JPS5919856A - 免疫学的活性物質固定化用担体微粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的検査用試薬として有効な免疫活性微粒
子に関し、特に粒子状担体に免疫活性物質を固定化して
なる免疫活性粒子を用いてヒトまたは動物の体液中の成
分を検出若しくは測定または細胞を識別する免疫学的検
査用試薬として有効な免疫活性微粒子の改良に関する。

抗原と抗体との反応を利用してその一方を免疫学的に検
出または定量する場合に、測定したい物質に結合する側
の物質を粒子状担体に固定化させておき、その粒子が被
測定物質の存在下で凝集を起こす現象を利用して高感度
の測定を行なう方法は免疫学的臨床検査の重要な手段と
なっている。また逆に測定したい物質を粒子状担体に固
定化させておき、その被測定物質と特異的に反応する抗
原または抗体の存在による被測定物質固定化粒子の凝集
が、被検液中の被測定物質の存在により阻止されること
により被測定物質を検出または定量する方法も免疫学的
臨床検査において広く用いられている。また特定の細胞
と選択的に結合する物質を粒子状担体に固定化させてお
き、その粒子が細胞に結合するか否かによって細胞の識
別を行なう方法も免疫学的検査の手段としてしばしば採
用されている。

このような免疫活性粒子を用いた免疫学的検査用試薬に
おける粒子状担体々しては、従来、ヒトを含む咽乳動物
や鳥類の赤血球、カオリンや炭素など無機物の粒子、天
然ゴムラテックスやポリスチレンなどの有機高分子化合
物のラテックスが凝集反応用として広く用いられている
。

これらのうち赤血球は多種類の抗原・抗体を固定化する
ことが可能で応用範囲が最も広い。し７かし採取する動
物個体によって品質等に差があるこ々、安定性に難があ
り保存が難しいこと、−またヒト血清により非特異的に
凝集する場合があることなどの問題点がある。

非生物由来の粒子として最も広く用いられているのはポ
リスチレン粒子であり、これは合成高分子化合物である
ところから品質を一定にすることが可能でまたそれ自体
では安定である。ポリスチレンは疎水性で種々の蛋白質
を吸着する性質があるため、通常ポリスチレンへの抗原
または抗体の固定化は物理吸着によって行なわれる。し
かし物理吸着によって抗原または抗体を固定化した場合
には固定化した抗原（または抗体）と遊離の抗原（才た
は抗体）との間に平衡が存在し、そのため測定の目的物
質である対応する抗体（または抗原）に対し粒子に固定
化した抗原（または抗体）と遊離の抗原（または抗体）
との間に競争反応が起こり、その競争反応は凝集に対し
て抑制的に作用する。その結果、多くの例において感度
と安定性の不足が指摘されている。また当然のことなが
らポリスチレンに対して物理的に吸着されにくい物質は
固定化することができない。これらの問題点のためにポ
リスチレン粒子は赤血球を担体とする場合に比較して限
られた範囲でしか実用に供されていない。

これらの問題点の解決を図る目的で最近、スチレン−メ
タクリル酸コポリマーラテックスにヒト絨毛性ゴナドト
ロピンをカルボジイミドを使用して結合させた試薬（Ｄ
Ｔ２．６４９．２１８　）、カルボキシル化スチレン−
ブタジェンコポリマー、カルボキシル化ポリスチレン、
アミノ基をもつカルボキシル化ポリスチレン、アクリル
酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、メタクリル酸
ポリマー、アクリロニトリル−ブタジェン−スチレンコ
ポリマー、ポリ酢酸ビニルアクリレート、ポリビニルピ
リジン、塩化ビニル−アクリレートコポリマーなど種々
のラテックスポリマーにカルボジイミドを縮合剤として
ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト血清アルブミンまたは
変性ガンマグロブリンをアミド結合を介して縮合させた
粒径０．０１〜０．９ミクロンの粒子からなる試薬（特
公昭５Ｂ−１２９６６）、メタクリル酸、２−ヒドロキ
シエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレートを
共重合して製造したヒドロキシル基とカルボキシル基を
含有するメチルメタクリレート系ラテックスにトレボネ
ーマ抗原を臭化シアノゲンまたはカルボジイミド法で結
合させた試薬（臨床病理２７、補冊、５２２頁（１９７
８））、ポリスチレン粒子を芯として、それをスチレン
−グリシジルメタクリレートコポリマーの外皮で被覆し
たラテックスのエポキシ基とヒト絨毛ゴナドトロピンま
たはインシュリンを反応させて、それらをラテックスに
結合させた試薬（特開昭５５−１１０１１８）など、共
有結合により抗原または抗体や担体に結合させた試薬が
提案されている。

これら先行技術においてはカルボジイミドにより免疫活
性物質を粒子に結合させる方法が多用されているが、カ
ルボジイミドを使用すると免疫活性物質分子間および分
子内の縮合反応を惹起する。これはのぞましくない副反
応であって免疫活性物質の活性を損なうものである。臭
化シアノゲンを用いれば免疫活性物質分子間および分子
内の縮合反応を回避することはできるが、この場合には
ヒドロキシル基を有するポリマーと臭化シアノーゲンと
の反応の再現性を得ることが難かしく、その結果免疫活
性物質を固定化した粒子の免疫活性が変動しやすい。こ
れらの免疫活性物質固定化法に比較して重合体に導入さ
れたエポキシ基と蛋白質またはポリペプチドを反応させ
る方法は免疫活性の失活も少なく再現性も良好である。

しかしエポキシ基を利用する上記先行技術においては重
合体粒子表面にスチレンに由来する部分が存在するため
蛋白質を非特異的に吸着する傾向を有している。

一般にヒトまたは動物の体液中には多種類の蛋白質が含
まれ、とくに血漿または血清中にはこれが高濃度で含有
されている。検体体液から蛋白質が担体粒子に吸着され
ると、それが目的とする抗原−抗体反応などの免疫学的
反応に干渉し、凝集反応の選択性や感度の低下をもたら
すおそれがある。

本発明者らはこのよりな問題点を解消するこ々を目的に
検討を行なった結果、担体として２，３−ジオキシプロ
ピルメタクリレートを主成分とする架橋重合体よりなる
平均直径０．０８μｍ−１０μｍの親水性微粒子がすぐ
れていることを見出した（特開昭５６−８０４０５、特
開昭５６〜１４１５５９）。上記２，３−ジオキシプロ
ピルメタクリレートを主成分とする架橋重合体にはアミ
ン基またはカルボキシル基を容易に導入できるので、こ
れらの官能基を用いて免疫学的活性物質を固定化するこ
とができる。しかしアミン基を導入した微粒子は陽電荷
を、カルボキシル基を導入した微粒子は陰電荷を帯びる
。微粒子が帯電するのを避けたい場合には２，３−ジオ
キシプロピルメタクリレート単位のヒドロキシル基を官
能基として利用し、微粒子を臭化シアノゲンで処理する
ことにより活性化したのち、免疫学的活性物質と反応さ
せる方法で、免疫学的活性物質を微粒子とに固定化する
ことができる。しかし臭化シアノゲンは毒性が強くて取
扱いに危険が伴なう上に、臭化シアノゲン活性化法によ
る免疫学的活性物質固定化は既述のように再現性に難が
ある。

本発明者らはできるだけ中性の微粒子を担体として、免
疫学的活性物質を、簡便にかつ再現性よく固定化する方
法を検討した結果、本発明に達した。すなわち本発明は
、グリシジルアクリレートおよび（または）グリシジル
メタクリレートのくり返し単位を有する重合体がらなり
、かつグリシジルアクリレートまたはグリシジルメタク
リレート単位以外に疎水性成分を表面に持たない平均直
径が０．０８〜１０μ規の微粒子に、メルカプト基を導
入させてなる免疫学的活性物質固定化用担体微粒子を提
供するものである。

グリシジルアクリレートおよび／またはグリシジルメタ
クリレートのくり返し単位を有する重合体がらなり、か
つグリシジルアクリレートまたはグリシジルメタクリレ
ート単位以外に疎水性成分を表面に持たない、平均粒径
０．０８〜ｌＯμｍの微粒子は、たとえば特願昭５７−
５４２４５に記載した方法により製造できる。

重合体Ｅ１粒子製造時のグリシジルアクリレートとグリ
シジルメタクリレートとの混合割合は任意であり、いず
れか一方のみを単独で使用してもよい。

本発明の重合体微粒子は、他の共重合成分を加えること
がしばしば好ましい結果をもたらす。共重合成分添加の
効用は粒径の調節である。共重合成分としてのぞましい
のは親水性単量体であり、とくに水溶性単量体がのぞま
しい。

共重合に用いる水ｍ性単址体さして適当なものは、例え
ば２−メキシエチルアクリレート、２−オキシエチルメ
タクリレート、２−オキシプロピルアクリレート、２−
オキシプロピルメタクリレート、重合度２ないし２５の
ポリエチレンクリコールモノアルキルエーテルのアクリ
ル酸エステルまたはメタクリル酸エステル、アクリルア
ミド、メタクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、グリ
セロールメタクリレートなどである。これらの水溶性単
量体は２種以上併用してもよい。これら水溶性単量体を
共重合した場合には、免疫活性物質を固定化した後に、
重合体微粒子表面で何らの結合物によって覆われること
もなく露出しているのは、水溶性単量体に由来する親水
性部分である。蛋白質は水性媒体中では親水性重合体に
は吸着しにくいので、本発明による免疫活性物質固定化
微粒子は、検体体液に対して安定で非特異的凝集を起こ
しにくく、また細胞に対する非特異的付着がない。グリ
シジルアクリレートとグリシジルメタクリレートのオロ
に対する共重合成分の和の比率はモル比で１００：０な
いし５：９５の範囲で変えることができる。

本発明の重合体微粒子は例えば次の方法によって製造す
ることができる。

重合反応は通常乳化重合、沈澱重合または懸濁重合によ
って好ましく行なわれる。これらいずれの方法も重合と
同時に重合体が粒子状になって析出するので本発明の目
的に適している。

沈澱重合は、単量体は溶解するが重合によって生成する
重合体は溶解しない媒体中で重合を行な５方法であって
、単量体と重合媒体との組合せを選択することによって
生成する重合体粒子の平均直径を０．０８ないし１０μ
ｍの範囲に入るよう調節することが比較的容易であり、
粒径の分布も比較的狭い。また沈澱重合は、乳化重合や
懸濁重合の場合と異なって、乳化剤や懸濁安定剤を使用
しないので、重合反応後これらの添加剤を除去する必要
がないのも利点の一つである。

沈澱重合に用いられる媒体としては、例えば酢酸エチル
、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル各
異性体およびプロピオン酸の上記相当エステルなどのエ
ステル類、メチルエチルケトン、メチルｎ−プロピルケ
トン、メチルイソプロピルケトン、メチルブチルケトン
各異性体などのケトン類、ベンゼン、トルエン、Ｏ−キ
シレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシ１／ン、四塩化炭素な
どである。

架橋剤を重合系に添加することは必須ではないが、通常
重合に当って重合性炭素炭素二重結合を分子内に２基以
上含む多官能性単量体を添加して積極的に重合体を架橋
させろこおがのぞましい。そのような目的で重合系に添
加するに適した多官能性単量体は多数存在するが、若干
例をあげレバ、ジビニルベンゼン、エチレングリコール
ジメタクリレー）、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミド、コノ飄り酸ジビニル、コハク酸ジアリル、メタク
リル酸ビニル、メタクリル酸アリル、トリアリルシアヌ
レート、トリアリルイソシアヌレートなどである。架橋
剤の添加量は通常全単量体中の３０モル％以下である。

また架橋結合は重合反応後生成型合体の反応性を利用し
てこれを多官能化合物と反応させろことによつ℃導入す
ることもできる。例えば生成重合体に含まれるエポキシ
基とエチレンジアミンなどのジアミンとを反応させるこ
とにより重合体を架橋させることができる。

重合開始剤としては通常のラジカル重合開始剤、例えば
２．２′−アゾビスイソブチロニトリル、２．２’−ア
ゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２．２’
−アゾビス（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニ
トリル）、ナどのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、ジラ
ウロイルパーオギサイド、ジーｔｇｒｔブチルパーオキ
サイドなどの過酸化物を用いることができる。重合温度
も通常のラジカル重合の温度範囲でよく、２０℃ないし
８０℃がとくに好ましい。

重合開始剤の重合混合液中の濃度は、通常０．００１な
いし０．０８モル／ｌ程度である。単量体の重合混合液
中の濃度は通常５ないし５０重量％の範囲が好ましい。

単量体濃度が５０重量％を超えると生成する重合体粒子
が凝集する傾向がある。また単量体濃度が５重量％未満
でも本発明は実施可能であるが、得られる重合体微粒子
が少なくなるので生産性が低くなる。なお重合は窒素ま
たはアルゴンなどの不活性ガスで置換して行なうのがの
ぞましい。

乳化重合は直径０．５μｍ以下の微粒子を製造するのに
適している。乳化剤としては、アニオン性、カチオン性
およびノニオン性いずれのタイプの界面活性剤も使用で
きる。

重合開始剤としては、たとえば過硫酸のナトリウム、カ
リウムまたはアンモニウム塩のよりな水溶性無機過酸化
物、２．２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）塩酸
塩、４゜４′−アゾビス−４−シアンペンクン酸のよつ
な水溶性有機アゾ化合物が好ましく用いられる。これら
の重合開始剤から遊離基を発生させるためには、通常温
度を上げて熱反応により分解させるが、紫外線を照射し
て光反応により分解させてもよい。重合温度は、グリシ
ジルアクリレ−１・またはグリシジルメタクリレートの
エポギシ基の加水分層を避けるために７０°Ｃ以下で行
なうのかのぞましく・。

粒子の形状は多くの場合球形であるが球形であることは
必要条件ではなく不規則な形状であっても差し支えない
。

不規則な形状の粒子の直径は最大径と最小径の和の％と
する。平均直径は式（１）によって定義されるｄによっ
て表わされる。ただしｄｉはｉ番目の粒子の直径、Ｎは
粒子の総数である。

ｄ−Σ　　ｄ　ｉ　／、Ｎ　　　　　　　　・・・・（
１）ｉ　＝　１ 凝集反応が判定しやすいのは経験的に平均直径がｏ、１
μｍ以±１０／Ｊ７ＦＬ以下の場合である。また細胞標
識の目的には平均直径は０．０８μｍ以上５μｍＪＪ、
下の範囲が好ましく・。また染料ないし顔料により適洒
ＫＭ色した粒子は凝集反応、細胞標識いずれの目的に対
しても好都合である。また細胞標識に対しては螢光を付
与した粒子も好ましい。

重合体微粒子にメルカプト基を導入するためには、重合
体微粒子を水または不活性な液状有機化合物に分散させ
て、メルカプト基を導入するための試薬と反応させる。

メルカプト基を導入するための試薬きしては、硫化水素
、分子内にメルカプト基を２基以上有するポリチオール
または分子内にアミノ基おメルカプト基の両方を有する
化合物などが好韮しい。硫化水素はガス状で反応系に吹
き込んでもよく、またナトリウム塩すなわち水硫化ナト
リウムなどのアルカリ金属塩として使用してもよい。分
子内にメルカプト基を２基以上有するポリチオールの例
を若干あげれば、ジチオグリコール、ジチオエリスリｌ
−ル、ジチオスレイトール、トルエン−８，４−ジチー
ルなどである。また、分子内にアミン基とメルカプト基
の両方を有する化合物としては、たとえば２−アミノエ
クンチオール、２−アミノチオフェノール、４−アミノ
チオフェノール、システィン、システィンエチルエステ
ル、システィンメチルエステルなどがあげられる。メル
カプト基導入反応の温度は０°Ｃないし１００゛Ｃの範
囲が適当である。また反応は（ｙＬ押しつつ行なうのが
よい。

メルカプト基を導入された重合体微粒子に免疫学的活性
物質を固定化するためには結合剤を使用する。結合剤と
しては分子内にメルカプト基と反応して結合する官能基
を有し、その他にアミン基まだは、カルボキシル基と反
応して結合する官能基を有する化合物が好適である。そ
のよつな化合物として容易に入手できるものに、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドと４−（マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボン酸さのエステル（略称：Ｃ
ＩＩＭ）があるが、勿論これに限定されるものではない
。メルカプト基含有重合体微粒子と結合剤とを反応させ
ると、結合剤のメルカプト基反応性官能基が重合体微粒
子のメルカプト基と反応して結合し、重合体微粒子にア
ミノ基またはカルボキシル基と反応する官能基が導入さ
れる。免疫学的活性物質は蛋白質であるかまたはポリペ
プチド部分を含んでいるので、アミノ基およびカルボキ
シル基を含有しており、上記結合剤によって処理された
重合体微粒子き接触させると、重合体微粒子上に固定化
される。免疫学的活性物質を固定化したのち、過剰の結
合剤官能基が残存する場合には血清アルブミン、ゼラチ
ンなど目的とする免疫学的検査に干渉しない親水性蛋白
質を過剰の官能基と反応させることによって、その反応
性を失わせることができる。その際官能基消去用の親水
性蛋白質は固定化の目的である免疫活性物質と混合して
同時に反応させてもよく、また免疫活性物質を先に単独
で反応させてその後で反応させてもよい。またと記アル
ブミンやゼラチンなどの親水性蛋白質の代りにグリシン
、アラニンなどのアミノ酸を用いることも可能である。

ここで免疫活性物質とは抗原および抗体のみでなく、補
体、Ｆｃレセプター、Ｃ３レセプターなど液性免疫反応
ないし細胞性免疫反応に関与（−である物質に特異的に
結合する物質を意味するものとする。具体例を若干あげ
れば、梅毒トレボネーマ抗原、Ｂ型肝炎表面抗原（ｌｉ
Ｂ８抗原）、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体（抗１１Ｂ
ｇ抗体）、風疹抗原、トキソプラズマ抗原、ストレプト
リジン０１抗ストレプトリジンＯ抗体、マイコプラズマ
抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、抗ＣＥ抗
体、熱凝集ヒトＩｇＧ、リウマチ因子、核蛋白、ＤＮＡ
、抗ＤＮＡ抗体、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、抗ＣＲＰ抗
体、抗エストロゲン抗体、α−フェトプロティン（α−
ＦＰ）、抗α−ＦＰ抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗
ＣＥＡ抗体、Ｃ１、抗（１’ｌｑ抗体、Ｃ８、抗Ｃ３抗
体、抗Ｃ８ｂ抗体、抗Ｃａｌ、ｉ抗体、Ｃ４、抗Ｃ４抗
体、プロティン−Ａ、コングルチニン、イムノコングル
チニンなどである。

次に実施例に基づいて本発明を説明する。

実施例Ｌ グリシジルメタクリレート１４．５０部（重量基準、以
ト同じ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート１．５
０部、トリエチレングリコールジメタクリレー）１．６
５部、フロピオン酸エチル２５．００部および四塩化炭
素２５−００部を混合シ、２，２′−アゾビス（２，４
−ジメチルバレロニトリル）を０．０５０部添加溶解し
たのち、アルゴン雰囲気下４５℃で１６時間重合させた
。０．４１部の凝集塊を除いて１６．００部のよく分散
した重合体微粒子を得た。重合体微粒子を走査電子顕微
鏡で観察すると、直径は２．７μｍでほとんど均一の球
形であった。この重合体微粒子を５０倍（重量）の水に
分散し、６０℃に昇温して硫化水素ガスを吹き込みつつ
、３時間攪拌した。次に重合体微粒子を遠心沈降させて
、Ｎ／２００水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、さらに
水洗してから０．１６％硫酸水溶液に２％の含量で分散
させ、残存エポキシ基を加水分解する目的で５０°Ｇに
２４時間保った。次に重合体微粒子を再び水洗し、水を
ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略記〕で置換し
て、重合体微粒子をＤＭＳＯ中に２％の割合で分散させ
た。この分散液５ｗｔ１を等容の０．５％ＣＨＭ／ＤＭ
ＳＯ溶液と混合し、窒素雰囲気下に３０℃で１時間攪拌
した。反応後型合体微粒子をＤＭＳＯで洗浄して遠沈し
た。沈降した重合体微粒子を１　ｍ９７　ｍ／のヒトガ
ンマグロブリン、／　７）　Ｂ　Ｓ溶液（ＰＢＳ：＋）
ン酸塩緩衝食塩水、リン酸塩濃度０．０１モル／ｌ、食
塩０．１４モル／ｌ、　ｐＨ７，０）　８ｒｕｌに分散
し、窒素雰囲気下４℃に１６時間保った。次いでこの分
散液２ｍ、／を水洗乾燥したのち、６Ｎ塩酸中で１１０
°Ｃに２０時間加熱することにより固定化された蛋白質
を加水分解してアミノ酸分析により生成アミノ酸を測定
した。その結果、ガンマグロブリン固定化量は重合体微
粒子１〜当り１０００μｍであった。前記４℃で１６時
間保ったのち乾燥しなかったヒトガンマグロブリン固定
化重合体微粒子分散液ＩＮを、２モル／ｌグリシン水溶
液（ｐＨ７−５）　１ｍｔと混合し、窒素雰囲気下に２
５℃で１時間攪拌した。そしてＰＢＳで洗浄したのち、
１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記）添加ＰＢ
Ｓに、重合体微粒子含量が１％になるように分散させた
。このヒトガンマグロブリン固定化重合体微粒子分散液
１０μｌと抗ヒトＩｇＧ抗血清（ヤギ）希釈液（希釈は
１％ＢＳＡ添力ｎＰＢｓによる）１０μｌとを、スライ
ドグラス上で混合し、肉眼により凝集の有無を判定した
。その結果、無希釈、１０倍希釈および１００倍希釈の
抗血清では明らかに凝集が認められたが、１０００倍希
釈抗血清では凝集が認められなかった。この凝集が抗原
抗体反応による特異的なものであることは、次のように
して阻止試験により確認した。ヒトＩＱＧの１ｍｇ、４
／、０．１ｍｔｉ／ｒｎｌ、０．０１ｐｒｙ／ｒａｔお
よび□ｍｙ／ｍｌの溶液（溶媒は１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ
）を各々等容の５倍希釈抗ヒトＩｇＧ抗血清と混合し８
７℃で３０分インキュベートした。しかる後、その混合
分散液１０μｌとヒトガンマグロブリン固定化重合体微
粒子分散液１ＯＩＩｌとをスライドグラス上で混合して
凝集を観察した。その結果、ヒトＩｇＧ濃度０．Ｏｌお
よびＯｍ９／ａｔの場合は強い凝集が、ｔｌｌ　ＩＱ／
ＩＩＩの場合は弱い凝集が認められたが、ｈｍｙ／ｒｎ
ｌの場合は凝集が完全に阻止された。

実施例２ 実施例１と同様に重合して得た重合体微粒子２部を１０
０部の水に分散し、ジチオスレイトール１部を添加溶解
して窒素雰囲気下６０℃で８時間攪拌した。遠沈水洗を
くり返したのち、重合体微粒子を０．１６％硫酸水溶液
中に２％の含量で分散させ、５０℃で２４時間別水分解
処理を行なった。このようにしてメルカプト基を導入し
た重合体微粒子の元素分析値はＣ４８，６７％、Ｈ６，
８６％、　８８．７５％であった。このメルカプト基導
入重合体微粒子を実施例１と同様にしてＣＨＮで処理し
、ヒトガンマグロブリンを固定化した。実施例１と同様
にして固定化蛋白質量を定量した結果、重合体微粒子１
ｍｇ当り７．８μりであった。また実施例１と同様にし
てスライドグラス上で抗ヒト１（ＩＧ抗血清（ヤギ〕と
反応させた結果、無希釈、１０倍希釈、２０倍希釈、お
よび４０倍希釈抗血清では凝集が認められたが、１００
倍希釈抗血清では凝集が認められなかった。なお抗ヒト
ＩｇＧ抗血清（ヤギ）の代りに抗ヒトフィブリノーゲン
抗血清（ヤギ）を用いた場合には上記どの希釈倍率でも
凝集は認められなかった。

実施例＆ （コロナト微粒子の調製） クリシジルメタクリレート、スルホプロピルメタクリレ
ート、トリエチレングリコールジメタクリレートなモル
比で８５：１０：５となるように混合した。０．０１％
ドデシル硫酸ナトリウムと０．０１モル／ｌの４，４′
−アゾビス−４−シアンペンタン酸の存在下で全モノマ
ー濃度が１０％となるようにして反応をおこなった。反
応液のｐＨは７．２となるようにＨａＯＨによりあわせ
ておいた。激しく攪拌し乳化状態を保ちながら、１００
Ｗの高圧水銀灯の光を照射して２０℃で約１５分間反応
をおこなった。

反応後、ＣＣｌ４により未反応のモノマーを抽出し、除
去した。生成ポリマーの収率は６２％であった。

３０ｍ９７ｍ１の微粒子分散液と８０ｍ９／ｍ１（Ｄジ
チオエリスＩＪ　）−ル溶液とを等容混合し、５０℃で
一晩反応させた。

微粒子を２５４００Ｇ、８０分の遠心分離、再分散を繰
り返すことで、０．５モル／ｌ水酸化ナトリウム水溶液
で洗浄し、さらに水で洗浄した。得られたメルカプト基
含有重合体微粒子をｌ　０ｍ９／ｍｌとなるように水に
分散させ、Ｎ、雰囲気下に保存した。この微粒子の直径
を走査電子顕微鏡により測定したところ（ｋｌ　７μｍ
であった。

（コロイド微粒子へのＢＳＡの固定化）１０■のメルカ
プト基含有コロイド微粒子を１ｙｎｌのＤＭＳＯに分散
させた。分散後に１０ｍりのＮ−（４−カルボキシシク
ロヘキシルメチル）−マレイミド（ＣＩ−ＩＭと略す）
を加えて３０℃で１時間反応させた。ＤＭＳＯでコロイ
ド微粒子を洗浄した後、１０■のＣ１１Ｍ処理コロイド
微粒子を１ｍ９（ＤＢＳＡを含むＰＢＳＬｍｌに分散さ
せ、ａｏｏｃで１時間反応させ、さらに１ｏ１ｎｊ；／
のヒト血清アルブミン（ＩＩＳＡと略す）を加えて４℃
で一晩反応させた。ｐＨ８，０の０．１モル／ｌトリス
塩酸塩緩衝液（’Ｊ’ｒｉｓと略す）で粒子を洗浄し、
１％のＩＩ　Ｓ　Ａや含むＴｒｉｓ緩衝液に分散させ、
４℃で保存した。

（ＢＳＡの測定） 特願昭５６−１５８１９８に記した方法でＢＳＡの測定
をおこなった。すなわち、実施例１に記した微粒子の重
合においてＣＣｌ　４を溶媒に混合しないで、同様の条
件で重合をおこない、直径４μｍの粒子を調製した。こ
の粒子をアミノ化し、加水分解した。特願昭５５−４８
６１８に記載の方法に準じてグルタルアルデヒドで活性
化し、ＰＢＳに濃度が１％になるように分散させた。こ
の分散液と抗ＢＳＡ抗血清（ウサギ片を等容混合し、８
０℃で３時間反応させた後、ｌ１ＳＡを粒子分散液中で
１％々なるように加え、さらに１時間反応を続けた。１
５００Ｇの遠心沈＃お再分散を繰り返すこおによる洗浄
の後、１％Ｉｆ　Ｓ　Ａを含むＴｒｉｓに分散させ、抗
ＢＳＡ抗血清固定化同相を調製した。

ＢＳＡを１　μｔ　／ｍｌ、１００　ｎ−９／ｍ１．　
１０＊ｇ／ｍｌ、　　１７１＆／ゼ含むＴｒｉｍ　１０
υμＢに各々抗ＢＳＡ抗血清固足化固相分散液１００μ
ｌを加え、２時間８０”Ｃで反応させた後に００２５％
のＢＳＡ結合コロイド微粒子分散液１０ｔｔｌ！を加え
、２時間反応させた。反応後Ｔｒｉｓ６ｍ）を加え１５
００Ｇ５分の遠心で固相粒子とコロイド微粒子を分離し
、上清のコロイド微粒子をボイック積分球式濁度ｔ１（
日本精密光学）により測定した。第１図に、ｌ　００　
ｎ２〜での濁度な１００％とした各ＢＳＡｐ度での散乱
光強度を示した。第１図かられかるように、ＢＳＡはＩ
　ｎ　？／ｍト１００ｎη傭の範囲で測定できた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３のＢ　、５’　Ａ測定結果を示す線図
である。 特許出願人　東し株式会社 □き 代　理　人　弁理士　　斉　藤　武　彦　　リソ５　　
・Ｉ ′−じ））゛

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）グリシジルアクリレートおよび／またはグリシジ
   ルメタクリレートのくり返し単位を有する重合体からな
   り、かつグリシジルアクリレートまたはグリシジルメタ
   クリレート単位以外に疎水性成分を表面に持たない平均
   粒径０．０３〜ｌＯμｍの微粒子に、メルカプト基を導
   入させてなる免疫学的活性物質固定化用担体微粒子。