澱物をPBSに加えて100mlとなし、これに20
％飽和になるように硫安を加えて生じる沈澱
物を去し、さらに35％飽和になるように硫
安を追加し、これを遠心分離（8000rpm、15
分間）して、そのIgG画分を得（収率70％）、
さらにこのLgG画分をPBS10mlに溶解し、
これをセフアデツクスG100（商品名）を充填
したカラム（径２×70cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて展開せし
めて、脱塩されたその素通り区分を得、さら
にその活性画分をDEAEセルロースを充填し
たカラム（径１×30cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）にて展開せし
めて、その素通り区分を集めて、インスリン
のIgG画分を得た（収率59％、抗体含量1.7
％）。 精製法２：シアノブロマイドで活性化したセフ
アロース4B（商品名）２ｇに、ヘキサメチレ
ンジアミンの10％水溶液（PH11）２mlを加え
て撹拌下60分間反応せしめ、次いで洗浄した
後これに５％グルタルアルデヒド水溶液（PH
８）２mlを加えて反応せしめ、さらにPBS
で洗浄し、次いでこれにインスリン100mgを
加えて、〔（セフアロース4B）−NH−（CH2）
６−Ｎ＝CH−（CH2）3−CH＝（インスリン）〕
で略示されるセフアロース4Bの水酸基とイ
ンスリンのアミノ基とによるインスリン固定
化セフアロース4Bを得た。次いでこのイン
スリン固定化セフアロース4Bに、上記のイ
ンスリンのIgG画分を加えて一夜撹拌してイ
ンスリン固定化セフアロース4Bのインスリ
ンと、その抗体成分たるIgGとを結合せし
め、これをPBSで十分洗浄後0.1Mグリシ
ン・HCl緩衝液（PH2.5）にて溶出してアフ
イニテイークロマトグラフイーを行なつて、
その活性画分を得た（収率37％、抗体純度66
％）。 Ｂ：モルモツトのIgGに対する抗体 モルモツトのIgG3mgを用いて、上記と同様
にして、上記のモルモツトの代りにウサギを用
いて感作、採血して、その血清を得る。 さらにこの血清は、上記と同様にして得られ
たモルモツトIgG固定化セフアロース4Bを用い
てアフイニテイークロマトグラフイーを行な
い、0.1Mグリシン・HCl緩衝液（PH2.5）にて
溶出して、ウサギのモルモツトのインスリン
IgGに対する抗体として得た（収率37％、純度
72％）。 なお、このモルモツトのIgGに対する抗体を
得るに当つては、モルモツトとは別種の動物を
用いて感作等せしめればよいものであつて、そ
の際ウサギに限定されるものでなく、牛や馬な
どを用いてもよく、この場合には牛または馬の
モルモツトのIgGの抗体が得られるものであ
る。 Ｃ：インスリン用の生体成分測定用化合物〔〕 ６・６ナイロンビーズ（径５mm）500粒を５
塩化リン４ｇとピリジン４ｇを含むベンゼン60
ml中で２日間撹拌した後４回ベンゼンにて洗浄
してイミノクロライド化した６・６ナイロンビ
ースを得、これに１ｇのヘキサメチレンジアミ
ンを含む炭酸緩衝液（PH11）50mlを加えて室温
下24時間撹拌反応せしめ、１％重ソウ100mlで
４回洗浄し、さらにこれに２％グルタルアルデ
ヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH８）50mlを加
えて１時間室温で反応せしめて0.1Mリン酸緩
衝液（PH８）で洗浄し、さらに同様にして再度
ヘキサメチレンジアミンおよびグルタルアルデ
ヒドの順にて処理して、該ナイロンビーズにス
ペーサーを導入せしめた。次いで、このスペー
サーを導入したナイロンビーズ150粒に、上記
Ｂ項に記載した通りのウサギのモルモツトのイ
ンスリンIgGに対する抗体（抗IgG）155γを
PBS（PH8.0）中に加えて５℃、一夜反応せしめ
て、〔（該ナイロン）−（抗IgG）〕にて略示され
る結合物を得（450〜590ng抗IgG／１ビーズ）、
次いで、これに上記のＡ項に記載した通りのモ
ルモツトのインスリンの抗体を含有する血清の
10000倍希釈液（0.1％NaN3、0.15M NaCl、
0.25％BSA、５ｍMEDTA含有0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2）よりなる希釈液）15ml（350ngの
抗インスリIgGを含む）を加えて５℃、一夜撹
拌して〔（該ナイロン）−（抗IgG）−（インスリ
ンの抗体）〕にて略示されるインスリン測定用
の生体成分測定用化合物〔〕を得た。本品
は、後述のインスリン−β−ガラクトシダーゼ
結合物によるインスリン−標識化合物結合物を
使用してそのインスリンの抗体活性を測定した
結果、１ビーズ当り2.0±0.11ngのインスリン
抗体活性を有していた。（本品の理論的インス
リン抗体活性値は2.25ngである。 Ｄ：インスリン測定用の生体成分測定用化合物
〔〕の測定に使用するインスリン−標識化合
物結合物たるインスリン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物、インスリン60mgを、0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.5）４mlに溶解し、これに３−（ベン
ゾチアゾール−2′−イルジチオ）プロピオン
酸・スクシンイミドエステル8.5ng含有ジメチ
ルホルムアミド0.4mlを加えて室温下１時間反
応せしめ、反応後PH5.0となして沈澱物を回収
し、さらにこの沈澱物を0.1Mリン酸緩衝液
（PH8.5）40mlに溶解し（インスリンとして1.0
mg／ml含有）、このうち100μを分取し、これ
にβ−ガラクトシダーゼ10mgを加えて１時間反
応せしめ、その後この反応液をセフアデツクス
G100を充填したカラム（径1.5×120cm）にて
PBSにて溶出せしめ、その65〜73mlの画分を
集めて、〔（インスリン）−CO−（CH2）2−Ｓ（β
−ガラクトシダーゼ）〕で略示されるインスリ
ンのアミノ基とβ−ガラクトシダーゼのチオー
ル基とによるインスリン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物を含有する溶出区分（インスリン
2.4γ／ml、かつβ−ガラクトシダーゼ１分子当
り１分子のインスリンの結合物であり、かつイ
ンスリン抗体に対しインスリン結合物の95％の
活性を有している）を得た。 なお、上記で使用された３−（ベンゾチアゾ
ール−2′−イルジチオ）プロピオン酸・スクシ
ンイミドエステルは次の如くして得られたもの
である（特願昭53−85900号参照）。 ２・2′−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
13.2ｇをベンゼン400mlに加え、さらにβ−メ
ルカプトプロピオン酸６ｇを加えて、70℃、３
時間加熱撹拌し、その後この反応液を氷水浴に
て冷却して析出せしめて13.8ｇの粗結晶を得、
さらにこれをベンゼンにて再結晶化して12ｇの
３−（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）プ
ロピオン酸の結晶を得た（本品のm.p.は162〜
164℃、ベンゼン：酢酸エチル＝１：２による
リシカゲル薄層クロマトグラフイーにてのRf
値は0.33である）。次いでこの３−（ベンゾチア
ゾール−2′−イルジチオ）プロピオン酸３ｇを
酢酸エチル20mlに溶解し、これにＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド１ｇおよびジシクロヘキシル
カルボジイミド1.7ｇを加えて３時間、室温に
て撹拌反応して、生成するジシクロヘキシル尿
素を別した後その酢酸エチル層を回収し、さ
らにこれをPH7.5のリン酸緩衝液で洗浄して未
反応の遊離酸を除去し、さらにこの酢酸エチル
層に芒硝を加えて脱水した後乾固し、さらにこ
れを熱石油エーテルに溶解した後冷却して３−
（ベンゾチアゾール−2′−イルジチオ）プロピ
オン酸・スクシンイミドエステル2.4ｇを得た
（本品のm.p.は114〜115℃、ベンゼン：酢酸エ
チル＝３：１によるシリカゲル薄層クロマトグ
ラフイーにてのRf値は0.53である）。 Ｅ：インスリンの測定 (i) 測定用キツト ●生体成分測定用化合物〔〕を含有する
系：上述のインスリン測定用の〔（該ナイ
ロン）−（抗IgG）−（インスリン抗体）〕で
略示される１ビーズ当り2.0±0.11ngのイ
ンスリン抗体を有する生体成分測定用化合
物〔〕１粒を含有する1.0ml容容器。 ●リガンド−酵素標識化合物結合物を含有す
る系：上記の〔（インスリン）−CO−
（CH2）−Ｓ−（β−ガラクトシダーゼ）〕で
略示されるインスリン−β−ガラクトシダ
ーゼ結合物／PBS溶液50μ（インスリン
として1ng／ml）を有する容器。 ●β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体：０
−ニトロフエニール−β−Ｄ−ガラクトシ
ド５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％
NaN3、0.1％BSA、20ｍＭメルカプトエ
タノール、10％メタノール含有）（PH6.7）
200μからなるβ−ガラクトシダーゼ活
性測定用媒体、および0.2Mグリシン緩衝
液（PH10.4）2.5mlからなる該媒体反応停
止液。 ●反応媒体：脱インスリンの牛血清100μ。 ●反応用洗浄液：0.1％NaN3、0.15M
NaCl、0.25％BSA、５ｍMEDAT含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）。 上記各系を組合せて１テスト用のインスリ
ン測定用キツトとなす。 (ii) 測定方法 上記の組合せキツトを用いて、次の如くし
て、インスリンの測定を行なつた。 まず、インスリンの0.2ng／ml、0.4ng／
ml、0.8ng／ml、1.6ng／ml、3.2ng／ml、
6.4ng／ml、12.5ng／ml、25ng／mlの各濃度
のインスリンを含有する液体を調整して、イ
ンスリン含有液体試料となし、また反応媒体
としては脱インスリンの牛血清100μを用
いた。このインスリン含有液体100μを、
上記の生体成分測定用化合物〔〕１粒を含
有する1.0ml容容器に上記インスリン−β−
ガラクトシダーゼ結合物／PBS溶液50μを
含有する容器の内容物とともに注入して、５
℃、一夜インキユベイトせしめ、その後これ
を別して固相と液相とを分別し、この固相
を反応用洗浄液にて洗浄した後さらにこの固
相の固形物に上記のβ−ガラクトシダーゼ活
性測定用媒体を加えて44℃で２時間反応せし
めた後、これに上記の該媒体反応停止液を加
えた後、その発色を420nｍの波長にてその
吸光度を測定して、その生体成分測定用化合
物〔〕に対するインスリンとインスリンβ
−ガラクトシダーゼ結合物の競合反応によ
る、その生体成分測定用化合物〔〕に結合
したインスリンβ−ガラクトシダーゼ結合物
のβ−ガラクトシダーゼの活性とインスリン
液体中のインスリン量との関係を測定した。 その結果、第１図に示す通り、本発明のイ
ンスリン測定用の生体成分測定用化合物
〔〕は、極めて良好な定量曲線を示すもの
であつた。 実施例 ２ グルカゴンの生体成分測定 Ａ：グルカゴン抗体 グルカゴン（ブタグルカゴン）を用いてなる
ウサギのグルカゴン抗体を含有する市販の抗血
清を用いた。 Ｂ：ウサギのIgGに対する抗体 ウサギのIgG4mgを上記実施例１のＢ項の方
法に準じて、山羊に感作せしめて、その抗血清
を得、さらにそのアフイニテイークロマトグラ
フイーを行なつて山羊のウサギのIgGに対する
抗体として得た（収率36％、純度68％）。 Ｃ：グルカゴン用の生体成分測定用化合物〔〕 ６・６ナイロンビース（径５mm）100粒を五
塩化リン１ｇを含むベンゼン100ml中で２日間
撹拌反応せしめた後ベンゼンにて４回洗浄し、
次いでこの50粒を用いて、これにアジピン酸１
ｇ含有50ml0.1M炭酸緩衝液（PH11）を加えて
室温下24時間撹拌反応し、別した後洗浄し、
さらにこれに250mgＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、500mgジシクロヘキシルカルボジイミド
を含有するテトラヒドロフラン50mlを加えて５
時間室温にて反応せしめて、スクシンイミド活
性エステル化せしめ、これを洗浄後500mgヘキ
サメチレンジアミン含有0.1M炭酸緩衝液（PH
11）を加えて室温下３時間撹拌反応し、その後
１％重ソウ100mlにて４回洗浄し、さらにこれ
に２％グルタルアルデヒド含有0.1Mリン酸緩
衝液（PH８）50mlを加えて室温、１時間反応せ
しめた後0.1Mリン酸緩衝液にて洗浄して、該
ナイロンビーズのアミド基を活性化した部位に
アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、グルタ
ルアルデヒドの順にて処理されたスペーサー導
入ナイロンビーズを得た。次いでこのスペーサ
ー導入ナイロビーズ100粒に、上記Ｂ項にて得
られた山羊のウサギのグルカゴンIgGに対する
抗体（抗IgG）5.6γ（ウサギのグルカゴンIgG相
当量としては10γ）をPBS（P48.0）中にて５
℃、一夜反応せしめて、〔（該ナイロン）−（抗
IgG）〕にて略示される結合物を得（41〜50ng
抗IgG／１ビーズ）、次いでこれに上記Ａ項に
記載した市販品たるグルカゴンの抗体を含有す
る血清の80000倍希釈液（0.1％NaN3、0.15M
NaCl、0.25％BSA、５ｍMEDTA含有0.01M
リン酸緩衝液（PH7.2）よりなる希釈液）５ml
（4.8ngグルカゴン抗体／ml）を加えて５℃、一
夜撹拌して、〔（該ナイロン）−抗IgG）−（グル
カゴンの抗体）〕にて略示されるグルカゴン測
定用の生体成分測定用化合物〔〕を得た。本
品は、後述のグルカゴン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物によるグルカゴン−標識化合物結合物
を使用して、そのグルカゴンの抗体活性を測定
した結果、１ビーズ当り0.21±0.01ngのグルカ
ゴン抗体活性を有していた（本品の理論的グル
カゴン抗体活性は0.24ngである）。 Ｄ：グルカゴン測定用の生体成分測定用化合物
〔〕の測定に使用するグルカゴン−標識化合
物たるグルカゴン−β−ガラクトダーゼ 「医学のあゆみ」第103巻第25頁（1977年）
に記載の方法に準じて、25mgのグルカゴンを２
mgのＳ−アセチルメルカプトサクシニツクアン
ハイドライドにて40分間反応せしめてメルカプ
トサクシニル化せしめ、さらにこれを0.5Mヒ
ドロキシアミンにて20℃、30分間処理して脱ア
セチル化した後0.1Mリン酸緩衝液（PH８）に
飽和させたＮ・N′−０−フエニルジマレイミ
ド２mlを反応せしめて、マレイミド化せしめた
グルカゴンを得、次いでこれをセフアデツクス
G25を充填したカラム（径１×60cm）にチヤー
ジして0.1Mリン酸緩衝液（PH８）にて溶出せ
しめてその活性画分を得（1.4mgグルカゴン／
ml）、その内その10μを分取し、これに2.8mg
のβ−ガラクトシダーゼ溶解リン酸緩衝液（PH
８）１mlを加えて、30℃、30分間反応せしめ、
この反応液をセフアデツクスG100によるクロ
マトグラフイーを行なつて、チオール基を導入
したグルカゴンのチオール基とβ−ガラクトシ
ダーゼのチオール基とによるグルカゴン−β−
ガラクトシダーゼ結合物を含有する溶出区分
（グルカゴン1.4μｇ／ml、β−ガラクトシダー
ゼ253μｇ／ml、かつβ−ガラクトシダーゼ１
分子当り１分子のグルカゴン結合物である）。 Ｅ：グルカゴンの測定 (i) 測定用キツト ●生体成分測定用化合物〔〕を含有する
系：上記のグルカゴン測定用の〔（該ナイ
ロン）−（抗IgG）−（グルカゴン抗体）〕で
略示される１ビーズ当り0.21±0.01ngのグ
ルカゴン抗体を有する生体成分測定用化合
物〔〕１粒を含有する1.0ml容容器。 ●リガンド−酵素標識化合物結合物を含有す
る系：上記のグルカゴン−β−ガラクトシ
ダーゼ結合物／PBS溶液50μ（グルカゴ
ンとして0.5ng／ml）を有する容器。 ●β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体：前
記実施例１に記載の該媒体と同一媒体を使
用。 ●反応媒体：脱グルカゴンの牛血清100μ。 ●反応用洗浄液：前記実施例１に記載の該洗
浄液と同一洗浄液を使用。 上記の各系を組合せて１テスト用のグルカ
ゴン測定用キツトとなす。 (ii) 測定方法 上記の組合せキツトを用いて、次の如くし
て、グルカゴンの測定を行なつた。 まずグルカゴンを含有する液体として、
1.0ml当り0.1ng〜6.4ng含有液を調整した。
このグルカゴン含有液体100μ（液体100μ
当り0.01〜0.64ngのグルカゴン含有）、反
応媒体100μを、上記のグルカゴン測定用
生体成分測定用化合物〔〕１粒を含有する
1.0ml容容器に、上記グルカゴン−β−ガラ
クトシダーゼ結合物／PBS溶液50μを含有
する容器の内容物とともに注入して、５℃、
一夜反応せしめ、その後これを別して固相
と液相とを分別し、この固相を反応用洗浄液
にて洗浄した後、さらにこの固相の固形物
に、β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体を
加えて44℃、２時間反応せしめ、次いでこれ
にその反応停止液を加えた後、その発色を
420nｍの波長にてその吸光度を測定して、
その生体成分測定用化合物〔〕に対するグ
ルカゴンとグルカゴン−β−ガラクトシダー
ゼ結合物とによる競合反応より、その生体成
分測定用化合物〔〕に結合したグルカゴン
−β−ガラクトシダーゼ結合物のβ−ガラク
トシダーゼ活性とグルカゴン液体中のグルカ
ゴン量との関係を測定した。 その結果、第２図に示す通りであつて、本
発明のグルカゴン測定用の生体成分測定用化
合物〔〕は極めて良好な定量曲線を示すも
のであつた。 実施例 ３ 1α・25（OH）2−コレカルシフエロールの生体
成分測定 Ａ：1α・25（OH）2−コレカルシフエロールレセ
プター ４週間ビタミンＤ欠餌を与えてクル病とした
ニワトリ（白色レグホン）の小腸３ｇを、
0.25Mシユクロース、0.025M Ｋ Cl.0.005M
MgCl2を含有する0.5Mトリス−Ｈ Cl緩衝液
（PH7.5）にて洗浄し、次いで同一緩衝液30mlを
加えてポツタ型ホモゲナイザーにてホモゲナイ
ズして、これを800G、10分間遠心分離してそ
の沈澱物を得る。またその上清液は、8000G、
さらに100000Gにて遠心分離してその上清液を
回収し、この上清液は後述の1α・25（OH）2−
コレカルシフエロールの測定に際して、その反
応媒体として使用する。次いでこの800Gによ
る沈澱物を0.1％トリトンＸ−100含有の上記緩
衝液に加えて、これを800G、10分間遠心分離
してその沈澱物を得、さらにこれを1.75Mシユ
クロース、0.025M Ｋ Cl、0.005MgCl2含有
0.05MトリスＨ Cl緩衝液（PH7.5）15mlに加
えてホモゲナイズした後65000G、１時間遠心
分離して、その沈渣を得、次いで
0.006MEDTA含有0.025M NaCl溶液（PH8.0）
35mlにて２回、0.025M NaCl含有0.01Mトリス
−Ｈ Cl緩衝液（PH8.0）にて１回洗浄し、さ
らに1.75Mシユクロース、0.025M Ｋ Cl、
0.005MgCl2含有0.05Mトリス−HCl緩衝液（PH
7.5）15mlを加えて撹拌し、これを65000G、１
時間遠心分離して、1α・25（OH）2−コレカル
シフユロールレセプターを含有する沈澱物を得
た。 Ｂ：ニワトリの1α・25（OH）2−コレカルシフエ
ロールレセプターに対する抗体 上記の如くして得られた1α・25（OH）2−コ
レカルシフエロールレセプター４mgを用いて、
上記実施例１のＢ項記載の如くして、ウサギを
用いて２週間毎、６回投与して感作せしめ、さ
らに採血、精製して、ウサギのニワトリ1α・
25（OH）2−コレカルシフエロールレセプター
に対する抗体として得た（収率33％、純度28
％）。 Ｃ：1α・25（OH）2−コレカルシフエロール用の
生体成分測定用化合物〔〕 シアノブロマイドにて活性化したセフアロー
ス4B5ｇ（湿重量）に、５％ヘキサメチレンジ
アミン水溶液10mlを加えて撹拌下60分間反応せ
しめ、次いで洗浄した後これに２％グルタルア
ルデヒド水溶液10mlを加えて室温下60分間反応
せしめた後洗浄しさらにこれを２％ε−アミノ
カプロン酸水溶液10mlを加えて室温下60分間反
応せしめる。洗浄した後これをＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド1.1ｇおよびジシクロヘキシル
カルボジイミド2.1ｇ含有テトラヒドロフラン
20mlを加えて、〔（セフアロース4B）−NH
（CH2）6−Ｎ＝CN−（CH2）3−CH＝Ｎ−CH2
（CH2）4−COOH〕で略示されるその末端カル
ボキシル基をスクシンイミドエステル化した、
スペーサー導入セフアロース4Bを得、このセ
フアロース4B1ｇを分取して0.1Mリン酸緩衝
液にて充分洗浄した後、上記Ｂ項に記載した通
りのウサギのニワトリ1α・25（OH）2−コレカ
ルシフエロールレセプターに対する抗体を上記
実施例１のＡ項における精製法１に準じて精製
した該レセプターに対する抗体（純度28％）
4.0mgを0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.0）５mlに溶解して加え、５℃、24時間反
応せしめて、〔（該セフアロース4B）−（該レセ
プターに対する抗体）〕にて略示される結合物
を得、次いでこれに、上記Ａ項に記載した
1α・25（OH）2−コレカルシフエロールレセプ
ターの沈渣２mgを0.005M MgCl2、0.15M
NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）５mlに
分散した溶液を加えて、５℃、一夜撹拌して、
〔（該セフアロース4B）−（該レセプターに対す
る抗体）−（1α・25（OH）2−コレカルシフエロ
ールレセプター）〕で略示される1α・25（OH）2
−コレカルシフエロール測定用の生体成分測定
用化合物〔〕を得た。本品はトリチウム標識
化合物を用いて、本品10mg当り2.08〜2.42ngの
1α・25（OH）2−コレカルシフエロールレセプ
ター活性を有していた（本品の理論活性は
2.60ngである）。 また1α・25（OH）2−コレカルシフエロール
測定用の生体成分測定用化合物〔〕の測定に
使用する酵素標識化合物は、1α−25（OH）2−
コレカルシフエロール−酵素結合体を調製して
用いればよい。さらにこれらの各試料を、前記
実施例に準じて同様に行なうことにより1α・
25（OH）2−コレカルシフエロールの測定をな
し得る。 実施例 ４ １−34h−PTHの生体成分測定 Ａ：１−34h−PTH抗体 Ser−Val−Ser−Glu−Ilu−Gln−Leu−Met
−His−Asn−Leu−Gly−Lys−His−Leu−
Asp−Ser−Met−Glu−Arg−Val−Glu−Trp
−Leu−Arg−Lys−Lys−Leu−Gln−Asp−
Val−His−Asn−Phe−NH2で表わされるア
ミノ基末端からなるアミノ酸配列を有する１−
34h−PTH（ヒト−パラチロイドホルモン）３
mgを0.5％BSA含有0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）
21mlに溶解し、その２mlづつに２mlのFreund
Adjuvantを加えて充分に混和し、これをウサ
ギに、２週間毎12回皮下注射して充分に感作せ
しめ、その２週間後に採血し、これを
3000rpm.15分間遠心分離してその血清を得、
これを60℃、30分間処理してウサギの１−34h
−PTH抗体を含有する血清を得た。 Ｂ：ウサギのIgGに対する抗体 ウサギのIgG4mgを用いて、これを馬に皮下
注射して、以下同様にして、感作せしめて採血
し、遠心分離し、精製して、馬のウサギ１−
34h−PTH抗体に対する抗体として得、次いで
実施例１の方法に準じてアフイニテーフロスト
グラフイーで精製した。（収率36％、純度67％） Ｃ：１−34h−PTH用の生体成分測定用化合物
〔〕 ６・６−ナイロン（５mm径）100粒に、ジメ
チル硫酸50mlを加えて100℃、４分間処理、冷
却後エタノール100mlにて５回洗浄し、これに、
0.5Mヘキサメチレンジアミン含有0.1Mホウ酸
緩衝液（PH9.5）50mlを加えて、室温下２時間
反応後0.5M NaCl、次いで水にて洗浄し、さ
らにこれに３％グルタルアルデヒド含有0.1M
ホウ酸緩衝液（PH8.5）50mlを加えて５℃、40
分間撹拌反応せしめて、スペーサー導入該ナイ
ロンを得、そのナイロンビース50粒を分取し、
これに上記の馬のウサギ１−34h−PTH抗体に
対する抗体（馬抗体）（馬抗体45％含有IgG画
分）25γを加えて20℃、２時間、PBS（PH7.2）
中にて反応せしめて、〔（該ナイロン）−（馬抗
体）〕で略示される結合物を得、さらにこれに、
上記のウサギ１−34h−PTHの抗体を含有する
血清の75000倍希釈液2.5mlを加えて反応せし
め、〔（該ナイロン）−（馬抗体）−（ウサギ１−
34h−PTH抗体）〕で略示される１−34h−
PTH測定用の生体成分測定用化合物〔〕を
得た。本品は、後述の１−34h−PTH− 125Iに
よるインスリン−放射性物質結合物を使用して
その１−34h−PTHの抗体活性を測定した結
果、１ビース当り0.55±0.020ngの抗体活性を
有していた（本品の理論的１−34h−PTH抗体
活性値は0.63ngである）。 また１−34h−PTH測定用の生体成分測定用
化合物〔〕の活性測定に使用する１−34h−
PTH−酵素結合物は、前記実施例に準じて調
製して用いればよい。さらにこれらの各試料
を、前記実施例に準じて同様に行なうことによ
り１−34h−PTHの測定をなし得る。 実施例 ５ α−フエトプロテインの生体成分測定 Ａ：α−フエトプロテイン抗体 ラツトより抽出したα−フエトプロテインを
抗原として、ウサギを用いて、上記と同様にし
て、感作せしめ、次いで採血し、そのウサギの
α−フエトプロテイン抗体を含有する血清を得
た。 Ｂ ウサギのIgGに対する抗体 ウサギのIgG4mgを用いて、山羊に皮下注射
し、以下同様にして感作、採血、精製して、山
羊のウサギのα−フエトプロテイン抗体に対す
る抗体として得た（収率38％、純度74％）。 Ｃ α−フエトプロテイン用の生体成分測定用化
合物〔〕 ダイヤイオンHP−20（商品名：三菱化成工
業社製）３ｇに、濃硝酸47％含有濃硫酸５mlを
加えて、０℃、40分間反応せしめ、次いでこれ
に冷水100mlを加えて反応を停止し、さらに水
洗し、これに６％Na2S2O4含有2M水酸化カリ
ウム溶液10mlを加えて70℃、２時間還元せしめ
てアミノ化スチレン基を有する該HP−20を
得、次いでこのアミノ化スチレン基を有する該
HP−20、１ｇを分取し、２％グルタルアルデ
ヒド水溶液（PH８）を用いて反応せしめた後こ
れに上記の山羊のウサギのα−フエトプロテイ
ン抗体に対する抗体（山羊抗体）170γを加え
て結合せしめて、〔（該HP−20）−（山羊抗体）〕
で略示される結合物を得、さらにこれに上記の
α−フエトプロテイン抗体の40000希釈液５ml
を加えて反応せしめて、〔（該HP−20）−（山羊
抗体）−（α−フエトプロテイン抗体）〕で略示
されるα−フエトプロテイン測定用の生体成分
測定用化合物〔〕を得た。本品の抗体活性は
1.5±0.05ng／20mgであつた（理論的抗体活性
は1.8ng／20mgである）。 また前記実施例に準じてα−フエトプロテイ
ン−酵素標識化合物結合体を調製し、さらにこ
れらの各試料を前記実施例に準じて同様に行な
うことにより、α−フエトプロテインを定量し
得る。 実施例 ６ テストステロンの生体成分測定 アミノプロピルトリエトキシシラン処理したガ
ラースビース（径５mm）（アミノプロピルトリエ
トキシシラン２ｇ、ガラスビーズ50粒、アセトン
溶媒100ml、45℃、24時間反応）50粒に、２％グ
ルタルアルデヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）20mlを加えて室温下１時間反応せしめ、次
いで0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）にて充分洗浄
し、これに、山羊のウサギIgGに対する抗体（山
羊抗体）25γを加えて５℃、１夜反応せしめて、
〔（該ガラスビーズ）−（山羊抗体）〕で略示される
結合物を得、次いで洗浄後、これに、Stevoid16、
415〜428（1970）に記載の方法に準じて得られた
テストステロン−３−山羊血清アルブミン４mgを
用いて得られたテストステロンのウサギ抗体たる
血清の5000倍希釈液５ml（20ng／ml）を加えて、
５℃、一夜反応せしめて、〔（該ガラスビース）−
（山羊抗体）−（テストステロンのウサギ抗体）〕に
て略示されるテストステロン測定用の生体成分測
定用化合物〔〕を得た。本品は、その１ビーズ
当り、1.5±0.12ngのテストステロン抗体活性を
有していた（理論的活性は1.8ng／ビーズであ
る）。 本品は、テストステロン測定用の生体成分測定
用化合物として使用されるものであり、テストス
テロン−酵素標識化合物結合体とともに用いて、
前記と同様に行なうことによりテストステロンを
定量し得るものである。 実施例 ７ プロゲステロンの生体成分測定 セフアデツクスＧ−50（商品名：フアルマシア
社製）５ｇ（湿重量）に、30ｍＭ過ヨウ素酸ナト
リウム10mlを加えて室温下30分間撹拌反応せし
め、さらにこれに2Mエチレングリコールを加え
て30分間撹拌し、次いでこれを取後0.01M炭酸
緩衝液（PH9.5）にて洗浄し、得られた該セフア
デツクス１ｇを分取し、これに、ウサギIgGに対
する山羊抗体（山羊抗体）170γ（抗体として49γ
含有）を加えて５℃、一夜反応せしめて、〔（該セ
フアデツクス）−（山羊抗体）〕で略示される結合
物を得（20mg当り、465〜544ngを含有）、さらに
これに、Ｊ・Biol.Chem.228、７（1957）に記載
の方法に準じて得られた11α−ヒドロキシ−４−
プレグネン−3.20−ジオン−11−ヘミスクシニル
−牛血清アルブミン３mgを用いて得られたプロゲ
ステロンのウサギ抗体たる血清の10000倍希釈液
５mlを加えて、５℃、一夜反応せしめて、〔（該セ
フアデツクス）−（山羊抗体）−（プロゲステロンの
ウサギ抗体）〕で略示されるプロゲステロン測定
用の生体成分測定用化合物〔〕を得た。本品は
50mg当り、0.86±0.03ngのプロゲステロン抗体活
性を有していた（理論的抗体活性としては
1.1ng／mgである）。さらにこれとともに、プロゲ
ステロンの酵素標識化合物結合体を用い、前記と
同様に行なうことによりプロゲステロンを定量し
得るものである。 実施例 ８ インスリンの生体成分測定 実施例１、Ｃ項のスペーサー導入６・６ナイロ
ンビーズの代りに、６・６ナイロン（径５mm）
100粒を五塩化リン１ｇ含有ベンゼン100ml中で２
日間撹拌反応してベンゼンにて洗浄し、この50粒
にアジピン酸１ｇ含有50ml0.1M炭酸緩衝液（PH
11）を加えて室温下１日撹拌反応せしめ、洗浄後
さらにこれに250mgＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、500mgジシクロヘキシルカルボジイミド含有
テトラヒドロフラン50mlを加えて室温下５時間反
応せしめ、次いでこれに500mgのヘキサメチレン
ジアミン含有0.1M炭酸緩衝液（PH11）を加えて
室温下３時間反応せしめ、その後１％重ソウ100
mlにて洗浄後これに２％グルタルアルデヒド含有
0.1Mリン酸緩衝液（PH８）50mlを加えて室温、
１時間反応せしめて洗浄して、該ナイロンビーズ
をアジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、グルタ
ルアルデヒドの順にて処理してスペーサー導入ナ
イロンビーズを用いて、以下実施例１、Ｃ項と同
様に行なつて、インスリン測定用の生体成分測定
用化合物〔〕を得た。本品の１ビース当りのイ
ンスリン抗体活性は2.1±0.08ngであつた。 本品はインスリンの測定において、充分な活性
を有しているものであつた。 実施例 ９ インスリンの生体成分測定 実施例１、Ｃ項のスペーサー導入ナイロンビー
ズの代りに、下記のスペーサー導入担体を用い、
その他は、実施例１、Ｃ項と同様に行なつたもの
であつて、その結果、インスリンの測定用の生体
成分測定用化合物〔〕は良好な抗体活性を有す
るものであつた。 (i) ポリアクリロニトリル系ポリマー 500ml容三つ口フラスコを約35℃の恒温水浴
にひたし、約15分間窒素で置換せしめ、次い
で、フラスコ内に120mlの蒸留水を加え、さら
にアルキルスルホン酸ナトリウム２ｇ、アクリ
ロニトリル80ｇ、過硫酸ナトリウム0.1ｇ、亜
硫酸水系ナトリウム0.033ｇを加え、約３時間
撹拌せしめて乳濁液を得、次いでこれを約500
mlの水に注ぎ、撹拌下塩を加えて凝固せしめて
生成物を析出し、これを別、水洗し、通風乾
燥してポリアクリロニトリル（0.5％、30℃に
おけるジメチルホルムアミドでの対数粘度は約
10.5である）を得た。次いでこのポリアクリロ
ニトリル10ｇをジメチルホルムアミド150mlに
溶解し、これを、20％ジメチルホルムアミド含
有水浴中に、糸状に成形して、多孔質構造を有
するフイラメント状のポリアクリロニトリルを
得た。同様に、ポリアクリロニトリル10ｇを20
％ジメチルホルムアミド含有水浴中に、アトマ
イザーカツプを用いて滴下して、多孔質構造を
有する粒状のポリアクリロニトリルを得た。 次いで、水素化リチウムアルミニウム2.5ｇ
を三つ口フラスコに加え、乾燥エーテル100ml
を添加・撹拌し、これに上記の多孔質構造を有
する粒状のポリアクリロニトリル２ｇを加えて
50℃にて16時間加熱還流し、反応後氷冷下、水
を滴下して未反応の水素化リチウムアルミニウ
ムを分解せしめ、さらに1N HClを滴下して、
その分解物を溶解せしめ、次いでこれを別し
て、アミノ化された該ポリアクリロニトリルを
回収し、次いで1N HCl、水、1N Na OH、
水、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）の順で洗浄し
て遊離アミノ基およびニトリル基を有する多孔
質構造の粒状物を得た。 同様に、上記の多孔質構造を有する粒状のポ
リアクリロニトリルの代りに、多孔質構造を有
するフライメント状のボリアクリロニトリルを
用いて行なつた結果、遊離アミノ基およびニト
リル基を有する多孔質構造のフイラメント状物
を得た。 このようにして得られた遊離アミノ基および
ニトリル基を有する多孔質構造物を、12.5％グ
ルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液（PH8.5）に
加えて０℃、20分間反応せしめ、次いでこれを
取し、ホウ酸緩衝液にて洗浄後、さらにこれ
を７−ADCA（７−アミノデスアセトキシセフ
アロスポラン酸）／0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）に加えて30℃、60分間振盪して反応せし
め、その後その上清中に残存する７−ADCA
の量を液体クロマトグラフイーにより求めて、
該遊離アミノ基およびニトリル基を有する多孔
質構造物１ｇ当り７−ADCA33〜35μMを結合
し得るアミノ基を有している性質の構造物であ
つた。 また、上記のグルタルアルデヒド処理後、
0.2Mヘキサメチレンジアミン（PH9.5）を室温
下２時間処理しさらにグルタルアルデヒドを反
応せしめた後、７−ADCAを同様反応せしめ
て求めた結果７−ADCAの結合量は42〜
46μM／ｇであつた。 本発明において、このアミノ化したポリアク
リロニトリルをその担体として用い、そのスペ
ーサー導入担体としてはこのアミノ化ポリアク
リロニトリルを上記の７−ADCAの結合の際
と同様にしてグルタルアルデヒド処理物、また
はグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジアミ
ン、グルタルアルデヒドにての処理物を使用す
るものである。 (ii) ６・６ナイロンビーズ系ポリマー ６・６−ナイロンビース100ｇをγ−アミノ
プロピルトリエトキシシラン100ml中に分散し
て、100℃、３時間加熱処理した後該ビースを
取し、水洗して乾燥してアミノプロピル化し
た該ビーズを得た。本化合物を、無水コハク酸
20ｇ／150mlジメチルホルムアミド中に加え、
一夜放置反応せしめ、取し、ジメチルホルム
アミドにて洗浄し、これをジシクロヘキシルカ
ルボジイミド20.6ｇおよびＮ−ヒドロキシスク
シンイミド11.5ｇ／ジメチルホルムアミド150
mlにて一夜反応せしめてジメチルホルムアミド
にて洗浄し、さらにこのビーズを0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.2）（0.1％NaN3、0.25％BSA、５
ｍMEDTA、0.15M NaCl含有）で３回洗浄し
て、スペーサー導入該ナイロンビーズを得た。 さらに、このスペーサー導入該ナイロンビー
ズに、ウサギのモルモツトIgGに対する抗体
（ウサギ抗体）を加えて５℃、17時間反応せし
めて充分洗浄して、〔（該ナイロンビーズ）−（ウ
サギ抗体）〕にて略示される結合物を得、さら
にこれにモルモツトのインスリン抗体を含有す
る血積希釈液を加えて、同様に反応せしめて
〔（該ナイロンビーズ）−（ウサギ抗体）−（モルモ
ツトのインスリン抗体）〕で略示されるインス
リン測定用の生体成分測定用化合物を得た。 実施例 10 実施例１で得られたインスリン測定用の生体成
分測定用化合物〔〕（No.１と略す）、実施例２で
得られたグルカゴン測定用の生体成分測定用化合
物〔〕（No.２と略す）、実施例４で得られた１−
34h−PTH測定用の生体成分測定用化合物〔〕
（No.３と略す）、実施例５で得られたα−フエトプ
ロテイン測定用の生体成分測定用化合物〔〕
（No.４と略す）の各々の化合物を、安定化剤を含
むPBSに浸漬したのち、凍結乾燥して各化合物
の凍結乾燥物を得た。またこの凍結乾燥物の活性
は、各々の凍結乾燥前の活性値を100％とした相
対活性を示すもので、さらに活性測定は、前記実
施例に記載した通りの手段である。該当リガンド
−標識化合物結合物を用いて、これを５℃、一夜
インキユベイトせしめた後Ｂ・Ｆ分離して、その
固相上の標識化合物の量を求めたものである。対
照として、その凍結乾燥は無添加条件の場合を挙
げたものである。その結果、第１表に示す通り、
本発明の添加物を用いることにより、極めて安定
化した凍結乾燥物が得られた。特に、アルブミ
ン、カゼインなどの蛋白質0.5〜２％の添加、グ
リセリン１〜３％の添加、ピロリン酸５％の添加
における安定化剤を用いることにより良好な効果
を有しているものであつた。
【表】
【表】
実施例 11
実施例１、(i)測定用キツトにおいて、その生体
成分測定用化合物〔〕を合否する系として、そ
のインスリン測定用の生体成分測定用化合物の代
りに、上記実施例10と同様にして得られたその
N0.1にて示されるアルブミン１％添加のインス
リン測定用の生体成分測定用化合物の凍結乾燥物
を用いて、それを各々１粒有した1.0ml容容器50
セツト、 同様に、リガンド−標識化合物を含有する系を
2.5ml、 さらに、β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体
10mlの凍結乾燥物およびその添付液たる蒸留水10
ml、該媒体反応停止液125ml、反応媒体５mlを用
いて、50セツト用インスリン測定用キツトとな
す。
成分測定用化合物〔〕を合否する系として、そ
のインスリン測定用の生体成分測定用化合物の代
りに、上記実施例10と同様にして得られたその
N0.1にて示されるアルブミン１％添加のインス
リン測定用の生体成分測定用化合物の凍結乾燥物
を用いて、それを各々１粒有した1.0ml容容器50
セツト、 同様に、リガンド−標識化合物を含有する系を
2.5ml、 さらに、β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体
10mlの凍結乾燥物およびその添付液たる蒸留水10
ml、該媒体反応停止液125ml、反応媒体５mlを用
いて、50セツト用インスリン測定用キツトとな
す。
第１図はインスリンの定量曲線を示し、第２図
はグルカゴンの定量曲線を示す。
はグルカゴンの定量曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕は不溶性担体、〔Ｂ〕は抗
体またはレセプター、〔Ａ〕は〔Ｂ〕に対して特
異的に結合する抗体、〔Ｃ〓〓Ａ〕における結合
はスペーサーを介してもよい結合、〔Ａ〓〓Ｂ〕
における結合は免疫結合を示す）で表わされる生
体成分測定用化合物を含有してなる系を、少なく
とも〔Ｂ〕に特異的結合するリガンドを含有する
液体、および該リガンド−酵素標識化合物結合物
を作用せしめ、次いで必要に応じてその固相と液
相とを分離回収し、その存在する酵素標識化合物
を測定することを特徴とする測定法。 ２ 少なくとも、下記、式〔〕 〔Ｃ〓〓Ａ〓〓Ｂ〕 〔〕 （ただし、式中、〔Ｃ〕は不溶性担体、〔Ｂ〕は抗
体またはレセプター、〔Ａ〕は〔Ｂ〕に対して特
異的に結合する抗体、〔Ｃ〓〓Ａ〕における結合
はスペーサーを介してもよい結合、〔Ａ〓〓Ｂ〕
における結合は免疫結合を示す）で表わされる生
体成分測定用化合物、および〔Ｂ〕に特異的に結
合するリガンド−酵素標識化合物結合物からなる
測定用キツト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12380278A JPS55156865A (en) | 1978-10-06 | 1978-10-06 | Organism component measuring compound and its manufacture plus organism component measuring composition, organism component measuring method and organism component measuring kit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12380278A JPS55156865A (en) | 1978-10-06 | 1978-10-06 | Organism component measuring compound and its manufacture plus organism component measuring composition, organism component measuring method and organism component measuring kit |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12881086A Division JPS6242061A (ja) | 1986-06-03 | 1986-06-03 | 生体成分測定用安定化組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55156865A JPS55156865A (en) | 1980-12-06 |
| JPS633261B2 true JPS633261B2 (ja) | 1988-01-22 |
Family
ID=14869670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12380278A Granted JPS55156865A (en) | 1978-10-06 | 1978-10-06 | Organism component measuring compound and its manufacture plus organism component measuring composition, organism component measuring method and organism component measuring kit |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS55156865A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006170877A (ja) * | 2004-12-17 | 2006-06-29 | Shunichi Uchiyama | 酵素免疫測定材料及びそれを用いた酵素免疫測定方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| JPS5919856A (ja) * | 1982-07-27 | 1984-02-01 | Toray Ind Inc | 免疫学的活性物質固定化用担体微粒子 |
| JPS60138466A (ja) * | 1983-12-27 | 1985-07-23 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
| JPS61196166A (ja) * | 1985-02-27 | 1986-08-30 | Eiken Kagaku Kk | 免疫学的測定試薬及びその製法 |
| JPS6336150A (ja) * | 1986-07-30 | 1988-02-16 | Denka Seiken Co Ltd | 特定免疫グロブリン種抗体の定量方法 |
| JPS6271862A (ja) * | 1986-08-30 | 1987-04-02 | アンステイテユ、ナシヨナル、ド、ラ、サント、エ、ド、ラ、ルシエルシユ、メデイカル（アンセルム） | 抗体または免疫学的活性物質を可逆的に固定するように変性されたタンパク質担体、および抗原または類似物の定量および精製に対するその応用 |
| JP3287249B2 (ja) * | 1996-12-27 | 2002-06-04 | 富士レビオ株式会社 | 免疫測定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS53130425A (en) * | 1977-04-18 | 1978-11-14 | Squibb & Sons Inc | Test method and apparatus for separating solid phase |
-
1978
- 1978-10-06 JP JP12380278A patent/JPS55156865A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS53130425A (en) * | 1977-04-18 | 1978-11-14 | Squibb & Sons Inc | Test method and apparatus for separating solid phase |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006170877A (ja) * | 2004-12-17 | 2006-06-29 | Shunichi Uchiyama | 酵素免疫測定材料及びそれを用いた酵素免疫測定方法 |
| JP4549837B2 (ja) * | 2004-12-17 | 2010-09-22 | 俊一 内山 | 酵素免疫測定材料の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS55156865A (en) | 1980-12-06 |
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