DE4335057A1 - Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro - Google Patents
Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitroInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues nicht radioaktives Verfahren zum
quantitativen Nachweis zytotoxischer Mechanismen. Sie findet
Anwendung in der Humanmedizin und hier besonders auf dem Gebiet
der Immunologie und der Virologie.
Zur Untersuchung zytotoxischer Mechanismen gibt es drei prinzi
pielle Möglichkeiten:
- 1) Färbung geschädigter Zellen durch Farbstoffe, wie Typanblau oder Eosin (Goere, P.A. and O′Gormann, P.: The Cytotoxic Activity of Isoantibodies in Mice. Transpl. Bull. 3: 142-143, 1956),
- 2) der Nachweis von aus der geschädigten Zelle austretenden Sub stanzen, die entweder vorher durch exogene Markierung in die Zel le eingebracht wurden oder die als physiologischer Bestandteil der Zelle vorliegen oder
- 3) der indirekte Nachweis geschädigter Zellen über den Nachweis lebender Zellen mittels der metabolischen Aktivität ihrer Enzyme (Mosmann, T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival. Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods, 1983: 65, 55).
Aufgrund der objektiven Auswertungsmöglichkeit und der Durchführ
barkeit für grobe Serien wird heute der erstmals von Brunner und
Mitarbeitern beschriebene ⁵¹Cr-Freisetzungs-Test weithin als
Standardmethode angesehen (Brunner, K.T., Mauel, J.; Cerottini,
J.-C. and Chapius, B.: Quantitative Assay of the Lytic Action of
Immune Lymphoid Cells on ⁵¹Cr-Labelled Allogenic Target Cells in
vitro; Inhibition by Isoantibody and by Drugs, Immunology 1968:
14, 181).
Zur Vermeidung des Umgangs mit radioaktiven Substanzen und zur
Umgehung einer dem Test vorangehenden Zellmarkierung ist darauf
hingearbeitet worden, bei der Zellschädigung austretende nieder
molekulare endogene Proteine zu messen und zum Nachweis zytotoxi
scher Effekte zu verwenden. So ist ein Zytotoxizitätstest entwic
kelt worden, der auf dem Aktivitätsnachweis von aus geschädigten
Zellen in den Zellkulturüberstand freigesetzter Lactatdehydroge
nase (LDH) beruht (Korzeniewski, C. and Callewaert, D.M.: An En
zyme Release Assay for Natural Cytotoxicity. J. Immunol. Methods,
1983: 64, 313; Decker, T. and Lohmann-Matthes, M.-L.: A quick and
simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase rele
ase in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosts
factor (TNF) activity. J. Immunol. Methods, 1988: 15, 61) und
dessen Prinzip im "CytoTox 96TM Non-Radioaktive Cytotoxicity
Assay" (Progema, Madison, USA) Anwendung findet.
Jedoch erhöhen sowohl LDH-Aktivität in fötalem Kälberserum, das
Zellkulturmedien üblicherweise zugesetzt wird, als auch in letz
terem enthaltenes Phenolrot als pH-Indikator den Leerwert und li
mitieren damit die Empfindlichkeit des Zytotoxtestes.
Aus der Literatur sind ferner Verfahren bekannt, die eine Bestim
mung der Kupfer/Zink-abhängigen Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) zum
Inhalt haben. Ihr Nachweis ist mit Hilfe polyklonaler anti-Cu/Zn-
SOD-Antiseren (Iizuka, S. u. a., JNCL. 72, 5 (1984), 1043-1048),
monoklonaler und polyklonaler Antikörper (anti-SOD-Antikörper)
und von Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD vorgenommen worden
(Porstmann, T. u. a., Clin.Chim.Acta 171 (1988) 1-10; DD 2 83 684
A5; DD 2 85 114 A5; DD 2 88 673 A5).
Es ist das Ziel der Erfindung, für die immunologische und virolo
gische Forschung und Diagnostik ein Verfahren zur Verfügung zu
stellen, das es ermöglicht, Untersuchungen zur Zytotoxizität ohne
Verwendung radioaktiver Substanzen in kompletten Zellkulturmedien
durchzuführen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Nach
weisverfahren zur Untersuchung zytotoxischer Mechanismen in vitro
zu entwickeln.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die durch
Zellschädigung/Zytolyse aus den Zellen aus tretende zytoplasmatische
Kupfer/Zink-abhängige Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) im
Zellkulturüberstand bestimmt wird. Der darauf beruhende erfin
dungsgemäße Zytotoxizitätstest besteht darin, mit Hilfe von mono
klonalen Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD die zytoplasmati
sche Cu/ZnSOD immunchemisch zu quantifizieren.
Dazu finden epitopdifferente monoklonale Antikörper (mAk) gegen
die humane Cu/ZnSOD Verwendung. Sie tragen die Bezeichnung CB-
SOD-1 bis -11 und werden von den Hybridomen H-CB-SOD-1 bis -11
(DD 2 85 114) produziert. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet
sich als Enzymimmunoassay dadurch aus, daß bei einer Immunreakti
on zwischen Zellkulturüberstand und anti-SOD-Antikörpern von 10
bis 15 Minuten (min) und einer Substratreaktion zwischen Immun
komplex und Substratlösung von 10 min bei On-line-Auswertung
einer Standardkurve das Ergebnis nach weniger als 30 min vor
liegt.
Weitere Merkmale der Erfindung bestehen in einem Testbesteck
sowie in seiner Verwendung zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen
in vitro. Es besteht aus Mikrotiterplatten mit Flachboden,
der mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet ist, geeigneten Mitteln
zur Bestimmung der Cu/ZnSOD-Konzentration und humaner gereinigter
oder rekombinanter Cu/ZnSOD sowie lysierter Zellproben als Stan
dard. Als geeignete Mittel zur Cu/ZnSOD-Bestimmung lassen sich
markierte Antikörper und Reagenzien zur Substratreaktion verwen
den, z. B. Peroxidase(POD)-markierte anti-SOD-Antikörper und o-
Phenylendiamin (o-PD) verwenden. Zur Bendigung der Substratreak
tion wird Schwefelsäure eingesetzt.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß der Nachweis
zytotoxischer Mechanismen durch eine SOD-Quantifizierung nach
einer Immunreaktion zwischen Zellkulturüberstand, anti-SOD-Anti
körpern und einer Substratreaktion zwischen Immunkomplex und
Substratlösung als Enzymimmunoassay möglich ist.
Im Gegensatz zum unterschiedlichen Anteil der LDH-Isoenzyme in
verschiedenen Zelltypen, die sich in ihren Substratoptima unter
scheiden und damit durch die Aktivitätsmessung nicht exakt die
ausgetretende LDH-Menge quantifiziert werden kann, ist die Kon
zentration der Cu/ZnSOD in verschiedenen Zelltypen relativ kon
stant. Darüber hinaus ist die Cu/ZnSOD im Gegensatz zur Mn-abhän
gigen SOD weder durch Zytokine noch durch Sauerstoffradikale in
duzierbar (Asayama, K., Janco, R.L. and Burr, I.M.: Selective
induction of manganous superoxide dismutase in human monocytes.
Am. J. Physiol. 249 (1985), C393-397; Harris, E.D.: Regulation of
antioxidant enzymes. FASEB J. 6 (1992), 2675-2683).
Die immunologische Bindung der Cu/ZnSOD ermöglicht ihre exakte
Quantifizierung anhand einer Standardkurve, erstellt mit bekann
ter Cu/ZnSOD-Konzentration.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, empfindliche, ob
jektiv quantifizierbare Untersuchungen zur Zytotoxizität in kur
zer Zeit ohne Verwendung radioaktiver Substanzen in kompletten
Zellkulturmedien durchzuführen.
Zellen der humanen T-Zellinien Molt 4 und H9 werden aus permanen
ten Zellkulturen geerntet und nach Waschen in PBS auf eine Zell
dichte von 75.000 Zellen/ml in PRMI 1640/10% fötalem Kälberserum
eingestellt. Die Zellen werden in geometrischen Verdünnungsreihen
in Mikrotiterplatten mit v-förmigem Boden in Volumina von 150
oder 200 µl pipettiert und dann in den Platten durch zweimaliges
Frieren und Tauen lysiert und für 5 min bei 400×g zentrifu
giert. 50 µl des zelltrümmerfreien Überstandes werden mit 50 µl
POD-markierten anti-SOD-Antikörper in mit anti-SOD-Antikörpern
benetzten Mikrotiterplatten auf einem Schüttler für 15 min bei
Raumtemperatur inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen erfolgt die Substratreaktion mit o-Phe
nylendiamin für 10 min bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der
Substratreaktion mit 1 M H₂SO₄ wird die Absorption bei 492/690 nm
gemessen. Die Auswertung erfolgt anhand einer Standardkurve mit
humaner rekombinanter Cu/ZnSOD (Abb. 1). Die untere Nachweisgren
ze beträgt etwa 1 ng/ml Cu/ZnSOD. Das entspricht etwa 2,3×10³
H9-Zellen/ml bzw. 1,5×10³ Molt-4-Zellen/ml (Abb. 2).
Claims (7)
1. Verfahren zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro, da
durch gekennzeichnet, daß bei einer Zytolyse aus Zielzellen aus
tretende Kupfer/Zink-abhängige Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) im
Zellkulturüberstand mit Hilfe von Antikörpern gegen die humane
Cu/ZnSOD immunchemisch als Eiweiß quantifiziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle
der Verwendung monoklonaler Antikörper (mAk) hochaffine epi
topdifferente mAk gegen die humane Cu/ZnSOD eingesetzt werden,
die mit CB-SOD-1 bis -11 bezeichnet sind und die von den Hybrido
men H-CB-SOD-1 bis H-CB-SOD-11 produziert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei den eingesetzten Zielzellen um Zellen menschlichen
Ursprungs handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
die SOD-Quantifizierung nach einer Immunreaktion zwischen Zell
kulturüberstand und anti-SOD-Antikörpern von 15 Minuten und einer
Substratreaktion zwischen Immunkomplex und Substratlösung von 10
Minuten als Enzymimmunoassay vorgenommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß
humane Zellen in Mikrotiterplatten gebracht, durch Frieren und
Tauen lysiert, zentrifugiert, der Überstand mit Peroxidase-mar
kierten anti-SOD-Antikörpern in mit anti-SOD-Antikörpern benetz
ten Mikrotiterplatten inkubiert, nach Waschen die Substratreakti
on mit o-Phenylendiamin vorgenommen und mit Schwefelsäure beendet
und die Auswertung anhand einer Standardkurve mit gereinigter hu
maner oder rekombinanter Cu/ZnSOD vorgenommen wird.
6. Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro,
bestehend aus Mikrotiterplatten, die mit anti-SOD-Antikörpern
beschichtet sind, markierten Antikörpern, Waschlösungen und Rea
genzien zur Substratreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß es hu
mane gereinigte oder rekombinante Kupfer/Zink-abhängige Supero
xiddismutase (Cu/ZnSOD) und lysierte Zellproben als Standard ent
hält.
7. Verwendung eines Testbestecks, bestehend aus Mikrotiterplat
ten, die mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet sind, markierten
Antikörpern, Waschlösungen, Reagenzien zur Substratreaktion, hu
maner gereinigter oder rekombinanter Kupfer/Zink-abhängiger Su
peroxiddismutase (Cu/ZnSOD) und lysierten Zellproben als Stan
dard, zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19934335057 DE4335057A1 (de) | 1993-10-11 | 1993-10-11 | Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19934335057 DE4335057A1 (de) | 1993-10-11 | 1993-10-11 | Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4335057A1 true DE4335057A1 (de) | 1995-04-13 |
Family
ID=6500155
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19934335057 Withdrawn DE4335057A1 (de) | 1993-10-11 | 1993-10-11 | Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro |
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Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4335057A1 (de) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2496693A1 (fr) * | 1980-12-19 | 1982-06-25 | Toyo Jozo Kk | Procede de dosage de la peroxyde dismutase |
GB2089980A (en) * | 1980-12-19 | 1982-06-30 | Toyo Jozo Kk | Method for assaying superoxide dismutase |
EP0217542A1 (de) * | 1985-08-29 | 1987-04-08 | Ube Industries, Ltd. | Einen monoklonalen Antikörper gegen Kupfer-Zink-Superoxiddismutase enthaltendes Arzneimittel für diagnostischen Test und dasselbe verwendendes diagnostisches Testverfahren |
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WO1990006513A1 (de) * | 1988-12-08 | 1990-06-14 | Humboldt Universität Zu Berlin | VERFAHREN UND TESTBESTECKE ZUR BESTIMMUNG DER HUMANEN SOD MIT HILFE MONOKLONALER ANTI-Cu/ZnSOD-ANTIKÖRPER |
-
1993
- 1993-10-11 DE DE19934335057 patent/DE4335057A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (6)
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