WO1990006513A1 - VERFAHREN UND TESTBESTECKE ZUR BESTIMMUNG DER HUMANEN SOD MIT HILFE MONOKLONALER ANTI-Cu/ZnSOD-ANTIKÖRPER - Google Patents

VERFAHREN UND TESTBESTECKE ZUR BESTIMMUNG DER HUMANEN SOD MIT HILFE MONOKLONALER ANTI-Cu/ZnSOD-ANTIKÖRPER Download PDF

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WO1990006513A1
WO1990006513A1 PCT/AT1989/000118 AT8900118W WO9006513A1 WO 1990006513 A1 WO1990006513 A1 WO 1990006513A1 AT 8900118 W AT8900118 W AT 8900118W WO 9006513 A1 WO9006513 A1 WO 9006513A1
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sod
znsod
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cells
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PCT/AT1989/000118
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Inventor
Thomas Porstmann
Rüdiger VON BAEHR
Hans-Richard Rackwitz
Roland Grunow
Original Assignee
Humboldt Universität Zu Berlin
Cl-Pharma Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes

Definitions

  • the invention relates to methods and test kits for the quantitative determination of human Cu / Zn superoxide dismutase (Cu / ZnSOD) in human sera and in fetal erythrocytes with the aid of monoclonal antibodies which are directed against human copper / zinc-dependent superoxide dismutase (Cu / ZnSOD) (anti- Cu / ZnSOD-mAb) and the production of these antibodies.
  • the test kits allow a clear prenatal diagnosis of DOWN syndrome and allow a clear follow-up of SOD therapy.
  • the diagnosis of trisomy is carried out in high-risk pregnancies (pregnant women over 35 years of age and pregnant women with an already existing child with DOWN syndrome).
  • the free trisomies are detected by karyogram analysis.
  • fetal cells are obtained from the amniotic fluid or the umbilical vein blood, cultivated in the presence of hitogens, inhibited in the metaphase and then the chromosomes are counted.
  • the result is in amniotic fluid cells at the earliest after 2 to 3 weeks, in the case of umbilical vein lymphocytes after 4 to 5 days before.
  • the structural aberrations (translocation trisomies and chromosome 21 duplications) additionally require complex staining and evaluation techniques in order to identify the transcribed or doubled chromosome elements (Perry, P. and S. Wolf, Nature 258 (1974), 156 - 158).
  • trisomy 21 has so far only been postnatally, primarily on erythrocytes, by quantifying copper / zinc-dependent superoxide dismutase (Cu / ZnSOD), the gene of which is located on chromosome 21 and is closely associated with the gene complex responsible for DOWN syndrome , demonstrated (Tan, Y., J. Tischfeld and F. Ruddle, J. Exp. Med. 137 (1973), 317-330; Sinet, P.-K., J. Couturier, B., Dutrillaux, M. Poissonier, 0. Raoul, H.-0. Rethore, D. Allard, J. Lejeune and H. Jerome, Exp. Cell Res.
  • Cu / ZnSOD copper / zinc-dependent superoxide dismutase
  • the recently published European Patent Application 279 705 also deals with the determination of SOD-1 in amniotic fluid samples for the detection of fetal trisomy 21. Thereafter, in a radioimmunoassay with monoclonal or polyclonal anti-SOD-1 antibodies during the examination of the SOD- 1 content in 70
  • the invention further relates to a method for monitoring the course of an SOD therapy.
  • Animal experiments on the pathogenesis of myocardial infarction and ischemic conditions have shown for both regional and global ischemia that on the one hand adenosine-5'-triphosphate (ATP) is broken down to hypoxanthine and on the other hand calcium-activated proteases xanthine dehydrogenase through irreversible limited proteolysis in xanthine oxidase convert (De Wall, RA, Vasko, KA, Stanley, EL and Kezdi, P .: Responses of the ischemic myocardium to allupurinol. Am. Heart J.
  • ATP adenosine-5'-triphosphate
  • the invention further relates to a method for producing monoclonal antibodies (mAb) against human Cu / Zn superoxide dismutase (Cu / ZnSOD).
  • mAb monoclonal antibodies
  • the production of murine monoclonal antibodies (mAb) has been solved as a technical problem.
  • the principle was first published by G. KöHLER and C. MILSTEIN (NATURE , 1975, 256,495), who hybridized Ak-forming cells from the spleen of immunized mice with cells of a permanently growing plasmacytoma cell line, received Ak-producing hybridomas and, after corresponding cloning steps, received monoclonal (formed by a cell clone) Ak.
  • ELISA techniques based exclusively on polyclonal anti-Cu / ZnSOD antisera have been used to detect human Cu / ZnSOD (S. IIZUKA, N. TANIGUCHI, A. MAKITA; jnci. 72, 5, 1984, 1043-1048 ).
  • These test systems are difficult to standardize and do not guarantee the required sensitivity, as is required, for example, for the intracellular detection of human Cu / ZnSOD in intrauterine material.
  • the aim of the invention is to provide medical practice with methods and test kits which make it possible to diagnose DOWN syndrome prenatally regardless of its genetic constellation and to take SOD therapy under follow-up control.
  • monoclonal anti-Cu / ZnSOD antibodies are to be made available.
  • the invention is based on the object. to develop an improved procedure as well as a test kit for the penatal diagnosis of DOWN syndrome.
  • the task was solved with the help of an enzyme immunoassay to determine the copper-zinc superoxide dismutase (Cu / ZnSOD) controlled by a gene on chromosome 21 in erythrocytes and in trophoblast tissue using monoclonal antibodies against this enzyme.
  • the Cu / ZnSOD determination in erythrocytes is carried out in such a way that both fetal and maternal erythrocytes are lysed and then the Cu / ZnSOD content in the lysates is quantified.
  • chorionic biopsy material is mechanically digested and then the Cu / ZnSOD content in the soluble phase is quantified.
  • the respective erythrocyte lysate or the soluble phase of the chorionic biopsy material is dosed simultaneously with peroxidase-labeled monoclonal anti-SOD antibodies in cavities of a hikrotest plate which are coated with an anti-SOD antibody of a different epitope specificity and the is removed after the reaction has ended unbound substances. After adding substrate solution to the cavities and stopping the substrate reaction, the SOD concentration is determined.
  • the inter-individual fluctuation range of the Cu / ZnSOD concentration in erythrocytes from the prenatal period is surprisingly so small ( ⁇ 10%) despite the high proportion of reticulocytes that a 50% higher SOD content is found with a highly precise determination method for the Cu / ZnSOD the fetal erythrocytes can be reliably detected in a chromosome constellation causing DOWN syndrome.
  • the Hb determination also has a 25% higher coefficient of variation compared to the cell count determination.
  • the Cu / ZnSOD concentration is based on the number of erythrocytes and not on the Hb content as before.
  • the fetal erythrocytes are obtained by cardiac or umbilical vein puncture under ultrasound control according to known methods (Daffos, F. et al., 1. c.). They are separated from the plasma by centrifugation and aspiration of the supernatant, suspended in physiological saline, centrifuged again depending on the degree of hemolysis or counted immediately. In addition to the erythrocyte concentration, the mean cell volume (MCV) of the erythrocytes is determined to identify a fetal or maternal origin. If a maternal origin cannot be ruled out with certainty, an Hb electrophoresis to detect fetal Hb must be carried out in parallel with the further examinations (Kleihauer, E. and K.
  • erythrocytes According to known erythrocytes a lysis and two dilution steps are carried out, after which a cell lysate of exactly 1 million erythrocytes per 1.0 ml is obtained. In this cell lysate, the Cu / ZnSOD is quantified using a one-step solid phase enzyme immunoassay. As a control, erythrocytes from the mother's cubital vein blood are processed using the same procedure for Cu / ZnSOD quantification.
  • the mean concentration of Cu / ZnSOD in fetal erythrocytes from fetuses with normal karyogram findings is 14.5 ng per 1.0 million cells.
  • the coefficient of variation is 11.37%.
  • the range of variation of the Cu / ZnSOD concentration ranges between 11.0 and 17.3 ng Cu / ZnSOD per 1.0 million erythrocytes. Since both the method-related error and the biological range of variation of the Cu / ZnSOD are included in the test material in these results, fetal erythrocytes are the suitable biological material for the gene-dose determination of every form of trisomy 21 by means of enzyme-immunological Cu / ZnSOD quantification. Proof of the effect.
  • the Cu / ZnSOD concentration in 1.0 million erythrocytes is 19.0 ng and more, the Cu / ZnSOD gene closely associated with the gene complex causing the DOWN syndrome is tripled either as a free trisomy 21, as a translocation trisomy or as duplicated gene segment from chromosome 21.
  • the Cu / ZnSOD concentration in 1.0 million erythrocytes is less than
  • Fetal trophoblast tissue is examined by chorionic biopsy
  • fetal material erythrocytes
  • the biological variation range of the Cu / ZnSOD is so small that the Gen-Doeis effect of a 50 liter increase in concentration in trisomy 21 compared to the normal value can be demonstrated with certainty.
  • a high-precision enzyme immunological quantification of the Cu / ZnSOD to diagnose a DOWN syndrome regardless of its genetic constellation in any case, whereas with fetal material in which the SOD content is subject to a higher biological fluctuation (trophoblast tissue) only in more than the 1 , 5-fold increase compared to the mean, a DOWN syndrome can be diagnosed, this finding requiring confirmation by the erythrocytic SOD.
  • the test kit according to the invention consists of 12-well microstrips coated with anti-SOD antibodies, different SOD standard concentrations for calibration curve display, lysates of erythrocytes from normal people and from patients with a DOWN syndrome as comparative samples, enzyme-labeled antibodies and reagents for the enzyme-substrate reaction.
  • Another object of the invention is to develop a method and a test kit for monitoring the progress of an SOD therapy.
  • the object was achieved in that Cu / ZnSOD concentrations in the plasma are immunochemically quantified with the aid of antibodies against the human Cu / ZnSOD.
  • Detection is carried out in an immunoassay using polyclonal and / or monoclonal anti-SOD antibodies (anti-SOD mAb), in the case of monoclonal antibodies the epitope-different mAb against the human Cu / ZnSOD has the designation CB-SOD-1 to - 11 and are produced by the hybridomas H-CB-SOD-1 to H-CB-SOD-11.
  • the method according to the invention is characterized in that, with an immune reaction of 5 min. and a substrate reaction of 5 min. with online evaluation of a standard curve in the case of an enzyme immunoassay the result after 12 min. in the case of a radioimmunoassay or fluorescence immunoassay in less than
  • a preferred embodiment is a superfast enzyme immunoassay, as a one-step, two-sided assay with two epitope-different, high-affinity monoclonal anti-SOD antibodies.
  • test kit consists of 12-well microstrips which are coated with anti-SOD antibodies, five standard SOD concentrations, two different SOD concentrations as control materials, washing solutions, labeled antibodies and reagents for the substrate reaction, the latter of which are packaged in tubes Dimensions allow simultaneous dosing together with the sample to be determined with the 12-channel pipette.
  • the method according to the invention enables the current monitoring of the Cu / ZnSOD blood level after intravenous Cu / ZnSOD injection e.g. as an additive to lysis therapy for myocardial infarction. Due to the extremely fast immunochemical quantification of the enzyme without pretreatment of the plasma, an individually controllable SOD substitution can take place, which guarantees the maintenance of a constant active level of SOD.
  • hybridoma cells are said to be in Optimal economic effort / benefit ratio in vitro (up to large scaling in the bioreactor) and in vivo (Aecites fluid of the mouse) can be cultivated and favor cleaning by high antibody secretion performance.
  • mice from the Balb / c strain were first immunized with a purified recombinant preparation of human Cu / ZnSOD according to a specific scheme according to the invention.
  • the use of 8-10 week old female Balb / c mice proved to be advantageous.
  • the immunization was carried out by repeated application of the antigen. The best results were achieved when the mice were initially c a. every 6 weeks a dose of 50 ⁇ g of the purified recombinant Cu / ZnSOD material in complete Freund's adjuvant intraperitonea! were applied over a period of 8-12 months.
  • the last immunization was carried out intravenously with 100-150 ⁇ g of the antigen in phosphate buffer.
  • a single cell suspension was prepared from the spleens of such hyperimmunized mice 5 days after the last immunization by tissue homogenization.
  • Mouse hyeloma cells of the P3X63 Ag8 / 653 line (J. KEARNEY et al., J. Immunol. 123, 1979, 548) were used as fusion partners for these cells, which in RPHI 1640 cell growth medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) , were cultivated.
  • FCS fetal calf serum
  • the cell fusion was carried out by PEG (50%) in the presence of DMSO (6%).
  • the cells were then divided into subcultures (several hundred per fusion, each with a volume of 200 ⁇ l) and cultured in a HAT selection medium (hypoxanthine, aminopterin, thymidine; LITTLEFIELD, Science, 145, 1964, 709).
  • HAT selection medium hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • LITTLEFIELD hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • hybrid cells that produce antibodies against human Cu / ZnSOD could be selected. Specific cell cultures were detected in the ELISA.
  • H-CB-SOD-1 and H-CB-SOD-5 of these hybridomas were deposited with the European Cell Culture Depository (ECACC) Porten Down, Salisbury, Wilts SB4 OJG, UK, on December 6, 1989.
  • the hybridomas described are cell lines with high productivity (only a few comparable data from international literature are known).
  • the hybridoma cell cultures are suitable for the mass production of mAbs in vitro and in vivo.
  • the mAbs can be enriched to a high degree of purity using various processes.
  • the enzymes can be labeled with enzymes (eg peroxidase) for the development of certain test methods. They can also be coupled to certain support materials for use in separation processes (positive affinity chromatography).
  • Example 1 0.40 ml of heparinized umbilical vein blood (sample 1) and 0.5 ml of heparinized cubital vein blood of the pregnant women (sample 2) are held in a 2.0 ml eppendorf for 10 min. Centrifuged at 500 x g. The supernatant is completely aspirated with a glass capillary, the dry cell sediment is then in
  • An MCV of greater than 100 ⁇ m 3 is evidence of the fetal origin of sample 1.
  • samples 1 and 2 are diluted as follows with 0.15 mol / l NaCl to a cell concentration of 2 ⁇ 10 7 cells / ml and in a further dilution step to a cell concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the Zeil suspension is diluted 1: 2 with the enzyme immunoassay dilution buffer (0.02 mol / l Na phosphate buffer, pH 7.4, 10% (v / v) gelafusal 0.1% (v / v) Tween 20, 0.04% (X / V) digitonin), the erythrocytes being lysed simultaneously.
  • the enzyme immunoassay dilution buffer 0.02 mol / l Na phosphate buffer, pH 7.4, 10% (v / v) gelafusal 0.1% (v / v) Tween 20, 0.04% (X / V) digitonin
  • the SOD content of sample 1 is 61.5% higher than in sample 2, whose SOD content is within the mean value + 3s range for normal people.
  • the mean SOD concentration in sample 1 exceeds the limit of 19.0 ng / 10 6 erythrocytes. The diagnosis of DOWN syndrome is thus ensured by translocation or free trisomy or gene duplication of chromosome 21.
  • tissue crumbs are homogenized by a glass potter.
  • the pestle is rinsed with 0.5 ml PBS, and the 1.0 ml tissue suspension is digested in an ice bath 5 x 20 s with an ultrasonic tube transducer (Labsonic 1510, Braun Helsungen AG) with a power of 100 W.
  • the centrifugation is then carried out in a 2.0 ml eppendorf tube in the Eppendorf centrifuge 5415 for 10 min. at 12000 rpm.
  • the protein content is determined in the clear supernatant using the Lowry et al. Method (J. Bio !. Chem. 193 (1951) 265-275) with bumin serum bumin (Serva, Heidelberg, FRG) dried to constant weight as well as the SOD content determined in the enzyme immunoassay.
  • the quotient is 6.87 times the mean (332 ⁇ g SOD / g protein), which is an indication of the presence of a DOWN syndrome.
  • the suspicion was confirmed by karyotype analysis (47 xy, + 21) and by the SOD content of the fetal erythrocytes (22.1 ng / 10 6 cells). Examples 3 and 4: Monitoring an SOD Therapy
  • the substrate reaction with tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide follows for 5 min. by known method (Gallati, H. and Pracht J .: Peroxidase from Heerrettich: kinetic studies and optimization of the peroxidase activity determination with the substrates H 2 O 2 and 3, 3 ', 5, 5' - tetramethylbenzidine. J. Clin. Chem Clin Biochem 1985, 23, 453).
  • the reaction is stopped by adding 100 ⁇ l sulfuric acid per cavity.
  • the reaction scheme is shown in Fig. 1, the standard curve for Cu / ZnSOD obtained in Fig. 2.
  • the mAb was labeled with europium (labeling by LKB, Wallac, Finland) and used in a two-sided time-resolved fluoroimmunoassay with measurement of the solid-phase-bound immune complex in the 1230 Arcusr fluorometer (LKB, Wallac) .
  • mice were immunized with 50 ⁇ g of purified recombinant Cu / ZnSOD (GRÜNENTHAL-A6) in a complete Freund's adjuvant. The boosters take place every 6 weeks.
  • 150 ⁇ g antigen intravenously, approximately 2 ⁇ 10 8 spleen cells are isolated per animal. These are fused with polyethylene glycol 1500 (with the addition of 6% DMSO) to 2 x 10 7 myeloma cells P3X63 Ag8.653. After corresponding washing steps, the cells are plated in 96-well flat-bottom cell culture plates with 10 5 spleen cells in 150 ⁇ l per well.
  • RPMI 1640 supplemented by 10% heat-inactivated FCS, is used as the cell growth medium.
  • 50 ⁇ l of 4-fold concentrated HAT selection medium are added to each well.
  • the primary cultures are checked with a specific ELISA for the production of specific antibodies against human Cu / ZnSOD. Up to 20% of the primary cultures can produce specific antibodies according to the specified procedure.
  • the positive primary cultures are cloned and recloned on mouse peritoneal macrophages (10 4 per well) using the limit dilution method.
  • the cloned cell lines with specific antibody production against human Cu / ZnSOD are grown in RPMI 1640 culture medium, supplemented with 10% fetal calf serum, in a humid atmosphere with a 5% CO 2 content. Through gradual adaptation, these cells can also be grown in media with 2-5% FCS. The cells are grown in cell culture flasks. With dilution rates of up to 1:10, the culture volume can be expanded. The antibodies are mass-produced in roller bottles and then in the airlift bioreactor at 50 Liters of volume. A description of the in vitro cell culture properties of the hybridomas is given in Table 2.
  • the monoclonal hybridomas are grown to a cell amount of 10 7 -2.5 x 10 7 in cell culture bottles (volume 275 ml; NUNCLON, Kamstrup, Denmark).
  • the cells are centrifuged off and resuspended in phosphate-buffered isotonic saline.
  • 1 ml Suspens ⁇ on with a certain (optimized) cell number is applied intraperitoneally to Balb / c houses that had been treated with 1 ml Pristan 8 days earlier. After 5-14 days, the abdominal swelling shows the beginning of ascites production.
  • the hybridoma clones differ with regard to optimal conditions and effectiveness in the in vivo production of mAbs against human Cu / ZnSOD (Table 3).
  • the monoclonal antibodies are purified by known methods.
  • Hybridoma cell lines with antibody production against at least 3 different epitopes of Cu / ZnSOD which are designated with CB-SOD-1 to CB-SOD-11, are obtained according to the described scheme.
  • the antibodies react with high affinity with the corresponding epitopes on the molecule of the human Cu / ZnSOD.

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Abstract

Superoxiddismutase, SOD-Bestimmung, Cu/ZnSOD, Immunoassay, DOWN-Syndrom, Pränataldiagnostik, SOD-Therapie, Verlaufskontrolle, Myokardinfarkt, anti-SOD-Antikörper. Die Erfindung betrifft Verfahren und Testbestecke zur Bestimmung der humanen Kupfer/Zink-abhängigen Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) mit Hilfe monoklonaler anti-Cu/ZnSOD-Antikörper (anti-Cu/ZnSOD-mAk). Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen eine eindeutige pränatale Diagnostik des DOWN-Syndroms und eine Verlaufkontrolle bei einer SOD-Therapie, z.B. bei Myokardinfarkt.

Description

Verfahren u n d Testbestecke zur Bestimmung d e r humanen SOD mit Hilfe monoklonaler anti-Cu/ZnSOD-Antikörper
Die Erfindung betrifft Verfahren sowie Testbestecke zur quantitativen Bestimmung von humaner Cu/Zn Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) in menschlichen Seren und in fetalen E r y t h r o z y t e n mit Hilfe monoklonaler Antikörper, die gegen humane Kupfer/Zinkabhängige Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) gerichtet sind (anti- Cu/ZnSOD-mAk) sowie die Herstellung dieser Antikörper. Die Testbestecke erlauben eine eindeutige pränatale Diagnostik des DOWN-Syndroms und ermöglichen eine eindeutige Verlaufskontrolle bei einer SOD- Therapie.
Das DOWN-Syndrom als häufigste numerische Chromosomenaberration unter den Lebendgeburten wird in 95 % der Fälle durch eine Verdreifachung des gesamten Chromosoms 21 (freie Trisomie) und in 51 durch Verdreifachung von Teilen des Chromosoms 21, die auf andere Chromosomen versprengt sind (Trans!okationstrisomie) , hervorgerufen. Während die freien Trisomien in ihrer Häufigkeit mit dem Alter der Schwangeren positiv korreliert sind (35 Jahre 0,45 %, 38 Jahre 0,91 %) ist die Frequenz der Trans!okationstrisomie altersunabhängig, hat aber ein Wiederholungsrisiko von 10 % (Körner, H. und S. Tinschert, Z. Klin. Hed. 43 (1988), 505 - 507; Führmann/Vogel, Genetische Famüienberatung, Heidelberger Taschenbücher, Springer Verlag, Heidelberg, New York, 1982, S. 76 - 91).
Die Diagnostik einer Trisomie wird bei Risikoschwangerschaften (Schwangere über 35 Jahre und Schwangere bei bereits vorhandenem Kind mit DOWN-Syndrom) durchgeführt. Die freien Trisomien werden durch Karyogrammanalyse nachgewiesen. Hierfür werden fetale Zellen aus dem Fruchtwasser oder dem Nabelvenenblut gewonnen, in Gegenwart von Hitogenen kultiviert, in der Metaphase gehemmt und anschließend werden die Chromosomen gezählt. Das Ergebnis liegt bei Fruchtwasserzellen frühestens nach 2 bis 3 Wochen, bei Nabelvenenlymphozyten nach 4 bis 5 Tagen vor. Die strukturellen Aberrationen (Translokationstrisomien sowie Chromosom 21- Duplikationen) setzen nach der Chromosomenpräparation zusätzlich aufwendige Färbe- und Auswertungstechniken voraus, um die transiozierten bzw. verdoppelten Chromosomenel emente zu identifizieren (Perry, P. und S. Wolf, Nature 258 (1974), 156 - 158).
Als zweite neue Methode neben den klassischen zytogenetisehen Untersuchungen ist die in situ-Hybridisierung zur Trisomiediagnostik beschrieben worden (Julien, C, A. Bazin. B . Guyot, F. Forstier und F. Daffs, The Lancet, II (1986), 863 - 864) . Biotinmarkierte DNS-Fragmente von Chromosom 21 DNS werden mit Fruchtwasserzellen nach deren DNS-Denaturierung inkubiert. Die Bindung der markierten DNS an die zelluläre DNS wird durch anschließende Inkubation mit Avidin-FITC und mikroskopischer Zählung der Fluoreszenzpunkte pro Zelle ausgewertet. Drei Punkte pro Zelle sind Hinweis auf eine Trisomie 21. Die Untersuchung dauert 1 bis 2 Tage, umgeht die Zeilkultivierung verlangt aber eine entsprechend große Zellzahl in der Amnionflüssigkeit (Kindestvolumen 20 ml) und weist nur freie Trisomien nach.
Als dritte Methode wurde die Trisomie 21 durch Quantifizierung der Kupfer/Zink-abhängigen Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD), deren Gen auf dem Chromosom 21 lokalisiert und eng mit dem für das DOWN-Syndrom verantwortlichen Genkomplex assoziiert ist, bisher nur postnatal, vornehmlich an Erythrozyten, nachgewiesen (Tan, Y., J. Tischfeld und F. Ruddle, J. Exp. Med. 137 (1973), 317 - 330; Sinet, P.-K., J. Couturier, B., Dutrillaux, M. Poissonier, 0. Raoul, H.-0. Rethore, D. Allard, J. Lejeune und H. Jerome, Exp. Cell Res. 97 (1976), 47 - 55; Benson, P., Lancet I (1975), 584; Crosti, N., A. Serra, A. Rigo und P. Viglino, Hum. Genet. 31 (1976), 197 203). Die jedoch mit methodischen Schwierigkeiten behaftete Enzymaktivitätsbestimmung ist von der Präzision her unzureichend für eine sichere Trisomiediagnostik, so daß in Ery throzyten von Patienten mit DOWN-Syndrom fälschlicherweise normale SOD-Konzentrationen bestimmt wurden (Chelack, W. S. und A. Petkau, Biochim. Biophys. Acta 660 (1980), 83 - 90; Falck, P., Allerg. Immunol. 32 (1986), 199 - 204; Oyanagni, Y. , Anal. Bioehem. 142 (1984), 290 - 296; Jeziorowska, A., L. Jakubowski, J. Lach und B. Kaluzweski, Clin. Genet. 33 (1988), 11- 19). Bei Bestimmung der erythrozytären Cu/ZnSOD setzt sie zusätzlich die Entfernung des Hämoglobins voraus, wodurch eine Hindestblu t m e nge erforderlich ist. Eine immunchemische Quantifizierung der Cu/ZnSOD aus Fruchtwasser und Fruchtwasserzellen zur pränatalen Diagnostik eines DOWN-Syndroms war wegen der erheblichen biologischen Variationsbreite der Cu/ZnSOD-Konzentration die ein vielfaches des Gen-Dosis-Effektes betrugen, erfolglos (Baetman M. A., M. G. Mattei, A. Baret, H. Gamerre und J. F. Hattei, Acta Paediatr. Scand. 74 (1985), 697 - 700).
Es ist auch ein Enzymimmunoassay zur Bestimmung der humanen Cu/ZnSOD unter Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper (anti-SOD-Antikörper) beschrieben worden. Im Ergebnis dieser Untersuchungen stellte sich heraus, daß Serum, Urin und Erythrozyten von Patienten mit einem DOWN-Syndrom einen erhöhten Cu/ZnSOD-Gehalt aufweisen (Porstmann, T., R. Wietschke, H. Schmechta, R. Grunow, B. Porstmann, R. Bleiber, H. Pergande, S. Stachat und R. von Baehr, Clin. Chim. Acta 171 (1988), 1 - 10) .
Mit der Bestimmung der SOD-1 in Fruchtwasserproben zur Erkennung der fetalen Trisomie 21 beschäftigt sich auch die kürzlich erschienene European Patent Application 279 705. Danach wurden in einem Radi oimmunoassay mit monoklonalen oder polyklonalen anti- SOD-1-Antikörpern bei der Untersuchung des SOD-1-Gehaltes in 70
Fruchtwasserproben von Schwangerschaften mit der späteren Geburt normaler Kinder unter Festlegung eines Grenzwertes von 314 ng/ml
13 % als falsch positiv (Trisomie 21) bestimmt. Von den 15 Fruchtwasserproben von späteren DOWN-Syndrom-Kindern wurde 1 (7 %) falsch negativ bestimmt, was erneut die Nichteignung des Untersuchungsmaterials zur Trisomiediagnostik im Hinblick auf eine therapeutische Konsequenz demonstriert.
Gegenwärtig steht keine standardisierte, einfache und schnelle Methode zur Verfügung, die sicher pränatal ein DOWN-Syndrom, hervorgerufen durch eine freie Trisomie oder durch strukturelle Aberrationen, innerhalb eines Tages nachweisen kann.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zu r Verlaufskontrolle einer SOD-Therapie. Tierexperimentelle Untersuchungen zur Pathogenese des Herzinfarktes und ischämischer Zustände haben sowohl für die regionale als auch für die globale Ischämie ergeben, daß einerseits Adenosin-5'-Triphosphat (ATP) zu Hypoxanthin abgebaut wird und andererseits Calcium-aktivierte Proteasen Xanthindehydrogenase durch limitierte Proteolyse irreversibel in Xanthinoxidase umwandeln (De Wall, R. A., Vasko, K. A., Stanley, E. L. und Kezdi, P.: Responses of the ischemic myocardium to allupurinol. Am. Heart J. 1971, 82, 362; Roy, R. S. und McCord, J.M.: Superoxide and ischemia: conversion of xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase. In: Oxy Radicals and Their Scavenger Systems, Vol 2, Hrsg.: Greenwald, R. und Cohen, G. Elsevier, New York 1983, 145). Der durch Reperfusion des ischämischen Gebietes zugeführte Sauerstoff wird durch Oxidation von Xanthin durch Xanthinoxidase in Superoxidanionen überführt. Diese verursachen eine weitere Zellschäsigung und führen damit zur Vergrößerung des geschädigten Gebietes. Durch intravenöse Gabe von Superoxiddismutase (SOD) während der Reperfusion konnte die Infarktausdehnung wesentlich reduziert werden (Chambers, D.E., Parks, D.A., Patterson, G. et al : Role of oxygen derived radicals in myocardial ischemia Fed. Proc. 1983, 42, 1093). Eine Lysetherapie des Myokardinfarktes wird zukünftig durch i. v. Applikation von humaner Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) ergänzt werden. Die kurze Halbwertszeit de r SOD in der Blutzirkulation verringert extrem schnell eine therapeutisch wirksame Konzen tration in dem geschädigten Myokardbereich. Zur Kontrolle eines wirksamen Serumspiegels muß demzufolge eine Methode zur SOD-Quantifizierung verfügbar sein, die innerhalb weniger Minuten eine SOD-Bestimmung aus Plasma gewährleistet. Wegen der bekannten Schwierigkeiten des enzymatischen SOD-Nachweisee, der zudem noch durch den therapeutischen Einsatz von Radikalfängern (z.B. Allopurinol) gestört werden kann, kommt lediglich eine immunchemische Cu/ZnSOD-Bestimmung in Frage. Alle bisherigen Immunoassays benötigen jedoch mehrere Stunden zur SOD- Quantifizierung und sind demzufolge f ü r Verlaufskon trollen der SOD -Spiegel völlig ungeeignet.
Die Erfindung betrifft weiterin ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen humane Cu/ZnSuperoxiddismutase (Cu/ZnSODDie Herstellung muriner monoklonaler Antikörper (mAk) ist als technisches Problem gelöst. Das Prinzip wurde erstmalig durch G. KöHLER und C. MILSTEIN publiziert (NATURE, 1975, 256,495), die Ak-bildende Zellen aus d e r Milz immunisierter Mäuse mit Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie hybridisierten, Ak-produzierende Hybridoma erhielten und nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonale (von einem Zell-Klon gebildete) Ak erhielten. Dieses biotechnologische Prinzip wird (modifiziert) bis heute breit angewendet. Auch die Anwendung des Verfahrens auf die Herstellung von murinen mAk gegen humane Cu/ZnSOD ist bekannt (T. Porstmann, R. Wietschke, H. Schmechta, R. Grunow, B. Porstmann, R. Bleiber, M. Pergande, S. Stachat, R. von Baehr, Clin. Chim. Acta 171 (1988), 1 - 10; A.A. Khan, R.E. Warrington, EP 279 705).
Zum Nachweis humaner Cu/ZnSOD wurden bisher u.a. ELISA-Techniken genutzt, die ausschließlich auf polyklonalen anti-Cu/ZnSOD- Antiseren basieren (S. IIZUKA, N. TANIGUCHI, A. MAKITA; jnci. 72, 5, 1984, 1043-1048). Diese Testsysteme sind schwer zu standardisieren und gewährleisten nicht die geforderte Sensitivität, wie sie zum Beispiel für den intrazellulären Nachweis von humaner Cu/ZnSOD in intrauter inem Material gefordert wird. Es ist das Ziel der Erfindung, der medizinischen Praxis Verfahren und Testbestecke zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen ein DOWN-Syndrom unabhängig von seiner genetischen Konstellation pränatal zu diagnostizieren und eine SOD-Therapie unter Verlaufskontrolle zu nehmen. Ferner sollen monoklonale anti- Cu/ZnSOD-Antikörper zur Verfügung gestellt werden.
Der Erfindung liegt zunächst die Aufgabe zugrunde. ein verbessertes Verfahren sowie ein Testbesteck zur pänatalen Diagnostik des DOWN-Syndrome zu entwickein. Die Aufgabe wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassaye zur Bestimmung der von einem Gen auf dem Chromosom 21 gesteuerten Kupfer-Zink-Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) in Erythrozyten und in Trophobl astgewebe unter Einsatz monoklonaler Antikörper gegen dieses Enzym gelöst. Bei der Cu/ZnSOD-Bestimmung in Erythrozyten wird derart vorgegangen, daß sowohl fetale als auch mütterliche Erythrozyten lysiert werden und anschließend der Cu/ZnSOD-Gehalt in den Lysaten quantifiziert wird. Bei der Cu/ZnSOD-Bestimmung im Trophobl astgewebe wird Chorionbiopsieraaterial mechanisch aufgeschlossen und anschließend der Cu/ZnSOD-Gehalt in der löslichen Phase quantifiziert. Dazu dosiert man das jeweilige Erythrozyten-Lysat bzw. die lösliche Phase des Chorionbiopsiematerials simultan mit Peroxidase-markierten monoklonalen anti-SOD-Antikörpern in Kavitäten einer Hikrotestpl atte, die mit einem anti-SOD- Antikörper anderer Epitopspezifitat beschichtet sind und entfernt nach beendeter Reaktion die ungebundenen Substanzen. Nach Zugabe von Substratlösung in die Kavitäten und Stoppen der Substratreaktion wird die SOD-Konzentration ermittelt. Auf diese Weise werden neben freien Trisomien des Chromosoms 21 auch strukturelle Aberrationen, die ein DOWN-Syndrom erzeugen und mittels Karyogramm nicht nachweisbar sind, erfaßt. Trotz eines größeren Zellvolumens von fetalen Erythrozyten (Daffos, F., M. Capella-Pa/lovsky und F. Forestier, Prenatal Diagnosis 3 (1983), 271 - 277) und ihres höheren Hämoglobingehaltes gegenüber Erythrozyten aus der Postnatalperiode hat sich überraschenderweise gezeigt, daß de r Cu/ZnSOD-Gehalt exakt dem der Erythrozyten de r Postnatalperiode entspricht. Die interindividuelle Schwankungsbreite de r Cu/ZnSOD- Konzentration in Erythrozyten aus der Pränatalperiode ist trotz des hohen Anteils an Retikulozyten überraschenderweise so gering (< 10 %), daß sich mit einer hochpräzisen Bestimmungsmethode für die Cu/ZnSOD der 50 % höhere SOD-Gehalt in den fetalen Erythrozyten bei einer DOWN-Syndrom hervorrufender Chromosomenkonstellation sicher nachweisen läßt. Neben der unterschiedlichen Hämoglobin (Hb)-Konzentration in Erythrozyten der Prä- und Postnatalperiode weist auch die Hb-Bestimmung einen um 25 % höheren Variationskoeffizienten gegenüber der Zellzahlbestimmung auf. Die häufige Kombination des DOWN-Syndroms mit zyanotischen Herzfehlern kann durch Erhöhung des erythrozytären Hb-Gehaltes bei einer SOD/Hb-Quotientenbildüng zu niedrige Werte und damit Fehldiagnosen hervorrufen. Aus diesen Gründen wird die Cu/ZnSOD-Konzentration auf die Erythrozytenzahl und nicht wie bisher auf den Hb-Gehalt bezogen.
Die fetalen Erythrozyten werden durch Herz- oder Nabelvenenpunktion unter Ultraschallkontrolle nach bekannten Verfahren gewonnen (Daffos, F. et al., 1. c.). Sie werden durch Zentrifugation und Absaugen des Überstandes vom Plasma getrennt, in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt, in Abhängigkeit vom Hämolysegrad erneut zentrifugiert oder sofort gezählt. Neben der Erythrozytenkonzentration wird das mittlere Zellvolumen (MCV) der Erythrozyten zur Identifizierung einer fetalen oder maternalen Herkunft bestimmt. Kann damit eine maternale Herkunft nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden, so ist parallel zu den weiteren Untersuchungen eine Hb-Elektrophorese zum Nachweis von fetalem Hb durchzuführen (Kleihauer, E. und K. Betke, Internist 1 (1960), 292 - 302). Nach bekannter Erythrozyten konzentration erfolgen ein Lyse- und zwei Verdünnungsschritte, nach deren Ausführung ein Zellysat von exakt 1 Million Erythrozyten pro 1,0 ml erhalten wird. In diesem Zellysat wird die Cu/ZnSOD mittels Ein-Schritt-Festphasenenzymimmunoassay quantifiziert. Als Kontrolle werden Erythrozyten aus dem Kubitalvenenblut der Mutter nach gleichem Vorgehen zur Cu/ZnSOD-Quantifizierung aufgearbeitet.
Bewertung:
Die mittlere Konzentration der Cu/ZnSOD in fetalen Erythrozyten von Feten mit normalem Karyogrammbefund beträgt 14,5 ng pro 1,0 Million Zellen. Der Variationskoeffizient beträgt 11,37 % . Die Variationsbreite der Cu/ZnSOD-Konzentration bewegt sich zwischen 11,0 und 17,3 ng Cu/ZnSOD pro 1,0 Million Erythrozyten. Da in diese Ergebnisse sowohl der methodisch bedingte Fehler als auch die biologische Variationsbreite der Cu/ZnSOD in das Untersuchungsmaterial eingehen, sind fetale Erythrozyten das geeignete biologische Material, um mittels enzymimmunoiogischer Cu/ZnSOD-Quantifizierung bei jeder Form von Trisomie 21 den Gen- Dosis-Effekt sicher nachzuweisen.
Beträgt die Cu/ZnSOD-Konzentration in 1,0 Million Erythrozyten 19,0 ng und mehr, so liegt eine Verdreifachung des mit dem das DOWN- Syndrom verursachenden Genkomplex eng assoziierten Cu/ZnSOD-Gens entweder als freie Trisomie 21, als Translokationstrisomie oder als duplizierter Genabschnitt von Chromosom 21 vor. Beträgt die Cu/ZnSOD-Konzentration in 1,0 Million Erythrozyten weniger als
19,0 ng, so ist ein DOWN-Syndrom ausgeschlossen.
Fetales Trophoblastgewebe wird durch Chorionbiopsie mittels
Katheter in der 8. - 12. Schwangerschaftswoche mit der Methode nach Bommer und Mitarbeiter (Z. Klin. Med. 43 (1988), 579 - 583) gewonnen. Die Gewebebröckel werden nach Spülung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) mit einem Glaspotter mechanisch zerkleinert, in 1,0 ml PBS aufgenommen und anschließend durch Ultraschall aufgeschlossen. Nach Bestimmung des Eiweißgehaltes in der löslichen Phase wird die Cu/ZnSOD im Enzymimmunoassay quantifiziert und der Cu/ZnSOD-Gehalt pro Gramm Eiweiß ermittelt. Bei der Untersuchung von 31 Chorionbiopsien normalen Karyotyps wurde ein mittlerer SOD-Gehalt von 332, 0 μg/g Protein ermittelt, wobei der minimale und der maximale SOD- Gehalt 132,2 und 649,5 μg SOD/g Protein betrug. Quotienten über 500 μg SOD/g Protein sind verdächtig auf Vorliegen eines DOWN- Syndroms.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gelingt es, aus fetalem Material (Erythrozyten), in dem die biologische Variationsbreite der Cu/ZnSOD so gering ist, daß der Gen-Doeis- Effekt einer 50 ligen Konzentrationssteigerung bei Trisomie 21 gegenüber dem Normalwert mit Sicherheit nachweisbar ist, durch eine hochpräzise enzymimmunologische Quantifizierung der Cu/ZnSOD ein DOWN-Syndrom unabhängig von seiner genetischen Konstellation in jedem Fall sicher zu diagnostizieren, während an fetalem Material, bei dem der SOD-Gehalt einer höheren biologischen Schwankung unterliegt (Trophoblastgewebe) nur bei mehr als der 1,5-fachen Erhöhung gegenüber dem Mittelwert ein DOWN-Syndrom zu diagnostizieren ist, wobei dieser Befund der Bestätigung durch die erythrozytäre SOD bedarf.
Das erfindungsgemäße Testbesteck besteht aus 12-Well-Microstrips, die mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet sind, verschiedenen SOD-Standardkonzentrationen zur Eichkurvendarstellung, Lysaten von Erythrozyten von Normal- personen und von Patienten mit einem DOWN- Syndrom als Vergleichsproben, enzymmarkierten Antikörpern und Reagenzien zur Enzym-Substratreaktion.
Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Testbesteck zur Verlaufskontrolle einer SOD-Therapie zu entwickeln.
Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß Cu/ZnSOD- Konzentrationen im Plasma mit Hilfe von Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD immunchemiseh als Eiweiß quantifiziert werden. Der Nachweis erfolgt in einem Immunoassay unter Verwendung von polyklonalen und/oder monoklonalen anti-SOD-Antikörpern (anti- SOD-mAk), wobei im Falle monoklonaler Antikörper die epitopdifferenten mAk gegen die humane Cu/ZnSOD die Bezeichnung CB-SOD-1 bis -11 tragen und von den Hybridomen H-CB-SOD-1 bis H- CB-SOD-11 produziert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich daraus aus, daß bei einer Immunreaktion von 5 min . und einer Substratreaktion von 5 min. bei on-line-Auswertung einer Standardkurve im Falle eines Enzymimmunoassaye das Ergebnis nach 12 min., im Falle eines Radioimmunoassays oder Fluoreszenzimmunoassays in weniger als
min vorliegt. tine bevorzugte Ausführungeforra besteht in einem superschnell en Enzymimmunoassay, als Ein-Schritt-Zwei- Seiten-Assay mit zwei epitopdifferenten hochaffinen monoklonalen anti-SOD-Antikörpern.
Das erfindungsgemäße Testbesteck besteht aus 12-Well-Mikrostrips, die mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet sind, fünf SOD-Standardkonzentrationen, zwei unterschiedlichen SOD-Konzentrationen als Kontrollmaterialien, Waschlösungen, markierten Antikörpern und Reagenzien zur Substratreaktion, die in Röhrchen abgepackt sind, deren Dimensionen eine simultane Dosierung zusammen mit der zu bestimmenden Probe mit der 12-Kanal pipette ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die aktuelle Verlaufskontrolle des Cu/ZnSOD-Blutspiegels nach intravenöser Cu/ZnSOD-Injektion z.B. als Zusatz zur Lysetherapie bei Myokardinfarkt. Durch die extrem schnelle immunchemische Quantifizierung des Enzyms ohne Vorbehandlung des Plasmas kann eine individuell steuerbare SOD-Substi tution erfolgen, die die Aufrechterhal tung eines konstanten Wirkspiegels an SOD garantiert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der effektiven
Erzeugung von murinen Hybridomzellinien, von denen in anschließenden methodischen Schritten monoklonale Antikörper gegen Cu/ZnSOD isoliert werden können. Die Hybridomzellen sollen in optimalem ökonomischen Aufwand/Nutzen-Verhältnis in vitro (bis zum Large-Scaling im Bioreaktor) und in vivo (Aecites-Flüseigkeit der Maus) kultivierbar sein und durch hohe Antikörper- Sekretionsleistung die Reinigung begünstigen.
Die Aufgabe wurde derart gelöst, daß zunächst Mäuse vom Stamm Balb/c mit einem gereinigten Rekombinanten-Präparat de r humanen Cu/ZnSOD nach einem bestimmten, der Erfindung gemäßen, Schema immunisiert werden. Als vorteilhaft erwies sich die Verwendung von 8-10 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen. Die Immunisierung erfolgte durch mehrmalige Applikation des Antigens. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Mäuse zunächst c a . alle 6 Wochen eine Dosis von 50 μ g des gereinigten Rekombinanten- Cu/ZnSOD-Materials in komplettem Freund schen Adjuvans intraperitonea! über einen Zeitraum von 8-12 Monaten appliziert bekamen. Die letzte Immunisierung erfolgte erfindungsgemäß mit 100-150 μg des Antigens in Phosphatpuffer intravenös. Aus den Milzen derart hyperimmunieierter Mäuse wurde 5 Tage nach der letzten Immunisierung durch Gewebe-Homogenisierung eine Einzel- Zell-Suspension hergestellt.
Als Fusionspartner für diese Zellen wurden Maus-Hyelomzellen der Linie P3X63 Ag8/653 (J. KEARNEY et al ., J. Immunol . 123, 1979, 548) verwendet, die in RPHI 1640 Zellzuchtmedium, ergänzt mit 10 % Fetalem Kälberserum (FKS), kultiviert wurden.
Nach Mischen der Zellsuspensionen (Hilzlymphozyten:Myelomzellen im Verhältnis 5:1) und ihrer Sedimentation erfolgte die Zellfusion durch PEG (50 %) in Gegenwart von DMSO (6 % ). Anschließend wurden die Zellen in Subkulturen (mehrere Hundert pro Fusion zu je 200 μl Volumen) aufgeteilt und in einem HAT- Selektionsmedium (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin; LITTLEFIELD, Science, 145, 1964, 709) kultiviert. Damit konnten nicht fusionierte Zellen der permanenten Myelomlinie eliminiert und, erfindungsgemäß, Hybridzellen seiektioniert werden, die Antikörper gegen humane Cu/ZnSOD produzieren. Die Detektion spezifischer Zellkulturen erfolgte im ELISA. Primärzellinien mit spezifischer Antikörper-Produktion wurden nach dem Grenzverdünnungsprinzip (C. TASWELL, J. Immunol. 126, 1981, 1614) kloniert und subkloniert, bis mit statistischer Sicherheit Hybridoma erhalten wurden, die äußerst stabil und mit bisher nicht beschriebener, hoher Effizienz monoklonale Antikörper gegen humane Cu/ZnSOD sezernieren. Diese Hybridoma wurden als H-CB-SOD bezeichnet. Etabliert wurden die Hybri doma-Klone H-CB-SOD-1 bis H-CB-SOD-11. Von diesen Hybridoma wurde H-CB-SOD-1 und H-CB-SOD-5 bei der europäischen Hinterlegungstelle für Zellkulturen (ECACC) Porten Down, Salisbury, Wilts SB4 OJG, UK, am 6.12.1989 hinterlegt. Bei den beschriebenen Hybridoma handelt es sich um Zellinien mit hoher Produktivität (nur wenige vergleichbare Daten aus dem internationalen Schrifttum sind bekannt). Die Hybridomzellkulturen eignen sich für die Massenproduktion von mAk in vitro und in vivo.
Erstmalig ist es gelungen, in den beschriebenen Hybridomalinien mAk zu produzieren, die verschiedene Epitope der humanen Cu/ZnSOD erkennen. Die überraschend hohe Antigen-ßindungsaffinität erlaubt den Einsatz der mAk zu diagnostischen und biotechnologischen Zwecken.
Es liegen experimentelle Erfahrungen bei der Bearbeitung der Hybridoma im Airlift-Bioreaktor (Kulturvolumen 50 1) in vitro sowie der Asci tesproduktion in Pristan-behandel ten Baib/c-Häusen in vivo vor. Auf diese Weise wurden aus den beschriebenen Hybridomkulturen die monoklonalen Antikörper CB-SOD-1 bis CB-SOD- 11 in großen Mengen gewonnen. Durch verschiedene Verfahren lassen sich die mAk bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren können die Ak mit Enzymen (z.B. Peroxidase) markiert werden. Sie können außerdem zur Anwendung bei Trennverf ahren (positive Affinitätschroraatographie) an bestimmte Trägermaterialien gekoppelt werden.
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AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Beispiele 1 und 2: Pränatsle Diagnostik des DOWN-Syndroms
Beispiel 1
0,40 ml heparinisiertes Nabelvenenblut (Probe 1) und 0,5 ml heparinisiertes Kubitalvenenblut der Schwsngeren (Probe 2) werden in einem 2,0 ml Eppendorf gef äß 10 min. bei 500 x g zentrifugiert. Der überstand wird mit einer Glaskapillare komplett abgesaugt, das trockene Zellsediment anschließend in
2,0 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt und erneut zentrifugiert (s. o.). Der überstand wird verworfen, das Zell sediment in 1,0 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt und gut durchgemischt.
Unmittelbar danach werden am Coulter Counter, Kode! S-Plus IV (Coulter Electronics Inc. Flor. USA) die Erythrozytenkonzentrstion und das mittlere Zellvolumen für beide Proben ermittelt :
Figure imgf000015_0001
Ein MCV von größer als 100 μm3 ist beweisend für die fetale Herkunft von Probe 1.
Nach nochmaliger guter Durchmischung werden die Proben 1 und 2 wie folgt mit 0,15 mol/l NaCl auf eine Zellkonzentration von 2 X 107 Zellen/ml und in einem weiteren Verdünnungsschritt auf eine Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml verdünnt.
Figure imgf000016_0001
Nach erneutem Durchmischen wird die Zeil suspension 1 : 2 mit dem Enzymimmunoassay-Verdünnungspuffer (0,02 mol/lNa-Phosphstpuffer, pH 7,4, 10 % (V/V) Gelafusal 0,1 % (V/V) Tween 20, 0,04 % (X/V) Digitonin) verdünnt, wobei die Erythrozyten gleichzeitig lysiert werden. 50 μl dieser Lysatlösung mit einer theoretischen Zellkonzentration von 2 x 105 Zellen/ml werden im 1-Schritt- Festphasen-Enzymimmunoassay simultan mit 50 μl peroxidasemarkierten monoklonalen anti-SOD-Antikörpern in die mit einem anti- SOD-Antikörper anderer Epitopspezifität beschichteten Kavitäten eines 12-Well-Microstrips dosieNach 5 Minuten Reaktionszeit bei 20 ºC wird das Reaktionsgemisch abgesaugt, und die ungebundenen Substanzen werden durch dreimaliges Spülen άer Kavitäten entfernt. Anschließend wird Substratlösung (o-Phenylendiamin und H2O2) in die Kavitäten dosiert. Die Substratreaktion wird 5 Minuten später gestoppt. Die Extinktion de r entwickelten Farbe wird im Vertikal photometer gemessen. Mit den durch die SOD-Standardkonzentration erzeugten Extinktionen wird eine Bezugskurve erstellt, an der aus den Extinktionen der in Doppelbestimmung angesetzten Proben 1 und 2 die SOD-Konzentration ermittelt wird:
Figure imgf000017_0001
Berechnung: Die SOD-Konzentration der Proben 1 und 2 werden mit 2 multipliziert. Anschließend erfolgt die Mittelwertbildung.
Für Probe 1 (fetale Erythrozyten) ergibt sich:
11,9 x 2 = 23,8
11,6 x 2 = 23,2 47,0 : 2 eine mittlere SOD-Konzentration von
23,5 ng/106 Zellen.
Für Probe 2 (maternale Erythrozyten) ergibt sich :
7,3 x 2 = 14,6
7,25 x 2 = 14,5
29,1 : 2 eine mittlere SOD-Konzentration von
14,55 ng/106 Zellen.
Bewertung:
Der SOD-Gehalt von Probe 1 i s t um 61,5 % höher als in Probe 2, deren SOD-Gehalt sich innerhalb des Hittelwert- + 3s-Bereiches für Normalpersonen bewegt. Die mittlere SOD-Konzentration in Probe 1 überschreitet den Grenzwert von 19,0 ng/106 Erythrozyten. Damit ist die Diagnose DOWN-Syndrom durch Translokations- oder freie Trisomie bzw. Genduplikstion des Chromosoms 21 gesichert. Beispiel 2
Zu 8 mg Trophoblastgewebe (Feuchtgewicht), gewonnen durch Chorionbiopsie, werden in einem Reagenzglas 5,0 ml PBS gegeben. Nach kurzem Schütteln wird die überstehende Flüssigkeit von dem inzwischen sedimentierten Material mit einer Kapillare abgesaugt.
Dieser Vorgang wird wiederholt. Anschließend werden 0,5 ml hinzugegeben;, und die Gewebsbröckel werden durch einen Glaspotter homogenisiert. Das Pistill wird mit 0,5 ml PBS gespült, und die 1,0 ml Gewebesuspeneion werden im Eisbad 5 x 20 s mit einem Ultraschalltubusschwinger (Labsonic 1510, Braun Helsungen AG) mit einer Leistung von 100 W aufgeschlossen. Anschließend erfolgt die Zentrifugation in einem 2,0 ml -Eppendorfröhrchen in der Eppendorfzentrifuge 5415 10 min. bei 12000 U/min. In dem klaren überstand wird der Proteingehalt mit der Methode nach Lowry und Mitarbeiter (J. Bio!. Chem. 193 (1951) 265 - 275) mit zur Gewichtskonstanz getrocknetem Rinderserumal bumin (Serva, Heidelberg, BRD) als Standard sowie der SOD-Gehalt im Enzymimmunoassay bestimmt.
Ergebnis: Protei ngehalt: 0,6 mg/ml
SOD-Gehalt 1368,9 ng/ml
μg SOD/g Protein 2281,5
Der Quotient beträgt das 6,87-fache des Mittelwertes (332 μg SOD/g Protein), womit der Wert hinweisend auf das Vorliegen eines DOWN-Syndroms ist. Der Verdacht wurde durch Karyotypanalyse (47 xy, + 21) sowie durch den SOD-Gehalt der fetalen Erythrozyten (22,1 ng/106 Zellen) bestätigt. Beispiele 3 und 4: Verlaufskonirolle eine SOD-Therapie
Nach einmaliger i. v.-Injektion von 30 mg gereinigter humaner Cu/ZnSOD in die linke Kubitalvene eines 1,82 m großen 83 kg schweren Mannes wurden in den in Tabelle 1 ausgeführten Zeitintervallen aus einer in der rechten Kubitalvene liegenden Flexüle etwa 2 ml Blut entnommen. Das in mit Heparin beschichteten 1,5 ml Eppendorfgefäßen aufgenommene Blut wird unmittelbar danach in der Eppendorfzentrifuge Typ 5415 bei
8000 U x min-1 für 20 sek. zentrifugiert. Jeweils 100 μl des Plasmas werden in die Röhrchen de r Positionen 9 und 10 dosiert. Die anderen Röhrchen sind mit Standard und Kontrollmaterial in dem nach Abb. 1 vorgegebenen Schema gefüllt. Nachdem 50 μl enzymmarkierter anti-SOD-Antikörper in die Kavitäten 1-12 des 12- Well-Microstrips gefüllt wurden, werden mit der 12-Kanalpipette aus den Röhrchen 1-12 jeweils 50 μl entnommen und in die Kavitäten des 12-Well-Hicrostrips transferiert. Nach 5 min. Inkubation bei 20 °C unter Schütteln wird die Abtrennung de r nicht gebundenen Bestandteile aus den Kavitäten durch Absaugen der Lösungen und Bmaligem Spülen mit Tween-20-haltiger phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, vollzogen. Es folgt die Substratreaktion mit Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid über 5 min. nach bekanntem Verfahren (Gallati, H. und Pracht J.: Peroxidase aus Heerrettich: kinetische Studien und Optimierung der Peroxidase-Aktivitätsbestimmung mit den Substraten H2O2 und 3, 3', 5, 5' - Tetramethylbenzidin. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985, 23, 453). Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 μl Schwefelsäure pro Kavität gestoppt. Das Reaktionsschema ist in Abb. 1, die dabei erhaltene Standardkurve für Cu/ZnSOD in Abb. 2 dargestellt.
Die zu den verschiedenen Zeiten bestimmten Cu/ZnSOD- Konzentrationen sind aus Tabelle 1 ersichtlich. Neben der Markierung des mAk CB-SOD-1 mit Peroxidase nach bekanntem Verfahren (Wilson, H.B. und Nakane, P.K.: Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies. In: W. Knapp, K. Holubar und G. Wick (Hrsg.): Immunofluoreecenc and related staining techniques. Elsevier, Amsterdam 1978, 215) wurde de r mAk durch Chloramin-T mit 125J nach bekannten Verfahren (Hunter, W.H.
Radioimmunoassay.
In: D.H. Weir (Hrsg.): Handbook of Experimental Immunology. Blackwell Scientific Publicatione, Oxford London 1979, Kap. 14) markiert (spez. Akt. 63 μCi/ μg IgG) und in einem Radioimmunoassay in Removal stripe (Dynatech, USA) eingesetzt. Jedes Well wurde 10 sek. im Gamma Counter gezahlt (Abb. 2). Zusätzlich zur Markierung mit Peroxidase und 125J wurde der mAk mit Europium markiert (Markierung durch LKB, Wallac, Finnland) und in einem Zwei-Seiten-Time-resol ved Fluoroimmunoassay unter Vermessung des festphasegebundenen Immunkomplexes im 1230 Arcusr Fluorometer (LKB, Wallac) eingesetzt.
Tabelle 1
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(- entspricht Blutentnahme vor der Cu/ZnSOD-Injektion,
+ entspricht den Zeitpunkten der Blutentnahme nach der Cu/ZnSOD- Injektion) Beispiele 4 bis 7: Anti-Cu/ZnSOD-mAk
Beispiel 4
über einen Zeitraum von 6 Monaten werden 5 Mäuse mit jeweils 50 μg gereinigter rekombinanter Cu/ZnSOD (GRÜNENTHAL-A6) in komplettem Freund'schen Adjuvans immunisiert. Die Boosterungen erfolgen alle 6 Wochen. N ac h de r letzten Immunisierung mit 150 μg Antigen intravenös werden pro Tier etwa 2 x 108 Milzzellen isoliert. Diese werden durch Polyethylenglykol 1500 (unter Zusatz von 6 % DMSO) mit 2 x 107 Myelomzellen P3X63 Ag8.653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-well-Flachboden-Zellkulturplatten mit 105 Milzzellen in 150 μl pro well ausplattiert. Als Zellzuchtmedium wird RPMI 1640, ergänzt durch 10 % hitzeinaktiviertes FKS, verwendet. Am nächsten Tag werden pro well 50 μl 4-fach konzentriertes HAT- Seiektionsmedium zugesetzt. Nach ca. 14 Tagen werden die Primärkulturen mit einem spezifischen ELISA hinsichtlich der Produktion spezifischer Antikörper gegen humane Cu/ZnSOD geprüft. Nach dem angegebenen Verfahren können bis zu 20 % der Primärkulturen spezifische Antikörper produzieren. Die positiven Primärkulturen werden auf Maus-Peritonealmakrophagen (104 pro well) nach dem Grenzverdünnungsverfahren Moniert und rekloniert.
Auf diese Weise werden monoklonale Zellinien mit spezifischer Antikörperproduktion gegen humane Cu/ZnSOD erhalten.
Beispiel 5
Die klonierten Zellinien mit spezifischer Antikörperproduktion gegen humane Cu/ZnSOD werden in RPMI 1640 Kulturmedium, ergänzt durch 10 % Fetales Kälberserum, gezüchtet in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2-Anteil. Durch schrittweise Adaptation lassen sich diese Zellen auch in Medien mit 2-5 % FKS-Anteil züchten. Die Zellen werden in Zeilkulturflaschen vermehrt. Hit Verdünnungsraten von bis zu 1:10 kann das Kulturvolumen expandiert werden. Die Massenproduktion der Antikörper erfolgt in Rollerflaschen und anschließend im Airlift-Bioreaktor mit 50 Litern Volumen. Eine Beschreibung de r in-vitro-Zellkultureigenschaften der Hybridoma erfolgt in Tabelle 2.
Beispiel 6
In Zellkulturflaschen (Volumen 275 ml; NUNCLON, Kamstrup, Dänemark) werden die monoklonalen Hybridoma auf eine Zellmenge von 107-2,5 x 107 gezüchtet. Die Zellen werden abzentrifugiert und in phosphatgepufferter isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert. Je 1 ml Suspensϊon mit einer bestimmten (optimierten) Zellzahl wird Balb/c-Häusen intraperitoneal appliziert, die 8 Tage zuvor mit 1 ml Pristan behandelt worden waren. Nach 5-14 Tagen zeigt die Bauchschwellung den Beginn der Ascitesproduktion. Die Hybridomklone unterscheiden sich hin- sichtlich optimaler Bedingungen und Effektivität in der In-vivo-Gewinnung von mAk gegen humane Cu/ZnSOD (Tabelle 3). Die Reinigung der monoklonalen Antikörper erfolgt nach bekannten Verfahren.
Beispiel 7
Nach dem beschriebenen Schema werden Hybridomzellinien mit Antikörperproduktion gegen mindestens 3 verechiedene Epitope de r Cu/ZnSOD gewonnen, die mit CB-SOD-1 bis CB-SOD-11 bezeichnet werden. Die Antikörper reagieren mit hoher Affinität mit den entsprechenden Epitopen auf dem Molekül der humanen Cu/ZnSOD.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der humanen Kupfer-Zink-abhängigen Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) mit Hilfe von Antikörpern gegen die Cu/ZnSOD-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß Cu/ZnSOD-Konzentrationen im Zellinhalt bzw. im Blutplasma immunchemisch im Falle des Einsatzes monoklonaler Antikörper (mAk), die gegen die Cu/ZnSOD gerichtet sind (anti-Cu/ZnSOD- mAk), unter Verwendung der mAk CB-SOD-1 bis -11, die von den Hybridomen H-CB-SOD-1 bis H-CB-SOD-11 produziert werden, als Eiweiß quantifiziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur pränatalen Diagnostik des DOWN- Syndroms auf der Grundlage der Bestimmung der von einem Gen auf dem Chromosom 21 gesteuerten Cu/ZnSOD, dadurch gekennzeichnet, daß Cu/ZnSOD-Konzentrationen im Inhalt von Zellen fetalen Ursprungs mit Hilfe von Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD (anti-SOD-Antikörper) immunchemisch a!s Eiweiß quantifiziert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die immunchemische Quantifizierung der SOD-Konzentration von Inhalten fetaler Zellen mit einem Enzymimmunoassay unter Verwendung von polyklonalen und/oder monoklonalen anti-SOD- Antikörpern erfolgt, wobei im Falle mAk epitopdifferente anti- Cu/ZnSOD-mAk eingesetzt werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Erythrozyten sind und fetale sowie mütterliche
Erythrozyten getrennt lysiert und die Cu/ZnSOD-Konzentration dieser Lysate mit Hilfe der anti-SOD-Anti körper bestimmt und mit Normalwerten verglichen werden.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen aus dem Trophobl astgewebe stammen und das Gewebe nach Homogenisierung aufgschlossen, zentrifugiert und im überstand der Cu/ZnSOD-Gehalt mit Hilfe der anti-SOD- Antikörper sowie der Gesamteiweißgehalt bestimmt und als SOD- Menge pro Gramm Eiweiß ausgedrückt wird,
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß entweder die getrennten Erythrozytenlysate oder der überstand nach Aufschluß des Trophoblastgewebes mit peroxidasemarkierten monoklonalen Antikörpern versetzt und in Kavitäten einer Mikrotiterplatte oder einee 12-Well- Hicrostrϊps dosiert werden, welche mit einem anti-SOD- Antikörper anderer Epitopspezifitat beschichtet sind, wonach man die Antikörper reagieren läßt, danach die ungebundenen Substanzen entfernt werden und dann die Substratlösung in die Kavitäten eingebracht, die Substratresktion gestoppt und die SOD-Konzentration bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verdacht auf strukturelle Aberrationen, die ein DOWN-Syndrom erzeugen und mittels Karyogramm nicht nachweisbar sind, die Cu/ZnSOD-Quantifizierung aus dem Inhalt von Zellen der Pränstalperiode durchgeführt wird.
8. Testbesteck zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 7, enthaltend mit anti-SOD-Antikörper beschichtete, vorzugsweise 12-Well-Microstrips, verschiedene SOD-Standardkonzentrationen zur Eichkurvenherstellung, Lysate von Erythrozyten von Normalpersonen und DOWN-Patienten als Vergleichsproben sowie enzymmarkierte Antikörper einschließlich der Reagenzien zur Enzym-Substratreaktion.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Verlaufskontrolle einer Superoxiddismutase (SOD)-Therapie
Konzentrationen der Cu/ZnSOD im Blutplasma mit Hilfe von
Antikörpern gegen die humane Cu/ZnSOD immunchemisch als Eiweiß quantifiziert werden.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle der Verwendung mAk hochaffine epitopdifferente anti-Cu/ZnSOD-mAk eingesetzt werden.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die SOD-Quantifizierung nach einer Immunreaktion zwischen Blutplasma und anti-SOD-Antikörpern von 5 min. und einer Substratresktion zwischen Immunkomplex und Substratlösung von 5 min, vorzugsweise als Enzymimmunoaesay, durch Verwendung anderer Marker, wie Radioisotope oder Fluorochrome, als Immunoassays, wie z. B. Radioimmuno- oder Time- resolved-Immunassays, vorgenommen werden.
12. Testbesteck zur Verlaufskontrolle einer SOD-Therapie nach den Ansprüchen 1 und 9 bis 11, enthaltend 12-Well-Mikrostrips, die mit anti-SOD-Antikörpern beschichtet sind, fünf SOD- Standardkonzentrationen, zwei unterschiedliche SOD- Konzentrationen als Kontrollmaterialien, Waschlösungen, markierte Antikörper und Reagenzien zur Substratreaktion, die in Röhrchen abgepackt sind, deren Dimensionen eine simultane Dosierung der zu bestimmenden Probe mit den Standardkonzentrationen und den Kontrollmaterialien mit der 12-Kanalpipette ermöglichen.
13. Varfahren nach den Ansprüchen 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Hilzlymphozyten erfolgt, nachdem als Antigen gereinigte rekombinante Cu/ZnSOD derart verwendet wird, daß alle 6 Wochen über einen Zeitraum von 8 bis 12 Monaten Boosterungen durch Gabe von 50 μg Antigen erfolgen und die letzte Immunisierung, die zu einer Hyperimmunisierung führt, mit 100 bis 150 μg Antigen 5 Tage vor Entnahme der Hilzlymphozyten vorgenommen wird.
Zusammanfassung
Superoxiddismutase, SOD-Bestimmung, Cu/ZnSOD, Immunoassay, DOWN- Syndrom, Pränataldiagnostik, SOD-Therapie, Verlaufskontrolle, Myokardinfarkt, anti -SOD-Antikörper
Die Erfindung betrifft Verfahren und Testbestecke zur Bestimmung der humanen Kupfer/Zink-abhängigen Superoxiddismutase (Cu/ZnSOD) mit Hilfe monoklonaler anti-Cu/ZnSOD-Antikörper (anti-Cu/ZnSOD- mAk). Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen eine eindeutige pränatale Diagnostik des DOWN-Syndroms und eine Verlaufkontrolle bei einer SOD-Therapie, z. B. bei Myokardinfarkt.
PCT/AT1989/000118 1988-12-08 1989-12-07 VERFAHREN UND TESTBESTECKE ZUR BESTIMMUNG DER HUMANEN SOD MIT HILFE MONOKLONALER ANTI-Cu/ZnSOD-ANTIKÖRPER WO1990006513A1 (de)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE4335057A1 (de) * 1993-10-11 1995-04-13 Seramun Diagnostica Gmbh Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0217542A1 (de) * 1985-08-29 1987-04-08 Ube Industries, Ltd. Einen monoklonalen Antikörper gegen Kupfer-Zink-Superoxiddismutase enthaltendes Arzneimittel für diagnostischen Test und dasselbe verwendendes diagnostisches Testverfahren
EP0279705A2 (de) * 1987-02-20 1988-08-24 Monoclonetics International, Inc. Screening von Körperflüssigkeiten für Superoxid-Dismutase zur Bestimmung des fötalen Trisomy-21-Downsyndroms, und Antikörper, Hybridomen und Sätze dafür

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0217542A1 (de) * 1985-08-29 1987-04-08 Ube Industries, Ltd. Einen monoklonalen Antikörper gegen Kupfer-Zink-Superoxiddismutase enthaltendes Arzneimittel für diagnostischen Test und dasselbe verwendendes diagnostisches Testverfahren
EP0279705A2 (de) * 1987-02-20 1988-08-24 Monoclonetics International, Inc. Screening von Körperflüssigkeiten für Superoxid-Dismutase zur Bestimmung des fötalen Trisomy-21-Downsyndroms, und Antikörper, Hybridomen und Sätze dafür

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clinica Chimica Acta, Band 171, 1988, 15. Januar 1988 Elsevier Science Publishers B.V. (Amsterdam, NL) T. PORSTMANN et al.: "A Rapid and Sensitive Enzyme Immunoassay for Cu/Zn Superoxide Dismutase with Polyclonal and Monoclonal Antibodies", seiten 1-10 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4335057A1 (de) * 1993-10-11 1995-04-13 Seramun Diagnostica Gmbh Verfahren und Testbesteck zum Nachweis zytotoxischer Mechanismen in vitro

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