DE4335057A1

DE4335057A1 - Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro

Info

Publication number: DE4335057A1
Application number: DE19934335057
Authority: DE
Inventors: Tomas Prof Dr Porstmann; Lutz Dr Franke
Original assignee: Seramun Diagnostica GmbH
Current assignee: Seramun Diagnostica GmbH
Priority date: 1993-10-11
Filing date: 1993-10-11
Publication date: 1995-04-13

Description

Die Erfindung betrifft ein neues nicht radioaktives Verfahren zum quantitativen Nachweis zytotoxischer Mechanismen. Sie findet Anwendung in der Humanmedizin und hier besonders auf dem Gebiet der Immunologie und der Virologie.

Zur Untersuchung zytotoxischer Mechanismen gibt es drei prinzi pielle Möglichkeiten:

1) Färbung geschädigter Zellen durch Farbstoffe, wie Typanblau oder Eosin (Goere, P.A. and O′Gormann, P.: The Cytotoxic Activity of Isoantibodies in Mice. Transpl. Bull. 3: 142-143, 1956),
2) der Nachweis von aus der geschädigten Zelle austretenden Sub stanzen, die entweder vorher durch exogene Markierung in die Zel le eingebracht wurden oder die als physiologischer Bestandteil der Zelle vorliegen oder
3) der indirekte Nachweis geschädigter Zellen über den Nachweis lebender Zellen mittels der metabolischen Aktivität ihrer Enzyme (Mosmann, T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival. Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods, 1983: 65, 55).

Aufgrund der objektiven Auswertungsmöglichkeit und der Durchführ barkeit für grobe Serien wird heute der erstmals von Brunner und Mitarbeitern beschriebene ⁵¹Cr-Freisetzungs-Test weithin als Standardmethode angesehen (Brunner, K.T., Mauel, J.; Cerottini, J.-C. and Chapius, B.: Quantitative Assay of the Lytic Action of Immune Lymphoid Cells on ⁵¹Cr-Labelled Allogenic Target Cells in vitro; Inhibition by Isoantibody and by Drugs, Immunology 1968: 14, 181).

Zur Vermeidung des Umgangs mit radioaktiven Substanzen und zur Umgehung einer dem Test vorangehenden Zellmarkierung ist darauf hingearbeitet worden, bei der Zellschädigung austretende nieder molekulare endogene Proteine zu messen und zum Nachweis zytotoxi scher Effekte zu verwenden. So ist ein Zytotoxizitätstest entwic kelt worden, der auf dem Aktivitätsnachweis von aus geschädigten Zellen in den Zellkulturüberstand freigesetzter Lactatdehydroge nase (LDH) beruht (Korzeniewski, C. and Callewaert, D.M.: An En zyme Release Assay for Natural Cytotoxicity. J. Immunol. Methods, 1983: 64, 313; Decker, T. and Lohmann-Matthes, M.-L.: A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase rele ase in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosts factor (TNF) activity. J. Immunol. Methods, 1988: 15, 61) und dessen Prinzip im "CytoTox 96^TM Non-Radioaktive Cytotoxicity Assay" (Progema, Madison, USA) Anwendung findet. Jedoch erhöhen sowohl LDH-Aktivität in fötalem Kälberserum, das Zellkulturmedien üblicherweise zugesetzt wird, als auch in letz terem enthaltenes Phenolrot als pH-Indikator den Leerwert und li mitieren damit die Empfindlichkeit des Zytotoxtestes. Aus der Literatur sind ferner Verfahren bekannt, die eine Bestim mung der Kupfer/Zink-abhängigen Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) zum Inhalt haben. Ihr Nachweis ist mit Hilfe polyklonaler anti-Cu/Zn- SOD-Antiseren (Iizuka, S. u. a., JNCL. 72, 5 (1984), 1043-1048), monoklonaler und polyklonaler Antikörper (anti-SOD-Antikörper) und von Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD vorgenommen worden (Porstmann, T. u. a., Clin.Chim.Acta 171 (1988) 1-10; DD 2 83 684 A5; DD 2 85 114 A5; DD 2 88 673 A5).

Es ist das Ziel der Erfindung, für die immunologische und virolo gische Forschung und Diagnostik ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es ermöglicht, Untersuchungen zur Zytotoxizität ohne Verwendung radioaktiver Substanzen in kompletten Zellkulturmedien durchzuführen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Nach weisverfahren zur Untersuchung zytotoxischer Mechanismen in vitro zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die durch Zellschädigung/Zytolyse aus den Zellen aus tretende zytoplasmatische Kupfer/Zink-abhängige Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) im Zellkulturüberstand bestimmt wird. Der darauf beruhende erfin dungsgemäße Zytotoxizitätstest besteht darin, mit Hilfe von mono klonalen Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD die zytoplasmati sche Cu/ZnSOD immunchemisch zu quantifizieren.

Dazu finden epitopdifferente monoklonale Antikörper (mAk) gegen die humane Cu/ZnSOD Verwendung. Sie tragen die Bezeichnung CB- SOD-1 bis -11 und werden von den Hybridomen H-CB-SOD-1 bis -11 (DD 2 85 114) produziert. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich als Enzymimmunoassay dadurch aus, daß bei einer Immunreakti on zwischen Zellkulturüberstand und anti-SOD-Antikörpern von 10 bis 15 Minuten (min) und einer Substratreaktion zwischen Immun komplex und Substratlösung von 10 min bei On-line-Auswertung einer Standardkurve das Ergebnis nach weniger als 30 min vor liegt.

Weitere Merkmale der Erfindung bestehen in einem Testbesteck sowie in seiner Verwendung zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro. Es besteht aus Mikrotiterplatten mit Flachboden, der mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet ist, geeigneten Mitteln zur Bestimmung der Cu/ZnSOD-Konzentration und humaner gereinigter oder rekombinanter Cu/ZnSOD sowie lysierter Zellproben als Stan dard. Als geeignete Mittel zur Cu/ZnSOD-Bestimmung lassen sich markierte Antikörper und Reagenzien zur Substratreaktion verwen den, z. B. Peroxidase(POD)-markierte anti-SOD-Antikörper und o- Phenylendiamin (o-PD) verwenden. Zur Bendigung der Substratreak tion wird Schwefelsäure eingesetzt.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß der Nachweis zytotoxischer Mechanismen durch eine SOD-Quantifizierung nach einer Immunreaktion zwischen Zellkulturüberstand, anti-SOD-Anti körpern und einer Substratreaktion zwischen Immunkomplex und Substratlösung als Enzymimmunoassay möglich ist.

Im Gegensatz zum unterschiedlichen Anteil der LDH-Isoenzyme in verschiedenen Zelltypen, die sich in ihren Substratoptima unter scheiden und damit durch die Aktivitätsmessung nicht exakt die ausgetretende LDH-Menge quantifiziert werden kann, ist die Kon zentration der Cu/ZnSOD in verschiedenen Zelltypen relativ kon stant. Darüber hinaus ist die Cu/ZnSOD im Gegensatz zur Mn-abhän gigen SOD weder durch Zytokine noch durch Sauerstoffradikale in duzierbar (Asayama, K., Janco, R.L. and Burr, I.M.: Selective induction of manganous superoxide dismutase in human monocytes. Am. J. Physiol. 249 (1985), C393-397; Harris, E.D.: Regulation of antioxidant enzymes. FASEB J. 6 (1992), 2675-2683). Die immunologische Bindung der Cu/ZnSOD ermöglicht ihre exakte Quantifizierung anhand einer Standardkurve, erstellt mit bekann ter Cu/ZnSOD-Konzentration.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, empfindliche, ob jektiv quantifizierbare Untersuchungen zur Zytotoxizität in kur zer Zeit ohne Verwendung radioaktiver Substanzen in kompletten Zellkulturmedien durchzuführen.

Ausführungsbeispiel

Zellen der humanen T-Zellinien Molt 4 und H9 werden aus permanen ten Zellkulturen geerntet und nach Waschen in PBS auf eine Zell dichte von 75.000 Zellen/ml in PRMI 1640/10% fötalem Kälberserum eingestellt. Die Zellen werden in geometrischen Verdünnungsreihen in Mikrotiterplatten mit v-förmigem Boden in Volumina von 150 oder 200 µl pipettiert und dann in den Platten durch zweimaliges Frieren und Tauen lysiert und für 5 min bei 400×g zentrifu giert. 50 µl des zelltrümmerfreien Überstandes werden mit 50 µl POD-markierten anti-SOD-Antikörper in mit anti-SOD-Antikörpern benetzten Mikrotiterplatten auf einem Schüttler für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach dreimaligem Waschen erfolgt die Substratreaktion mit o-Phe nylendiamin für 10 min bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Substratreaktion mit 1 M H₂SO₄ wird die Absorption bei 492/690 nm gemessen. Die Auswertung erfolgt anhand einer Standardkurve mit humaner rekombinanter Cu/ZnSOD (Abb. 1). Die untere Nachweisgren ze beträgt etwa 1 ng/ml Cu/ZnSOD. Das entspricht etwa 2,3×10³ H9-Zellen/ml bzw. 1,5×10³ Molt-4-Zellen/ml (Abb. 2).

Claims

1. Verfahren zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro, da durch gekennzeichnet, daß bei einer Zytolyse aus Zielzellen aus tretende Kupfer/Zink-abhängige Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) im Zellkulturüberstand mit Hilfe von Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD immunchemisch als Eiweiß quantifiziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle der Verwendung monoklonaler Antikörper (mAk) hochaffine epi topdifferente mAk gegen die humane Cu/ZnSOD eingesetzt werden, die mit CB-SOD-1 bis -11 bezeichnet sind und die von den Hybrido men H-CB-SOD-1 bis H-CB-SOD-11 produziert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den eingesetzten Zielzellen um Zellen menschlichen Ursprungs handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die SOD-Quantifizierung nach einer Immunreaktion zwischen Zell kulturüberstand und anti-SOD-Antikörpern von 15 Minuten und einer Substratreaktion zwischen Immunkomplex und Substratlösung von 10 Minuten als Enzymimmunoassay vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß humane Zellen in Mikrotiterplatten gebracht, durch Frieren und Tauen lysiert, zentrifugiert, der Überstand mit Peroxidase-mar kierten anti-SOD-Antikörpern in mit anti-SOD-Antikörpern benetz ten Mikrotiterplatten inkubiert, nach Waschen die Substratreakti on mit o-Phenylendiamin vorgenommen und mit Schwefelsäure beendet und die Auswertung anhand einer Standardkurve mit gereinigter hu maner oder rekombinanter Cu/ZnSOD vorgenommen wird.

6. Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro, bestehend aus Mikrotiterplatten, die mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet sind, markierten Antikörpern, Waschlösungen und Rea genzien zur Substratreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß es hu mane gereinigte oder rekombinante Kupfer/Zink-abhängige Supero xiddismutase (Cu/ZnSOD) und lysierte Zellproben als Standard ent hält.

7. Verwendung eines Testbestecks, bestehend aus Mikrotiterplat ten, die mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet sind, markierten Antikörpern, Waschlösungen, Reagenzien zur Substratreaktion, hu maner gereinigter oder rekombinanter Kupfer/Zink-abhängiger Su peroxiddismutase (Cu/ZnSOD) und lysierten Zellproben als Stan dard, zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro.