JPH01165963A

JPH01165963A - Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキサイド・ディスムターゼの測定方法

Info

Publication number: JPH01165963A
Application number: JP32376387A
Authority: JP
Inventors: Shunichi Aitsu; 合津　俊一; Masahide Kondo; 雅英近藤; Kuniyo Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1987-12-23
Filing date: 1987-12-23
Publication date: 1989-06-29
Also published as: AU630339B2; EP0325782A2; EP0325782A3; AU2741988A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、Ｃｕ、　Ｚｎ−スーパーオキサイド・ディス
ムターゼ（以下、Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤと略記する）を
特異的に認識するモノクローナル抗体を利用した、試料
中のＣｕ、　Ｚｎ−９ＯＤの測定方法に関するものであ
る。

［従来の技術］Ｃｕ、　Ｚｎ−８ＯＤは、スーパーオキサイド・ラジカ
ル（以下、０２丁と略記する）の不均化反応の触媒作用
を有する酵素で、最近その測定が臨床的に注目されてお
り、肝臓や肺臓などの種々の組織におけるＣｕ、　Ｚｎ
−３ＯＤの微量測定が望まれている。またＣｕ。

Ｚｎ−８ＯＤは、種々の治療薬としても用いられるよう
になり、その血中濃度の測定が望まれるようになった。

　従来の測定に関しては、マコード（Ｍｅ　Ｃｏｒｄ　
）らの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４４巻６０４
９〜６０５５頁、　１９８９年）が知られている。この
方法は操作が繁雑で、また測定感度も充分なものではな
かった。さらにマコードらの方法は、０２τを消去する
物質の量を測定する方法であり、Ｃｕ、　Ｚｎ−８ＯＤ
にのみ特異的なものではない。

スーパーオキサイド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）は酵素
活性の発現に必要なキレート金属の種類により、Ｃｕ、
　Ｚｎ型、Ｍｎ型およびＰｅ型に分類される。

真核生物の細胞質にはＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤが含まれ、
ミトコンドリアにはＭｎ−３ＯＤが含まれる。さらに０
２ＴはチトクロームＣ，エピネフリン、アスコルビン酸
などの生体物質によっても消去される。従って、試料中
のＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤのみを特異的に定量することは
マコードらの方法によっては不可能である。

一方従来から、体液中の微量成分を測定する方法として
、免疫学的測定、たとえば放射性免疫測定法、および酵
素免疫測定法が用いられている。

Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤの免疫学的測定法については、従
来からいくつかの特許が公開されている。例えば特開昭
５’ｌ−１［）２１９５号公報には、酵素標識したＳＯ
Ｄ含有液とＳＯＤと特異的結合を有する抗体含有液と、
ＳＯＤを定量すべき被検液を混合し、免疫複合体を沈殿
物として水溶液から除き水溶液または沈殿物の標識酵素
の活性を測定することでＳＯＤの測定をしている。また
特開昭５７−１．０２１９［ｉ号公報や特開昭５８−７
５６０号公報では酵素標識した抗ＳＯＤポリクローナル
抗体と不溶性担体に結合させた抗ＳＯＤポリクローナル
抗体を用いるサンドイツチ法によりＳＯＤ測定を行って
いる。

又、特開昭６２−１６７４７９号公報では、標識化した
抗Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤモノクロ一ナル抗体と数種の抗
Ｃｕ、　Ｚｎ−８ＯＤモノクロ一ナル抗体を結合させた
不溶性担体とを用い、２段階の抗原抗体反応を行う２ス
テツプサンドイツチ法によりＳＯＤ測定を行っている。

［発明が解決しようとする問題点］本発明はＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤの免疫学的測定において
、つねに同品質のものを得ることができるモノクローナ
ル抗体を用いて、再現性がよ（、かつ感度のすぐれた測
定方法を提供するものである。

［問題点を解決するための手段および作用コ本発明者ら
は、測定しようとするＣｕ、　Ｚｎ＝ＳＯＤに特異的な
モノクローナル抗体を作製し、これを用いて免疫学的測
定法の検討を行った。その結果、本発明に関わるモノク
ローナル抗体はＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤ測定用試薬として
極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、Ｃｕ、　Ｚｎ−８ＯＤを特異的に
認識するモノクロ−九ル抗体で、固相化されている抗体
と標識されている抗体が同一の抗体であり、かつそれら
を用いて同一容器内で同時に抗原抗体反応を行い、測定
感度が１　ｎ　ｇ　／　ｍｌ−３２０ｎｇ／　ｍ＋であ
ることを特徴とするＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤの測定方法で
ある。

本発明において使用されるモノクローナル抗体は、好ま
しくは、Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤで免疫された動物の抗体
産生肺細胞とミエローマ細胞とを融合させることによっ
て、該Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤを認識するモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを得、ついで該ハイブリ
ドーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、その
培養物がら採取する。Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤを認識する
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、手法
それ自体は公知である細胞融合法（Ｇ、ケーラー（Ｋｏ
ｈｌ、ｅｒ）とＣ，ミルシュタイン（旧１ｓｔｅｉｎ）
、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５８巻、４９５頁、１
９７５年）によって製造することができる。

本発明においては、前述の如き方法によって、Ｃｕ、　
Ｚｎ−８ＯＤを認識するモノクローナル抗体を得た。

Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤは均等な２個のサブユニットより
なる２ｆｆｉ体であるので、同じモノクローナル抗体を
使ったサンドイツチ法による固相酵素免疫測定法（Ｅｎ
ｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　１ｍｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎ
ｔ　Ａｓ５ａｙ　）が可能となった。モノクローナル抗
体を数多く必要とせず、１種でよいこと、また、同一容
器内て固相化抗体及び標識化抗体を用いて同時に抗原抗
体反応を行えることなどから操作が非常に簡便となった
。

本発明は、固相化抗体としてＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤを特
異的に認識するモノクローナル抗体を固定化するが、固
定化の方法は、公知の方法を採用できる。

抗体を固定化するものとしては、例えばガラス。

ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル。

ラテックス、アガロース、セルロース、メタアクリレー
ト等を用いたビーズやマイクロプレートが好ましく使用
される。

また、標識化モノクローナル抗体を調製するためのモノ
クローナル抗体は固定化に用いたものと同一のモノクロ
ーナル抗体を用い、また標識化の方法や手段、それの検
出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公知の方
法や手段により測定することができる。標識剤としては
、酵素を用いる方法（ＥＩＡ　）では、パーオキシダー
ゼ、β−り一ガラクトシダーゼ、又はアルカリ・ホスフ
ァターゼ等の酵素が、放射性物質を用いる方法（ＲＩＡ
　）では、　　　ｉ、　　３Ｈ等が、蛍光物質を用いる
方法（ＰＩＡ　）では、フルオレッセイン・イソチオシ
アネート等が通常使用されるが、その他のものであって
もよい。

標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するため
に基質が用いられる。例えば、西洋ワサビパーオキシダ
ーゼの基質としては、２．２−−アジノジ−［３−エチ
ルベンズチアゾリンスルホン酸］ニアンモニウム塩（以
下ＡＢＴＳとする）　′−Ｈ２０２，５−アミノサリチ
ル酸−Ｈ２Ｏ２，ｏ　　フェニレンジアミン−Ｈ２Ｏ２
等を、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、０−
ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を、
アルカリ・ホスファターゼの基質として、ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート等を挙げることができる。

測定のためには、これらの試薬以外にも溶解剤。

洗浄剤２反応停止剤等の公知の試薬が使用される。

このようにしてＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤに対する１種のモ
ノクローナル抗体を用いてサンドイツチ法における２種
類の抗原抗体反応を同一容器内で同時に進行させること
ができ、試薬の添加や不要物質の洗浄除去操作は１回の
みでよい１段階サンドイツチ法を行うことかできる。

本発明方法では試料中のＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤは特に１
．００〜３２０　ｎｇ／　ｍｌの範囲で測定する方法で
ある。この範囲を越えるものは、現在の検出法では測定
が難しくなるからである。

［発明の効果コ本発明方法はＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤに対して特異的な測
定方法であり、Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ以外の０２７を消
去する物質か存在してもなんら影響を受けない。また、
本発明に使用されるモノクローナル抗体は大量に均質な
ものを得ることができ、反応の均一性が高いものである
。そして、これらは工業的に生産することも可能である
。また、モノクローナル抗体を１種しか必要とせず、固
相化抗体及び標識化抗体を用いて同一容器内で同時に抗
原抗体反応を行えることなどから操作が非常に簡便、迅
速となった。

［実施例］以下、実施例により本発明を詳述する。しかし、本発明
はこれら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１イ）抗ヒトＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤモノクロ一ナル抗体の
調製抗ヒトＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤモノクロ一ナル抗体の
調製はＧ、ケーラーとＣ，ミルシュタインの方法に準じ
て行った。すなわちヒト赤血球由来のＣｕ、　Ｚｎ−８
ＯＤを溶解したＰＢＳ　　（リン酸緩衝生理食塩水）と
フロイントの完全アジュバントを混合した乳濁液を４週
間の間隔で２度ＢＡＬＢ／　ｃマウス腹腔に投与した。

血中抗体価の上昇を９６ウエルプレートを用いる固相酵
素免疫測定法で確認した後、ヒト赤血球由来のＣｕ、　
Ｚｎ−３ＯＤを溶解したＰＢＳを該マウスの尾静脈に注
射した。４日後にマウスの肺細胞を取り出し、ポリエチ
レングリコールを用いて、８−アザグアニン耐性ミエロ
ーマ細胞５Ｐ２１０と細胞融合を行った。

細胞は９６ウエルプレートで培養し、公知のＨＡＴ選択
を行った。ハイブリドーマのスクリーニングは９６ウエ
ルプレートを用いる固相酵素免疫測定法を行い、抗ヒト
ＳＯＤ抗体を産生ずるハイブリドーマについて限界希釈
法によりクローニングを行った。

以上のようにして得られたハイブリドーマをフラスコ培
養後、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス腹系内ウス腹腔内培養し、
モノクローナル抗体を含む腹水を得た。

これを硫安沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィー
によって抗ヒＩ・Ｃｕ、　Ｚｎ−３ＯＤモノクロ一ナル
抗体を得た。これらは、ヒトＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤに特
異的であり、他動物例えばウシ、ブタ、ラットのＣｕ。

Ｚｎ−８ＯＤ及びＭｎ−３ＯＤとは反応性を示さないこ
とを確認した。

口）固相化モノクローナル抗体の調製未処理９６ウエルーマイクロタイタープレート（商品名
タンク・イムノプレート、インターメッド社製）の各ウ
ェルに０，１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に
溶解した１Ｈｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣｕ、　Ｚｎ−３
ＯＤモノクロ一ナル抗体（イ）で調整したモノクローナ
ル抗体、以下、５Ｈ２Ｂとする。　ＩｇＧ１）２５０μ
ｍを加えて、４℃で一夜インキユベートした。次に、各
ウェルの溶液を除き、０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０を含
有するＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔ溶液という）で、
３回洗浄した後、１％のＢＳＡ　　（ウシ血清アルブミ
ン）を含有するＰＢＳ−Ｔ溶液を３００μ！加えて４℃
でブロッキング処理（担体に存在する、抗原または抗体
との非特異的結合部位にＢＳＡを吸着させる処理）をし
、そのまま４°Ｃで保存した。

ハ）標識化モノクローナル抗体の調製０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１＞に溶解
した西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰＯとする
）溶液（５［Ｉ１ｇ／　ｍｌ）　１　ｍｌに１％１−フ
ルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０
．１ｍｌを加え、室温で１時間反応させた。次に０．０
６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．Ｏｍｌを加えて３０分間
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを０．１［
ｉＭエチレングリコール１．Ｏｍｌを加えて除去した後
、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に対
して透析した。

＝　１１　− 次に固相化抗体と同一のモノクローナル抗体（ＳＨ２Ｂ
）’Ｇ　５　ｍｇ加え５時間反応させた。水素化ホウ素
ナトリウム５　ｍｇを加え、４°Ｃで一夜放置した。

上記のようにして得られた反応物をＴＳＫゲルＧ−３０
００ＳＷ　（東ソー株式会社製、商標）を用いた高速液
体クロマトグラフィーにて精製し、ＨＲＰ　Ｏ標識化モ
ノクローナル抗体を得た。

二）酵素免疫測定法によるヒ）　Ｃ０，Ｚｎ−３ＯＤの
定ｍ。

本実施例の口）で抗体を固定化したマイクロタイタープ
レートを室温に戻し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。

その後、精製したヒト赤血球由来Ｃｕ。

Ｚｎ−３ＯＤ　（ヒト赤血球よりＳＤＳ電気泳動的に均
一にまで生成した標品で、ウシ血清アルブミンを標準と
するロウソー法により決定した蛋白質濃度１　＋ｎｇ当
り、３，５００単位（１単位はマコードらの方法による
；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４４巻、　６０４９頁
、　１９６９年）の活性を示したもの）０〜３２０ｎｇ
　／　ｍｌを含有する正常ウサギ血清を、標準物質とし
て各ウェルに２０μ！ずつ加えた。次いで、各ウェルに
ハ）でＩｎしたＨ　ｌ？　Ｐ　Ｏ標識抗体４．５ｍｇ／
ｍｌを１．５％正常ウサギ血清、０１吋％ミオグロビン
、　０．０７５％精製白糖。

０．０５％卵白アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０
００倍に希釈した溶液を各ウェルに３００μβずつ添加
し、室温で３時間インキュベートした後、溶液を除去し
てからＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。さらに、■、２
％ＡＢＴＳ、　０．０１％Ｈ２Ｏ２を含有する０、１Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）　２００μｍを各ウェル
に添加し、室温で３０分間反応させたあと、１Ｍクエン
酸溶液を１００μｍ加えて反応を停止した。反応停止後
、各ウェルについて波長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎ
ｍの吸収強度を自動マイクロタイタープレート・リーダ
ー（東ソー株式会社製ＭＰＲ−Ａ４．商標）で測定し標
準物質の濃度及び吸収強度をプロットして表１の如き結
果を得て、検量線を作成した。この検量線を用いて、各
試料中のヒトＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ濃度を求めることが
できる。

−１３＝ ”　表１ホ）　５Ｈ２Ｂの交差反応性の検討本実雄側二）と同様の方法において、標準物質として用
いたヒトＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤのかわりにウシ、ブタ、
ラットの赤血球由来のＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤ又はミトコ
ンドリア由来Ｍｎ−８ＯＤを３２０ｎｇ／ｍｌ含有する
正常ウサギ血清を用いてマウス抗ヒトＣｕ、　Ｚｎ−３
ＯＤモノクロ一ナル抗体Ｓ　Ｈ２Ｂの交差反応の有無を
検討した。その結果、４１５ｎｍでの吸光度はいずれも
０．０１未浅であった。このことから本実施例で用いた
固相免疫測定用の試薬、即ぢ、固相化抗体と標識化抗体
の組は、ヒトＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤに特異的であること
が示された。

実施例２イ）抗ウシＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤモノクロ一ナル抗体の
調製実施例１イ）において、抗原として用いたヒトＣｕ
、　Ｚｎ−８ＯＤのかわりに、ウシ赤血球由来のＣｕ、
　Ｚｎ−３ＯＤを用いた以外は、全く同様の操作により
、マウスの抗ウシＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤモノクロ一ナル
抗体を調製した。これらは、ウシＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ
に特異的であり、他動物例えはヒト、ブタ、ラットのＣ
ｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ及びＭｎ−３ＯＤとは反応性を示さ
ないことを確認した。

口）固相化モノクローナル抗体の調製水実施例イ）で調製したマウスの抗ウシＣｕ、　Ｚｎ−
３ＯＤモノクローナル抗体（名称ＳＨ３にとする。

ＩｇＧｌ）を用いて実施例１０）と同じ方法にて固相化
モノクローナル抗体を調製した。

ハ）標識化モノクローナル抗体の調製水実施例イ）で調製し、かつ口）の固相化モノクローナ
ル抗体の調製に用いたものと同じモノクローナル抗体（
ＳＯ３Ｍ）を用いて、実施例１ハ）と同様の方法で標識
化モノクローナル抗体を調製した。

二）酵素免疫測定法によるウシＣｕ、ｚｎ−３ＯＤの定
量本実施例の口）とハ）で調製した固相化モノクローナ
ル抗体および標識化モノクローナル抗体を用いて、実施
例に）で記述した方法により、ウシＣｕ、　Ｚｎ−３Ｏ
Ｄ　Ｏ〜３２０ｎｇ　／　ｍｌ含有する正常ウサギ血清
を、標準物質として測定した。ウシＣｕ、　Ｚｎ−３Ｏ
Ｄはウシ赤血球よりＳＤＳ電気泳動的に均一にまで精製
した標品である。本標品は、ウシ血清アルブミンを標準
とするロウソー法により決定した蛋白質濃度１　ｍｇ当
り、Ｌ８００単位（１単位はマコードらの方法による；
　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４４巻、　６０４９頁。

１９６９年）の活性を示した。ウシＣｕ　、　Ｚ　ｎ　
−Ｓ　ＯＤ　ａ度及び吸収強度をプロットして表２の如
き結果を得て、検量線を作成した。この検量線を用いて
各試料中のウシＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤ濃度を求めること
ができる。

表２ホ）　ＳＯ２にの交差反応性の検討 −１７＝本実雄側二）と同様の方法において、標準物質として用
いたウシＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤのかわりにヒト、ブタ、
ラットの赤血球由来のＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ又はミトコ
ンドリア由来Ｍｎ−３ＯＤを３２０ｎｇ／ｍｌ含有する
正常ウサギ血清を用いてモノクローナル抗体Ｓ　Ｈ３Ｋ
の交差反応の有無を検討した。その結果、４１５ｎｍで
の吸光度はいずれも０１吋未満であった。従って本実施
例での測定用キットはウシＣｕ、　Ｚｎ−８ＯＤに特異
的であることが示された。

以上の結果から、本発明は種々の試料中におけるＣｕ、
　Ｚｎ−８ＯＤを測定するのに優れた方法であることか
わかる。

Claims

【特許請求の範囲】

Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキサイド・ディスムターゼを特
異的に認識するモノクローナル抗体で、固相化されてい
る抗体と標識されている抗体が同一の抗体であり、かつ
それらを用いて同一容器内で同時に抗原抗体反応を行い
、測定感度が１ｎｇ／ｍｌ〜３２０ｎｇ／ｍｌであるこ
とを特徴とするＣｕ、Ｚｎ−スーパーオキサイド・ディ
スムターゼの測定方法。