JPS6336150A - 特定免疫グロブリン種抗体の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、特定免疫グロブリン種抗体の定量方法に関
する。

［従来の技術］ １つの既知抗原に対するそれぞれの特定免疫グロブリン
種抗体、すなわち、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）　、免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）　、免疫グロブリンＡ（Ｉｇ
Ａ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＤ
（ＩｇＤ）等をそれぞれ定量することは医療」二重要な
意義を持っている。例えばＩｇＭ抗体は感染後急激に血
中に出現するが短時間のうちに消失してしまうのて、多
くの場合、感染後１ケ月以内のＩｇに抗体を測定するこ
とによって臨床症状からのみでは特定か困難な感染源を
特定することもてきるし、感染してからどれぐらいの時
間か経過しているかも知ることかできる。また、ＩｇＧ
抗体はＩｇＭ抗体に比べやや遅れて出現するか、ピーク
時の抗体濃度はＩｇ！ｌＩ抗体より高く、しかも長時間
にわたって血中に存在する場合が多いのて、ＩｇＧ抗体
の測定は、病原体に対する疫学調査やワクチンの予防効
果の把握等に重要である。また、ＩｇＡ抗体は感染後Ｉ
ｇＧ抗体とほぼ同時期に上昇し、以後漸次減少の一途を
たどる。また星もＩｇＧ抗体に比べ少ないが、局所にお
ける分泌型の抗体とされ、血中のＩｇＡ抗体はそのへロ
メーターとして重要である。さらに、ＩｇＥ抗体は、ア
レルギーとの関連て重要な抗体であり、アレルゲンに対
応するＩｇＥ抗体は特に臨床的意義か高いとされている
。

既知抗原に対する特定免疫グロブリン種抗体を測定する
１つの方法として特公昭６１−２９０７に記載された方
法か提案されている。この方法ては、既知抗原に対する
測定しようとする特定免疫グロブリン種抗体に対する抗
体を固定支持体に固定し、これに測定しようとする特定
免疫グロブリン種抗体を含む被検試料を反応させ、さら
に既知抗原を反応させて、特定免疫グロブリン種抗体及
びこれに対する固定化抗体を介して固定支持体に固定さ
れた抗原の量を測定する。この抗原丑の測定は、標識さ
れた抗原を用い、その標識を測定することによって、又
は抗原に対する標識された抗体をさらに反応させ、その
標識を固定することによって行なわれる。

［従来技術の欠点］ 特公昭６１−２９０７の方法ては、測定しようとする特
定免疫グロブリン種抗体に対する抗体を固定支持体に固
定するので、免疫グロブリン種抗体か異なれば当然支持
体に固定される抗体も異なる。

すなわち、異なる免疫グロブリン種抗体を測定しようと
すると異なる抗体か固定された支持体を用いなければな
らない。従って、例えば１つの被検試料中の］ｇＭ抗体
とＩｇＧ抗体との相対量を調べて感染の時期を推定した
りするような場合にも１種類の固定支持体を用いてこれ
を行なうことかてきず不便である。また、反応感度及び
抗体か結合された固定支持体の貯蔵性に問題がある。さ
らに、特公昭６１−２９０７のような方法ては、反応感
度と特異性を高めるために、通常、固定支持体に結合す
る抗体としては、測定しようとする特定免疫クロプリン
種抗体に対する単一クローン抗体を用いるか、支持体に
固定するためには高価な弔−クローン抗体か大清に必要
てあり、このため測定用キラ１−か高価なものになる。

［発明か解決しようとする問題点］ この発１１の目的は、１種類の抗体結合固定支持体を用
いて複数の特定免疫グロブリン種抗体を測定することか
てき、かつ、その反応感度及び抗体結合固定支持体の貯
蔵安定性に優れ、さらに用いられる抗体結合固定支持体
を安価に提供することかてきる、特定免疫クロプリン種
抗体の測定力υ；を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ この発明の方法によると、既知抗原に対する特定免疫グ
ロブリン種抗体を含む被検試料と、この特定免疫グロブ
リン種抗体に対する第１抗体と、この第１抗体に対する
、固定支持体上に固定された第２抗体とを反応させる。

そうすると、被検試料中の定量すべき特定免疫グロブリ
ン種抗体か、第１抗体及び第２抗体を介して固定支持体
に結合される。次に、このように形成された固定化抗原
抗体複合物と前記既知抗原とを反応させると、既知抗原
は特定免疫グロブリン種抗体と結合し、その結果、特定
免疫グロブリン種抗体並びに第１及び第２抗体を介して
固定支持体に結合される。次にこのようにして結合され
た既知抗原の量を測定することによって、被検試料中の
特定免疫グロブリン種抗体の量を測定することがてきる
。

［発明の効果］ この発明の方法によると、１種類の固定化第２抗体を用
いて種々の特定免疫グロブリン種抗体を定ｔｔすること
かてきる。なぜなら、第２抗体は第１抗体を構成する免
疫グロブリンの不変部をその抗原とするため、種々の第
１抗体に対して同一の第２抗体を用いることがてきるか
らである。

従って、被検試料中の複数の特定免疫グロブリン種抗体
を定量したい時などに１種類の第２抗体固定支持体を用
いて行なうことかできるので便利である。また、この発
明の方法では、：ＪＩ、２抗体を結合した固定支持体の
貯蔵安定性か良く、反応感度も高い。さらに、固定支持
体に固定される第２抗体としては、第１抗体に対するポ
リクローナル抗体を用いても全く反応感度に悪影響を与
えないのて、抗体結合支持体をつくるのに大量に必要と
する第２抗体として安価なポリクローナル抗体を用いる
ことかてき、経済的である。

［発明の詳細な説明］ この発明の方法ては、先ず、被検試料中の定量しようと
する特定免疫グロブリン種抗体に対する第１抗体に対す
る第２抗体を固定支持体に結合したものを準備する。固
定支持体としては、抗体をその活性を失わせることなく
結合てきるものてあればどのような支持体をも用いるこ
とかてきる。操作性の観点から、好ましい支持体として
は、例えばポリエチレン製のマイクロプレートのウェル
を挙げることができる。

第２抗体としては、第１抗体の供給者とは異なる種の動
物に第１抗体を免疫して得られたものを用いることかて
きる。単一クローン抗体を用いることもてきるか、ポリ
クローナル抗体を用いても反応感度は低下しないので、
経済性の観点からポリクローナル抗体を用いることが好
ましい。

種ノ？の動物の免疫グロブリンに対するポリクローナル
抗体の懸濁液か重版されており、これらの重版品を有利
に用いることかてきる。第２抗体は第１抗体を構成する
免疫グロブリンの不変部をその抗原としているのて、種
々の特定免疫グロブリン種抗体に対する種々の第１抗体
に対する第２抗体として同じ抗体を用いることがてき、
特定免疫グロフリン種抗体毎に第２抗体を変える必要か
ないのて非常に有利である。

抗体をマイクロプレー１−等の固定支持体に結合する方
法はこの分野において広く知られている０例えば、抗体
の懸濁液を固定支持体と接触させ、２〜１０℃て一夜イ
ンキユベートすることによって行なうことかてきる。固
定の際に用いられる第２抗体懸濁液の濃度は、特に制限
はないか、通常０．１　ルｇ／ｍｌないし１００終ｇ／
ｍｌ、好ましくは１ルｇ／ｍｌないしｌＯ牌ｇ／ｌであ
る。

第１抗体は、被検試料中の定量ずべき特定免疫グロブリ
ン種抗体を特定免疫グロブリン種抗体の供給者とは異な
る種の動物に免疫して得られる抗体である。第１抗体と
してポリクローナル抗体を用いることも可１オてはある
が、反応感度及び特異性の観点から、特定免疫グロブリ
ン種抗体に対する単一クローン抗体を用いることか好ま
しい。

例えば、ヒｈ１ｇＭ抗体を定量しようとする場合には、
抗ヒト１ｇＭマウスＩｇＧ　ｄｉ−クローン抗体を第１
抗体として用いることかてきる。ヒトの各クラスの免疫
グロブリンに対するマウスの巾−クローン抗体か型取さ
れており、このような重版の単一クローン抗体を好まし
く用いることかできる。

被検試料は、定量しようとする特定免疫グロブリン種抗
体を含む疑いかあるいずれのものてあってもよい。例え
ば、Ａ型肝炎ウィルス、インフルエンザウィルス、風疹
ウィルス、麻疹ウィルス及びＢ型肝炎ウィルスのような
病原体のような抗原に対する特定免疫グロブリン種抗体
を含む疑いのあるもの、例えばその病原体に感染してい
る疑いのある患者の血清である。

この発明の方法ては、上述した、固定支持体に結合され
た第２抗体と、第１抗体と、被検試料とを反応させる。

この場合、第２抗体か結合された支持体上で被検試料と
第１抗体とを同時に混合しても良いし、第２抗体と第１
抗体を先ず反応させ、結合しなかった第１抗体を除去し
、次いで被検試料を反応させても良い。反応は例えば１
５°Ｃないし２５℃で３０分ないし１２０分間行なう。

反応の際の第１抗体の濃度は、特に制限はないか通常１
０＃Ｌｇ／ｍｌないし０．００１　ｕ、ｇ／ｍＩ、好ま
しくは１．Ｏｐ、ｇ／ｍＩないし０．０Ｉｇｇ／ｍｌで
ある。また、被検試料がヒトの血清である場合には、緩
衝液で５倍ないし５００倍に希釈してから反応させるこ
とが好ましい。また、反応終了後非結合物を除去するこ
とか好ましい、この反応によって、固定支持体上に結合
された第２抗体に第１抗体か結合され、この第１抗体に
特定免疫グロブリン種抗体が結合された抗原抗体複合物
が固定支持体上に形成される。

次に、定量すべき特定免疫グロブリン種抗体に対する既
知抗原を反応させる。すなわち、例えばＡ型肝炎ウィル
スに対するヒトＩｇＭ抗体を定賃する場合には、Ａ型肝
炎ウィルスを、Ｌ記抗原抗体複合物か形成された固定支
持体と接触させる。

この場合、定量すべき特定免疫グロブリン種抗体に対し
てヒ分量の抗原を用いる必要がある。反応は例えば１５
℃ないし２５℃で３０分ないし１２０分間行なわせるこ
とかできる。この反応により、抗原が特定免疫グロブリ
ン種抗体と結合し、その結果、抗原は、特定免疫グロブ
リン種抗体並びに第１及び第２抗体を介して固定支持体
上に固定される。

次に、このようにして支持体に上に固定された抗原の量
を測定する。この測定は、予め抗原に標識を付しておき
、その標識を定量することによっても行なうことができ
るし、抗原に対する標識された第３の抗体をさらに反応
させ、その標識を定量することによっても行なうことか
できる。

この測定には、放射免疫測定、酵素免疫測定、蛍光免疫
測定等の当業者に広く知られた手法をそのまま用いるこ
とがてきる。

種々の既知濃度の特定免疫グロブリン種抗体を含む被検
試料について上記操作を行なうことによって検量線を作
成することかでき、この検Ｆヨ線に基づき未知濃度の特
定免疫グロブリン種抗体を定量することがてきる。また
、各種免疫グロブリン種抗体の相対的な比率のみを知り
たい場合には、検量線を作成することなく、単に各特定
免疫グロブリン種抗体について得られた抗原礒の生デー
タを比較することによってもそれを行なうことかできる
。

［発明の実施例］ 実施例１ 市１１の抗マウスＩｇＧヤギ抗体（第２抗体）懸濁液（
タンパク濃度１６．９ｍｇ／■１、カベル社製）０．５
国Ｉを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐ１１９．５）て］：１
ＯＯ５］：５００．１：　１０００、］　：　２５００
、］：５０００、及び］、：１Ｏ０００倍に希釈し、そ
の１００．１を９６ウエルのポリエチレン製マイクロプ
レートに入れ、２〜１０°Ｃで一夜インキユベートして
抗体を固定化した。非結合物を除去した後、重版の抗ヒ
トＩｇＧマウスモノクローナル抗体（第１抗体）懸濁液
（タンパク濃度２．１　Ｂ／ｉｆ　、ヤマサ醤油社製）
又は重版の抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体（第
１抗体）懸濁液（タンパク濃度１．８■ｇ／ｍｌ　、ヤ
マサ醤油社製）をリン酸緩衝液て１００００倍に希釈し
たちのて検体を２００倍に希釈した。検体は、Ａ型肝炎
つィルス感染ｌＯ日後のヒト血清及びＡ型肝炎つィルス
感染３ケ月後のヒト血清てあった。希釈した検体を上記
マイクロプレートのウェルに入れ、室温で１時間反応さ
せた。非結合物を洗浄除去した後、重版の不活化精製Ａ
型肝炎ウィルス懸濁液（５０ｎｇ／１１）を１００　用
１加え、さらに室温て１時間反応させた。非結合物を洗
浄除去した後、別に調製したペルオキシダーゼ標識抗Ａ
型肝炎ウィルス抗体（タンパク濃度］０用ｇ／ｍｌ）　
１００　ｈ　ｌを室温て１時間反応させた。非結合物を
洗浄して除去した後、基質液（オルソフェニレンジアミ
ン十８２０□）を１００．１加えて室温て３０分間反応
させ、反応液の吸光度を波長４９２ｎｓで測定した。結
果を第１表に示す。

第１表 ＊Ａ型肝炎ウィルス感染ＩＯ日後のヒト血清ロム型肝炎
ウィルス感染３ケ月後のヒト血清第１表に示されるよう
に、Ｉｇｌｌ抗体を多く含みＩｇＧ抗体か未だ出現して
いないウィルス感染１０日後の血清では、第１抗体とし
て抗ヒトＩｇＭ抗体を用いて測定した場合に抗体が検出
され、しかも吸光度は第２抗体の希釈率に依存して変化
している。これに対し、抗ヒトＩｇＧ抗体を第１抗体と
して用いて測定した場合には、吸光度はほとんど０に近
く、しかも第２抗体の希釈率に依存した変化は見られな
い。一方、ＩｇＭ抗体か消失し、ＩｇＧ抗体か多く含ま
れるウィルス感！Ｊ！３ケ月後の血清ては、第１抗体と
して抗ヒトＩｇＭ抗体を用いた場合に吸光度はほとんど
０てあり、しかも第２抗体の希釈率に依存して変化して
おらず、逆に抗ヒトＩｇＧ抗体を第１抗体として用いて
測定した場合には、第２抗体の希釈率に依存した大きな
吸光度か測定された。これらの測定結果より、この実施
例の方法により、Ａ型肝炎ウィルスに対するヒト血清中
のＩｇＭ抗体とｔｇｃ抗体とをそれぞれ区別して測定す
ることかてきることかわかる。

実施例２ 実施例１て用いたのと同じ抗マウスＩｇＧヤギ抗体を０
．０５１４炭酸緩衝掖ｐｌ＋９．５で１００００倍に希
釈し、実施例１と同様に９６穴ボツスチレン製マイクロ
プレートのウェルに固定した。、Ａ型肝炎ウィルス感染
後の経口日数がわかっているヒト血清を検体として用い
、実施例１と全く同様に吸光度を測定した。結果を第２
表に示す。

第　　２　　表 第２表に示すように、第１抗体として抗ヒトＩｇＭと抗
ヒトＩｇＧを用いた場合のそれぞれについて、ウィルス
感染後の経過時間に依存した異なる吸光度の増減か見ら
れ、この実施例の方法により血清中のＴｇＭとＩｇＧと
が区別して測定されていることかわかる。また、逆に、
血清中の抗Ａ型肝炎ウィルスＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体と
をこの発明の方法により別々に測定することにより、ウ
ィルス感染後の経過時間を推定することがてきることか
わかる。

実施例３ Ａ型肝炎ウィルスに代えて別に調製した不活化精製風疹
ウィルス（５０ｎｇ／■ｌ）を用いたことを除き実施例
１と全く同様にして急性期及び回復期（感染２週間後）
にある風疹患者の血清を被検試料として用いて試験した
。結果を第３表に示す。

第３表 ＊急性期の、＋！！者の血清 木本回復期（感染２週間後）の患者の血清：５３表から
、第１表と同様にこの発明の方法により、風疹ウィルス
に対する風疹患者の血清中の１ｇＭ抗体とＩｇＧ抗体と
がそれぞれ区別して測定されていることかわかる。

実施例４ 実施例１で用いたのと同じ抗マウスＩｇＧヤギ抗体を０
．０５Ｍ炭酸緩衝液ｐｌｔ９．５で１００００倍に希釈
し、実施例１と同様に９６穴ポリスチレン製マイクロプ
レートのウェルに固定した。次にインフルエンザウィル
ス（Ａ　ｙ！１１Ｉ　ｙ　Ｎ　２　）感染後の経日日数
かわかっているヒト血清を検体として用い、これを実施
例１て用いたのと同じ抗ヒトＩｇＭマウスモノクローナ
ル抗体懸濁液、抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体
！ｇ濁液、又は重版の抗ヒト［ｇＡマウスモノクローナ
ル抗体懸濁液（タンパク濃度１．７Ｂ／ｍｌ、ヤマサ醤
油社製）をリン酸緩衝液で１００旧）倍に希釈したちの
て２００倍に希釈した。希釈した検体をに記マイクロプ
レートのウェルに入れ、室温て１時間反応させた。非結
合物を洗浄除去した後、石版の不活化精製インフルエン
ザウイルス（Ａ型　Ｈ：１Ｎ２）懸濁液（４００ｇ／ｌ
）を１［１（１７ｚ＋加え、以下、実施例１と全く同様
に行なって吸光度を測定した。結果を第４表に示す。

第４表 第４表より、抗ヒトＩｇＭ　、抗ヒトＩｇＧ　、抗ヒ）
１ｇＡはそれぞれ異なって増減しており、各免疫グロブ
リンかそれぞれ区別して測定されていることかわかる。

実施例５ Ａ型肝炎ウィルスに代えて別に７Ａ製した不活化精製麻
疹ウィルス（５５ｎｇ／ｍｌ）を用いたこと、及び第２
抗体の希釈率をＩ：５００．１：２５００、Ｉ：５００
０の３通りとしたことを除き、実施例１と全く同様にし
て急性期及び回復期（感染２週間後）にある麻疹７ｍ者
の血清を被検試料として用いて試験した。結果を：５５
表に示す。

第５表 ＊急性期の患者の血清

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）既知抗原に対する特定免疫グロブリン種抗体を含
   む被検試料と、該特定免疫グロブリン種抗体に対する第
   １抗体と、該第１抗体に対する、固定支持体上に固定さ
   れた第２抗体とを反応させ、さらに前記既知抗原を反応
   させて、前記特定免疫グロブリン種抗体並びに前記第１
   及び第２抗体を介して前記固定支持体に結合された前記
   既知抗原の量を測定することから成る、前記特定免疫グ
   ロブリン種抗体の定量方法。
2. （２）固定支持体上に固定された前記第２抗体と前記第
   １抗体とを先ず反応させ、非結合物を除去し、次いで前
   記被検試料中の特定免疫グロブリン種抗体を反応させる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）固定支持体上の前記第２抗体と、前記第１抗体と
   、前記被検試料とを同時に反応させる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
4. （４）前記第２抗体は、複数の特定免疫グロブリン種抗
   体にそれぞれ対する複数の第１抗体に対するものである
   特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記
   載の方法。
5. （５）前記複数の特定免疫グロブリン種抗体は、免疫グ
   ロブリンＭ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、免
   疫グロブリンＤ及び免疫グロブリンＥから成る群より選
   ばれる特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）前記複数の特定免疫グロブリン種抗体は、免疫グ
   ロブリンＭ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、免
   疫グロブリンＤ及び免疫グロブリンＥである特許請求の
   範囲第５項記載の方法。
7. （７）前記既知抗原は標識されており、この標識を定量
   することによって前記固定支持体に結合された前記既知
   抗原の量を測定する特許請求の範囲第１項ないし第６項
   のいずれか１項に記載の方法。
8. （８）前記既知抗原に対する標識された第３抗体を、前
   記固定支持体に結合された前記既知抗原と反応させ、該
   第３抗体の標識を定量することによって前記固定支持体
   に結合された既知抗原の量を測定する特許請求の範囲第
   １項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。
9. （９）前記既知抗原はＡ型肝炎ウィルス、インフルエン
   ザウイルス、風疹ウィルス、麻疹ウィルス又はＢ型肝炎
   ウィルスである特許請求の範囲第１項ないし８項のいず
   れか１項に記載の方法。