JPH038514B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトまたはウシ由来のSOD
（Superoxide dismutase）の測定法に関する。 SODは、スーパーオキシド・ラジカル（O₂・）
の不均化反応を触媒する作用を有する酵素で、最
近その測定が臨床的に注目されており、肝臓や肺
臓などの種々の組織におけるSODの微量測定が
望まれている。またSODは、種々の治療薬とし
ても用いられるようになり、その血中濃度の測定
が望まれるようになつた。 しかしながら従来のSODの測定に関しては、
Mc Cordらの方法〔J.Biol.Chem.，244、6049〜
6055（1969）〕が知られているが、この方法は操作
が煩雑で、また測定感度も充分なものではなく、
特に近年ヒト由来のSODやウシ由来のSODを測
定することが必要となつたが、例えばウシ由来の
SODを医薬として投与した場合ウシ由来のSOD
を測定する必要があるが、本来ヒト由来のSOD
も存在し、両者の酵素活性は同一であり、良好に
区別して測定し難いものであつた。 本発明者らは、ヒトおよびウシ由来のSODか
らなる群より選ばれた１種のSODの簡便かつ良
好な測定法について誠意研究した結果、ヒトまた
はウシ由来のSODと特異的結合性を有する抗体
の該SODに対する特異的結合性において、ヒト
由来のSODに対する抗体がウシ由来、ブタ由来、
ウサギ由来、ラツト由来およびウマ由来のSOD
に対してヒト由来のSODに対する免疫学的交叉
性に比較して少なくとも1000分の１以下の極めて
交叉性の少ないものが得られ、かつウシ由来の
SODに対する抗体がヒト由来、ブタ由来、ウサ
ギ由来、ラツト由来およびウマ由来のSODに対
してウシ由来のSODに対する免疫学的交叉性に
比較して少なくとも1000分の１以下の極めて交叉
性の少ないものが得られ、ヒトまたはウシ由来の
SODに対する抗体として、当該由来のSODに対
する交叉性に比較して少なくとも異種動物由来
SODに対する交叉性が1000分の１以下の特性を
有する抗体（モノクロール抗体の場合を除く）を
用い、かつこのSODと特異的結合性を有する抗
体を用いてなる固相体に、被検液を加えて反応せ
しめ、次いでこれに該SODと特異的結合性を有
する抗体一酵素結合体を加えて反応せしめ、その
後その固相体の酵素活性を測定することにより、
ヒトおよびウシ由来のSODからなる群より選ば
れた１種のSODの定量測定法を完成した。本発
明は上記の知見に基づいてなされたもので、ヒト
およびウシ由来のSOD（ただしSODはスーパーオ
キシド・デムスターゼを意味する）からなる群よ
り選ばれた１種のSODと該SODに対する交叉性
に比較して少なくとも異種動物由来SODに対す
る交叉性が1000分の１以下の特性を有する特異的
結合性を有する抗体（モノクローナル抗体の場合
を除く）の固相体に、少なくとも該当するSOD
を含有する被検液を加えて反応せしめた後該
SODと特異的結合性を有する抗体−酵素結合体
を加えて反応せしめ、次いでその固相体の酵素活
性を測定することを特徴とするウシ由来のSOD
からなる群より選ばれた１種のSODの定量的測
定法である。 まず本発明に用いられるSODとしては、スー
パーオキシド・ラジカルの不均化反応を触媒する
作用を有するヒトおよびウシ由来のSODからな
る群より選ばれた１種のSODであればよく、例
えばウシ由来のSOD、特にウシ肝臓由来のSOD
であるオルゴテイン（orgotein）、ヒト由来の
SODが挙られる。SODの単離、精製に当つては、
J.Biol.chem.，234、46（1959）に記載の方法に準
じて、適宜選択した動物から単離精製すればよ
い。次いでヒトおよびウシ由来のSODからなる
群より選ばれた１種のSOD（以下単に、SODとい
うこともある）と特異的結合性を有する抗体を得
るに当つては、通常そのSODを抗原として異種
動物に感作せしめて得られた抗体を使用するもの
で、例えばウシ由来のオルゴテインのフロイン
ト・コンプリート・アジユバントの乳化物をウサ
ギやモルモツトなどの異種動物に一定期間にて数
回注射して免疫感作せしめ、次いで採血し、これ
を遠心分離、塩析、等電点沈澱、透析、クロマト
グラフイー、ゲル過手段などの常法により抗体
を分離、精製すればよく、この抗体としては、ヒ
トおよびウシ由来のSODからなる群より選ばれ
た１種のSODに対する交叉性に比較して少なく
とも異種動物由来SODに対する交叉性が1000分
の１以下の特性を有する特異的結合性を有する抗
体であればよい。さらにこのようにして得られた
SODと特異的結合性を有する抗体は、直接的ま
たは結合剤を用いてなる間接的手段により不溶性
担体と結合せしめて、その固相体を得る。固相体
を得るに用いられる不溶性担体としては、例えば
グルタルアルデヒドなどにて処理してなるアルブ
ミンやゼラチンなどの不溶性蛋白質系担体、アガ
ロース、セルロースやデキストリンなどのエピク
ロルヒドリン処理または臭化シアン処理、さらに
それらのアミノ化試薬処理してなる不溶性半合成
高分子系担体、アクリロニトリル、アクリル酸、
アクリル酸エステル、メタアクリル酸、メチルメ
タアクリル酸、ビニルアルコール、酢酸ビニル、
スチレン、アミノスチレン、ジビニルベンゼン、
アクリルアミド、エチレン、無水マレイン酸、ク
ロトン残などのポリマーまたはコポリマー、さら
にそれらのアミノ化試薬処理してなる不溶性合成
高分子系担体、その他アミノ化試薬処理してなる
シラン化合物などの不溶性無機担体などの官能基
を有する不溶性担体が挙られる。またこの不溶性
担体にアミノ基などを導入する手段としては公知
の種々の手段を用いればよく、例えばニトリル基
の還元によるアミノ化、水酸基のγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの反応によるアミノアル
キル基の導入、またはヒドロキシメチル基の過ヨ
ウ素酸酸化によるアルデヒド基への変換、さらに
そのアルデヒド基にヘキサメチレンジアミンやデ
カメチレンジアミンなどのジアミンを反応せしめ
てなるアミノ基の導入、多糖類水酸基の臭化シア
ン反応によるイミドカルボナート基への変換、ア
ミド基のハロゲン化リン化合物反応によるイミノ
ハロゲニド基への変換、さらにこれらの官能基
を、例えばグルタルアルデヒドやアジポアルデヒ
ドなどのジアルデヒド、ω−アミノ酸の酸クロラ
イドなどの反応性誘導体、Ｓ−アセチルメルカプ
トサクシニツク・アンハイドライドなどの試薬を
用いて反応せしめ、新たに官能基を導入してもよ
い。また固担体を得るに当つて、SODと特異的
結合性を有する受容体と不溶性担体の分子内の官
能基、例えばアミノ基、アルデヒド基、カルボキ
シル基、ヒドロキシル基、チオール基、イミドカ
ルボナート基やイミノハロゲナイド基などに基い
て、両者を結合せしめる。結合に当つては、両者
を直接または結合剤を用いて間接的に結合せしめ
てもよい。両者を直接結合せしめるに当つては、
例えば不溶性担体のカルボキシル基やイミドカル
ボナート基をもつて不活性媒体中にて受容体分子
内アミノ基と、必要に応じて水溶性カルボジイミ
ドの存在下、反応せしめればよく、また結合剤を
用いて反応せしめるに当つては公知の種々の多官
能性化合物、例えばヘキサメチレンジイソシアナ
ート、２，４−トルエンジイソシアナートなどの
ジイソシアナート化合物、ヘキサメチレンジイソ
チオシアナートなどのジイソチオシアナート、ス
クシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポ
アルデヒドなどのジアルデヒド、Ｎ，N′−エチ
レンビスマレイミド、Ｎ，N′−Ｏ−フエニレン
ジマレイミド、ビスジアゾベンジジン、Ｎ，
N′−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、ジ
エチルマロンイミデート、ジメチルアジピンイミ
デート、３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）−
プロピオン酸、３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサ
イド−ジチオ）プロピオン酸、６−Ｎ〔３−（2′−
ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル〕カプ
ロン酸などのスルフイドカルボン酸またはそのス
クシンイミドエステル、Ｐ−ニトロフエニルエス
テル、酸クロライド、イミデートなどの反応性誘
導体（特願昭53−85900号参照）、マレイミド安息
香酸、マレイミドフエニル酢酸、マレイミドフエ
ニルプロピオン酸などのマレイミドカルボン酸ま
たはその反応性誘導体などを用いて固相体を得れ
ばよい。 またSODと特異的結合性を有する抗体−酵素
結合体を得るに当つて、使用される酵素として
は、酸化還元酵素、加水分解酵素、転位酵素、リ
アーゼ、イソメラーゼ、リガーゼが適宜使用され
るもので、例示すればラクテートデヒドロゲナー
ゼ、マレイトデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ、マルトースデヒドロゲナーゼ、ペル
オキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、マレイ
トオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コリ
ンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミ
ノ酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カ
タラーゼ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、リゾチーム、リパーゼ、アルカリホスフアタ
ーゼ、アミノペプチターゼ、トリプシン、パパイ
ン、α−キモトリプシン、アミダーゼ、ヘキソキ
ナーゼ、グリセロキナーゼなどが挙られる。さら
にこれらの酵素は、あらかじめ任意のスペーサー
導入を行なつてもよく、例えばグルタルアルデヒ
ドなどのジアルデヒド、ω−アミノ酸クロライド
などの反応性誘導体、ジアルデヒドやジカルボン
酸クロライドとヘキサメチレンジアミン、デカメ
チレンジアミンなどのジアミン、Ｓ−アセチルメ
ルカプトサクシニツク・アンハイドライド、ジア
ルデヒドと２−アミノエタンチオールなどのスペ
ーサー導入試薬を用いて新たにアルデヒド基、ア
ミノ基、チオール基を導入してもよい。また同様
に、用いる抗体においても、あらかじめ任意のス
ペーサー導入を行なつてもよい。さらにこのよう
な抗体と酵素とを結合せしめるに当つては、抗
体、酵素の有するアミノ基、水酸基、チオール
基、カルボキシル基などや、さに導入されたアル
デヒド基、アミノ基、チオール基やカルボキシル
基などに基いて両者を結合せしめればよく、また
前記の如くの多官能性結合剤を用いて結合せしめ
てもよい。 また固相体やSODと特異的結合性を有する抗
体−酵素結合体を得るに当つては、通常Ω６〜８
の緩衝液中メタノール、エタノール、アセトン、
ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセ
トアミド、ジメチルスルホキサイドなどの有機溶
媒の存在下、または有機溶媒中、０〜40℃にて反
応せしめればよい。反応後、必要に応じて洗浄、
精製すればよく、精製するに当つて好ましくは吸
着クロマトグラフイーやゲル過手段を用いれば
よい。 次いで本発明を実施するに当つては、まず一定
量のSODと特異的結合性を有する抗体の固相体
およびSOD値を定量すべき被検液を反応せしめ
る。反応に当つては、通常４℃にて一度、水性媒
体、例えば0.25％BSA（牛血清アルブミン）、0.1
％NaN₃、0.15MNaCl含有10mMリン酸緩衝液
（Ω7.2）中にて反応せしめる。次いで反応後、好
ましくはその固相体を洗浄し、さらにこれに、
SODと特異的結合性を有する抗体−酵素結合体
の一定量を加えて、水性媒体中にて通常４℃、一
夜反応せしめる。その後その固相体を回収し、洗
浄後、その酵素活性を測定する。さらにこの酵素
活性を測定するに当つては、使用する酵素反応に
従つて対応する基質を用いて消費される成分また
は生成される成分をもつてその定量を行なえばよ
く、例えば酸化酵素の場合にはその基質が酵素反
応により酸化される際に消費される酸素や生成さ
れる過酸化水素を測定し、これによりその酵素活
性を求め、この値より被検液中のSODの定量を
行なえばよく、また還元酵素の場合はその酵素反
応により消費される補酵素を測定すればよく、さ
らに加水分解酵素の場合はその酵素反応により生
成した加水分解物を測定すればよく、またこれら
の測定に当つては酸素電極、過酸化水素電極、比
色計にて直接測定するか、過酸化水素呈色試薬を
用いてその反応による呈色を測定してなる公知の
種々の方法が使用し得るもので、使用する酵素に
基いて適宜選択してその手段を採用すればよい。 以上の如くして本発明を実施することにより、
被検液中のヒトおよびウシ由来のSODからなる
群より選ばれた１種のSODは極めて良好に定量
し得るもので、また使用する各種試薬も完全、か
つ安定であり、好適なSODの測定法であつた。 次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれによつて何んら限定されるもの
ではない。 実施例 (1) SOD ウシ由来のSOD（オルゴテイン）：ダイアグ
ノステイツク・デイタ・インコーポレイテツド
より入手した。 ヒト由来のSOD（ヒトSOD）：J.Biol.chem.，
234、46（1959）に記載の方法にて、ヒト赤血球
より、分離、精製した。 その他の動物のSOD：ヒトSODの分離、精製の
方法に準じた方法にて分離、精製した。 (2) SODと特異的結合性を有する抗体 ５mg／mlのオルゴテインを等量のフロイン
ト・コンプリート・アジユバントと混和混合し
て乳化物を作成し、この0.5mlづつを家兎背部
皮下に注射した。これを２週間毎に３回行なつ
た後３週間おいて、さらに２週間毎に３回免疫
感作せしめた。次いでその抗体価を、補体結合
反応にて測定しつつ、800Uになつたとき、全
採血し、常法によりオルゴテインに対する抗血
清を得た。 ５mg／mlのヒトSODを、上記のオルゴテ
インの代りに用いて、以下同様に家兎に免疫せ
しめ、採血後、ヒトSODに対する抗血清を得
た。 得られた各抗血清と異種動物由来のSODと
の交叉性について調べた結果、第１表に示す通
り、得られた抗血清の異種動物由来のSODと
の交叉性は１／1000以下であつた。 【表】 (3) オルゴテインと特異的結合性を有する抗体の
固相体 ６，６−ナイロンビーズ（直径９mm、厚さ５mm
の円筒状物）75粒（100ｇ）をベンゼンで洗浄し
た後、５塩化リン18ｇを有するベンゼン200ｇを
加えて、室温で２日間撹拌反応せしめ、その後ベ
ンゼンで充分に洗浄した。さらにこれを少量のテ
トラヒドロフランで洗浄後、アジピン酸29ｇを含
有するテトラヒドロフラン200mlに加えて室温で
１夜反応せしめた。次いでこのビーズをジメチル
ホルムアミドで充分洗浄した後、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド2.3ｇおよびN.N′−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド４ｇ含有ジメチルホルムアミ
ド溶液100mlに加え、室温で、６時間反応し、次
いでジメチルホルムアミドにて洗浄した。さらに
このビーズに、200mgのヘキサンメチレンジアミ
ン水溶液100ml（Ω11.0）を加えて一夜、室温に
て反応せしめ、反応後0.5M食塩水で洗浄し、さ
らに生理食塩水で洗浄し、次いでグルタルアルデ
ヒド含有液を加えて反応せしめ、さらに洗浄し
た。また前記オルゴテインに対する抗血清より常
法により硫安分画して得られたオルゴテインに対
する抗体を含むウサギγ−グロブリン分画を、１
ビーズ当り100μｇづつ加えて一夜反応せしめた
（１ビーズ当り、γ−グロブリンの結合量は平均
で65μｇであつた）。 (4) オルゴテインと特異的結合性を有する抗体−
酵素結合体 前記オルゴテインに対する抗血清より常法によ
り硫安分画して得られたオルゴテインに対する抗
体を含むウサギγ−グロブリン分画、およびβ−
ガラクトシダーゼを用いて、J.Biochem.，84，
93〜102（1978）に記載の方法（Ｎ，N′−Ｏ−フ
エニレン−ジマレイミドを多官能性試薬として）
に準じて、オルゴテインに対する抗体−β−ガル
クトシダーゼ結合体の含有を得た。 (5)オルゴテインの測定（検量線） 前記の如くして得られたビーズ１粒（オルゴテ
インに対する抗体の固相体）に、被検液（オルゴ
テイン含有量０〜100mg／ml）100μおよび0.25
％BSA、0.1％NaN₃、0.15MNaCl含有10mMリ
ン酸緩衝液（Ω7.2）100μを加えて４℃で一夜
反応し、反応後上記と同一緩衝液にて洗浄し、こ
れに、前述の如くして得られたオルゴテインに対
する抗体−β−ガラクトシダーゼ結合体含有液
（50倍希釈液）100μを添加して４℃、一夜反応
せしめた。反応後、生理食塩水で洗浄後、これ
を、４mg／mlＯ−ニトロフエニル−β−ガラクト
シド、20mMメルカプトエタノール、10％エタノ
ール含有30mMリン酸緩衝液（Ω7.0）0.2mlを加
えて、37℃、１時間反応後、グリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液（Ω11.5）2.3mlを加えて、その
呈色を波長420nmにて吸光度測定した。 (6) オルゴテインの測定 被検液として、ラツトに各１mgのオルゴテイン
を筋肉内注射して得られた血清を用い、前記オル
ゴテインの測定法（検量線）と同様に行なつて、
オルゴテイン投与後のラツト血清中のオルゴテイ
ン含有量を測定し、算出した。 その結果、第２表に示す通りであつた。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒトおよびウシ由来のSOD（ただしSODはス
   ーパーオキシド・デスムターゼを意味する）から
   なる群より選ばれた１種のSODと該SODに対す
   る交叉性に比較して少なくとも異種動物由来
   SODに対する交叉性が1000分の１以下の特性を
   有する特異的結合性を有する抗体（ただしモノク
   ローナル抗体の場合を除く）の固相体に、少なく
   とも該当するSODを含有する被検液を加えて反
   応せしめた後該SODと特異的結合性を有する抗
   体−酵素結合体を加えて反応せしめ、次いでその
   固相体の酵素活性を測定することを特徴とするヒ
   トおよびウシ由来のSODからなる群より選ばれ
   た１種のSODの定量的測定法。