ITVR980010A1 - Dosaggio nei liquidi biologici di anticorpi diretti contro uno o piu' antigeni del helicobacter pylori mediante metodo immunologico eteroge - Google Patents
Dosaggio nei liquidi biologici di anticorpi diretti contro uno o piu' antigeni del helicobacter pylori mediante metodo immunologico eterogeInfo
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Description
Descrizione del trovato avente per titolo:
"DOSAGGIO NEI LIQUIDI BIOLOGICI DI ANTICORPI DIRETTI CONTRO UNO O PIU' ANTIGENI DEL HELICOBACTER PYLORI MEDIANTE METODO IMMUNOLOGICO ETEROGENEO DI TIPO REVERSE"
CAMPO DI APPLICAZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la determinazione non quantitativa e/o quantitativa nei liquidi biologici (plasma, siero, sangue), di immunoglobuline dirette contro uno o più antigeni del Helicobacter pylori.
Il procedimento secondo l'invenzione viene utilizzato nell'ambito della sierologia per l'individuazione di anticorpi diretti contro gli antigeni del Helicobacter Pylori.
Tale procedimento può essere impiegato per la diagnosi di infezione, per il monitoraggio del paziente dopo terapia eradicante o per verificare l'avvenuta immunizzazione dopo vaccinazione.
STATO DELLA TECNICA
Secondo la tecnica nota l'individuazione nei liquidi biologici di anticorpi diretti contro gli antigeni del Helicobacter Pylori viene eseguita utilizzando alcuni metodi di tipo immunologico quantitativo o non quantitativo. I metodi attualmente in uso sono fondamentalmente di tre tipi:
a) dosaggio immunoenzimatico eterogeneo indiretto (ELISA);
questo metodo permette la valutazione qualitativa e/o quantitativa della presenza di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori presenti in un liquido biologico; b) test immunocromatografico su striscia o pad (STRIP TEST);
questo test consente la determinazione rapida della presenza o assenza di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori in un liquido biologico;
c) test di agglutinazione al lattice (Latex Agglutination Test, LAT); questo test consente la determinazione rapida della presenza o assenza di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori in un liquido biologico.
I metodi sopraelencati sono tutti di tipo immunologico cioè sfruttano la reazione specifica tra antigene e anticorpo per individuare in un campione di liquido biologico la presenza di immunoglobuline dirette contro gli antigeni del Helicobacter Pylori.
in generale, i metodi immunodiagnostici vengono suddivisi dagli esperti del settore in metodi di tipo "omogeneo" e "eterogeneo". Quando la reazione tra antigene e anticorpo viene eseguita in soluzione e la formazione dell'immunocomplesso determinata direttamente nella soluzione liquida il metodo viene definito di tipo "omogeneo". Quando una delle due controparti immunologiche viene immobilizzata mediante legame ad una matrice solida il metodo immunologico è di tipo "eterogeneo". Si definisce "fase solida" una matrice insolubile nei solventi acquosi alla quale è stato legato in modo covalente o per semplice adsorbimento una delle due controparti immunologiche o altra sostanza in grado di immobilizzare o l‘antigene oppure 1'anticorpo contenuti in una soluzione liquida.
I metodi eterogenei vengono successivamente classificati in metodi "indiretti" o "diretti". Se la reazione tra antigene e anticorpo viene rilevata utilizzando un'ulteriore sostanza che si lega all ' immunocomplesso il metodo è di tipo "indiretto", mentre la misurazione dell'immunocomplesso mediante coniugazione di una delle due controparti immunologiche con sostanze portatrici di un segnale viene definita di tipo "diretto".
Nei metodi eterogenei "diretti" la controparte immunologica utilizzata per determinare la presenza in un liquido biologico dell'antigene o dell'anticorpo viene coniugata con sostanze in grado di fornire un segnale (tracciante). Per esempio nei metodi immunoenzimatici l'anticorpo o l'antigene vengono coniugati con enzimi; la trasformazione del substrato specifico fornirà un segnale di tipo ottico, elettrico, chemiluminescente, fluorescente a senconda del sistema utilizzato (EIA, Enzyme ImmunoAssay).
Il metodo immunologìco che utilizza anticorpi o antigeni coniugati con sostanze fluorescenti (ad esempio fluoresceina) viene definito dagli esperti del settore FluorolmmunoAssay (FIA), mentre, se sono coniugati con isotopi radioattivi, il metodo è di tipo RIA (RadioImmunoAssay) o IRMA (ImmunoRadiometric Assay).
Una variante ai metodi sopra descritti è costituita dalla coniugazione di una delle due controparti immunologiche con apteni o molecole a basso peso molecolare che non danno direttamente un segnale misurabile della formazione dell1immunocomplesso.
Tuttavia tali coniugati possono reagire successivamente o in contemporanea con la formazione dei complessi antigeneanticorpo con un tracciante opportuno ottenendo l'effetto della coniugazione diretta di una delle due controparti immunologiche.
Per esempio l’antigene o l‘anticorpo possono essere coniugati in modo covalente alla biotina la quale può reagire ad esempio con un tracciante specifico composto da streptoavidina coniugata ad un enzima (streptoavidina-enzima; forma che rappresenta un composto legato ad un altro).
Il metodo immunologìco di 'tipo "indiretto1· viene utilizzato nella diagnostica sierologica per la ricerca di anticorpi diretti contro antigeni di agenti patogeni. in questo tipo di dosaggio immunologico vengono utilizzate fasi solide composte da matrici plastiche (generalmente tubi o piastre microtiter a 96 pozzetti in polistirene) alle quali vengono adesi uno o più antigeni di agenti patogeni. Dopo l'aggiunta del liquido biologico (siero o plasma) le immunoglobuline specifiche per l'agente patogeno reagiscono con la fase solida formando immunocomplessi con 1'antigene. Quindi dopo aver rimosso il liquido di reazione vengono aggiunti traccianti che riconoscono in modo specifico 1'anticorpo, ad esempio anti-immunoglobuline coniugate ad un enzima oppure Proteina A-enzima, Proteina G-enzima, recettore Fc-enzima (esempio per metodi immunoenzimatici).
Il dosaggio immunologico eterogeneo "indiretto" è sicuramente il metodo più utilizzato nella diagnostica sierologica generale e del Helicobacter Pylori.
In questo contesto, i documenti WO-A-9601273, J07294530, EP-A-638175, EP-A-582672 riguardano la preparazione degli antigeni del Helicobacter Pylori per la produzione di fasi solide ed il successivo utilizzo nei dosaggi immunologici di tipo "indiretto".
Una variante al metodo "indiretto", utilizzata nei test sierologici, consiste nel preparare una fase solida costituita da una matrice insolubile in soluzioni acquose (plastica) alla quale vengono adesi uno o più anticorpi monoclonali diretti contro gli antigeni del Helicobacter Pylori. Successivamente viene fatta reagire sulla fase solida una soluzione contenente uno o più antigeni del Helicobacter Pylori.
Il risultato finale è quello di ottenere una fase solida costituita solo dagli antigeni riconosciuti dagli anticorpi monoclonali utilizzati. L'esecuzione successiva del test sierologico è identica a quella del metodo "indiretto". Questo tipo di dosaggio viene chiamato dagli esperti del settore "antigen capture".
Sono stati sviluppati test diagnostici rapidi per l'individuazione di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori nei liquidi biologici che utilizzano una metodologia che viene definita "immunocromatografia".
Il metodo è sempre di tipo immunologico, però, la reazione tra antigene e anticorpo avviene su di una striscia di carta cromatografica o di altro materiale idrofilico sulla quale è stato adeso, in modo permanente e su un'area ben delimitata, l'antigene o gli antigeni del Helicobacter Pylori e, in un punto diverso dal precedente un agente in grado di catturare le immunoglobuline.
In una zona vicino al punto di deposizione del campione di liquido biologico si trova assorbita in modo solubile una certa quantità di immunoglobuline legate a microsfere che riconoscono le immunoglobuline del campione.
Quando il campione di liquido viene depositato sulla fase cromatografica, per capillarità si ottiene una migrazione longitudinale. Le immunoglobuline presenti nel campione reagiscono con le anti-immunoglobuline già presenti sulla striscia, quindi, quando gli immunocomplessi formati da antiimmunoglobuline legate alle microsfere e immunoglobuline specifiche del campione arrivano, durante la corsa cromatografica, sull'area contenente l‘antigene reagiscono con esso concentrandosi su una zona ristretta dalla striscia.
Le microsfere continuando la migrazione lungo la striscia cromatografica incontrano successivamente l'area di cattura delle immunoglobuline formando quindi una seconda banda cromatografica che ha lo scopo di confermare la corretta esecuzione del test e la funzionalità dei reagenti. I tempi di esecuzione del test variano generalmente da 5 a 10 minuti.
I documenti WO-A-9518378, WO-A-9517676 e WO-A-9516207 descrivono metodi immunocromatografici del tipo sopradescritto.
II metodo immunologico eterogeneo "indiretto" è molto sensibile, tuttavia presenta l'importante inconveniente di dover diluire il campione di liquido biologico (siero o plasma) prima di eseguire il test (generalmente le diluizioni vanno da 1:50 a 1:200 v/v), in quanto la quantità di immunoglobuline totali è molto elevata.
Inoltre le curve di taratura del test (curve standard) generalmente non seguono un profilo rettilineo cioè non si ha un rapporto dose/risposta costante nel range delle concentrazioni di immunoglobuline da determinare.
DESCRIZIONE DEL TROVATO
La presente invenzione si propone di ovviare agli inconvenienti e svantaggi tipici della tecnica nota, e di fornire quindi un metodo per la determinazione non quantitativa e/o quantitativa nei liquidi biologici (plasma, siero, sangue), di immunoglobuline dirette contro uno o più antigeni del Helicobacter pylori che possa essere direttamente eseguito su liquido biologico allo stato indiluito, e che consenta allo stesso tempo di ottenere un rapporto dose/risposta costante nel range delle concentrazioni di immunoglobuline da determinare.
Ciò è ottenuto grazie alla messa in opera di un metodo avente le caratteristiche descritte alla rivendicazione principale.
La presenza o assenza nei liquidi biologici di immunoglobuline di classe immunoglobulineG e/o immunoglobuline M e/o immunoglobuline A, dirette contro gli antigeni patogeni dell'Helicobacter pylori (Helicobacter Pylori), viene determinata mediante una reazione immunologica utilizzando antigeni del Helicobacter Pylori marcati con sostanze che indicano direttamente e/o indirettamente la formazione di complessi antigene-anticorpo.
Come liquido biologico si intende una soluzione liquida prodotta da un organismo umano o animale incluse urine, saliva, siero e sangue. Nel formato preferito il campione di do biologico è costituito da siero o plasma animale.
L'invenzione comprende le seguenti fasi, materiali e reattivi;
1) applicare il campione di liquido biologico da esaminare su di un'area detta di "cattura" (viene definita area di cattura della fase solida una zona ben delimitata e separata da altre aree di cattura, in grado di legare sostanze specifiche presenti in una soluzione che è in contatto con la fase solida), composta da una matrice solida sulla quale vi è adesa una sostanza in grado di catturare le immunoglobuline;
2) far reagire le immunoglobuline presenti nel liquido biologico con la fase solida;
3) togliere il liquido biologico dall'area di cattura mediante aspirazione o lavaggio della fase solida;
4) applicare sull'area di cattura una soluzione liquida contenente uno o più antigeni del Helicobacter Pylori; 1'antigene o gli antigeni possono essere in forma naturale oppure coniugati con una o piu' sostanze rivelatrici direttamente o indirettamente dell'eventuale formazione di immunocomplessi;
5) far reagire l'antigene o gli antigeni descritti al punto 4) con le immunoglobuline catturate precedentemente dalla fase solida;
6) togliere mediante aspirazione o lavaggio la soluzione di antigene o antigeni, descritti al punto 4), che non hanno reagito con le immunoglobuline catturate dalla fase solida;
7) determinare direttamente o indirettamente (previa aggiunta in questo ultimo caso di una sostanza che si lega all'antigene), mediante opportuno sistema di lettura, la presenza di antigeni legati alle immunoglobuline catturate dalla fase solida.
Il metodo secondo l'invenzione comprende anche la determinazione quantitativa di immunoglobuline dirette contro gli antigeni del Helicobacter Pylori.
La determinzione quantitativa viene eseguita utilizzando nel test due o piu' soluzioni contenenti una quantità nota di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori (soluzioni standard) che reagiscono con gli antigeni utilizzati nel test immunologico .
Le soluzioni standard vengono preparate diluendo scalarmente (ad esempio 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 v/v) una soluzione contenente un'alta concentrazione di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori con soluzioni contenenti immunoglobuline che non reagiscono con gli antigeni del Helicobacter Pylori.
Ad esempio può essere utilizzato un siero o pool di sieri umani iperimmuni come fonte di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori ed un siero o pool di sieri di soggetti non infetti come soluzione diluente.
Il metodo immunologico secondo la presente invenzione può essere definito anche come metodo immunologico a cattura di anticorpi e di tipo competitivo.
Infatti la quantità di sostanza presente sulla fase solida in grado di catturare le immunoglobuline presenti nel liquido biologico è in difetto rispetto alla concentrazione di anticorpi presenti nel campione biologico.
Quindi le immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori competono per un sito di legame sulla fase solida con le immunoglobuline irrilevanti presenti nel liquido biologico. In altre parole, la quantità di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori che si legherà alla fase solida dipenderà dal rapporto tra la quantità di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori e la quantità di immunoglobuline totali presenti in soluzione.
Pertanto, nel metodo secondo l'invenzione, la quantità di antigene legato agli anticorpi catturati dalla fase solida sarà proporzionale alla quantità di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori catturate dalla fase solida.
Utilizzando, quindi, soluzioni contenenti quantità note di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori diluite in soluzioni contenenti quantità costanti di immunoglobuline aspecifiche è possibile determinare la concentrazione di immunoglobuline specifiche presenti in un campione, relativamente agli standard utilizzati.
Secondo una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, le soluzioni standard possono essere incubate precedentemente al test diagnostico sull'area di cattura descritta precedentemente.
Avvenuta la reazione di cattura la fase solida viene lavata, essiccata e mantenuta in un'ambiente adatto che preserva l'integrità del legame tra fase solida e immunoglobuline. Questa nuova fase solida, contenente le soluzioni standard preassorbite, può essere utilizzata in una successiva seduta analitica.
Vengono quindi evitate, secondo questa forma di realizzazione dell'invenzione, la dispensazione ed incubazione delle soluzioni standard, semplificando notevolmente le fasi operative del test immunologico.
Rispetto ai metodi in uso nel settore diagnostico riguardanti la rivelazione nei liquidi biologici di immunoglobuline dirette contro uno più antigeni del Helicobacter Pylori il metodo secondo la presente invenzione apporta le seguenti caratteristiche di carattere innovativo: a) utilizzo nel test diagnostico di liquido biologico indiluito in quanto il test è di tipo competitivo relativamente alla fase solida impiegata;
b) determinazione della presenza nei liquidi biologici di anticorpi diretti contro uno o più antigeni del Helicobacter Pylori mediante valutazione quantitativa degli di antigeni legati alla fase solida;
c) utilizzo di soluzioni standard composte da miscele contenenti concentrazioni variabili di immunoglobuline anti-Heiicobacter Pylori e immunoglobuline che non reagiscono con gli antigeni utilizzati nel test.
Da un primo punto di vista, queste caratteristiche consentono di ottenere una maggiore semplicità nell'esecuzione del saggio immunologico rispetto ai metodi esistenti, in quanto i liquidi biologici non vengono diluiti prima del test, inoltre, si può rilevare una maggiore precisione e accuratezza del dato analitico in quanto il risultato del test non viene influenzato da errori di dispensazione del liquido biologico nell'area di cattura, poiché il risultato del test viene influenzato solo dalla percentuale di immunoglobuline anti Helicobacter Pylori presenti nel campione di liquido biologico.
Infine, è registabile una migliore valutazione delle quantità di immunoglobuline dirette contro 1'antigene o gli antigeni del Helicobacter Pylori presenti nel liquido biologico in quanto il rapporto dose/risposta è lineare su un ampio range di concentrazioni di immunoglobuline specifiche.
DESCRIZIONE DI UNA FORMA DI REALIZZAZIONE
La determinazione della presenza o assenza nei liquidi biologici animali di immunoglobuline dirette contro uno o più antigeni del Helicobacter Pylori viene eseguita secondo il presente trovato utilizzando un test immunologico competitivo eterogeneo del tipo comunemente definito come "reverse" dai tecnici del settore.
La presenza o assenza di immunocomplessi specifici viene valutata o in modo "diretto" (il segnale della reazione è portato direttamente dall'antigene o dagli antigeni del Helicobacter Pylori) oppure in modo "indiretto" (il segnale della reazione immunologica viene ottenuto aggiungendo una o più sostanze traccianti che si legano all'antigene o agli antigeni del Helicobacter Pylori catturati dalle immunoglobuline).
Un test immunologico di tipo "diretto" oppure un test di tipo "indiretto secondo il trovato viene eseguito secondo le seguenti fasi operative:
1) fornire una fase solida, suddivisa in più aree di cattura, composta da una matrice insolubile in soluzioni acquose sulla quale vengono adese una o più sostanze in grado di legare le immunoglobuline presenti in un campione di liquido biologico;
2) fornire una determinata quantità di antigene o antigeni del Helicobacter Pylori per la determinazione "diretta" o "indiretta" della formazione di immunocomplessi specifici catturati dalla fase solida;
3) fornire due o più soluzioni standard di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori per l'esecuzione di un test immunologico di tipo quantitativo;
4) fornire, in alternativa ai reagenti descritti al punto precedente, due o più fasi solide contenenti diverse quantità standard di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori per l'esecuzione di un test immunologico di tipo quantitativo. Tali fasi solide vengono preparate utilizzando la fase solida di cui al punto 1) sulla quale vengono immobilizzate, attraverso l'agente di cattura, le immunoglobuline presenti nelle soluzioni standard di cui al punto 3). Dette fasi solide sono in forma essiccata e pronte all'uso;
5) fornire una o più soluzioni contenenti immunoglobuline dirette contro uno o più antigeni del Helicobacter Pylori da utilizzarsi nel test immunologico come campione/i di controllo di qualità del test;
6) fornire una o più soluzioni per la rivelazione di immunocomplessi se il test immunologico è di tipo "indiretto ";
7) fornire soluzioni di lavaggio;
8) fornire un kit diagnostico per la determinazione di immunoglobuline dirette contro uno o più antigeni del Helicobacter Pylori.
Secondo la presente invenzione vengono inoltre effettuate le seguenti fasi operative:
a) aggiungere ed incubare una determinata quantità di liquido biologico sull'area di cattura della fase solida;
b) lavare detta area di cattura;
c ) aggiungere ed incubare una determinata quantità di antigene o antigeni del Helicobacter Pylori descritti precedentemente;
determinare la quantità di immunoglobuline specifiche catturate dalla fase solida misurando la quantità di antigene o antigeni del Helicobacter Pylori legati alle immunoglobuline specifiche mediante sistema "diretto" o "indiretto". In quest'ultimo caso viene aggiunta ed incubata sulla fase solida un'ulteriore soluzione liquida contenente uno o più agenti che legandosi per affinità molecolare agli antigeni del Helicobacter Pylori legati alle immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori forniscono un segnale della loro presenza sulla fase solida.
ESEMPIO DI KIT DIAGNOSTICO PREFERITO E DELLE FASI
OPERATIVE DEL METODO DI DOSAGGIO
Preparazione della fase solida
Secondo una forma di realizzazione preferita, la matrice insolubile in soluzioni acquose è costituita da una piastra microtiter a 96 pozzetti di polistirene (un secondo formato preferito utilizza tubi in plastica) sulla quale viene adesa per adsorbimento o covalentemente una sostanza in grado di legare le immunoglobuline.
Secondo una forma di realizzazione particolarmente vantaggiosa dell'invenzione, viene utilizzata Proteina A di stafilococco aureo.
Ulteriori forme di realizzazione comprendono l'utilizzo di Proteina G, Proteina B, anti-immunoglobuline specie specifiche, frammenti di anticorpi anti-immunoglobuline, recettori Fc, molecole del complemento. Tali sostanze possono essere di tipo nativo, ottenute per sintesi chimica o ricombinate e frammenti attivi di esse.
Preparazione delle soluzioni standard e delle fasi solide essiccate contenenti ali standard della fase solida contenente i calibratori (curva standard)
Sulla fase solida vengono dispensate ed incubate soluzioni contenenti percentuali scalari di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori e immunoglobuline che non riconoscono gli antigeni del batterio.
Ad esmpio un pool di sieri umani-ad alta concentrazione di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori viene diluito, precedentemente all'esecuzione del test, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 con un pool di sieri umani che non contiene immunoglobuline dirette contro gli antigeni del Helicobacter Pylori.
Si ottenengono quindi quattro soluzioni che conterranno il 50, 25, 12.5, 6.25 % di immunoglobuline specifiche rispetto alla soluzione di partenza.
Con questa tecnica il contenuto totale di immunoglobuline nelle soluzioni finali rimane pressoché invariato.
Tali miscele standard possono essere utilizzate contemporaneamente all'esecuzione del test per la costruzione della curva di taratura del metodo oppure dopo aver lavato ed essiccato la fase solida è possibile utilizzare queste curve di calibrazione preformate in una sessione analitica successiva.
Preparazione dell'antigene o degli antigeni del Helicobacter Pylori
Gli antigeni del Helicobacter Pylori vengono ottenuti dalle cellule di Helicobacter Pylori mediante sonicazione di una sospensione di cellule batteriche e successivi passaggi di estrazione con soluzioni acquose (1'antigene o gli antigeni possono essere ricombinanti cioè ottenuti mediante tecniche di biologia molecolare oppure ottenuti con sintesi chimiche oppure essere frammenti di essi).
Secondo una forma di realizzazione preferenziale dell'invenzione, in cui il metodo utilizzato è di tipo "reverse indiretto", uno o più antigeni vengono coniugati alla biotina secondo metodi classici di coniugazione chimica.
Ulteriori forme di realizzazione dell'invenzione utilizzano altri apteni legati chimicamente agli antigeni del Helicobacter Pylori, come ad esempio la digossigenina, che possono essere riconosciuti da anticorpi specifici anti-aptene coniugati a sostanze portatrici di segnale.
Il metodo "indiretto" può tuttavia essere rappresentato anche dall ' antigene o antigeni del Helicobacter Pylori come tali (cioè non modificati) che vengono riconosciuti, successivamente alla reazione con le immunoglobuline del campione del liquido biologico, da un secondo anticorpo, proveniente da una specie animale diversa da quella che si sta esaminando, coniugato con un tracciante.
Preparazione del tracciante per il metodo immunologico eterogeneo di tipo "reverse indiretto”
il metodo immunologico eterogeneo di tipo "reverse indiretto" utilizza preferibilmente l‘antigene o gli antigeni del Helicobacter Pylori coniugati con biotina, mentre il tracciante è composto da un coniugato streptavidinaperossidasi di rafano ottenuto per reazione chimica.
Secondo ulteriori forme di realizzazione dell'invenzione, si utilizzano traccianti composti da streptavidina-βgalattosidasi, streptavidina-fosfatasi alcalina, streptavidina-ureasi, streptavidina-glucosio ossidasi.
Kit diagnostico
Il metodo secondo la presente invenzione può essere messo in opera a mezzo di un cosiddetto "kit diagnostico" che comprende, rispettivamente, fase solida, antigene o antigeni coniugati, traccianti, soluzioni standard o fasi solide pronte all'uso per la curva standard, soluzioni di lavaggio, campioni di controllo, eventuali substrati e cromogeni per i metodi immunoenzimatici, soluzioni di blocco dell reazioni enzimatiche ed istruzioni per l'esecuzione del test.
Esecuzione del test immunologico secondo una forma di realizzazione vantaggiosa dell'invenzione
100 μl di campione di liquido biologico (preferibilmente siero, plasma, sangue) vengono aggiunti ed incubati nei pozzetti della piastra microtiter.
Dopo lavaggio della fase solida viene aggiunta ed incubata, in tutti i pozzetti compreso i pozzetti contenenti le immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori preassorbite (curva standard), la soluzione (100 μl) contenente l1antigene· o gli antigeni coniugati con biotina.
Dopo un tempo variabile tra 15 e 90 minuti , 100 μΐ di tracciante vengono aggiunti su tutti i pozzetti della fase solida.
Dopo 5-30 minuti la fase solida viene lavata ed in ogni pozzetto vengono aggiunti 100 μl di una soluzione composta da substrato e/o croniogeno specifici per l'enzima utilizzato come tracciante.
Nel caso si utilizzi l'enzima perossidasi di rafano la forma preferita della soluzione contiene tetrametilbenzidina (cromogeno) e perossido di ossigeno (substrato). Dopo un periodo di tempo compreso tra 5-20 minuti, la reazione enzimatica viene bloccata con una soluzione di acido cloridrico o solforico. L'acidificazione delle soluzioni genera un viraggio della colorazione della soluzione che da azzurro-blu diventa giallo.
Mediante lettore spettrofotometrico per micropiastre a 96 pozzetti è possibile leggere le densità ottiche, ottenute per reazione enzimatica, dei pozzetti utilizzati per i campioni di liquido biologico e degli standard. Mediante opportuni calcoli o per interpolazione grafica è quindi possibile calcolare la quantità di immunoglobuline specifiche presenti nei campioni in esame confrontandoli con il segnale ottenuto nei pozzetti della curva standard. Generalmente i valori degli standard vengono rappresentati arbitrariamente come, ad esempio, 100 unità per millilitro per la soluzione standard a più alta concentrazione anticorpale mentre le altre soluzioni saranno frazioni di essa.
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1 . Procedimento immunologico eterogeneo di tipo reverse diretto per la determinazione non quantitativa e/o quantitativa nei liquidi biologici, ad esempio plasma, siero, sangue, di immunoglobuline di classe IgG e/o IgM e/o IgA, dirette contro uno o più antigeni patogeni del Helicobacter pylori, il detto procedimento comprendendo le seguenti fasi: a) fornire una fase solida composta da una matrice insolubile in soluzioni acquose, sulla quale vengono adese una o più sostanze in grado di legare le immunoglobuline presenti nel campione di liquido biologico in esame; b) fornire una soluzione contenente una determinata quantità di antigene o antigeni del Helicobacter Pylori, sia naturali che di origine ricombinante o ottenuti per sintesi chimica, coniugati con sostanze rivelatrici del legame con le immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori; c) fornire due o più soluzioni di immunoglobuline, dette soluzioni standard, contenenti diverse quantità sia di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori sia di immunoglobuline che non si legano agli antigeni descritti al punto 1.A.2, da impiegare nell'allestimento di una curva di calibrazione del procedimento immunologico; d) aggiungere ed incubare le soluzioni standard di cui alla fase c) e il liquido biologico da esaminare sulla fase solida di cui alla fase a), dispensando le varie soluzione in aree di cattura diverse; e) lavare la fase solida; f) aggiungere ed incubare le soluzioni contenenti una determinata quantità di antigene o antigeni marcati del Helicobacter Pylori di cui alla fase b), sulle aree di cattura utilizzate durante la fase d); g) lavare la fase solida; h) aggiungere ed incubare il substrato specifico per le sostanze rivelatrici di cui al punto b), nel caso in cui tali sostanze siano di tipo enzimatico; i) determinare la quantità di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori catturate dalla fase solida misurando la quantità di antigene o antigeni del Helicobacter Pylori coniugate con sostanze rivelatrici del legame antigene-anticorpo che hanno reagito con le immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori presenti nelle diverse aree di cattura della fase solida.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che le dette sostanze di cui alla fase a), in grado di legare le immunoglobuline presenti nel campione di liquido biologico in esame, comprendono Proteina A, Proteina G, Proteina B, anti immunoglobuline specie specifiche, recettori Fc, fattori del complemento, peptidi, sia in forma nativa che ottenuti con tecnologia ricombinate o per sintesi chimica, frammenti di essi.
- 3. Procedimento secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che le dette sostanze rivelatrici del legame con le immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori comprendono isotopi radioattivi, molecole bioluminescenti o chemiluminescenti, molecole fluorescenti, enzimi.
- 4 . Procedimento immunologico eterogeneo di tipo reverse indiretto per la determinazione non quantitativa e/o quantitativa nei liquidi biologici, ad esempio plasma, siero, sangue, di immunoglobuline di classe IgG e/o IgM e/o IgA, dirette contro uno o più antigeni patogeni del Helicobacter pylori, il detto procedimento comprendendo le seguenti fasi: a) fornire una fase solida composta da una matrice insolubile in soluzioni acquose, sulla quale vengono adese una o più sostanze in grado di legare le immunoglobuline presenti nel campione di liquido biologico in esame; b) fornire una soluzione contenente una determinata quantità di antigene o antigeni del Helicobacter Pylori, sia naturali che di origine ricombìnante o ottenuti per sintesi chimica, non modificati o coniugati con sostanze, in particolare apteni o molecole con peso molecolare inferiore a 2 kD; c) fornire una o più soluzioni, dette soluzioni standard, contenenti una determinata quantità di tracciante composto da una sostanza che si lega in modo specifico all'antigene o alla molecola di aptene legato all'antigene, di cui alla fase b), coniugati con sostanze in grado di fornire un segnale misurabile della reazione antigeneanticorpo; d) aggiungere ed incubare le soluzioni standard di cui alla fase c) e il liquido biologico da esaminare sulla fase solida di cui alla fase a), dispensando le varie soluzione in aree di cattura diverse; e) lavare la fase solida; f) aggiungere ed incubare le soluzioni contenenti una determinata quantità di antigene o antigeni marcati o non marcati con sostanze rivelatrici del legame antigene-anticorpo del Helicobacter Pylori di cui alla fase b), sulle aree di cattura utilizzate durante la fase d); g) lavare la fase solida, oppure, h) aggiungere ed incubare una soluzione contenente una determinata quantità di sostanze di cui alla fase C ) ; i) lavare la fase solida; j ) aggiungere ed incubare il substrato specifico per i traccianti di cui alla fase c), nel caso siano traccianti di tipo enzimatico; k) determinare la quantità di immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori catturate dalla fase solida misurando la quantità di antigene o antigeni coniugati del Helicobacter Pylori che hanno reagito con le immunoglobuline anti-Helicobacter Pylori presenti nelle diverse aree di cattura della fase solida.
- 5 ) Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che le sostanze di cui alla fase a) comprendono Proteina A, Proteina G, Proteina B, anti immunoglobuline specie specifiche, recettori Fc, fattori del complemento, peptidi, sia in forma nativa che ottenuti con tecnologia ricombinate o per sintesi chimica, frammenti di essi.
- 6) Procedimento secondo una delle rivendicazioni 4 o 5, caratterizzato dal fatto che le sostanze di cui alla fase b) comprendono biotina, digossigenina, fluoresceina, dinitrofluorobenzene.
- 7 ) Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 4 a 6, caratterizzato dal fatto che i coniugati di cui alla fase c) comprendono composti come streptavidina-enzima, in particolare streptavidina-perossidasi, oppure streptavidina-fosfatasi alcalina, oppure streptavidinaglucosio ossidasi, oppure streptavidina-ureasi, oppure strepoavidina-b-galattosidasi, oppure streptavidina marcata con uno o più isotopi radioattivi, oppure streptavidina-molecola chemiluminescente, oppure streptavidina-molecola fluorescente, e/o anticorpi anti aptene o anticorpi anti antigene o antigeni del Helicobacter Pylori coniugati con enzimi, isotopi radioattivi, molecole bioluminescenti o chemiluminescenti, molecole fluorescenti.
- 8 . Un kit diagnostico per l'esecuzione di un procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che esso comprende, rispettivamente, fase solida, antigene o antigeni coniugati, sostanze rivelatrici o traccianti, soluzioni standard o fasi solide pronte all'uso per la determinazione della curva standard, soluzioni di lavaggio, campioni di controllo, eventuali substrati e cromogeni per i metodi immunoenzimatici, soluzioni di blocco delle reazioni enzimatiche.
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